焦磷酸測序技術檢測大豆過敏原成分的引物和方法
2023-05-05 11:56:36
焦磷酸測序技術檢測大豆過敏原成分的引物和方法
【專利摘要】本發明公開了一種焦磷酸測序技術檢測大豆過敏原成分的引物和方法，正向引物序列為SEQ?ID?NO1；反向引物序列為SEQ?ID?NO2；測序引物序列為SEQ?ID?NO3；方法包括下列步驟：首先依據大豆GlymBd30K基因設計特異性PCR引物和焦磷酸測序引物；再提取待測樣品的DNA，然後分別以GlymBd30K基因的特異性引物進行PCR擴增；用瓊脂糖凝膠電泳對擴增產物進行檢測，若引物擴增片段長度為188bp，則製備焦磷酸測序單鏈模板，再進行焦磷酸測序反應，最後根據PCR擴增結果和焦磷酸測序結果來判定樣品中是否含有過敏原成分。本發明所建立的大豆過敏原基因GlymBd30K焦磷酸測序方法能夠快速對目的基因進行測序，具有較高的特異性；該方法具有快速、穩定性好、靈敏、特異性高的特點。
【專利說明】焦磷酸測序技術檢測大豆過敏原成分的引物和方法
[0001]【技術領域】:
本發明屬於食源性過敏原的檢測【技術領域】，涉及一種採用焦磷酸測序iPyrosequencing)技術檢測大豆蛋白過敏原的方法。
[0002]【背景技術】:
世界糧農組織(FAO) 1995年報告，90%以上的食物過敏是由牛奶、雞蛋、魚、貝殼海產品、花生、大豆、堅果類和小麥引起。大豆蛋白屬於8類主要致過敏食物之一，大豆是人類主要的蛋白來源之一。大豆蛋白在食品加工業的廣泛應用，給大豆敏感人群帶來了一定的食物安全問題。
[0003]GlymBd 30K也稱為P34，是半胱氨酸蛋白酶的木瓜蛋白酶超家族的一個邊緣成員。Ogawa等的與IgE結合試驗中表明，超過65%以上對大豆敏感的病人僅對GlymBd 30K蛋白過敏，即使是種子的一小部分(小於總種子蛋白的1% )，因此GlymBd 30K蛋白被視為大豆蛋白中一個重要的免疫顯性過敏原。早在1998年Takano T就在NCBI資料庫中提交了大豆Gly mBd 30K的DNA序列(AB013289)，而2006年SchmidtM A在NCBI的核酸資料庫中提交了大豆GlymBd 30K的mRNA序列(DQ324851)。目前國內關於大豆過敏原成分的研究報導很少，本發明首次建立大豆GlymBd 30K基因的焦磷酸測序快速檢測方法，將為我國進出口大豆及其製品的過敏原快速檢測提供很好的技術支撐。
[0004]
【發明內容】
:
本發明所要解決的技術問題是提供一種大豆GlymBd 30K基因的焦磷酸測序技術檢測確證方法，以克服現有檢測技術的不足。
[0005]為解決上述技術問題，本發明的主要原理是利用焦磷酸測序技術，通過測序引物和聚合酶鏈式反應擴增單鏈脫氧核糖核酸模板雜交，與脫氧核糖核酸聚合酶、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)硫酸化酶、螢光素酶、三磷酸腺苷雙磷酸酶和底物(APS)、螢光素孵育，逐一加入四種三磷酸鹼基脫氧核苷酸(dNTPs):三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸dATP、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸dTTP、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸dCTP、三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸dGTP，如與模板配對，此三磷酸鹼基脫氧核苷酸與引物的末端形成共價鍵，釋放焦磷酸基團(PPi);腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)硫酸化酶在底物(APS)存在的情況下催化焦磷酸形成腺嘌呤核苷三磷酸，腺嘌呤核苷三磷酸驅動螢光素酶介導的螢光素向氧化螢光素轉化，氧化螢光素髮出與腺嘌呤核苷三磷酸量成正比的可見光信號；光信號由電荷耦合器件(CCD)收集並由軟體轉化為峰；每個光信號的峰高與反應中摻入的核苷酸數目成正比，腺嘌呤核苷三磷酸和未摻入的三磷酸鹼基脫氧核苷酸由三磷酸腺苷雙磷酸酶降解，淬滅光信號，並再生反應體系，利用光信號轉化得到的峰圖，對樣品中的目標基因進行準確的檢測。
