在複雜生物液中的蛋白質的快速表徵的製作方法

2023-05-05 09:21:36

專利名稱：在複雜生物液中的蛋白質的快速表徵的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於快速篩選候選蛋白質治療劑的組合物和方法。特別地，本發明提供了用於測定在複雜生物液中的候選蛋白質治療劑的行為和用於鑑定在這些液體中展示期望的藥代動力學性質的候選蛋白質治療劑的組合 物和方法。
背景技術：
在開發用於治療應用的生物製劑中，在早期階段能夠評估候選化合物的穩定性和活性是非常重要的。當需要測定許多候選物時，體內評估是不切實際的。因此，開發了體外分析技術以提供初步的穩定性和活性數據。然而，這些技術一般使用標準緩衝液和定義明確的條件進行，這些緩衝液和條件接近，但可能截然不同於使候選化合物穩定和有活性從而在治療上有效的複雜生物液的環境。在過去幾年中日益明顯的是，當在血液循環後恢復時，蛋白質治療劑，例如抗體和其他重組表達的多肽展示改變的生理化學特徵，包括減少的效能。因此，應用標準緩衝液和條件的要求快速評估和選擇候選蛋白質治療劑的目前的藥物開發方案可能不能提供足夠的數據用於準確評估臨床有效性和穩定性。特別地，常規測定不能區分在複雜生物液中的穩定和顯示期望藥代動力學(「PK」)性質的候選蛋白質治療劑與不穩定和表現不佳的候選蛋白質治療劑。在一個這樣的常規分析技術的例子中，Chen等人，Glycobiology, 19(3) : 240-249(2009)描述了在人血清中存在的單克隆抗體的電泳分析。Chen等人應用的分析技術要求在電泳分離目的抗體以鑑定特定的生理化學特性以前，首先通過親和分離從血清樣品中移取這些抗體和然後在標準磷酸緩衝液(「PBS」)溶液中重懸。因此，此技術不能分離暴露於人血清對生理化學特性的特定貢獻與親和分離和在PBS中的重懸的貢獻。此外，親和分離和重懸步驟使抗體表徵技術增加了大量時間和成本。能夠快速、精確和靈敏地分析在複雜生物液，例如血液、血清、血漿、淋巴液(lymph)、尿液和唾液中的候選蛋白質治療劑的高通量技術不僅可降低開發成本，而且可便於有效篩選大量候選分子。本發明滿足了這些需求。發明概述
在某些實施方案中，本發明涉及分析候選蛋白質治療劑的生理化學性質的方法，其中所述候選蛋白質治療劑首先被標記，然後暴露於複雜生物液，其後基於候選蛋白質治療劑的物理屬性得到和分離包含標記的候選蛋白質治療劑的複雜生物液樣品，其中檢測所述標記物以測定候選蛋白質治療劑的生理化學性質。在某些實施方案中，在候選蛋白質治療劑上的標記物是螢光標記物。在某些實施方案中，在候選蛋白質治療劑上的螢光標記物是Pico Protein 染料(Caliper Life Sciences, Inc. , Hopkinton, MA)。在本發明的某些實施方案中，候選蛋白質治療劑選自抗體、抗體類似物(例如免疫粘附分子)、酶、細胞因子、細胞因子受體、淋巴因子、淋巴因子受體和激素。在某些實施方案中，待測定的生理化學性質選自(a)候選蛋白質治療劑的片段化情況；(b)候選蛋白質治療劑的聚集傾向；(c)候選蛋白質治療劑的失活傾向；和(d)候選蛋白質治療劑的另一種藥代動力學特徵。在某些實施方案中，待測定的生理化學性質是候選蛋白質治療劑的藥代動力學特徵，其選自候選蛋白質治療劑的吸收速率、分布速率、代謝速率、排洩速率、吸收程度、分布程度、代謝程度和排洩程度。在本發明的某些實施方案中，候選蛋白質治療劑暴露的複雜生物液選自血液、血漿、血清、淋巴液、尿液和唾液。 在某些實施方案中，包含候選蛋白質治療劑的複雜生物液的分離是電泳分離。在某些實施方案中，電泳分離是毛細管電泳，例如使用LabChip GXII儀器(Caliper Life Sciences, Inc. , Hopkinton, MA)進行的毛細管電泳。附圖
