啟動子核酸；包含其的表達盒、載體和宿主細胞；和使用該細胞表達基因的方法

2023-12-11 22:43:52 1

專利名稱：：啟動子核酸；包含其的表達盒、載體和宿主細胞；和使用該細胞表達基因的方法
技術領域：
：本發明涉及來自棒桿菌屬細菌的新的啟動子核酸、包含該啟動子的表達盒、包含該表達盒的載體、包含該載體的宿主細胞和使用該宿主細胞表達基因的方法。
背景技術：
：棒桿菌類細菌是用於產生用於許多應用的多種化學物質的微生物，所述化學物質為如動物飼料、藥品，和食品，包括L-賴氨酸、L-蘇氨酸，和多種核酸。通過遺傳工程和代謝工程可以開發顯示出高生產力的棒桿菌菌株。為了得到顯示出高生產力的棒桿菌菌株，需要在棒桿菌中表達涉及多種代謝途徑的基因。為此，必須開發合適的啟動子。通常，在棒桿菌中，基因在內在地包括在該基因中的啟動子的控制下表達(見例如，JournalofBacteriology，181(19)，6188-6191，1999)。同時，在棒桿菌細菌中表達基因的啟動子序列的結構是未知的，而其他工業微生物，如大腸桿菌(E.coli)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的結構是已知的。因此，已經提出了下面的方法用來產生能夠使基因在棒桿菌細菌中表達的啟動子。首先，除去耐受抗生素，如氯黴素的基因的啟動子區。使用合適的限制酶單獨地切割從棒桿菌細菌分離的染色體DNA，並將所得片段導入除去該啟動子區的基因中。然後，所得基因用於轉化棒桿菌細菌以產生轉化的菌株並測量所轉化的菌株的抗生素抗性(見Gene,102，93-98，1991；Microbiology,142，1297-1309，1996.)。具體地，已經開發了用於Corynebacteriumammoniagenesis中的非常少數目的啟動子，Corynebacteriumammoniagenesis是一種已知的生產核酸的微生物。例如,在大腸桿菌中使用比tac啟動子活性高約10%的啟動子(見Biotechnol.Lett.25，1311-1316，2003.)。然而，當它用於基因的大量表達時，這種啟動子顯示出低效率。美國專利號5，593，781公開了一種啟動子DNA，其從黃色短桿菌(Brevibacteriumflavum)菌株MJ-233(FERMBP-1497)分離並且具有比tac啟動子更高的活性。然而，這種從短桿菌屬分離的啟動子DNA在其他細菌中不能工作。因此，需要開發來自通過商業途徑可獲得的產氨棒桿菌(Corynebacteriumammoniagenes)並且在其他細菌中具有高活性的啟動子序列。因此，本發明的發明人在產氨棒桿菌中尋找強啟動子序列並且發現根據本發明的啟動子可以在產氨棒桿菌中以高活性表達基因。附圖描述圖1顯示了從產氨棒桿菌細菌提取的樣品的二維電泳測定的結果，其中將測定結果進行銀染並顯影用於鑑定；圖2圖解了根據本發明的實施方案產生pll7_gfp的篩選載體的方法；圖3圖解了根據本發明的實施方案從篩選載體pll7_gfp產生包括啟動子序列PCjl到PCj7的重組載體的方法。發明詳述技術問題本發明提供了在棒桿菌中具有高活性的啟動子。本發明還提供了包括所述啟動子的表達盒和包括該表達盒的載體。本發明還提供了包括所述載體的宿主細胞。本發明還提供了使用所述宿主細胞表達基因的方法。技術解決方案本發明提供了包含至少一種選自由SEQIDNO:1到7組成的組的多核苷酸的啟動子。根據本發明的實施方案的啟動子是分離的核酸並且具有啟動子活性。這裡，術語「啟動子」指DNA區，RNA聚合酶結合該DNA區以起始基因的轉錄。術語「tac啟動子」指通過將從大腸桿菌的色氨酸操縱子啟動子的-35區得到的序列與從大腸桿菌的乳糖操縱子啟動子的-10區得到的序列融合得到的啟動子。已知tac啟動子具有高啟動子活性。具有選自SEQIDNO:1、4、5、6和7的至少一種核酸的啟動子在棒桿菌屬細菌中具有比tac啟動子更高的活性。具體地，具有選自SEQIDNO:1和4的至少一種核酸的啟動子在棒桿菌屬細菌中具有比tac啟動子高4到10倍的活性。根據本發明的實施方案的啟動子除了在棒桿菌屬細菌中，還在埃希氏菌(Escherichia)屬細菌中具有啟動子活性。具體地，含有SEQIDNO:1的啟動子甚至在埃希氏菌屬細菌中也顯示出比tac啟動子高兩倍的啟動子活性。本發明的啟動子可以在其中起作用的細胞可以是任何棒桿菌屬細菌。