一種與水稻白葉枯病抗性基因緊密連鎖的分子標記、引物及其應用的製作方法

2024-03-26 04:47:05

一種與水稻白葉枯病抗性基因緊密連鎖的分子標記、引物及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種與水稻白葉枯病抗性基因緊密連鎖的分子標記、引物及其應用，其特徵在於，所述分子標記的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：4所示。所述引物對的引物1的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示，所述引物2的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：3所示。在用於水稻白葉枯病檢測時，通過PCR擴增，若所得PCR擴增產物為98bp鹼基片段，則待測水稻為白葉枯病抗性品種，若所得PCR擴增產物為103bp鹼基片段，則待測水稻為白葉枯病感病品種。本發明方法可以對白葉枯病抗性水稻進行早期世代選擇而縮短育種周期，能夠較快地篩選出抗白葉枯病的水稻材料，可廣泛應用於水稻的輔助育種。
【專利說明】-種與水稻白葉枯病抗性基因緊密連鎖的分子標記、引物 及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬於植物抗病育種【技術領域】，特別涉及用於檢測水稻白葉枯病抗性的方法 和功能特異性分子標記及其應用。

【背景技術】
[0002] 基於表型選擇的常規育種方法存在選擇效率低和育種周期長等缺點，迫切需要注 入現代分子技術手段，輔之於高效率地基因型定向選擇，才能快速高效地培育出優異水稻 新品種。隨著分子生物學和基因組學的迅速發展，分子標記技術的應用更加廣泛。基於PCR 的分子標記如微衛星或SSR(simple sequence repeat)等具有多態率高、相對穩定、檢測方 法簡便快速及易於操作等特點而被廣泛的應用。由於分子標記輔助選擇不易受環境因素影 響和性狀顯隱性幹擾等，可以從分子水平定向選擇目標性狀基因，同時還有可能打破不利 基因之間的連鎖而高效率地聚合多個優良基因於一體。通常所說的分子標記既包括目標基 因的連鎖標記也包括目標基因自身功能標記。分子標記輔助多基因聚合育種技術已經成為 水稻、玉米等作物育種研究的一種發展趨勢，運用該技術能否有效地將優質、多抗和高產等 基因聚合到少數骨幹品種中，關鍵在於能否獲得與目標性狀基因或主效QTL緊密連鎖的實 用分子標記。
[0003] 水稻是世界上最重要的糧食作物，世界半數以上的人口以此為生。由革蘭氏陰性 菌黃單胞桿菌水稻變種（Xanthomonas oryzae pv. Oryzae Xoo)引起的水稻白葉枯病是水 稻生產上危害最大的細菌性病害之一。輕則減產10-20%，重時則達50%，在分櫱期受侵可 導致顆粒無收。白葉枯病最早於1884年在日本福網地區發現50年代以來，發病範圍不斷 擴大，目前白葉枯病的發生範圍已遍及世紀各水稻產區。白葉枯病在亞洲國家比較嚴重， 尤其在我國，從南到北，幾乎各稻區都有分布，一般而言，其災害南方重於北方，秈稻重於粳 稻，雙季晚稻重於雙季早稻，單季中稻重於單季晚稻。
[0004] 水稻白葉枯病抗性遺傳研究開始於20世紀50年代，自上世紀60年代末以來，科 學家們就致力於水稻白葉枯病抗性品種基因的發掘和利用。近20年來，分子生物學技術 的飛速發展及其在植物病理學中的廣泛應用，為水稻抗病基因的研究奠定了堅實的基礎， 新基因的發現、鑑定、定位和克隆不斷完善。目前在不同的水稻資源中已鑑定出多於30個 白葉枯病抗性基因，已經定位的有19個，已克隆的基因有6個，其中xa5基因 （Petpisit V, Khush G S, Kauffinan Η E, et al. Inheritance of Resistance to Bacterial Blight in Rice. Crop Science, 1987, 17 (0):551-554)由 Petpisit 等從水稻品種 DZ192 中鑑定 出來，McCouch研究小組於2004年宣布克隆了這個基因，序列分析表明其編碼產物可能為 TFIIAy小亞基。


【發明內容】

[0005] 本發明目在於提供用於檢測水稻白葉枯病抗性的功能特異性分子標記和方法，採 用本發明方法可以對白葉枯病抗性水稻進行早期世代選擇而縮短育種周期，能夠較快地篩 選出抗白葉枯病的水稻材料，可廣泛應用於水稻的輔助育種。
