一種測定鹼性蛋白酶活力的酶譜方法

2023-12-11 22:51:22

專利名稱：一種測定鹼性蛋白酶活力的酶譜方法
技術領域：
本發明屬於生物蛋白酶檢測技術領域，具體涉及一種測定鹼性蛋白酶活力的酶譜方法。
背景技術：
酶譜法(zymography)是一種在SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)技術的基礎上通過特異性底物和丙烯醯胺共聚合來測定酶活性的電泳檢測技術。明膠酶譜法是測定蛋白酶活性的一種常用手段，因該技術能測定多種降解明膠的蛋白酶活性，且具有方法簡單、 檢測結果直觀和定量等優點，近年來被廣泛應用於生物蛋白酶檢測技術領域。然而，大量的檢測數據顯示該方法仍存在一些缺點。如1、缺乏一種能夠適用於多數蛋白酶的通用方法。2、缺乏特異性更高且能和丙烯醯胺偶聯的底物。3、難以測定一些 SDS敏感蛋白酶的活性。4、難以測定一些含鹼性蛋白酶的組分的活性。相關文獻
相關的美國專利包括7，153，660 B2, US2003/0171271 Al。相關日本專利包括 JP20010023781, JP20010131, JP20040299951, JP20041014。相關文獻包括Choi NS et al. ， 2006， J. Microbiol. Biotechnol. 16:457-464; Boonyaras Kim SH and Choi NS, 2000，Biosci.，Biotechnol. , Biochem. 64:1722—1725; Cristiane Μ. C. de Salles et al. , 2006, Anal. Biochem. 357:153-155; Christa Heussen and Eugene B. Dowdle, 1980, Anal. Biochem. 102:196-202; Eiichi Saitoh et al. , 2007, Anal. Chem. Insights 2:51-59; Choi NS and Kim SH, 2000， Anal. Biochem. 281(2):236-8; Choi NS et al. , 2005, J. Microbiol. Biotechnol. 15:35-39; Jeff Wilkesman and Liliana Kurz, 2009, Recent Pat. Biotechnol. 3:175-184; Choi NS et al., 2009, Anal. Biochem. 386:121-122; Choi NS et al. , 2001, J. Biochem. Mol. Biol. 34:531-536;Choi NS et al. ， 2003， J. Biochem. Mol. Biol. 37:298-303; PA Snoek-van Beurden and Jff Von den Hoff, 2005， BIOTECHNIQUES 38:73—83; Choi NS et al. ， 2005， J. Microbiol. Biotechnol. 15:537—543; R. Porcel et al. ， 2001， J. Colloid Interface Sci. 239:568-576； A Granel1i-Piperno and E Reich, 1978, J. Exp. Med. ； TM Leber and FR Balkwill, 1997，249:24-28;騫愛榮等，2003，解放軍醫學雜誌，28 =282-283;姜微波等，2002，植物學通報，19:607-610。