棒桿菌屬細菌的實例包括產氨棒桿菌CJHB100(KCCM-10330)和ATCC6871、穀氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC13032和ATCC13060，等等。然而，穀氨酸棒桿菌屬細菌不限於此。本發明的啟動子可以在其中起作用的埃希氏菌屬細菌的實例包括大腸桿菌。根據本發明實施方案的啟動子的序列可以由本領域普通技術人員通過已知的誘變方法如定向進化和位點定向誘變而容易地改變。因此，本發明的範圍內包括與分離的啟動子序列具有例如70%或者更高同源性，優選80%或者更高同源性，更優選90%或者更高同源性並且可以在棒桿菌屬細菌中作為啟動子的核酸，所述分離的啟動子序列包括至少一種選自SEQIDN0.:1到7的核酸。本發明還提供了表達盒，其包括可操縱連接編碼序列的啟動子。編碼序列可以是例如完整基因或者編碼基因的預定區域的編碼序列。這裡，術語「可操縱連接(operablylinked)」指出編碼序列功能地連接啟動子，使得啟動子序列可以起始或者介導編碼序列的轉錄。根據本發明的實施方案的表達盒可以還包括可操縱連接啟動子序列的5』和3』控制序列。編碼序列可以是結合代謝產物，如IMP、GMP、L-賴氨酸和L-蘇氨酸的基因。本發明還提供了包括根據本發明的實施方案的表達盒的載體。這裡，載體是不受限制的，並且可以是本領域中已知的任何載體。根據本發明的實施方案的載體的實例包括pCR2.1-T0P0載體(InvitrogenInc,USA生產)和pECCG117(KFCC-10673)。然而，載體不限於此。包括根據本發明的實施方案的表達盒的載體的實例包括Pll7-cjl-gfp、pi17-cj2-gfp>ρ117-cj3-gfp、pi17-cj4-gfp>ρ117-cj5-gfp>pi17-cj6-gfp禾口pll7-cj7-gfp。本發明還提供了包括按照本發明的實施方案的載體的宿主細胞。宿主細胞可以是棒桿菌屬細菌或者埃希氏菌屬細菌，但不限於此。例如，宿主細胞可以是產氨棒桿菌CJHB100(KCCM-10330)或者大腸桿菌。本發明還提供了通過培養宿主細胞表達異源基因的方法。根據所選的宿主細胞，可以在多種已知的培養基和多種已知的培養條件之一下培養宿主細胞。有益效果可操縱連接根據本發明的啟動子的基因在大腸桿菌和產氨棒桿菌中有效表達。啟動子適於用棒桿菌屬細菌開發菌株。包括根據本發明的啟動子的表達盒和包括根據本發明的表達盒的載體適於在大腸桿菌和產氨棒桿菌中有效表達外源基因。根據本發明的宿主細胞可以有效表達外源基因。通過使用根據本發明的表達基因的方法，可以有效表達外源基因。最佳方式將參考下面的實施例進一步詳細描述本發明。這些實施例僅用於闡明目的，並且不意在限制本發明的範圍。實施例從不同培養階段的產氨棒桿菌CJHB100(KCCM-10330)製備細菌提取物。對細菌提取物進行二維電泳以發現其中過表達的蛋白質，然後將其切割以分析肽序列。所得的肽序列用於鑑定過表達蛋白質的基因。然而，分離啟動子區，並使用啟動子區產生載體。接著，測量啟動子在產氨棒桿菌CJHB100(KCCM-10330)和大腸桿菌中的活性。實施例1培養產氨棒桿菌CJHB100(KCCM-10330)並根據培養階段選擇過表達蛋白質(1)細菌的培養在具有糖蜜的粗糖(含有50%葡萄糖和50%果糖的混合物)的培養基中培養產氨棒桿菌CJHB100(KCCM-10330)。此時，測量細胞濃度。在早穩定期和穩定期收穫培養的產氨棒桿菌CJHB100(KCCM-10330)的樣品。將樣品離心並除去所得的上清液。得到的細胞沉澱在崩解緩衝液中裂解以產生約100μm細菌提取物。(2)二維電泳測定從第(1)部分得到的細菌提取物用6M尿素、2M硫脲、4%CHAPS和0.4%DTT稀釋以得到總體積350μ1的混合物。然後，向其中加入7μ1的IPT緩衝液和3μ1的溴酚藍(BPB)。使用immobilinepH梯度drystrip將所得溶液裝載到再水化盤。再水化盤上的樣品用2ml覆蓋液覆蓋以防止樣品的蒸發和尿素的結晶，然後在室溫下再水化約24小時。使用等電聚焦裝置(MultiphorII=AmershamBioscience,USA.生產)將再水化的條帶凝膠(stripgel)進行等電聚焦在20°C0-100V進行1小時，300V進行1小時，600V進行1小時，和在8000V下進行預定的時間，該時間經調節以進行聚焦43-97kVhr(pH4-743.4kVhr,pH4.5-5.5，ρΗ5·5-6.7:97kVhr)。