[0006] 為實現本發明目採用如下技術方案：
[0007] -種與水稻白葉枯病抗性基因 xa5緊密連鎖的分子標記，其特點在於，所述分子 標記的核苷酸序列如SEQ ID N0 :4所示。
[0008] -種擴增如上所述分子標記的引物對，其特點在於，所述引物對的引物1為序列 表SEQ ID N0 :1所示的核苷酸，所述引物對的引物2為SEQ ID N0 :3所示的核苷酸。
[0009] -種檢測水稻白葉枯病抗性的方法，其特點在於，所述方法包括如下步驟：
[0010] (l)PCR擴增：以待測水稻提取的基因組作為DNA擴增模板，以序列表SEQID N0 :1 所示核苷酸、序列表SEQ ID N0 :2所示核苷酸和序列表SEQ ID N0 :3所示核苷酸組成的擴 增引物對進行PCR擴增；
[0011] (2)擴增產物的鑑定：若所得PCR擴增產物為98bp鹼基片段，則待水稻為白葉枯 病抗性品種，若所得PCR擴增產物為103bp鹼基片段，則待測水稻為白葉枯病感病品種。
[0012] 所述步驟（2)中，98bp鹼基片段序列如SEQ ID N0 :4所示；103bp鹼基片段序列如 SEQ ID N0 :5 所示。
[0013] 所述步驟（1)中待測水稻基因組採用鹼煮法提取，具體方法如下：取0. 8 - 1. 2cm 長的水稻葉片，用0. 2Mol/L氫氧化鈉40ml在100°C水浴5分鐘，再加入60ml的0. 17Mol/ Ltris-HCL水浴3分鐘，所得提取液即為待測水稻提取的基因組，4。C冰箱冷卻備用。
[0014] 所述步驟（1)中的PCR擴增的反應體系中包含：含Mg2+的10X Buffer2y 1，10mM 的dNTPO. 4 μ 1，5 μ Μ的序列表SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列、序列表SEQ ID NO :2所示 的核苷酸序列和序列表SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列各2μ1，所述待測玉米提取的基因 組DNA1 μ 1，5U/ μ 1的taq酶0. 5 μ 1，其餘為超純水，反應體積為20 μ 1，滴加一滴礦物油覆 蓋；PCR 反應程序為：94°C 5min ;94°C 45s、56°C 45s, 72°C 45s, 32 個循環；72°C 5min。
[0015] 本發明同時保護所述的與水稻白葉枯病抗性基因緊密連鎖的分子標記在水稻育 種中的應用。
[0016] 本發明相對於現有技術具有如下優點和效果：
[0017] 本發明的方法克服了常規育種中因表型選擇易受環境因素幹擾而導致育種效率 低等問題，可以利用分子標記對水稻白葉枯病抗性基因 xa5進行早期世代選擇而縮短育種 周期，從而較快地篩選出抗白葉枯病的水稻材料。本發明可應用於水稻育種，以提高育種效 率和水稻產量水平。
[0018] 本發明的方法克服了分子標記輔助育種中，由於分子標記和抗白葉枯病基因有一 定的遺傳距離，在育種過程中存在分離的可能性的問題。本發明中的分子標記位點位於抗 性基因的功能位點，與抗性基因緊密連鎖，不會出現分離，可以更有效地提高育種效率。
[0019] 本發明的分子標記擴增採用2個上遊引物和1個下遊引物，其中2個上遊引物的 設計，可以對不同水稻品使用相同的擴增體系和擴增條件，並且能夠通過凝膠電泳區分抗 白葉枯病水稻和不抗白葉枯病水稻，達到快速、直觀檢測的技術效果。
[0020] 本發明中水稻基因組的提取過程簡化操作方便，提高了檢測的效率。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1是本發明實施例擴增抗性品種IRBB60、不抗品種1030以及兩者F2材料的電 泳圖。圖中1為IRBB60,2為1030,3到13為兩者的？ 2材料。

【具體實施方式】
[0022] 以下的實施例便於更好地理解本發明，但並不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均由常 規生化試劑公司購買得到，抗性品種IRBB60來自國際水稻所選育、不抗品種1030為本公司 育種材料。本發明實施例所使用的抗性材料和感病材料僅用於進一步解釋說明本發明技術 方案，並非是對本發明的進一步限定，本發明方法除了可以檢測本實施例所用的抗性品種 和感病品種外，也可以用於其它抗性品種和感病品種的檢測。