簡述
圖 I 描述了電泳圖的編繪(a compilation of electropherograms),分別說明了 mAb-1樣品在5°C下和在25°C和40°C加熱6和3個月後的蛋白質組成。「LC」指輕鏈；「HC」指重鏈；「Fab」指Fab片段，如在發明詳述中更詳細概述的，其包括抗體的抗原結合區jP「Fc」指Fe片段，如在發明詳述中更詳細概述的，其包括抗體的恆定區；和「聚集物」指抗體的聚集。圖2描述了電泳圖的編繪，說明在全血中孵育4和24小時後得到的mAb-1數據的精度(η=3) ο圖3(A)_3(B)描述了電泳圖的編繪，其為在全血中孵育T= O小時，T= 4小時和T= 24小時後得到的(A) DVD-I和(B) mAb-1分子。發明詳述
本發明涉及用於快速篩選候選蛋白質治療劑的組合物和方法。特別地，本發明提供了用於測定在複雜生物液中的候選蛋白質治療劑的行為和用於鑑定在這些液體中展示期望的PK性質的候選蛋白質治療劑的組合物和方法。為了明確且不用於限制，此詳述分為以下子部分
1.定義；
2.待分析的性質,和
3.分析方法。I.定義
為了可以更容易地理解本發明，首先定義一些術語。 術語「蛋白質」，如本文使用的，旨在指包含通過肽鍵連接的胺基酸殘基的組合物。術語蛋白質，如本文使用的，可與術語「多肽」同義，或可另外指2種或多種多肽的複合物，例如包含通過二硫鍵結合在一起的重鏈和輕鏈多肽分子二者的抗體。術語「抗體」，如本文使用的，旨在指包含免疫球蛋白的分子。免疫球蛋白包含4條多肽鏈，2條重(H)鏈和2條輕(L)鏈，重鏈和輕鏈之間通過二硫鍵連接。每條重鏈包含重鏈可變區(本文中簡稱為HCVR或Vh)和重鏈恆定區(Ch)。重鏈恆定區包含3個結構域，CH1、CH2和CH3。每條輕鏈包含輕鏈可變區(本文中簡稱為LCVR或')和輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含I個結構域，Q。Vh和' 區可被進一步細分為被稱為互補決定區(CDR)的高變區和穿插在高變區中的被稱為框架區(FR)的更保守的區域。每個Vh和' 由3個CDR和4個FR組成，從氨基端到羧基端以如下順序排列FR1、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。有5種免疫球蛋白，IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，基於其重鏈恆定區的結構鑑定每一種類。IgA、IgD和IgG的重鏈恆定區每個具有3個Ig結構域和提供靈活性的鉸鏈區；而IgE和IgM的恆定區具有4個Ig結構域。 IgA和IgG種類分別被進一步分為2和4種單獨的同種型(IgAl 和 IgA2 ;IgGl、IgG2、IgG3 和 IgG4)。本文中描述了包含抗體的「抗原結合部分」(或「抗體部分」)的某些抗體片段。這些片段包含抗體保留特異性結合抗原的能力的部分。術語抗體的「抗原結合部分」中包含的抗原結合片段的實例包括(i) Fab片段，包含'、Vh、(^和Chi結構域的單價片段；(ii)F(ab』)2片段，包含2個Fab片段的二價片段，所述2個Fab片段通過在鉸鏈區的二硫鍵連接；(iii)包含Vi^PChi結構域的Fd片段；(iv)包含抗體單臂的Vlj和Vh結構域的Fv片段，(V) dAb片段(Ward等人，(1989) Nature 341:544-546，將其全部教導引入本文作為參考)，其包含Vh結構域；和(vi)分離的互補決定區(⑶R)。