當等電聚焦完成時，各自的條帶凝膠在含有20mMTris_HCl、6M尿素、2%SDS、20%甘油、2.5%丙烯醯胺和5mMTBP的pH8.8溶液中平衡15分鐘。將各自平衡的條帶裝載到二維凝膠(9-16%濃度梯度)中然後用含有0.5%具有低沸點的瓊脂和0.001%BPB的SDS溶液密封。在100V下電泳約19小時。電泳完成後，將凝膠在45%甲醇溶液和5%乙酸溶液中固定。用蒸餾水洗滌乙酸1小時。將凝膠用0.02%硫代硫酸鈉敏化2分鐘並用蒸餾水洗滌。然後，將凝膠與0.1%硝酸銀反應20分鐘並用蒸餾水洗滌。反應產物用含有2%(w/v)碳酸鈉和0.04%(ν/ν)甲醛的溶液顯影。當斑點具有出現的希望的強度時，用乙酸中止反應。凝膠用蒸餾水洗滌並在4°C下保存在密封的塑膠袋中。當使用考馬斯染色時，當電泳完成後，用30%甲醇溶液和10%乙酸溶液固定凝膠1小時，用蒸餾水洗滌，用膠體考馬斯亮藍G-250染色24小時，然後用10%甲醇溶液和7%乙酸溶液漂白4小時。(3)基於斑點，製備用於質譜的肽樣品使用已知方法(Shevchenkoetal.Anal.Chem.，68(5)，850-8，1996.)的改進版從斑點分離肽。首先，從第(2)部分製備的凝膠切除蛋白質斑點，用30mM鐵氰化鉀和IOOmM硫代硫酸鈉的11比例的120μ1混合溶液漂白，並用蒸餾水洗滌，然後用120μ150%乙腈/25mM碳酸氫銨(pH7.8)洗滌10分鐘。所得產物與50μ1100%乙腈反應直到白色出現約5分鐘，然後真空乾燥。向乾燥的斑點加入10μ1二維電泳級的胰蛋白酶(0.02μg/μ1)然後在冰水反應45分鐘。然後，向反應產物加入50mM碳酸氫銨緩衝液(pH7.8)並在37。C反應12-14小時。所得產物在10μ10.5%TFA和50%乙腈中用超聲波處理3次10分鐘以提取肽。(4)質譜法通過HPLC-MS/MS分析如上述提取肽。用1100系列HPLC系統(AgilientInc,USA生產)和FinniganLCQDECA離子阱質譜裝置(ThermoQuest,USA生產)進行HPLC-MS/MS，在該裝置上安裝納噴霧離子化源。用C18顯微探針反相柱進行HPLC，並以線性梯度(流速=1μ1/分鐘)提供0.甲酸(溶劑Α)和90%(ν/ν)乙腈和0.甲酸的溶液(溶劑B)以分離肽。使用納噴霧電離(NSI)(噴霧電壓1.8kV；毛細管溫度200°C；毛細管電壓34V；管透鏡偏移40V；和電子倍增器-60V)進行肽檢測3次。以圖心模式(centroidmode)得到測量。得到400-2000Da的完整MS掃描後，將閾值設置為1XIO5計數並通過高解析度局部放大掃描分離最強的離子。然後，進行碰撞誘導解離(CID)MS/MS。使用TurboQuest軟體(ThermoFinniganInc，USA生產)鑑定不編碼的CID光譜的序列。SEQUEST搜索的結果通過互相關和ΔΟι(Δ歸一化相關)鑑定。使用Q-starPulsarLCMS/MS(AppliedBiosystemsInc，USA生產)證實和鑑定肽的胺基酸序列。結果，發現了50種蛋白質，並選擇了50種蛋白質的7種過表達的蛋白質。圖1顯示了從產氨棒桿菌提取的樣品的二維電泳分析的結果，其中將測定結果銀染並顯影用於鑑定。在圖1中，鑑定了通過CJl到CJ7表示的7種過表達的斑點。這些7種過表達的蛋白質的功能在表1中指出。通過將肽的序列與NCBIgenebank資料庫中所含的胺基酸序列比較，鑑定了這些蛋白質的功能。表1tableseeoriginaldocumentpage7從7種過表達的蛋白質推定基因序列並分析以選擇啟動子區。結果，推定從對應於CJl到CJ7表示的蛋白質的基因序列分離的SEQIDNO:1到7的寡核苷酸具有啟動子活性。實施例2製備具有啟動子序列的重組載體pll7_cjl7_qfp和在產氨棒桿菌中啟動子活性的證實(1)從產氨棒桿菌CJHB100的基因組擴增啟動子序列使用Eikmann等人(Gene，102,93-98,1991)提出的方法，從培育1天的25ml產氨棒桿菌CJHB100培養物分離500yg染色體DNA。分離的染色體DNA用作模板。