預防和治療非典型肺炎的蛋黃抗體組合物及其製備方法

2023-05-24 17:37:21 4

專利名稱：預防和治療非典型肺炎的蛋黃抗體組合物及其製備方法
技術領域：
本發明屬於生物治療技術領域，特別是涉及一種預防和治療非典型肺炎的蛋黃抗體組合物及其製備方法，另外還涉及該蛋黃抗體組合物的用途。
現在，我國科技工作者對於傳染性非典型肺炎的病原體已成功分離和鑑定，通過電鏡形態學、血清學和動物致病性觀察及逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)擴增與部分基因序列分析，對分離的病原體進行鑑定，從形態學和分子生物學的證據均證明其治病病原體為冠狀病毒(Coronaviridae)。2003年4月16日，世界衛生組織(WHO)在各方研究成果的基礎上，正式宣布導致SARS的病原體是一種以前未知的冠狀病毒，並命名為SARS冠狀病毒。SARS冠狀病毒隸屬於巢狀病毒目，冠病毒科，冠狀病毒屬。根據其基因組結構分類，它屬於單鏈正義RNA病毒，自身即可發揮翻譯模板作用，長度在27-31kb。
在本病病變機理中，過強的自身免疫反應是目前認為最有可能解釋SARS病毒引起急性肺損傷的機制。但SARS病毒所具有的結構蛋白和5個全新的未知蛋白進入機體如何成為「超級抗原」，有待於進一步研究。
目前對於SARS還缺乏特效的治療方法，現有的治療手段包括抗病毒治療如利巴韋林及血清療法等；用激素降低免疫系統對肺的損傷；用抗生素治療潛在的細菌感染以及辨證的中西醫結合治療；呼吸機的應用以及應激和急性呼吸窘迫症候群(ARDS)的對症支持治療等。
中國學者畢勝利將廣東省治療非典型肺炎行之有效的經驗歸納為1)支持療法，為病人提供足夠的熱能，如葡萄糖、胺基酸、維生素等，保證病人有足夠的營養和抵抗力；2)謹慎使用抗菌素，因為抗菌素有毒性；3)根據病情進展的實際情況使用激素，在病人有器官破壞傾向的情況下，可以使用激素，以緩解組織器官的破壞；4)臨床要注意保護醫務人員；5)靈活應用呼吸機等應急手段。
在本病的臨床治療過程中，上述藥物常產生嚴重的毒副作用以及過敏反應，並很容易產生耐藥性，給臨床有效治療SARS帶來了一定的困難。
基於上述治療手段所存在的不足，近幾個月來，對SARS治療藥物的研究重點逐漸轉移到生物技術藥物領域。國內外學者的研究重點多集中在針對於SARS冠狀病毒的有效藥物的大規模篩選、多肽藥物、抗體藥物尤其是單克隆抗體藥物以及疫苗的研究領域。
單克隆抗體作為治療劑的研究於近年來已獲得重要進展。單克隆抗體藥物(monoclonalantibody agent)可應用於治療腫瘤、病毒性感染、心血管病以及其它疾患，尤其是用於傳染性疾病的治療，已顯示出良好的應用前景。
抗體藥物一般包括兩大類，一是抗病原體單克隆抗體(簡稱單抗)或多克隆抗體(簡稱多抗)；二是抗病原體單抗或多抗偶聯物，或稱免疫偶聯物(immunoconjugate)。免疫偶聯物分子由單抗或多抗與「彈頭」藥物兩部分構成，故稱為導向藥物，又稱生物飛彈或「魔彈」(magic bullets)，與之相對應的治療方法稱為導向治療。單抗或多抗所針對的靶標通常為病原體表面的特異性抗原或特定的受體。用作「彈頭」的物質主要有三類，即放射性核素、藥物和毒素，其與單抗或多抗連接分別構成放射免疫偶聯物、化學免疫偶聯物和免疫毒素。自80年代以來對抗病原體尤其是抗腫瘤單抗藥物進行了大量研究，特別是自1997年以來，Rituxan、Herceptin在美國相繼獲批准用於臨床腫瘤治療，單抗藥物的研究與開發有了新的發展勢頭，成為生物技術藥物的新熱點(甄永蘇，單克隆抗體藥物治療腫瘤的研究現狀與展望，中國醫學科學院學報，2000，229-12)。
儘管單抗藥物的臨床研究結果已為其應用於治療腫瘤展示出良好的前景，但仍有許多問題需要進一步研究解決(Nguyen DT，Amess JA，Doughty H，et al.IDEC-C2B8 anti-CD20(rituximab)immunotherapy in patiebts with low-grade non-Hodgkin′s lymphoma and lymphoproli ferativedisordersevahuation of response on 48 patients，Eur J Haematol，1999，6276-82)。單抗藥物存在的問題主要涉及免疫學和藥理學兩方面。免疫學方面的問題關鍵是人抗鼠Ig抗體(HAMA)反應，因為多年來用於臨床研究的單抗藥物多數使用小鼠單抗製備，往往導致HAMA反應。此外，病原體在抗原性方面的異質性，病原體的抗原性調變等也能影響單抗藥物的療效。藥理學方面的問題主要是到達病原體的藥量不足。單抗藥物在體內運送過程中受多種因素影響。由於它是異體蛋白，會被網狀內皮系統攝取，有相當數量將積聚於肝、脾和骨髓；再者就是機體對該異體蛋白產生抗體而降低其效力。單抗藥物是大分子物質，通過毛細血管內皮層以及穿透病原體均受到限制。(甄永蘇，單克隆抗體藥物治療腫瘤的研究現狀與展望，中國醫學科學院學報，2000，229-12)。
疾病的免疫治療是利用病原體免疫原進行主動免疫來激發、增強機體對病原體的主動特異性免疫反應。目前所研究的病原體疫苗主要是基因工程疫苗、肽疫苗、核酸疫苗、抗獨特型抗體疫苗。其中a)病原體基因工程疫苗是通過基因重組技術，將目的基因導入受體細胞而製備的疫苗；b)肽疫苗是基於在免疫反應中抗原在胞漿內降解為短肽，最後形成肽-MHC-TCR複合體最終激發細胞毒性T淋巴細胞(CTL)反應；c)核酸疫苗是由編碼能引起保護性免疫反應的抗原基因片段和載體構建而成的，包括DNA疫苗和RNA疫苗，目前研究較多的為DNA疫苗；核酸疫苗能夠同時刺激機體產生體液免疫和細胞免疫，誘導許多亞單位疫苗不能誘導的CTL效應；d)抗獨特型抗體疫苗(Ab2疫苗)是根據抗獨特型抗體具有模擬抗原及免疫調節的雙重作用，同時能克服機體免疫抑制，打破免疫耐受故能代替病原體抗原誘發特異性主動免疫反應(BhattacharyaCM，Mukerjee S，biddle W，et al.Murine monoclonal anti-idiotype antibldy as a potential networdantigen for human carcinoembryonic antigen.J Immumol，1990，1452758.)。
在上述病原體疫苗免疫治療方法中，由於病原體抗原的抗原性強弱不同，且病原體宿主經常處於免疫抑制狀態，難以激發有效的抗病原體反應。儘管抗獨特型抗體的研究已取得許多進展，但事物總是兩方面的。Ab2疫苗應用存在許多困難，因為抗獨特型抗體β(Ab2β)雖能模擬小分子多肽抗原，卻難以精確反映大分子蛋白質抗原的決定簇，尤其是Ab2β單抗。再者由於病原體抗原極其複雜，常發生調變等，製備廣譜的病原體特異性獨特型疫苗難度很大。更重要的是目前使用的Ab2β主要來自鼠雜交瘤細胞，為異種蛋白，能激發人免疫系統產生人抗鼠Ig抗體(HAMA)，發生中和反應並產生毒性免疫複合物，而降低療效，嚴重時可引起血清病反應。
