金黃色葡萄球菌腸毒素c3製備、製劑、用量及其用途的製作方法

2023-05-25 01:11:56 1

專利名稱：：金黃色葡萄球菌腸毒素c3製備、製劑、用量及其用途的製作方法
技術領域：
：本發明屬生物工程，涉及金黃色葡萄球菌腸毒素C3(Staphyl0C0CCalEnter0t0XinC3，SEC3)的製備方法、純化方法、製劑、用量及其在製備腫瘤、病毒及調節機體免疫藥物中的應用，本發明中的SEC3製劑、用量及應用領域也包括非本發明的其他途徑上得到的SEC3的範圍。
背景技術：
：超級抗原(SAg)是瑞典科學家懷特於1989年首次推出的新免疫學名詞，它是由細菌或病毒編碼的蛋白分子，可不需要抗原(APC)處理，以完整的蛋白質分子形式直接與APC膜上的MHC-II類分子抗原結合槽外側結合，導致帶有特異性Vβ片段的T細胞大量活化增值，活化的T細胞數是普通抗原的數千倍乃至數萬倍，但用量微小，是目前世界上已知最強大的免疫細胞激活劑。激活的T細胞、NK細胞、LAK細胞和巨噬細胞，除了直接殺滅腫瘤細胞外，誘導產生多種內源性細胞因子和細胞毒來治療癌症、愛滋病等多種免疫類疾病。根據10年超10000例的觀察，抗癌總有效率達97.4%，抑癌率達42.5%。國際上公認的超級抗原物質來源於金黃色葡萄球菌腸毒素(StaphylococcalEnterotoximSE)，這種具有強烈毒性的物質被發現具有超級抗原的特性後，成為治療人類疾病的福音。SE作為藥品有以下優點①.直接殺滅(SDCC)=SE直接與MHC-II類分子結合，呈到T淋巴細胞，激活T細胞，直接殺傷腫瘤細胞。②.間接殺滅SE活化體內多種免疫細胞，釋放大量細胞因子，攻擊腫瘤細胞，打破了機體對腫瘤的耐受並擴大對腫瘤的反應。③.提高腫瘤細胞對SDCC的易感性增強對腫瘤細胞的殺滅。④.保護白細胞在治療時，可以保護患者造血功能不被破壞，明顯預防和治療相關性的白細胞下降。⑤.類似幹擾素，卻優秀與幹擾素。⑥.適合於各種腫瘤患者群體使用直接治療，姑息治療，延長生命，提高生存質量，預防腫瘤轉移及復發。⑦.用於病毒引起的疾病治療如病毒性肝病，愛滋病等。⑧.用於免疫力低下患者治療使用。所以SEC3特殊的作用機理及強大的治療效果，是目前臨床常用藥不可相比的。自發現超抗原並挖掘出SE到現在，研究發現，SE分為A、B、C1、C2、C3、D及E等多種血清型，其中SEA、SED、SEE的胺基酸序列同源性高，SEA和SEE同源性大於90%，SEB、SECUSEC2、SEC3之間的同源性沒有上述3個分型高，但彼此之間還是存在一定的同源性，SEA、SEE由257個胺基酸組成，SEB、SECl、SEC2則為239個胺基酸組成，SEC3為238個胺基酸組成，SED為258個，各型的SE的C-末端和N-末端胺基酸殘基都不完全相同。目前研究較多的是SEA、SEB、SEC(1，2，3)分型，研究發現，SEA、SEB安全性較低，腹腔注射SEA、SEB致幼貓嘔吐的劑量為0.5μg，而SEC嘔吐劑量為25μg，安全係數是前兩個分型的50倍，所以SEC及分型更加安全。在中國，以金黃色葡萄球菌C(SEC)的SEC2為主要有效成分的金黃色葡萄球菌濾液製劑作為腫瘤放化療治療的輔助藥物應用於臨床已有近十個年頭，大量的臨床數據證明使用後腫瘤患者的免疫能力獲得了顯著的提高，患者的食慾、睡眠以及全身狀況均得到了明顯好轉。