表達豬繁殖與呼吸症候群病毒游離受體重組腺病毒組及其製備與應用的製作方法

2023-05-24 16:06:11

表達豬繁殖與呼吸症候群病毒游離受體重組腺病毒組及其製備與應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及表達豬繁殖與呼吸症候群病毒游離受體重組腺病毒組及其製備與應用。所述重組腺病毒組，是由表達豬唾液酸粘附素前四個IgV結構域和與豬IgG?Fc片段融合蛋白的重組腺病毒，及表達脫衣殼受體CD163第5-9個SRCR結構域與豬IgG?Fc片段融合蛋白的重組腺病毒組成。該重組腺病毒組應用於製備防治豬繁殖與呼吸症候群製劑。與現有的疫苗相比，本發明製備的重組腺病毒為複製缺陷性病毒，不能在豬體內擴散傳播，不存在散毒和毒力返強風險，表達的兩種游離受體的協同作用能顯著抑制不同毒株PRRSV感染，可以作為防控PRRS的新型製劑進行開發。
【專利說明】表達豬繁殖與呼吸症候群病毒游離受體重組腺病毒組及其製備與應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物技術與動物疫病防控領域，具體涉及表達豬繁殖與呼吸症候群病毒游離受體重組腺病毒的製備方法與應用 。
【背景技術】
[0002]豬繁殖與呼吸症候群(PRRS)是豬的一種高度接觸性傳染病，以母豬繁殖障礙和各種年齡豬呼吸道症狀為主要特徵。該病首次於1987年在北美發生，1996年傳入我國，給世界養豬業造成巨大的經濟損失。豬繁殖與呼吸症候群病毒(PRRSV)主要感染豬的單核-巨噬細胞系統，導致嚴重的細胞凋亡和免疫抑制，並能引起持續性感染。另外，該病毒不僅毒株多、變異快，還利用多種機制逃逸宿主的先天性和獲得性免疫應答，包括抑制幹擾素應答、幹擾抗原提呈、抗體依賴的感染促進作用、減少感染細胞表面病毒抗原表達和中和表位遮蔽。因此，現有疫苗的免疫保護效果欠佳(滅活苗)或有散毒、毒力返強風險(弱毒苗)，新型疫苗研製又面臨巨大挑戰，迫切需要研究防控該病的新策略。
[0003]PRRSV利用受體依賴的胞吞機制進入靶細胞，參與巨噬細胞感染的受體至少有三個，包括非特異吸附因子硫酸乙醯肝素、吸附與進入受體唾液酸粘附素(Sn)和脫衣殼受體⑶163。其中，Sn前4個免疫球蛋白樣結構域(Sn4D)參與病毒的吸附，⑶163的第5個清道夫受體半胱氨酸富含(SRCR)結構域參與病毒的結合，但需要第6-9個SRCR結構域存在才具有受體功能，這些病毒結合結構域可以作為游離受體阻斷病毒感染。
[0004]與容易變異的病毒蛋白不同，病毒受體是宿主細胞編碼的保守分子，因此可作為阻斷病毒感染的理想靶點，尤其是對容易變異的RNA病毒。其中，游離受體能與細胞受體競爭結合病毒，所以能中和或抑制病毒感染，並在抗麻疹病毒、禽白血病病毒和柯薩奇病毒等病毒中得以證實。據報導，由Sn4D和人IgG Fe片段組成的游離受體可部分抑制PRRSV感染，但人IgG Fe片段對豬有免疫原性，所用的游離受體從重組質粒轉染細胞提取，因此豬體內使用受到限制。更為重要的是，PRRSV至少使用兩個特異受體感染巨噬細胞，單個游離受體不足以阻斷該病毒感染。至於CD163游離受體及其對PRRSV感染的阻斷作用，目前尚無報導。

【發明內容】

[0005]本發明用重組腺病毒表達PRRSV游離受體Sn4D-Fc和SRCR59_Fc，經融合蛋白處理病毒和重組病毒轉染細胞證明，兩個游離受體的共同作用能顯著抑制不同毒株PRRSV感染。該重組腺病毒可用較成熟的技術進行批量製備，能在注射豬體內持續表達，但不能在豬體內擴散傳播，因此可作為防治PRRSV的新型製劑進行開發。
[0006]表達PRRSV游離受體的重組腺病毒組，是由表達Sn4D_Fc和SRCR59_Fc融合蛋白的重組腺病毒組成。即由表達豬唾液酸粘附素前4個IgV結構域和與豬IgG Fe片段融合蛋白的重組腺病毒，及表達脫衣殼受體⑶163第5-9個SRCR結構域與豬IgG Fe片段融合蛋白的重組腺病毒組成。
[0007]本發明還公開了上述表達PRRSV游離受體的重組腺病毒組在製備防治豬繁殖與呼吸症候群製劑中的應用。
[0008]其中，所述PRRSV游離受體的重組腺病毒組通過下述方法製備:
[0009]1.用化學合成法合成豬IgG重鏈信號肽序列，用反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)擴增豬IgG Fe片段、唾液酸粘附素前4個IgV結構域(Sn4D)和CD163第5_9個結構域(SRCR59)編碼序列。
[0010]2.將Sn4D與Fe融合序列插入腺病毒載體pShuttle_CMV，獲得重組載體pShuttle-Sn4D-Fc ;將豬IgG信號肽、SRCR59與Fe融合序列插入腺病毒載體pShuttle-CMV,獲得重組載體 pShuttle-SRCR59_Fc。
[0011]3.用重組載體 pShuttle-Sn4D-Fc 和 pShuttle-SRCR59_Fc 轉染 AAV-293 細胞，獲得重組腺病毒 rAd-Sn4D-Fc 和 rAd-SRCR59_Fc。
[0012]4.用AAV-293細胞擴增重組腺病毒。
[0013]與現有的PRRS疫苗相比，本發明製備的重組腺病毒為複製缺陷性病毒，不存在散毒或毒力返強等風險，而且能在注射豬體內持續表達，表達的游離受體對不同毒株PRRSV感染具有穩定的抑制作用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為重組腺病毒載體的結構示意圖。ITR為腺病毒基因組左、右反向末端重複序列；PCMV為巨細胞病毒早期`啟動子；L為豬IgG重鏈信號肽序列；Fc為豬IgG Fe片段編碼序列；Sn4D為豬Sn前4個IgV結構域編碼序列；SRCR5和SRCR59分別為豬CD163第5個和第5~9個SRCR結構域編碼序列。
[0015]圖2為重組腺病毒轉導PK-15細胞中游離受體基因轉錄RT-PCR檢測。
[0016]圖3為重組腺病毒轉導豬細胞中游離受體表達的免疫螢光檢測
[0017]圖4為親和純化游離受體的電泳分析
[0018]圖5為純化游離受體的免疫印跡檢測
[0019]圖6為純化游離受體與PRRSV結合的RT-PCR檢測。PRRSV為未結合病毒對照；SPA-Sn4D-Fc代表與Sn4D_Fc包被的葡萄球菌A蛋白(SPA)偶聯瓊脂糖的結合；SPA-SRCR5-Fc代表與SRCR5_Fc包被的SPA偶聯瓊脂糖的結合；SPA-SRCR59_Fc代表與SRCR59-Fc包被的SPA偶聯瓊脂糖的結合；SPA_Fc代表與豬Fe片段包被的SPA偶聯瓊脂糖的結合；SPA代表與無游離受體包被的SPA偶聯瓊脂糖的結合。
[0020]圖7為游離受體中和PRRSV感染的劑量依賴關係流式細胞術檢測，縱坐標表示病毒陽性細胞百分率；橫坐標代表游離受體濃度；Sn4D-Fc+SRCR59-Fc為兩種游離受體的共同作用。
[0021]圖8為重組腺病毒表達的游離受體中和PRRSV感染的作用檢測，rAd-Fc為僅表達豬IgGFc片段的重組腺病毒對照；3D4/21-PAM和PK-15/PAM分別代表重組腺病毒轉導3D4/21和PK-15細胞表達的游離受體向PAM細胞的傳遞。
[0022]圖9為重組腺病毒表達的游離受體中和PRRSV感染的劑量依賴關係，縱坐標代表病毒滴度，橫坐標代表病毒接種劑量。[0023]圖10為重組腺病毒表達的游離受體中和PRRSV感染的動態檢測，縱坐標代表病毒滴度，橫坐標表示感染後不同時間。
[0024]圖11為重組腺病毒表達的游離受體對不同毒株PRRSV感染的抑制作用，縱坐標代表病毒滴度，橫坐標表示不同毒株。
[0025]圖12本發明克隆的豬IgG Fe片段序列與發表序列(L0C396781)的比對分析。
[0026]圖13本發明克隆的豬Sn4D序列與發表序列(NM-214346)的比對分析。
[0027]圖14本發明克隆的豬SRCR5序列與發表序列的(NM-213976.5)比對分析。
[0028]圖15本發明克隆的豬SRCR59序列與發表序列(NM-213976.59)的比對分析。
【具體實施方式】
[0029]生物材料來源:
[0030]1.pShuttle-CMV載體:購自美國 Stratagene 公司。文獻:He TC, Zhou S，da CostaLT, Yu J, Kinzler Kff.et al.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95(5):2509-2514.[0031]2.BJ-5183-AD-1 株大腸桿菌:購自美國 Stratagene 公司。文獻:He TC, Zhou S，daCosta LT, Yu J, Kinzler Kff.et al.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95(5):2509-2514.[0032]3.AAV-293細胞:從中國科學院細胞庫引進。文獻:Xie Qff, Leung M, FuortesM，Sassa S，Nathan C.Co mplementation analysis of mutants of nitric oxide synthasereveals that the active site requires two hemes.Proc Natl Acad Sci USA.1996,93(10):4891-4896.[0033]4.pMD18-T載體:購自寶生物工程(大連)有限公司(Takara Code:6011)。
[0034]5.PRRSV參考株VR2332:購自美國ATCC (ATCC VR2332)，本實驗室保存。文獻:Col Iins.TE，Benfield DA, Christianson WT, Harris L, Hennings JC, ShawDP，Goya，SM，McCullough S，Morrison RB，.Too HS.1solation of swine infertilityand respiratory syndrome virus (isolate ATCC VR-2332)in North America andexperimental reproduction of the disease in gnotobiotic pigs.J Vet DiagnInvest,1992，4:117-126 ；
[0035]6.PRRSV疫苗株CH-1R和強毒株JXAl:由國藥集團揚州威克生物工程有限公司提供。文獻:Hu SPj Zhang Zj Cai XHj Tian ZJj An TQj Wu DL.Valuation of protectiveefficacy of PRRS attenuated vaccine and inactivated mutant PRRSV strains.Chinese J Prev Vet Med,2009, 31:392-396 ；Tian K，Yu X，Zhao T，Feng Y，Cao Zj WangC，Hu Y，Chen X，Hu D，Tain X.Emergence of fatal PRRSV variants:unparalleledoutbreaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of the uniquehallmark.PLoS One, 2007.2 (6):e526.[0036]7.MARC-145細胞:從美國ATCC引進(ATCC CRL-12231 )，江蘇揚州優邦生物製藥有
限公司保存。
[0037]8.PK-15細胞:從從美國ATCC引進(ATCC CCL-33)，本實驗室保存。
[0038]9.6周齡健康豬:由江蘇省畜牧獸醫職業技術學院種豬場提供。
[0039]具體操作步驟如下:
[0040]1.重組腺病毒構建:具體操作步驟如下:[0041](I)豬IgGl重鏈信號肽序列(GenBank Accession:L0C396781)合成:由南京金瑞思生物科技有限公司合成。[0042](2)豬IgGlFc片段編碼序列克隆:根據豬IgGlFc片段編碼序列(GenBankAccession:L0C396781)設計下列 I 對引物:
[0043]正向引物:5-GGAACAAAGACCAAACCACC-3(SEQID N0.1)；
[0044]反向引物:5-TCATTTACCCTGAGTCTTGGA-3(SEQID N0.2)。
[0045]按照RNAiso Kit [自寶生物工程(大連)有限公司]說明書，從豬外周血淋巴細胞提取 RNA,按照 RevertAid?First Strand cDNA Synthesis Kit (美國 Fermentas 公司)說明書進行反轉錄，按照LA Taq DNA聚合酶[自寶生物工程(大連)有限公司]說明書進行PCR擴增，將擴增產物克隆入pMD18-T載體進行序列測定。結果顯示:克隆的豬IgGlFc片段編碼序列與發表序列的同源性為92.6%，無插入或缺失突變(圖12)。
