B型肝炎病毒基因分型的基因晶片和試劑盒及方法
2023-05-06 00:04:51 1
專利名稱：B型肝炎病毒基因分型的基因晶片和試劑盒及方法
技術領域：
本發明涉及一種疾病病原體基因檢測技術，尤其涉及一種B型肝炎病毒基因分型檢測的基因晶片和試劑盒及其方法，可用於人B型肝炎病毒(HBV)基因型(B、C、D)三型感染的輔助診斷。
背景技術：
B型肝炎病毒Q^patitis B virus, HBV)是嚴重危害人類健康的肝炎病毒之一， 是主要的肝臟疾病致病因子。世界上有20億人感染過HBV，目前全世界慢性HBV感染患者至少有3. 8億，其中慢性HBV攜帶者75%分布在東南亞和次撒哈拉地區，而我國就佔了 1.5 億，其中有2000萬人為慢性B肝患者，每年因此病死亡的人已近50萬。估計全球每年有 100-200萬人直接死於HBV持續感染。HBV屬於嗜肝DNA病毒科，是一種DNA病毒，其基因組由長3. 2kb的部分雙鏈DNA 組成，共有四個開放讀碼框(Open Readin Frame, ORF) :S、C、P、X，他們編碼至少8個不同蛋白表面抗原蛋白，DNA多聚酶蛋白，核心抗原蛋白，X蛋白等。HBV具有病毒複製產量高 (1012-13病毒粒/天)和突變率高(1010-11個點突變/天)的特徵，高突變是由於高複製，尤其是由於基因組複製，需先轉錄為RNA中間體，但聚合酶缺乏校正功能所致。根據HBV 全基因核苷酸序列異源性大於8 %或S基因區核苷酸序列異源性大於4. 1 %，可將HBV分為 A、B、C、D、E、F、G、H，8 個基因型。HBV基因型呈一定的地域性分布在世界不同地區基因型分布不同，A型為全世界分布，B型、C型主要分布在亞洲，D型分布在南歐、美、澳大利亞和中東，E型分布在非洲，F 型分布在美洲土著人和玻里尼西亞，G型分布在美洲、歐洲，H型在美國發現。目前我國B型肝炎患者的HBV基因型主要是B、C和D這三型，並以C型最多，其中在北方城市以C型為主，由北方至南方，B型感染率逐漸增高，在香港、廣州等南部地區有少部分D型分布，另外， 華北、新疆地區有A型存在。眾多的研究證實，不同基因型的B肝病毒具有不同的致病性，人類感染B肝病毒後的臨床病情輕重、肝臟病變程度以及治療效應與B肝病毒的基因型存在著十分密切的關係。A型B肝病毒的抗原性可能較弱，故免疫清除能力較弱，不過有報導指出A型B肝病毒對標準幹擾素治療的應答率較其他基因型高；B型B肝病毒則與慢性攜帶有關，並且年輕患者容易發展成肝細胞癌症；由於較容易發生CP變異和在遷延性感染時免疫清除期較長， C型B肝病毒導致的肝臟炎症損害和纖維化較其他基因型嚴重；而D型B肝病毒多見於重度肝炎。因此，對B肝患者進行B肝病毒分型測定，有助於患者早期治療和指導臨床醫生制定針對性的治療方案以及預後判斷。目前多採用基因型特異性引物PCR法、限制性片段長度多態性分析法(RFLP)和基因序列測定法對HBV進行基因分型檢測。基因型特異性引物PCR法通常需要藉助凝膠電泳判讀結果，這種受到很多不可確定性因素制約的結果判讀方法一直避免應用於臨床檢測，所以此法目前多限於科學研究領域。RFLP操作繁瑣而且重複性差，對檢測人員技術要求較高，使得其無法在臨床上得到廣泛應用。基因序列測定法是最準確可靠的方法，但是測序需要的設備和技術門檻使得測序只能局限在某些具有一定實力的單位進行，國家相關機構也無法對不同檢測對象的測序結果進行質量控制，再加上測序費用較高，使得基因測序根本無法應用於臨床檢測。目前，市場上僅有的兩種B肝病毒基因分型檢測試劑盒都是採用PCR螢光法，但由於螢光染料和檢測儀器的局限性，這兩種分型試劑盒僅能對B型和C型進行分型。1989年由&iiki等提出了反向斑點雜交(reverse dot blot，RDB)技術，該技術是在PCR技術的基礎上進行了一個實用性的改進。Saiki及其同事在檢測HLA時提出了一個有效的改進，該方法是將靶基因在PCR過程用放射性元素標記，然後與尼龍膜雜交，從而檢測靶基因的突變情況。這一方法可將多個靶基因在同一條件下進行檢測從而大大提高了檢測的效率。