湯煒等通過對早期口腔癌採用局部金黃色葡萄球菌濾液製劑治療及對晚期口腔癌應用黃色葡萄球菌濾液製劑聯合化療，發現其可使大量淋巴細胞及纖維組織聚集在癌巢附近，並能觀察到腫瘤細胞顯著減少甚至部分病例腫瘤細胞消失，但是患者用金葡菌濾液注射液(主要成分為SEC2)後約24%60%的患者出現發熱、疼痛等副作用，必要時需要對症治療，給臨床使用製造了很大的障礙，如，臨床統計分別有28%和24%的腫瘤患者在使用金黃色葡萄球菌濾液製劑，並聯合卡鉬治療惡性胸腔積液過程中出現了發熱、局部疼痛等副作用；甚至有的臨床統計報導黃色葡萄球菌濾液製劑聯合順鉬治療惡性胸水過程中出現的副作用約佔治療組患者總數的65.5%。現代研究證實，在SEC的三個血清亞型中安全高效的是SEC3亞型，並且分子量只有26900，猴嘔吐試驗表明，SECl及SEC2為5μg，而SEC3的嘔吐劑量大於10μg，所以安全性及療效明顯優秀與Cl、C2兩個分型，把SEC3深度研究，開發成藥品，用於疾病的治療，更加具有意義，更加安全有效。所以SEC3的研究具有明顯的創新性和發明性。目前，已經有人利用基因工程手段製備金黃色葡萄球菌腸毒素超抗原，如，徐明愷等將SEC2基因克隆至pET28a中表達，但表達的重組產物比天然蛋白增加36個胺基酸，因此抗原決定簇及產物活性改變的可能性均較大。另外目前研究SEC上，主要研究的是SEC1、SEC2，SEC3的研究沒有文獻發表，僅有一篇CN1283264C專利，公開了金黃色葡萄球菌製備SE口服製劑的發明，其中SEC3的製備作為這篇專利的一小部分，但是也只界定為從CGMCC0341、CGMCC0342、CGMCC0485、CGMCCO165、CGMCC0381、CGMCC0780、CGMCC0662中的一種金黃色葡萄球菌株分離製得。
發明內容鑑於目前SE的研究情況，本發明提供了一種從國際標準菌株分離SEC3的發明，從種菌的復甦、復壯、培養、分離、純化及在各種製劑中做創新，使用本方法製備的SEC3能明顯降低常見的副作用，甚至不出現副作用大提高用藥安全性。本發明能顯著提高免疫細胞的活性，顯著刺激T淋巴細胞應答，顯著提高機體的免疫功能。還能明顯提高抑瘤率，起到直接的治療作用。本發明為超抗原的一個血清分型，ng級的用藥量就能起到顯著的效果，效果是普通抗原的200050000倍或以上；優秀於SEA、SEB、SEC混合液、SEC1、SEC2、SED及SEE等血清分型。在國內外現有培養基的基礎上，本發明優選出了創新的「優瓊培養基」，與其他研究的種子培養基，種子在創新的培養基裡生長更為優良。細菌在培養過程中，極易出現菌種退化、變異現象，導致不能正常生產，生產時，因為退化或變異的菌種產生的不明代謝產物，影響到產品質量，進而影響到臨床用藥的安全性及有效性。所以，生產時，必須對菌種進行復壯，防止出現以上的危險，為了解決這些問題，我們創新性的優選了一種強化復壯培養基，可保證生產菌種在幾十年中不受菌種變異而出現生產上的影響，始終為生產菌種保持原來的一切性狀和特性。另外還在原有的培養基基礎上，創新的發明了產毒培養基，使SEC3的產量是一般培養基的2倍以上。本發明同時研究清楚了SEC3的用量範圍，探討出SEC3的有效劑量範圍及毒性劑量範圍。完成上述發明任務的技術方案是，一種金黃色葡萄球菌腸毒素C3的製備、純化方法，其特徵在於，步驟如下，(1).按照常規方法，打開金黃色葡萄球菌產腸毒素標準菌株FRIS6或FRI1230，其中以FRI1230為首選。(2).把標準菌株分離於瓊脂平板和血平板上，經孵育選取典型菌落；(3).選取典型菌落，接種於復壯培養基中，20°C45°C復壯培養1022小時，進一步分離，分離與瓊脂平板和血平板上；(4).選取步驟(3)分離的典型菌落，接種於種子培養基中，20°C45°C搖瓶進行培養1022小時；(5).把步驟(4)中的菌落按照1.0%10.0%(V/V)接種於20°C45°C生產培養基中，於20°C45°C溫度下，培養2472小時；(6).