鑑於以上技術方案所存在的諸多問題，為了避免或減少HAMA反應，現通常是使鼠源性單抗人源化或研製完全的人源抗體。單抗人源化主要是通過基因工程技術製備嵌合抗體(chimericantibody)或改形抗體(reshaping antibody)。嵌合抗體是將Fc段置換為人源性，其它部分仍為鼠源性。改形抗體是指除互補決定區(CDR)為鼠源性外，其它部分均為人源性。還可以使偶聯物分子小型化，以提高藥物對病原體的滲透力，研製高效單抗藥物。採取局部注射以提高單抗藥物在病原體部位的濃度。使多種抗體混合應用以彌補單抗的異質性問題。其中鼠源性單抗人源化和研製完全的人源抗體具有較高的技術難度，難於在短時期內普及應用。
禽類尤其是雞在系統發育上與哺乳動物有很大差異，雞的免疫球蛋白與哺乳動物免疫球蛋白在免疫學特性上也有很大不同。雞的免疫系統能識別更多的免疫反應位點和更多的抗原決定簇，因此雞免疫系統對哺乳動物的蛋白或生物分子能產生具有更高效價和親和力的特異性抗體。雞免疫系統針對於外源性蛋白所產生的IgY不僅具有更高的免疫特異性，更重要的是這種特異性IgY主要儲存在雞蛋黃中，因此可利用下蛋母雞作為免疫反應器來大量生產具有重要臨床應用價值的抗體藥物。
眾所周知，雞蛋作為人類的常用食品和化妝品原料，無論內服和外用均對人體無任何生物毒性和不良作用。因此，利用禽類作為免疫反應器來大量生產抗體藥物，並應用於疾病的診斷和免疫治療，將具有極其廣闊的應用前景。以疾病特異性蛋黃抗體IgY為原料製備的免疫藥物和抗獨特型抗體疫苗(Ab2疫苗)可以很好地解決上述單抗偶聯物或上述病原體疫苗所存在的HAMA反應和異質性問題。
授權中國專利申請號93112409.3公開了「一種新型免疫原性複合物製劑及製備方法」，本發明由抗原與抗體組建，抗原量多於抗體量，利用抗原抗體複合物為載體，攜帶抗原，改變抗原提呈形式，增強機體免疫性。本發明採用血源純化B肝表面抗原，很難避免其潛在的感染性。況且該複合物是一種抗原抗體複合物，而不是抗體和抗獨特性抗體複合物。
授權中國專利申請號97106291.9公開了「抗原-抗體-重組DNA複合型疫苗」，本發明由微生物抗原-抗體與帶有編碼微生物的一種或幾種基因的重組質粒DNA製備成複合型疫苗，通過誘生對微生物感染處於免疫應答低下或免疫耐受者產生應答，可顯著提高機體的特異性體液免疫與細胞免疫，具有抗原提呈形式多，誘生免疫應答速度快，而且用量少，穩定性高等特點。本發明採用基因重組B肝表面抗原和抗體，再加入B肝DNA重組質粒。該方法需要基因工程技術，技術工藝周期長，難度大，況且該複合物是一種抗原-抗體-重組DNA複合物，而不是抗體和抗獨特性抗體複合物。
中國專利申請號02113744.7公開了「抗禽類病毒性疫病的複合卵黃抗體及其製備和應用」，是由蛋黃抗腸毒素免疫球蛋白、卵轉鐵蛋白、溶菌酶和餘量的水分、灰分及微量元素組成的蛋白複合物，而不是抗體和抗獨特性抗體複合物。
中國專利申請號00125941.5公開了「蛋黃免疫活性蛋白複合物」，是由具有抗體活性的抗禽流感、新城疫的雞卵黃抗體(抗-ANIgY)組成的抗體複合物，也不是抗體和抗獨特性抗體複合物。
在現有技術中，單克隆抗體藥物和疫苗為兩大類相互獨立的免疫藥物，其中單克隆抗體藥物通常用於免疫治療，疫苗通常用於免疫預防。臨床通常是分別單獨使用，其中疫苗用於未病先預防，而單克隆抗體藥物則主要施用於既病患者，但是，在臨床上很難及時判斷出就診者是未發病還是已發病，當就診者處於觀察期或疾病處於窗口期時，是施用疫苗還是施用抗體藥物就變得非常難把握，在此情況下，假如對未病者施用抗體藥物，不但會造成浪費而且又不能起到預防的目的；如果對已病者施用疫苗，不但達不到預防的目的而又失去了早期治療的機會，因此臨床急需一種能夠實現有病治病未病預防的複合型抗體藥物。另外，對於減毒或滅活病原體疫苗的使用，會給患者帶來潛在感染的隱患，其使用安全性不高。因此研製開發一種既能治病又能防病、安全高效的免疫藥物已成為當今生物技術領域的重大課題。
發明目的本發明目的在於克服上述技術的缺點與不足，提供一種預防和治療非典型肺炎的蛋黃抗體組合物，包括非典型肺炎病原體特異性蛋黃抗體IgY、抗獨特型抗體組合物，以達到既能治病又能防病的目的。該蛋黃抗體組合物用於作為生物治療劑，能有效避免因減毒或滅活病原體疫苗的使用所導致的潛在感染問題，不存在鼠源性單克隆抗體的HAMA反應，無毒副作用和過敏反應，安全性高，靶向性強，且療效全面，適用於作為傳染性非典型肺炎的預防和治療劑及診斷劑。
本發明的另一目的還在於預防和治療非典型肺炎的蛋黃抗體組合物的製備方法。
本發明的另一目的還在於預防和治療非典型肺炎的蛋黃抗體組合物的用途。技術方案本發明的技術方案是這樣實現的一種預防和治療非典型肺炎的蛋黃抗體組合物，其特徵在於；主要是由非典型肺炎病原體特異性蛋黃抗體LgY和蛋黃抗獨特型抗體組成，其中以預防為目的者，非典型肺炎病原體特異性蛋黃抗獨特型抗體的量(w/w)＞蛋黃抗體IgY的量；以治療為目的者，非典型肺炎病原體特異性蛋黃抗體IgY的量(w/w)＞蛋黃抗獨特型抗體的量；以預防性治療或早期治療為目的者，非典型肺炎病原體特異性蛋黃抗體IgY的量(w/w)＝蛋黃抗獨特型抗體的量。
根據本發明，其特徵還在於所述非典型肺炎病原體特異性蛋黃抗體IgY是針對於病原體特異性免疫原的蛋黃抗體IgY；所述非典型肺炎病原體特異性蛋黃抗獨特型抗體是針對於病原體特異性免疫原所對應的特異性抗體包括蛋黃抗體IgY的特異性蛋黃抗獨特型抗體。
根據本發明，其特徵還在於所述蛋黃抗體IgY是針對於純化或重組的非典型肺炎病原體特異性免疫原的抗體。其中所述免疫原包括純化或滅活的非典型肺炎病原體特異性抗原、通過基因工程技術重組的非典型肺炎病原體特異性抗原或疫苗、非典型肺炎病原體DNA或mRNA及其與相應載體組成的重組體中的任一種或其組合；還包括上述非典型肺炎病原體特異性免疫原的納米微粒或脂質體複合物；根據本發明，其特徵還在於所述非典型肺炎病原體特異性蛋黃抗獨特型抗體是針對於非典型肺炎病原體特異性抗原的單克隆或多克隆抗體包括蛋黃抗體IgY的抗獨特型抗體α(Ab2α)、抗獨特型抗體β(Ab2β)、抗獨特型抗體γ(Ab2γ)和抗獨特型抗體ε(Ab2ε)中的任一種或其組合。
所述抗獨特型抗體是針對於外來抗原的抗體分子(Ab1)可變區上獨特型(Id)可刺激機體產生相應的抗Id抗體(Ab2)。其中Ab2α屬半抗原非抑制性Ab2，具有調節作用，可促進或抑制Ab1克隆；Ab2β具有與外來抗原相似的胺基酸排列順序或空間構型，它能夠在體內模擬始動抗原的作用，故被認為是外部抗原在機體免疫系統中的「內影像」(internal image)，可抑制Ab1與相應抗原的結合反應；Ab2γ屬半抗原非抑制性Ab2，能抑制抗原與Ab1的結合，具有調節作用，可促進或抑制帶有相應Id克隆細胞增殖；Ab2ε又稱Epibody，是一種雙特異性抗體，能識別Ab1骨架區上的抗原決定簇，同時又能識別自身或外來抗原上的表位，更有利於非典型肺炎的免疫治療。