隨後，其它科學家證實了該方法可以區分單個鹼基的突變，利用共價鍵的探針固定方法代替紫外交聯以及使用非放射性的生物素標記引物的方法，RDB技術的穩定性有了明顯的提高。目前Oogenetics的LiPA系列產品(通過CE認證)均是基於上述的原理。從技術原理來說，RDB在本質上也是DNA晶片(一般是中密度晶片)的一種，但它不同於一般所說的玻璃DNA晶片，其信號特異性強，簡便易行，技術要求低，儀器設備投入小，檢測結果用肉眼就可直接判斷，而無需購買昂貴的雷射掃描儀，更符合中國目前的國情也更利於在基層醫院推廣。然而，目前RDB技術整個雜交過程的操作步驟比較多，操作時間也相對較長，成為大規模推廣應用的阻力。基於此需求，雖然已經有相應的自動化雜交儀出現，但自動化雜交儀的價格昂貴，並非普通的基層醫院可接受。而且，繁多的操作步驟，也對自動化儀器運行的穩定性提出了挑戰。目前，市場上尚無利用PCR-RDB法對B肝病毒進行分型的診斷試劑盒。因此，研發B型肝炎病毒基因分型檢測試劑盒(PCR-反向點雜交法)，具有較高的臨床應用價值和可觀經濟效益。
發明內容
本發明採用PCR-RDB方法，在具備了 PCR高靈敏度高特異性等優點的基礎上，實現對HBV基因型的高通量多通道分析，這不僅有助於臨床病情評估，治療藥物的選擇和預後判斷，還為追蹤大範圍B肝暴發時的傳染源提供了可行性。本發明的技術方案為提供一種B型肝炎病毒基因分型的基因晶片，包括尼龍膜， 所述尼龍膜上固定有探針，所述探針為可分別與B型肝炎病毒各種亞型病毒的核酸雜交的核苷酸，所述探針序列如下所示探針Bl :5，-AGTTGGCTTTGAATGCA-3，；探針B2 :5，-GTGATCCTTGTTGGGGTTGAAG-3，；探針B3 :5，-GCTGGTGGAAAGATTCTGC-3，；探針P :5，-TGMGGGCTCCACCCCAA-3，；探針PC :5，-TGCCGATATAGGTCACAGCATG-3，；
探針 CC 5，-CTTCCAATATCCGGTCCTGTTGAT-3，。
優選的，上述基因晶片所述各探針5』進行氨基標記，探針CC的5』端進行生物素標記。本發明的另一技術方案為提供一種B型肝炎病毒基因分型的試劑盒，包括權利要求1所述的B型肝炎病毒基因分型的基因晶片，還包括PCR反應液，所述PCR反應液包括擴增B型肝炎病毒各種亞型病毒的核酸的引物，所述引物序列如下所示上遊引物H-I :5，-GAGTTCCACTGCATGGCC-3，；下遊引物H-2 5，-CCCATGCTGTAGCTCTTGTTCCC-3，。所述上遊引物H-I的5』端進行生物素標記。優選的，上述試劑盒所述PCR反應液還包括內標質粒，所述內標質粒的擴增引物為上遊引物H-3 :5，-TCATCGTCGCTGGAGCTGGTT-3，；下遊引物H-4 :5，-CGGCGGTTTGTCAAGCTGAT-3，；所述上遊引物H-3的5』端進行生物素標記。優選的，上述試劑盒所述PCR反應液還包括純水、10XPCR buffer,25mM MgCl2, 20mM dNTP、Taq 酶、UNG 酶，所述 dNTP 包括 dATP、dUTP、dGTP、dCTP。優選的，上述試劑盒的還包括雜交液，所述雜交液包括A液貯存液、B液貯存液、C 液貯存液、D液貯存液、E液貯存液、F液貯存液。本發明的又一技術方案為B型肝炎病毒基因分型的方法，該方法包括下述具體步驟a、以B型肝炎病毒基因組野生B、C、D型樣本序列為主設計合成分型引物與分型探針，所述探針序列為Bl :5，-AGTTGGCTTTGAATGCA-3，；B2 5' -GTGATCCTTGTTGGGGTTGAAG-3，；B3 :5』 -GCTGGTGGAAAGATTCTGC-3』 ；P:5， -TGMGGGCTCCACCCCAA-3，；PC :5』 -TGCCGATATAGGTCACAGCATG-3』 ；CC :5，-CTTCCAATATCCGGTCCTGTTGAT-3，；所述CC探針3』端進行生物素標記；所述引物序列為上遊引物H-I :5，-GAGTTCCACTGCATGGCC-3，；下遊引物H-2 :5，-CCCATGCTGTAGCTCTTGTTCCC-3，；b、用活性氨基標記步驟a所述探針，並將其依次固定在尼龍膜上，製成檢測膜條；C、對步驟a所述上遊引物H-I的5，端進行生物素標記，進行HBVDNA擴增；d、將擴增產物與檢測膜條雜交，以過氧化物酶與四甲基聯苯胺顯色；e、判斷基因分型結果。本發明試劑盒具有快速、靈敏、準確、高通量的特點，一次雜交反應可以檢測多種靶序列，取材方便，無需特殊設備，儀器投入低，具有快速簡便、敏感度高和特異性強的特