取步驟(5)培養液，離心除菌，過濾，取上清液，得SEC3原液；(7).取步驟(6)SEC3原液經過離子交換、分子篩等，純化，得高純度SEC3，SEC3純度達85%以上；(8).用注射用水配製pH4.57.5的PBS，加入高純度的SEC3，稀釋，定量，過濾，除菌，配製成SEC3的注射液；在配製注射劑時，根據具體需求，也可以採用其它的輔料配製注射劑或者其他類型供注射的製劑，如注射用凍乾粉，注射用輸液等。配製的注射液用於腫瘤、病毒及免疫性疾病治療使用。(9).用於腫瘤治療的靶向超抗原的製備，單克隆抗體B3是對應於LeY家族中一種糖類抗原的鼠源抗體，這種抗原在許多腫瘤細胞表面都有表達，包括肺癌、胃癌、結腸癌、乳腺癌、卵巢癌及一些表皮癌細胞，由於mAbB3隻與極少部分的正常細胞發生作用，所以是一種理想的腫瘤導向治療的抗體，所以通過小分子基因工程抗體，選擇從步驟(7)得到的SEC3，製備成B3ds-scFv-SEC3融合蛋白，所獲得的B3(ds-scFv)-SEC3重組超抗原具備了導向和殺傷腫瘤細胞的雙重功能，製成的有效腫瘤免疫治療靶向藥物，具有靶向性好，產量高，穩定性好的優點.技術路線首先是通過重疊PCR技術，連接B3抗體的VH和VL片段(參照文獻JungSH，PastanI，LeeB,D)，並將PCR產物克隆至原核表達載體；將SEC3基因片段經酶切連接亞克隆至上述獲得的重組表達載體B3dS-SCFv-pET22b，構建包含B3ds-scFv-SEC3-pET22b片段的重組表達載體；然後經酶切鑑定B3dS-SCFv與SEC3兩片段連接正確後，轉化大腸桿菌，經過不同表達方式進行表達，獲得包涵體，然後將表達的包涵體進行變性、復性、復性產物可以通過陽離子柱SP-Siipharose等純化方法進行初步純化，獲得B3ds-scFv-SEC3融合蛋白。將上述製成的B3ds-scFv_SEC3融合蛋白採用PBS等製成B3ds-scFv_SEC3融合蛋白注射液。在配製注射劑時，根據具體需求，也可以採用其它的輔料配製注射劑或者其他類型供注射的製劑，如注射用凍乾粉，注射用輸液等，也可以通過一定輔型劑製成口服等製劑。另外也可以採用表皮生長因子(EGF)、血管內皮生長因子(VEGF)分別構建成EGF-SEC3、VEGF-SEC3融合蛋白質，用於腫瘤治療的各種給藥途徑的製劑，也可以採用本專利沒有具體描述的其他技術依託於SEC3製成的其他更先進的製劑。(10)口服製劑的配製，可以從步驟(6)得到的SEC3原液直接進行配製，也可以從步驟(7)得到的高純度SEC3進行配製，添加口服劑的各種輔料製成各種類型的單一成分或複方口服製劑，其中液體口服製劑的pH為4.58.0。本發明使用的菌株是中國微生物菌種保藏委員會微生物中心及中國軍事醫學科學院的標準菌株FRI1230或FRIS6。以上所述的培養、除菌、過濾、製備等環節的方法，可以是常規的、已知的金黃色葡萄球菌培養、除菌、過濾、製備等環節的方法。本發明製備成的供臨床使用的製劑可以是採用SEC3直接製成的單、複方注射劑、輸液劑或者臨床需要的其他類型的製劑，製劑過程中的方法可以是常規的、已知製備方法，製劑過程中需要的輔料可以是已知、常用的輔料，也可以是未來開發的新輔料，也可以是依託於SEC3製成的靶向等先進位劑，也可以是SEC3製成的單一或複方口服製劑，如口服液、膠囊、片劑、微丸等。以上方法中所述的復壯培養基(稱為培養基一)；所述的生產培養基(稱為培養基·~-)ο培養基製備(1).