此外，儘管Fv片段的2個結構域，Vl和Vh，是由單獨的基因編碼，使用重組方法，通過能夠使它們成為單條蛋白質鏈的合成接頭可將它們連接，其中 '和Vh區配對從而形成單價分子(被稱為單鏈Fv (scFv)；見，例如，Bird 等人(1988) Science 242:423-426;和 Huston 等人(1988) Proc. Natl.Acad. Sci. USA 85:5879-5883，將其全部教導引入本文作為參考)。術語抗體的「抗原結合部分」也旨在包括這樣的單鏈抗體。也包括單鏈抗體的其他形式，例如雙抗體。雙抗體是二價的雙特異性抗體，其中％和\結構域在單條多肽鏈上表達，但使用太短以至於不允許同一鏈上的2個結構域之間配對的接頭，因此迫使結構域與另一條鏈的互補結構域配對並產生2個抗原結合位點(見,例如，Holliger, P.，等人(1993) Proc. Natl. Acad. Sci.USA 90:6444-6448 ；Poljak, R. J.,等人(1994) Structure 2:1121-1123，將其全部教導引入本文作為參考)。此外，雙可變結構域抗體(DVD-IgG)是雙特異性的四價免疫球蛋白G (IgG)樣分子，其可從任意2種單克隆抗體改造而成，同時保留親本抗體的活性(見，例如，Wu 等人，(2007) Nature Biotechnology 25,1290 - 1297)。此外，抗體或其抗原結合部分可為更大的免疫粘附分子的一部分，所述免疫粘附分子通過抗體或抗體部分與一種或多種其他蛋白質或肽的共價或非共價連接形成。這樣的免疫粘附分子的實例包括使用鏈黴抗生物素核心區製備四聚scFv分子(Kipriyanov, S. Μ.,等人(1995) Human Antibodiesand Hybridomas 6:93-101,將其全部教導引入本文作為參考)和使用半胱氨酸殘基、標記肽和C-端多聚組氨酸標記以製備二價和生物素化的scFv分子(Kipriyanov, S. Μ.，等人(1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058，將其全部教導引入本文作為參考)。可使用常規技術，例如全抗體的分別的木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化從全抗體製備抗體部分，例如Fab和F(ab』)2片段。此外，可使用標準重組DNA技術得到抗體、抗體部分和免疫粘附分子。本文討論的某些抗體片段不保留抗體結合能力，包括但不限於，Fe抗體片段。術語「Fe片段」，如本文使用的，指當用木瓜蛋白酶消化免疫球蛋白分子時產生的抗體片段，和指排除輕鏈的可變區(')和恆定區以及重鏈的可變區(Vh)和恆定區I (Chi)的免疫球蛋白分子的區域。術語「複雜生物液」，如本文使用的，旨在指在受試者中發現的任意循環或非循環的生物液，包括但不限於血液、血清、血漿、淋巴液、尿液、腦脊液和唾液。在分離分析前可最低限度地處理複雜生物液；例如，可通過離心(低速或高速)或過濾或沉澱去除細胞和/或粗顆粒成分，或可使用本領域已知的標準緩衝液稀釋所述液體。甚至在這樣的處理以後，在本文中仍然將其稱為「複雜生物液」。術語「全血」，如本文使用的，旨在指在脊椎動物的心臟、動脈、毛細血管和靜脈中循環的攜帶營養和氧氣至身體所有部分並帶走廢產物的液體，其包含多種類型的細胞、蛋白質和鹽Issaq等人，Chem Rev 107(8) :3601-3620 (2007)。