大熊貓西氏蛔蟲抗原的製備及其應用的製作方法

2023-05-05 15:06:16 1

專利名稱：：大熊貓西氏蛔蟲抗原的製備及其應用的製作方法
技術領域：
：本發明屬蛔蟲的防治及其檢測領域，尤其涉及到大熊貓西氏蛔蟲的製備及其應用。
背景技術：
：大熊貓蛔蟲病的病原為西氏蛔蟲(Ascar/s■scZ/roeofen')。蛔蟲通常寄生於小腸.但在口腔、喉頭、氣管及胃內亦曾有發現，也可鑽進與腸管相通的管道如胰管、膽管內，引起阻塞及炎症.甚至導致死亡.學者馮文和解剖33具野外大熊貓屍體，對其死亡原因作了分析野生大熊貓感染蛔蟲為100%，大熊貓感染蛔蟲的直接、間接死亡率為66.67%，嚴重危及大熊貓物種的生存。由於蛔蟲病症狀表現不一，蛔蟲對大熊貓的危害根據其產生數量可分為三類第一為感染蟲體數較少，約100條以下，表現為大熊貓營養不良，尤其是表現為生長發育遲緩。第二為中度感染蟲數，約100300條，大熊貓表現為營養不良性消瘦、貧血、厭食、腹瀉、腹痛或腸道功能紊亂等症狀。第三為重度感染，蟲數在300條以上。蛔蟲寄生後引起併發症，如腸炎、腸梗阻、腸穿孔、異位寄生可致肝壞死、胰腺出血性壞死、肺炎等，直接威脅大熊貓的生命(張華，張再歷.大熊貓蛔蟲病的診治，甘肅畜牧獸醫，2002(6):25-26.)。感染大熊貓蛔蟲的診斷常用糞便直接塗片法或飽和鹽水漂浮法等方法。但由於蛔蟲的特殊生活史，其通過糞便檢査檢出蟲卵時，往往宿主已經被幼蟲在體內的移行而危害了大熊貓的機體。相對其它蟲種來說，蛔蟲的免疫診斷技術研究較少。因此蛔蟲的早期診斷顯得尤為重要。由於對宿主感染蛔蟲後引起的免疫研究，有學者提出了大熊貓蛔蟲感染的早期診斷、流行病學調查以及血清學方法考核防治效果的問題，蛔蟲感染的免疫診斷應該受到重視(馮漢利.博士論文.蘇雲金桿菌晶體蛋白對豬蛔蟲的作用及豬蛔蟲重組As37蛋白的免疫保護研究)。現代分子生物學技術的發展為蛔蟲疫苗的研製展示了廣闊的前景。因此如何利用分子生物學與免疫學的方法對大熊貓西氏蛔蟲進行防疫或篩選出抗原疫苗在野外快速檢測寄生蟲等引起的疾病，也是大熊貓疾病防治的重要課題之一。本發明的目的是公開一種大熊貓西氏蛔蟲抗原的製備及其應用。
發明內容實現本發明目的的技術方案是這樣的一種大熊貓西氏蛔蟲抗原的製備及其應用，其特徵在於大熊貓西氏蛔蟲抗原按照下述步驟製備(1)以大熊貓蛔蟲成蟲或二期幼蟲為模板，用RNA試劑盒法提取大熊貓蛔蟲總RNA。(2)根據豬蛔蟲的抗原基因序列設計大熊貓蛔蟲Bs-Agl、Bs-Ag2和Bs-Ag3基因引物，所述引物對的序列(以BS-Agl基因為例)上遊5，-CGCGGATCCCAAGGACCTCAAGGACCACCAC—3，(含"a/zz/Wll切位點)；下遊引物5，-CCCMGCTTCTAGCCTTGCATCTCTTTTTG—3，(含幼V^/J7酶切位點)，(3)採用RT-PCR法將大熊貓總RNA逆轉錄合成cDNA，再以cDNA為模板進行PCR擴增，擴增出目的產物Bs-Agl、Bs-Ag2和Bs-Ag3基因。(4)將回收純化的目的產物直接與pMD18-T載體連接後，轉化至受體細胞大腸桿菌K-12的衍生菌DH5a。感受態細菌，經含有氨苄青黴素的平板篩選培養，培養於3mlLB培養基中，培養14一16h後，取2u1培養的重組克隆菌液為模板，經過菌落PCR鑑定，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。