培養基一取新鮮的豬心，去除筋膜等附帶組織，洗淨，絞碎豬心，絞碎後，力口0.53.0倍潔淨水，60°C100°C溫化0.53.0小時，過濾，得濾液，加入總重量0.120%蛋白腖，調pH至2.07.0，低溫靜置，後加入0.1%1.0%的活性炭，煮沸，過濾，濾液調pH至5.09.0，靜置，再次活性炭吸附，過濾，調pH至3.09.0，滅菌，得培養基一。(2).培養基二取新鮮的豬心，去除筋膜等附帶組織，洗淨，絞碎豬心，絞碎後，力口一定量的潔淨水，60°C100°C溫化5min180min，冷卻，調pH至5.09.0，加入總體積130%的的胰腺酶，至30°C65°C酶解，1.07.0小時候後，滅活酶活性，過濾，調pH3.09.0，加入一定量活性炭吸附後，過濾，調pH3.09.0，滅菌，得培養基二。完成本申請第二個發明任務的方案是，一種上述金黃色葡萄球菌腸毒素C3的製備、純化方法所得到的金黃色葡萄球菌腸毒素C3在製備抗腫瘤、抗病毒及提高免疫力藥物中的應用，其特徵在於，所述SEC3單、複方經肌肉、血液給藥臨床用量有效劑量範圍是大於3ng/天。所述SEC3靶向、融合等先進的各種類型的製劑(如注射液、注射用凍乾粉、輸液、口服、外用製劑等)給藥臨床用量有效劑量範圍是大於3ng/天。所述的SEC3單、複方製成的口服液、膠囊、片劑、微丸等口服製劑，臨床用量有效劑量範圍是大於SOOng/天。本發明推薦的劑型為單、複方普通注射劑、輸液製劑或靶向、融合等各種類型的製劑，及口服製劑。本發明使用的菌株是中國微生物菌種保藏委員會微生物中心及中國軍事醫學科學院的標準菌株FRI-1230、FRI-S6。本發明主要應用於腫瘤疾病領域，病毒疾病領域，或者需要免疫治療的疾病領域。本發明的製劑可以是SEC3單一成分製劑，也可以是以SEC3為主藥的複方製劑，也可以是依託於SEC3製成的靶向等先進位劑。本研究創新的SEC3血清分型，研究結果表明，SEC3比SEA、SEB、SEC混合液、SEC1、SEC2、SED、SEE等，更加安全，更加有效，更加穩定，更加具有臨床應用意義。綜上所述，本發明的研究，能彌補臨床治療的不足，甚至替代掉目前臨床上經典的免疫激活劑。腫瘤方面聯合放化療，起到增效減毒防止血象異常的作用；預防和治療因放化療引起的白細胞減少或異常；對於手術後腫瘤患者，還能預防腫瘤的復發及轉移；在腫瘤方面還具有直接抑制、清除腫瘤細胞的作用；本發明的研究，還包括腫瘤領域其他未在本文描述的疾病範圍及需要免疫治療的。病毒方面用於病毒性肝病、愛滋病、皰疹、流感等治療，本發明的研究，還包括病毒領域其他未在本文描述的疾病範圍。免疫調節方面用於紅斑狼瘡、銀屑病等免疫性疾病，還包括免疫領域其他未在本文描述的需要免疫治療的疾病。具體實施例方式一、製備下面將通過實施例子對本發明作進一步的描述，這些描述並不是對本
發明內容的進一步限定，也不是本發明唯一的路線，可以是常規的、已知，也可以是本發明第一次使用的方法。相關人員應認識到，對本
發明內容技術特徵所做的等同替換，或者相應的改進等，仍屬於本發明的保護範圍。培養基製備1.培養基一取新鮮的豬心，去除筋膜等附帶組織，洗淨，絞碎豬心，絞碎後，力口0.53.0倍潔淨水，60°C100°C溫化0.53.0小時，過濾，得濾液，加入總重量0.120%蛋白腖，調pH至2.07.0，低溫靜置，後加入0.1%1.0%的活性炭，煮沸，過濾，濾液調pH至5.09.0，靜置，再次活性炭吸附，過濾，調pH至3.09.0，滅菌，得培養基一。2.培養基二取新鮮的豬心，去除筋膜等附帶組織，洗淨，絞碎豬心，絞碎後，加一定量的潔淨水，60°C100°C溫化5min180min，冷卻，調pH至5.09.0，加入總體積130%的胰腺酶，至30°C65°C酶解，1.07.0小時候後，滅活酶活性，過濾，調pH3.09.0，加入一定量活性炭吸附後，過濾，調pH3.09.0，滅菌，得培養基二。