根據本發明，其特徵還在於所述非典型肺炎病原體相應免疫原包括SARS冠狀病毒、腺病毒、肺炎支原體、肺炎衣原體特異性的純化或重組抗原、組織細胞和細胞因子及其受體；所述免疫原是蛋白質、多肽、粘多糖、脂多糖、糖蛋白、細胞核、細胞質、細胞膜、細胞表面受體、核蛋白、DNA、RNA、線粒體、微粒體中的任一種或其組合。
根據本發明，其特徵還在於所述預防和治療非典型肺炎的蛋黃抗體組合物包括SARS冠狀病毒蛋黃抗體組合物、腺病毒蛋黃抗體組合物、肺炎支原體蛋黃抗體組合物、肺炎衣原體蛋黃抗體組合物中的任一種或其組合。
根據本發明，其特徵還在於在上述蛋黃抗體組合物中還含有特異性蛋黃抗體IgY和蛋黃抗獨特型抗體特異性結合所形成的免疫複合物；所述免疫複合物包括IgY-Ab2α、IgY-Ab2β、IgY-Ab2γ和IgY-Ab2ε複合物中的任一種或其組合。
具有內影像特點的抗獨特型抗體能模擬病原體相關抗原誘導機體產生主動免疫應答，其應答過程極其複雜，但主要涉及體液免疫和細胞免疫兩方面。Ab2β作為胸腺依賴抗原(TD)激活輔助T淋巴細胞亞群(Th1和Th2)，分泌一系列細胞因子，如Th1細胞產生幹擾素-γ(INF-γ)、IL-10、TNF和白細胞介素-2(IL-2)；Th2細胞產生IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等。Th2細胞產生的細胞因子影響和促進B淋巴細胞分化和增殖，產生特異性抗體Ab3，Ab3一部分能與Ab1互相模擬，即具有與抗原結合性，稱之為抗病原體抗體(Ab1′)。總Ab3的產生已被證實與微小病原體病灶消退和/或病人病情好轉呈正相關。被激活的Th1細胞釋放細胞因子，如INF-γ可通過影響NK細胞及T細胞功能而發揮抗病原體效應，IL-2可促進T細胞生長、克隆性擴增而增強機體的免疫功能，亦可誘導或促進多種細胞毒性細胞活性，如自然殺傷細胞(NK)、細胞毒性T淋巴細胞(CTL)、淋巴因子激活的殺傷細胞(LAK)及腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)等，發揮免疫監視及抗病原體效應。同時IL-2還可協同刺激B細胞增殖及分泌抗體，與補體及效應細胞相作用，發揮抗體依賴性細胞毒作用(ADCC)及補體依賴性細胞毒性(CDC)抗病原體作用(龔非力等，醫學免疫學，第二版，武漢科學出版社，2000)。人體內免疫系統是一個處於自身動態平衡中的系統。在傳染病患者體內的免疫系統中，抗獨特型抗體是一個較關鍵的系統要素，用人為的方法改變抗獨特型抗體的質量和數量，必然會使系統發生變化，再在更高的層次上達到新的平衡。使對病原體免疫的系統平衡按照理論上預測的有利於患者的方向發展變化，在某種意義上這正是抗獨特型抗體應用的關鍵所在。
根據本發明，其特徵還在於在上述蛋黃抗體組合物中還含有藥用輔料；所述藥用輔料包括包衣材料、蛋白穩定劑、藥用佐劑、免疫增強劑，其中包衣材料為丙烯酸樹脂、羥丙基甲基纖維素及其衍生物中的任一種；蛋白穩定劑為聚乙二醇、蔗糖、海藻糖中的任一種；藥用佐劑為氫氧化鋁、表面活性劑、福氏(Freund)佐劑中的任一種；免疫增強劑為多聚糖、糖肽、糖脂、脂類和磷脂，其中脂類包括三棕櫚醯絲氨醯甘油基半胱氨酸(P3CSS)、單棕櫚脂酸、雙棕櫚脂酸、三棕櫚脂酸、棕櫚醯賴氨酸、α-氨基十六烷酸(含線性飽和脂性側鏈)、月桂醯肽脂中的任一種；上述脂類是以分子內佐劑的形式與所述蛋黃抗體組合物中的特異性蛋黃抗體IgY或蛋黃抗獨特型抗體結合成複合物。
根據本發明，其特徵還在於在上述蛋黃抗體組合物中還含有免疫偶聯物；所述免疫偶聯物包括上述非典型肺炎病原體特異性蛋黃抗體IgY與放射性核素、藥物和毒素以及細胞因子的偶聯物中的任一種或其組合；其中所述放射性核素包括碘131I、磷32P、鍶89Sr、釔90y、釤153Sm、錸188Re中的任一種或其組合；所述藥物包括抗病毒藥物、抗菌素、免疫調節藥物、免疫抑制劑中的任一種或其組合；所述毒素包括包括篦麻籽毒素(RT)、相思子毒素(abrin)、苦瓜毒素(MD)、氧化苦參鹼(OXY)、去甲斑蝥素、白喉毒素(DT)、假單胞菌內毒素以及綠膿桿菌外毒素(PE)中的任一種或其組合；所述細胞因子包括白細胞介素、集落刺激因子(CSF)、腫瘤壞死因子(TNF)、趨化因子中的任一種或其組合；從而使所述蛋黃抗體組合物具有導向或靶向作用。
根據本發明，其特徵還在於所述的蛋黃抗體組合物是其納米微粒或脂質體複合物。
根據本發明，其特徵還在於所述蛋黃抗體組合物是任一種藥劑學上所述的劑型；所述劑型包括注射劑、膠囊、口服液、噴霧劑、貼劑中的任一種劑型。
一種預防和治療非典型肺炎的蛋黃抗體組合物的製備方法，其特徵在於包括以下步驟1)採用蛋白質鹽析、柱層析純化非典型肺炎病原體特異性抗原或通過基因重組的辦法製備非典型肺炎病原體特異性抗原；所述非典型肺炎病原體特異性抗原包括SARS冠狀病毒、腺病毒、肺炎支原體、肺炎衣原體的純化或重組特異性抗原；2)通過免疫動物製備針對於上述非典型肺炎病原體抗原的單克隆或多克隆抗體；或通過基因重組的辦法製備非典型肺炎病原體特異性抗體；3)以步驟1)製備的非典型肺炎病原體特異性抗原為免疫原，多次重複免疫注射給禽類優選是雞，待5-20天後禽類尤其是雞的產蛋中即含有針對於上述非典型肺炎病原體特異性免疫原的蛋黃抗體IgY；所述的免疫原注射量為1-2ml，免疫原量10-500μg/ml+等量不完全福氏佐劑；4)禽蛋尤其是雞蛋去殼取黃，經滅菌處理後，依次進行a)用5倍體積的0.1mol/L PH7.2磷酸鹽-海藻糖稀釋液稀釋蛋黃；b)自-20℃到室溫反覆凍融，每分鐘500-1000轉低速離心後合併上清液備用c)向上清液中加入辛酸至終濃度為1.5％，沉澱後取上清液備用；d)向上清液中加入硫酸鈉至終濃度為36％，取沉澱備用；e)取沉澱通過浸提、萃取、濃縮、純化、冷凍或噴霧乾燥，即得到針對於非典型肺炎病原體的蛋黃抗體組合物組分之一蛋黃抗體IgY；所述非典型肺炎病原體特異性蛋黃抗體IgY可進一步偶聯放射性核素、藥物、毒素和細胞因子中的任一種而製備成蛋黃抗體IgY偶聯物；5)取步驟2)製備的針對於上述抗原的抗體或步驟3)製備的蛋黃抗體IgY為免疫原，多次重複免疫注射給禽類優選是雞，待5-20天後禽類尤其是雞的產蛋中即含有針對於上述相應抗體包括蛋黃抗體IgY的蛋黃抗獨特型抗體；所述的免疫原抗體Ab1的注射量為1-2ml，免疫原抗體Ab1的用量為10-2000μg/ml+等量不完全福氏佐劑；