當從此液體中去除細胞而不凝血，則剩下的液體部分為「血漿」;然而，如果在無抗凝血劑的情況下去除細胞，則液體部分被稱為「血清」。血清與血漿的區別在於，去除了纖維蛋白以及與纖維蛋白相關的蛋白質；估計血清比血漿少約3-4%的蛋白質。血漿一般包含約22種蛋白質，它們構成99%的總蛋白質含量——這22種蛋白質包括白蛋白、總IgG、轉鐵蛋白、纖維蛋白原、總IgA、α-2-巨球蛋白、總IgM、α-I-抗胰蛋白酶、C3補體、結合珠蛋白(haptoglobulin)、α-I-酸性糖蛋白、 載脂蛋白-B、載脂蛋白-Al、脂蛋白(a)、因子H、血楽;銅藍蛋白(ceruloplasmin)、C4補體、補體因子B、前白蛋白、C9補體、Clq補體和C8補體。Anderson等人，MoI Cell Proteomics3(4) :311-326 (2004)和Anderson等人，Mol Cell Proteomics 1(11) :845-867 (2002)。血眾的其餘1%由數百種微豐度(micro-abundant)蛋白質組成。因此,血清蛋白質展示了極度「擁擠的」環境，其中排除體積導致抗體治療劑採用緊密的結構以及在血清中顯示與抗原的結合增強。Demeule等人，Anal Biochem 388(2) :279-287 (2009)。此外，高水平的白蛋白、半胱氨酸、胱氨酸、穀胱甘肽、高半胱氨酸和其他小硫醇也提供了便於從血清中恢復的抗體治療劑中的二硫鍵重排的「氧化還原」環境。Summa等人，Proteins 69(2) :369-378 (2007)；Soriani 等人,Arch Biochem Biophys 312 (I) : 180-188 (1994) ;Mills 等人,J Lab ClinMed 135(5) :396-401 (2000) ;HiIdebrandt 等人，Mech Ageing Dev 123(9) :1269-1281(2002) ；Fiskerstrand 等人，Clin Chem 39(2) :263-271 (1993) ；Di Giuseppe 等人，JLab Clin Med 142(1) :21-28 (2003);和 Andersson 等人，Clin Chem 39(8) :1590-1597(1993)。術語「藥代動力學性質」或「PK性質」，如本文使用的，旨在指描述候選蛋白質治療劑在受試者中傾向(disposition )的參數。代表性藥代動力學性質包括但不限於,候選蛋白質治療劑在受試者中的吸收、分布、代謝和排洩的程度或速率(「ADME特徵」)。術語「電泳」，如本文使用的，旨在指通過基質，優選通過聚合基質溶液使用電動勢(「EMF」)推動或拉動分子的技術。將分子常規地引入基質，在應用電流後，分子將以不同的速率朝正極(如果分子帶負電)或朝負極(如果分子帶正電)移動通過基質。電泳基質的實例包括如在SDS-PAGE分離中通常使用的聚丙烯醯胺，以及用於微流體電泳分離，例如LabChip GXIII儀器應用的毛細管電泳分離的具有低粘度的聚合物溶液。術語「受試者」，如本文使用的，旨在指任意動物，包括人和非人動物二者。術語「約」，如本文使用的，旨在指高於或低於參考值約10-20%的範圍。在某些情況下，本領域技術人員將承認，由於參考值的性質，術語「約」可表示多於或少於該值的10-20%的偏差。
2.待分析的性質