選取陽性重組克隆，小規模擴大培養後，進行測序。所述的大熊貓西氏蛔蟲抗原的製備及其應用，其特徵在於大熊貓西氏蛔蟲抗原經測序結果其抗原基因為Bs-Agl基因、Bs-Ag2基因、Bs-Ag3基因三個基因(基因序列見基因序列表圖1)。所述的大熊貓西氏蛔蟲抗原的製備及其應用，其特徵在於構建大熊貓西氏蛔蟲抗原重組蛋白的原核表達載體，進行重組質粒PET28a(+)-Bs-Agl、PET28a(+)-Bs-Ag2和PET32a(+)-Bs-Ag3的構建，包括如下步驟(以PET28a(+)-Bs-Agl為例)(1)將測序正確的陽性菌經培養後，離心去沉澱抽提PET28a(+)質粒，用5^22/7/和歷/^////在37'C酶切2h，回收大片段與純化後的Bs-Agl基因；用fe/zz^/和歷V7c/i7/進行雙酶切後，回收酶切產物中Bs-Agl基因進行連接反應。(2)誘導表達和重組蛋白的純化，將測序正確的重組質粒，轉化到大腸桿菌BL21感受態細胞，根據表達的觀察結果，進行蛋白的大量表達，收集誘導表達菌。收集表達菌離心，用緩衝液(0.5mmol/LNaCl，20mmol/LTris-HClpH8.0)進行懸浮，加入溶菌酶至100wg/ml，細胞懸液放在一20。C冰箱20min後，取出溶解經超聲裂解後，依次用含O、2、4mol/L尿素的lX結合蛋白緩衝液(5腿ol/L咪唑，0.5腿ol/LNaCl，20面ol/LTris-HC1pH8.O)洗滌沉澱；隨後用含8mol/L尿素的1X結合蛋白緩衝液重懸沉澱，冰上放置lh，使包涵體蛋白完全溶解；16000Xg離心30min去除不可溶物，以孔徑O.45wm的NC膜過濾收集上清液。經His結合樹脂純化，以緩衝液(6mol/L尿素，60mmol/L咪唑，0.5mol/LNaCl，20mmol/LTris-HC1pH8.0)洗去雜蛋白，以洗脫液(6mol/L尿素，lmol/L咪唑，0.5mol/LNaCl，20mmol/LTris-HClpH8.0)洗脫目的蛋白。將純化的重組蛋白於4。C分別在含4mol/L、2mol/L尿素的PBS及PBS溶液中依次進行透析，將溶液置於-2(TC保存。所述的大熊貓西氏蛔蟲抗原的製備及其應用，其特徵還在於分別將純化的重組蛋白Bs-Agl、Bs-Ag2和Bs-Ag3與弗氏完全佐劑l:l混和皮下接種免疫小白鼠，基礎免疫後進行兩次加強免疫，並在最後一次免疫後一周對小白鼠攻蟲，7天後殺小白鼠取其肝、肺臟，經貝爾曼法收集幼蟲，記錄結果並對結果進行統計學分析，證明pet28(a)-Bs-Agl、PET28a(+)-Bs-Ag2和PET32a(+)-Bs-Ag3蛋白具有較高的免疫保護力，對宿主保護力分別達到60.7%、56.7%和61.2%，與其它組差異極顯著；Bs-Agl、Bs-Ag2和Bs-Ag3基因可作為蛔蟲製備基因工程疫苗的侯選基因。所述的大熊貓西氏蛔蟲抗原的製備及其應用，其特徵還在於用大熊貓蛔蟲重組蛋白Bs-Agl、Bs-Ag2和Bs-Ag3作為抗原進行ELISA方法試驗，對免疫後的鼠血清進行ELISA檢測，發現保護力高的rBs-Agl、rBs-Ag2和rBs-Ag3-FCA組其血清中抗體水平檢出時間早，而且抗體滴度高，證實重組蛋白Bs-Agl、Bs-Ag2和其產物經過檢測並進行免疫保護試驗以及對試驗動物抗體IgG的ELISA檢測分析結果表明Bs-Ag3具有良好的反應原性，可以用來構建ELISA方法來檢測感染大熊貓蛔蟲。