合成增加量的葡糖胺聚糖的植物的製作方法

2023-05-05 05:34:06 1

專利名稱：合成增加量的葡糖胺聚糖的植物的製作方法
合成增加量的葡糖胺聚糖的植物本發明涉及合成增加量的葡糖胺聚糖的植物細胞和植物，和製備此類植物的方 法，還有在這些植物細胞或植物的幫助下製備葡糖胺聚糖的方法。此處，相比較於野生型植 物細胞或野生型植物，根據本發明的植物細胞或經遺傳修飾的植物具有葡糖胺聚糖合酶活 性以及額外增加的葡糖胺6-磷酸乙醯轉移酶活性和增加的UDP-N-乙醯基-葡糖胺焦磷酸 化酶活性。本發明還涉及包含具有增加的葡糖胺聚糖合成的植物細胞的組合物。蛋白聚糖是一類糖蛋白，尤其是軟骨的主要成份並且具有由重複的二糖單元組成 的附著於核心蛋白質上的葡糖胺聚糖。重複的二糖單元其功能在於通過特徵性的碳水化合 物結合序列共價附著到核心蛋白質上。根據二糖單元的組成，尤其是在葡糖胺聚糖乙醯肝 素/硫酸肝素、硫酸角質素硫酸和軟骨素/皮膚素之間進行區分，其二糖單元各包含為葡糖 胺或葡糖胺衍生物的分子。乙醯透明質酸是另一種葡糖胺聚糖，也具有作為其二糖單元組分之一的葡糖胺衍 生物(N-乙醯基-葡糖胺)，但其在自然界中不附著到蛋白質上。除了乙醯透明質酸，所提 及的葡糖胺聚糖是天然硫酸化聚合物。在這些物質中，硫酸根在二糖單元的多個原子或取 代基處引入，使得所提及的物質不是單一的聚合物，而是總結於各總稱下的聚合物集合。正 在討論的聚合物集合的每一分子可能在硫酸化程度和具有硫酸根的單體的位置上有所不 同。乙醯透明質酸是天然產生的、無分支的、線性粘多糖(葡糖胺聚糖)，其由交替的 葡糖醛酸(GlcA)和N-乙醯基-葡糖胺(GlcNAc)分子組成。乙醯透明質酸的基本結構單 元由二糖葡糖醛酸_ 0 -1，3-N-乙醯基-葡糖胺組成。在乙醯透明質酸中，這些重複單元經 3-1，4鍵相互附著。在藥劑學中，經常使用術語透明質酸。由於在大部分情況中乙醯透明 質酸作為多聚陰離子而不是游離酸存在，所以在下文中，優選使用術語乙醯透明質酸，但各 術語應理解為均包含兩種分子形式。乙醯透明質酸具有不一般的物理化學特性，例如聚合電解質的特性、粘彈性特性、 結合水的高能力、凝膠形成的特性，除此之外乙醯透明質酸的其他特性都描述於Lapcik等 的綜述文章中(1998，Chemical Reviews98 (8)，2663-2684)。乙醯透明質酸是脊椎動物胞外結締組織和體液的組分。在人中，透明質酸由所 有體細胞尤其是間充質細胞的細胞膜合成，並廣泛存在於身體當中，尤其在結締組織、細 胞外基質、臍帶、關節液、軟骨組織、皮膚和眼的玻璃體中具有高濃度(Bernhard Gebauer, 1998, Inaugural-Dissertation, Virchow-Klinikum Medizinische Fakllltat Chariteder HumboldtUniversitatZU Berlin ；Fraser等，1997, Journal of Internal Medicine 242, 27-33)。近來，還在動物非脊椎動物有機體(軟體動物)中發現了乙醯透明質酸(Volpi和 Maccari,2003, Biochimie 85，619—625)。此外，由於乙醯透明質酸是非免疫原性物質，一些人類致病性革蘭氏陽性細菌 (鏈球菌屬(Str印t0C0CCus)A和C)和革蘭氏陰性細菌(巴斯德菌屬(Pasteurella))合成 乙醯透明質酸作為菌表多糖，其保護這些細菌免受宿主免疫系統的攻擊。
感染小球藻屬(Chlorella)的單細胞綠藻的病毒賦予單細胞綠藻在被所述病毒 感染後合成乙醯透明質酸的能力，一些這類病毒作為內共生體存在於草履蟲(Paramecium) 種中(Graves等，1999，Virology 257，15-23)。然而，合成乙醯透明質酸的能力不是用於表 徵正在討論的藻類的特徵。藻類合成乙醯透明質酸的能力由基因組中具有編碼乙醯透明質 酸合酶的序列的病毒感染所介導(DeAngelis，1997，Science 278，1800-1803)。乙醯透明質酸合成的催化受單個膜整合或膜結合的酶乙醯透明質酸合酶的影響。將合成的乙醯透明質酸分子穿過細胞質膜轉移到細胞周圍培養基中的機制仍未 完全闡明。初期的假說認為穿過細胞膜的轉運受乙醯透明質酸合酶本身的影響。然而，更 近期的結果顯示乙醯透明質酸分子穿過細胞質膜的轉運經負責該運動的轉運蛋白質通過 能量依賴運輸發生。因此，通過突變來產生鏈球菌屬菌株，在所述突變中活性轉運蛋白的 合成被抑制。這些菌株比相應的野生型細菌菌株合成更少的乙醯透明質酸(Ouskova等， 2004,Glycobiology 14(10)，931-938)。在人成纖維細胞中，可證明在特異性抑制已知轉運 蛋白的試劑的幫助下可以將所產生的乙醯透明質酸的量以及乙醯透明質酸合酶的活性降 低(Prehm 和 Schumacher，2004，BiochemicalPharmacology 68，1401—1410)。如果在植物 中確實存在轉運乙醯透明質酸的轉運蛋白質，那麼其中量是未知的。乙醯透明質酸的不一般特性提供了在多個領域，例如藥劑學、化妝品工業、食品和 飼料生產、在技術應用(例如潤滑劑)等中應用的廣泛可能性。目前使用乙醯透明質酸的最 重要的應用就是在醫學和化妝品領域(例如見Lapcik等，1998，Chemical Reviews 98(8)， 2663-2684，Goa 和 Benfield，1994，Drugs 47 (3)，536-566)。在醫學領域，含乙醯透明質酸的產品目前用於關節病的關節內治療和用於眼的眼 外科中。乙醯透明質酸還用於治療賽馬中的關節疾病。此外，乙醯透明質酸是一些眼鼻用 藥(rhinologics)的組分，其例如以滴眼劑和nasalia的形式用於潤溼乾燥黏膜。注射用 的含乙醯透明質酸的溶液用作鎮痛藥和抗風溼劑。在創傷癒合中使用包含乙醯透明質酸或 衍生化的乙醯透明質酸的藥膏。對於皮膚學，含乙醯透明質酸的凝膠埋植劑用於在整形外 科中矯正皮膚畸形。對於藥理學應用，優選使用具有高分子量的乙醯透明質酸。在化妝品藥物中，乙醯透明質酸製劑是最適合的皮膚填充材料。通過注射乙醯透 明質酸有限時間，可以使皺紋平滑或增加嘴唇的體積。在化妝品產品中，尤其是在皮膚乳液和洗液中，由於其高結合水的能力，常使用乙 醯透明質酸作為增溼劑。此外，含乙醯透明質酸的製劑也作為所謂的營養製品(食品添加劑)來出售，其也 可用於動物中(例如狗、馬)用以預防和減輕關節病。目前從動物組織(雞冠)中分離或使用細菌培養物發酵來製備商業化目的的乙醯 透明質酸。US 4，141，973描述了從雞冠或臍帶中分離乙醯透明質酸的方法。除了乙醯透明 質酸，動物組織(例如雞冠、臍帶)也包含其他與乙醯透明質酸相關的粘多糖，例如硫酸軟 骨素(chondrotin sulfate)、硫酸皮膚素、硫酸角質素、硫酸乙醯肝素和肝素。此外，動物 有機體包含蛋白質(hyaladherins)，所述蛋白質與乙醯透明質酸特異性結合併且對於有機 體中大多數不同功能，例如肝中乙醯透明質酸的降解、乙醯透明質酸作為細胞遷移的前導
4結構的功能、內吞作用的調節、細胞表面上乙醯透明質酸的錨定或乙醯透明質酸網絡的形 成是必需的(Turley，1991，Adv DrugDelivery Rev 7,257ff. ；Laurent 和 Fraser，1992， FASEB J. 6,183ff. ；Stamenkovic 禾口 Aruffo，1993，Methods Enzymol. 245,195ff ；Knudson 和 Knudson，1993，FASEB 7，1233ff.)。用於細菌產生乙醯透明質酸的鏈球菌屬菌株全部是對人致病的細菌。在培養過程 中，這些細菌還產生釋放到培養基中的(致熱性的)外毒素和溶血素(鏈球菌溶血素，尤其 是 a 溶血素禾口 3 溶血素)Kilian, M. Streptococcus and Enterococcus.出自 Medical Microbiology. Greenwood, D. ；Slack, RCA ；Peutherer, J. F.(編輯).第 16 章.Churchill Livingstone, Edinburgh, UK 第 174-188 頁，2002，ISBN 0443070776)。這使純化和分離在 鏈球菌菌株幫助下製備的乙醯透明質酸變得更加困難。尤其是對於藥物應用，製劑中外毒 素和溶血素的存在是個問題。US 4，801，539描述了通過誘變處理後的細菌菌株(Str印tococcuszooedemicus) 的發酵來製備乙醯透明質酸。所用的誘變處理細菌菌株不再合成3溶血素。所獲的產率 為每升培養基3. 6g乙醯透明質酸。EP 0694616 描述 了培養 Streptococcus zooedemicus 或馬鏈球菌 (Streptococcus equi)的方法，其中在所用的培養條件下，合成了增量的乙醯透明質酸而 不產生鏈球菌溶血素。所獲的產率為每升培養基3. 5g乙醯透明質酸。在培養過程中，鏈球菌屬菌株向培養基中釋放酶透明質酸酶，其結果是在該生 產體系中，在純化過程中也降低了分子量。透明質酸酶陰性的鏈球菌屬菌株的用途或 製備乙醯透明質酸的方法(其中在培養過程中抑制了透明質酸酶的產生)描述於us 4，782，046中。所獲產率至多每升培養基2. 5g乙醯透明質酸，並且所獲的最高平均分子量 為3. 8X106Da，介於2. 4X106至4. 0X106的分子量分布中。US 20030175902 和 W0 03054163 描述了在枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)中 在來自類馬鏈球菌(Streptococcus equisimilis)的乙醯透明質酸合酶的異源表達的幫助 下製備乙醯透明質酸。為實現足量乙醯透明質酸的產生，除了異源表達乙醯透明質酸合酶 之外，還需要在芽孢桿菌(Bacillus)細胞中同時表達UDP葡糖脫氫酶。US 20030175902和 W0 03 054163沒有描述在枯草桿菌幫助下的生產中所獲的乙醯透明質酸的絕對量。所獲的 最高平均分子量約為4.2 X106。然而，該平均分子量僅獲自重組芽孢桿菌菌株中，其中將編 碼來自類馬鏈球菌的乙醯透明質酸合酶基因的基因和編碼來自枯草芽孢桿菌的UDP葡糖 脫氫酶的基因整合入在amyQ啟動子調控下的枯草芽孢桿菌基因組中，其中同時失活枯草 芽孢桿菌內源cxpY基因(其編碼細胞色素P450氧化酶)。Chien和Lee (2007, Biotechnol. Prog. Online publication, ASAP Article 10. 1021/bp070036w，S8756-7938(07)00036-7) 描述了多種的重組枯草芽孢桿菌菌株。已轉化有編碼乙醯透明質酸合酶的核酸序列和編碼 UDP葡糖脫氫酶的核酸序列的菌株合成最高1. 14g/l的乙醯透明質酸。除轉化有剛剛提及 的核酸序列外還轉化了編碼透明顫菌屬(Vitreoscilla)血紅蛋白的核酸序列的菌株合成 1. 8g/l的乙醯透明質酸。W0 06 032538描述了轉化有編碼乙醯透明質酸合酶的核酸分子的轉基因植物。清 楚地表明了在正在討論的植物中乙醯透明質酸的合成。W0 05 012529描述了使用編碼來自小球藻感染病毒的乙醯透明質酸合酶的核酸
5分子轉化的轉基因菸草植株的產生。在W0 05 012529中，一方面使用編碼小球藻病毒菌株 CVH1的乙醯透明質酸合酶的核酸序列，另一方面使用編碼小球藻病毒菌株CVKA1的乙醯透 明質酸合酶的核酸序列來轉化菸草植株。僅用編碼分離自小球藻病毒菌株CVKA1的乙醯透 明質酸合酶的核酸轉化的植物能證明乙醯透明質酸的合成。對於轉化有編碼分離自小球藻 病毒菌株CVH1的乙醯透明質酸合酶的核酸轉化的菸草植株，不可能在相應的轉基因植物 中檢測到乙醯透明質酸的合成。W0 05 012529中唯一產乙醯透明質酸的轉基因菸草植株所 合成的乙醯透明質酸的量表述為每ml測定體積中約4. g的乙醯透明質酸，考慮到對於 進行所述實驗的描述，其對應於約每克植物材料鮮重最高12 y g乙醯透明質酸的量。W0 2007 039314描述了具有乙醯透明質酸合酶活性和額外增加的穀氨醯胺果 糖6-磷酸醯胺轉移酶(GFAT)活性的轉基因植物。這些植物相比於僅具有乙醯透明質酸合 酶活性的植物合成了增加量的乙醯透明質酸。由這些菸草植株合成的乙醯透明質酸的最大 量為用於測定的每克植物材料鮮重的約0. 03% (見W0 2007 039316中的圖5)。W0 2007 039316描述了與野生型植物相比具有乙醯透明質酸合酶活性以及額 外增加的穀氨醯胺果糖6-磷酸醯胺轉移酶(GFAT)活性和增加的UDP葡萄糖脫氫酶 (UDP-Glc-DH)活性的轉基因植物。這些植物相比於具有乙醯透明質酸合酶活性以及同 時具有蛋白質(具有GFAT活性)的活性的植物合成了增加量的乙醯透明質酸。由這些 菸草植株合成的乙醯透明質酸的最大量為用於測定的每克植物材料鮮重的0.2% (見TO 2007039316 中的圖 6)。此外，W0 2007 039316包含了蛋白質列表，所述蛋白質能在植物細胞中表達以在 植物細胞中進一步增加合成的乙醯透明質酸的量。W0 2007039316中提出的蛋白質為酶的 隨機列表，所述酶在多種有機體中參與了 UDP-GlcNAc的合成。列於W0 2007 039316中的 蛋白質具有多種酶功能。W0 2007 039316未給予說明列出的酶當在轉基因植物中表達時是 否可能確實增加乙醯透明質酸的含量或哪一種酶能確實增加乙醯透明質酸的含量。由軟骨素合酶從UDP-葡糖醛酸(UDP-GlcA)和UDP_N_乙醯基-半乳糖胺 (UDP-GalNAc) (UDP-N-乙醯基-葡糖胺(UDP-GlcNAc)的表異構物)開始來催化軟骨素/ 皮膚素([3-1，4)]_[葡糖醛酸-0_1，4-N-乙醯半乳糖胺]n)的二糖鏈的合成(Kitagawa 等，2001，J Biol Chem 276 (42)，38721-38726)。通過表異構酶，軟骨素的葡糖醛酸分子可 轉化為艾杜糖醛酸。如果超過10%的葡糖醛酸分子以艾杜糖醛酸存在，則聚合物稱為皮膚 素。隨後經其他酶催化在二糖鏈的軟骨素或皮膚素的多個位置上引入硫酸根，導致硫酸軟 骨素/皮膚素的形成。此處，硫酸化程度因分子不同而不同。有時候，已將硫酸軟骨素作為治療骨關節炎的潛在有效化合物來討論(Clegg等， 2006, The New England Journal of Medicine 354(8)，795—808)。肝素/乙醯肝素合酶從UDP-G1 cA和UDP-G1 cNAc開始催化肝素/乙醯肝素 (heparosans) 二糖鏈([a _1，4]_[葡糖醛酸_1，4_ 葡糖胺]n 或[a_l，4]_[艾杜糖 酸酸-a-1，4-葡糖胺]n)的合成(DeAngelis 和 White，2004，J. Bacteriology 186(24)， 8529-8532)。h印arosans的葡糖醛酸分子可通過表異構酶轉化為艾杜糖醛酸。在乙醯肝 素二糖鏈多個位置上引入硫酸根隨後由其他酶催化，導致肝素或硫酸乙醯肝素的形成。硫 酸肝素比硫酸乙醯肝素具有顯著更多的硫酸根替代。硫酸肝素具有約90%的艾杜糖醛酸 分子，而在硫酸乙醯肝素中葡糖醛酸分子佔優勢(Gallagher等，1992，Int. J. Biochem 24，553-560)。如在硫酸軟骨素/硫酸皮膚素的情況中以及硫酸肝素/硫酸乙醯肝素的情況下， 硫酸化程度因分子不同而不同。尤其使用硫酸肝素作為抗凝血劑，例如用於預防和治療血栓形成。目前，通過從動物組織中分離來製備硫酸軟骨素/硫酸皮膚素和硫酸肝素/硫酸 乙醯肝素。硫酸軟骨素主要從牛軟骨(cartillage)或鯊魚軟骨(cartillage)中分離，而 硫酸肝素/硫酸乙醯肝素從豬腸或牛肺中分離。由於硫酸軟骨素/硫酸皮膚素和硫酸肝素 /硫酸乙醯肝素的二糖鏈不具有統一的硫酸化結構，因此難以獲得相同的特定產物。因此， 產物通常為具有不同程度硫酸化的分子的混合物。如早已描述，葡糖胺聚糖，例如硫酸軟骨素或硫酸肝素/硫酸乙醯肝素目前從動 物組織中分離。除了所需物質外，這些組織還包含其他葡糖胺聚糖。如完全可能的話，分離 各葡糖胺聚糖是困難且昂貴的。此外，當使用從動物組織中分離的葡糖胺聚糖時，可在人中 導致疾病的病原微生物和/或其他物質例如BSE或禽流感病原體對動物組織的潛在汙染 形成了問題。在患者中，使用被動物蛋白質汙染的醫學製劑可導致人體不期望的免疫反應 (對於乙醯透明質酸製劑見例如US 4，141，973)，尤其是如果患者對動物蛋白質過敏。此外，從動物粗原料中製備的物質對於一些生活方式是無法接受的，例如對於素 食者或koscher食物製品。從動物組織中分離葡糖胺聚糖的另一個問題實際在於，由於動物組織還包含葡糖 胺聚糖降解酶，因此葡糖胺聚糖的分子量常常在純化過程中下降。可從動物組織中以令人滿意的質量和純度獲得的葡糖胺聚糖的量(產率)是很低 的(例如來自雞冠的乙醯透明質酸0. 079% w/w, EP 0144019，US4, 782，046)，這意味著需 要加工大量的動物組織。由於必須在密閉無菌的容器內並在昂貴的可控培養條件下發酵細菌，因此通過細 菌菌株發酵產生葡糖胺聚糖成本很高(乙醯透明質酸見例如US4，897，349)。此外，可通過 細菌菌株發酵產生的葡糖胺聚糖的量受每種情況中存在的生產裝置的限制。此處，還必須 考慮到作為物理定則的結果，不能將發酵罐建成具有非常大的培養體積。此處可特別要提 及的是，如果可確保，僅用高額的技術消費才可確保在大發酵罐中有效生產所需的培養基 與從外部填料的物質(例如細菌必需的營養源、調節PH值的試劑、氧氣)的均質混合。植物在天然狀態下不產生葡糖胺聚糖，例如乙醯透明質酸、硫酸肝素/硫酸乙醯 肝素、硫酸角質素或硫酸軟骨素/硫酸皮膚素。天然出現的植物自身在其基因組中不具 有編碼催化葡糖胺聚糖合成的蛋白質的任何核酸，並且，儘管已描述並表徵了大量植物碳 水化合物，迄今為止還不可能在未感染的天然植物細胞中檢測到任何提及的葡糖胺聚糖 (Graves 等，1999，Virology 257，15-23)。W0 98 35047 (US 6，444，878)描述了在植物細胞中合成GlcNAc的代謝途徑，其中 葡糖胺經多個連續酶催化反應步驟形成代謝物GlcNAc、N-乙醯基-葡糖胺6-磷酸和N-乙 醯基_葡糖胺1-磷酸並轉化為UDP-GlcNAc。在更高濃度下，葡糖胺6-磷酸對植物細胞是 有毒性的(W0 98 35047)。描述的植物備選代謝途徑包括果糖6-磷酸和葡糖胺反應產生葡糖胺6-磷酸，其 隨後經多步連續酶催化反應步驟形成代謝物葡糖胺1-磷酸和N-乙醯基-葡糖胺1-磷酸 並轉化為 UDP-GlcNAc (Mayer 等，1968，PlantPhysiol. 43，1097-1107)。