本發明的分析技術可用於測定候選蛋白質治療劑在複雜生物液中的行為，以及鑑定候選蛋白質治療劑的一種或多種PK性質。例如，但不以限制的方式，本發明的分析技術可用於測定通過暴露於複雜生物液而引起的某些分子行為，包括但不限於，候選蛋白質治療劑在這些液體中的片段化情況，以及候選治療劑在這些液體中形成聚集物的傾向。可使用本發明的分析技術評估的PK性質包括但不限於，候選蛋白質治療劑的吸收、分布、代謝和排洩特徵。在本發明的某些實施方案中，可同時或連續測定2種或多種這樣的片段化、聚集和ADME特徵。在某些實施方案中，本發明的分析技術用於測定候選蛋白質治療劑在複雜生物液中的片段化情況(fragmentation prof iIe)。在某些實施方案中，片段化情況可包括有關分子間片段化的信息，例如抗體中的重鏈和輕鏈多肽的分離。在某些實施方案中，片段化情況可包括有關分子內片段化的信息，例如抗體被蛋白酶切割以釋放Fc、Fv、Fab和/或F(ab』)2片段，或小於完整抗體，小於完整的單鏈免疫球蛋白，小於完整的Fc、Fv、Fab或F(ab』)2片 段等等的亞片段。在某些實施方案中，片段化情況可包括有關分子間和分子內片段化二者的信息。此外，在某些實施方案中，本發明的分析技術允許比較候選蛋白質治療劑暴露於相同類型的複雜生物液的不同樣品導致產生的片段化情況，以及基於候選蛋白質治療劑暴露於這些液體的時間長度(the length)比較片段化情況。在某些實施方案中，本發明的分析技術用於測定特定候選蛋白質治療劑在存在複雜生物液時聚集的傾向。此外，在某些實施方案中，本發明的分析技術允許比較候選蛋白質治療劑暴露於特定複雜生物液導致的特定候選蛋白質治療劑的聚集傾向，以及基於候選蛋白質治療劑暴露於這些液體的時間長度的比較。在某些實施方案中，本發明的分析技術用於測定候選蛋白質治療劑的吸收、分布、代謝和排洩的程度或速率。此外，在某些實施方案中，本發明的分析技術允許比較候選蛋白質治療劑暴露於特定複雜生物液導致的特定候選蛋白質治療劑的吸收、分布、代謝和排洩的程度或速率，以及基於候選蛋白質治療劑暴露於這些液體的時間長度的比較。3.分析方法
本發明的某些實施方案涉及用於測定已暴露於複雜生物液的候選蛋白質治療劑的生理化學特徵的方法。如下詳細概述地，這些方法包括用於測定生理化學特徵的多種技術，例如，但不限於，電泳分離、大小排阻層析和親和層析，並可包括候選蛋白質治療劑在體外或體內暴露於複雜生物液。在某些實施方案中，在暴露於複雜生物液以前標記目的候選蛋白質治療劑。在其他實施方案中，在暴露於複雜生物液以後，和任選地在電泳如或後標記候選蛋白質治療劑。在特別的實施方案中，標記物為螢光染料，例如Pico Protein 染料。在其他實施方案中，候選蛋白質治療劑被放射性標記或化學標記或酶標記或免疫標記。在某些實施方案中，候選蛋白質治療劑不被標記，而是通過足以鑑定目的候選蛋白質治療劑的免疫相互作用相互作用(例如，抗體與候選蛋白質治療劑的特異性結合)、受體/配體相互作用、酶相互作用，或任意其他蛋白質蛋白質或化學相互作用檢測。在某些實施方案中，標記的候選蛋白質治療劑通過在體外直接摻入(spiking)所述液體的樣品暴露於複雜生物液。在某些實施方案中，複雜生物液是血液、血漿、血清、淋巴液、尿液或唾液。在這樣的實施方案中，可在本領域技術人員有利確定的特定條件，例如溫度、壓力等下孵育樣品特定的時間。在這樣的直接摻入後，在本領域技術人員有利確定的一個或多個時間點上取出包含在複雜生物液中的候選蛋白質治療劑的樣品的一個或多個等分試樣。在某些實施方案中，然後基於等分試樣的成分的特定物理特徵，分離這些成分。在特別的實施方案中，分離是基於電荷，而在其他實施方案中，分離是基於可選的物理特徵，例如大小、PH或對特定層析底物的親和力。在分離是基於電荷的實施方案中，可通過應用電泳步驟完成分離。在特別的實施方案中，應用毛細管電泳通過電荷分離等分試樣的成分。