按照本發明所說的技術方案實施後，取得如下的積極效果和作用(BS-Agl為例)。純化回收後的PCR產物直接與PMD18-T載體相連，轉化Aco7iDH5a感受態細胞，挑取陽性克隆進行測序，測序結果經BLAST搜索發現與豬蛔蟲L2R59抗原基因(GenBankaccessionno:AB057441)同源性為90%。本發明選用Pet28a(+)原核表達系統，此系統含有kan抗性基因，其誘導物為IPTG(異丙基-e-D-硫代半乳糖苷)。通過利用DNAmari軟體對大熊貓蛔蟲Bs-Agl基因的酶切位點進行分析，發現該基因ORF去掉編碼信號肽序列後的鹼基序列中不含歷V^/JT和fe/^/酶切位點，而表達載體PET28a(+)中含有歷/^/J7和)fe^/酶切位點，所以在設計上遊和下遊基因引物中分別引入了歷/7o77/和"rf/酶切位點，以便定向克隆至PET28a(+)表達載體。用歷/7rf/7/及5a/z^/消化陽性克隆質粒，將其目的片段與相同酶消化的PET28a(+)表達載體連接，得到了表達Bs-Agl的原核表達rBs-Agl。大熊貓蛔蟲Bs-Agl通過軟體預測，閱讀框能編碼146個胺基酸，分子量15.857，pI9.61;去掉16個胺基酸信號肽後，能編碼132個胺基酸的分子量分子量14.127，p19.49,130個胺基酸。通過BLAST搜索結果發現大熊貓蛔蟲的Bs-Agl和豬蛔蟲L2R59抗原基因編碼的胺基酸(BAB67769.1)同源性高達90%;可以看出Bs-Agl閱讀框編碼胺基酸的同源性較高都是線蟲抗原和線蟲的基因產物。說明Bs-Agl是線蟲特有基因的產物。因此,Bs-Agl基因可作為蛔蟲製備基因工程疫苗的侯選基因。用大熊貓蛔蟲重組表達蛋白作為抗原進行了ELISA方法的初步探討。對免疫後的鼠血清進行ELISA檢測，結果證實，所說的重組蛋白具有良好的反應原性，可以用來建立ELISA方法以提高檢測感染大熊貓蛔蟲的診斷手段。圖1為本發明所說的大熊貓蛔蟲Bs-Agl基因、Bs-Ag2基因、Bs-Ag3基因三個基因序列表。圖2為本發明所說的大熊貓蛔蟲Bs-Agl和豬蛔蟲L2R59去掉信號肽的鹼基序列同源性比較圖。圖3為本發明所說的重組質粒PET28a(+)—BS-Agl用fe^/酶切和歷/^J//雙酶切後構建成的片段圖。圖4為本發明所說的重組質粒表達蛋白SDS-PAGE圖。圖5為本發明所說的重組質粒表達蛋白Western-blot圖。注釋說明1、本發明所涉及的菌株和質粒基因克隆菌株E.coh'DH5ct、表達菌株BL21(DE3)購於成都博瑞克生物公司；克隆載體PMD18-T購自天泰生物公司，表達載體Pet28a(+)由四川農業大學寄生蟲免疫研究室保存。2、酶、主要試劑歷朋/、jWMi77P艮制性內切酶、RT試劑盒、TaqDNA聚合酶、T4DNA連接酶和DNAMarker均為TakaRa公司產品、考馬斯亮藍、溶菌酶、DTT(大連寶生物)公司產品；RNA基因組抽提、質粒抽提、膠回收、PCR產物純化等試劑盒購於上海華舜公司。IPTG、SDS購於上海生工公司；兔抗大熊貓蛔蟲IgG由四川農業大學寄生蟲免疫研究室自己製備;2XTaqPCRMasterMix、山羊抗鼠IgG-HRP、山羊抗兔IgG-HRP:購於成都博瑞克生物公司。