[0006]一種焦磷酸測序技術檢測大豆過敏原成分的方法，包括下列步驟:
首先依據大豆GlymBd 30K基因設計特異性引物及焦磷酸測序引物；再提取待測樣品的脫氧核糖核酸(DNA)，然後分別以GlymBd 30K基因的特異性引物進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增；用瓊脂糖凝膠電泳對擴增產物進行檢測，若引物擴增片段長度為188bp，則製備焦磷酸測序單鏈模板，再進行焦磷酸測序反應，最後根據PCR擴增結果和焦磷酸測序結果來判定樣品中是否含有過敏原。
[0007]設計的焦磷酸測序技術檢測大豆過敏原成分的引物:
正向引物序列為 SEQ ID NO 1:5』 - GCGGATGGTGTAGATTACTGGA -3』 ；
反向引物序列為SEQ ID NO 2:5』 - ACCTTTAACGCGAGCAGACA _3，;5，進行生物素標記。
[0008]測序引物序列為SEQ ID NO 3:5』 - CAAAGAAACACGGGTAA -3』。 [0009]大豆過敏原GlymBd 30K 基因的目標序列為 SEQ ID NO 4:TTTATTAGGAGTGTGTGGGATGAATTATTTGCTCACTACCC ;擴增片段長度為 188bp ；
具體包括下列步驟:
(一)DNA模板的製備
樣品處理:取大豆等試驗材料，用滅菌潔淨研缽或合適的粉碎裝置將樣品充分研磨混勾備用；
DNA模板的提取:取200 mg樣品於50 mL離心管中，加入5 mL CTAB提取緩衝液和20 μ L蛋白酶K溶液，充分混勻；65 °C振蕩過夜後，13 000 g離心20 min，轉移上清液700 μ L至新的離心管中；加入700 μ L三氯甲燒後用力振蕩，13 000 g離心5 min,將上清轉移到新的2 mL印pendorf離心管中；加入2倍體積的CTAB沉澱液，室溫靜置60 min, 13 000 g離心5 min,棄去上清；加入350 μ L NaCl溶液將沉澱進行懸浮,再加入350 UL三氯甲烷，渦旋振蕩進行混勻，13 000 g離心10 min。轉移上清到新的2 mL印pendorf離心管中後加入0.8倍體積的異丙醇，室溫放置60 min, 13 000 g離心10min，棄去上清；加入500 μ L 70%乙醇溶液洗滌沉澱，溶解於100 μ L TE溶液中，立即使用或-20 1:保存備用；
(二)PCR擴增
PCR反應體系:2 XGoTaq Master Mix 25 μ L，生物素標記上遊引物和下遊引物各10pmoL, DNA模板2 μ L，加無菌去離子水至50 μ L ;擴增反應參數:94°C預變性5 min，94°C變性20 s，58°C退火30 s，72°C延伸20 S，50個循環，72 °C延伸5 min, 4 °C保溫；取反應產物5 μ L上樣，2%瓊脂糖凝膠電泳觀察結果，其餘擴增產物用於焦磷酸測序；
(三)焦磷酸測序
將PCR產物轉移至96孔PCR板中，在產物中分別加入Sepharose beads 3 μ L和Binding Buffer 47 μ L,常溫混勻 10 min ；
打開真空泵，將磁珠抓取臂(Vacuum Prep T001)在超純水中清洗30s後移到96孔PCR板中，抓取磁珠,分別在70%乙醇中清洗5~10s、Denaturation Buffer中變性5 S、Washing Buffer中清洗5~10s,關閉真空泵,將磁珠釋放入96孔測序板中，該板中預先加入測序引物 0.3 μ mol/L 和 Annealing Buffer 共 45 μ L ;