在某些實施方案中，通過檢測在暴露於複雜生物液以前與蛋白質結合的標記物實現目的候選蛋白質，包括其片段和聚集物的分離分析。在某些實施方案中，對受試者(可為人或非人受試者)施用候選蛋白質治療劑以將候選蛋白質治療劑體內暴露於複雜生物液。可對受試者施用任意的多種形式的候選蛋白質 治療劑。這包括,但不限於,液體、半固體和固體劑量形式,例如液體溶液(例如,可注射和可輸注的溶液)、分散劑或懸浮劑、片劑、丸劑、粉末、脂質體和栓劑。劑量形式依賴於例如，預期的施用模式和計劃的治療應用。一般的組合物是可注射或可輸注的溶液形式，例如類似用於抗體的受試者被動免疫的組合物。一種施用模式是胃腸外的(例如，靜脈內，皮下，腹膜內，肌肉內)。在一個方面，通過靜脈內輸注或注射施用候選蛋白質治療劑。在另一個方面，通過肌肉內或皮下注射施用候選蛋白質治療劑。在對受試者施用候選蛋白質治療劑後，可在一個或多個時間點從受試者處米樣用於分析。基於特定的目的候選蛋白質治療劑，本領域技術人員可測定採集的樣品，例如血液、淋巴液、尿液或唾液。在某些實施方案中，採集的樣品是血液樣品。在特別的實施方案中，採集的血液將被進一步加工為血漿樣品。在可選的實施方案中，採集的血液將被進一步加工為血清樣品。此外，基於目的候選蛋白質治療劑以及待採樣的複雜生物液的已知特徵，本領域技術人員可確定這樣的採樣的時機。在某些實施方案中，這樣的採樣將以每小時、每12小時或每天的基礎進行。在某些實施方案中，在施用候選蛋白質治療劑後採集的樣品將基於該樣品的成分的物理特徵直接用於分析。在可選的實施方案中，在這樣的分析前，樣品將被進一步加工。例如，但不通過限制的方式，可使用本領域已知的標準緩衝液稀釋樣品。也可，或可選地離心樣品，例如，以約2，000 rpm離心5分鐘血液樣品以產生血清上清。在這樣的分析前，也可，或可選地將樣品暴露於中和化合物，例如，蛋白酶抑制劑，以抑制蛋白質降解。在某些實施方案中，通過基於特定物理特徵分離樣品成分分析這些成分。在特別的實施方案中，分離是基於電荷，而在其他實施方案中，分離是基於可選的物理特徵，例如大小、pH或對特定層析底物的親和力。在分離是基於電荷的實施方案中，可通過應用電泳步驟完成分離。在特別的實施方案中，應用毛細管電泳通過電荷分離樣品的成分。在某些實施方案中，通過檢測在暴露於複雜生物液以前與蛋白質結合的標記物實現目的候選蛋白質，包括其片段和聚集物的分離分析。在某些實施方案中，上述分析允許比較2種或多種候選蛋白質治療劑在一種或多種複雜生物液中的行為，以及比較候選蛋白質治療劑在這些液體中的一種或多種PK性質。在特別的實施方案中，這樣的比較允許分級多種候選蛋白質治療劑，包括，但不限於不同單克隆抗體克隆或DVD-IgG分子。
在某些實施方案中，本發明允許同時分析2種或多種候選蛋白質治療劑。在本發明的特別的實施方案中，候選蛋白質治療劑具有允許同時分析多種候選治療劑的不同的物理特徵，例如，但不限於，電荷或大小。在可選的實施方案中，候選蛋白質治療劑具有允許同時分析多種候選治療劑的不同的標記物。例如，但不通過限制的方式，可用在第一波長處發射的第一螢光標記物標記第一候選蛋白質治療劑，同時可用在第二波長處發射的第二螢光標記物標記第二候選蛋白質治療劑。在某些實施方案中，本發明允許分析特定候選蛋白質治療劑的降解途徑和代謝物。在特別的實施方案中，體外或體內標記特定候選蛋白質治療劑的特定代謝物並暴露於複雜生物液。包含特定候選蛋白質治療劑的特定代謝物的複雜生物液樣品的分析可提供有關在一種或多種複雜生物液中的候選蛋白質治療劑的代謝物的行為的信息，以及候選蛋白質治療劑的代謝物在這樣的液體中的一種或多種PK性質。在某些實施方案中，使用LabChip GXII儀器或等同的設備進行分析。在進行其分析中，LabChip GXII儀器應用晶片形式的傳統凝膠電泳原理。然而，晶片形式大大降低了分離時間並以數字格式提供自動化大小分類和定量信息。晶片包含連接分離通道的連通的微通道組，其包括分離基質和緩衝孔。一個微通道與從晶片底部以90度角延伸的短毛細管連接。在測定時，此毛細管從微板的孔中吸取樣品。