[0023] 實施例1、白葉枯病抗性性狀鑑定專用分子標記BYK1的獲得
[0024] 一、序列查找與引物設計
[0025] 通過感病材料IR24和抗病材料IRBB5的雜交，擴大研究群體對xa5基因所在區域 進行重組事件的分析，掃描了 2345株的" IR24X IRBB5"群體，將基因定位於一個開放讀碼 框內，序列分析表明其編碼產物可能為TFIIA γ小亞基，利用軟體Primer Premier5. 0進行 引物設計，命名為BYK1，由正向引物BYK-F1、正向引物BYK-F2和反向引物BYK-R組成，對應 的序列信息分別為 SEQ ID N0. 1、SEQ ID N0. 2 和 SEQ ID N0. 3。
[0026] SEQ ID NO. 1(5,-3,）gccattcaagttcttgag
[0027] SEQ ID NO. 2(5,-3,）agctcgccattcaagttcttgtc
[0028] SEQ ID NO. 3 (5,-3,）aatgaggagtcgaatttttcaa
[0029] 二、引物合成和驗證
[0030] 引物由北京梓熙生物公司合成。以白葉枯病抗性品種IRBB60、不抗白葉枯病水 稻品種1030以及兩者的雜交種F 2為擴增對象。分子標記BYK1的PCR擴增條件：20μ 1 反應體系中包括PCR反應體系為：含Mg2+的10Χ Buffer2y 1，dNTPO. 4μ l(10mM)，正向 引物BYK-F 1、正向引物BYK-F2和反向引物BYK-R3條各0.15μΜ的引物5μΜ)，基因組 DNAly l，Taq酶0. 5μ 1(5U)，其餘為超純水，反應體積為20μ 1，滴加一滴礦物油覆蓋。PCR 反應程序為：94°C 5min ;94°C 60s、53. 5°C 60s, 72°C 60s, 35 個循環；72°C 10min。
[0031] PCR擴增產物用6%聚丙烯醯胺凝膠電泳分析，快速銀染法染色並觀察拍照。結果 BYK得到清晰的電泳圖，見圖1。
[0032] 實施例2、BYK引物對的擴增產物與抗性性狀的相關性驗證
[0033] 以抗白葉枯病材料IRBB60和不抗白葉枯病材料1030做親本，兩者雜交後的96個 F2代材料為試驗對象。採用鹼煮法提取水稻葉片的基因組DNA，以BYK1引物對進行PCR擴增 實驗。PCR 反應體系為：含 Mg2+的 10X Buffer2y l，dNTP0.4y l(10mM)，正向引物 BYK-F1、 正向引物8￥1(42和反向引物8￥1(-1?3條各0.15 4 1的引物5 4河），基因組0嫩14 1，了&9酶 0. 5 μ 1 (5U/μ 1)，其餘為超純水，反應體積為20 μ 1，滴加一滴礦物油覆蓋。PCR反應程序 為：94°C 5min ;94°C 60s、53. 5°C 60s, 72°C 60s, 35 個循環；72°C 10min。（以上反應試劑除 水稻基因組以外，均由市場購買獲得）
[0034] 本發明也可以採用其他現有技術獲得水稻葉片基因組。
[0035] PCR擴增產物用6%聚丙烯醯胺凝膠電泳分析，快速銀染法染色並觀察拍照記錄， 見圖2所示。其中純合的103bp的22株，純合98bp的24株，雜合帶型的50株。
[0036] 供試稻白葉枯病菌株為經提純的I、II、III、IV和V等5個生理小種代表菌株，由 安徽農業大學提供。於水稻成株期，人工剪葉方法接菌，菌齡72h，菌液濃度3億個細菌/ml， 接種後21d參照方中達等（1990)的分級標準調查病級，每株調查2-3片葉子。抗感類型的 劃分標準見表1。
[0037] 分析如下：供試水稻樣本中存在純合98bp的24株，22株表現為中抗以上，有2株 為感病；而不帶有98bp片段的22個材料中20株感病，有2株中抗；雜合的50株，46株表 現為不抗，4株抗病；兩者的一致性達到91. 6%。見表2。因此，BYK1是與水稻白葉枯病抗 性性狀相關位點相緊密連鎖的功能標記，可用於水稻分子輔助育種。
[0038] 表1 :水稻白葉枯病抗性分級標準
[0039] 抗感_準分級 抗感級別 ?ΚΚ.度 0 ( I) 0-0. 2 1 (1110 0.3-1.5 3 (MR) 1.6-3. 0 5 (MS) 3·Κδ. 0 ? (S) δ. 0-10.0 9 (IIS) 10·0以 Ι·.