迄今為止，仍不清楚植物中合成UDP-GlcNAc的代謝途徑中應修飾哪一種蛋白質 活性以使植物合成增加量的葡糖胺聚糖。因此，本發明的目標是提供用於在植物中製備有效量的葡糖胺聚糖的備選方法和 過程。通過權利要求中涉及的實施方案實現該目標。令人驚奇的是，已發現包含編碼葡糖胺聚糖合酶的核酸分子和額外包含編碼具有 葡糖胺6-磷酸乙醯轉移酶活性的蛋白質的外來核酸分子和編碼具有單功能UDP-N-乙醯 基_葡糖胺焦磷酸化酶活性的蛋白質的外來核酸分子的經遺傳修飾的植物細胞或經遺傳 修飾的植物較(僅)具有葡糖胺聚糖合酶活性的植物細胞或植物產生顯著更高量的葡糖胺 聚糖。因此，本發明涉及包含編碼葡糖胺聚糖合酶的外來核酸分子的經遺傳修飾的植物 細胞或經遺傳修飾的植物，其特徵在於所述經遺傳修飾的植物細胞或所述經遺傳修飾的植 物還包含編碼具有葡糖胺6-磷酸乙醯轉移酶活性的蛋白質的外來核酸分子和編碼具有單 功能UDP-N-乙醯基-葡糖胺焦磷酸化酶活性的蛋白質的外來核酸分子。由於必須在密閉無菌的容器內並在昂貴的可控培養條件下發酵細菌，因此通過細 菌菌株發酵產生葡糖胺聚糖伴隨著高成本(見例如US4，897，349)。此外，可通過細菌菌株 發酵產生的葡糖胺聚糖的量受每種情況中生產裝置的限制。例如目前市售乙醯透明質酸的 高價格說明這種葡糖胺聚糖雖然具有特定特性(例如粘彈性，結合水的高容量)，但不適合 於工業應用。因此，與產生葡糖胺聚糖的已知方法相比，根據本發明的植物細胞和根據本發明 的植物提供這樣的優點，與僅包含葡糖胺聚糖合酶活性的植物細胞或植物相比它們合成了 增加量的葡糖胺聚糖(例如乙醯透明質酸)。此處，根據本發明的經遺傳修飾的植物細胞或根據本發明的經遺傳修飾的植物的 遺傳修飾可以是導致編碼葡糖胺合酶的外來核酸分子及編碼具有葡糖胺6-磷酸乙醯轉移 酶活性的蛋白質的外來核酸分子及編碼具有單功能UDP-N-乙醯基-葡糖胺焦磷酸化酶活 性的蛋白質的外來核酸分子整合到植物細胞或植物的任何遺傳修飾。在本發明的上下文中，術語「葡糖胺聚糖合酶」理解為從底物UDP葡糖醛酸 (UDP-GlcA)和 UDP-N-乙醯基-己糖醛胺(aldohexsosamine) (UDP-AldohexNAc)合成葡糖 胺聚糖的蛋白質。葡糖胺聚糖的催化根據下文的一般反應方案發生nUDP-GlcA+nUDP-AldohexNAc — [GlcA_GlcNAc]n+2nUDP優選地，上文反應順序中製備的UDP-N-乙醯基-己糖醛胺為UDP-N-乙醯基-葡 糖胺或UDP-N-乙醯基-半乳糖胺。在優選的實施方案中，本發明涉及根據本發明的植物細胞或根據本發明的植物， 其中編碼葡糖胺聚糖合酶的外來核酸分子編碼乙醯透明質酸合酶或軟骨素合酶或肝素/ heparosan在本發明的上下文中，術語「乙醯透明質酸合酶」(EC 2.4. 1.212)理解為從底物 UDP葡糖醛酸(UDP-GlcA)和UDPN-乙醯基-葡糖胺(UDP-GlcNAc)合成乙醯透明質酸的蛋 白質。乙醯透明質酸的合成根據下文的反應方案催化nUDP-GlcA+nUDP-GlcNAc — ^ -1,4-[GlcA- 3 -1，3-GlcNAc]n+2nUDP
可將迄今已研究的乙醯透明質酸合酶劃分為兩組1類乙醯透明質酸合酶和II類 乙醯透明質酸合酶(DeAngelis，1999，CMLS, Cellular andMolecular Life Sciences 56， 670-682)。來自脊椎動物的乙醯透明質酸合酶經鑑定到的同功酶進一步進行區分。多個同功 酶以其鑑定的順序用阿拉伯數字來指代(例如hSHASl、hsHAS2、hsHAS3)。已描述了編碼乙醯透明質酸合酶的核酸分子和相應的蛋白質序列，尤其是以 下生物兔(Oryctolagus cuniculus) ocHas2 (EMBL AB055978. 1，US20030235893)、 ocHas3(EMBL AB055979.1, US 20030235893)；各弗各弗(Papioanubis)paHasl(EMBL AY463695. 1)；非洲爪蛙(Xenopus laevis) xlHasl (EMBL M22249. 1，US 20030235893)、 xlHas2(DG42)(EMBLAF168465.1)、 xlHas3(EMBL AY302252.1)；人(Homo sapiens) hsHASl(EMBL D84424.1， US 20030235893)、 hsHAS2(EMBL U54804.1， US20030235893)、 hsHAS3 (EMBL AF232772. 1，US 20030235893)；小鼠(Musmusculus)mmHasl (EMBL D82964. 1， US 20030235893)、mmHAS2 (EMBLU52524. 2，US 20030235893)、mmHas3 (EMBL U86408. 2， US20030235893)；牛(Bos taurus)btHas2(EMBL AJ004951.1， US20030235893)；雞 (Gallus gallus)ggHas2(EMBL AF106940. 1, US20030235893)；大鼠(Rattus norvegicus) rnHas 1 (EMBL AB097568. 1, Itano 等，2004，J. Biol. Chem. 279 (18) 18679-18678)、 rnHas2(EMBLAF008201. 1) ；rnHas 3(NCBI NM_172319. 1, Itano 等，2004，J. Biol. Chem. 279(18) 18679-18678)、馬(Equus caballus)ecHAS2(EMBL AY056582. 1, GI 23428486)、豬(Sus scrofa)sscHAS2(NCBI NM_214053. 1，GI :47522921)、sscHas 3(EMBLAB159675)、斑馬魚(Danio rerio)brHasl (EMBL AY437407)、brHas2 (EMBL AF190742. l)brHas3(EMBLAF190743. 1)；多殺巴斯德氏菌(Pasteurella multocida) pmHas (EMBLAF036004. 2)；釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes) spHas (EMBL, L20853. 1， L21187. 1, US 6，455，304，US 20030235893)；馬鏈球菌 seHas(EMBL AF347022.1， AY173078.1)、乳房鏈球菌(Str印tococcus uberis)suHasA(EMBL AJ242946. 2，US 20030235893)、似馬鏈球菌(Str 印 tococcusequisimilis) seqHas (EMBL AF023876. 1，US 20030235893)；硫磺礦硫化葉菌(Sulfolobus solfataricus) ssHAS (US 20030235893)、 Sulfolobustokodaii stHas (AP000988. 1)、小球藻病毒 1 (Paramecium bursariaChlorella virus 1), cvHAS(EMBL U42580. 3，PB42580，US 20030235893)。在優選的實施方案中，本發明涉及根據本發明的經遺傳修飾的植物細胞或根據本 發明的經遺傳修飾的植物，其中編碼葡糖胺聚糖合酶的外來核酸分子的特徵在於其編碼乙 醯透明質酸合酶。正在討論的編碼乙醯透明質酸合酶的外來核酸分子優選為編碼病毒乙醯 透明質酸合酶的外來核酸分子。優選地，編碼乙醯透明質酸合酶的外來核酸分子編碼感染 藻類的病毒的乙醯透明質酸合酶。關於藻類感染病毒，編碼乙醯透明質酸合酶的外來核酸分子優選編碼小球藻感染 病毒(Paramecium bursaria Chlorella virus)的乙醯透明質酸合酶，尤其優選為小球藻 病毒1的乙醯透明質酸合酶並特別優選為HI菌株的小球藻病毒的乙醯透明質酸合酶。優選地，編碼乙醯透明質酸合酶的外來核酸分子的特徵在於其編碼乙醯透明質酸 合酶，所述乙醯透明質酸合酶的胺基酸序列與SEQ ID NO 2中顯示的胺基酸序列具有至少 70%、優選至少80%、優選至少90%、尤其優選為至少95%並且特別優選為至少98%的同一性。在尤其優選的實施方案中，編碼乙醯透明質酸合酶的外來核酸分子的特徵在於其編 碼具有SEQID NO 2中顯示的胺基酸序列的乙醯透明質酸合酶。在其他實施方案中，編碼乙醯透明質酸合酶的外來核酸分子與SEQ IDN0 1或SEQ ID NO 3中顯示的核酸序列具有至少70%、優選至少80%、優選至少90%、尤其優選為至少 95%並且特別優選為至少98%的同一性。在尤其優選的實施方案中，編碼乙醯透明質酸合 酶的外來核酸分子的特徵在於其具有SEQ ID NO 3中的核酸序列或特徵在於外來核酸分子 序列由於遺傳密碼的簡併性與SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 3中顯示的核酸序列有所不同。2004年8月25日，包含編碼小球藻病毒乙醯透明質酸合酶的合成核酸分子的 質粒IC 341-222根據布達佩斯條約以編號DSM16664保藏於德國微生物菌種保藏中心 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH),德國，不倫瑞克， Mascheroder ffeg lb，38124。顯示於SEQ ID NO 2中的胺基酸序列可來源於整合至質粒IC 341-222中的核酸序列的編碼區並編碼小球藻病毒乙醯透明質酸合酶。因此，本發明還涉及根據本發明的經遺傳修飾的植物細胞或根據本發明的經遺傳 修飾的植物，其中編碼乙醯透明質酸合酶的核酸分子的特徵在於其編碼蛋白質，所述蛋白 質的胺基酸序列可來源於插入至質粒DSM16664中的核酸序列的編碼區，或特徵在於其編 碼蛋白質，所述蛋白質的胺基酸序列與可來源於插入至質粒DSM16664中的核酸序列的編 碼區的胺基酸序列具有至少70%、優選至少80%、優選至少90%、尤其優選為至少95%並 且特別優選為至少98%的同一性。本發明還涉及根據本發明的經遺傳修飾的植物細胞或根據本發明的經遺傳修飾 的植物，其中編碼乙醯透明質酸合酶的外來核酸分子的特徵在於它是整合至質粒DSM16664 中的乙醯透明質酸合酶編碼核酸序列，或者特徵在於它與整合至質粒DSM16664中的核酸 序列具有至少70%、優選至少80%、優選至少90%、尤其優選至少95%並且特別優選至少 98%的同一性。在本發明的上下文中，術語「軟骨素合酶」(EC 2.4. 1. 175，EC 1.4. 1.226)理解 為蛋白質或由兩個蛋白質組成的蛋白質複合體，其從底物UDP葡糖醛酸(UDP-GlcA)和 UDP-N-乙醯基-半乳糖胺(UDP-GalNAc)合成軟骨素。軟骨素合成根據下文的反應方案催 化nUDP-GlcA+nUDP-GalNAc — ^ -1,4-[GlcA- 3 _1，3-GalNAc]n+2nUDP在一些生物體中，由兩個不同蛋白質組成的軟骨素合酶酶複合體催化附著在蛋白 聚糖上的軟骨素分子的延伸。兩個蛋白質中的一個蛋白質N-乙醯基氨基半乳糖基轉移酶 II (EC 2.4. 1. 175)經0-1，4_附著向軟骨素分子添加N-乙醯基-半乳糖胺單體，第二個蛋 白質N-乙醯基氨基半乳糖基蛋白聚糖3-0葡糖苷酸基轉移酶(EC 2.4.1.226)經0-1， 3_附著向軟骨素分子添加葡糖醛酸單體。然而，本領域技術人員也熟悉雙功能蛋白質，在所 述雙功能蛋白質中，單個蛋白質向軟骨素分子添加N-乙醯基-半乳糖胺單體以及葡糖醛酸 單體。在其他優選的實施方案中，本發明涉及根據本發明的經遺傳修飾的植物細胞或根 據本發明的經遺傳修飾的植物，其中編碼葡糖胺聚糖合酶的外來核酸分子的特徵在於其編 碼軟骨素合酶。 本發明的優選實施方案涉及根據本發明的經遺傳修飾的植物細胞或根據本發明的經遺傳修飾的植物，其中編碼軟骨素合酶的外來核酸分子編碼向軟骨素分子附加N-乙 醯基_半乳糖胺單體以及葡糖醛酸單體的雙功能軟骨素合酶。在本發明的上下文中，術語「雙功能軟骨素合酶」理解為其中N-乙醯基氨基半乳 糖基轉移酶II(EC 2.4. 1. 175)活性以及乙醯氨基半乳糖基蛋白聚糖3-0葡糖苷酸基轉移 酶(EC 2. 4. 1. 226)活性存在於一個分子中的蛋白質。例如，已從細菌(例如大腸桿菌(Escherichiacoli)US2003109693、EP 1283259) 中描述了編碼單功能軟骨素合酶的核酸分子和源於其的胺基酸序列。例如，已從哺乳動物中(例如人W0 03012099、US 2005048604、US2006052335、 NCBI acc. No :BC046247. 1， BC023531. 2 ；Kitagawa ，2001， J. Biol. Chem. 276(42)， 38721-38726)或 Pasteurella multicoda 中(US2003104601、EMBL acc. No :AF195517， DeAngelis 和 Padgett-McCue，2000，J. Biol. Chem. 275 (31)，24124-24129)描述了編碼雙功 能軟骨素合酶的核酸分子和源於其的胺基酸序列。編碼軟骨素合酶的外來核酸分子優選為編碼細菌軟骨素合酶，優選編碼來自巴斯 德菌屬的軟骨素合酶，尤其優選編碼來自出血敗血性巴斯德菌的軟骨素合酶的外來核酸分 子。優選地，編碼軟骨素合酶的外來核酸分子的特徵在於其編碼軟骨素合酶，所述軟 骨素合酶的胺基酸序列與SEQ ID NO 5中顯示的胺基酸序列具有至少70%、優選為至少 80%、優選至少90%、尤其優選為至少95%並且特別優選為至少98%的同一性。在尤其優 選的實施方案中，編碼軟骨素合酶的外來核酸分子的特徵在於它編碼具有SEQ ID N0 5中 顯示的胺基酸序列的軟骨素合酶。在其他實施方案中，編碼軟骨素合酶的外來核酸分子與SEQ ID NO 4中顯示的核 酸序列具有至少70%、優選為至少80%、優選至少90%、尤其優選為至少95%並且特別優 選為至少98%的同一性。在尤其優選的實施方案中，編碼軟骨素合酶的核酸分子的特徵在 於它具有SEQ ID NO 4中所示的核酸序列或特徵在於外來核酸分子序列由於遺傳密碼的簡 並性與SEQ ID NO 4中所示的核酸序列有所不同。在本發明的上下文中，術語「肝素/乙醯肝素合酶」或「 h印arosan合酶」(EC 2. 4. 1. 224、EC 2. 4. 1. 225)理解為從底物UDP葡糖醛酸(UDP-GlcA)和UDP-N-乙醯基-葡 糖胺(UDP-GlcNAc)合成肝素/乙醯肝素的蛋白質或由兩個蛋白質組成的酶複合體。肝素 /乙醯肝素的合成根據下文的反應方案催化nUDP-GlcA+nUDP-GlcNAc — a -1,4-[GlcA-beta-1，4-GlcNAc]n+2nUDP例如，已從細菌中(出血敗血性巴斯德菌EMBL acc. Nos :AF425591、AF439804、 AY292199、AY292200、US 20030099967，大腸桿菌 EMBL acc. No :X77617. 1)或人中(NCBI acc. Nos :BC001174. 1,NM_207122. 1)描述了編碼肝素/乙醯肝素合酶的核酸分子和來源於
其的胺基酸序列。在一些生物體中，由兩種不同蛋白質組成的肝素/乙醯肝素合酶酶複合體催化 附著在蛋白聚糖的肝素/乙醯肝素分子的延伸。兩個蛋白質中的一個蛋白質葡糖苷酸 基-N-乙醯基葡糖胺基蛋白聚糖4-a -N-葡糖胺基轉移酶(EC 2. 4. 1. 224)經0 -1,4-附 著向肝素/乙醯肝素分子添加N-乙醯基-葡糖胺單體，第二個蛋白質N-乙醯基-葡糖胺 基蛋白聚糖4-0-葡糖苷酸基(glucoronosyl)轉移酶(EC 2.4.1.225)經0-1，3-附著向