6)重複步驟4)的過程，即得到針對於非典型肺炎病原體免疫原相應抗體的蛋黃抗體組合物組分之一蛋黃抗獨特型抗體；7)根據實際需要按重量配比調製步驟4)所得的蛋黃抗體IgY和步驟6)所得的蛋黃抗獨特型抗體，再輔以可接受量的藥用輔料即得到所述的蛋黃抗體組合物；所述的蛋黃抗體組合物可製備成納米微粒或脂質體複合物以利於吸收；8)取步驟7)製備的蛋黃抗體組合物經過無菌、安全及毒性試驗合格後，再通過相應的製劑工藝製備成藥劑學上相應的劑型；所述劑型包括注射劑、膠囊、口服液、噴霧劑、貼劑中的任一種劑型。
根據本發明的製備方法，其特徵還在於包括以下步驟1)分別取純化或重組的非典型肺炎病原體特異性抗原和已製備好的針對於上述抗原的抗體包括蛋黃抗體IgY作為免疫原，分別連續或同時多次重複免疫注射給禽類優選是雞；還可將純化或重組的非典型肺炎病原體特異性抗原同已製備好針對於上述抗原的抗體包括蛋黃抗體IgY按1∶1比例混合後作為免疫原進行免疫注射；待5-20天後禽類尤其是雞的產蛋中即同時含有針對於上述抗原的蛋黃抗體IgY和針對於上述抗體包括蛋黃抗體IgY的特異性蛋黃抗獨特型抗體；2)取上一步驟所得的禽蛋或雞蛋，經滅菌處理後，依次進行a)用5倍體積的0.1mol/L PH7.2磷酸鹽-海藻糖稀釋液稀釋蛋黃；b)自-20℃到室溫反覆凍融，每分鐘500-1000轉低速離心後合併上清液備用；c)向上清液中加入辛酸至終濃度為1.5％，沉澱後取上清液備用；d)向上清液中加入硫酸鈉至終濃度為36％，取沉澱備用；e)取沉澱通過浸提、萃取、濃縮、純化、冷凍或噴霧乾燥；一次性提取純化，即可同時得到蛋黃抗體IgY和蛋黃抗獨特型抗體兩種組合物組分；所述的蛋黃抗體組合物可製備成納米微粒或脂質體複合物以利於吸收；3)然後檢測其中各組分的含量，再輔以可接受量的藥用輔料，並經過無菌、安全及毒性試驗合格後，再根據實際需要，通過相應的製劑工藝製備成藥劑學上相應的劑型；所述劑型包括注射劑、膠囊、口服液、噴霧劑、貼劑中的任一種劑型。
根據本發明，預防和治療非典型肺炎的蛋黃抗體組合物的用途，其特徵在於所述蛋黃抗體組合物用於作為非典型肺炎的預防和治療劑以及食品、保健品添加劑，尤其是用於作為因SARS冠狀病毒、腺病毒、肺炎支原體、肺炎衣原體感染所致的傳染性非典型肺炎的預防和治療劑以及食品、保健品添加劑和診斷劑。技術效果本發明將蛋黃抗體IgY和蛋黃抗獨特型抗體有機巧妙地結合在一起，既適用於治療又適用於預防傳染性非典型肺炎，兼具治病和防病於一身，不但避免了單克隆抗體藥物和疫苗之功能單一的缺點，而且有效地解決了鼠源性單抗所產生的HAMA反應問題，無毒副作用和過敏反應，安全性高，靶向性強，且療效全面。更重要的是由於本發明中的特異性蛋黃抗體IgY和蛋黃抗獨特型抗體免疫複合物的形成，使其所攜帶的蛋黃抗體IgY的中和或消除靶向抗原的功能同其所攜帶的蛋黃抗獨特型抗體的調節、抑制、模擬「內影像」及雙特異性抗體等功能相得益彰、相互促進、相互協調、相互增強，協同作用以達到預防和治療傳染性非典型肺炎的雙向目的。
本發明就是採用上述方法所製備的非典型肺炎病原體特異性蛋黃抗體IgY和蛋黃抗獨特型抗體組合物，作為非典型肺炎特異性治療劑而用於傳染性非典型肺炎的特異性免疫預防和治療。該蛋黃抗體組合物能夠激活特定的淋巴細胞(B細胞和/或T細胞)反應，產生相應的抗非典型肺炎病原體作用，並對將來的非典型肺炎病原體產生記憶反應，激活機體免疫系統甚至重新調節機體免疫的系統平衡，調動體液免疫和細胞免疫作用，產生特異性對抗非典型肺炎病原體的抗體或殺傷性淋巴細胞，來共同殺滅非典型肺炎病原體，以達到預防和治療非典型肺炎的目的。
本發明通過檢測試驗和動物實驗，取得了意想不到的效果，其實驗結果(見實驗例)表明，本發明具有下列優點1、本發明服用、攜帶、運輸方便，適用於男女、老幼患者使用。
2、本發明療效確切、無毒副作用和過敏反應，適用於傳染性非典型肺炎的預防和治療劑以及食品、保健品添加劑。
3、本發明可替代和補充昂貴的抗病毒、抗細菌以及免疫抑制藥物，能有效避免上述藥物的耐藥性及毒副作用。
4、本發明製備原料包括免疫原、禽類及其蛋黃、飼料、純化設備及其所用化學原料來源廣泛易得，經濟實用。
5、本發明製備工藝成熟，純度高且質量可靠，容易實施。
6、本發明防治功能齊全，防病與治病集於一身，克服了單抗藥物和疫苗的各自的弱點。
7、本發明有效避免了鼠源性單抗的HAMA反應問題。
8、本發明具有較好的導向性或靶向性。
9、本發明各組分間協同作用，相互促進、相互增強、相互協調，能有效防治因SARS冠狀病毒感染所致的傳染性非典型肺炎，且療效全面，應用面廣。
10、本發明中的蛋黃抗體IgY和蛋黃抗獨特型抗體免疫複合物更有利於抗獨特型抗體模擬「內影像」抗原性的提呈，並且上述免疫複合物比單純抗獨特型抗體可誘生更高滴度的抗體產生和淋巴細胞增殖反應，從而更有效地誘生體液和細胞免疫反應。
下面就結合實施例與實驗例對本發明作進一步的描述，但這些實施例與實驗例並不限制本發明。
實施例1非典型肺炎病原體蛋黃抗體IgY的製備(以SARS冠狀病毒免疫原為例)1)用具有免疫活性的血源純化SARS冠狀病毒抗原或基因重組SARS冠狀病毒抗原或SARS冠狀病毒疫苗作為免疫原，其中血源純化SARS冠狀病毒抗原和基因重組SARS冠狀病毒抗原均由北京華大吉比愛生物技術有限公司提供；2)取6月齡SPF純系萊航產蛋母雞於標準II級清潔級動物房飼養，每隻雞於胸腹部多點注射上述SARS冠狀病毒免疫原1ml(免疫原量100μm/ml+等量不完全福氏佐劑)，待3周後加強免疫注射2次，待15天後免疫母雞所產的雞蛋中即含有針對於上述SARS冠狀病毒免疫原的蛋黃抗體IgY；3)取步驟2)獲得的雞蛋10個去蛋清後的蛋黃液125ml充分攪拌均勻後，加入蛋黃勻漿液5倍體積的0.1mol/L PH7.2磷酸鹽-海藻糖稀釋液，然後置於冰盒(-20℃)冰凍1小時，取出於室溫復融並低速離心(1000r/min)後瀝出收集上清液，再向沉澱物中加入2倍體積的0.1mol/LPH7.2磷酸鹽-海藻糖稀釋液，充分混勻溶解沉澱物，依上法再次凍融收集上清液，如此反覆凍融3次，合併收集各次得到的上清液，加入辛酸至終濃度為1.5％，沉澱後取上清液備用；4)取步驟3)製備的上清液，加入硫酸鈉至終濃度為36％，取沉澱物通過浸提、萃取、濃縮、純化、冷凍或噴霧乾燥，即得到本發明蛋黃抗體組合物組分之一蛋黃抗體IgY，共得到IgY2.1g，其收率為85％。該蛋黃抗體IgY是針對於上述SARS冠狀病毒免疫原的。