點ο
圖1為膜條點陣基本尺寸；
圖2為膜條探針排列順序；
圖3:PCR擴增調節示意圖4HBV-DNA 陽性，HBV B 型;
圖5HBV-DNA 陽性，HBV D 型;
圖6=HBV-DNA陽性，HBV BC混合型
圖7=HBV-DNA 陰性。
具體實施例方式為詳細說明本發明的技術內容、構造特徵、所實現目的及效果，以下結合實施方式並配合附圖詳予說明。本發明是將高靈敏度的聚合酶鏈反應(PCR)技術和反向點雜交技術相結合的基因及基因突變檢測技術。是將特異的探針分別固定到硝酸纖維素膜或尼龍膜上，再將經PCR 特異性擴增的產物(在PCR引物5』端預先進行生物素標記，使擴增產物相應標記有生物素)與之雜交，這樣待檢樣本就會與具有同源序列的探針結合，經洗滌去除未結合的DNA樣本，由於待測的DNA樣本具有生物素類的標記物，結合了待測DNA的探針點上就帶有生物素類的標記物，再經相應的顯色反應就能顯出雜交信號。生物素(Biotin)本發明生物素標記，優選地高辛標記。以尼龍膜為載體的DNA晶片技術，採用的是微量點樣DNA微陣列技術。其主要的基本原理如下DNA探針為含有特定DNA序列的寡核苷酸片段，其末端帶有氨基標記。經活化處理的尼龍膜帶有負電荷基團，可以與氨基形成共價結合。利用這種方法可將DNA探針按一定的排列規律永久的固定在尼龍膜的表面。其主要優點是簡便易行，技術要求低，並且探針不受探針分子大小種類的限制，能根據使用者的要求簡便地制出符合目的的晶片。在此基礎上結合PCR技術對微量待測樣品進行大量快速擴增，擴增後含有相應標記物的待測樣品與晶片上的探針進行特異性雜交，此後對雜交信號強弱和有無進行分析，即可判斷樣品中靶分子的數量和性質。實施例1本發明試劑盒的組成膜條生產工藝將尼龍膜經EDC. HCl (1_ (3_ 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽)預處理30 分鐘後激活表面羧基；同時，將5』端帶有氨基標記的探針用緩衝液稀釋到適當的濃度，按陣列順序點加於尼龍膜相應位置上，氨基與活化的羧基發生反應生成穩定的「-C0-NH-」共價鍵，從而將探針固定在尼龍膜表面，最後用0. IN的NaOH處理尼龍膜，封閉未結合探針的表面羧基，膜條製作完成，具體流程如下1、將將膜條裁成適當大小，用雷射印表機打上1X6的格子，每格大小為 4. 5X5. Omm ；2、配探針稀釋液(0. 5mol/L NaHC03, ρΗ8· 4)；3、將所有6條探針分別用探針稀釋液稀釋至5 μ mol/L ；4、配32%的EDC溶液等比例混合EDC和探針稀釋液；
7
5、用八通道連續移液器取0. 6μ L稀釋好的探針點於尼龍膜相應的格子上膜條自然晾乾30min ；6、配製 0. lmol/L NaOH, 二次泡膜 5 分鐘；7、純水洗膜3次；8、膜條烘乾 30min;9、二次裁剪備用。請參閱圖1，圖2，圖1為膜條點陣基本尺寸(單位毫米)，1的長度為4. 5士0. 25， 2的長度為5. 0 士 0. 25，3的長度為36. 5 士 0. 254的長度為7. 5 士 0. 25，圖2為膜條探針排列順序。上述探針的名稱及序列如表1(M = A+C)。表 權利要求
1.B型肝炎病毒基因分型的基因晶片，其特徵在於，包括尼龍膜，所述尼龍膜上固定有探針，所述探針為可分別與B型肝炎病毒各種亞型病毒的核酸雜交的核苷酸，所述探針序列如下所示探針 Bl :5』 -AGTTGGCTTTGAATGCA-3』 ；探針 B2 :5，-GTGATCCTTGTTGGGGTTGAAG-3，；探針 B3 :5』 -GCTGGTGGAAAGATTCTGC-3』 ；探針 P :5，-TGMGGGCTCCACCCCAA-3，；探針 PC :5』 -TGCCGATATAGGTCACAGCATG-3』 ；探針 CC :5』 -CTTCCAATATCCGGTCCTGTTGAT-3，；所述各探針5』進行氨基標記，所述探針CC的3』端進行生物素標記。
