具有放射保護和抗腫瘤作用的減毒沙門氏菌藥物組合物的製作方法
2024-03-21 05:02:05
專利名稱：具有放射保護和抗腫瘤作用的減毒沙門氏菌藥物組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種抗腫瘤血管新生和促進放療後造血恢復及延長生存期的藥物組合物，尤其是涉及減毒的細菌載體及克隆的cDNA載體及其在動物體內的表達，小鼠接種腫瘤後抗腫瘤血管新生治療以及正常小鼠放射線照射後各種指標的檢測及生存期的觀察。
背景技術：
腫瘤病人放療後血液系統均出現不同程度的損傷，一些長期接觸放射性物質或者受到輻射損傷的病人也出現骨髓抑制。PF4是血小板特異性蛋白，CXC趨化因子家族成員。能促進放射損傷後造血的恢復，對造血細胞有可逆性的抑制作用，暫時性地抑制其增殖，使造血細胞停止於S期，能提高骨髓造血細胞對輻射的耐受性，還能刺激早期造血幹細胞的增殖，從而有效地促進照射後骨髓造血細胞的恢復。PF417-70是PF41-70的一個基因片段，有報導腺病毒編碼的PF41-70及PF417-70通過抑制血管新生抑制腫瘤的生長。並證明通過抗血管新生抑制腫瘤與目前的手術及放化療相比毒性低。減毒細菌株其特點在於通過口服途徑可以穿過小腸黏膜上皮細胞侵入腸壁的淋巴組織特別是迴腸下端的集合淋巴結和孤立淋巴結，並延淋巴管至腸繫膜淋巴結。在這些淋巴組織內，被巨噬細胞吞噬，並在其中繁殖；另一方面經胸導管進入血液，血液中的病菌很快被全身單核吞噬系統如肝、脾、骨髓、和淋巴結中的巨噬細胞。由於骨髓中的巨噬細胞攝取病菌較多，存在時間較長，故骨髓培養陽性率可高達90％。在腫瘤組織內的微環境的影響，減毒的沙門氏菌能選擇性的集聚在腫瘤組織中，其特異性與正常組織相比1000∶1。成為一種有價值的抗腫瘤基因治療的載體。減毒菌株由於不能合成對羥基苯甲酸(PAB)和2，3-二羥基苯(DHB)，所以不能在哺乳動物細胞內增殖而成為營養缺陷的減毒株。
發明內容
本發明所要解決的問題是提供一種具有放射保護和抗腫瘤作用的減毒沙門氏菌藥物組合物，通過減毒的菌株及克隆的cDNA載體在動物體內的表達。
為了解決上述技術問題，本發明採用的技術方案是一種具有放射保護和抗腫瘤作用的減毒沙門氏菌藥物組合物，攜帶有SEQ ID NO.1的核苷酸序列/或SEQ ID NO.3核苷酸序列片段的真核表達載體，通過口服後可以在體內整合，由受體細胞在體內表達相應多肽，達到抗輻射損傷和抗腫瘤作用，藥物組合是通過將具有抗輻射和抗腫瘤血管新生的基因片段克隆到攜帶綠色螢光蛋白的真核表達載體中，並將克隆基因片斷的載體通過電轉化方式轉入到減毒的沙門氏菌中。
所用的沙門氏菌為減毒菌株。
所述的真核表達載體為PIRES2-EGFP，經減毒沙門氏菌介導，轉移整合到達全身各個組織。
口服後可以在體內表達具有放射保護作用的多肽因子，延長放射損傷動物的生存時間，促進造血的恢復。
口服後可以在體內表達具有抗腫瘤生長的多肽因子，顯著抑制惡性腫瘤的生長。
本發明的有益效果是通過減毒的沙門氏菌株為細菌載體將轉化的基因片斷靶向性地在組織中發揮治療作用。方法簡單、有效，無毒副作用，損傷小適合長期應用。
圖1是真核表達載體的構建。
圖2是綠色螢光蛋白在小鼠腫瘤組織中的表達。
圖3是綠色螢光蛋白在骨髓組織中的表達。
圖4是綠色螢光蛋白在外周血中的表達。
圖5是綠色螢光蛋白在肝臟中的表達。
圖6是綠色螢光蛋白在脾臟中的表達。
圖7是綠色螢光蛋白在腎臟中的表達。
圖8是綠色螢光蛋白在小腸中的表達。
圖9是腫瘤體積的觀察。
圖10是照射後小鼠的生存曲線。
圖11是接種腫瘤後小鼠的生存率。
圖12照射後是動物外周血象的比較。
圖13照射後動物骨髓細胞總數的比較。
圖14照射後動物骨髓高增值潛能集落形成單位數的比較。
圖15照射後動物骨髓粒單集落形成單位數的比較。
圖16小鼠照射7Gy後生存曲線。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明做進一步的說明，但本發明並不受限於下述實施例1用於克隆的cDNA的製備如圖1所示，通過基因runner設計引物序列，由上海生物公司合成引物，引物兩側分別帶有EcoRI和BamHI酶切位點，從載體PCMV-PF417-70及PCMV-PF41-70擴增帶有人MCP-1信號肽(27個胺基酸)的PF417-70(SEQ ID NO.3)及PF41-70(SEQ ID NO.1)的基因片斷。擴增的片斷大約為240bp，291bp(包括信號肽)。