[0046](3) Sn4D編碼序列克隆:根據豬Sn4個N端IgV結構域序列(GenBankAccess ion:NM_214346)合成下列 I 對引物:
[0047]正向引物:5-ATGGACTTCCTGCTCCTGCT-3(SEQID N0.3)；
[0048]反向引物:5-GCTGACCACCACGCTGACA-3(SEQ ID N0.4)。
[0049]按照RNAiso Kit[自寶生物工程(大連)有限公司]說明書，從豬肺巨噬細胞提取RNA,按照 RevertAid?First Strand cDNA Synthesis Kit (美國 Fermentas 公司)說明書進行反轉錄，按照LA Taq DNA聚合酶[自寶生物工程(大連)有限公司]說明書進行PCR擴增，將擴增產物克隆入PMD18-T載體進行序列測定。結果顯示:克隆的Sn4D編碼序列與發表序列的同源性為99.3%，無插入或缺失突變(圖13)。
[0050](3) SRCR5編碼序列克隆:根據豬CD163第5個SRCR結構域序列(GenBankAccession:NM_213976)合成下列 I 對引物:
[0051]正向引物:5-GTTGGAGGGGACATTCCC-3(SEQID N0.5)；
[0052]反向引物:5-GACTACGCCGACGTCCCT-3(SEQ ID N0.6)。
[0053]按照RNAiso Kit [自寶生物工程(大連)有限公司]說明書，從豬肺巨噬細胞提取RNA，按照PrimeScript? RT-PCR Kit[自寶生物工程(大連)有限公司]說明書進行RT-PCR擴增，將擴增產物克隆入pMDlS-Τ載體進行序列測定。結果顯示克隆的序列與發表序列一致(圖14)。
[0054](4) SRCR59編碼序列克隆:根據豬CD163第5個SRCR結構域序列(GenBankAccession:NM_213976)合成下列 I 對引物:
[0055]正向引物:5-GTTGGAGGGGACATTCCC-3(SEQID N0.7)；
[0056]反向引物:5-TGAGCACGTCACAGCAGC-3(SEQ ID N0.8)。
[0057]按照RNAiso Kit [自寶生物工程(大連)有限公司]說明書，從豬肺巨噬細胞提取RNA，按照PrimeScript? RT-PCR Kit[自寶生物工程(大連)有限公司]說明書進行RT-PCR擴增，將擴增產物克隆入pMDlS-Τ載體進行序列測定。結果顯示克隆的序列與發表序列一致(圖15)。
[0058](5)對照載體pShuttle-Fc的構建:將合成的豬IgGl重鏈信號肽序列克隆入腺病毒載體pShuttIe-CMV (美國Stratagene公司)的KpnI和XhoI酶切位點之間,將克隆的豬Fe編碼序列克隆在HindIII和EcoRV酶切位點之間，經限制酶消化法鑑定重組載體(圖1)構建正確。
[0059](6)重組載體pShuttle-Sn4D_Fc的構建:將克隆的Sn4D編碼序列克隆入腺病毒載體pShuttIe-CMV (美國Stratagene公司)的KpnI和XhoI酶切位點之間,將克隆的豬Fe編碼序列克隆在HindIII和EcoRV酶切位點之間，經限制酶消化法鑑定重組載體(圖1)構
建正確。
[0060](7)重組載體pShutt I e-SRCR5_Fc的構建:將克隆的SRCR5編碼序列插在pShuttle-Fc中豬IgG重鏈信號肽與Fe序列之間，經限制酶消化法鑑定重組載體(圖1)構建正確。
[0061 ] (8 )重組載體pShutt I e-SRCR59_Fc的構建:將克隆的SRCR59編碼序列插在pShuttle-Fc中豬IgG重鏈信號肽與Fe序列之間，經限制酶消化法鑑定重組載體(圖1)構建正確。