具體實施例方式結合附圖給出實施例並做出進一步的說明。首先利用大熊貓糞便沉澱法收集蛔蟲卵，用含2%福馬林的生理鹽水培養皿內，加蓋，置25-28'C溫箱內培養，3-4周就能獲得大量的感染性蟲卵，將其大熊貓蛔蟲感染性蟲卵人工感染白兔，每隻灌胃3,500個，每間隔一周重複一次。每次免疫前對試驗動物耳靜脈採血，免疫四次後經瓊擴法測定其效價待血清效價達到1:8時心臟採血，收集分離血清，分裝小管，一2(TC保存備用，以此獲得兔抗大熊貓蛔蟲陽性血清供下一步試驗時用。將收集的大熊貓蛔蟲成蟲從-7(TC冰箱取出，經凍過低溫的研缽中磨成粉末，然後參照總RNA提取試劑盒使用說明書，提取大熊貓蛔蟲總RNA，一70'C保存備用.也可以選用蛔蟲的二期幼蟲獲得大熊貓蛔蟲總RNA的提取。以大熊貓蛔蟲BS-Agl基因為例，根據豬蛔蟲的抗原基因序列，結合本發明需用表達載體的特點，利用引物設計軟體Primer5.0設計合成如下一對引物上遊引物5'-CGCGGATCCCAAGGACCTCAAGGACCACCAC—3，(含Aaffl^/酶切位點)；下遊引物5，-CCCAAGCTTCTAGCCTTGCATCTCTTTTTG—3，(含歷/^/77酶切位點)，引物委託寶生物工程(大連)有限公司合成實施。參照TaKaRa公司RT試劑盒的使用說明書進行反轉錄合成cDNA，再以cDNA為模板進行PCR擴增.PCR反應體系為2XTaqPCRMasterMix25uL;cDNA產物3UL;無菌水22uL;上下遊引物各1.5uL。反應混合物進行PCR，反應程序為；95。C預變性5min;95。C變性30s，55。C退火30s，72。C延伸45s,循環擴增30次，最後72'C延伸10min.擴增結束後取PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。採用膠回收純化試劑盒回收PCR擴增出的目的產物(400-500bp左右)，將回收純化的目的產物直接與pMD18-T載體連接後，將連接產物轉化￡coh'DH5a感受態細胞，經含有氨苄青黴素的平板篩選培養，挑取菌落培養於3mlLB培養基中，培養14-16h後，取10u1培養的重組克隆菌液為模板，用引物做菌落PCR鑑定，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測.選取3個陽性重組克隆，小規模擴大培養後，進行測序。測得基因序列見圖1(基因序列正在提交)。圖2是大熊貓蛔蟲Bs-Agl基因和豬蛔蟲L2R59去掉信號肽的鹼基序列同源性比較圖。大熊貓蛔蟲Bs-Agl基因與豬蛔蟲L2R59抗原基因去掉編碼信號肽後的鹼基的序列同源性為90%。閱讀框有450個鹼基。大熊貓蛔蟲Bs-Agl基因開放閱讀框共450bp，能編碼146個胺基酸，分子量15.857,pI9.61;信號肽共48個鹼基能編碼16個胺基酸信號肽，去掉信號肽後能編碼132個胺基酸的分子量14.127，p19.49,130個胺基酸。並通過BLAST搜索同源性高的線蟲抗原基因編碼胺基酸，大熊貓蛔蟲Bs-Agl基因閱讀框編碼的胺基酸和豬蛔蟲L2R59抗原基因閱讀框編碼的胺基酸(BAB67769.1)同源性高達90%。為了構建大熊貓西氏蛔蟲抗原重組蛋白的原核表達載體，需要進行重組質粒PET28a(+)-Bs-Agl、PET28a(+)-Bs-Ag2和PET32a(+)-Bs-Ag3的構建，包括如下步驟本實施例僅以PET28a(+)-Bs-Agl為例說明。