將96孔測序板置80 °C溫箱2 min,冷卻至室溫後進行焦磷酸測序反應，設定程序，鹼基的加入為ATCG 6-10個重複，根據程序給定劑量(該劑量根據樣本數的多少而定，由儀器程序自動給出)，在試劑艙中加入酶混合物、底物混合物以及四種dNTP，將試劑艙和96孔測序板放入機箱中進行反應。
[0010]本發明所建立的大豆過敏原基因Glym Bd 30K焦磷酸測序方法能夠快速對目的基因進行測序，尚未出現假陽性和假陰性結果。具有較高的特異性；該方法具有快速、穩定性好、靈敏、特異高的特點。焦磷酸測序技術作為一種短片段測序方法，操作簡單方便，可程序化，能夠很好地保證測序結果的穩定性和準確性，另外該方法檢測速度快，40 min內即可準確、實時的測定出96個樣品目的片段的基因序列，可滿足快速檢測的需求，具有不可替代的作用。
[0011]【專利附圖】
【附圖說明】:
圖1為本發明實施例1 PCR擴增引物特異性實驗結果電泳圖，圖中，1:綠豆；2:赤豆；3 工豆；4:蠶豆；5:50 bp ladder marker ；6:大豆；7:芸豆；8:扁豆；9:花生；10:豌豆。
[0012]圖2為本發明實施例1特異性實驗中焦磷酸測序結果圖。
[0013]圖3為本發明實施例2實驗結果電泳圖，圖中，M:100 bp ladder marker ；1為大醜中黃57樣品。
[0014]圖4為本發明實施例2實驗結果焦磷酸測序結果圖。
[0015]圖5為本發明實施例3實驗結果電泳圖，圖中,M:50 bp ladder marker ;I為樣品維維牌維他型豆奶粉。
[0016]圖6為本發明實施例3實驗結果焦磷酸測序結果圖。
[0017]【具體實施方式】:
下面通過具體實施例並結合附圖進一步闡述本發明。
[0018]實施例1:PCR擴增引物特異性實驗
(I)樣品材料:從青島市撫順路批發市場購買綠豆、赤豆、豇豆、蠶豆、大豆、芸豆、扁豆、花生、豌豆。
[0019](2) DNA模板的製備
樣品處理:取IOOg大豆等試驗材料，用滅菌潔淨研缽或合適的粉碎裝置將樣品充分研磨混勻備用；
DNA模板的提取:取200 mg樣品於50 mL離心管中，加入5 mL CTAB提取緩衝液和20 μ L蛋白酶K溶液，充分混勻；65 °C振蕩過夜後，13 000 g離心20 min，轉移上清液700 μ L至新的離心管中；加入700 μ L三氯甲燒後用力振蕩，13 000 g離心5 min,將上清轉移到新的2 mL印pendorf離心管中；加入2倍體積的CTAB沉澱液，室溫靜置60 min, 13 000 g離心5 min,棄去上清；加入350 μ L NaCl溶液將沉澱進行懸浮,再加入350 UL三氯甲烷，渦旋振蕩進行混勻，13 000 g離心10 min。轉移上清到新的2 mL印pendorf離心管中後加入0.8倍體積的異丙醇，室溫放置60 min, 13 000 g離心10min，棄去上清；加入500 μ L 70%乙醇溶液洗滌沉澱，溶解於100 μ L TE溶液中，立即使用或-20 1:保存備用；
(3) PCR擴增
PCR反應體系:2 XGoTaq Master Mix 25 μ L，生物素標記上遊引物和下遊引物各10pmoL, DNA模板2 μ L，加無菌去離子水至50 μ L ;擴增反應參數:94°C預變性5 min，94°C變性20 s，58°C退火30 s，72°C延伸20 S，50個循環，72 °C延伸5 min, 4 °C保溫；取反應產物5 μ L上樣，2%瓊脂糖凝膠電泳觀察結果，其餘擴增產物用於焦磷酸測序；
擴增結果見圖1，結果表明只有大豆能夠有效擴增出目的片斷，其餘豆類樣品無特異性片斷出現。
[0020](4)焦磷酸測序