11肝素/乙醯肝素分子添加葡糖醛酸單體。然而，本領域技術人員也熟悉雙功能蛋白質，在所 述雙功能蛋白質中，單個蛋白質向肝素/乙醯肝素分子添加N-乙醯基_葡糖胺單體以及 葡糖酸酸單體。例如已在人中(Busse 和 Kusche-Gullberg，2003，J. Biol. Chem. 278(42), 41333-41337)或巴斯德菌屬中(DeAngelis 和 White，2004，J. Bacteriology 186(24)， 8529-8532)描述了此類雙功能肝素/乙醯肝素合酶。具有肝素/乙醯肝素合酶活性的雙功 能蛋白質具有分類為EC編號2. 4. 1. 224的酶的活性以及分類為EC編號2. 4. 1. 225的酶的 活性。在其他實施方案中，本發明涉及根據本發明的經遺傳修飾的植物細胞或根據本發 明的經遺傳修飾的植物，其中編碼葡糖胺聚糖合酶的外來核酸分子的特徵在於它編碼肝素 /乙醯肝素合酶。本發明的優選實施方案涉及根據本發明的經遺傳修飾的植物細胞或根據本發明 的經遺傳修飾的植物，其中編碼肝素/乙醯肝素合酶的外來核酸分子編碼向肝素/乙醯肝 素分子附加N-乙醯基-葡糖胺單體以及葡糖醛酸單體的雙功能肝素/乙醯肝素合酶。編碼肝素/乙醯肝素合酶的外來核酸分子優選為編碼細菌肝素/乙醯肝素合酶， 優選編碼來自巴斯德菌屬的肝素/乙醯肝素合酶，尤其優選編碼來自出血敗血性巴斯德菌 的肝素/乙醯肝素合酶的外來核酸分子。優選地，編碼肝素/乙醯肝素合酶的外來核酸分子的特徵在於它編碼肝素/乙醯 肝素合酶，所述肝素/乙醯肝素合酶的胺基酸序列與SEQ ID NO 7中顯示的胺基酸序列具 有至少70%、優選為至少80%、優選至少90%、尤其優選為至少95%並且特別優選為至少 98%的同一性。在尤其優選的實施方案中，編碼肝素/乙醯肝素合酶的外來核酸分子的特 徵在於它編碼具有SEQ ID NO 7中顯示的胺基酸序列的肝素/乙醯肝素合酶。在其他實施方案中，編碼肝素/乙醯肝素合酶的外來核酸分子與SEQID N0 6中顯 示的核酸序列具有至少70%、優選為至少80%、優選至少90%、尤其優選為至少95%並且 特別優選為至少98%的同一性。在尤其優選的實施方案中，編碼肝素/乙醯肝素合酶的核 酸分子的特徵在於它具有SEQ ID NO 6中所示的核酸序列或特徵在於外來核酸分子的序列 由於遺傳密碼的簡併性而與SEQ ID NO 6中所示的核酸序列有所不同。在本發明的上下文中，術語「葡糖胺磷酸N-乙醯基轉移酶(乙醯-CoA :D葡糖胺磷 酸N-乙醯基轉移酶或GlcN-P乙醯基轉移酶)，，(EC 2. 3. 1. 4)理解為從底物D葡糖胺磷酸 (GlcN-P)和乙醯CoA(AcCoA)合成N-乙醯基-D葡糖胺磷酸(GlcNAc-P)的蛋白質。N-乙 醯基_葡糖胺6-磷酸的合成根據下文的反應方案催化GlcN-P+AcCoA — GlcNAc-P+CoASH在所示的反應方程式中，底物GlcN-P可以是葡糖胺1-磷酸(GlcN-1-P)或葡糖胺 6_ 磷酸(GlcN-6-P)。在正在討論用於合成UDP-N-乙醯基-葡糖胺的代謝途徑中，所研究的細菌和真核 生物間的根本差異在於正在討論的代謝途徑不同的中間產物用作乙醯化反應的底物。在細 菌生物中，通過具有GlcN-1-P乙醯轉移酶(EC2. 3. 1. 157)活性的蛋白質進行GlcN_l_P的 乙醯化(Gehring等，1996，Biochemistry 35，579-585)，而在真核動物或真菌中通過具有 葡糖胺6-磷酸乙醯轉移酶(EC 2. 3. 1. 4)活性的蛋白質催化GlcN-6-P的乙醯化(Milewski 等，2006，Yeast 23，1-14，在 Wiley InterScience 中在線發表，D0I 10. 1002. /yea. 1337)。因此，在不同生物中使用不同的底物和不同的蛋白質來合成UDP-G1 cNAc。令人驚奇的是，已發現與現有技術(W0 2007 023682)中公開內容不同，不可能通 過向植物細胞中引入編碼具有GlcN-P乙醯轉移酶活性的蛋白質的任何核酸分子來在植物 細胞中增加合成的葡糖胺聚糖的量。當然，已發現引入外來核酸分子(其編碼具有乙醯化 GlcN-1-P的GlcN-P乙醯轉移酶活性的蛋白質(例如來自大腸桿菌的glmu))不能導致植物 細胞或植物合成的葡糖胺聚糖量的增加。因此，對於根據本發明的植物細胞或根據本發明 的植物而言外來核酸分子編碼具有GlcN-P乙醯轉移酶(其使用GlcN-6-P作為乙醯化反應 的底物並因此是具有GlcN-6-P乙醯轉移酶活性的蛋白質(EC 2.3. 1.4))活性的蛋白質是 至關重要。相反，編碼具有GlcN-1-P乙醯轉移酶活性(EC 2. 3. 1. 157)(其使用GlcN-1-P 用於乙醯化反應的)的蛋白質的外來核酸分子不適合於產生根據本發明的植物細胞或根 據本發明的植物。此外，已發現具有外來核酸分子的植物細胞或植物不能合成顯著更高量的葡糖胺 聚糖，所述外來核酸分子編碼葡糖胺6-磷酸變位酶(GlcN-6-P變位酶)(其催化GlcN-6-P 向GlcN-1-P異構化)。在本發明的上下文中，術語「葡糖胺6-磷酸乙醯轉移酶(乙醯CoA :D葡糖胺6_磷 酸N-乙醯基轉移酶或GlcN-6-P乙醯轉移酶)」(EC 2. 3. 1. 4)應理解為從底物D-葡糖胺 6_磷酸(GlcN-6-P)和乙醯CoA(AcCoA)合成N-乙醯基_D_葡糖胺6-磷酸(GlcNAc-6-P) 的蛋白質。N-乙醯基-葡糖胺6-磷酸的合成根據下文的反應方案催化GlcN-6-P+AcCoA — GlcNAc-6-P+CoASH具有GlcN-6-P乙醯轉移酶活性的蛋白質的功能形式為同質二聚體。單體的三級 結構具有中心核區。該核區由具有五條逆平行鏈(0鏈1-5)(其由四條a螺旋環繞)和 第六條0鏈(0-6鏈)的0摺疊片結構組成。在同質二聚體的形成過程中，亞基的3-6 鏈與其他各個亞基相應的0-6鏈間具有相互作用。SEQ ID No 9 (EMBL acc. No :AB017626. 1)中顯示的胺基酸序列編碼具有來自釀酒 酵母(Saccharomyces cerevisiae)的GlcN_6_P乙醯轉移酶活性的蛋白質。在SEQ ID No 9 中顯示的胺基酸序列中，7-11位胺基酸形成0-1鏈，13-26位胺基酸形成a-1鏈，37-47位 胺基酸形成a-2鏈，62-69位胺基酸形成3-2鏈，74-86位胺基酸形成3-3鏈，92-103位氨 基酸形成3 -4鏈，111-125位胺基酸形成a -3鏈，130-136位胺基酸形成3 _5鏈，139-146 位胺基酸形成a -3鏈以及154-159位胺基酸形成0 _6鏈。SEQ ID No 9中顯示的序列中 的3 -4鏈中存在的胺基酸Glu (98位)、Asp (99位)和lie (100位)與底物AcCoA相互作 用，它們將它的羰基鍵極化並且穩定由AcCoA和GlcN-6-P以及GlcN_6_P乙醯轉移酶組成 的四聚反應中間產物中的AcCoA的氧原子的負電荷。SEQ ID No 9中顯示的序列中的胺基酸 Tyr (143位)穩定了待將切除的CoA分子的硫醇鹽陰離子。SEQ ID No 9中顯示的序列中的 胺基酸Leu(133位)支持了反應催化過程中的這些相互作用。在反應催化過程中，GlcN-6-P 結合在同質二聚體的單體間形成的袋之中，0-6鏈的胺基酸殘基參與了其形成。在反應 催化過程中，SEQ ID似9中顯示的序列中的胺基酸4印(134位)增加了61(^-6- 氨基的 親核性(Milewski 等，2006,在線發表於 Wiley InterScience, www. interscience. wiley. com, D0I =10. 1002/yea. 1337)。參與正在討論的反應催化的具有GlcN-6-P乙醯轉移酶活 性的蛋白質的其他胺基酸描述於Peneff等(2004，J. Biological Chemistry 276(19)，16328-16334，圖 1)。也可以在來自其他生物的編碼具有GlcN-6-P乙醯轉移酶活性的蛋白質的胺基酸 序列中鑑定出此處以示例性方式指出的參與催化反應的釀酒酵母胺基酸序列中的胺基酸。 例如,這些是來自白色念珠菌(Candidaalbicans) (EMBL acc. No :AB017627. 1)的編碼具有 GlcN-6-P乙醯轉移酶活性的蛋白質的胺基酸序列中的胺基酸Glu88、Asp80、11 e90、Asp 124 和 Tyrl33。已描述了編碼具有GlcN-6-P乙醯轉移酶活性的蛋白質的核酸分子和相應 的蛋白質序列，尤其來自以下生物釀酒酵母(EMBL acc. No :AB017626. 1)、裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe) (EMBL acc. No :AB017629. 1)、白色念珠菌(EMBL acc. No :AB017627. 1)、米麴黴(Aspergillus oryzae) (EMBL CDS acc. No :BAE62756. 1)、秀麗 隱杆線蟲(Caenorhabditis elegans) (NCBI acc. No :NM_073253. 4，EMBL CDS acc. No BAA63497. 1，CAA044531. 1)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster) (EMBL CDS acc. . No AAL13916. 1)>Xenopus traopicalis(EMBL acc. No :CR760021. 2)、/J、鼠(EMBL CDS acc. No BAE39886. 1)、人(EMBL CDSacc. No :BAC03482. 1)、猩猩(Pongo pygmaeus) (EMBL CDS acc. No :CR858996. 1)、Acanthamoeba polyphaga mimivirus(EMBL CDS acc. No :AAV50586. 1)。 儘管如已描述的，參與催化反應的胺基酸殘基在來自多種生物的具有GlcN-6-P乙醯轉移 酶活性的蛋白質中是保守的，但在一些情況下它們的序列相互間具有非常低的同一性。 因此，來自釀酒酵母的編碼具有GlcN-6-P乙醯轉移酶活性的蛋白質的胺基酸序列(EMBL acc. No :AB017626. 1)與來自白色念珠菌的相應序列(EMBL acc. No :AB017627. 1)僅具有 44%的同一性並且與來自裂殖酵母的相應序列(EMBL acc. No :AB017629. 1)甚至僅具有 25% 的同一性(Milewski 等，2006，在線發表於 Wiley InterScience, www. interscience. wiley. com,D0I :10. 1002/yea. 1337)。儘管在正在討論的胺基酸序列相互間同一性低，所有 上文提及的編碼具有GlcN-6-P乙醯轉移酶活性的蛋白質的序列均適合於產生根據本發明 的植物細胞或根據本發明的植物。根據本發明，編碼具有GlcN-6-P乙醯轉移酶酶活性的蛋白質的外來核酸分子可 來自任何生物；優選地，所述核酸分子來自真菌、動物或植物，尤其優選來自真菌並特別優 選來自釀酒酵母。優選地，編碼GlcN-6-P乙醯轉移酶的外來核酸分子的特徵在於它編碼GlcN-6-P 乙醯轉移酶，其胺基酸序列與SEQ ID NO 9中顯示的胺基酸序列具有至少70%、優選為至少 80%、優選至少90%、尤其優選為至少95%並且特別優選為至少98%的同一性。在尤其優 選的實施方案中，編碼具有GlcN-6-P乙醯轉移酶活性的蛋白質的外來核酸分子的特徵在 於它編碼具有GlcN-6-P乙醯轉移酶活性的蛋白質，所述蛋白質具有SEQ ID NO 9中顯示的 胺基酸序列。在其他實施方案中，編碼具有GlcN-6-P乙醯轉移酶活性的蛋白質的外來核酸分 子與SEQ ID NO 8中顯示的核酸序列具有至少70%、優選為至少80%、優選至少90%、尤 其優選為至少95%並且特別優選為至少98%的同一性。在尤其優選的實施方案中，編碼 GlcN-6-P乙醯轉移酶的核酸分子的特徵在於它具有SEQ ID NO 8中顯示的核酸序列或特徵 在於所述外來核酸分子序列由於遺傳密碼的簡併性而與SEQ ID NO 8中所示的核酸序列有 所不同。
在本發明的上下文中，術語「UDP-GlcNAc焦磷酸化酶(2_乙醯胺基_2_脫氧-d_葡 萄糖1-磷酸尿苷醯轉移酶)(EC 2. 7. 7. 23)，，理解為從底物尿苷三磷酸(UTP)和N-乙醯 基-D-葡糖胺1-磷酸(GlcNAc-1-P)合成UDP-N-乙醯基-葡糖胺(UDP-GlcNAc)的蛋白質。 UDP-GlcNAc的合成根據下文的反應方案催化 具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的原核生物蛋白質通常為雙功能蛋白質，其除 了上文顯示的反應(EC 2. 7. 7. 23)外，還具有葡糖胺1-磷酸乙醯轉移酶(GlcN-1-P乙醯轉 移酶，EC 2. 3. 1. 157)的功能，即它們催化葡糖胺1-磷酸(GlcN-1-P)向N-乙醯基-葡糖 胺 1-磷酸(GlcNAc-1-P)的 N-乙醯基化(GlcN-l-P+AcCoA —GlcNAc-l-P+CoASH) (Gehring 等，1996, Biochemistry 35，579-585)。相反，具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的真核生物 蛋白質為僅催化上述反應
的單 功能蛋白質(Mio 等，1998，J. Biol. Chem. 273(23)，14392-14397)。在本發明的上下文中，術語「具有UDP-G1 cNAc焦磷酸化酶活性的單功能蛋 白質」理解為催化上文描述的針對具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白質的反應
的蛋白質。具有 udp-gicnac 焦磷 酸化酶活性的單功能蛋白質不(額外)具有催化GlcN-1-P向GlcNAc-1-P乙醯化的活性。 因此，將具有GlcNAc焦磷酸化酶活性的單功能蛋白質分類在EC編號2. 7. 7. 23中，而具有 UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的雙功能蛋白質具有分類在EC編號2. 7. 7. 23中的酶的活性以 及分類在EC編號2. 3. 1. 157中的酶的活性。令人驚奇的是，已發現與現有技術中的公開內容(例如W0 2007023682)不同的 是，具有編碼具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性和GlcN-1-P乙醯轉移酶活性的雙功能蛋白 質(例如glmU aus大腸桿菌，EC2. 7. 7. 23和EC 2. 3. 1. 157)的外來核酸分子的根據本發明 的植物細胞或根據本發明的植物不能合成增加量的葡糖胺聚糖。因此，編碼UDP-GlcNAc焦 磷酸化酶的外來核酸分子編碼具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶(EC 2. 7. 7. 23)活性的單功能 蛋白質對於根據本發明的植物細胞或根據本發明的植物是必需的。因此，編碼UDP-GlcNAc 焦磷酸化酶的外來核酸分子不應該編碼蛋白質，其除了剛提及的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶 活性外還具有額外的GlcN-1-P乙醯轉移酶(EC 2. 3. 1. 157)活性。因此，它優選為真核來 源的外來核酸分子。此外，令人驚奇的是，已發現與現有技術中的公開內容(例如W0 2007 023682)不同的是，乙醯葡糖胺磷酸變位酶(GlcNAc-P變位酶，EC 5.4.2.3)的表達以及具 有G1 cN-6-P乙醯轉移酶活性的蛋白質的表達和具有UDP-G1 cNAc焦磷酸化酶活性的蛋白質 的表達不會導致植物細胞或植物中葡糖胺聚糖量的進一步增加。編碼具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的單功能蛋白質的胺基酸序列包含在蛋白 質間高度保守的胺基酸殘基。編碼具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的真核蛋白質的氨基 酸序列在每種情況下具有蛋白質間保守的三個結構域。第一個結構域的共有序列為GlyGly GlnXxxThrArgLeuGlyXxxXxxXxxProLysGly(SEQ ID No 11 中顯示的序列的 111-124 位氨基 酸)，第二個結構域的共有序列為 Pro (Asp 或Asn) GlyAsn (Gly 或Ala) GlyXxxXxxXxxAla (SEQ ID No 11中顯示的序列的219-228位胺基酸)並且第三個結構域的共有序列為LysXxxG luXxxPheXxxPheAspXxxPhe (SEQ ID No 11 中顯示的序列的 377-386 位胺基酸)，其中 Xxx 為任何胺基酸。具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的原核蛋白質(例如glmU aus大腸桿菌，EMBL acc.No :EAY46949. 1)具有與來自真核生物中相應蛋白質的第一個結構域相似的 保守結構域(GlyXxxGlyThr(Arg或Ser)XxxXxxXxxXxxProLys)。對於真核蛋白質的第二個 或第三個結構域，在原核蛋白質中未發現相應的結構域。(Mok和Edwards，2000，J.Biol. Chem. 280(47)，39363-39372)SEQ ID No 11中顯示的胺基酸序列中的胺基酸Gly (112位)、Gly (114位)、 Thr(115 位)、Arg(116 位)、Pro (122 位)和 Lys(123 位)在編碼具有 UDP-GlcNAc 焦磷酸 化酶活性的蛋白質的一級序列中是保守的。SEQ ID No 11中顯示的胺基酸序列中的胺基酸 Gly(112位)、Arg(116位)或Lys(123位)的替換導致近乎失活的蛋白質。相反，SEQ ID No 11中顯示的胺基酸序列中的胺基酸Gly (114位)、Thr (115位)或Pro (122位)的替換 僅顯示了正在討論的蛋白質活性的降低。因此，SEQ ID No 11中顯示的胺基酸序列中的氨 基酸Gly (112位)、Arg(116位)和Lys(123位)是在具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的 蛋白質中具有催化功能的胺基酸(Mio等，1998，J. Biol. Chem. 273(23)，14392-14397)。在編碼來自腸賈第鞭毛蟲(Giardia intestinales)的具有UDP-GlcNAc焦磷 酸化酶活性的蛋白質的胺基酸序列中(EMBL ￡1(^.唚441154702.1)，胺基酸617(108位) 對應於SEQ ID No 11中顯示的序列的胺基酸Gly(112位)。編碼來自腸賈第鞭毛蟲的 具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白質的胺基酸序列中的胺基酸Gly (108位)經氨 基酸Ala的替換也導致了蛋白質活性的幾乎完全降低(Mok和Edwards，2005，J.Biol. Chem. 280 (47)，39363-39372)。編碼來自人的具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白 質的胺基酸序列(EMBL acc.No :BAA31202. 1)中的胺基酸Gly (111位)(其對應於SEQ ID No 11中顯示的序列中的胺基酸Gly(112位))的替換也導致了活性的幾乎完全降低 (Wang-Gillam 等，2000，J. Biol. Chem. 275 (2)，1433-1438)。編碼來自人的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶的蛋白質(EMBL acc. No :BAA31202)中的 胺基酸Gly (222位)和來自腸賈第鞭毛蟲的相應蛋白質(EMBL acc. No :AAM54702. 1)中 的相應胺基酸Gly (210位)的替換在兩種情況下均同樣導致了活性的幾乎完全喪失，這說 明所述胺基酸同樣為參與了催化的胺基酸(Mok和Edwards，2005，J. Biol. Chem. 280(47)， 39363-39372)。