以上兩種培養基可以是常規、已知，中間也可以穿插本發明第一次用的方法，但是以上培養基不是本發明唯一培養基。SEC3製備1.按照常規方法，打開金黃色葡萄球菌產腸毒素標準菌株FRI-S6、FRI-1230。2.把標準菌株分離於瓊脂平板和血平板上，經孵育選取典型菌落。3.選取典型菌落，接種於復壯培養基中，20°C45°C復壯培養1022小時，進一步分離，分離與瓊脂平板和血平板上。4.選取「3」分離的典型菌落，接種於種子培養基中，20°C45°C搖瓶進行培養1022小時。5.把「4」中的菌落按照1.0%10.0%(V/V)接種於20°C45°C生產培養基中，於20°C45°C溫度下，培養2472小時。附表三批試驗種子接種量及培養結束時活菌計數tableseeoriginaldocumentpage96.取「5」培養液，離心除菌，過濾，取上清液，得SEC3原液。附表三批試驗濾液中SEC3含量測定tableseeoriginaldocumentpage97.取「6」SEC3原液經過離子交換、分子篩等，純化，得高純度SEC3，SEC3純度達85%以上。8.用注射用水配製pH4.57.5的PBS，加入高純度的SEC3，稀釋，定量，過濾，除菌，配製成SEC3的注射劑，供注射用SEC3每天用量為大於3ng/天。在配製注射劑時，根據具體需求，也可以採用其它的輔料配製注射劑或者其他類型供注射的製劑。通過以上的製備工藝、成型工藝及質量標準生產的SEC3製劑，成為了科技含量高、質量穩定及易於控制的產品，在生產的最後環節，可以根據要求用一定量的丙內酯殺滅殘存菌或汙染菌。附表β-丙內酯對濾液殘留活菌滅菌檢查tableseeoriginaldocumentpage9表4SEC3注射劑在不同溫度下存放的穩定性觀察tableseeoriginaldocumentpage109.取「7」SEC3，首先是通過重疊PCR技術，連接Β3抗體的VH和VL片段(參照文獻JungSH，PastanI，LeeB,D)，並將PCR產物克隆至原核表達載體；將SEC3基因片段經酶切連接亞克隆至上述獲得的重組表達載體B3dS-SCFv-pET22b，構建包含B3ds-scFv-SEC3-pET22b片段的重組表達載體；然後經酶切鑑定B3dS-SCFv與SEC3兩片段連接正確後，轉化大腸桿菌，經過不同表達方式進行表達，獲得包涵體，然後將表達的包涵體進行變性、復性、復性產物可以通過陽離子柱SP-Siipharose等純化方法進行初步純化，獲得B3ds-scFv-SEC3融合蛋白。將上述製成的B3ds-scFv_SEC3融合蛋白採用PBS等製成B3ds-scFv_SEC3融合蛋白注射液。在配製注射劑時，根據具體需求，也可以採用其它的輔料配製注射劑或者其他類型供注射的製劑，如注射用凍乾粉，注射用輸液等，也可以通過一定輔型劑製成口服等製劑。10.另外也可以採用表皮生長因子(EGF)、血管內皮生長因子(VEGF)分別構建成EGF-SEC3、VEGF-SEC3融合蛋白質，用於腫瘤治療的各種給藥途徑的製劑，也可以採用本專利沒有具體描述的其他技術依託於SEC3製成的其他更先進的製劑。11.取「6」或「7」的SEC3，加入輔料，定量，製成口服液。本發明推薦的劑型為SEC3單、複方普通注射劑、輸液製劑；先進的SEC3靶向等製劑(注射、口服、外用)；SEC3單、複方製成的口服液、膠囊、片劑、微丸等口服製劑。二、藥效驗證1.SEC3對免疫調節的研究SEC3對小鼠T細胞增殖作用的影響實驗材料用常規法製備T細胞懸液使細胞濃度為8X106/ml。