將大豆的PCR產物轉移至96孔PCR板中，在產物中分別加入Seharose beads 3 μ L和 Binding Buffer 47 μ L,常溫混勻 10 min ；
打開真空泵，將磁珠抓取臂(Vacuum Prep T001)在超純水中清洗30s後移到96孔PCR板中，抓取磁珠,分別在70%乙醇中清洗5~10s、Denaturation Buffer中變性5 S、Washing Buffer中清洗5~10s,關閉真空泵,將磁珠釋放入96孔測序板中，該板中預先加入測序引物 0.3 μ mol/L 和 Annealing Buffer 共 45 μ L ;
將96孔測序板置80 °C溫箱2 min,冷卻至室溫後進行焦磷酸測序反應，設定程序，鹼基的加入為ATCG 6-10個重複，根據程序給定劑量(該劑量根據樣本數的多少而定，由儀器程序自動給出)，在試劑艙中加入酶混合物、底物混合物以及四種dNTP，將試劑艙和96孔測序板放入機箱中進行反應。
[0021]焦磷酸測序結果見圖2。 [0022]測序結果為TTTATTAGGAGTGTGTGGGATGAATTATTTGCTCACTACCC，與預期一致能夠有效測出目標序列，並鑑定出含有大豆過敏原成分。
[0023]實施例2:檢測某一大豆樣品中是否含有大豆過敏原成分
(I)樣品材料:從青島團島農貿市場購買大? (品種為中黃57) 500g。
[0024](2) DNA模板的製備
樣品處理:取100 g大豆，用滅菌潔淨研缽或合適的粉碎裝置將樣品充分研磨混勻備
用；
DNA模板的提取:取200 mg樣品於50 mL離心管中，加入5 mL CTAB提取緩衝液和20 μ L蛋白酶K溶液，充分混勻；65 °C振蕩過夜後，13 000 g離心20 min，轉移上清液700 μ L至新的離心管中；加入700 μ L三氯甲燒後用力振蕩，13 000 g離心5 min,將上清轉移到新的2 mL印pendorf離心管中；加入2倍體積的CTAB沉澱液，室溫靜置60 min, 13 000 g離心5 min,棄去上清；加入350 μ L NaCl溶液將沉澱進行懸浮,再加入350 UL三氯甲烷，渦旋振蕩進行混勻，13 000 g離心10 min。轉移上清到新的2 mL印pendorf離心管中後加入0.8倍體積的異丙醇，室溫放置60 min, 13 000 g離心10min，棄去上清；加入500 μ L 70%乙醇溶液洗滌沉澱，溶解於100 μ L TE溶液中，立即使用或-20 1:保存備用；
(3)PCR擴增
PCR反應體系:2 XGoTaq Master Mix 25 μ L，生物素標記上遊引物和下遊引物各10pmoL, DNA模板2 μ L，加無菌去離子水至50 μ L ;擴增反應參數:94°C預變性5 min，94°C變性20 s，58°C退火30 s，72°C延伸20 S，50個循環，72 °C延伸5 min, 4 °C保溫；取反應產物5 μ L上樣，2%瓊脂糖凝膠電泳觀察結果，其餘擴增產物用於焦磷酸測序。
[0025]擴增結果見圖3，結果表明大豆中黃57能夠有效擴增出特異性片斷。
[0026](4)焦磷酸測序
將大豆中黃57的PCR產物轉移至96孔PCR板中，在產物中分別加入S^harose beads3 μ L 和 Binding Buffer 47 μ L,常溫混勻 10 min ；
打開真空泵，將磁珠抓取臂(Vacuum Prep T001)在超純水中清洗30s後移到96孔PCR板中，抓取磁珠,分別在70%乙醇中清洗5~10s、Denaturation Buffer中變性5 S、Washing Buffer中清洗5~10s,關閉真空泵,將磁珠釋放入96孔測序板中，該板中預先加入測序引物 0.3 μ mol/L 和 Annealing Buffer 共 45 μ L ;將96孔測序板置80 °C溫箱2 min,冷卻至室溫後進行焦磷酸測序反應，設定程序，鹼基的加入為ATCG 6-10個重複，根據程序給定劑量(該劑量根據樣本數的多少而定，由儀器程序自動給出)，在試劑艙中加入酶混合物、底物混合物以及四種dNTP，將試劑艙和96孔測序板放入機箱中進行反應。