[0040] 註：1、HR、MR、MS、S和HS分別表示免疫、
[0041] 高抗、中抗、感病和高感，病斑長度單位為cm。
[0042] 表2 :BYK1擴增產物鑑定結果與田間白葉枯病接種試驗對照
[0043] _擴增片段|室內分τ鑑記|川_接種鑑定|兩#比較 98hp 2.丨株 22株抗，2株感| ---1兩者…致件 103bp/98bp 50株 46株感，4株抗丨 ---!達到91.6% ]03bp 22株 20株感，2株抗j
[0044]
[0045] 序列表 +α io>+iTtl l:.樂種、丨卩股份iiW公-n'J '種1 .J冰稻Π 葉枯病抗性+?W緊密迮鎖_分〗Η小'丨d、引物及.R:.Kv: 1丨| <130〉 <160)5 <170'-P<itentIn version 3.1 1 ::211 :> 18 Ι)ΧΛ ?';213>人Γ.序列 ：220> primer hind \222：> (1) .. (IB) ..:.100/1 gucattcaag ttuttgag 18 <210/2 23 1)ΧΛ 人丨:序列 primer bind ^222/ (1) .. (23)
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【權利要求】
1. 一種與水稻白葉枯病抗性基因 xa5緊密連鎖的分子標記，其特徵在於，所述分子標 記的核苷酸序列如SEQ ID NO :4所示。
2. -種擴增權利要求1所述分子標記的引物對，其特徵在於，所述引物對的引物1的核 苷酸序列如SEQ ID NO :1所示，所述引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示。
3. -種檢測水稻白葉枯病抗性的方法，其特徵在於，所述方法包括如下步驟： (1) PCR擴增：以待測水稻提取的基因組作為DNA擴增模板，以序列表SEQ ID NO : 1所 示核苷酸、序列表SEQ ID NO :2所示核苷酸和序列表SEQ ID NO :3所示核苷酸組成的擴增 引物對進行PCR擴增； (2) 擴增產物的鑑定：若所得PCR擴增產物為98bp鹼基片段，則待測水稻為白葉枯病 抗性品種，若所得PCR擴增產物為103bp鹼基片段，則待測水稻為白葉枯病感病品種。
4. 根據權利要求3所述的一種檢測水稻白葉枯病抗性的方法，其特徵在於，所述步驟 (2)中，98bp鹼基片段序列如SEQ ID N0:4所示；103bp鹼基片段序列如SEQ ID N0:5所 /_J、1 ο
5. 根據權利要求3所述的一種檢測水稻白葉枯病抗性的方法，其特徵在於，所述步驟 (1)中待測水稻基因組採用鹼煮法提取，具體方法如下：取0. 8 - 1. 2cm長的水稻葉片，用 0· 2Mol/L氫氧化鈉40ml在100°C水浴5分鐘，再加入60ml的0· 17Mol/Ltris-HCL水浴3 分鐘，所得提取液即為待測水稻提取的基因組，4°C冰箱冷卻備用。
6. 根據權利要求3所述一種檢測水稻白葉枯病抗性的方法，其特徵在於，所述步驟（1) 中的PCR擴增的反應體系中包含：含Mg2+的10X Buffer 2 μ 1，10mM的dNTP 0· 4 μ 1，5 μ Μ 的序列表SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列、序列表SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列和序列 表SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列各2 μ 1，所述待測玉米提取的基因組DNA 1 μ 1，5U/ μ 1 的taq酶0. 5 μ 1，其餘為超純水，反應體積為20 μ 1，滴加一滴礦物油覆蓋；PCR反應程序 為：94°C 5min ;94°C 45s、56°C 45s, 72°C 45s, 32 個循環；72°C 5min。
7. 權利要求1所述的一種與水稻白葉枯病抗性基因緊密連鎖的分子標記在水稻育種 中的應用。
【文檔編號】C12N15/11GK104087578SQ201410320538
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月7日 優先權日:2014年7月7日
【發明者】朱先飛, 徐繼萍, 蔣繼武, 陳慶全, 王兆賢, 周桂林, 徐劍, 汪大海, 陳滿元, 唐照銳 申請人:合肥豐樂種業股份有限公司