—旦充滿通道，晶片行使集成電路的功能以實現樣品的電泳分離。通過電極盒中的不同電極驅動電路，當晶片支架關閉時電極接觸晶片孔中的溶液。將充滿測定通道的聚合物基質設計為當通過電泳驅使蛋白質通過基質時，通過大小過濾蛋白質，類似於使用聚丙烯醯胺凝膠。然後，包含候選蛋白質治療劑的複雜生物液樣品電泳移動進測定通道。當片段在測定通道中向下移動時，它們通過大小分離，最後經過激發與候選蛋白質治療劑結合的螢光染料的雷射。軟體將螢光強度對時間作圖並產生每個樣品的電泳圖。
實施例I.全血中的蛋白質的分析
此實施例描述了使用LabChip GXII儀器分析直接從全血中回收的預標記的mAb和DVD-IgG分子。LabChip GXII具有從約14至約200 kDa的大小範圍和約土 10%的大小解析度。測定具有從約50 pg/ μ L至約100 ng/ μ L的約4 log的線性範圍。如下詳述地，使用製造商提供的Pico Protein 染料進行目的分子的標記。將標記的抗體摻入全血，在分析以前離心血液並收集上清用於在LabChip GXII上分析。將等分試樣的上清電動上樣至毛細管中並在包含具有低粘度的聚合物溶液的14 mm長的分離通道中分離。在約40秒中進行每種樣品的分析；直接在96或384孔板上進行。此研究證明了此測定的高精度，以及此方法的解析度和卓越的靈敏度。如製造商描述地製備染料溶液，Pico Protein 染料和蛋白梯。使用的標記緩衝液是O. 5M碳酸氫鈉(pH 8. O)。在此研究中使用2種不同的分子，mAb-Ι ( 一種單克隆抗體)和DVD-I ( 一種雙可變結構域抗體)。在標記緩衝液中將抗體稀釋為2mg/mL，然後將8 μ g抗體與40 μ M工作染料溶液孵育(抗體的終濃度為O. 8 mg/mL)。允許標記反應進行I小時，然後使用在O. IM Tris (pH 7. O)中的IM乙醇胺猝滅反應。然後將每種分子摻入人血(抗體的終濃度為約O. I mg/mL)並在5°C孵育不同時間(至多24小時)。然後以2000 rpm離心等分試樣的血液5分鐘並收集5μ L血清，使用製造商提供的樣品緩衝液稀釋至O. 01 mg/mL。在LabChip GXII上分析以前,將樣品加熱至75 °C，持續5分鐘。圖I中分別顯示了在5°C以及在25°C和40°C加熱6和3個月後的mAb-Ι的分析。得到的電泳圖與在其他儀器上通過CE-SDS (使用變性的十二烷基硫酸鈉的毛細管電泳)分析的片段可比較。LabChip GXII顯示了在熱應激後得到的所有已知片段，還顯示了 mAb-Ι的聚集。圖2中顯示了在全血中經過4和24小時後得到的mAb-Ι的精確數據(n=3)。從3次單獨的分析中得到電泳圖，並證明了此測定的卓越的可重複性。圖3A和3B中顯示了在全血中孵育T= O小時，T= 4小時和T= 24小時後得到的DVD-I和mAb-Ι分子的電泳圖。DVD-I分子較大，並具有與mAb-Ι不同的遷移時間。2種分子在全血中都顯示了不同水平的片段和聚集物形成。2.對動物施用的蛋白質的分析