實驗方法無菌小培養瓶內加200μIT細胞懸液，空白對照組為RPMI1640培養基，另設陽性對照加PHA(終濃度50μg/ml)，給藥組加各濃度藥，每組四瓶，置37°C，5%C02培養70小時候MTT比色法Victor1420MultilabelCounter測0D570mm值，取平均值。實驗結果SEC3有明顯的使T細胞增值作用，明顯優秀與正常對照組和T細胞增殖藥物PHA組，結果見下表。表SEC3對小鼠T細胞增殖試驗tableseeoriginaldocumentpage11SEC3對小鼠NK細胞活性及ConA誘導淋巴細胞轉化能力影響ICR小鼠分別iv.給予本品l、2、4ng/kg體重，可明顯改善及提高模型小鼠的細胞免疫水平，結果見下表。表SEC3對小鼠NK及ConK的影響(χ士sd)tableseeoriginaldocumentpage11『注空白組及治療組與模型組比較，*Ρ<0.05，試驗組與正常組沒有顯著意義。SEC3對模型ICR小鼠體內升白細胞作用的影響實驗材料昆明種小鼠100隻，體重約20g左右，雌雄各半，隨機分為五組，每組雌雄各十隻。實驗方法正常對照組連續五天注射生理鹽水，每日1次，每次0.2ml；環磷醯胺組連續五天腹腔注射環磷醯胺，每日1次，每次0.2ml；SEC3三個劑量組，連續五天腹腔注射SEC3，每日1次，每次0.2ml；第三、四、五天亦注射環磷醯胺，每日1次，每次0.2ml。未次給藥後1小時取小鼠尾靜脈血20μ1記數白細胞數。實驗結果SEC3注射具有明顯的升白作用，可以使模型動物的白細胞升至正常範圍內，結果見下表。表SEC3明顯促進模型小鼠升高白細胞tableseeoriginaldocumentpage122.SEC3抗腫瘤作用的影響SEC3對SMMC7721細胞、D6細胞有明顯的生長抑制作用實驗材料細胞株D6細胞(肺癌)SMMC7721細胞(肝癌)。試劑1640培養液、小牛血清、胰酶、生理鹽水、MTT、DMSO等。實驗方法將生長良好的D6細胞和SMMC7721細胞分別用胰酶消化，製成細胞懸液，計數細胞，調細胞濃度至lX106/ml。將已調好細胞濃度的二株細胞分別加入經無菌處理的96孔細胞培養板內，每孔加180μ1。分別將配好的無菌藥物加入96孔板內，每孔加200μ1藥物，與三種細胞分別混勻。每種細胞株(實驗組)有4個復孔。從實驗當日開始至隨後的7天，每天分別用MTT法測0D570mm值。實驗結果加入SEC3的實驗中，肺癌細胞的生長至第3天就開始受到抑制，並且隨著時間的推移，抑制作用更趨明顯。加入SEC3的實驗中，肝癌細胞的生長至第3天已受到明顯的抑制，並且隨著時間的推移，抑制作用更趨明顯。表明SEC3具有抑制肝癌、肺癌細胞生長的作用。結果見下表。表SEC3對SMMC7721細胞增殖的影響(MTT法0D570mm)tableseeoriginaldocumentpage12表SEC3對D6細胞增殖的影響(MTT法0D570mm)tableseeoriginaldocumentpage12SEC3對小鼠肝癌H22、S180、Lewis肺癌抑制作用研究結果表明，本品對小鼠肝癌H22、S180、Lewis肺癌均有明顯抑制作用，其中高、中劑量均達到40%以上，低劑量有一定的抑瘤作用，並有一定的量效關係，結果見下表。計算公式formulaseeoriginaldocumentpage13表SEC3對小鼠H22腫瘤生長的影響tableseeoriginaldocumentpage13注Ρ值為各組與對照組相比。表SEC3對小鼠S180抑制作用的影響tableseeoriginaldocumentpage13注P值為各組與對照組相比。