實施例2非典型肺炎病原體蛋黃抗獨特型抗體的製備(以SARS冠狀病毒抗體特異性蛋黃抗獨特型抗體為例)1)用具有免疫活性的血源純化SARS冠狀病毒抗體或基因重組SARS冠狀病毒抗體或上述實施例1中所製備的SARS冠狀病毒抗原特異性蛋黃抗體IgY為免疫原；2)取6月齡SPF純系萊航產蛋母雞於標準II級清潔級動物房飼養，每隻雞於胸腹部多點注射上述SARS冠狀病毒抗體免疫原1ml(上述免疫原的用量為500μg+等量不完全福氏佐劑)，待3周後加強免疫注射2次，待15天後免疫母雞所產的雞蛋中即含有針對於上述SARS冠狀病毒抗體免疫原的蛋黃抗獨特性抗體；3)取步驟2)獲得的雞蛋10個去蛋清後的蛋黃液138ml充分攪拌均勻後，加入蛋黃勻漿液5倍體積的0.1mol/L PH7.2磷酸鹽-海藻糖稀釋液，然後置於冰盒(-20℃)冰凍1小時，取出於室溫復融並低速離心(1000r/min)後瀝出收集上清液，再向沉澱物中加入2倍體積的0.1mol/LPH7.2磷酸鹽-海藻糖稀釋液，充分混勻溶解沉澱物，依上法再次凍融收集上清液，如此反覆凍融3次，合併收集各次得到的上清液，加入辛酸至終濃度為1.5％，沉澱後取上清液備用；4)取步驟3)製備的上清液，加入硫酸鈉至終濃度為36％，取沉澱物通過浸提、萃取、濃縮、純化、冷凍或噴霧乾燥，即得到本發明蛋黃抗體組合物組分之一蛋黃抗獨特型抗體，共得到IgY2.35g，其收率為82％。該蛋黃抗獨特型抗體是針對於上述SARS冠狀病毒抗體或SARS冠狀病毒特異性蛋黃抗體IgY為免疫原的。
實施例3非典型肺炎病原體蛋黃抗體IgY和蛋黃抗獨特型抗體組合物的製備(以SARS冠狀病毒蛋黃抗體IgY和蛋黃抗獨特型抗體組合物為例)1)分別取上述實施例1中的SARS冠狀病毒抗原免疫原和上述實施例2中的SARS冠狀病毒抗體包括蛋黃抗體IgY免疫原等量混合之，成為SARS冠狀病毒抗原和SARS冠狀病毒抗體包括蛋黃抗體IgY的混合免疫原；2)取6月齡SPF純系萊航產蛋母雞於標準H級清潔級動物房飼養，每隻雞於胸腹部多點注射上述SARS冠狀病毒混合免疫原1ml(上述免疫原的用量為1000μg+等量不完全福氏佐劑)，待3周後加強免疫注射2次，待15天後免疫母雞所產的雞蛋中即含有針對於上述SARS冠狀病毒混合免疫原的蛋黃抗體IgY和蛋黃抗獨特性抗體；3)取步驟2)獲得的雞蛋10個去蛋清後的蛋黃液150ml充分攪拌均勻後，加入蛋黃勻漿液5倍體積的0.1mol/L PH7.2磷酸鹽-海藻糖稀釋液，然後置於冰盒(-20℃)冰凍1小時，取出於室溫復融並低速離心(1000r/min)後瀝出收集上清液，再向沉澱物中加入2倍體積的0.1mol/LPH7.2磷酸鹽-海藻糖稀釋液，充分混勻溶解沉澱物，依上法再次凍融收集上清液，如此反覆凍融3次，合併收集各次得到的上清液，加入辛酸至終濃度為1.5％，沉澱後取上清液備用；4)取步驟3)製備的上清液，加入硫酸鈉至終濃度為36％，取沉澱物通過浸提、萃取、濃縮、純化、冷凍或噴霧乾燥，即得到本發明蛋黃抗體組合物的主要組分即蛋黃抗體IgY和蛋黃抗獨特型抗體的混合物，共得到IgY2.5g，其收率為80％。該蛋黃抗體混合物是針對於上述SARS冠狀病毒抗原和SARS冠狀病毒抗體包括SARS冠狀病毒特異性蛋黃抗體IgY為免疫原的。
實施例4非典型肺炎病原體蛋黃抗體組合物的製備(以SARS冠狀病毒特異性蛋黃抗體組合物為例)取上述實施例1製備的SARS冠狀病毒抗原特異性蛋黃抗體IgY100mg和上述實施例2製備的SARS冠狀病毒抗體特異性蛋黃抗獨特型抗體100mg，將二者等量混合，然後加入氫氧化鋁佐劑200mg，充分混勻，再經過巴氏滅菌和除熱源處理後即為SARS冠狀病毒特異性蛋黃抗體組合物。
實施例5SARS冠狀病毒特異性蛋黃抗體IgY與氧化苦參鹼的偶聯試驗首先取葡聚糖10g，加入200mL蒸餾水後加高碘酸鈉3g，室溫下避光反應過夜，使葡聚糖充分氧化為多醛基葡聚糖，蒸餾水充分透析後凍幹；注射治療前2小時內取多醛基葡聚糖100mg加入0.15mol/L(pH7.2)的磷酸緩衝液20mL中，加氧化苦參鹼100mg，室溫下反應24小時後，再加入已純化的SARS冠狀病毒特異性蛋黃抗體IgY100mg，4℃攪拌反應24小時；然後在上述反應混合物中加硼氫化鈉2mg，在4℃下還原2小時，離心後經Sephadex G-150層析柱過柱，收集第一峰即可應用。
實施例6SARS冠狀病毒特異性蛋黃抗體組合物的製備取上述實施例5製備的SARS冠狀病毒抗原特異性蛋黃抗體IgY與氧化苦參鹼的偶聯物50mg和上述實施例2製備的SARS冠狀病毒抗體特異性蛋黃抗獨特型抗體50mg，將二者等量混合，然後加入分子內佐劑棕櫚醯賴氨酸100mg，充分混勻，待反應完全後再經過巴氏滅菌和除熱源處理後即成為極易穿透細胞脂質膜且具有靶向抗病毒作用的SARS冠狀病毒特異性蛋黃抗體組合物。該蛋黃抗體組合物不僅具有上述實施例5所製備的蛋黃抗體組合物所具備的免疫協調和治療作用，而且具有針對於SARS冠狀病毒的生物飛彈功能，因此對於SARS冠狀病毒具有更強的特異性殺傷能力。
實施例7SARS冠狀病毒特異性蛋黃抗體組合物注射劑的製備取上述實施例5製備的SARS冠狀病毒抗原特異性蛋黃抗體IgY與氧化苦參鹼的偶聯物50mg和上述實施例2製備的SARS冠狀病毒抗體特異性蛋黃抗獨特型抗體50mg，將二者等量混合，然後加入分子內佐劑棕櫚醯賴氨酸100mg，再加入藥用敷料海藻糖2.0g，充分混勻，待反應完全後再經過巴氏滅菌和除熱源處理後，冷凍或乾燥處理後裝安陪、封口即成為注射劑。
實施例8SARS冠狀病毒特異性蛋黃抗體組合物膠囊的製備取上述實施例5製備的SARS冠狀病毒抗原特異性蛋黃抗體IgY與氧化苦參鹼的偶聯物50mg和上述實施例2製備的SARS冠狀病毒抗體特異性蛋黃抗獨特型抗體50mg，將二者等量混合，然後加入分子內佐劑棕櫚醯賴氨酸100mg，再加入藥用敷料蔗糖100g、大豆磷脂100g，充分混勻，待反應完全後再經過巴氏滅菌和除熱源處理後，裝入空心膠囊即成為用於口服的膠囊。
實施例9SARS冠狀病毒特異性蛋黃抗體組合物口服液的製備取上述實施例5製備的SARS冠狀病毒抗原特異性蛋黃抗體IgY與氧化苦參鹼的偶聯物50mg和上述實施例2製備的SARS冠狀病毒抗體特異性蛋黃抗獨特型抗體50mg，將二者等量混合，然後加入分子內佐劑棕櫚醯賴氨酸100mg，再加入藥用敷料蔗糖100g，補足重蒸餾水至2.0ml，充分混勻，待反應完全後再經過巴氏滅菌和除熱源處理後，裝入口服液瓶並無菌封口即成為口服液。
實施例10SARS冠狀病毒特異性蛋黃抗體組合物氣霧劑的製備取上述實施例5製備的SARS冠狀病毒抗原特異性蛋黃抗體IgY與氧化苦參鹼的偶聯物50mg和上述實施例2製備的SARS冠狀病毒抗體特異性蛋黃抗獨特型抗體50mg，將二者等量混合，然後加入分子內佐劑棕櫚醯賴氨酸100mg，再加入藥用敷料氣霧劑溶劑，待反應完全後再經過巴氏滅菌和除熱源處理後，打壓裝帶噴嘴耐壓氣霧劑瓶中即成為氣霧劑。
實施例11SARS冠狀病毒特異性蛋黃抗體組合物貼劑的製備取上述實施例5製備的SARS冠狀病毒抗原特異性蛋黃抗體IgY與氧化苦參鹼的偶聯物50mg和上述實施例2製備的SARS冠狀病毒抗體特異性蛋黃抗獨特型抗體50mg，將二者等量混合，然後加入分子內佐劑棕櫚醯賴氨酸100mg，再加入適量的藥用敷料羥丙基甲基纖維素，充分混勻，待反應完全後再經過巴氏滅菌和除熱源處理後，塗布於貼劑基質載體表面即成為貼劑。
實驗例實驗例1-8均在生物安全三級實驗室(P3實驗室)內進行。