[0062](9)重組病毒產生:參考 AdEasy? Adenoviral Vector System (美國 Stratagene公司)說明書進行(文獻:He TC, Zhou S，da Costa LT, Yu J, Kinzler Kff.et al.Proc NatlAcad SciUSA，1998,95(5):2509-2514.He TC, Zhou S, da Costa LT, Yu J1Kinzler Kff.etal.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95 (5): 2509-2514)。用限制酶 PacI 消化法將重組質粒pShuttle-Sn4D_Fc, pShuttle-SRCR5_Fc, pShuttle_SRCR59_Fc、pShuttle-Fc 線性化，電轉化BJ-5183-AD-1大腸桿菌感受態細胞，利用卡那黴素抗性初步篩選同源重組質粒，用瓊脂糖凝膠電泳法初步篩選大於20Kb的重組質粒，利用限制酶PacI消化和瓊脂糖凝膠電泳法確認陽性重組質粒。用常規法將重組質粒轉化DH5 α大腸桿菌感受態細胞,用AxyPrep質粒DNA小量提取試劑盒[康寧生命科學(吳江)有限公司]提取質粒DNA。在25cm2培養皿中培養AAV-293細胞至密度為80%。用限制酶PacI消化法將上述重組質粒線性化，將3 μ g質粒 DNA 與 15 μ L Lipofectmine (Life Technologies?)混合,按照試劑說明書轉染 AAV-293細胞(中國科學院細胞庫)。培養10-14天觀察細胞縮小、變圓，反覆凍融裂解細胞，收穫的重組腺病毒 rAd-Sn4D-Fc、`rAd-SRCR5_Fc、rAd-SRCR59_Fc 和 rAd-Fc 用 AAV-293 細胞擴增，按照 ViraBind? Adenovirus Miniprep Kit (美國 CELL B10LABS 公司)說明書進行重組腺病毒純化，參考Luo等方法測定病毒滴度(文獻:Jinyong Luo, Zhong-Liang Deng, XiaojiLuo,et al.A protocol for rapid generation of recombinant adenoviruses using theAdEasy system.Nature protocols, 2007, 2 (5):1236-1247.[0063]2.游離受體基因的轉錄檢測
[0064]在25cm2細胞瓶培養PK-15細胞，次日分別用重組腺病毒rAd-SRCR5_Fc、rAd-SRCR59-Fc、rAd-Sn4D-Fc 和 rAd-Fc (感染指數=1)，培養 24 小時後，用 RNAiso Kit[自寶生物工程(大連)有限公司]提取細胞總RNA，按照PrimeScript? RT-PCR Kit[自寶生物工程(大連)有限公司]說明書進行RT-PCR擴增，結果顯示在rAd-SRCR5-Fc、rAd-SRCR59-Fc、rAd-Sn4D_Fc和rAd-Fc感染細胞中分別能擴增出預期大小的SRCR5_Fc、SRCR59-Fc、Sn4D-Fc 和 Fe 轉錄子(圖 2)。
[0065]3.游離受體表達免疫螢光檢測
[0066]在24孔板培養PK-15、3D4/21和豬肺巨噬細胞(PAM)，次日分別用重組腺病毒 rAd-SRCR5、rAd_SRCR59、rAd-Sn4D_Fc 和 rAd-Fc (感染指數=1)，培養 24 小時後，用IRDye800CW標記山羊抗豬IgG (美國Rockland公司)進行免疫螢光檢測。結果顯示重組腺病毒感染PK-15和3D4/21細胞為螢光強陽性，PAM細胞為弱陽性(圖3)。
[0067]4.游離受體的純化
[0068]在75cm2細胞瓶內培養PK-15細胞至密度約80%，次日分別用重組腺病毒rAd-SRCR5-Fc、rAd-SRCR59-Fc、rAd-Sn4D-Fc 和 rAd-Fc 轉導(感染指數=1)，培養 48 小時後收集細胞上清，500g離心10分鐘後小心吸取上清，按照Protein A Sefinose? (上海生工生物有限公司)說明書進行Fe融合蛋白純化，各取10 μ L進行SDS-PAGE (12%分離膠)分離。結果顯示:在四種重組腺病毒感染細胞中，能純化到預期分子量的豬IgG Fe片段(SEQID N0.9)及 Sn4D-Fc (SEQ ID N0.10)、SRCR5_Fc (SEQ ID N0.11)和 SRCR59_Fc (SEQ IDN0.12)融合蛋白(圖4)。
[0069]5.游離受體免疫鑑定
[0070]各取上述純化蛋白10 μ L進行SDS-PAGE分離，按照IRDye800CW標記山羊抗豬IgG(美國Rockland公司)說明書進行免疫轉印。結果顯示:純化的融合蛋白Sn4D_Fc，SRCR5_Fc和SRCR59-Fc以及豬IgG Fe片段均能與豬IgG反應(圖5)。
[0071]6.游離受體的病毒結合試驗
[0072]純化游離受體與PRRSV結合試驗參考報導的方法進行(文獻:Van BreedamWj Delputte PL,Van Gorp H，Misinzo G,Vanderheiiden N，Duan X，Nauwynck HJ.Porcinereproductive and respiratory syndrome virus entry into the porcine macrophage.1Gen Virol，2010，91 (Pt7):1659_1667)。取 50%Protein A Sefinose Bead Slurry (上海生物工程有限公司)100 μ L，分別與PBS或25 μ g具體實施方案4純化的pFc、Sn4D_Fc、SRCR5-Fc、SRCR59-Fc 混合，然後加入 VR2332 株 PRRSV，37°C孵育 90min，用 PBS 離心洗去未結合病毒，用試劑盒中的洗脫 液洗脫結合病毒，用RNAiso Plus Kit抽提病毒RNA，按照RevertAid? Reverse Transcriptase說明書反轉錄後，以下列PRRSV VP5特異引物進行PCR擴增。
[0073]正向引物:5-TTGAATGTTCAAGTATG_3(SEQID N0.13),
[0074]反向引物:5-ATCATTGCAGAAGTCGT-3(SEQID N0.14)。
[0075]結果顯示:游離受體Sn4D-Fc和SRCR59_Fc能與PRRSV結合，而SRCR5_Fc和豬Fe不能與PRRSV結合(圖6)。
[0076]7.游離受體的中和病毒作用檢測
[0077]在24孔板培養PAM細胞(IO6細胞/孔)，次日用PRRSV感染。先將PRRSV(感染指數=1)與 O、25、50、100 μ g/mL 純化豬 pFc、Sn4D_Fc、SRCR59_Fc 或 Sn4D-Fc+SRCR59_Fc 混合，37°C孵育I小時，然後接種PAM細胞培養。感染24h，用胰酶消化分散細胞，用4%多聚甲醛溶液室溫固定30min，各取IO5細胞，以PRRSV N蛋白單克隆抗體(美國Rural Technologies公司)進行流式細胞術分析。結果與豬Fe處理組相比:Sn4D-Fc、SRCR59_Fc單獨處理組的PRRSV陽性細胞數均下降55%，兩者共同處理組(Sn4D-Fc+SRCR59-Fc)的病毒陽性細胞數平均下降78%)，兩種游離受體對PRRSV感染具有協同抑制作用，且具有劑量依賴關係(圖7)。
[0078]8.重組腺病毒及其組合細胞轉導的抗病毒作用檢測
[0079]將3D4/21或PK-15細胞培養於24孔雙層培養板(CORNING公司)的上層作為供體細胞，PAM細胞培養於下層作為接受細胞。供體細胞用rAd-Sn4D-Fc、rAd-SRCR59-Fc單獨轉導或用rAd-Sn4D-Fc與rAd-SRCR59_Fc同時轉導(轉導指數=1)，設rAd-Fc轉導對照組，洗去未結合重組病毒後繼續培養48h。然後用VR2332株PRRSV感染PAM細胞(感染指數=0.5),感染後24h收穫病毒,按報導的方法在MARC-145細胞上進行病毒滴定(文獻:Jacobs AC, Hermann JR, Munoz-Zanzi C，Prickett JR, Roof MB, Yoon KJ.Stability ofporcine reproductive and respiratory syndrome virus at ambient temperatures.JVet Diagn Invest, 2010, 22:257_260)。結果與 rAd-Fc 轉導 3D4/21 細胞共培養組的 PRRSV滴度(5.61og TCID5tl)相比，與rAd-Sn4D-Fc、rAd-SRCR59-Fc單獨轉導細胞共培養的PAM細胞的PRRSV滴度分別下降1.0和1.1log,與兩種重組腺病毒同時轉導細胞共培養的PRRSV滴度下降3.51og (圖8);與rAd-Fc轉導PK-15細胞共培養組的PRRSV滴度(5.51og)相比，與rAd-Sn4D-Fc、rAd-SRCR59_Fc單獨轉導細胞共培養的PAM細胞的PRRSV滴度分別下降