編碼來自人的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶的蛋白質(EMBLacc. No :BAA31202) 中的胺基酸Gly (224位)的替換導致了蛋白質活性相當大但不完全的喪失，並且胺基酸 Pro(222位)的替換僅導致了活性輕微下降。從中推斷出SEQ ID No 11中顯示的序列 的胺基酸Gly (221位)和Gly (223位)參與了 UTP的識別，並且在SEQ ID No 11中顯 示的序列的胺基酸Gly (111位)和Gly (112位)(在各自一級序列中保守)參與了結合 GlcNAc-l-P (Wang-Gillam 等，2000，J. Biol. Chem. 275(2)，1433-1438)。已描述了編碼具有上文提及特性的具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶單功能活性 的蛋白質的核酸分子和相應蛋白質序列，尤其是在以下生物中腸賈第鞭毛蟲(Giardia intestinales)(EMBL acc. No :AAM54702. 1)、釀酒酵母(EMBL acc. No :X79380. 1，NCBI protein ID-accession No :CAA557927)、白色念珠菌(NCBI acc. No :XM_715480. 1)、 Pichia stipitis(NCBI acc. No :XM_001385151. 1)、小鼠(NCBI acc. No :NM_133806. 4)、 Can is lupus (NCBI acc. No :XM_844774. 1)；牛(NCBI acc. No :NM_001046404. 1)、Xenopus tropicalis(NM_001011142. 1)、非洲爪蛙(Xenopus laevis) (NCBI acc. No :BC077836. 1)、 擬南芥(Arabidopsisthaliana) (NCBI acc. No :NM_102845. 4)、Danio rerio (NCBI acc. No NM_212621. 1)、人(NCBI acc. No :NM_003115. 3，EMBL acc. No. :BAA31202. 1)。根據本發明，編碼具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶酶活性的蛋白質的外來核酸分子 可來自任何真核生物；優選地，所述核酸分子來自真菌、動物或植物，尤其優選來自真菌，特 別優選來自釀酒酵母。優選地，編碼具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白質的外來核酸分子的特徵 在於它編碼UDP-GlcNAc焦磷酸化酶，其胺基酸序列與SEQ IDN0 11中顯示的胺基酸序列具 有至少70%、優選為至少80%、優選至少90%、尤其優選為至少95%並且特別優選為至少 98%的同一性。在尤其優選的實施方案中，編碼具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白質 的外來核酸分子的特徵在於它編碼具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的且具有SEQ ID NO 11中顯示的胺基酸序列的蛋白質。在其他實施方案中，編碼具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白質的外來核酸 分子與SEQ ID NO 10中顯示的核酸序列具有至少70%、優選為至少80%、優選至少90%、 尤其優選為至少95%並且特別優選為至少98%的同一性。在尤其優選的實施方案中，編碼 UDP-GlcNAc焦磷酸化酶的核酸分子的特徵在於它具有SEQ ID NO 10中顯示的核酸序列或 特徵在於所述外來核酸分子序列由於遺傳密碼的簡併性而與SEQ ID NO 10中所示的核酸 序列有所不同。在本發明的上下文中，術語「外來核酸分子」理解為分子，其不天然存在於相應的 野生型植物細胞中或不天然存在於野生型植物細胞中具體的空間排布中或其定位於野生 型植物細胞的基因組中其天然不存在的位點上。優選地，外來核酸分子為包含不同元件的重組分子，所述元件的組合或特異的空 間排列不天然存在於植物細胞中。在本發明的上下文中，術語「重組核酸分子」理解為包含不同核酸分子(其不以在 重組核酸分子中存在的組合天然存在)的核酸分子。因此，重組核酸分子除了包含編碼葡 糖胺聚糖合酶和/或具有GlcN-6-P乙醯轉移酶活性的蛋白質和/或具有UDP-GlcNAc焦 磷酸化酶活性的蛋白質的核酸分子之外，還包含不與所述核酸分子存在天然組合的核酸序 列。以在重組核酸分子上與編碼葡糖胺聚糖合酶和/或具有GlcN-6-P乙醯轉移酶活性的 蛋白質和/或具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白質的核酸分子組合存在的所述額外 核酸分子可以是任何序列。例如，它們可以是植物基因組核酸序列。額外的核酸序列優選 為調控序列(啟動子、終止信號、增強子)，尤其優選為在植物組織中有活性的調控序列， 特別優選為在植物組織中有活性的組織特異性調控序列。用於產生重組核酸分子的方法 為本領域技術人員所知並且包括基因工程方法，例如通過連接來結合核酸分子、遺傳重組 或核酸分子的從頭合成(例如見 Sambrok 等，Molecular Cloning, ALaboratory Manual, 第三版(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. ISBN 0879695773,Ausubel等，Short Protocols inMolecular Biology,John Wiley & Sons ；第 五版(2002)，ISBN 0471250929)。本發明優選的實施方案涉及根據本發明的植物細胞或根據本發明的植物，其中外 來核酸分子穩定整合到植物細胞或植物的基因組中。其基因組中(穩定)整合了外來核酸分子或者其基因組中整合了多個外來核酸 分子的經遺傳修飾的植物細胞和經遺傳修飾的植物可以與野生型植物細胞和野生型植物區分開來，尤其是通過它們分別包含野生型植物細胞和野生型植物中天然不存在的外來核 酸分子的事實，或因為此分子整合到根據本發明的經遺傳修飾的植物細胞基因組或根據本 發明的經遺傳修飾的植物基因組這樣的位點上，(其分別整合到在野生型植物細胞和野生 型植物中不發生的位點上，即整合在不同的基因組環境中)的事實而區分開來，所述外來 核酸分子編碼葡糖胺聚糖合酶和/或具有GlcN-6-P乙醯轉移酶活性的蛋白質和/或具有 UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白質。此外，此類根據本發明的經遺傳修飾的植物細胞和 根據本發明的經遺傳修飾的植物可分別與非遺傳修飾的野生型植物細胞和非遺傳修飾的 野生型植物區分開來，因為如果適當時除了包含天然存在於野生型植物細胞或野生型植物 中的該分子的拷貝外，還包含整合到其基因組中的至少一個拷貝的外來核酸分子。如果引 入根據本發明的經遺傳修飾的植物細胞或根據本發明的經遺傳修飾的植物中的外來核酸 分子是早已天然存在於野生型植物細胞或野生型植物中的分子的額外拷貝，根據本發明的 經遺傳修飾的植物細胞和根據本發明的經遺傳修飾的植物可分別與野生型植物細胞和野 生型植物區分開來，尤其是通過該額外拷貝/這些額外拷貝分別定位在野生型植物細胞基 因組和野生型植物基因組中非天然存在的位點的事實區分開來。可通過遺傳方法和/或分子生物學方法來證實核酸分子向植物細胞或植物的基 因組中的整合。核酸分子向植物細胞的基因組或植物基因組中的穩定整合的特徵在於在已 遺傳了所述核酸分子的後代中，穩定整合的核酸分子所處於的基因組環境與親代中的基因 組環境相同。使用本領域技術人員已知的方法，尤其是在RFLP分析(限制性片段長度多態 性)的 DNA 印跡分析(Nam 等，1989，The Plant Cell 1，699-705 ;Leister 和 Dean，1993， The Plant Journal 4 (4)，745-750)，利用基於PCR的方法，例如，擴增片段中長度差異的分 析(擴增片段長度多態性，AFLP) (Castiglioni 等，1998，Genetics 149，2039-2056 ；Meksem ^,2001,Molecular Genetics andGenomics 265，207-214;Meyer等，1998，Molecular and General Genetics259,150-160)或使用採用限制性內切酶切割擴增片段(切割擴增多態 性序列，CAPS) (Konieczny 和 Ausubel，1993，The Plant Journal 4，403-410 Jarvis 等， 1994，Plant Molecular Biology 24，685-687 ；Bachem 等，1996，ThePlant Journal 9(5)， 745-753)的幫助下來證實植物細胞的基因組中或植物的基因組中核酸序列的穩定整合的 存在。在本發明的上下文中，術語「野生型植物細胞」理解為植物細胞，其作為用於產生 根據本發明的經遺傳修飾的植物細胞的起始材料，即除去引入的遺傳修飾和導致的編碼葡 糖胺聚糖合酶和/或具有GlcN-6-P乙醯轉移酶活性的蛋白質和/或具有UDP-GlcNAc焦磷 酸化酶活性的蛋白質的核酸分子的整合外，它們的遺傳信息對應於根據本發明的經遺傳修 飾的植物細胞的遺傳信息。在本發明的上下文中，術語「野生型植物」理解為植物，其作為用於產生根據本發 明的經遺傳修飾的植物的起始材料，即除去引入的遺傳修飾和導致的編碼葡糖胺聚糖合酶 和/或具有GlcN-6-P乙醯轉移酶活性的蛋白質和/或具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的 蛋白質的核酸分子的整合外，它們的遺傳信息對應於根據本發明的經遺傳修飾的植物的遺 傳信息在本發明的上下文中，術語「基因組」理解為存在於植物細胞中的全部遺傳物質。 對於本領域的技術人員已知的是，除了細胞核外，其他區室(例如質體、線粒體)也包含遺傳物質。可獲得向植物宿主細胞中(穩定)整合核酸分子的大量技術。這些技術包括使用 根瘤農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)或髮根土壤桿菌(Agrobacterium rhizogenes) 用t-DNA作為轉化方法的植物細胞轉化、原生質體融合、注射、DNA電穿孔術、通過生物射 彈轟擊方法引入DNA和其他選項(綜述見於「Transgenic Plants」，Leandro編輯，Humana Press2004, ISBN 1-59259-827-7)。已深入研究並在 EP 120516 ；Hoekema, IN :The Binary Plant VectorSystem Offsetdrukkeri j Kanters B. V. Alblasserdam(1985),第五章；Fraley 等，Crit. Rev. Plant Sci. 4，1-46和An等EMBO J. 4，(1985)，277-287詳盡地描述了農桿菌介導植物細胞轉化的 用途。對於馬鈴薯的轉化，例如見Rocha-Sosa等，EMBO J. 8，(1989)，29-33)，對於番茄植株 的轉化例如見US5，565，347。也已描述了使用基於農桿菌轉化的載體轉化單子葉植物(Chan等，Plant Mol. Biol. 22，(1993) ,491-506 ；Hiei 等，Plant J. 6，(1994)271-282 ；Deng 等，Science in China 33，(1990) ,28-34 ；ffilmink 等，Plant Cell Reportsll, (1992) ,76-80 ；May 等， Bio/Technology 13，(1995)，486-492 ;Conner 和 Domisse，Int. J. Plant Sci. 153(1992)， 550-555 ;Ritchie 等，Transgenic Res. 2，(1993)，252-265)。用於轉化單子葉植物的備 選系統為使用生物射彈轟擊方法的轉化(Wan和Lemaux，Plant Physiol. 104，(1994)， 37-48 ；Vasil 等，Bio/Technology 11(1993)，1553-1558 ；Ritala 等，Plant Mol. Biol. 24， (1994)，317-325 ；Spencer 等，Theor. Appl. Genet. 79，(1990)，625-631)、原生質體轉化、 部分透化處理細胞的電穿孔術、使用玻璃纖維引入DNA。具體而言，已在文獻中數次描述 了玉米的轉化(參考，例如，W095/06128、EP0513849、EP0465875、EP0292435 ；Fromm 等， Biotechnology 8，(1990),833-844 ；Gordon Kamm 等，Plant Cell 2，(1990)，603-618 ； Koziel 等，Biotechnologyll (1993), 194-200 ；Moroc 等，Theor. Appl. Genet. 80, (1990)， 721-726)。也已描述了其他牧草的轉化，例如柳枝稷(Panicum virgatum, Somleva等， 2002Crop Science 42 2080-2087 ；Richards ^,2001, Plant Cell Reporters20,48-54) 或甘鹿(Bower 禾口 Birch，1992，Plant Journal 2 (3)，409—416 ;Bower 等，1996 Molecular Breeding 2，239-249 ；Arencibia 等，1998，Transgenic Research 7，213-222)或黍(Casas 等，1993，PNAS 90,11212-11216 ；US 6,369,298)。還已描述了其他穀類物種的成功轉化，例如大麥(Wan和Lemaux，s.o. ；Ritala等， s. o. ；Krens 等，Nature 296，(1982)，72-74)和小麥(Nehra 等，PlantJ. 5，(1994)，285-297 ； Becker等，1994，Plant Journal 5，299_307)。所有上述方法均適合於本發明的上下文中。與現有技術相比，根據本發明的經遺傳修飾的植物細胞或根據本發明的經遺傳修 飾的植物提供的優勢在於它們比僅具有葡糖胺聚糖合酶活性的植物產生更高量的葡糖胺 聚糖(例如乙醯透明質酸)。由於從具有更高葡糖胺聚糖含量的植物中分離葡糖胺聚糖復 雜度更低並且更節省成本，因此這允許以很少的花費來生產葡糖胺聚糖。此外，與現有技術 中描述的植物相比，使用根據本發明的經遺傳修飾的植物需要更少的栽種面積來生產葡糖 胺聚糖。這使得提供甚至用於工業應用的足夠量的葡糖胺聚糖成為可能，而由於葡糖胺聚 糖的缺乏和高價格目前工業應用上是不使用它的。小球藻屬的病毒感染植物生物體不適合 於產生相對大量的葡糖胺聚糖(乙醯透明質酸)。在生產葡糖胺聚糖(乙醯透明質酸)中，病毒感染的藻類具有葡糖胺聚糖合酶所需的基因不能穩定整合至它們的基因組中的劣勢 (Van Etten 和 Meints，1999，Annu. Rev. Microbiol. 53，447-494)，因此，對於生產葡糖胺聚 糖(乙醯透明質酸)，不得不重複進行病毒感染。因此，不可能分離到連續合成所需品質和 數量的葡糖胺聚糖(乙醯透明質酸)的獨立小球藻細胞。此外，在病毒感染的小球藻中，葡 糖胺聚糖(乙醯透明質酸)僅在有限的時期內產生，並因為病毒引起的裂解，在感染僅約8 小時後藻類會被殺死(Van Etten等，2002，Arch Virol 147，1479-1516)。相反，本發明提 供根據本發明的經遺傳修飾的植物細胞和根據本發明的經遺傳修飾的植物具有可以不受 限地以無性或有性方式來繁殖並且它們持續產生葡糖胺聚糖(乙醯透明質酸)的優勢。在W0 05 012529中描述的具有編碼乙醯透明質酸合酶的核酸分子的轉基因植物 合成相對少量的葡糖胺聚糖(乙醯透明質酸)。相反，本發明提供根據本發明的經遺傳修飾 的植物細胞和根據本發明的經遺傳修飾的植物合成顯著更高量的葡糖胺聚糖的優勢。因此，本發明還提供合成葡糖胺聚糖的根據本發明的經遺傳修飾的植物細胞或根 據本發明的經遺傳修飾的植物。在優選的實施方案中，根據本發明的植物細胞或根據本發明的植物合成選自軟骨 素、肝素/類肝素和乙醯透明質酸的葡糖胺聚糖。為了測定根據本發明的經遺傳修飾的植物中與鮮重相關的葡糖胺聚糖含量，優選 使用植物整個地上部分材料，即除了根之外的所有植物部分。可通過分離它們合成的葡糖胺聚糖並確定其結構來鑑定合成葡糖胺聚糖的根據 本發明的經遺傳修飾的植物細胞或根據本發明的經遺傳修飾的植物。由於植物組織具有不 含任何葡糖胺聚糖的優勢，可使用簡易快速的分離方法來證明在根據本發明的經遺傳修飾 的植物細胞或根據本發明的經遺傳修飾的植物中葡糖胺聚糖的存在。由於植物組織還具有 不含任何葡糖胺聚糖降解酶的優勢，可使用簡易快速的分離方法來證明在根據本發明的經 遺傳修飾的植物細胞或根據本發明的經遺傳修飾的植物中葡糖胺聚糖的存在。為此，將水 加到待檢測的植物組織中，隨後將植物組織機械粉碎(例如在砂磨機、Warring Blender、液 汁提取機等的幫助下)。需要時，然後可向懸浮液中加入更多的水，並隨後通過離心去除細 胞碎片和水不溶性組分。例如，可使用與相關葡糖胺聚糖(例如乙醯透明質酸)特異性結 合的蛋白質來證實離心後獲得的上清液中葡糖胺聚糖(例如乙醯透明質酸)的存在。用於不同葡糖胺聚糖的基於免疫學試劑的此類檢測試劑盒(ELISA)為本 領域技術人員所知並且可通過商業途徑獲得(例如用於肝素檢測試劑盒lifespan Technologies, 2401 Foothill Drive, Salt Lake City, UT84109-1405，產品號K_2100)。例如在US 5，019，498中描述了在特異性結合乙醯透明質酸的蛋白質的幫助下檢 測乙醯透明質酸的方法。US 5，019，498中描述的進行該方法的檢測試劑盒可通過商業途徑 獲得(例如來自Corgenix，Inc.，Colorado, USA，產品號029-001的透明質酸(HA)檢測試 劑盒；也見於一般方法第四項)。例如在免疫學方法的幫助下檢測軟骨素(Mizuguchi等，2003，Nature423, 443-448)。也可使用其他分析方法，例如IR、NMR或質譜來確認離心上清液中葡糖胺聚糖的存在。由於已觀察到隨著根據本發明的植物發育的時間，葡糖胺聚糖積累於植物組織