(1)重組質粒的構建歷'/^///及^/^/消化陽性克隆質粒，將其目的片段與相同酶消化的PET28a(+)表達載體連接。連接反應體系為Bs-Agl基因片段6ul，PET28a(+)質粒lul，5xLigase:41，T4D亂igase:8ti1，Autoclaned:1，混合後置16。C連接5h，轉化DH5a感受態細胞混勻後冰浴30min—lh，然後42'C水浴90sec，取出冰浴3-5min,加預熱的適量LB培養基在37'C低轉速搖床培養在含A即的LB瓊脂平皿上進行篩選，用接種環挑取菌落，在含Kan(100.0ug/mL)的LB液體培養基中，250-300r/min37'C恆溫搖床過夜。在這一過程中需要對重組PET28a(+)/Bs-Agl質粒的鑑定。酶切鑑定用5a^飾歷V^/i7^重組質粒在37'C進行雙酶切2h，用1%瓊脂糖凝膠電泳分析酶切產物。圖3是本發明所說的重組質粒￡128&(+)用飽/^7酶切和歷/^//7雙酶切後構建成的片段圖。可以看出將重組質粒PET28a(+)-Bs-Agl用fe/z^7f卩歷V707J7雙酶切後電泳，可見兩條大小分別約為大片段6kb和小片段400500kb的片段，表明重組質粒構建成功。(2)SDS-PAGE將構建好的表達載體轉入轉化￡coh'DH5a感受態細胞，挑取陽性克隆進行測序，測序結果正確的克隆菌抽提質粒轉化到ABI21中進行表達，收集菌液離心，分別取上清和沉澱經超聲波破碎後離心，SDS-PAGE分析顯示表達蛋白主要以包涵體形式存在。當0D600-0.8，lmMIPTG時，分別取誘導表達O、1、2、3、4、5h的菌液進行SDS-PAGE,在蛋白分子量18.OOKD以下出現蛋白條帶，與預期蛋白的分子量14.127KD相符。圖4為本發明所說的重組質粒表達蛋白SDS-PAGE分析圖。(3)重組蛋白的純化收集表達菌離心，用緩衝液(0.5mmol/LNaCl，20mmol/LTris_HClpH8.0)進行懸浮，加入溶菌酶至IOOug/ml，細胞懸液放在—2(TC冰箱20min後，取出溶解經超聲裂解後，依次用含0、2、4mol/L尿素的lX結合蛋白緩衝液(5mmol/L咪唑，0.5隱ol/LNaCl，20mmol/LTris-HC1pH8.0)洗滌沉澱；隨後用含8mol/L尿素的lX結合蛋白緩衝液重懸沉澱，冰上放置lh，使包涵體蛋白完全溶解；16000Xg離心30min去除不可溶物，以孔徑O.45um的NC膜過濾收集上清液。經His結合樹脂純化，以緩衝液(6mol/L尿素，60mmol/L咪唑，0.5mol/LNaCl，20mmol/LTris-HC1pH8.0)洗去雜蛋白，以洗脫液(6mol/L尿素，lmol/L咪唑，0.5mol/LNaCl，20醒ol/LTris-HClpH8.0)洗脫目的蛋白。將純化的重組蛋白於4'C分別在含4mol/L、2mol/L尿素的PBS及PBS溶液中依次進行透析，將溶液置於-2(TC保存。(4)Westernblot將純化後的表達產物進行Westernblot分析，同時用空表達載體Pet28a(+)(不含目標片段)的表達產物做空白對照。結果發現，空白載體不能與第一步所做的兔抗大熊貓蛔蟲陽性血清發生反應，而含有目標片段的重組載體菌表達產物則可與兔抗大熊貓蛔蟲陽性血清發生反應，出現顯色帶。