發明內容
技術問題本發明的目的在於解決酶譜測定時鹼性蛋白酶活性難以檢測的問題，對現有基於SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)基礎上的酶譜方法進行了改進，提供了一種檢測鹼性蛋白酶活性的方法。該方法的效果要明顯好於用增加電泳時間來檢測鹼性蛋白酶的酶譜改進方法。技術方案本發明的技術方案為一種測定鹼性蛋白酶活力的酶譜方法，包括凝膠配製步驟和電泳步驟，電泳用聚丙烯醯胺凝膠由兩種不同組分配比的聚丙烯醯胺凝膠組成
a.聚丙烯醯胺凝膠I由7質量份丙烯醯胺混合溶液I和1質量份濃縮膠緩衝液組成， 其中
(1)丙烯醯胺混合溶液I由丙烯醯胺、過硫酸銨、N，N，N' ,N'-四甲基二乙胺(TEMED) 和超純水組成，該溶液中丙烯醯胺質量體積比為6. 67%、過硫酸銨質量體積比0. 133%、 N, N，N' ,N'-四甲基二乙胺(TEMED)質量體積比0. 133%。(2)濃縮膠緩衝液由氫氧化鉀、冰乙酸和超純水組成，該溶液中氫氧化鉀質量體積比為2. 7%，冰乙酸體積比為2. 87%，ρΗ6· 7。b.聚丙烯醯胺凝膠II由7質量份丙烯醯胺混合溶液II和1質量份分離膠緩衝液組成，其中
(1)丙烯醯胺混合溶液II由丙烯醯胺、明膠、過硫酸銨、N，N，N' ,N'-四甲基二乙胺(TEMED)和超純水組成，該溶液中丙烯醯胺質量體積比為13. 33%、過硫酸銨質量體積比0. 133%、N, N, N' ,N'-四甲基二乙胺(TEMED)質量體積比0. 133%、明膠質量體積比 0. 133%。(2)分離膠緩衝液由氫氧化鉀、冰乙酸和超純水組成，該溶液中氫氧化鉀質量體積比為2. 7%，冰乙酸體積比為17. 2%，ρΗ4· 3。c.上述兩種聚丙烯醯胺凝膠分別配製完成後，按照體積比聚丙烯醯胺凝膠I 聚丙烯醯胺凝膠11=2 5，用於製備電泳用聚丙烯醯胺凝膠。本發明的技術方案所述的測定鹼性蛋白酶活力的酶譜方法，樣品緩衝液中含有質量體積比為1%的十六烷基三甲基，體積比為25%的甘油，質量體積比為0. 002%甲基綠，體積比為12. 5%濃縮膠緩衝液，ρΗ6· 7。凝膠製好後，按照生物化學常規電泳方法製備所需要的其它溶液，並參照常規操作或根據情況適當調整進行蛋白酶電泳和酶譜分析。本發明可以應用於微生物、植物和動物體中得到的鹼性蛋白酶的電泳和酶譜分析。有益效果本發明提供了一種檢測鹼性蛋白酶活性的方法，解決了用普通 SDS-PAGE進行酶譜實驗後無法正常檢測到鹼性蛋白酶活性的問題。本方法能夠有效專一靈敏的檢測鹼性蛋白酶活力。


圖1基於SDS-PAGE的酶譜法測定鹼性蛋白酶活性(泳道Α、Β)。圖1 (泳道Α)簡稱為圖1 (Α)，圖1 (泳道B)簡稱為圖1 (B)。圖2基於SDS-PAGE的酶譜法測定非鹼性蛋白酶和鹼性蛋白酶活性。符號M以下的蛋白條帶為蛋白質分子量標記，圖左邊和符號M下面的蛋白條帶對應的數字標記出了各蛋白條帶的分子量大小。圖2 (泳道A)簡稱為圖2 (A)，該泳道蛋白為非鹼性蛋白酶，圖2 (泳道B)簡稱為圖2 (B)，該泳道蛋白為鹼性蛋白酶。圖3本方法檢測鹼性蛋白酶的活性。圖3 (泳道A)簡稱為圖3 (A)，該泳道蛋白為非鹼性蛋白酶，圖3 (泳道B)簡稱為圖3 (B)，該泳道蛋白為非鹼性蛋白酶，圖3 (泳道C) 簡稱為圖3 (C)，該泳道蛋白為鹼性蛋白酶，圖3 (泳道D)簡稱為圖3 (D)，該泳道蛋白為鹼性蛋白酶。