EcoRI和BamHI酶切載體及膠回收後的PCR產物，分子克隆主要參考Sambrook等的方法(Sambrook，T.etal.Molecular CloningA Laboratory Manual，1989，Cold Spring HarborLaboratory，New York)，PIRES2-EGFP質粒購於invitrogen公司，減毒菌株購於加拿大細菌庫，將兩端分別帶有EcoRI和BamHI接頭cDNA的片段插入到經EcoRI和BamHI雙酶切的PIRES2-EGFP的質粒中，用連接物轉化大腸桿菌，篩選陽性克隆，進行酶切、電泳及測序鑑定，正確的克隆用於表達。
實施例2攜帶克隆基因片段載體的減毒菌株的製備減毒菌株在LB培養基中培養至OD600＝0.4，製備感受態減毒菌株，通過電穿孔的方法將攜帶克隆基因片段的載體轉化入減毒菌株。篩選陽性克隆。
實施例3體內轉染的檢測如圖2至圖8，通過檢測體內組織中綠色螢光蛋白的表達來間接說明轉基因在體內的分布。分別取照射後及接種腫瘤小鼠的肝臟、脾臟、腎臟、小腸、骨髓、外周血及腫瘤組織螢光顯微鏡檢測螢光的表達，在共聚焦顯微鏡下均可見到綠色螢光蛋白的表達，腫瘤組織內表達更強。而對照組小鼠切片中未見到綠色螢光蛋白的表達。表明沙門氏菌可將外源性基因導入小鼠體內並進行器官特異表達。
實施例4腫瘤體積的觀察如圖9所示，將1(105)B16惡性黑色素細胞接種於小鼠右側腋下，當腫瘤長至肉眼可見時，將轉化有基因片段的減毒菌株在含有50ug/ml卡那黴素的LB培養基中培養至，OD600＝0.4，收集菌體，PBS清洗後，100g/LNaCHO3溶液懸浮調整細菌數為1×109個/ml。實驗動物共分四組每組6隻，分別為空白對照組、綠色螢光蛋白組、空菌組(SL3261)、SL3261/PF417-70組，各組鼠用胃管每隔三天飼服相應細菌0.1ml，空白對照組飼服等量100g/L NaCHO3，每隔兩天測量腫瘤的大小。經過治療的小鼠腫瘤體積明顯縮小(P＜0.05)實施例5生存期觀察如圖10所示，小鼠照射後記錄其狀態及小鼠的存活情況。將攜帶轉化克隆基因片段載體的減毒菌株培養至OD600＝0.4，10％NaHCO3將細菌數調整到1×109/ml取100ul通過食管探子口服餵飼。健康雄性Balb/c小鼠隨機分為五組實驗組PF41-70、實驗組PF417-70、空載體組、減毒菌株組和PBS組，每組均於照射前隔三天餵飼，第二次餵飼後第二天給予7.0cGy放射線照射。照射後第二天給予餵飼，以後隔三天餵飼一次。共餵飼7次。經過PF41-70及PF417-70治療的小鼠的生存期與對照組相比明顯延長。PF417-70治療的小鼠在試驗期間一直存活，PF41-70治療的小鼠有五分之二死亡，沒有治療的小鼠全部死亡。
如圖11所示，腫瘤接種後經SL3261/PF417-70治療的小鼠的生存期與對照組相比明顯延長50％。
實施例6動物外周血象的比較如圖12所示，照射後我們檢測每組小鼠在第7天的外周血白細胞、血小板和紅細胞的計數。各組小鼠的血小板和紅細胞差異不明顯。經過PF41-70及PF417-70治療，的白細胞數雖然低於正常值，但是與對照組相比明顯增高(P＜0.05)。
實施例7動物骨髓細胞總數的比較如圖13所示，照射後第7天時每組取三隻小鼠，頸椎脫臼法處死小鼠，取出股骨和脛骨，衝出骨髓細胞計數骨髓中單個核細胞(MNC)的數量。經過PF41-70及PF417-70治療組的骨髓單個核細胞數比對照組增加(P＜0.05)。
實施例8照射後骨髓集落培養如圖14、15所示，照射後第十四天，取小鼠的雙側脛骨及股骨單個核細胞5×104集落培養PF41-70及PF417-70治療組，高增殖潛能集落形成單位(HPP-CFC)的數量、粒單集落形成單位(GM-CFU)與對照組相比有明顯區別(P＜0.05)。
實施例9化學合成人造血功能保護肽對小鼠的放射保護作用為驗證上述的藥物組合物的抗輻射保護造血的功能系細菌攜帶的重組載體在體內表達造血功能保護肽所致。本發明採用化學合成方法，合成了該多肽。並用高度純化的多肽進行了動物體內試驗。具體地說，雌性C57小鼠照射7Gy後，每天皮下注射多肽1次，共注射4次，每次每隻小鼠注射5μg。然後觀察小鼠的生存情況，結果如圖16所示，接受多肽注射的小鼠其生存率提高了約27％。
SEQUENCE LISTING(序列表)110中國醫學科學院血液學研究所120具有放射保護和抗腫瘤作用的減毒沙門氏菌藥物組合物1603170PatentIn version 3.12101211439212DNA213人類(Homo sapiens)220