20中，所以尤其優選在收穫正在研究的植物時或在收穫前(一或兩)天來測定根據本發明的經遺傳修飾的植物中與鮮重相關的葡糖胺聚糖含量。在優選的實施方案中，本發明涉及根據本發明的經遺傳修飾的植物細胞或根據本 發明的經遺傳修飾的植物，其特徵在於與僅具有編碼葡糖胺聚糖合酶的外來核酸分子的經 遺傳修飾的植物細胞或經遺傳修飾的植物相比，或與具有編碼葡糖胺聚糖合酶的外來核酸 分子但不具有編碼具有UDP-GlcNAc乙醯轉移酶活性的外來核酸分子和不具有編碼具有 UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白質的外來核酸分子的經遺傳修飾的植物細胞或經遺傳 修飾的植物相比，它們產生增加量的葡糖胺聚糖。優選地，與(僅)具有葡糖胺聚糖合酶活性的相應經遺傳修飾的植物細胞或相應 經遺傳修飾的植物相比，就根據本發明的經遺傳修飾的植物細胞或根據本發明的經遺傳修 飾的植物中植物材料鮮重產生的葡糖胺聚糖的量增加至少1. 2倍，優選至少1. 4倍，尤其優 選至少1. 6倍並且特別優選至少1. 8倍。為了測定與根據本發明的經遺傳修飾的植物細胞 或根據本發明的經遺傳修飾的植物中植物材料鮮重相關的葡糖胺聚糖含量的增加，優選使 用在根據本發明的經遺傳修飾的植物細胞或根據本發明的經遺傳修飾的植物分別與(僅) 具有葡糖胺聚糖合酶活性的相應的植物細胞或植物相比，其中用植物細胞或植物的等量材 料(例如葉、塊莖)進行比較，其中在相同條件下培養從中獲取該材料的所述植物細胞或植 物，並且其中將比較具有可比較年齡(發育階段)的植物材料的葡糖胺聚糖含量。例如，植 物的幼葉不應與不同植物的老葉相比較。同樣適用於植物整個地上部分的葡糖胺聚糖含量 的測定。待用於比較的植物應已在可比較的條件下培養並且具有相同的發育階段。在優選的實施方案中，本發明涉及根據本發明的植物細胞或根據本發明的植物每 克植物材料鮮重(FW)合成至少160ii g、優選為至少180 y g、尤其優選為至少200ii g、特別 優選為至少225 u g並且最優選為至少250 u g的葡糖胺聚糖。在其他實施方案中，根據本發明的植物細胞或根據本發明的植物每克植物材料鮮 重(FW)合成最多450 yg、優選為最多400 yg、尤其優選為最多300 yg、特別優選為最多 280 u g並且最優選為最多260 u g的葡糖胺聚糖。在本發明的其他實施方案中，根據本發明的經遺傳修飾的植物細胞或根據本發明 的經遺傳修飾的植物分別為合成葡糖胺聚糖的綠色陸生植物的植物細胞或綠色陸生植物。在本發明的上下文中，術語「綠色陸生植物(有胚植物)」理解為如在 Strasburger, "Lehrbuch der Botanik" [Textbook of Botany]，第 34 片反，Spektrum Akad. Verl. , 1999, (ISBN 3-8274-0779-6)中所定義的。本發明的優選實施方案涉及是多細胞生物的根據本發明的經遺傳修飾的植物細 胞或根據本發明的經遺傳修飾的植物。因此，該實施方案涉及不來自於單細胞植物(原生 生物)或不是原生生物的植物細胞或植物。原則上根據本發明的經遺傳修飾的植物細胞或根據本發明的經遺傳修飾的植物 可以分別是任何植物物種，即單子葉植物和雙子葉植物的植物細胞或植物。它們優選為農 作物植物，即由人培養用於為人或動物提供食物或用於產生生物量目的和/或製備用於技 術、工業目的的物質的植物(例如玉米、稻、小麥、苜蓿、黑麥、燕麥、大麥、木薯、馬鈴薯、番 茄、柳枝稷(Panicum virgatum)、西米、綠豆、豌豆、高粱、胡蘿蔔、茄子、蘿蔔、油菜、大豆、花 生、黃瓜、南瓜、甜瓜、韭菜、大蒜、捲心菜、菠菜、紅薯、蘆筍、西葫蘆、萵苣、洋薊、甜玉米、防風草、鴉蔥、菊芋、香蕉、甜菜、甘蔗、甜菜根、綠花椰菜、捲心菜、洋蔥、黃甜菜、蒲公英、草莓、 蘋果、杏、李、桃、葡萄藤、花椰菜、芹菜、bell p印pers、swede、大黃)。尤其優選為玉米、甘 蔗、紅薯或粟糖(sugar millet)，非常特別優選為番茄或馬鈴薯植物。在優選的實施方案中，本發明涉及根據本發明的經遺傳修飾的植物細胞或根據本 發明的經遺傳修飾的植物，其中編碼蛋白質的外來核酸分子的特徵在於與編碼基源生物的 各個蛋白質的核酸分子的密碼子相比外來核酸分子的密碼子被修飾。特別優選地，已將外 來核酸分子的密碼子修飾使得它們適合於其基因組中整合了或待整合它們的植物細胞或 植物的密碼子使用頻率。由於遺傳密碼的簡併性，胺基酸可由一個或更多個密碼子編碼。在不同生物中，編 碼胺基酸的密碼子以不同頻率使用。將編碼核酸序列的密碼子與其基因組中將整合待表達 序列的植物細胞或植物中密碼子使用頻率相適應可有助於在特定植物細胞或植物中增加 翻譯正在討論的蛋白質的量和/或提高正在討論的mRNA的穩定性。可由本領域技術人員針 對編碼特定胺基酸的特定密碼子的頻率通過測定正在討論的生物中儘可能多的編碼核酸 序列來測定正在討論的植物細胞或植物中密碼子的使用頻率。特定生物的密碼子使用頻率 為本領域技術人員所知並且可使用電腦程式以簡易快速的方式測定。合適的電腦程式 是對公眾開放的並且尤其是網際網路免費提供的(例如http://gCua. schoedl. de/ ；http:// www. kazusa. or. jp/codon/ ；http://www. entelechon. com/eng/cutanalysis. html)。可通過體外誘變或優選地通過基因序列的從頭合成來使編碼核酸序列的密碼子 適應於其基因組將整合待表達序列的植物細胞或植物中的密碼子使用頻率。用於核酸序列 從頭合成的方法為本領域技術人員所知。例如可通過開始合成單一核酸寡核苷酸、將其與 互補的寡核苷酸雜交使得它們形成DNA雙鏈，並隨後將單一雙鏈寡核苷酸連接以獲得所需 核酸來進行從頭合成。還可以將包括與向特定目的生物使用的密碼子頻率相適應的核酸序 列的從頭合成交給提供該服務的公司(例如Entelechon GmbH, Regensburg，Germany)。在本發明的上下文中，術語「同一性」指核酸分子的編碼區全長或編碼蛋白質的 胺基酸全長上至少60%的序列相同、尤其為至少70%、優選為至少80%、尤其優選為至 少90%並且特別優選為至少95%相同。在本發明的上下文中，術語「同一性」理解為與 其他蛋白質/核酸的相同胺基酸/核苷酸的數目(同一性)，以百分比表示。優選地，在 電腦程式的幫助下通過將其他蛋白質/核酸與SEQ ID NO 2中提供的胺基酸序列相 比較來測定與具有乙醯透明質酸合酶活性的蛋白質相關的同一性，並通過與SEQ IDN0 1 或SEQ ID NO 3中提供的核酸序列相比較來測定與編碼具有乙醯透明質酸合酶活性的蛋 白質的核酸分子相關的同一性，通過與SEQ ID NO 5中顯示的胺基酸序列相比較來測定 與具有軟骨素合酶活性的蛋白質相關的同一性或者通過與SEQ ID NO 4中顯示的核酸 序列相比較來測定與編碼具有軟骨素合酶活性的蛋白質的核酸分子相關的同一性，通過 與SEQ IDN0 7中顯示的胺基酸序列相比較來測定與具有肝素/heparosan合酶活性的蛋 白質相關的同一性或者通過與SEQ ID NO 6中顯示的核酸序列相比較來測定與編碼具有 肝素/h印arosan合酶活性的蛋白質的核酸分子相關的同一性，通過與SEQ ID NO 9中顯 示的胺基酸序列相比較來測定與具有GlcNAc-6-P乙醯轉移酶活性的蛋白質相關的同一 性或者通過與SEQ IDN0 8中顯示的核酸序列相比較來測定與編碼具有GlcNAc-6-P乙醯 轉移酶活性的蛋白質的核酸分子相關的同一性，通過與SEQ ID NO 11中提供的胺基酸序列相比較來測定與具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白質相關的同一性或者通過與 SEQ ID NO 10中顯示的核酸序列相比較來測定與編碼具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性 的蛋白質的核酸分子相關的同一性。如果用於彼此比較的序列長度不同，那麼通過測定 較短序列與較長序列共有胺基酸數目的同一性百分比來測定同一性。優選地，使用已知 且公開可得的電腦程式 ClustalW(Thompson 等，Nucleic Acids Research 22(1994)， 4673-4680)來測定同一性。經 Julie Thompson(ThompsoniEMBL-Heidelberg. DE)和 Toby Gibson(Gibson(iEMBL-Heidelberg. DE), European Molecular BiologyLaboratory, Meyerhofstrasse 1，D 69117 Heidelberg，Germany 使 ClustalW 成為公開可用的。還可 以從不同的網際網路頁上下載ClustalW，尤其是從IGBMC(Institut de Genetique et de Biologie Moleculaire et Cellulaire, B.P.163,674041llkirch Cedex, France ；ftp:// ftp-igbmc. u-strasbg. fr/pub/)禾口從 EBI (ftp://ftp. ebi. ac. uk/pub/software/)以及所 有 EBI(EuropeanBioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB101SD, UK)的鏡像網際網路頁上下載。優選地，使用1.8版本的ClustalW電腦程式來測定本發明上下文中描述的蛋白 質與其他蛋白質間的同一性。此處，需將參數按如下設定KTUPLE= 1，T0PDIAG = 5，WINDOW =5，PAIRGAP = 3，GAP0PEN = 10，GAPEXTEND = 0. 05，GAPDIST = 8，MAXDIV = 40，MATRIX =G0NNET, ENDGAPS (OFF)，N0PGAP, N0HGAP。優選地，使用1.8版本的ClustalW電腦程式來測定例如本發明上下文中描述的 核酸分子的核苷酸序列與其他核酸分子的核苷酸序列間的同一性。此處，需將參數按如下 設定KTUPLE = 2，T0PDIAGS = 4，PAIRGAP = 5,DNAMATRIX :IUB，GAP0PEN = 10，GAPEXT = 5，MAXDIV = 40, TRANSITIONS 未加權。此外，同一性表示正在討論的核酸分子或由其編碼的蛋白質間功能和/或結構的 等同。與上文描述的分子同源的核酸分子以及這些分子的代表性衍生物通常為代表具有相 同生物學功能的修飾的這些分子的變異。它們可以是天然存在的變異，例如來自其他物種 的序列，或突變，其中這些突變可能以天然方式發生或通過定向突變來引入。此外，變異可 以是合成產生的序列。等位變體可以是天然發生的變體或合成產生的變體或通過重組DNA 技術產生的變體。衍生物的特殊形式例如為核酸分子，其由於遺傳密碼的簡併性而與本發 明上下文中描述的核酸分子有所不同。由不同核酸分子衍生物編碼的蛋白質具有某些共有特徵。這些例如可以是生物學活性、底物特異性、分子量、免疫學反應性、構象等等。本發明還提供了根據本發明的經遺傳修飾的植物細胞或根據本發明的經遺傳修 飾的植物，其特徵在於整合到植物細胞或植物的基因組中的編碼葡糖胺聚糖合酶和編碼具 有GlcNAc-6-P乙醯轉移酶活性的蛋白質和/或編碼具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋 白質的外來核酸分子與植物細胞中起始轉錄的調節元件(啟動子)相連接。這些可以是同 源或異源啟動子。啟動子可以是組成型的、組織特異的、發育特異的或受外部因素調節的 (例如在應用化學底物後，在非生物因素，如熱和/或寒冷、乾旱、疾病等的作用下)。此處， 整合到根據本發明的經遺傳修飾的植物細胞或根據本發明的經遺傳修飾的植物的基因組 中的編碼葡糖胺聚糖合酶或具有GlcNAc-6-P乙醯轉移酶活性的蛋白質或具有UDP-GlcNAc 焦磷酸化酶活性的蛋白質的核酸分子在每種情況下可以與相同的啟動子結合，或不同啟動子可與各條序列相結合。此處，兩個或三個不同啟動子可以任何組合存在，在每種情況下與 根據本發明的經遺傳修飾的植物細胞或根據本發明的經遺傳修飾的植物中編碼葡糖胺聚 糖合酶或具有GlcNAc-6-P乙醯轉移酶活性的蛋白質或具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的 蛋白質的相關外來核酸分子相結合。本發明的優選實施方案涉及根據本發明的經遺傳修飾的植物細胞或根據本發明 的經遺傳修飾的植物，其中選自編碼葡糖胺聚糖合酶或具有GlcNAc-6-P乙醯轉移酶活性 的蛋白質或具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白質的核酸分子中的至少一個外來核酸 分子、尤其優選為至少兩個外來核酸分子、特別優選為三個外來核酸分子與組織特異的啟 動子相連接。優選的組織特異啟動子為特異地在植物塊莖、果實或種子細胞或葉中起始轉 錄的啟動子。通常，在植物細胞中具有活性的每一啟動子均適合於表達編碼葡糖胺聚糖合酶或 具有GlcNAc-6-P乙醯轉移酶活性的蛋白質或具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白質的 核酸分子。此處，可選擇啟動子使得表達為組成型的或僅在特定組織中、在植物特定的發育 時間點上或在由外界因素決定的時間點上表達。關於植物和關於待表達的核酸分子，啟動 子可以是同源的或異源的。例如，合適的啟動子為用於組成型表達的花椰菜花葉病毒的35S RNS啟動子 或來自玉米的泛素啟動子(Christensen 和 Quail，1996，TransgenicResearch 5(3)， 213-218)、來自黍的高粱醇溶蛋白啟動子(De Rose 等，1996，Plant Molecular Biology 321029-1035 ；Mishra ，2007， Molecular BiologyReports :2February 2007, D0I 10. 1007/sl 1033-007-9056-8)或洋丁香屬(Cestrum)YLCV 啟動子(Yellow Leaf Curling Virus ；W0 0173087 ;Stavolone 等，2003，Plant Mol. Biol. 53，703-713)、馬鈴薯中用於塊 莖特異表達的 patatingen 啟動子 B33(Rocha-Sosa 等，EMB0 J. 8 (1989)，23-29 或番茄果 實特異的啟動子，例如來自番茄的多聚半乳糖醛酸酶啟動子(Montgomery等，1993，Plant Cell 5,1049-1062)或來自番茄的 E8 啟動子(Metha 等，2002，Nature Biotechnol. 20 (6)， 613-618)或來自桃的 ACC 氧化酶啟動子(Moon 和 Callahan, 2004, J. Experimental Botany 55(402)，1519-1528)或確保僅在光合活性組織中表達的啟動子，例如ST-LS1啟 動子(Stockhaus 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987)，7943-7947 ；Stockhaus 等人， EMB0 J. 8 (1989), 2445-2451)或來自小麥的用於胚乳特異表達的HMWG啟動子、來自玉米 的USP啟動子、菜豆蛋白啟動子、玉米醇溶蛋白基因啟動子(Pedersen等，Cell 29(1982)， 1015-1026 ；Quatroccio 等，Plant Mol. Biol. 15 (1990)，81-93)，谷蛋白啟動子(Leisy 等，Plant Mol. Biol. 14 (1990)，41-50 ；Zheng 等，Plant J. 4 (1993)，357-366 ；Yoshihara 等，FEBS Lett. 383 (1996)，213-218)或 shrunken-1 啟動子(fferr 等，EMB0 J. 4(1985)， 1373-1380)。然而，也可使用僅在由外部因素決定的時間點上具有活性的啟動子(例如見 W0 9307279)。此處特別感興趣的是容許簡單誘導的熱激蛋白啟動子。此外可以使用種子特 異性啟動子，例如來自蠶豆(Vicia faba)的USP啟動子，其確保在蠶豆和其他植物中的種 子特異性表達(Fiedler 等，Plant Mol. Biol. 22 (1993), 669-679 ；B益umlein等，Mol. Gen-Genet. 225(1991)，459-467)。使用藻類感染病毒基因組中存在的啟動子也適合於在植物中表達核酸序列(Mitra 等，1994，Biochem. Biophys Res Commun 204 (1)，187-194 ；Mitra 和 Higgins，1994， Plant Mol Biol 26 (1)，85-93，Van Etten 等，2002，Arch Virol 147,1479-1516)。在本發明的上下文中，術語「組織特異性的」理解為將現象(例如轉錄起始)基本 限定在特定組織中的涵義。在本發明的上下文中，術語「塊莖、果實或種子細胞」理解為存在於塊莖、果實或種 子中的所有細胞。在本發明的上下文中，術語「同源啟動子」理解為天然存在於用於產生根據本發明 的經遺傳修飾的植物細胞或根據本發明的經遺傳修飾的植物的植物或植物細胞中(與植 物細胞或植物同源)的啟動子或在從中分離序列的生物中調節基因表達調節(與待表達的 核酸分子同源)的啟動子。在本發明的上下文中，術語「異源啟動子」理解為不天然存在於用於產生根據本發 明的經遺傳修飾的植物細胞或根據本發明的經遺傳修飾的植物的植物細胞或植物(與植 物細胞或植物異源)的啟動子或在其中分離待表達的核酸序列的生物中不天然存在的用 於調節所述核酸序列的表達(與待表達的核酸分子異源)的啟動子。還存在用於向核酸分子的mRNA轉錄物上添加多聚A尾的終止序列(多聚腺苷酸 信號)。認為多聚A尾用於穩定轉錄物。在文獻中描述了此類元件(參考Gielen等，EMB0 J. 8 (1989)，23-29)並且在需要時進行交換。還可以在啟動子和編碼區或編碼蛋白質的外來核酸分子間存在內含子序列。此 類內含子序列可在植物中促使表達穩定並增加表達(Callis等，1987，Genes Devel. 1， 1183-1200 ；Luehrsen 禾口 Walbot，1991，Mol.Gen. Genet. 225,81-93 ；Rethmeier 等，1997 ； Plant Journal 12(4)，895—899 ;Rose 禾口 Beliakoff，2000， Plant Physiol.122(2), 535-542 ；Vasil 等，1989，PlantPhysiol. 91，1575-1579 ;XU 等，2003，Science in China Series C Vol.46 No. 6，561-569)。例如，合適的內含子序列是來自玉米的shl基因的第一 個內含子、來自玉米的多泛素基因1的第一個內含子、來自稻的EPSPS基因的第一個內含子 或來自擬南芥的PAT1基因的前兩個內含子。本發明還涉及包含根據本發明的經遺傳修飾的植物細胞的植物。通過從根據本發 明的經遺傳修飾的植物細胞的再生來產生此類植物。在其他實施方案中，本發明涉及根據本發明的經遺傳修飾的植物的可收穫植物部 分，如果實、貯藏根和其他根、花、芽、枝條、葉或莖，優選種子、果實或塊莖，這些可收穫部分 包含根據本發明的經遺傳修飾的植物細胞。在本發明的優選實施方案中，根據本發明的可收穫植物部分是包含本發明經遺傳 修飾的植物細胞的根據本發明的經遺傳修飾的植物的可加工或可消耗部分。 在本發明的上下文中，術語「可加工部分」應理解為用於製備糧食或飼料的植物部 分，其用作工業過程的原材料來源，製備藥劑的原材料來源或製備化妝品產品的原材料來 源。在本發明的上下文中，術語「可消耗部分」應理解為用作人類食物或動物飼料的植 物部分。本發明還涉及包含本發明經遺傳修飾的植物細胞的根據本發明的經遺傳修飾的 植物的繁殖材料。