[0027]焦磷酸測序結果見圖4。[0028]測序結果為TTTATTAGGAGTGTGTGGGATGAATTATTTGCTCACTACCC，能鑑定出此樣品含有大豆過敏原成分。
[0029]實施例3:超市購買樣品檢驗是否含有大豆過敏原成分
(O樣品材料:從青島雙星利客來超市購買維維牌維他型豆奶粉I袋(生產代碼201306025275H)。
[0030](2) DNA模板的製備
DNA模板的提取:取200 mg樣品於50 mL離心管中，加入5 mL CTAB提取緩衝液和20 μ L蛋白酶K溶液，充分混勻；65 °C振蕩過夜後，13 000 g離心20 min，轉移上清液700 μ L至新的離心管中；加入700 μ L三氯甲燒後用力振蕩，13 000 g離心5 min,將上清轉移到新的2 mL印pendorf離心管中；加入2倍體積的CTAB沉澱液，室溫靜置60 min, 13 000 g離心5 min,棄去上清；加入350 μ L NaCl溶液將沉澱進行懸浮,再加入350 UL三氯甲烷，渦旋振蕩進行混勻，13 000 g離心10 min。轉移上清到新的2 mL印pendorf離心管中後加入0.8倍體積的異丙醇，室溫放置60 min, 13 000 g離心10min，棄去上清；加入500 μ L 70%乙醇溶液洗滌沉澱，溶解於100 μ L TE溶液中，立即使用或-20 1:保存備用；
(3)PCR擴增
PCR反應體系:2 XGoTaq Master Mix 25 μ L，生物素標記上遊引物和下遊引物各10pmoL, DNA模板2 μ L，加無菌去離子水至50 μ L ;擴增反應參數:94 °C預變性5 min, 94°C變性20 S，58 °C退火30 s，72°C延伸20 S，50個循環，72 °C延伸5 min, 4 °C保溫；取反應產物5 UL上樣，2%瓊脂糖凝膠電泳觀察結果，其餘擴增產物用於焦磷酸測序。
[0031]擴增結果見圖5，結果表明維他型豆奶粉中能夠有效擴增出特異性片斷。
[0032](4)焦磷酸測序
將維維牌維他型豆奶粉的PCR產物轉移至96孔PCR板中，在產物中分別加入Sepharose beads 3 μ L 和 Binding Buffer 47 μ L,常溫混勻 10 min ；
打開真空泵，將磁珠抓取臂(Vacuum Prep T001)在超純水中清洗30s後移到96孔PCR板中，抓取磁珠,分別在70%乙醇中清洗5~10s、Denaturation Buffer中變性5 S、Washing Buffer中清洗5~10s,關閉真空泵,將磁珠釋放入96孔測序板中，該板中預先加入測序引物 0.3 μ mol/L 和 Annealing Buffer 共 45 μ L ;
將96孔測序板置80 °C溫箱2 min,冷卻至室溫後進行焦磷酸測序反應，設定程序，鹼基的加入為ATCG 6-10個重複，根據程序給定劑量(該劑量根據樣本數的多少而定，由儀器程序自動給出)，在試劑艙中加入酶混合物、底物混合物以及四種dNTP，將試劑艙和96孔測序板放入機箱中進行反應。
[0033]焦磷酸測序結果見圖6。
[0034]測序結果為TTTATTAGGAGTGTGTGGGATGAATTATTTGCTCACTACCC，表明維他型豆奶粉.含有大豆過敏原成分。
【權利要求】
1.一種焦磷酸測序技術檢測大豆過敏原成分的引物，其特徵在於: 正向引物序列為SEQ ID NO I ； 反向引物序列為SEQ ID NO 2 ； 測序引物序列為SEQ ID NO 3。