221CDS222(101)..(310)4001ccgcagcatg agctccgcag ccgggttctg cgcctcacgc cccgggctgc tgttcctggg 60gttgctgctc ctgccacttg tggtcgcctt cgccagcgct gaa gct gaa gaa gat115Glu Ala Glu Glu Asp1 5ggg gac ctg cag tgc ctg tgt gtg aag acc acc tcc cag gtc cgt ccc163Gly Asp Leu Gln Cys Leu Cys Val Lys Thr Thr Ser Gln Val Arg Pro10 15 20agg cac atc acc agc ctg gag gtg atc aag gcc gga ccc cac tgc ccc211Arg His Ile Thr Ser Leu Glu Val Ile Lys Ala Gly Pro His Cys Pro25 30 35act gcc caa ctg ata gcc acg ctg aag aat gga agg aaa att tgc ttg259Thr Ala Gln Leu Ile Ala Thr Leu Lys Asn Gly Arg Lys Ile Cys Leu40 45 50gac ctg caa gcc ccg ctg tac aag aaa ata att aag aaa ctt ttg gag307Asp Leu Gln Ala Pro Leu Tyr Lys Lys Ile Ile Lys Lys Leu Leu Glu55 60 65agt tagctactag ctgcctacgt gtgtgcattt gctatatagc atacttcttt 360Ser70tttccagttt caatctaact gtgaaagaaa cttctgatat ttgtgttatc cttatgattt 420taaataaaca aaataaatc 439
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ctgatagcca cgctgaagaa tggaaggaaa atttgcttgg acctgcaagc cccgctgtac180aagaaaataa ttaagaaact tttggagagt 210
權利要求
1.一種具有放射保護和抗腫瘤作用的減毒沙門氏菌藥物組合物，其特徵是攜帶有SEQ ID NO.1的核苷酸序列/或SEQ ID NO.3核苷酸序列片段的真核表達載體，通過口服後可以在體內整合，由受體細胞在體內表達相應多肽，達到抗輻射損傷和抗腫瘤作用，藥物組合是通過將具有抗輻射和抗腫瘤血管新生的基因片段克隆到攜帶綠色螢光蛋白的真核表達載體中，並將克隆基因片斷的載體通過電轉化方式轉入到減毒的沙門氏菌中。
2.根據權利要求1所述藥用組合物，其特徵是所用的沙門氏菌為減毒菌株。
3.根據權利要求1所述藥用組合物，其特徵是所述的真核表達載體為PIRES2-EGFP，經減毒沙門氏菌介導，轉移整合到達全身各個組織。
4.根據權利要求1所述藥用組合物，其特徵是口服後可以在體內表達具有放射保護作用的多肽因子，延長放射損傷動物的生存時間，促進造血的恢復。
5.根據權利要求1所述藥用組合物，其特徵是口服後可以在體內表達具有抗腫瘤生長的多肽因子，顯著抑制惡性腫瘤的生長。
全文摘要
本發明公開了一種具有放射保護和抗腫瘤作用的減毒沙門氏菌藥物組合物，攜帶有SEQ ID NO.1的核苷酸序列/或SEQ ID NO.3核苷酸序列片段的真核表達載體，通過口服後可以在體內整合，由受體細胞在體內表達相應多肽，達到抗輻射損傷和抗腫瘤作用，藥物組合是通過將具有抗輻射和抗腫瘤血管新生的基因片段克隆到攜帶綠色螢光蛋白的真核表達載體中，並將克隆基因片斷的載體通過電轉化方式轉入到減毒的沙門氏菌中。通過減毒的沙門氏菌株為細菌載體將轉化的基因片斷靶向性地在組織中發揮治療作用。方法簡單、有效，無毒副作用，損傷小，適合長期應用。
文檔編號A61K35/66GK1562375SQ200410018770
公開日2005年1月12日 申請日期2004年3月22日 優先權日2004年3月22日
發明者韓忠朝, 趙麗華, 劉斌 申請人:中國醫學科學院血液學研究所