實驗例1非典型肺炎病原體蛋黃抗體IgY和蛋黃抗獨特型抗體的效價檢測與鑑定(以SARS冠狀病毒蛋黃抗體IgY和蛋黃抗獨特型抗體組合物為例)一、方法原理SARS冠狀病毒抗原特異性蛋黃抗體IgY的檢測採用ELISA間接法檢測，即以SARS冠狀病毒抗原液包被酶標板孔，採用辣根過氧化物酶標記的鼠抗雞IgY抗體作為二抗；SARS冠狀病毒抗體特異性蛋黃抗獨特型抗體的檢測採用ELISA間接法，即以SARS冠狀病毒抗原特異性蛋黃抗體IgY包被酶標板孔，採用辣根過氧化物酶標記的鼠抗雞IgY抗體作為二抗。
二、試劑材料1)包被緩衝液(PH9.6碳酸鹽緩衝液)取Na2CO30.16g和NaHCO30.29g，蒸餾水加至100ml；2)稀釋液(PH7.2磷酸鹽緩衝液)取Na2HPO4·12H2O 2.9g、KH2PO40.2g、NaCL 8.0g和KCL 0.2g蒸餾水加至1000ml；3)封閉液取上述稀釋液500ml加入牛血清白蛋白2.5g和Tween-20 0.25ml即可；4)洗滌液取上述稀釋液200ml加入表面活性劑Tween-20 0.1ml即可；5)底物緩衝液(0.1mol/L PH5.0磷酸鹽-檸檬酸緩衝液)取Na2HPO4·12H2O 1.8g和檸檬酸0.52g，蒸餾水加至100ml，4℃存放，用前加H2O2；6)終止液(2.0mol/LH2SO4)取濃硫酸55.5ml加蒸餾水444.5ml即可；7)包被材料重組SARS冠狀病毒抗原和SARS冠狀病毒IgG抗體均由北京華大吉比愛生物技術有限公司提供；鼠抗雞IgY由北京成文免疫化學研究所提供，其中辣根過氧化物酶標記鼠抗雞IgY自行按照過碘酸鈉法標記。
8)酶標反應底物用四甲基聯苯胺(TMB)。
三、試驗設備酶聯免疫檢測儀(國產Biocell2010型)、37℃水浴箱、48孔或96孔聚苯乙烯酶標板、微量移液器(50μl、100μ1)四、間接法ELISA檢測操作步驟1)取包被材料重組SARS冠狀病毒抗原或SARS冠狀病毒IgG抗體，用包被液稀釋成100μg/ml，取100μl/孔量分別加入聚苯乙烯酶標板孔中，於4℃吸附過夜；2)取上述已包被過夜的酶標板，用洗滌液洗3次，每次3分鐘；然後每孔加入200μl封閉液，於4℃封閉過夜；再用洗滌液洗3次，每次3分鐘；待幹後備用(如暫時不用置4℃存放)；3)分別取上述實施例1、實施例2和實施例3所製備的SARS冠狀病毒特異性蛋黃抗體IgY、蛋黃抗獨特型抗體、蛋黃抗體IgY和蛋黃抗獨特型抗體的混合物，分別進行1∶100至1∶20000的比例稀釋，取各種不同的稀釋樣品分別加入各自相應的檢測酶標板孔中，每孔100μl，同時設立陰性和陽性對照孔；4)於37℃孵育反應1小時後用洗滌液洗4次，每次5分鐘；5)每孔加入100μl辣根過氧化物酶標記的鼠抗雞IgY抗體(二抗)，37℃孵育反應1小時後用洗滌液洗5次，每次3分鐘；6)配製底物溶液用前取0.1mol/L PH5.0磷酸鹽-檸檬酸緩衝液7.0ml，加入3％H2O290μl和10mg/ml的四甲基聯苯胺(TMB)溶液0.1ml，混勻避光備用；7)加入新配製的底物溶液100μl/孔，保溫15分鐘，然後加入終止液(2.0mol/LH2SO4)50μl/孔以終止反應；8)將酶標板放入酶聯免疫檢測儀中，波長450nm，以空白對照調零，讀取各孔吸光度(OD)值；9)結果計算按照公式P/N≥2.1為陽性，否則P/N≤2.1為陰性，其中P為待測標本OD值，N為陰性對照OD值。
五、結果判斷以P/N≥2.1為陽性的最大稀釋度作為其效價。
六檢測結果按照上述間接法ELISA檢測操作對實施例1、實施例2和實施例3所製備的SARS冠狀病毒特異性蛋黃抗體IgY、蛋黃抗獨特型抗體、蛋黃抗體IgY和蛋黃抗獨特型抗體的混合物的效價進行測定，其檢測結果見表1。
表1蛋黃抗體IgY和蛋黃抗獨特型抗體效價檢測結果

實驗結果表明SARS冠狀病毒抗原特異性蛋黃抗體IgY的效價為1∶12000；SARS冠狀病毒抗體特異性蛋黃抗獨特型抗體的效價為1∶8000；SARS冠狀病毒特異性蛋黃抗體混合物中的蛋黃抗體IgY的效價為1∶6000；SARS冠狀病毒特異性蛋黃抗體混合物中的蛋黃抗獨特型抗體的效價為1∶4000。
實驗例2蛋黃抗體IgY和蛋黃抗獨特型抗體的鑑定(以SARS冠狀病毒蛋黃抗體IgY和蛋黃抗獨特型抗體組合物為例)用聚丙烯醯胺凝膠(PADE)電泳(濃縮膠濃度為5％)對SARS冠狀病毒抗原特異性蛋黃抗體IgY和SARS冠狀病毒抗體特異性蛋黃抗獨特型抗體進行純度鑑定，電泳中均出現一條電泳帶，其純度均為95％。
用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠(SDS-PADE)電泳，分離膠長度為8％，濃縮膠濃度為5％，穩流10mA電泳5小時；測得SARS冠狀病毒抗原特異性蛋黃抗體IgY和SARS冠狀病毒抗體特異性蛋黃抗獨特型抗體的分子量均為180KD。
實驗例3蛋黃抗體組合物的穩定性試驗(以SARS冠狀病毒特異性蛋黃抗體組合物為例)取上述實施例4和實施例6製備的SARS冠狀病毒特異性蛋黃抗體組合物，以10mg/管分裝小試管中，分別於-20℃冰凍、4℃、室溫和37℃保存，其中37℃保存屬於熱破壞性試驗。再定期進行其效價檢測。實驗結果表明SARS冠狀病毒特異性蛋黃抗體組合物於4℃保存，其穩定性至少可保持18個月以上；於-20℃冰凍保存，其穩定性至少可保持5個月以上；於室溫(20℃)保存，其穩定性至少可保持4個月以上。該蛋黃抗體組合物以4℃保存穩定性最好。
實驗例4；蛋黃抗體組合物中特異性複合物的檢測(以SARS冠狀病毒特異性蛋黃抗體組合物為例)用4％的聚乙二醇6000(PEG6000)檢測上述實施例4或實施例6製備的SARS冠狀病毒特異性蛋黃抗體組合物中特異性複合物的含量將4％PEG6000溶液與1∶100稀釋的待檢蛋黃抗體組合物溶液混合，置4℃冰箱過夜後離心，將沉澱物用4％PEG6000溶液充分洗滌，重新溶解於0.01mol/L的NaOH中，在波長280nm下測量溶液的吸光度；也可利用散射比濁法直接測定PEG沉澱的免疫複合物；以不同濃度的熱聚合IgG作為參考標準來計算免疫複合物的含量。結果表明上述實施例4所製備的SARS冠狀病毒特異性蛋黃抗體組合物中的免疫複合物佔43％；上述實施例6所製備的SARS冠狀病毒特異性蛋黃抗體組合物中的免疫複合物佔35％；另取上述SARS冠狀病毒特異性蛋黃抗體組合物經瓊脂擴散和免疫印跡鑑定為SARS冠狀病毒蛋黃抗體IgY和蛋黃抗獨特型抗體的特異性免疫結合複合物。
實驗例5蛋黃抗體組合物生物安全性試驗(以SARS冠狀病毒特異性蛋黃抗體組合物為例)毒性實驗用體重18-20g小白鼠10隻，每腹腔注射上述實施例4或實施例6製備的SARS冠狀病毒特異性蛋黃抗體組合物0.5ml(6.0mg/m1)，連續觀察7天，小白鼠的體重無一例減輕，無一例死亡，亦未發現任何不良反應。SARS冠狀病毒特異性蛋黃抗體組合物的毒性實驗表明該蛋黃抗體組合物具有較高的生物安全性。