2.B型肝炎病毒基因分型的試劑盒，其特徵在於，包括權利要求1所述的B型肝炎病毒基因分型的基因晶片，還包括PCR反應液，所述PCR反應液包括擴增B型肝炎病毒各種亞型病毒的核酸的引物，所述引物序列如下所示上遊引物 H-I :5』 -GAGTTCCACTGCATGGCC-3，； 下遊引物 H-2 :5，-CCCATGCTGTAGCTCTTGTTCCC-3，； 所述上遊引物H-I的5』端進行生物素標記。
3.如權利要求2所述的B型肝炎病毒基因分型的試劑盒，其特徵在於，所述PCR反應液還包括內標質粒，所述內標質粒的擴增引物為上遊引物 H-3 :5』 -TCATCGTCGCTGGAGCTGGTT-3』 ； 下遊引物 H-4 :5，-CGGCGGTTTGTCAAGCTGAT-3，； 所述上遊引物H-3的5』端進行生物素標記。
4.如權利要求2所述的B型肝炎病毒基因分型的試劑盒，其特徵在於，所述探針CC的 3』端進行地高辛標記，所述上遊引物H-I的5』端進行地高辛標記，所述上遊引物H-3的5』 端進行地高辛標記。
5.如權利要求2所述的B型肝炎病毒基因分型的試劑盒，其特徵在於，所述PCR反應液還包括純水、10 X PCR buffer,25mM MgCl2, 20mM dNTP、Taq 酶、UNG 酶，所述 dNTP 包括 dATP、dUTP、dGTP、dCTP。
6.如權利要求2所述的B型肝炎病毒基因分型的試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒還包括雜交液，所述雜交液包括A液貯存液、B液貯存液、C液貯存液、D液貯存液、E液貯存液、 F液貯存液。
7.B型肝炎病毒基因分型的的方法，其特徵在於，該方法包括下述具體步驟a、以B型肝炎病毒基因組野生B、C、D型樣本序列為主設計合成分型引物與分型探針， 所述探針序列為Bl 5' -AGTTGGCTTTGAATGCA-3『； B2 :5』 -GTGATCCTTGTTGGGGTTGAAG-3』 ； B3 5' -GCTGGTGGAAAGATTCTGC-3『； P 5' -TGMGGGCTCCACCCCAA-3『； PC :5』 -TGCCGATATAGGTCACAGCATG-3』 ； CC :5』 -CTTCCAATATCCGGTCCTGTTGAT-3』 ；所述CC探針3』端進行生物素標記； 所述引物序列為上遊引物 H-I :5』 -GAGTTCCACTGCATGGCC-3，； 下遊引物 H-2 :5，-CCCATGCTGTAGCTCTTGTTCCC-3，；b、用活性氨基標記步驟a所述探針，並將其依次固定在尼龍膜上，製成檢測膜條； C、對步驟a所述上遊引物H-I的5，端進行生物素標記，進行HBVDNA擴增；d、將擴增產物與檢測膜條雜交，以過氧化物酶與四甲基聯苯胺顯色；e、判斷基因分型結果。
全文摘要
本發明目的是利用高靈敏度的聚合酶鏈反應技術和反向點雜交技術相結合的基因檢測技術，快速準確的區分B型肝炎病毒基因型的方法。本發明技術方案為提供一種用於B型肝炎病毒基因分型的基因晶片和試劑盒及其方法。所述試劑盒包括尼龍膜，所述尼龍膜上固定有探針，所述探針為可分別與B型肝炎病毒各亞型的核酸雜交的核苷酸。本發明試劑盒具有快速、靈敏、準確、高通量的特點，一次雜交反應可以檢測多種靶序列，取材方便，無需特殊設備，儀器投入低，具有快速簡便、敏感度高和特異性強的特點。
文檔編號C12Q1/70GK102559933SQ20121001622
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月18日 優先權日2012年1月18日
發明者周曉強, 姚銘鋒, 林希瑾, 秦偉, 胡守旺, 謝佐福 申請人:泰普生物科學(中國)有限公司