此實施例描述了在對動物受試者施用後，使用LabChip GXII儀器分析直接從全血中回收的預標記的mAb和DVD-IgG分子。使用製造商提供的Pico Protein 染料進行目的分子的標記。對動物受試者施用標記的抗體並在這樣的施用以後的不同時間點得到全血。在分析以前離心血液並收集上清用於在LabChip GXII上分析。將等分試樣的上清電動上樣至毛細管中並在包含具有低粘度的聚合物溶液的14 mm長的分離通道中分離。在約40秒中進行每種樣品的分析；直接在96或384孔板上進行。如製造商描述地製備染料溶液，Pico Protein 染料和蛋白梯。使用的標記緩衝液是O. 5M碳酸氫鈉(pH 8. O)。在此研究中使用2種不同的分子，mAb-Ι ( 一種單克隆抗體)和DVD-I ( 一種雙可變結構域抗體)。在標記緩衝液中將抗體稀釋為2mg/mL，然後將8 μ g抗體與40 μ M工作染料溶液孵育(抗體的終濃度為O. 8 mg/mL)。允許標記反應進行I小時，然後使用在O. IM Tris (pH 7. O)中的IM乙醇胺猝滅反應。然後對小鼠施用每種分子(抗體的終濃度為約O. I mg/mL)。每天從小鼠中採集血樣，持續14天。然後以2000 rpm離心等分試樣的每種血液樣品5分鐘並收集5μ L血清，使用製造商提供的樣品緩衝液稀釋至O. 01 mg/mL。在LabChip GXII上分析以前,將每種樣品加熱至75 °C，持續5分鐘。
本文引用了多個出版物，其內容在此以其整體引入作為參考。
權利要求
1.一種用於分析候選蛋白質治療劑的生理化學性質的方法，其包括 (a)標記所述候選蛋白質治療劑； (b)將所述標記的候選蛋白質治療劑暴露於複雜生物液； (b)得到包含所述標記的候選蛋白質治療劑的所述複雜生物液的樣品；(c)基於所述候選蛋白質治療劑的物理屬性在微流體設備中分離所述樣品的成分；和 (d)檢測所述標記物以測定在被分離的樣品中的所述候選蛋白質治療劑的生理化學性質。
2.權利要求I的方法，其中所述標記物是螢光標記物。
3.權利要求I的方法，其中所述突光標記物是PicoProtein染料。
4.權利要求I的方法，其中所述候選蛋白質治療劑選自抗體、抗體類似物、酶、細胞因子、細胞因子受體、淋巴因子、淋巴因子受體和激素。
5.權利要求I的方法，其中所述性質選自(a)所述候選蛋白質治療劑的片段化情況；(b)所述候選蛋白質治療劑的聚集傾向；(c)所述候選蛋白質治療劑的失活傾向，和(d)所述候選蛋白質治療劑的另一種藥代動力學特徵。
6.權利要求5的方法，其中所述性質是所述候選蛋白質治療劑的片段化情況。
7.權利要求5的方法，其中所述性質是所述候選蛋白質治療劑的聚集傾向。
8.權利要求5的方法，其中所述性質是所述候選蛋白質治療劑的另一種藥代動力學特徵。
9.權利要求8的方法，其中所述藥代動力學特徵選自候選蛋白質治療劑的吸收速率、分布速率、代謝速率、排洩速率、吸收程度、分布程度、代謝程度和排洩程度。
10.權利要求I的方法，其中所述複雜生物液選自血液、血漿、血清、淋巴液、尿液、腦脊液和唾液。
11.權利要求5的方法，其中所述複雜生物液是血清。
12.權利要求I的方法，其中所述分離是電泳分離。
13.權利要求12的方法，其中所述電泳分離是毛細管電泳。
14.權利要求13的方法，其中所述毛細管電泳是使用LabChip GXII儀器進行的。
全文摘要
本文公開了用於快速篩選候選蛋白質治療劑的組合物和方法。特別地，本發明提供了用於測定在複雜生物液中的候選蛋白質治療劑的行為和用於鑑定在這些液體中展示期望的藥代動力學性質的候選蛋白質治療劑的組合物和方法。
文檔編號G01N33/58GK102713635SQ201180006970
公開日2012年10月3日 申請日期2011年1月25日 優先權日2010年1月25日
發明者I.R.科雷亞 申請人:雅培製藥有限公司