具體實施例方式文中所述質量體積比單位為g/mL，體積比單位為mL/mL。實施例1
現採用該方法，對蛋白酶粗酶液經層析純化後各組分進行酶譜檢測，並比較了不同方法對不同蛋白酶組分分析的差異，作為該方法檢測實例。菌株一株地衣芽孢桿菌(CGMCC No. 1. 807)，這些菌株均為普通微生物保藏中心可以購買到的菌株。培養條件55°C培養M小時。發酵產酶條件基礎培養基30°C培養48小時左右。樣品製備用基礎培養基發酵地衣芽孢桿菌(CGMCC No. 1. 807)，培養48小時後將菌液離心收集粗酶液。粗酶液經硫酸銨沉澱後，通過層析分離到耐熱蛋白酶組分。粗酶液和經層析得到的蛋白組分中包含鹼性蛋白酶和中性蛋白酶，用普通SDS-PAGE進行酶譜實驗後無法正常檢測到鹼性蛋白酶活性，因為鹼性蛋白酶會在膠頂端形成一個「綁定」區域， 無法跑入膠中進行分離。蛋白酶活性檢測
1、聚丙烯醯胺凝膠的配製
a.聚丙烯醯胺凝膠I由3質量份丙烯醯胺混合溶液I和1質量份濃縮膠緩衝液組成， 其中
(1)丙烯醯胺混合溶液I由丙烯醯胺、過硫酸銨、N，N，N' ,N'-四甲基二乙胺(TEMED) 和超純水組成，該溶液中丙烯醯胺質量體積比為6. 67%、過硫酸銨質量體積比0. 133%、 N, N，N' ,N'-四甲基二乙胺(TEMED)質量體積比0. 133%。(2)濃縮膠緩衝液為 0. 5 mol/L Tris-HCL 溶液，pH 6. 8。b.聚丙烯醯胺凝膠II由3質量份丙烯醯胺混合溶液II和1質量份濃縮膠緩衝液組成，其中
(1)丙烯醯胺混合溶液II由丙烯醯胺、明膠、過硫酸銨、N，N，N' ,N'-四甲基二乙胺(TEMED)和超純水組成，該溶液中丙烯醯胺質量體積比為13. 33%、過硫酸銨質量體積比0. 133%、N, N, N' ,N'-四甲基二乙胺(TEMED)質量體積比0. 133%、明膠質量體積比 0. 133%。(2)分離膠緩衝液為 0. 5 mol/L Tris-HCL 溶液，pH 8. 8。
0032]c.上述兩種聚丙烯醯胺凝膠分別配製完成後，按照體積比聚丙烯醯胺凝膠I 聚丙烯醯胺凝膠11=2:5，用於製備電泳用聚丙烯醯胺凝膠。
2、凝膠製好後，取樣品與樣品緩衝液(樣品緩衝液由蔗糖、溴酚藍、Tris-HCl組成，該溶液中蔗糖質量體積比為2%，溴酚藍質量體積比為0.2% ； Tris鹼質量體積比為 0.6%，pH 6.8) —比一混合均勻後點樣。上樣後，將冰浴的電泳槽放入4°C冰箱，以60V電壓使樣品壓成一條直線並進入分離膠，然後將電壓增至100V，繼續電泳至溴酚藍前沿泳出分離膠時，停止電泳。取下凝膠，將膠置於洗脫液(該溶液由聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100),CaCl2Jris-HCl組成，其中Triton X-100質量體積比為2. 5%，Tris鹼質量體積比為0. 6%，CaCl2質量體積比為0. 05%, pH7. 5)中振蕩洗脫2次，每次30分鐘，然後用漂洗液(除不含TritonX-IOO外其餘同洗脫液)漂洗2次，每次10分鐘，接著將膠置於孵育液 (該溶液由CaCl2、NaCUTris-HCl組成，其中CaCl2質量體積比為0. 05%, Tris鹼質量體積比為0. 