圖5為本發明所說的重組質粒表達蛋白Western-blot分析圖。(5)免疫保護試驗分別將純化的重組蛋白Bs-Agl與弗氏完全佐劑l:l混和皮下接種免疫小白鼠，基礎免疫後進行兩次加強免疫，並在最後一次免疫後一周對小白鼠攻蟲，7d後殺小白鼠取其肝、肺臟經貝爾曼法收集幼蟲，記錄結果見表1。表l各組小鼠攻蟲後肝臟和肺臟幼蟲數統計結果larvae_lii動物數平均檢蟲數減蟲率tableseeoriginaldocumentpage11對結果進行統計學分析，免疫組與對照組相比蟲體明顯減少了67.77%，免疫組蟲與佐劑組和對照組差異極顯著(屍<0.01)，FCA組與對照組相比，兩者差異不顯著(p〉0.05)。(6)對試驗動物抗體IgG的ELISA檢測分析鼠血清樣本IgG的ELISA檢測0D630，各組動物免疫前後血清樣品用ELISA檢測IgG，統計結果表明(表2)。在免疫後第14d、第28d、第42d免疫組鼠血清中均能檢測到特異性IgG抗體，並且抗體水平逐漸上升免疫組與對照組、FCA組差異極顯著0X0.01)，FCA組與對照組差異不顯著(P〉0.05)。表2免疫前後血清IgGELISA檢測統計結果(0D630)tableseeoriginaldocumentpage11注同列肩標不同字母表示差異極顯著(P0.05)。本發明所說的其產物經過檢測並進行免疫保護試驗以及對試驗動物抗體IgG的ELISA檢測分析結果再次證實了所說的大熊貓西氏蛔蟲抗原Bs-Agl、Bs-Ag2和Bs-Ag3基因可以作為蛔蟲製備基因工程疫苗的侯選基因。大熊貓蛔蟲重組蛋白Bs-Agl、Bs-Ag2和Bs-Ag3具有良好的反應原性，可以用來構建以ELISA方法檢測感染大熊貓蛔蟲。權利要求1、大熊貓西氏蛔蟲抗原的製備及其應用，其特徵在於大熊貓西氏蛔蟲抗原按照下述步驟製備(1)以大熊貓蛔蟲成蟲或二期幼蟲為模板，用RNA試劑盒法提取大熊貓蛔蟲總RNA。(2)根據豬蛔蟲的抗原基因序列設計大熊貓蛔蟲Bs-Ag1、Bs-Ag2和Bs-Ag3基因引物，所述引物對的序列為上遊CGCGGATCCcaaggacctcaaggaccaccac(含BAMHI酶切位點)；下遊5-CCCAAGCTTCTAgccttgcatctctttttg-3(含HINDIII酶切位點)。(3)採用RT-PCR法將大熊貓總RNA逆轉錄合成cDNA，再以cDNA為模板進行PCR擴增，擴增出目的產物Bs-Ag1、Bs-Ag2和Bs-Ag3基因。(4)將回收純化的目的產物直接與pMD18-T載體連接後，轉化至受體細胞大腸桿菌K-12的衍生菌DH5α。感受態細菌，經含有氨苄青黴素的平板篩選培養，培養於3mlLB培養基中，培養14--16h後，取2μl培養的重組克隆菌液為模板，經過菌落PCR鑑定，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。選取陽性重組克隆，小規模擴大培養後，進行測序。2、根據權利要求l所述的大熊貓西氏蛔蟲抗原的製備及其應用，其特徵在於大熊貓西氏蛔蟲抗原經測序結果其抗原基因為Bs-Agl基因、Bs-Ag2基因、Bs-Ag3基因三個基因(基因序列見序列表l、2、3)。