使用引物組(SEQIDNOS10禾口11,12禾口13、14和15,16禾口17,18禾口19,20和21、和22和23)進行PCR,分別在94°C，在55°C，在72°C，30秒，重複30次以擴增CJl到CJ7的啟動子。結果，擴增了各自的啟動子序列pcjl到pcj7。(2)製備篩選載體首先，使用pGFuv載體(ClontechInc,USA生產)作為模板並使用SEQIDNOS8和9作為引物分別在94°C30秒、55°C30秒、和72°C1分鐘進行PCR。在每個溫度下進行PCR30次。結果，擴增不包括啟動子區的綠色螢光蛋白(GFP)基因。然後，將所得的不包含啟動子區的GFP基因克隆到pCR2.1-T0P0載體(Invitrogen，USA生產)中，其然後通過PstI和EcoRI切割並導入pECCG117(KFCC-10673/KFCC-10674)的PstI和EcoRI位點中，pECCG117是穿梭載體並且可以在大腸桿菌和棒桿菌細菌中表達。結果用作篩選載體(Pll7_gfp)來分離啟動子。圖2圖解了根據本發明的實施方案，產生pll7-gfp的篩選載體的方法。(3)導入啟動子序列到篩選載體中和在產氨棒桿菌CJHB100中鑑定啟動子活性將部分(2)中得到的篩選載體用KpnI/EcoRV的限制酶切割，然後連接到通過相同的限制酶切割的PCjl到pcj7的啟動子序列中以產生pll7-cjl-7-gfp的重組載體，其中pcjl到pcj7的寡核苷酸從產氨棒桿菌CJHB100分離並且具有假定的啟動子活性，將所述寡核苷酸連接到GFP。圖3圖解了從根據本發明實施方案的篩選載體pll7-gfp產生包括SEQ.IDNOS:pcjl到pcj7的重組載體的方法。通過vanderRest等人(Appl.Microbiol.Biotechnol.，52，541-545，1999)介紹的方法將得到的重組載體導入容易轉化的產氨棒桿菌CJHB100(KCCM-10330)中。將所得轉化的菌株塗布含有10μg/ml卡那黴素的CM培養基(1%蛋白腖，1%肉湯，0.25%氯化鈉，酵母提取物，100mg/ml腺嘌呤，100mg/ml鳥嘌呤，2%瓊脂(pH7.2))上並在32°C培養3天。從菌落篩選顯示生長的活菌株。然後，將對篩選的菌株用紫外線照射並選擇發出螢光的菌株。發出螢光的菌株的篩選表明pcjl到pcj7的啟動子在棒桿菌細菌中顯示出啟動子活性。同時，定量測量啟動子活性。將pll7-cjl-7-gfp的重組載體導入產氨棒桿菌CJHB100(KCCM-10330)中並以與上述相同的方式培養。離心培養物得到細菌沉澱。然後，將細菌沉澱懸浮在蛋白質提取緩衝液(PBS中lmMEDTA，3%甘油，triton-X-100溶液，pH-7.5)並通過超聲處理裂解。將裂解物離心並分離含有細菌提取物的所得上層溶液。通過Bradford測定法測量細菌提取物中含有的蛋白質的量。隨後，使用LaureGory等人(FEMSMicrobiologyLetters194，127-133，2001)描述的方法向等於上述細菌提取物的量的細菌提取物照射488nm光，並使用LS-50B分光光度計(Perkin-Elmer)測量發射的光以發現GFP基因的表達程度並且發現具有511nm的波長。結果在表2中顯示。如表2中所示，根據本發明的實施方案的啟動子指導GFP基因的有效表達。更具體地，PCjl和pcj4的啟動子與其他啟動子相比顯示出最高的效率。表2tableseeoriginaldocumentpage8實施例3比較tac啟動子和根據本發明的實施方案的啟動子在產氨棒桿菌中的活性在本實驗中，比較了根據本發明實施方案的啟動子和常用於產氨棒桿菌中的tac啟動子的活性。(1)製備含有tac啟動子和組合的GFP基因的載體首先，使用pKK223-2載體(PharmaciaBiotech,USA生產)作為模板並使用SEQIDNOS:24和25作為引物以與實施例1中相同的方式進行PCR以擴增tac啟動子序列。將擴增的產物克隆到PCR2.1-T0P0載體(Invitrogen，USA)中。接著，將得到的tac啟動子序列用KpnI和EcoRV的限制酶切割並連接到用相同限制酶切割的pll7_gfp以得到重組的表達載體(pll7-tac-gfp·)。將重組載體以與實施例1中相同的方式轉化產氨棒桿菌CJHB100，並測量GFP基因的活性。將由於tac啟動子的GFP基因的活性與由於根據實施例2選擇的啟動子的GFP基因的活性進行比較。結果在表3中顯示。