6% NaCl質量體積比為0. 87%，pH7. 5)中55°C恆溫孵育池。孵育結束後經染色液(該溶液由考馬斯亮藍、甲醇、冰乙酸組成，其中考馬斯亮藍質量體積比為0. 1%、甲醇質量體積比為45%、乙酸質量體積比為10%)染色20min，及脫色液A、B(甲醇體積濃度分別為 30%,20%，乙酸體積濃度分別為10%、10%)分別脫色0. 5hUh後，顯示出蛋白酶為位於深色背景上的清晰透亮條帶，條帶亮度的強弱和面積大小經過濃度分析後可以定量地表徵蛋白酶的活性高低。於凝膠成像系統進行圖像採集見圖ι (A)，圖1 (B)，圖2 (A),圖2 (B)0圖 1 (A)為上樣緩衝液中添加SDS的鹼性蛋白酶組分，圖1 (B)為上樣緩衝液中不添加SDS的鹼性蛋白酶組分。由圖I(A)和(B)中蛋白條帶可見鹼性蛋白酶在基於SDS-PAGE的酶譜檢測中會在分離膠頂端堆積，形成一塊「綁定」區域無法有效分離，這是由於其等電點高於分離膠的等電點，而活性染色不能用加熱的方法使蛋白完全變性，導致蛋白樣品上的負電荷不足。圖2 (A)為非鹼性蛋白酶，圖2(B)為鹼性蛋白酶。3、聚丙烯醯胺凝膠的配製
a.聚丙烯醯胺凝膠I由7質量份丙烯醯胺混合溶液I和1質量份濃縮膠緩衝液組成， 其中
(1)丙烯醯胺混合溶液I由丙烯醯胺、過硫酸銨、N，N，N' ,N'-四甲基二乙胺(TEMED) 和超純水組成，該溶液中丙烯醯胺質量體積比為6. 67%、過硫酸銨質量體積比0. 133%、 N, N，N' ,N'-四甲基二乙胺(TEMED)質量體積比0. 133%。(2)濃縮膠緩衝液由氫氧化鉀、冰乙酸和超純水組成，該溶液中氫氧化鉀質量體積比為2. 7%，冰乙酸體積比為2. 87%，ρΗ6· 7。b.聚丙烯醯胺凝膠II由7質量份丙烯醯胺混合溶液II和1質量份分離膠緩衝液組成，其中
(1)丙烯醯胺混合溶液II由丙烯醯胺、明膠、過硫酸銨、N，N，N' ,N'-四甲基二乙胺(TEMED)和超純水組成，該溶液中丙烯醯胺質量體積比為13. 33%、過硫酸銨質量體積比0. 133%、N, N, N' ,N'-四甲基二乙胺(TEMED)質量體積比0. 133%、明膠質量體積比 0. 133%。(2)分離膠緩衝液由氫氧化鉀、冰乙酸和超純水組成，該溶液中氫氧化鉀質量體積比為2. 7%，冰乙酸體積比為17. 2%，ρΗ4· 3。c.上述兩種聚丙烯醯胺凝膠分別配製完成後，按照體積比聚丙烯醯胺凝膠I 聚丙烯醯胺凝膠11=2:5，用於製備電泳用聚丙烯醯胺凝膠。4、凝膠製好後，取樣品與以甲基綠為示蹤劑，以CTAB為助溶劑的樣品緩衝液(樣品緩衝液中含有質量體積比為1%的十六烷基三甲基，體積比為25%的甘油，質量體積比為 0.002%甲基綠，體積比為12.5%濃縮膠緩衝液，pH6. 7)混合均勻後點樣。上樣後，將冰浴的電泳槽放入4°C冰箱，以60V電壓使樣品壓成一條直線並進入分離膠，然後將電壓增至 100V，繼續電泳至甲基綠前沿泳出分離膠時，停止電泳。取下凝膠，將膠置於洗脫液(該溶液由聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、CaCl2、iTris-HCl組成，其中Triton X-100質量體積比為2. 5%，Tris鹼質量體積比為0. 6%，CaCl2質量體積比為0. 05%, ρΗ7· 5)中振蕩洗脫2次，每次30分鐘，然後用漂洗液漂洗2次，每次10分鐘，接著將膠置於孵育液(該溶液由CaCl2、NaCl、Tris-HCl組成，其中CaCl2質量體積比為0. 