實驗例6雞SARS冠狀病毒病毒感染模型的製備用SARS冠狀病毒RNA陽性血清150μl對15日齡雛雞進行腹腔注射，每隔15天對雞血清進行SARS冠狀病毒抗原(用雙抗體夾心ELISA法)和SARS冠狀病毒RNA(逆轉錄聚合酶鏈反應RT-PCR)檢測，以持續3個月雞SARS冠狀病毒抗原和SARS冠狀病毒RNA均為陽性作為雞SARS冠狀病毒感染模型成功建立的標誌。
實驗例7SARS冠狀病毒特異性蛋黃抗體組合物的動物試驗之一用上述實施例4製備的SARS冠狀病毒特異性蛋黃抗體組合物對雞SARS冠狀病毒感染模型進行動物實驗，其中雞血清SARS冠狀病毒抗原滴度(IU/ml)和雞血清SARS冠狀病毒抗體滴度(IU/ml)的檢測用雙夾心ELISA法(試劑均由北京華大吉比愛生物技術有限公司提供)，雞血清SARS冠狀病毒RNA拷貝值(COPY/ml)的檢測用逆轉錄聚合酶鏈反應RT-PCR(試劑由上海復星公司提供)方法；其實驗結果見表2。
表2實施例4製備的SARS冠狀病毒特異性蛋黃抗體組合物的動物試驗結果

實驗結果表明實驗組用皮下注射SARS冠狀病毒特異性蛋黃抗體組合物的SARS冠狀病毒感染雞，在經過三周的免疫注射後，用ELISA檢測感染雞血清中的SARS冠狀病毒抗原，其轉陰率為70％；用逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測感染雞血清中的SARS冠狀病毒RNA，其轉陰率為50％；用ELISA檢測感染雞血清中的SARS冠狀病毒抗體(IgG+IgM)，其轉陽率為50％。而對照組(對感染雞皮下注射SARS冠狀病毒滅活抗原)感染雞血清中SARS冠狀病毒抗原的轉陰率僅為30％、SARS冠狀病毒RNA的轉陰率僅為20％、SARS冠狀病毒抗體(IgG+IgM)的轉陽率僅為20％。
實驗例8SARS冠狀病毒特異性蛋黃抗體組合物的動物試驗之二用上述實施例6製備的SARS冠狀病毒特異性蛋黃抗體組合物對雞SARS冠狀病毒感染模型進行動物實驗，其中雞血清SARS冠狀病毒抗原滴度(IU/ml)和雞血清SARS冠狀病毒抗體滴度(IU/ml)的檢測用雙夾心ELISA法(試劑均由北京華大吉比愛生物技術有限公司提供)，雞血清SARS冠狀病毒RNA拷貝值(COPY/ml)的檢測用逆轉錄聚合酶鏈反應RT-PCR(試劑由上海復星公司提供)方法；實驗結果見表3。
表3實施例6製備的SARS冠狀病毒特異性蛋黃抗體組合物的動物試驗結果

實驗結果表明實驗組用皮下注射SARS冠狀病毒特異性蛋黃抗體組合物的SARS冠狀病毒感染雞，在經過三周的免疫注射後，用ELISA檢測感染雞血清中的SARS冠狀病毒抗原，其轉陰率為80％；用逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測感染雞血清中的SARS冠狀病毒RNA，其轉陰率為60％；用ELISA檢測感染雞血清中的SARS冠狀病毒抗體(IgG+IgM)，其轉陽率為60％。而對照組(對感染雞皮下注射SARS冠狀病毒滅活抗原)感染雞血清中SARS冠狀病毒抗原的轉陰率僅為30％、SARS冠狀病毒RNA的轉陰率僅為20％、SARS冠狀病毒抗體(IgG+IgM)的轉陽率僅為20％。
將本組試驗結果與實驗例7中的治療組試驗結果相比較並通過統計學分析，本組試驗結果明顯優於實驗例7中的治療組，兩組比較差異有顯著性意義，t＝3.1-5.3 P＜0.01；結果表明實施例6所製備的SARS冠狀病毒特異性蛋黃抗體組合物中由於含有SARS冠狀病毒抗原特異性蛋黃抗體IgY與氧化苦參鹼的偶聯物和分子內佐劑棕櫚醯賴氨酸組分，從而使其兼具免疫協調、免疫治療和靶向抗病毒作用，並且更易於穿透肝細胞脂質膜，因而具有更好的治療效果。
將本組試驗結果與實驗例7中的對照組試驗結果相比較並通過統計學分析，本組試驗結果明顯優於實驗例7中的對照組，兩組比較差異有顯著性意義，t＝3.9-15.6 P＜0.001；結果表明實施例6所製備的SARS冠狀病毒特異性蛋黃抗體組合物比單純的SARS冠狀病毒滅活抗原具有更好的治療效果。
上述實驗結果證明本SARS冠狀病毒特異性蛋黃抗體組合物的治療作用具有特異性強、毒副作用小等優點；該SARS冠狀病毒特異性蛋黃抗體組合物中的蛋黃抗體IgY和蛋黃抗獨特型抗體及其免疫複合物更有利於抗獨特型抗體模擬「內影像」抗原性的提呈，並且上述組合物及其免疫複合物比單純採用SARS冠狀病毒滅活抗原可誘生更高滴度的抗體產生和淋巴細胞增殖反應，從而更有效地誘生體液和細胞免疫反應，以達到對抗SARS冠狀病毒、保護組織細胞的目的。
權利要求
1.一種預防和治療非典型肺炎的蛋黃抗體組合物，其特徵在於主要是由非典型肺炎病原體特異性蛋黃抗體IgY和蛋黃抗獨特型抗體組成，其中以預防為目的者，非典型肺炎病原體特異性蛋黃抗獨特型抗體的量(w/w)＞蛋黃抗體IgY的量；以治療為目的者，非典型肺炎病原體特異性蛋黃抗體IgY的量(w/w)＞蛋黃抗獨特型抗體的量；以預防性治療或早期治療為目的者，非典型肺炎病原體特異性蛋黃抗體IgY的量(w/w)＝蛋黃抗獨特型抗體的量。
2.根據權利要求1所述的預防和治療非典型肺炎的蛋黃抗體組合物，其特徵在於所述的非典型肺炎病原體特異性蛋黃抗體IgY是針對於非典型肺炎病原體特異性免疫原的蛋黃抗體IgY；所述的非典型肺炎病原體特異性蛋黃抗獨特型抗體是針對於非典型肺炎病原體特異性免疫原所對應的特異性抗體包括蛋黃抗體IgY的特異性蛋黃抗獨特型抗體。
3.根據權利要求1或2所述的預防和治療非典型肺炎的蛋黃抗體組合物，其特徵在於所述蛋黃抗體IgY是針對於純化或重組的非典型肺炎病原體特異性免疫原的抗體；所述免疫原包括純化或滅活的非典型肺炎病原體特異性抗原、通過基因工程技術重組的非典型肺炎病原體特異性抗原或疫苗、非典型肺炎病原體DNA或mRNA及其與相應載體組成的重組體中的任一種或其組合；所述免疫原還包括上述非典型肺炎病原體特異性免疫原的納米微粒或脂質體複合物；所述蛋黃抗獨特型抗體是針對於非典型肺炎病原體特異性抗原的單克隆或多克隆抗體包括蛋黃抗體IgY的抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε中的任一種或其組合；
4.所述非典型肺炎病原體特異性免疫原包括SARS冠狀病毒、腺病毒、肺炎支原體、肺炎衣原體特異性的純化或重組抗原、組織細胞和細胞因子及其受體；所述免疫原是蛋白質、多肽、粘多糖、脂多糖、糖蛋白、細胞核、細胞質、細胞膜、細胞表面受體、核蛋白、DNA、RNA、線粒體、微粒體中的任一種或其組合。
5.根據權利要求1所述的預防和治療非典型肺炎的蛋黃抗體組合物，其特徵在於所述預防和治療非典型肺炎的蛋黃抗體組合物包括SARS冠狀病毒蛋黃抗體組合物、腺病毒蛋黃抗體組合物、肺炎支原體蛋黃抗體組合物、肺炎衣原體蛋黃抗體組合物中的任一種或其組合；在上述蛋黃抗體組合物中還含有特異性蛋黃抗體IgY和蛋黃抗獨特型抗體特異性結合所形成的免疫複合物；所述複合物包括IgY-Ab2α、IgY-Ab2β、IgY-Ab2γ和IgY-Ab2ε複合物中的任一種或其組合；所述預防和治療非典型肺炎的蛋黃抗體組合物是其納米微粒或脂質體複合物。