此處，術語「繁殖材料」包含適合經無性途徑或有性途徑產生後代的植物的那些成 分。適合無性繁殖的是例如，切割、愈傷組織培養、根莖或塊莖，但還有例如原生質體和細胞 培養物。通過有性過程方式產生的繁殖材料包括，例如果實、種子、幼苗等。所述繁殖材料 優選採取塊莖、果實或種子的形式。優選地，本發明涉及包含葡糖胺聚糖(例如乙醯透明質酸)的根據本發明的繁殖 材料或根據本發明的植物的可收穫部分。尤其優選地，根據本發明的繁殖材料或根據本發 明的植物的可收穫部分是合成葡糖胺聚糖的根據本發明的繁殖材料或根據本發明的植物 的可收穫部分。優選地，所述葡糖胺聚糖是軟骨素、肝素/乙醯肝素、乙醯透明質酸，尤其優 選為乙醯透明質酸。在本發明的上下文中，術語「馬鈴薯植物」或「馬鈴薯」應理解為茄屬(Solanum)的 植物種，尤其是茄屬的塊莖產生種，並尤其是馬鈴薯(Solanum tuberosum)。在本發明的上下文中，術語「番茄植物」或「番茄」應理解為表示番茄屬 (Lycopersicon)的植物禾中，尤其是番前(Lycopersicon esculentum)。本發明的其他優勢是根據本發明的經遺傳修飾的植物的可收穫部分、繁殖材料、 可加工部分或可消耗部分比僅包含編碼葡糖胺合酶的外來核酸分子的植物包含更多的葡 糖胺聚糖(例如乙醯透明質酸)。因此，根據本發明的經遺傳修飾的植物不僅特別適合用作 可從其中分離葡糖胺聚糖(例如乙醯透明質酸)的原材料，也可直接用作糧食/飼料，或用 於製備具有預防或治療特徵(例如用於骨關節炎預防，US 6，607，745)的糧食/飼料。由 於根據本發明的經遺傳修飾的植物比僅具有編碼葡糖胺聚糖合酶的外來核酸分子的植物 具有更高的葡糖胺聚糖含量，此類糧食/飼料的製備需要更少量的根據本發明的經遺傳修 飾的植物的可收穫部分、繁殖材料、可加工部分或可消耗部分。如果根據本發明的經遺傳修 飾的植物的可消耗部分例如直接作為所謂的「營養製品」被消耗，則甚至可通過攝取相對少 量的物質實現積極效果。這尤其在製備動物飼料中具有特殊重要性，因為具有太高植物成 分含量的動物飼料不適合用作多種動物種類的飼料。由於葡糖胺聚糖，尤其是乙醯透明質酸結合水的高能力，根據本發明的經遺傳修 飾的植物的可收穫部分、繁殖材料、可加工部分或可消耗部分當產生固體化糧食/飼料時 還具有需要更少濃縮劑的優勢。因此，例如，果凍的製備需要更少的糖，其與對健康的額外 積極影響相關。在需要天然植物材料脫水的糧食/飼料的產生中，使用根據本發明的經遺 傳修飾的植物的可收穫部分、繁殖材料、可加工部分或可消耗部分的優勢在於這樣的事實， 需要從正在討論的植物材料中去除更少的水，導致更低的生產成本，並因更溫和的生產方 法(例如更少的和/或更短的熱量輸入)致使正在討論的糧食/飼料的營養價值提高。因 此，例如，在番茄漿的生產中，需要引入更少的能量以達到期望的粘度。本發明還提供用於產生植物的方法，其包括a)遺傳修飾的植物細胞，其中所述遺傳修飾包括以下步驟i到iiii)向植物細胞中引入編碼葡糖胺聚糖合酶的外來核酸分子ii)向植物細胞中引入編碼葡糖胺6-磷酸乙醯轉移酶的外來核酸分子iii)向植物細胞中引入編碼UDP-N-乙醯基_葡糖胺焦磷酸化酶的外來核酸分子其中可以任何順序進行步驟i到iii，或同時進行單獨的步驟i到iii或其的任何 組合，
b)從來自步驟a) i和/或a) i i和/或a) i i i的植物細胞再生植物；c)適當時，使用根據步驟b)的植物再生另外的植物，其中，適當時，從步驟b)或 c)的植物中分離植物細胞，並重複方法步驟a)到c)直至產生具有編碼葡糖胺聚糖合酶的 外來核酸分子和編碼具有葡糖胺6-磷酸乙醯轉移酶活性的蛋白質的外來核酸分子以及編 碼具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白質的外來核酸分子的植物。用於產生植物的根據本發明方法的優選實施方案涉及產生植物的方法，其包括a)遺傳修飾植物細胞，其中所述遺傳修飾包括單獨或同時進行的以下任何順序的 步驟i到iii，或以下步驟i到iii的任何組合i)向植物細胞中引入編碼葡糖胺聚糖合酶的外來核酸分子ii)向植物細胞中引入編碼葡糖胺6-磷酸乙醯轉移酶的外來核酸分子iii)向植物細胞中引入編碼UDP-GlcNAc焦磷酸化酶的外來核酸分子b)從包含根據以下步驟的遺傳修飾的植物細胞中再生植物i)a)iii)a) iiiii)a)iiiiv)a) i ^P a) ii,v)a) i 禾口 a) iii，vi)a)ii 和 a)iii，或vii)a)i 和 a)ii 和 a)iiic)根據以下步驟向植物的植物細胞中引入遺傳修飾並再生植物i)根據步驟a) ii的b) i遺傳修飾，ii)根據步驟a) iii的b) i遺傳修飾，iii)根據步驟a) ii的b) i遺傳修飾，和同時根據步驟a) iii的遺傳修飾，iv)根據步驟a) i的b) ii遺傳修飾，v)根據步驟a) iii的b) ii遺傳修飾，vi)根據步驟a) i的b)ii遺傳修飾，和同時根據步驟a) iii的遺傳修飾，vii)根據步驟a) i的b) iii遺傳修飾，viii)根據步驟a) ii的b) iii遺傳修飾，ix)根據步驟a) i的b) iii遺傳修飾，和同時根據步驟a) ii的遺傳修飾，x)根據步驟a) iii的b) iv遺傳修飾，xi)根據步驟a)ii的b)v遺傳修飾，或xii)根據步驟a) i的b) vi遺傳修飾d)根據以下步驟向植物的植物細胞中引入遺傳修飾並再生植物i)根據步驟a) iii的c) i遺傳修飾，ii)根據步驟a) ii的c) ii遺傳修飾，iii)根據步驟a) iii的c)iv遺傳修飾，iv)根據步驟a) ii的c) v遺傳修飾，v)根據步驟a) ii的c) vii遺傳修飾，vi)根據步驟a) i的c) vii遺傳修飾，或
vii)根據步驟a) ii的c) ix遺傳修飾e)適當時在根據任何步驟b) vii C)iii、C)vi、C)X、C)Xi、C)Xii或根據任何步驟 d)i到d)vii的植物的幫助下進一步產生植物。根據本發明用於產生植物的方法步驟a)，為了引入外來核酸分子可使用任何可得 的方法。用於轉化植物細胞的多種方法早已在上文得到描述，並在此處可以相應方式應用。 如果不是同時進行而是連續進行用於產生植物的根據本發明方法的步驟a)的方法步驟， 可使用相同或不同方法用於各轉化步驟。可通過本領域技術人員已知的方法實現用於產生植物的根據本發明方法的步驟 b)和適當時步驟c)和d)的植物再生(例如描述於「Plant CellCulture Protocols 「， 1999，R. D. Hall 編輯，Humana Press, ISBN0-89603-549-2)。例如可通過無性繁殖(例如經過切割、塊莖或經過愈傷組織培養和完整植株的再 生)或通過有性繁殖進行用於產生植物的根據本發明方法的進一步植物的產生(根據方 法，根據步驟c)或步驟e))。此處，有性繁殖優選以可控方式進行，即具有某些性質的所選 植物彼此雜交並繁殖。優選進行選擇，以便所述進一步的植物(根據方法，其根據步驟c) 或步驟e)產生)具有在前述步驟中引入的外來核酸分子。在用於產生植物的根據本發明的方法中，可同時或以連續步驟並以任何組合進行 產生根據本發明經遺傳修飾的植物細胞的遺傳修飾。可以使用其中還未引入外來核酸分子 的野生型植物和野生型植物細胞，或可以使用早已經過遺傳修飾並早已向其中引入一個或 更多外來核酸分子的植物細胞或植物。在用於產生植物的根據本發明方法的步驟a)中，在向植物細胞或植物中引入外 來核酸分子的遺傳修飾中，所述外來核酸分子可以是單個核酸分子或多個核酸分子。因此， 編碼葡糖胺聚糖合酶或編碼具有GlcNAc-6-P乙醯轉移酶的酶活性的蛋白質或編碼具有 UDP-GlcNAc焦磷酸化酶的酶活性的蛋白質的外來核酸分子可一起存在於單個核酸分子上， 或者提及的外來核酸分子中的兩個可以任何可能組合一起存在於單個核酸分子上並且第 三個外來核酸分子存在於另一核酸分子上，或者所有三個提及的外來核酸分子可存在於各 單獨的核酸分子上。早已在上文中結合根據本發明的植物細胞或根據本發明的植物描述了外來核酸 分子或重組核酸分子的優選性質，並且在用於產生植物的根據本發明方法的實踐中相應地 應用它們。在其他優選實施方案中，用於產生植物的根據本發明的方法用於產生根據本發明 的經遺傳修飾的的植物。本發明還提供通過本發明方法獲得的植物，所述方法用於產生合成乙醯透明質酸 的植物。本發明還涉及用於產生葡糖胺聚糖(例如乙醯透明質酸)的方法，其包括從根據 本發明的經遺傳修飾的植物細胞、根據本發明的經遺傳修飾的植物、根據本發明的繁殖材 料、根據本發明的可收穫植物部分或通過用於產生植物的根據本發明方法獲得的植物或這 些植物的部分提取葡糖胺聚糖的步驟。優選地，此方法也包括在提取葡糖胺聚糖(例如乙 醯透明質酸)之前收穫根據本發明的經遺傳修飾的植物細胞、根據本發明的經遺傳修飾的 植物、根據本發明的繁殖材料、根據本發明的可收穫植物部分、根據本發明的可加工植物部分的步驟，並尤其優選地還包括在收穫之前培養根據本發明的經遺傳修飾的植物細胞或根 據本發明的經遺傳修飾的植物的步驟。與細菌或動物組織相反，植物組織沒有葡糖胺聚糖降解酶(例如透明質酸酶)。因 此，如上文早已描述，使用相對簡單的方法從植物組織中提取葡糖胺聚糖是可能的。如果需 要，可使用本領域技術人員已知的方法，如利用乙醇重複沉澱來進一步純化含有葡糖胺聚 糖的植物細胞或組織的上述水溶性提取物。在一般方法第3項中描述了用於純化乙醯透明 質酸的優選方法。早已描述用於從根據本發明的經遺傳修飾的植物細胞或根據本發明的經遺傳修 飾的植物中提取葡糖胺聚糖的方法也適合於從根據本發明的繁殖材料、根據本發明的可收 獲植物部分或通過用於製備合成乙醯透明質酸的植物的本發明方法獲得的植物或這些植 物的部分中分離葡糖胺聚糖(例如乙醯透明質酸)。本發明還提供根據本發明的經遺傳修飾的植物細胞、根據本發明的經遺傳修飾的 植物、根據本發明的繁殖材料、根據本發明的可收穫植物部分或通過用於產生製備葡糖胺 聚糖的植物的本發明方法可獲得的植物的用途。本發明還涉及包含根據本發明的經遺傳修飾的植物細胞的組合物。此處，因為植 物細胞已經例如通過加工而被破壞，所以無論它們是完整的還是不再完整的，細胞是無形 的。所述組合物優選為糧食或飼料，藥物產品或化妝品產品。本發明優選提供包含根據本發明的經遺傳修飾的植物細胞、根據本發明的經遺 傳修飾的植物、根據本發明的繁殖材料、根據本發明的可收穫植物部分或可通過本發明方 法獲得的植物的組分，並包含重組核酸分子的組合物，其中所述重組核酸分子的特徵在於 它們包含編碼葡糖胺聚糖合酶和具有GlcNAc-6-P乙醯轉移酶酶活性的蛋白質以及具有 UDP-GlcNAc焦磷酸化酶酶活性的蛋白質的核酸分子。外來核酸分子穩定整合到植物細胞或植物的基因組中導致所述外來核酸分子在 整合到植物細胞或植物基因組後其側翼為植物基因組核酸序列。因此，在優選的實施方案中，根據本發明的組合物的特徵在於根據本發明組合物 中存在的重組核酸分子側翼為植物基因組核酸序列。此處，所述植物基因組核酸序列可以是在用於製備所述組合物的植物細胞或植物 的基因組中天然存在的任何序列。在根據本發明的組合物中存在的重組核酸分子可以是單個核酸分子或不同的重 組核酸分子，其中編碼葡糖胺聚糖合酶(例如乙醯透明質酸合酶)和具有GlcN-6-P乙醯 轉移酶活性的蛋白質以及具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白質的核酸分子存在於一 個核酸分子中，或者是那些其中在單獨核酸分子中存在所述核酸分子。編碼葡糖胺聚糖合 酶(例如乙醯透明質酸合酶)或編碼具有GlcN-6-P乙醯轉移酶活性的蛋白質或編碼具有 UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白質的核酸分子可以一起存在於單個重組核酸分子上，或 所提及的核酸分子中任何可能組合的兩個核酸分子可一起存在於單個重組核酸分子上並 且第三個核酸分子可以存在於另一重組核酸分子上，或者所有三個所提及的核酸分子在每 一種情況下存在於各單獨的重組核酸分子上。根據編碼葡糖胺聚糖合酶(例如乙醯透明質 酸合酶)或編碼具有GlcN-6-P乙醯轉移酶活性的蛋白質或編碼具有UDP-GlcNAc焦磷酸化 酶活性的蛋白質的核酸分子在根據本發明組合物中如何存在，它們側翼可以是相同的或不
29同的植物基因組核酸序列。可使用本領域技術人員已知的方法證明根據本發明的所述組合物包含的重組核 酸分子，所述方法如，基於雜交的方法，或優選地使用基於PCR(聚合酶鏈式反應)的方法。如上文早已提及，可以使用根據本發明的經遺傳修飾的植物細胞、根據本發明的 經遺傳修飾的植物、根據本發明的繁殖材料、根據本發明的可收穫植物部分，或通過根據本 發明方法可獲得的植物來製備糧食或飼料。然而，在不必提取葡糖胺聚糖(例如乙醯透明 質酸)的情況下也可以作為原材料用於工業應用。因此，例如，根據本發明經遺傳修飾的的 植物或根據本發明經遺傳修飾的植物的部分可應用於農業培養領域中以實現土壤增加的 水結合。此外，根據本發明經遺傳修飾的的植物或根據本發明經遺傳修飾的植物細胞可用 於製備乾燥劑(例如當航運溼敏性項目使用)或作為液體吸收劑(例如在尿布中或用於吸 附洩露的水性液體)。對於此類應用，需要時可以使用根據本發明的完整的經遺傳修飾的的 植物、根據本發明的經遺傳修飾的植物的部分或粉碎的(例如研碎的)根據本發明的經遺 傳修飾的植物或根據本發明的植物部分。適合於其中使用研碎植物或植物細胞的應用尤其 是含有葡糖胺聚糖(例如乙醯透明質酸)的植物部分，但僅含有低比例的水。這些優選為 穀類植物(玉米、稻、小麥、黑麥、燕麥、大麥、西米或高粱)的穀粒。因為根據本發明經遺傳 修飾的的植物細胞或根據本發明經遺傳修飾的植物比僅具有一種編碼葡糖胺聚糖合酶的 外來核酸分子的植物具有更高的葡糖胺聚糖(例如乙醯透明質酸)含量，所以當使用根據 本發明經遺傳修飾的植物細胞或根據本發明經遺傳修飾的植物時，與這些相比需要使用較 少的材料用於工業領域。本發明還提供用於製備根據本發明組合物的方法，其中使用根據本發明的經遺傳 修飾的植物細胞、根據本發明的經遺傳修飾的植物、根據本發明的繁殖材料、根據本發明的 可收穫植物部分，或通過用於製備植物的根據本發明方法可獲得的植物。用於製備根據本 發明組合物的方法優選為用於製備糧食或飼料的方法，用於製備藥物產品的方法或用於制 備化妝品產品的方法。用於製備糧食或飼料的方法為本領域技術人員所知。用於在工業領域使用根據本 發明經遺傳修飾的的植物或根據本發明的植物部分的方法也為本領域技術人員所知，並尤 其包括粉碎或碾碎根據本發明經遺傳修飾的的植物或根據本發明的植物部分；然而，它們 不僅限於此。在上文中早已經描述了源於使用根據本發明的物質的一些優勢，所述根據本 發明的物質用於製備糧食/飼料或用於工業領域中。用於製備組合物的本發明方法尤其優選為用於製備包含葡糖胺聚糖(例如乙醯 透明質酸)的組合物的方法。本發明也提供可通過用於製備根據本發明組合物的方法獲得的組合物。本發明還涉及根據本發明的經遺傳修飾的植物細胞、根據本發明的經遺傳修飾的 植物、根據本發明的繁殖材料、根據本發明的可收穫植物部分或可通過本發明產生植物的 方法獲得的植物用於製備根據本發明的組合物的用途。優選根據本發明的經遺傳修飾的植 物細胞、根據本發明的經遺傳修飾的植物、根據本發明的繁殖材料、根據本發明的可收穫植 物部分或可通過本發明產生植物的方法獲得的植物用於製備糧食或飼料，用於製備藥物產 品或化妝品產品的用途。序列描述