05%, Tris鹼質量體積比為0. 6% NaCl質量體積比為0. 87%，pH7. 5)中55°C恆溫孵育池。孵育結束後經染色液(該溶液由考馬斯亮藍、甲醇、冰乙酸組成，其中考馬斯亮藍質量體積比為0. 1%、甲醇質量體積比為 45%、乙酸質量體積比為10%)染色20min，及脫色液A、B(甲醇體積濃度分別為30%、20%， 乙酸體積濃度分別為10%、10%)分別脫色0. 5h、lh後，顯示出蛋白酶為位於深色背景上的清晰透亮條帶。於凝膠成像系統進行圖像採集見圖3。圖3泳道A、B中的蛋白均為通過層析分離到非鹼性蛋白酶組分，該組分能在基於SDS-PAGE的酶譜中正常檢測，但無法在用於檢測鹼性蛋白酶活力的本方法中被檢測到。圖3泳道C、D分別為上樣緩衝液添加CTAB的鹼性蛋白酶組分和上樣緩衝液中不添加CTAB的鹼性蛋白酶組分。由圖3可見，無論是否添加 CTAB，鹼性蛋白酶樣品都在背景上留下了清晰透露的條帶，而添加CTAB後酶譜效果更佳。 證明了本方法能夠有效專一靈敏的檢測鹼性蛋白酶活力。
權利要求
1.一種測定鹼性蛋白酶活力的酶譜方法，包括凝膠配製步驟和電泳步驟，其特徵在於電泳用聚丙烯醯胺凝膠由兩種不同組分配比的聚丙烯醯胺凝膠組成a.聚丙烯醯胺凝膠I由7質量份丙烯醯胺混合溶液I和1質量份濃縮膠緩衝液組成， 其中(1)丙烯醯胺混合溶液I由丙烯醯胺、過硫酸銨、N，N，N',N'-四甲基二乙胺(TEMED) 和超純水組成，該溶液中丙烯醯胺質量體積比為6. 67%、過硫酸銨質量體積比0. 133%、 N，N，N' ,N'-四甲基二乙胺(TEMED)質量體積比0. 133%;(2)濃縮膠緩衝液由氫氧化鉀、冰乙酸和超純水組成，該溶液中氫氧化鉀質量體積比為 2. 7%，冰乙酸體積比為2. 87%，ρΗ6· 7 ；b.聚丙烯醯胺凝膠II由7質量份丙烯醯胺混合溶液II和1質量份分離膠緩衝液組成，其中(1)丙烯醯胺混合溶液II由丙烯醯胺、明膠、過硫酸銨、N，N，N',N'-四甲基二乙胺(TEMED)和超純水組成，該溶液中丙烯醯胺質量體積比為13. 33%、過硫酸銨質量體積比0. 133%、N, N, N' ,N'-四甲基二乙胺(TEMED)質量體積比0. 133%、明膠質量體積比 0. 133% ；(2)分離膠緩衝液由氫氧化鉀、冰乙酸和超純水組成，該溶液中氫氧化鉀質量體積比為 2. 7%，冰乙酸體積比為17. 2%，ρΗ4· 3 ；c.上述兩種聚丙烯醯胺凝膠分別配製完成後，按照體積比聚丙烯醯胺凝膠I 聚丙烯醯胺凝膠11=2 5，用於製備電泳用聚丙烯醯胺凝膠。
2.根據權利要求1所述的測定鹼性蛋白酶活力的酶譜方法，其特徵在於樣品緩衝液中含有質量體積比為1%的十六烷基三甲基，體積比為25%的甘油，質量體積比為0. 002%甲基綠，體積比為12. 5%濃縮膠緩衝液，ρΗ6· 7。
全文摘要
一種測定鹼性蛋白酶活力的酶譜方法，包括凝膠配製步驟和電泳步驟，電泳用聚丙烯醯胺凝膠由兩種不同組分配比的聚丙烯醯胺凝膠組成。本發明提供的方法，解決了用普通SDS-PAGE進行酶譜實驗後無法正常檢測到鹼性蛋白酶活性的問題。本方法能夠有效專一靈敏的檢測鹼性蛋白酶活力。
文檔編號G01N27/447GK102174641SQ201110052578
公開日2011年9月7日 申請日期2011年3月7日 優先權日2010年12月30日
發明者朱泓, 林先貴, 王一明 申請人:中國科學院南京土壤研究所