2.一種焦磷酸測序技術檢測大豆過敏原成分的方法，其特徵在於，包括下列步驟: 首先依據大豆GlymBd 30K基因設計特異性引物及焦磷酸測序引物；再提取待測樣品的脫氧核糖核酸(DNA)，然後分別以GlymBd 30K基因的特異性引物進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增；用瓊脂糖凝膠電泳對擴增產物進行檢測，若引物擴增片段長度為188bp，則製備焦磷酸測序單鏈模板，再進行焦磷酸測序反應，最後根據PCR擴增結果和焦磷酸測序結果來判定樣品中是否含有過敏原；大豆過敏原GlymBd 30K基因PCR及測序引物為: 正向引物序列為SEQ ID NO I ； 反向引物序列為SEQ ID NO 2 ;5』進行生物素標記； 測序引物序列為SEQ ID NO 3 ； 大豆過敏原GlymBd 30K基因的目標序列為SEQ ID NO 4 ;擴增片段長度為188bp ； 具體包括下列步驟: (一)DNA模板的製備 樣品處理:取大豆等試驗 材料，用滅菌潔淨研缽或合適的粉碎裝置將樣品充分研磨混勾備用； DNA模板的提取:取200 mg樣品於50 mL離心管中，加入5 mL CTAB提取緩衝液和20 μ L蛋白酶K溶液，充分混勻；65 °C振蕩過夜後，13 000 g離心20 min，轉移上清液700 μ L至新的離心管中；加入700 μ L三氯甲燒後用力振蕩，13 000 g離心5 min,將上清轉移到新的2 mL印pendorf離心管中；加入2倍體積的CTAB沉澱液，室溫靜置，60 min, 13 000 g離心5 min,棄去上清；加入350 μ L NaCl溶液將沉澱進行懸浮,再加Λ 350 μ L三氯甲烷，渦旋振蕩進行混勻，13 000 g離心10 min ;轉移上清到新的2 mL印pendorf離心管中後加入0.8倍體積的異丙醇，室溫放置60 min, 13 000 g離心10min，棄去上清；加入500 μ L 70%乙醇溶液洗滌沉澱，溶解於100 μ L TE溶液中，立即使用或-20 1:保存備用； (二)PCR擴增 PCR反應體系:2 XGoTaq Master Mix 25 μ L，生物素標記上遊引物和下遊引物各10pmoL, DNA模板2 μ L，加無菌去離子水至50 μ L ;擴增反應參數:94°C預變性5 min，94°C變性20 s，58°C退火30 s，72°C延伸20 S，50個循環，72 °C延伸5 min, 4 °C保溫；取反應產物5 μ L上樣，2%瓊脂糖凝膠電泳觀察結果，其餘擴增產物用於焦磷酸測序； (三)焦磷酸測序 將PCR產物轉移至96孔PCR板中，在產物中分別加入Sepharose beads 3 μ L和Binding Buffer 47 μ L,常溫混勻 10 min ； 打開真空泵，將磁珠抓取臂(Vacuum Prep T001)在超純水中清洗30s後移到96孔PCR板中，抓取磁珠,分別在70%乙醇中清洗5~10s、Denaturation Buffer中變性5 S、Washing Buffer中清洗5~10s,關閉真空泵,將磁珠釋放入96孔測序板中，該板中預先加入測序引物 0.3 μ mol/L 和 Annealing Buffer 共 45 μ L ;將96孔測序板置80 °C溫箱2 min,冷卻至室溫後進行焦磷酸測序反應，設定程序，鹼基的加入為ATCG 6-10個重複，根據程序給定劑量(該劑量根據樣本數的多少而定，由儀器程序自動給出)，在試劑艙中加入酶混合物、底物混合物以及四種dNTP，將試劑艙和96孔測序板放入機箱 中進行反應。
【文檔編號】C12Q1/68GK103468821SQ201310452643
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月29日 優先權日:2013年9月29日
【發明者】房保海, 金瑩, 賈俊濤, 姜英輝, 孫濤, 譚樂義, 王妍婷, 雷質文 申請人:山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心