3、根據權利要求1所述的大熊貓西氏蛔蟲抗原的製備及其應用，其特徵在於構建大熊貓西氏蛔蟲抗原重組蛋白的原核表達載體，進行重組質粒PET28a(+)-Bs-Agl、PET28a(+)-Bs-Ag2和PET32a(+)-Bs-Ag3的構建，包括如下步驟(以PET28a(+)-Bs-Agl為例)(1)將測序正確的陽性菌經培養後，離心去沉澱抽提PET28a(+)質粒，用BamHI和HindIII在37'C下，進行水浴酶切2h，回收大片段與純化後的Bs-Agl基因；用BamHI和HindIII進行雙酶切後，回收酶切產物中Bs-Agl基因進行連接反應。(2)誘導表達和重組蛋白的純化，將測序正確的重組質粒，用上述方法轉化到大腸桿菌BL21感受態細胞，根據表達的觀察結果，進行蛋白的大量表達，收集誘導表達菌。將所得細菌沉澱經反覆凍融和超聲裂解後，依次用含0、2、4mol/L尿素的lx結合蛋白緩衝液洗滌沉澱；隨後用含8mol/L尿素的lx結合蛋白緩衝液重懸沉澱，冰上放置lh，使包涵體蛋白完全溶解。將重組蛋白Bs-Agl於4'C條件下分別在含8mol/L尿素的PBS溶解，將溶液於4'C保存。4、根據權利要求l所述的大熊貓西氏蛔蟲抗原的製備及其應用，其特徵在於分別將純化的重組蛋白Bs-Agl、Bs-Ag2和Bs-Ag3與弗氏完全佐劑hl混和皮下接種免疫小白鼠，基礎免疫後進行兩次加強免疫，並在最後一次免疫後一周對小白鼠攻蟲，7天後殺小白鼠取其肝、肺臟，經貝爾曼法收集幼蟲，記錄結果並對結果進行統計學分析，證明PET28(a)-Bs-Agl、PET28a(+)-Bs-Ag2和PET32a(+)-Bs-Ag3蛋白具有較高的免疫保護力，對宿主保護力分別達到60.7%、56.7%和61.2%，與其它組差異極顯著；Bs-Agl、Bs-Ag2和Bs-Ag3基因可作為蛔蟲製備基因工程疫苗的侯選基因。5、根據權利要求l所述的大熊貓西氏蛔蟲抗原的製備及其應用，其特徵在於用大熊貓蛔蟲重組蛋白Bs-Agl、Bs-Ag2和Bs-Ag3作為抗原進行ELISA方法試驗，對免疫後的鼠血清進行ELISA檢測，發現保護力高的Bs-Agl、Bs-Ag2和Bs-Ag3-FCA組其血清中抗體水平檢出時間早，而且抗體滴度高，證實重組蛋白Bs-Agl、Bs-Ag2和Bs-Ag3具有良好的反應原性，可以用來構建以ELISA方法檢測感染大熊貓蛔蟲。全文摘要本發明公開了大熊貓西氏蛔蟲抗原的製備及其應用，屬大熊貓西氏蛔蟲的防治及檢測領域。包括設計出西氏蛔蟲抗原基因引物；採用RT-PCR法將蛔蟲總RNA逆轉錄合成cDNA，再以cDNA為模板，PCR擴增出目的產物；將純化的目的產物與pMD18-T載體連接，轉至DH5α，感受態細菌；經平板篩選培養，選取陽性重組克隆，培養後測序出抗原基因為Bs-Ag1基因、Bs-Ag2基因、Bs-Ag3基因。再進行重組質粒構建、誘導表達和重組蛋白純化，將測序正確的重組質粒，轉化到大腸桿菌BL21感受態細胞，進行蛋白的大量表達。其產物經檢測、免疫試驗以及對試驗動物抗體IgG的ELISA檢測分析大熊貓西氏蛔蟲抗原Bs-Ag1、Bs-Ag2和Bs-Ag3基因可以作為蛔蟲製備基因工程疫苗的侯選基因，其重組蛋白Bs-Ag1、Bs-Ag2和Bs-Ag3具有良好的反應原性，可以用來構建以ELISA方法檢測感染大熊貓蛔蟲。文檔編號C12N15/70GK101348787SQ200810044409公開日2009年1月21日申請日期2008年5月19日優先權日2008年5月19日發明者何光志,彭雪蓉,楊光友,濤汪申請人:四川農業大學