1.1log,與兩種重組腺病毒同時轉導細胞共培養的PRRSV滴度下降3.81og (圖8)。
[0080]9.重組腺病毒表達的游離受體協同中和PRRSV感染的劑量關係檢測
[0081]將PK-15細胞培養於24孔雙層培養板上層，PAM細胞培養於下層。供體細胞用rAd-Sn4D-Fc和rAd-SRCR59_Fc同時轉導(轉導指數=1)，設rAd-Fc轉導對照組，洗去未結合重組病毒後繼續培養48h，用不同劑量VR2332株PRRSV感染PAM細胞，感染後24h收穫病毒，按上述方法進行病毒滴定。結果與rAd-Fc轉導細胞共培養組的PRRSV滴度相比，4個PRRSV接種劑量的PAM細胞與rAd-Sn4D-Fc和rAd-SRCR59_Fc同時轉導細胞共培養後，PRRSV滴度下降3.9~5.21og,兩者表達的游離受體對PRRSV感染的協同中和作用具有劑量依賴關係(圖9)。
[0082]10.重組腺病毒表達的游離受體協同中和PRRSV感染的動態檢測
[0083]將PK-15細胞培養於24孔雙層培養板上層，PAM細胞培養於下層，供體細胞用rAd-Sn4D-Fc與rAd-SRCR59_Fc同時轉導(轉導指數=1)，設rAd-Fc轉導對照組，洗去未結合重組病毒後繼續培養48h，用VR2332株PRRSV感染PAM細胞，感染後不同時間收穫病毒，按上述方法進行病毒滴定。結果與rAd-Fc轉導細胞共培養組的PRRSV滴度相比，與rAd-Sn4D-Fc和rAd-SRCR59_Fc同時轉導細胞共培養不同時間後，PAM細胞的PRRSV滴度下降3.8~4.61og，兩種重組腺病毒表達的游離受體對PRRSV感染的協同中和作用至少維持60h (圖 10)。
[0084]11.重組腺病毒表達的游離受體協同中和不同毒株PRRSV感染的檢測
[0085]將PK-15細胞培養於24孔雙層培養板上層，PAM細胞培養於下層，供體細胞用rAd-Sn4D-Fc和rAd-SRCR59_Fc同時轉導(轉導指數=1)，設rAd-Fc轉導對照組，洗去未結合重組病毒後繼續培養48h，PAM細胞分別用JXA1、CH-1R、VR2332株PRRSV感染，感染後24h收穫病毒，按上述方法進行病毒滴定。結果與rAd-Fc轉導細胞共培養組的PRRSV滴度相比，接種3株病毒的PAM細胞與rAd-Sn4D-Fc和rAd-SRCR59_Fc同時轉導細胞共培養後，PRRSV滴度分別下降4.1,4.3和4.21og (圖11)。
【權利要求】
1.表達豬繁殖與呼吸症候群病毒游離受體重組腺病毒組，是由表達豬唾液酸粘附素前4個IgV結構域和與豬IgG Fe片段融合蛋白的重組腺病毒，及表達脫衣殼受體⑶163第5_9個SRCR結構域與豬IgG Fe片段融合蛋白的重組腺病毒組成。
2.權利要求1所述重組腺病毒組在製備防治豬繁殖與呼吸症候群製劑中的應用。
3.權利要求1所述表達豬繁殖與呼吸症候群病毒游離受體重組腺病毒組的製備方法，其步驟如下: (O用化學合成法合成豬IgG重鏈信號肽序列，用反轉錄聚合酶鏈式反應擴增豬IgGFe片段、唾液酸粘附素前4個IgV結構域Sn4D和⑶163第5_9個結構域SRCR59編碼序列。 (2)將Sn4D與Fe融合序列插入腺病毒載體pShuttle_CMV，獲得重組載體pShuttle-Sn4D-Fc ;將豬IgG信號肽、SRCR59與Fe融合序列插入腺病毒載體pShuttle-CMV,獲得重組載體 pShuttle-SRCR59_Fc.(3)用步驟(2)獲得的兩種重組載體轉染AAV-293細胞，獲得重組腺病毒rAd-Sn4D_Fc和 rAd-SRCR59-Fc0 (4)用AAV-293細胞擴增重組腺病毒。
4.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於，步驟(2)是:將豬IgGFe片段編碼序列分別與Sn4D、SRCR59編碼序列融合，用Sn自身信號肽引導Sn4D_Fc融合蛋白分泌性表達，以豬IgG重鏈信號肽引導 SRCR59-FC融合蛋白分泌性表達。
【文檔編號】A61K31/14GK103525775SQ201310485894
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月16日 優先權日:2013年10月16日
【發明者】孫懷昌, 陳陽, 郭睿, 張鑫宇, 夏曉莉 申請人:揚州大學