表3tableseeoriginaldocumentpage8如表3中所示，發現根據本發明的實施方案的啟動子有效表達GFP基因。此外，當根據本發明的實施方案的啟動子在產氨棒桿菌中的活性與tac啟動子在產氨棒桿菌中的活性比較時，pcjl、pCj4、pCj5、pCj6和pcj7啟動子比tac啟動子顯示出更高的強度。具體地，pcjl和pcj4的啟動子顯示出10倍於tac啟動子活性。實施例4在大腸桿菌中證實根據本發明的啟動子的活性證實根據本發明實施方案的啟動子除了在棒桿菌細菌中外還在大腸桿菌中顯示出活性。將大腸桿菌用在實施例1和2中使用的重組表達載體轉化。通過與實施例1中相同的方式測量GFP基因的活性確定根據本發明實施方案的啟動子是否能夠在大腸桿菌中有效表達GFP。參考載體是含有tac啟動子的pll7-taC-gfp重組載體。表4顯示了根據本發明實施方案的啟動子在大腸桿菌中的啟動子活性。表4啟動子pcjl__pcj2__pcj3__pcj4__pcj5__pcj6__pcj7__ptac296%15%20%17%19%24%24%100%如表4中所示，發現根據本發明實施方案的啟動子在大腸桿菌中有效表達GFP基因。更具體地，PCjl啟動子在棒桿菌細菌和大腸桿菌中都顯示出高活性。實施例5=IPTG對根據本發明的啟動子活性的影響公知tac啟動子是代表性啟動子，通過該啟動子，在大腸桿菌中可以通過IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)誘導基因表達。換句話說，在大腸桿菌中，tac啟動子表達的基因的量根據存在或不存在IPTG而變。在本實驗中，測量了IPTG對根據本發明實施方案的啟動子對GFP基因表達的影響。為此，將含有比pll7-cjl-gfp的其他啟動子有更高活性的pcjl啟動子的重組載體以實施例1和2中相同的方式導入大腸桿菌和產氨棒桿菌CJHB100(KCCM-10330)中，並測量由此表達的GFP基因的量。參照物是含有tac啟動子的pll7-taC-gfp重組載體。結果在表5中顯示。表5tableseeoriginaldocumentpage9如表5中所示，根據本發明實施方案的啟動子在大腸桿菌和產氨棒桿菌中比tac啟動子更有效地表達GFP基因，不考慮IPTG的存在。向pECCG117中插入上述實施例中得到的pCJl、pCJ2、pCJ3、pCJ4、pCJ5、pCJ6和PCJ7的啟動子。所得的載體用於轉化大腸桿菌DH5。將所得轉化體根據布達佩斯條約在2004年11月16日保藏在國際保藏組織韓國微生物培養中心(KCCM)中(保藏號KCCM-10611、KCCM-10612、KCCM-10613、KCCM-10614、KCCM-10615、KCCM-10616禾PKCCM-10617)。人或代理機構文件參考I國際申請號涉及保藏的微生物或其它生物材料的指示(PCT細則13bis)tableseeoriginaldocumentpage10tableseeoriginaldocumentpage10涉及保藏的微生物或其它生物材料的指示(PCT細則13bis)tableseeoriginaldocumentpage11tableseeoriginaldocumentpage11涉及保藏的微生物或其它生物材料的指示(PCT細則13bis)tableseeoriginaldocumentpage12tableseeoriginaldocumentpage13tableseeoriginaldocumentpage13涉及保藏的微生物或其它生物材料的指示(PCT細則13bis)tableseeoriginaldocumentpage14tableseeoriginaldocumentpage14涉及保藏的微生物或其它生物材料的指示(PCT細則13bis)tableseeoriginaldocumentpage15tableseeoriginaldocumentpage15涉及保藏的微生物或其它生物材料的指示(PCT細則13bis)tableseeoriginaldocumentpage16序列表CJ株式會社來自棒桿菌屬細菌的新的啟動子核酸、包含該啟動子的表達盒和包含該表達盒的載體、包含該載體的宿主細胞和使用該細胞表達基因的方法PN0594124KopatentIn1.711301DNAr'M^ffS'(Corynebacteriumammoniagenes)CJHB1001caccgcgggcttattccattacatggaatgaccaggaatggcagggaatgcgacgaaatt60gactgtgtcgggagcttctgatccgatgctgccaaccaggagagaaaataatgacatgtg120caggcacgctggtgagctggagatttatgatctcaagtaccttttttcttgcactcgagg180gggctgagtgccagaatggttgctgacaccaggttgaggttggtacacactcaccaatcc240tgccgtcgcgggcgcctgcgtggaacataaaccttgagtgaaacccaatctaggagatta300a3012285DNA/^M^ff·(Corynebacteriumammoniagenes)CJHB1002aattccaccagacgttgtttagtaagtgcccgaattctcggttggtgcagttgcttttcg60atgaatgggagaacctcgaatacttccgcgtctctactttccggtacgtgccacacagag120cagagcaatcggtggaagagcacgacagattagtagcgcttatcgaagcccaggcagaag180atttctacatcgaatcccaagcccgcaaccaccgcctgacaaccgcaacgacctaccgcc240aacgtttaaattccgaaaatcatcacgaagaacaaggagtgcaca2853291DNA/^M^ff·(Corynebacteriumammoniagenes)CJHB1003gctgcctacatctggacttctgacctgaagcgctcccacaacttcgcgcaaaacgttgaa60gccggcatggtctggttgaactccaacaacgtccgtgacctgcgcaccccattcggtggc120gtcaaggcatccggtctggggcatgagggcggctaccgctccattgacttctacaccgac180caacaggccgtacacatcaacttaggcgaagtccacaacccagtcttcggcaagcaaacc240aactaattctccctcatccacactccccttttaacctcactaggagtcatc2914312DNA/^M^ff·(Corynebacteriumammoniagenes)CJHB1004actgggagggtaggggtcacgctgaattagcaggtcacatcctgttgcttgagctggccg60ttaccctcctaggatccgagatgattcttgtagaggactaacgtccgcacaaatcttccg120cgggatgctcaaatcacccttagctggtttgaaaaatccgtggcataaatctaggatcgt180gtaactggcacgaaaagaaagcgtcatcggcgcttgggaacatctttttaagatattcct240caagtgccgtgacatctgtcaaccccgtggctgcgagagtcgtagtcacaatgaagtcca300ggaggacataca3125249DNA/^M^ff·(Corynebacteriumammoniagenes)CJHB1005tcggacatatacggatttacctgctgcaatcgcgccggcccttgctcgaaattgcgtgaa60ttttagtctgattgtgttggaatatccgcagaatgtgtgggtttgcttttataaatctgc120gcagtgtagggaacctcggtactatcggcagtgtcggagaaacttcctcgatataaatct180ttgaagtaattctcccaggcaatagcttttgacgtactccgcttcccaactttttaggag240acaactacc2496332DNA/^M^ff·(Corynebacteriumammoniagenes)CJHB1006ggcttcatcgtcgtctttgatccgatgcgagtccattaacccaaactccttaaagcccgt60aaaacgggggtattccaacacggttatccacagtttaaccgttattcgggggtaatccta120acccaaatcattacggaaactccaatctggctcacaatatcctccatgattctagggaca180cccaatcaggtgcacccgcttcctgcgacaacgagtcaaactcggcaaagccctcaacct240gtcggtctagaatatatataccgcccggtctagtgttgtggtgtacactaacgataaacc300aacaaagttgtctattaagaggaggccatttc3327318DNA/^M^ff·(Corynebacteriumammoniagenes)CJHB1007agaaacatcccagcgctactaatagggagcgttgaccttccttccacggaccggtaatcg60gagtgcctaaaaccgcatgcggcttaggctccaagataggttctgcgcggccgggtaatg120catcttctttagcaacaagttgaggggtaggtgcaaataagaacgacatagaaatcgtct180cctttctgtttttaatcaacatacaccaccacctaaaaattccccgaccagcaagttcac240agtattcgggcacaatatcgttgccaaaatattgtttcggaatatcatgggatacgtacc300caacgaaaggaaacactc318831DNA人工序列引物8acgcgatatcatgagtaaaggagaagatctt31931DNA人工序列引物9aaaactgcagttatttgtagagctcatccat311032DNA人工序列引物10cggggtaccaccgcgggcttattccattacat321132DNA人工序列引物11acgcgatatcttaatctcctagattgggtttc321233DNA人工序列引物12cggggtaccaattccaccagacgttgtttagta331332DNA人工序列引物13acgcgatatctgtgcactccttgttcttcgtg321433DNA人工序列引物14cggggtaccgctgcctacatctggacttctgac331531DNA人工序列引物15acgcgatatcgatgactcctagtgaggttaa311629DNA人工序列引物16cggggtaccactgggagggtaggggtcac291730DNA人工序列引物17acgcgatatctgtatgtcctcctggacttc301832DNA人工序列引物18cggggtacctcggacatatacggatttacctg321931DNA人工序列引物19acgcgatatcgttgtctcctaaaaagttggg312025DNA人工序列引物20cggggtaccggcttcatcgtcgtct252130DNA人工序列引物21acgcgatatcatggcctcctcttaatagac302233DNA人工序列引物22cggggtaccagaaacatcccagcgctactaata332329DNA人工序列引物23acgcgatatcagtgtttcctttcgttggg292429DNA人工序列引物24cggggyacccggagcttatcgactgcacg29權利要求啟動子，其由SEQIDNO4的多核苷酸組成。2.表達盒，其包含權利要求1的啟動子並且可操縱連接編碼序列。3.載體，其包含權利要求2的表達盒。4.宿主細胞，其包含權利要求3的載體。5.權利要求4的宿主細胞，其是屬於棒桿菌屬(Corynebacterium)或埃希氏菌屬(Escherichia)的細菌細胞。6.表達異源基因的方法，其包括培養權利要求4或者權利要求5的宿主細胞。全文摘要提供了包括至少一種選自由SEQIDNO1到7組成的組的多核苷酸的啟動子、包括該啟動子的表達盒、包括該表達盒的載體、包括該載體的宿主細胞，和使用該宿主細胞表達基因的方法。文檔編號C12N15/63GK101798571SQ20091026608公開日2010年8月11日申請日期2005年12月16日優先權日2004年12月16日發明者崔惠真,強泰善,樸英薰,李源植,李真浩,沈栽益,金顯洙,黃水淵申請人:Cj第一製糖株式會社