6.根據權利要求1所述的預防和治療非典型肺炎的蛋黃抗體組合物，其特徵在於在該組合物中還含有藥用輔料；所述藥用輔料包括包衣材料、蛋白穩定劑、藥用佐劑、免疫增強劑，其中包衣材料為丙烯酸樹脂、羥丙基甲基纖維素及其衍生物中的任一種；蛋白穩定劑為聚乙二醇、蔗糖、海藻糖中的任一種；藥用佐劑為氫氧化鋁、表面活性劑、福氏佐劑中的任一種；免疫增強劑為多聚糖、糖肽、糖脂、脂類和磷脂，其中脂類包括三棕櫚醯絲氨醯甘油基半胱氨酸、單棕櫚脂酸、雙棕櫚脂酸、三棕櫚脂酸、棕櫚醯賴氨酸、α-氨基十六烷酸、月桂醯肽脂中的任一種；所述脂類是以分子內佐劑的形式與上述蛋黃抗體組合物中的特異性蛋黃抗體IgY或蛋黃抗獨特型抗體結合成複合物。
7.根據權利要求1所述的預防和治療非典型肺炎的蛋黃抗體組合物，其特徵在於在該組合物中還含有免疫偶聯物；所述免疫偶聯物包括上述非典型肺炎病原體特異性蛋黃抗體IgY與放射性核素、藥物和毒素以及細胞因子的偶聯物中的任一種或其組合；其中所述放射性核素包括碘131I、磷32P、鍶89Sr、釔90Y、釤153Sm、錸188Re中的任一種或其組合；所述藥物包括抗病毒藥物、抗菌素、免疫調節藥物、免疫抑制劑中的任一種或其組合；所述毒素包括包括篦麻籽毒素、相思子毒素、苦瓜毒素、氧化苦參鹼、去甲斑蝥素、白喉毒素、假單胞菌內毒素以及綠膿桿菌外毒素中的任一種或其組合；所述細胞因子包括白細胞介素、集落刺激因子、腫瘤壞死因子、趨化因子中的任一種或其組合；
8.根據權利要求1所述的預防和治療非典型肺炎的蛋黃抗體組合物，其特徵在於所述的蛋黃抗體組合物是其納米微粒或脂質體複合物。
9.根據權利要求1所述的預防和治療非典型肺炎的蛋黃抗體組合物，其特徵在於所述蛋黃抗體組合物是任一種藥劑學上所述的劑型；所述劑型包括注射劑、膠囊、口服液、噴霧劑、貼劑中的任一種劑型。
10.一種預防和治療非典型肺炎的蛋黃抗體組合物的製備方法，其特徵在於包括以下步驟1)用蛋白質鹽析、柱層析純化非典型肺炎病原體特異性抗原或通過基因重組的辦法製備非典型肺炎病原體特異性抗原；所述非典型肺炎病原體特異性抗原包括SARS冠狀病毒、腺病毒、肺炎支原體、肺炎衣原體的純化或重組特異性抗原；2)通過免疫動物製備針對於上述非典型肺炎病原體抗原的單克隆或多克隆抗體；或通過基因重組的辦法製備非典型肺炎病原體特異性抗體；3)以步驟1)製備的非典型肺炎病原體特異性抗原為免疫原，多次重複免疫注射給禽類優選是雞，待5-20天後禽類尤其是雞的產蛋中即含有針對於上述非典型肺炎病原體特異性免疫原的蛋黃抗體IgY；所述的免疫原注射量為1-2ml，免疫原量10-500μg/ml+等量不完全福氏佐劑；4)禽蛋尤其是雞蛋去殼取黃，經滅菌處理後，依次進行a)用5倍體積的0.1mol/L PH7.2磷酸鹽-海藻糖稀釋液稀釋蛋黃；b)自-20℃到室溫反覆凍融，每分鐘500-1000轉低速離心後合併上清液備用；c)向上清液中加入辛酸至終濃度為1.5％，沉澱後取上清液備用；d)向上清液中加入硫酸鈉至終濃度為36％，取沉澱備用；e)取沉澱通過浸提、萃取、濃縮、純化、冷凍或噴霧乾燥，即得到針對於非典型肺炎病原體的蛋黃抗體組合物組分之一蛋黃抗體IgY；所述非典型肺炎病原體特異性蛋黃抗體IgY可進一步偶聯放射性核素、藥物、毒素和細胞因子中的任一種而製備成蛋黃抗體IgY偶聯物；5)取步驟2)製備的針對於上述抗原的抗體或步驟3)製備的蛋黃抗體IgY為免疫原，多次重複免疫注射給禽類優選是雞，待5-20天後禽類尤其是雞的產蛋中即含有針對於上述相應抗體包括蛋黃抗體IgY的蛋黃抗獨特型抗體；所述的免疫原抗體Abl的注射量為1-2ml，免疫原抗體Abl的用量為10-2000μg/ml+等量不完全福氏佐劑；6)重複步驟4)的過程，即得到針對於非典型肺炎病原體免疫原相應抗體的蛋黃抗體組合物組分之一蛋黃抗獨特型抗體；7)根據實際需要按重量配比調製步驟4)所得的蛋黃抗體IgY和步驟6)所得的蛋黃抗獨特型抗體，再輔以可接受量的藥用輔料即得到所述的蛋黃抗體組合物；所述蛋黃抗體組合物可製備成納米微粒或脂質體複合物；8)取步驟7)製備的蛋黃抗體組合物經過無菌、安全及毒性試驗合格後，再通過相應的製劑工藝製備成藥劑學上相應的劑型；所述劑型包括注射劑、膠囊、口服液、噴霧劑、貼劑中的任一種劑型。
11.根據權利要求10所述的預防和治療非典型肺炎的蛋黃抗體組合物的製備方法，其特徵在於包括以下步驟1)分別取純化或重組非典型肺炎病原體特異性抗原和已製備好的針對於上述抗原的抗體包括蛋黃抗體IgY作為免疫原，分別連續或同時多次重複免疫注射給禽類優選是雞；還可將純化或重組非典型肺炎病原體特異性抗原同已製備好針對於上述抗原的抗體包括蛋黃抗體IgY按比例混合後作為免疫原進行免疫注射；待5-20天後禽類尤其是雞的產蛋中即同時含有針對於上述抗原的蛋黃抗體IgY和針對於上述抗體包括蛋黃抗體IgY的特異性蛋黃抗獨特型抗體；2)取上一步驟所得的禽蛋或雞蛋，經滅菌處理後，依次進行a)用5倍體積的0.1mol/L PH7.2磷酸鹽-海藻糖稀釋液稀釋蛋黃；b)自-20℃到室溫反覆凍融，每分鐘500-1000轉低速離心後合併上清液備用；c)向上清液中加入辛酸至終濃度為1.5％，沉澱後取上清液備用；d)向上清液中加入硫酸鈉至終濃度為36％，取沉澱備用；e)取沉澱通過浸提、萃取、濃縮、純化、冷凍或噴霧乾燥；一次性提取純化，可同時得到蛋黃抗體IgY和蛋黃抗獨特型抗體兩種組合物組分；所述蛋黃抗體組合物可製備成納米微粒或脂質體複合物；3)然後檢測其中各組分的含量，再輔以可接受量的藥用輔料，並經過無菌、安全及毒性試驗合格後，再根據實際需要，通過相應的製劑工藝製備成藥劑學上相應的劑型；所述劑型包括注射劑、膠囊、口服液、噴霧劑、貼劑中的任一種劑型。
12.根據權利要求1或10所述的預防和治療非典型肺炎的蛋黃抗體組合物的用途，其特徵在於所述蛋黃抗體組合物用於作為非典型肺炎的預防和治療劑以及食品、保健品添加劑和診斷劑，尤其是用於作為因SARS冠狀病毒、腺病毒、肺炎支原體、肺炎衣原體感染所致的傳染性非典型肺炎的預防和治療劑以及食品、保健品添加劑。
全文摘要
本發明涉及一種預防和治療非典型非炎的蛋黃抗體組合物及其製備方法，主要是由非典型肺炎病原體特異性蛋黃抗體IgY和蛋黃抗獨特型抗體組成。本發明具有成本低、產量高、特異性強、決定簇廣並能進行集約化大規模生產的優點，尤其是能避免HAMA反應和異質性問題，且無毒副作用、安全性好。適用於作為因SARS冠狀病毒、腺病毒、肺炎支原體、肺炎衣原體感染所致的傳染性非典型肺炎的預防和治療劑以及食品、保健品添加劑。
文檔編號C07K16/02GK1478550SQ0314884
公開日2004年3月3日 申請日期2003年6月18日 優先權日2003年6月18日
發明者郭佔軍, 趙華, 郭愛芹, 楊煥雲, 張慧 申請人:郭佔軍