SEQ ID NO 1 編碼來自小球藻病毒1的乙醯透明質酸合酶的核酸序列。SEQ ID NO 2 來自小球藻病毒1的乙醯透明質酸合酶的胺基酸序列。所示胺基酸 序列可源自SEQ ID NO 1。SEQ ID NO 3 編碼來自小球藻病毒1的乙醯透明質酸合酶的合成核酸序列。以適 合於植物細胞中的密碼子使用的方式來合成所示的序列密碼子。所示的核酸序列編碼具有 顯示於SEQ ID No 2中的胺基酸序列的蛋白質。SEQ ID NO 4 編碼具有來自多殺巴斯德氏菌的軟骨素合酶活性的蛋白質的核酸 序列。SEQ ID NO 5 具有來自多殺巴斯德氏菌的軟骨素合酶活性的蛋白質的胺基酸序 列。所示胺基酸序列可源自SEQ ID NO 4。SEQ ID NO 6 編碼具有來自多殺巴斯德氏菌的h印arosan合酶活性的蛋白質的核 酸序列。SEQ ID NO 7 具有來自多殺巴斯德氏菌的h印arosan合酶活性的蛋白質的胺基酸 序列。所示胺基酸序列可源自SEQ ID NO 6。SEQ ID NO 8 編碼具有來自釀酒酵母的GlcN_6_P乙醯轉移酶活性的蛋白質的核 酸序列。SEQ ID NO 9 具有來自釀酒酵母的GlcN_6_P乙醯轉移酶活性的蛋白質的胺基酸 序列。所示胺基酸序列可源自SEQ ID NO 8。SEQ ID NO 10 編碼具有來自釀酒酵母的UDP_GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白質的 核酸序列。SEQ ID NO 11 具有來自釀酒酵母的UDP_GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白質的氨基 酸序列。所示胺基酸序列可源自SEQ ID NO 10。SEQ ID NO 12 包含來YLCV啟動子、限制性位點、自農桿菌的ocs終止子的多腺苷 酸化信號序列和來自農桿菌的nos終止子的多腺苷酸化信號序列的表達盒的核酸序列。SEQ ID NO 13 用於製備MCS( 「多克隆位點」)的合成寡核苷酸。SEQ ID NO 14:用於製備MCS( 「多克隆位點」)的合成寡核苷酸。SEQ ID NO 15 用於PCR反應的引物。SEQ ID NO 16 用於PCR反應的引物。SEQ ID NO 17 用於PCR反應的引物。SEQ ID NO 18 用於PCR反應的引物。SEQ ID NO 19 用於PCR反應的引物。SEQ ID NO 20 用於PCR反應的引物。SEQ ID NO 21 編碼具有來自大腸桿菌的GlcN_l_P變位酶活性的蛋白質的核酸序 列。SEQ ID NO 22 具有來自大腸桿菌的GlcN_l_P變位酶活性的蛋白質的胺基酸序 列。所示胺基酸序列可源自SEQ ID NO 21。SEQ ID NO 23 用作PCR引物的合成寡核苷酸。SEQ ID NO 24 用作PCR引物的合成寡核苷酸。SEQ ID NO 25 編碼具有來自大腸桿菌的葡糖胺1_磷酸乙醯轉移酶和
31UDP-GlcNAc焦磷酸化酶雙功能活性的蛋白質的核酸序列(glmu)。SEQ ID NO 26 具有來自大腸桿菌的葡糖胺1－磷酸乙醯轉移酶和UDP－GlcNAc焦 磷酸化酶雙功能活性的蛋白質的胺基酸序列。所示胺基酸序列可源自SEQ ID NO 25。SEQ ID NO 27 用於PCR反應的引物。SEQ ID NO 28 用於PCR反應的引物。SEQ ID NO 29 編碼具有來自釀酒酵母的乙醯葡糖胺磷酸(GlcN_P)變位酶活性的 蛋白質的核酸序列。SEQ ID NO 30 來自釀酒酵母的具有乙醯葡糖胺磷酸變位酶活性的蛋白質的氨基 酸序列。所示胺基酸序列可源自SEQ ID NO 30。一般方法下文描述了可使用的與本發明相關的方法。這些方法是特定的實施方案；然而，本 發明不限於這些方法。本領域技術人員已知的是可以通過修飾所描述的方法和/或由備選 方法或備選方法的部分替代個別方法或方法的部分的相同方式進行本發明。1.轉化馬鈴薯植株如在Rocha-Sosa等(EMB0 J. 8，(1989)，23-29)描述的在農桿菌的幫助下轉化馬
鈴薯植株。2.使用乙醯透明質酸作為示例從植物組織中分離葡糖胺聚糖為了檢測乙醯透明質酸的存在並測定植物組織中乙醯透明質酸的含量，如下操作 植物材料向約0. 3g植物材料中加入200 ill水(去礦物質的，導電率> 18MQ )，並在實驗 室用丁字球磨機(MM200，來自Retsch，Germany)(以30Hz進行30秒)中粉碎混合物。隨後 再加入800 ill水(去礦物質的，導電率彡18M Q )，並將混合物充分混合(例如使用Vortex 混合器)。通過在16000Xg離心5分鐘從上清液中分離細胞碎片和不溶性組分。為了測定 植物整個地上部分中的乙醯透明質酸的量，從培養基質上約1cm至3cm處切除植株的地上 部分，切成小片並隨後如一般方法第3項中描述的用Warring攪拌器粉碎。為了測定乙醯 透明質酸含量，可隨後從所獲的離心上清液中取等分試樣(見一般方法第3項)。3.使用乙醯透明質酸作為示例純化葡糖胺聚糖加入水之後(在每種100g植物材料的情況下，約100ml水，去礦物質，導電率 彡18M Q )，將粉碎的植物材料或植株的整個地上部分在Warring攪拌器中以最高速粉碎約 30秒。隨後使用茶葉濾網去除細胞碎片。將已去除的細胞碎片在300ml水(去礦物質，導 電率彡18MQ)中重懸浮並再次使用茶葉濾網去除。將所獲的兩份懸浮液(100ml+300ml) 合併並在13000Xg下離心15分鐘。向所獲的離心上清液中加入NaCl直至已達到的終 濃度。當NaCl已溶入溶液中後，通過加入兩倍體積的乙醇並隨後充分混合併在-20°C下孵 育過夜進行沉澱。隨後將混合物在13000Xg下離心15分鐘。經該離心後將所獲的沉澱物 溶於100ml緩衝液中(50mM TrisHCl, pH 8、lmM CaCl2)並隨後加入蛋白酶K至100 u g/ml 的終濃度並在42°C下孵育該溶液2小時。隨後在95°C下孵育10分鐘。再一次向該溶液加 入NaCl直至已達到的終濃度。當NaCl已溶於溶液後，通過加入兩倍體積的乙醇、充分 混合併在_20°C下孵育約96小時進行沉澱。隨後在13000Xg下離心15分鐘。經該離心後 將所獲的沉澱物溶於30ml水中(去礦物質，導電率彡18MQ)，並再一次加入NaCl至終濃度 為1%。通過加入兩倍體積的乙醇、充分混合併在－20°C孵育過夜進行另一次沉澱。將在隨後以13000Xg離心15分鐘所獲的沉澱物溶於20ml水(去礦物質，導電率彡18MQ)中。通過離心過濾進行進一步純化。為此，在每種情況下將5ml溶解的沉澱物加至 膜濾器上(CentriconAmicon，孔徑 10 000NMWL，產品號 UCF8 010 96)，並以 2200Xg 離心 樣品直至濾器上僅剩餘約3ml溶液。隨後再進行兩次，每次將3ml水(去礦物質，導電率 彡18MQ)加入膜上的溶液中並每次在相同條件下再離心直至最終濾器上僅剩餘約3ml溶 液。將離心過濾後仍存在於膜上的溶液去除，並用約1.5ml水(去礦物質，導電率> 18MQ) 重複衝洗膜(三至五次)。將仍存在於膜上的所有溶液及從衝洗所獲的溶液合併，加入NaCl 至終濃度為1%，當NaCl溶於溶液後，加入兩倍體積的乙醇，將樣品混合併在-20°C下過夜 保存以獲得沉澱。將隨後在13000Xg離心15分鐘後所獲的沉澱溶於4ml水(去礦物質， 導電率彡18MQ)中並隨後凍幹(在0.37mbar的壓力下在來自Christ，Osterode，Germany 的凍幹儀Christ Alpha 1-4上進行24小時)。4.乙醯透明質酸的檢測和乙醯透明質酸含量的測定按照生產商說明書使用商品化檢測(來自Corgenix，Inc.，Colorado，USA，產品號 029-001的透明質酸(HA)檢測試劑盒)檢測乙醯透明質酸，因此通過將所述說明書合併於 此作為參考。檢測原理基於特異性結合乙醯透明質酸(HABP)的蛋白質的存在並與酶聯免 疫吸附測定相似地操作，其中顏色反應指示了所檢測樣品中乙醯透明質酸的含量。在使用 檢測試劑盒中包含的確定量的乙醯透明質酸的校準曲線的幫助下來測定乙醯透明質酸的 值。因此，對於乙醯透明質酸的定量測定，待測定的樣品應該以處於所指明的極限之內的濃 度使用(例如正在討論的樣品的稀釋或用更少的水從植物組織中提取乙醯透明質酸均基 於是否超過或未達到該極限)。在平行批次中，首先對待測定樣品的等分試樣進行透明質酸酶消化並隨後使用商 業化檢測(來自Corgenix，Inc.，Colorado, USA，產品號029-001的透明質酸(HA)檢測試 劑盒)檢測。使用400 ill的在透明質酸酶緩衝液(0. 1M磷酸氫二鉀緩衝液，pH 5. 3 ； 150mM NaCl)中的植物提取物，通過加入了 5 iig( 3單位)的透明質酸酶(來自Sigma，產品號 H2251的III型透明質酸酶)並在37°C溫育30分鐘來進行透明質酸酶消化。每種情況下在1 10的稀釋中，隨後所有樣品均用於測定乙醯透明質酸含量。5.GFAT活性的測定如在Rachel 等(1996，J. Bacteriol. 178 (8)，2320-2327)中所描述來測定具有 GFAT活性的蛋白質的活性。為了區分蛋白質是否具有GFAT-1或GFAT-2活性，使用在Hu等(2004，J.Biol. Chem. 279 (29)，29988-29993)中描述的方法。
實施例1.製備植物表達質粒IR 47-71質粒pBinAR 是雙元載體質粒 pBinl9 (Bevan，1984，Nucl Acids Res 12 8711-8721)的衍生物，其如下構建從質粒pDH51(Pietrzak等，1986NucleicAcids Res. 14,5858)中分離包含花椰菜 花葉病毒35S啟動子6909-7437位核酸的長度為529bp的片段作為EcoR I/Kpn I片段，並 且連接至PUC18多接頭的EcoR I和Kpn I限制位點之間。以該方式形成了質粒pUC18_35S。使用限制性內切核酸酶Hind III和Pvu II，從質粒pAGV40 (Herrera-Estrella等， 1983Nature, 303, 209-213)分離包括 Ti 質粒 pTiACH5 (Gielen 等，1984，EMBO Journal 3， 835-846)的T-DNA的章魚鹼合酶基因(基因3)的多聚腺苷酸信號(3'末端)(11749-11939 位核酸)的長度為192bp的片段。將Sph I接頭加入到Pvu II限制位點後，將所述片段連接 至PUC18-35S的Sph I和Hind III限制位點中間。這形成了質粒pA7。此處，使用EcoR I 和Hind III取出包含35S啟動子和Ocs終止子的整個多接頭並將其連接至適當切割的載體 pBinl9 中。這產生了植物表達載體 pBinAR(H6fgen和 Willmitzer，1990，Plant Science 66,221-230)。將來自馬鈴薯(Solanum tuberosum)的 patatin 基因 B33 的啟動子(Rocha—Sosa 等，1989，EMBO J. 8，23-29)作為Dra I片段(-1512-+14位核酸)連接至Sst I切割的載 體PUC19中，已使用T4-DNA聚合酶將該載體末端平端化。這產生了質粒pUC19_B33。使用 EcoR I和Sma I從該質粒中取出B33啟動子並連接至適合的限制性載體pBinAR中。這產 生了植物表達載體pBinB33。為了便於進一步的克隆步驟，擴展了 MCS(多克隆位點)。為此，合成了兩條互補的 寡核酸，在95°C加熱5分鐘，緩慢冷卻至室溫以獲得良好的退火併將其克隆至pBinB33的 Sal 1和Kpnl限制位點中。用於此目的的寡核酸顯示於SEQ ID NO 13和SEQ ID NO 14 中。所獲質粒命名為IR47-71。2.製備植物表達載體pBinARHyg使用限制性內切核酸酶EcoR I和Hind III從pA7中取出包含35S啟動子、 Ocs終止子和整個多克隆位點的片段並克隆至載體pBIBHyg (Becker, 1990，Nucleic Acids Res. 18,203)中，已使用相同的限制性內切核酸酶切割該載體。所獲質粒命名為 pBinARHyg。3.製備克隆載體IC 317-204使用限制性內切核酸酶Xho I和Hind III，從質粒IR 47_71中分離包含ocs終止 子的核酸片段並將其克隆至載體pBlueScript KS(來自Stratagene，產品號212207)中，已 使用相同的限制性內切核酸酶切割該載體。所獲質粒命名為IC 306-204。使用限制性內切核酸酶Bam HI和Eco RI從質粒IR 47-71中分離包含B33啟動 子的核酸片段並將其克隆至載體pBlueScript KS(來自Stratagene，產品號212207)中，已 使用相同的限制性內切核酸酶切割該載體。所獲質粒命名為IC 314-204。使用限制性內切核酸酶Bam HI從IC 306-204中分離0CS終止子並將其克隆至 質粒IC 314-204中，已使用相同的限制性內切核酸酶切割該質粒。所獲質粒命名為IC 317-204。4.合成核酸分子a)合成編碼來自小球藻病毒1的乙醯透明質酸合酶的核酸分子通過Medigenomix GmbH (Munich，德國)合成編碼小球藻病毒1的乙醯透明質酸合 酶的核酸序列並克隆至來自Invitrogen的載體pCR2. 1(產品號K2000-01)中。所獲質粒 命名為IC 323 215。編碼來自小球藻病毒1的HAS蛋白質的合成核酸序列，其顯示於SEQ ID N0 3中。最初分離自小球藻病毒1的對應核酸序列顯示於SEQ ID NO 1中。b)合成包含YLCV啟動子和MCS、nos終止子和ocs終止子的核酸序列
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通過Entelechon GmbH 合成包含 YLCV 啟動子(Stavolone 等，PlantMolecular Biology 53 703-713,2003)和包含限制位點Sac I和Sma I的MCS( 「多克隆位點」)、 nos終止子和ocs終止子的核酸序列並克隆至來自Invitrogen的載體pCR4Topo (產品號 K4510-20)中。所獲質粒命名為IC389-337。合成核酸序列顯示於SEQ ID NO 12中。5.分離核酸分子a)分離並克隆具有GlcN-6-P乙醯轉移酶活性的蛋白質的編碼核酸序列通過PCR從釀酒酵母中分離編碼具有GlcN-6-P乙醯轉移酶活性的蛋白質的核酸 序列(gnal)並克隆至來自Invitrogen的載體pCR 2. 1 (產品號K4510-20)中。PCR反應條 件如下1.步驟5 分鐘 94°C，2.步驟45 秒，94°C，3.步驟45 秒，59 °C，4.步驟45 秒，72 °C，5.步驟10 分鐘，72 °C6.步驟4°C將步驟2至步驟4重複35次，並該操作隨後繼續進行步驟5。50 u 1 反應批量(reaction batch)包含緩衝液(10mM Tris-HCl, pH 9. 0、50mM KC1禾口 3mM MgS04)、每種情況下500nM的擴增引物(顯示於SEQ ID NO 15禾口 SEQ ID NO 16 中)、10iU Q溶液(包含於Qiagen，產品號206143中)、每種情況下0. 2mM脫氧核糖核酸、 0. 5u 1 Taq DNA聚合酶(Invitrogen，產品號11304_011)和作為模板的250ng酵母基因 組 DNA。使用來自 Eppendorf 的 Mastercycler 進行 PCR(Prod. NR. 5331 000. 010)。從釀酒酵母中分離的編碼具有GlcN-6-P乙醯轉移酶活性的蛋白質的核酸序列顯 示於SEQ ID N0 8中。在將所獲片段克隆至載體pCR 2. 1中並測序確認後，使用限制性內切核酸酶Kpn I和Xba I分離正在討論的來自釀酒酵母的編碼具有GlcN-6-P乙醯轉移酶活性的蛋白質的 核酸序列並克隆至載體PA7中，已使用相同的限制性內切核酸酶切割該載體。所獲質粒命 名為 IC 298-204。b)分離並克隆編碼具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白質的核酸序列通過PCR從釀酒酵母中分離編碼具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白質的核 酸序列(qri)並克隆至來自Invitrogen的載體pCR 2. 1 (產品號K2000-01)中。PCR反應 條件如下1.步驟5 分鐘 94°C，2.步驟45 秒，94°C，3.步驟45 秒，59 °C，4.步驟45 秒，72 °C，5.步驟30 分鐘，72 °C6.步驟4°C將步驟2至步驟4重複35次，並該操作隨後繼續進行步驟5。50 u 1 反應批量包含緩衝液(10mM Tris-HCl,pH 9. 0、50mM KC1 和 3mM MgS04)、每
35種情況下500nM的擴增引物(顯示於SEQ ID NO 17和SEQ ID NO 18中)、10 ii 1 Q溶液 (包含於Qiagen，產品號206143中)、每種情況下0. 2mM脫氧核糖核酸、0. 5iU Taq DNA聚 合酶(Invitrogen，產品號11304_011)和作為模板的250ng酵母基因組DNA (Invitrogen 產品號 40802)。使用來自 Eppendorf 的 Mastercycler (產品號 5331 000. 010)進行 PCR。從釀酒酵母中分離的編碼具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白質的核酸序列 顯示於SEQ ID NO 10中。在將所獲片段克隆至載體pCR 2. 1中並測序確認後，使用限制性內切核酸酶Kpn I和Xba I分離來自釀酒酵母的所述編碼具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白質的核酸 序列並克隆至載體PA7中，已使用相同的限制性內切核酸酶切割該載體。所獲質粒命名為 IC 303-204。c)分離並克隆編碼具有GlcNAc-P變位酶活性的蛋白質的核酸序列通過PCR從釀酒酵母中分離編碼具有乙醯葡萄糖胺磷酸變位酶活性的蛋白質 的核酸序列(pcm I，EC 5.4.2.3)並克隆至來自Invitrogen的載體pCR 2. 1 (產品號 K2000-01)中。PCR反應條件如下1.步驟5 分鐘 94°C，2.步驟45 秒，94°C，3.步驟45 秒，59 °C，4.步驟45 秒，72 °C，5.步驟30 分鐘，72 °C6.步驟4°C將步驟2至步驟4重複35次，並該操作隨後繼續進行步驟5。50 u 1 反應批量包含緩衝液(10mM Tris_HCl，pH 9. 0、50mM KC1 和 3mM MgS04)、每 種情況下500nM的擴增引物(顯示於SEQ ID NO 27和SEQ ID NO 28中)、10iU Q溶液 (包含於Qiagen，產品號206143中)、每種情況下0. 2mM脫氧核糖核酸、0. 5iU Taq DNA聚 合酶(Invitrogen，產品號11304_011)和作為模板的250ng酵母基因組DNA (Invitrogen 產品號 40802)。使用來自 Eppendorf 的 Mastercycler (產品號 5331 000. 010)進行 PCR。在將所獲片段克隆至載體pCR 2. 1中並測序確認後，使用限制性內切核酸酶Kpn I和Xba I分離來自釀酒酵母的所述編碼具有乙醯葡萄糖胺磷酸變位酶活性的蛋白質的核 酸序列並克隆至載體PA7中，已使用相同的限制性內切核酸酶切割該載體。所獲質粒命名 為 IC 304-204。d)從大腸桿菌(Escherichia coli)中分離並克隆編碼具有GlcN_l_P變位酶活性 的蛋白質的核酸序列通過PCR分離來自大腸桿菌的編碼具有葡糖胺1-磷酸變位酶(GlcN-1-P變位 酶)活性的蛋白質的核酸序列(glmm)並克隆至來自Invitrogen的載體pCR 2. 1(產品號 K2000-01)中。PCR反應條件如下1.步驟5 分鐘 94°C，2.步驟45 秒，94°C，3.步驟45 秒，59 °C，4.步驟45 秒，72 °C，