表SEC3對小鼠Lewis抑制作用的影響tableseeoriginaldocumentpage14注P值為各組與對照組相比。SEC3腹水瘤小鼠生命延長率的影響SEC3能明顯延長小鼠的生命時間，結果見下表。計算公式formulaseeoriginaldocumentpage14表SEC3對荷肝癌(Η22Α型)腹水瘤小鼠生命延長率的影響tableseeoriginaldocumentpage15注Ρ值為各組與對照組相比SEC3有效誘導腫瘤細胞凋亡實驗材料取生良好的細胞SMMC-7721人肝癌細胞株及D6人肺癌細胞株(對數期)，計數細胞，調細胞濃度為lX106/ml。實驗方法與藥物共同孵育一定時間後細胞一胰酶消化，收集細胞一提取DNA-40C12krpm，15min離心一棄上清，沉澱以70%乙醇洗滌一晾乾，加水溶解一取10μIDNA液，2%瓊脂糖凝膠電泳一觀察結果。實驗結果SEC3可導致癌細胞凋亡現象的發生。在瓊脂糖凝膠電泳中可以看到肝癌、肺癌細胞DNA鏈之間有有一定量的斷裂、脫落現象。通過對SEC3的部分藥理研究，表明SEC3無論在直接抑制殺傷腫瘤細胞方面，還是升高白細胞等輔助指標方面，是屬於既能殺滅腫瘤細胞又能增強機體免疫力的雙重療效的新藥，明顯優秀與現有臨床藥物及國內外報導的在研藥物，透出了光明的臨床前景。權利要求一種金黃色葡萄球菌腸毒素C3(StaphylococcalEnterotoxinC3，SEC3)的製備方法、純化方法、製劑及其在製備腫瘤、病毒及調節機體免疫藥物中的應用，其特徵在於採用標準菌株FRI～S6或FRI～1230，其中以FRI～1230為首選，經過改良後的培育基發酵，分離SEC3成分，製成注射劑、口服製劑，製成的製劑用於腫瘤、病毒及調節機體免疫藥物，其指標成分為SEC3。2.權利要求1所述的SEC3製劑，其特徵在於SEC3單、複方普通注射劑、輸液製劑；先進的SEC3靶向等製劑(注射、口服、外用)；SEC3單、複方製成的口服液、膠囊、片劑、微丸等口服製劑。3.如權利要求2所述的SEC3製劑，其特徵在於SEC3單、複方經肌肉、血液給藥的普通製劑臨床用量有效劑量範圍是大於3ng/天；SEC3靶向、融合等技術製成單、複方經肌肉、血液給藥的先進位劑臨床用量有效劑量範圍是大於3ng/天；SEC3單、複方製成的口服液、膠囊、片劑、微丸等口服製劑，臨床用量有效劑量範圍是大於800ng/天。4.如權利要求3所述的SEC3製劑，其特徵在於腫瘤方面聯合放化療，起到增效減毒防止血象異常的作用；預防和治療因放化療引起的白細胞減少或異常；對於手術後腫瘤患者，還能預防腫瘤的復發及轉移；在腫瘤方面還具有直接抑制、清除腫瘤細胞的作用；本發明的研究，還包括腫瘤領域其他未在本文描述的疾病範圍及需要免疫治療的。病毒方面用於病毒性肝病、愛滋病、皰疹、流感等治療，本發明的研究，還包括病毒領域其他未在本文描述的疾病範圍。免疫調節方面用於紅斑狼瘡、銀屑病等免疫性疾病，還包括免疫領域其他未在本文描述的需要免疫治療的疾病。5.權利要求1所述的SEC3成分製備方法，其特徵在於(1).按照常規方法，打開金黃色葡萄球菌產腸毒素標準菌株FRIS6或FRI1230，其中以FRI1230為首選。(2).把標準菌株分離於瓊脂平板和血平板上，經孵育選取典型菌落；(3).選取典型菌落，接種於復壯培養基中，20°C45°C復壯培養1022小時，進一步分離，分離與瓊脂平板和血平板上；(4).選取步驟(3)分離的典型菌落，接種於種子培養基中，20°C45°C搖瓶進行培養1022小時；(5).把步驟⑷中的菌落按照1.0%10.0%(V/V)接種於20°C45°C生產培養基中，於20°C45°C溫度下，培養2472小時；(6).