5.步驟30 分鐘，72 °C6.步驟4°C將步驟2至步驟4重複35次，並該操作隨後繼續進行步驟5。50 u 1 反應批量包含緩衝液(10mM Tris_HCl，pH 9. 0、50mM KC1 和 3mM MgS04)、每 種情況下500nM的擴增引物(顯示於SEQ ID NO 19和SEQ ID NO 20中)、10iU Q溶液 (包含於Qiagen，產品號206143中)、每種情況下0. 2mM脫氧核糖核酸、0. 5iU Taq DNA聚 合酶(Invitrogen，產品號11304_011)和作為模板的250ng大腸桿菌基因組DNA。使用來 自 Eppendorf 的 Mastercycler (產品號 5331 000. 010)進行 PCR。從大腸桿菌中分離的編碼具有葡糖胺1-磷酸變位酶活性的蛋白質的核酸序列顯 示於 SEQ ID NO 21 中。在將所獲片段克隆至載體pCR 2. 1中並測序確認後，使用限制性內切核酸酶Kpn I和Xba I分離來自大腸桿菌的所述編碼具有GlcN-1-P變位酶活性的蛋白質的核酸序列 並克隆至載體PA7中，已使用相同的限制性內切核酸酶切割該載體。所獲質粒命名為IC 300-204。e)從大腸桿菌中分離並克隆編碼具有GlcN-1-P乙醯轉移酶和UDP-GlcNAc-1-P焦 磷酸化酶雙功能活性的蛋白質的核酸序列通過PCR從大腸桿菌中分離編碼具有葡糖胺1-磷酸乙醯轉移酶和UDP-GlcNAc 焦磷酸化酶活性的雙功能蛋白質的核酸序列(qlmu)並克隆至來自Invitrogen的載體pCR 2. 1 (產品號K2000-01)中。PCR反應條件如下1.步驟5 分鐘 94°C，2.步驟45 秒，94°C，3.步驟45 秒，59 °C，4.步驟45 秒，72 °C，5.步驟30 分鐘，72 °C6.步驟4°C將步驟2至步驟4重複35次，並該操作隨後繼續進行步驟5。50 u 1 反應批量包含緩衝液(10mM Tris_HCl，pH 9. 0、50mM KC1 和 3mM MgS04)、每 種情況下500nM的擴增引物(顯示於SEQ ID NO 23和SEQ ID NO 24中)、10iU Q溶液 (包含於Qiagen，產品號206143中)、每種情況下0. 2mM脫氧核糖核酸、0. 5iU Taq DNA聚 合酶(Invitrogen，產品號11304_011)和作為模板的250ng大腸桿菌基因組DNA。使用來 自 Eppendorf 的 Mastercycler (產品號 5331 000. 010)進行 PCR。從大腸桿菌中分離的編碼具有葡糖胺1-磷酸乙醯轉移酶和UDP-GlcNAc焦磷酸化 酶雙功能活性的蛋白質的核酸序列顯示於SEQ IDN0 25中。在將所獲片段克隆至載體pCR 2. 1中並測序確認後，使用限制性內切核酸酶Kpn I和Xba I從大腸桿菌中分離所述編碼具有GlcN-1-P乙醯轉移酶和UDP-GlcNAc焦磷酸化 酶活性的雙功能蛋白質的核酸序列(glmu)並克隆至載體pA7中，已使用相同的限制性內切 核酸酶切割該載體。所獲質粒命名為IC 299-204。6.製備包含來自小球藻病毒1的乙醯透明質酸合酶編碼核酸序列的植物表達載 體
通過用BamH I和Xho I限制酶切消化從質粒IC 323-215中分離包含乙醯透明質 酸合酶編碼序列的核酸分子並克隆至質粒IR 47-71的BamH I和Xho I限制位點中。所獲 植物表達載體命名為IC 341-222。7.製備包含來自釀酒酵母的具有GlcN-6-P乙醯轉移酶活性的蛋白質的編碼核酸 序列的植物表達載體IC 351-222起始質粒為上述植物表達載體pUBI bar (WO 9744472)，其中將來自酵母的gna基 因的編碼序列克隆至所述植物表達載體pUBI bar的EcoR I和Sda I限制位點。通過EcoR I和Sda I限制酶切消化從質粒IC 298-204中分離來自酵母的gna基因的編碼序列。所獲 載體命名為IC 351-222。8.製備包含具有GlcN-6-P乙醯轉移酶活性的蛋白質和具有UDP-GlcNAc焦磷酸化 酶活性的蛋白質的編碼核酸序列的植物表達載體IC 392-337起始質粒為上文中進一步描述的質粒IC 351-222，其中將使用限制性內切核酸酶 Eco RI從質粒IC 389-337中分離的YLCV啟動子和N0S終止子和0CS終止子的盒克隆至其 Eco RI限制位點中。所獲載體命名為IC390-337。通過Sac I和Eco RV限制酶切消化從上述質粒IC 303-204中分離qri基因的 編碼序列並連接至載體IC 390-337的Sac I和Sma I限制位點中。所獲載體命名為IC 391-337。為了去除多餘的0CS終止子，用Aat II消化載體IC 391-337並隨後重連接。所 獲植物表達載體命名為IC 392-337。9.製備包含來自大腸桿菌的具有GlcN-1-P變位酶活性的蛋白質的編碼核酸序 列，以及具有GlcN-1-P乙醯轉移酶和UDP-GlcNAc焦磷酸化酶雙功能活性的雙功能蛋白質 的植物表達載體IC 360-237用於引入來自大腸桿菌的編碼具有G1 cN-1-P乙醯轉移酶和UDP-G1 cNAc-1-P 焦磷酸化酶雙功能活性的蛋白質的核酸序列的起始質粒為上文中進一步描述的質粒IC 299-204，經Eco RI限制酶切消化分離所述質粒的編碼序列並克隆至pMCS5載體(MoBiTec GmbH, Prod. No. :pMCS5)的Eco RI限制位點中。所獲載體命名為IC 307-204。在下一步 中，用限制性內切核酸酶Pme I和Sma I消化載體IC 307-204並重連接。所獲載體命名為 IC 311-204。隨後通過用Bam HI和Kpnl限制酶切消化從質粒IC 311-204中分離編碼具 有GLMU活性的蛋白質的核酸序列並連接至載體IC 312-204的Bam HI和Kpnl限制位點中。 所獲載體命名為IC315-204。通過同時連接包括經Eco RI和Sal I限制酶切消化從質粒 PA7中分離的35S啟動子片段、經Hind III和Sal I限制酶切消化從IC 309-204中分離的 ocs片段和已通過Eco RI限制酶切消化切開的載體IC310-204的三條片段來製備載體IC 312-204。質粒IC310-204為pUC 18載體，其部分MCS已通過Hind III和Eel 135II限制 酶切消化和隨後的重連接被去除。通過使用Hind III和Sal I從pA7中分離ocs片段並 將其克隆至用Hind III和Sal I消化的pBS KS載體來製備IC 309-204。通過Eco RI限制酶切消化從質粒IC 315-204中分離35S啟動子、來自大腸桿菌 的編碼具有葡萄糖胺1-磷酸乙醯轉移酶和UDP-GlcNAc焦磷酸化酶雙功能活性的蛋白質的 核酸序列(qlmu)和ocs終止子，並將其克隆至Ubi Bar載體(W0 9744472)的Eco RI限制 位點中。所獲載體命名為IC 359-237。
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用於引入編碼具有GlcN-1-P變位酶活性的蛋白質的核酸序列的起始質粒為上文 中進一步描述的質粒IC 299-204，經Sda I和Sma I限制酶切消化分離其編碼序列並連接 至Ubi bar載體的Sda I和Hpa I限制位點中。所獲載體命名為IC 355-222。通過Spe I和Dra I限制酶切消化從質粒IC 355-222中分離glmm基因的編碼 序列並將其克隆至IC 359-237質粒的Spe I和Pme I限制位點中。所獲載體命名為IC 360-237。10.製備包含來自釀酒酵母的具有GlcN-6-P乙醯轉移酶活性的蛋白質、具有 UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白質以及具有GlcNAc-P變位酶活性的蛋白質的編碼核酸 序列的植物表達載體IC 393-337用於引入來自釀酒酵母的編碼GlcNAc-P變位酶的核酸序列的起始質粒為上文中 進一步描述的質粒IC 304-204，經Eco RI限制酶切消化分離其編碼序列並克隆至pMCS5載 體(MoBiTec GmbH, Prod. No. :pMCS5)的 Eco RI 限制位點中。所獲載體命名為 IC 313-204。 在下一步中，經Pme I和Pac I限制酶切消化從載體IC 313-204中分離來自釀酒酵母的編 碼GlcNAc-P變位酶的核酸序列並克隆至已用Pme I和Pac I消化的載體IC393-337中。所 獲載體命名為IC 394-337。用於製備質粒IC 393-337的起始載體為上文進一步描述的質粒IC391-337，其已 包含具有GlcN-6-P乙醯轉移酶活性的蛋白質和具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白質 的核酸序列。為此，經Pac I和Avrll限制酶切消化分離上文中進一步描述的B33啟動子 並克隆至已用Pac I和Avr II消化的載體IC 391-337中。所獲植物表達載體命名為IC 393-337。11.馬鈴薯植株的轉化根據一般方法第一項中描述的方法用植物表達載體IC 341-222轉化馬鈴薯植 株，所述載體包含在來自馬鈴薯的patatin基因B33的啟動子調控下的來自小球藻病毒1 的乙醯透明質酸合酶的編碼核酸序列(Rocha-Sosa等，1989，EMB0 J. 8，23-29)。轉化有質粒IC 341-222的所獲馬鈴薯植株命名為365ES X，其中X表示從轉化中 獨立獲得的植株。將轉化後所獲的栽培品種命名為365ES X，並分析由正在討論的植株合成的乙醯 透明質酸的量(也見於W0 2006032538)。選擇栽培品種365ES13和365ES 74用於下文中 描述的轉化。根據一般方法第一項中描述的方法用植物表達載體IC 392-337或IC360-237或 IC 394-337轉化栽培品種365ES 13和365ES 74的馬鈴薯植株。將用質粒IC 392-337轉化的栽培品種365ES 13所獲的轉基因馬鈴薯植株命名為 437ES X，其中X表示從轉化中獨立獲得的植株。將用質粒IC 392-337轉化的栽培品種365ES 74所獲的轉基因馬鈴薯植株命名為 438ES X，其中X表示從轉化中獨立獲得的植株。將用質粒IC 360-237轉化的栽培品種365ES 13所獲的轉基因馬鈴薯植株命名為 397ES X，其中X表示從轉化中獨立獲得的植株。將用質粒IC 360-237轉化的栽培品種365ES 74所獲的轉基因馬鈴薯植株命名為 398ES X，其中X表示從轉化中獨立獲得的植株。
將用質粒IC 393-337轉化的栽培品種365ES 13所獲的轉基因馬鈴薯植株命名為 444ES X，其中X表示從轉化中獨立獲得的植株。將用質粒IC 393-337轉化的栽培品種365ES 74所獲的轉基因馬鈴薯植株命名為 445ES X，其中X表示從轉化中獨立獲得的植株。12.分析包含編碼乙醯透明質酸合酶和編碼具有GlcNAc-6-P乙醯轉移酶活性的 蛋白質和編碼具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白質的外來核酸分子的馬鈴薯植株在溫室中，將栽培品種365ES 13、365ES 74、437ES X、438ES X、397ES X、398ES X、 444ES X和445ES X的單獨植株種植於6cm盆中的土壤裡。根據一般方法第3項中描述的 方法從7至9周齡植株中收穫植株的整個地上部分並處理。使用一般方法第4項中描述的 方法並在標準曲線的幫助下通過測定植物提取物的等分試樣中所包含的乙醯透明質酸來 測定正在討論的植物提取物中乙醯透明質酸的量。對於測定乙醯透明質酸的量，按1 10 稀釋來使用離心後所獲的上清。對於選擇後的植株，獲得以下結果 表1 正在討論的植物由僅包含編碼乙醯透明質酸合酶的外來核酸分子的栽培品 種365ES 13和365ES 74的獨立選擇的轉基因植株在整個地上部分所產生的乙醯透明質酸 的量(以每克鮮重中的乙醯透明質酸的^8量計)。第一列顯示了從中收集材料的植株的 名稱(「wt Desiree」指栽培品種D6sir6e未轉化的野生型植株)。第2列顯示了基於所用 的鮮重的乙醯透明質酸的量。
表2 正在討論的植物由栽培品種437ES或438ES的獨立選擇的轉基因植株在整 個地上部分所產生的乙醯透明質酸的量(以每克鮮重中的乙醯透明質酸的4 8量計)。第 一列顯示了從中收集材料的植株的名稱。第2列顯示了基於所用的鮮重的乙醯透明質酸的量。顯示的結果說明同時含有編碼乙醯透明質酸合酶和編碼具有GlcN-6-P乙醯轉移 酶活性的蛋白質和編碼具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白質的外來核酸分子的植株 比僅包含編碼乙醯透明質酸合酶的外來核酸分子的植株合成明顯更大量的乙醯透明質酸。
表3 正在討論的植物由栽培品種497ES或498ES的獨立選擇的轉基因植株在整 個地上部分所產生的乙醯透明質酸的量(以每克鮮重中的乙醯透明質酸的4 8量計)。第 一列顯示了從中收集材料的植株的名稱。第2列顯示了基於所用的鮮重的乙醯透明質酸的量。顯示的結果說明同時含有編碼乙醯透明質酸合酶和編碼具有GlcN-P變位酶活性 的蛋白質和具有GlcN-1-P乙醯轉移酶和UDP-GlcNAc焦磷酸化酶雙功能活性的蛋白質的外 來核酸分子的植株比僅包含編碼乙醯透明質酸合酶的外來核酸分子的植株不合成明顯更 大量的乙醯透明質酸。
表4 正在討論的植物由栽培品種444ES或445ES的獨立選擇的轉基因植株在整 個地上部分所產生的乙醯透明質酸的量(以每克鮮重中的乙醯透明質酸的4 8量計)。第 一列顯示了從中收集材料的植株的名稱。第2列顯示了基於所用的鮮重的乙醯透明質酸的量。顯示的結果說明同時含有編碼乙醯透明質酸合酶和編碼具有GlcN-P變位酶活性 的蛋白質和具有GlcN-6-P乙醯轉移酶的蛋白質和具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白 質的外來核酸分子的植株比僅包含編碼乙醯透明質酸合酶和具有GlcN-6-P乙醯轉移酶活 性的蛋白質和具有UDP-GlcNAc焦磷酸化酶活性的蛋白質的外來核酸分子的植株不合成明 顯更大量的乙醯透明質酸。
權利要求
包含編碼葡糖胺聚糖合酶的外來核酸分子的經遺傳修飾的植物細胞，其中所述植物細胞還包含編碼具有葡糖胺6-磷酸乙醯轉移酶活性的蛋白質的外來核酸分子以及編碼具有單功能UDP-N-乙醯基-葡糖胺焦磷酸化酶活性的蛋白質的外來核酸分子。
2.包含權利要求1的經遺傳修飾的植物細胞的植物。
3.權利要求2的植物的繁殖材料，其包含權利要求1的經遺傳修飾的植物細胞。
4.權利要求2的植物的可收穫植物部分，其包含權利要求1的經遺傳修飾的植物細胞。
5.產生植物的方法，其包括a)遺傳修飾植物細胞，其中所述遺傳修飾包括下文的步驟i到iiii)向植物細胞中引入編碼具有葡糖胺聚糖合酶活性的蛋白質的核酸分子 )向植物細胞中引入編碼具有葡糖胺6-磷酸乙醯轉移酶活性的蛋白質的核酸分子iii)向植物細胞中引入編碼具有UDP-N-乙醯基-葡糖胺焦磷酸化酶單功能活性的蛋 白質的核酸分子b)從來自步驟a)i和/或a) ii和/或a) iii的植物細胞再生植物；c)適當時，使用步驟b)的植物產生進一步的植物，其中可以任何順序進行步驟a) i到a) iii，或者可同時獨立地進行步驟a) i到a) iii， 或者同時進行步驟a)i到a)iii的任何組合，並且適當時，可向根據步驟b)或c)獲得的植 物的植物細胞中引入步驟a) i到a) iii的缺少的外來核酸分子。
6.用於產生葡糖胺聚糖的方法，其包括從權利要求1的經遺傳修飾的植物細胞、權利 要求2的植物、權利要求3的繁殖材料、權利要求4的可收穫植物部分或通過權利要求5的 方法獲得的植物中提取葡糖胺聚糖的步驟。
7.權利要求1的經遺傳修飾的植物細胞、權利要求2的植物、權利要求3的繁殖材料、 權利要求4的可收穫植物部分或通過權利要求5的方法獲得的植物用於產生葡糖胺聚糖的 用途。
8.包含權利要求1的經遺傳修飾的植物細胞的組合物。
9.用於製備包含葡糖胺聚糖的組合物的方法，其包括使用權利要求1的經遺傳修飾的 植物細胞、權利要求2的植物、權利要求3的繁殖材料、權利要求4的可收穫植物部分或通 過權利要求5的方法獲得的植物。
10.權利要求1的經遺傳修飾的植物細胞、權利要求2的植物、權利要求3的繁殖材料、 權利要求4的可收穫植物部分或通過權利要求5的方法獲得的植物用於製備權利要求8的 組合物的用途。
全文摘要
本發明涉及合成增加量的葡糖胺聚糖的植物細胞和植物，和用於製備此類植物的方法，以及在這些植物細胞或植物的幫助下製備葡糖胺聚糖的方法。此處，相比較於野生型植物細胞或野生型植物，根據本發明的植物細胞或經遺傳修飾的植物具有葡糖胺聚糖合酶活性以及額外增加的葡糖胺6-磷酸乙醯轉移酶活性和增加的UDP-N-乙醯基-葡糖胺焦磷酸化酶活性。本發明還涉及包含具有增加的葡糖胺聚糖合成的植物細胞的組合物。
文檔編號C12N15/82GK101855354SQ200880115486
公開日2010年10月6日 申請日期2008年9月11日 優先權日2007年9月12日
發明者B·埃西格曼, C·弗羅貝格 申請人:拜爾作物科學股份公司