取步驟(5)培養液，離心除菌，過濾，取上清液，得SEC3原液；(7).取步驟(6)SEC3原液經過離子交換、分子篩等，純化，得高純度SEC3，SEC3純度達85%以上。6.如權利要求5所述的SEC3成分製備用的培養基，其特徵在於復壯培養基取新鮮的豬心，去除筋膜等附帶組織，洗淨，絞碎豬心，絞碎後，加0.53.0倍潔淨水，60°C100°C溫化0.53.0小時，過濾，得濾液，加入總重量0.120%蛋白腖，調pH至2.07.0，低溫靜置，後加入0.1%1.0%的活性炭，煮沸，過濾，濾液調pH至5.09.0，靜置，再次活性炭吸附，過濾，調pH至3.09.0，滅菌，得培養基。生產培養基取新鮮的豬心，去除筋膜等附帶組織，洗淨，絞碎豬心，絞碎後，加一定量的潔淨水，60°C100°C溫化5min180min，冷卻，調pH至5.09.0，加入總體積130%的的胰腺酶，至30°C65°C酶解，1.07.0小時候後，滅活酶活性，過濾，調pH3.09.0，加入一定量活性炭吸附後，過濾，調pH3.09.0，滅菌，得培養基。7.如權利要求2所述的SEC3製劑，其製劑特徵在(D.SEC3口服液的製備從權利5中(6)或5中(7)得到的SEC3直接進行配製，添加口服劑的各種輔料製成各種類型的單一成分或複方口服製劑，其中液體口服製劑的pH為4.58.0。(2).SEC3片劑及膠囊的製備從權利5中(6)或5的(7)得到的SEC3，取澱粉等輔料，噴霧制粒，製得的顆粒灌膠囊，即得SEC3膠囊；製得的顆粒，上壓片機，即得SEC3片。(3).SEC3注射劑的製備步驟一、用注射用水配製PH4.57.5的PBS，滅菌；步驟二、取步驟一的PBS，加入從權利5中(7)得到的SEC3；步驟三、取步驟二的混合液，稀釋，定量至每毫升含有SEC35ng、10ng、15ng、20ng等，過濾，除菌，配製成SEC3的注射液；步驟四、或從權利5中(7)得到的SEC3，稀釋，定量至每毫升含有SEC35ng、10ng、15ng、20ng等，過濾，除菌，灌裝，上凍幹機凍幹，製得SEC3凍幹製劑。(4).靶向SEC3的製備步驟一、通過重疊PCR技術，連接B3抗體的VH和VL片段，並將PCR產物克隆至原核表達載體；步驟二、SEC3基因片段經酶切連接亞克隆至上述獲得的重組表達載體B3ds-scFv-pET22b，構建包含B3ds-scFv_SEC3-pET22b片段的重組表達載體；步驟三、經酶切鑑定B3dS-SCFv與SEC3兩片段連接正確後，轉化大腸桿菌，經過不同表達方式進行表達，獲得包涵體；步驟四、將步驟三的包涵體進行變性、復性、復性產物可以通過陽離子柱SP-S印harose等純化方法進行初步純化，獲得B3dS-SCFv-SEC3融合蛋白。步驟五、將步驟四的B3dS-SCFv-SEC3融合蛋白，採用PBS等製成B3dS-SCFv-SEC3融合蛋白注射液或注射用凍乾粉。全文摘要本發明包括金黃色葡萄球菌腸毒素C3製備、製劑、用量及其用途，屬生物工程領域，通過金黃色葡萄球菌的培養、分離及純化，製得金黃色葡萄球菌腸毒素C3(StaphylococcalEnterotoxinC3，SEC3)，將SEC3製成的注射劑及口服液、膠囊、片劑、微丸等口服製劑，或者將SEC3製成融合蛋白，再製成注射製劑，生成的經肌肉、血液給藥製劑臨床用量有效劑量範圍大於3ng/天，生成的經口服給藥製劑臨床用量有效劑量範圍大於800ng/天。發明的SEC3適用於腫瘤、病毒疾病方及免疫缺陷方面的疾病。文檔編號A61P31/12GK101831480SQ20091002572公開日2010年9月15日申請日期2009年3月9日優先權日2009年3月9日發明者不公告發明人申請人:時貞平