篩選抗骨質疏鬆症藥物的材料和方法

2023-05-24 11:14:16

專利名稱：篩選抗骨質疏鬆症藥物的材料和方法
技術領域：
本發明涉及用於鑑別治療骨質疏鬆症的治療藥物的方法。本發明涉及分離、克隆並應用核苷酸，所述核酸含有命名為「雷洛昔芬(raloxifene)反應性元件」的新調節元件的哺乳動物轉化生長因子β基因的啟動子區域。本發明也包括用遺傳工程方法加工的含重組表達構建體的真核細胞，其中，將雷洛昔芬反應性元件與報導基因可操作地相連。在所述細胞中，雷洛昔芬反應性元件能夠應答用特定化合物進行的治療而調節報導基因的轉錄。本發明也涉及鑑別抗骨質疏鬆症藥物的方法，所述藥物經雷洛昔芬反應性元件誘導特定基因的轉錄，但不會特異性誘導與雌激素替代療法相關的有害或令人討厭的副作用，如增加患子宮和乳腺癌的危險。本發明的核酸、細胞和方法提供篩選推測的抗骨質疏鬆藥物的來源並將其加以鑑定的有效方法。所述藥物的優點在於沒有與目前抗-骨質疏鬆藥物相關的令人討厭的副作用。本發明也誘導骨形成的方法，治療骨質疏鬆的方法，治療骨折的方法，包括施用與雌激素受體結合的、有效誘導雷洛昔芬反應性元件轉錄的化合物。
在1991年，美國的藥物公司花費了約7.9億美元用於研製鑑定新的治療藥物(藥物製造商協會)。該數量之巨大部分是由於必須對成百(如果不是上千)種化合物進行試驗，以便鑑定一種不會產生不可接受水平的不令人滿意或有害的副作用的有效治療藥物。迫切要求經濟地試驗大量化合物的方法，以便快速鑑別在治療疾病中可能有效的那些化合物。目前，還沒有這種經濟的系統存在。
明顯缺乏一種迅速的方法來篩選大量潛在治療藥物的一種疾病是骨損失。骨損失發生於各種各樣的患者中，包括經受子宮切除術患者、正在或已經長期施用皮質類固醇者、Cushing氏綜合症或性腺發育不全的患者以及絕經後的婦女。
骨損失的機制還不是很清楚，但從實際結果看，這種疾病起因於新的健康骨的形成與舊骨吸收之間的不平衡，造成骨組織的淨損失。這種骨損失包括骨礦物質與蛋白質基質成分的減少，並導致明顯增加股骨和前臂及脊椎骨的骨折率。這些骨折又導致普遍增加的發病率，身高和活動性的明顯喪失，且在許多情況下，增加了併發症引起的死亡率。
未曾遏止的骨損失可以導致骨質疏鬆症這種消耗性疾病，其主要特徵是骨質量減少而骨體積沒有減小(減小了密度而擴大了骨空間)，產生多孔性和易折性。在絕經後的婦女中，骨質疏鬆是一種最普遍的骨疾病，僅在美國就影響約20到25百萬婦女。
絕經後骨質疏鬆的主要特徵是由於卵巢停止生產雌激素，而造成骨質量的大量迅速地損失。的確，資料清楚地表明，雌激素具有限制骨質、疏鬆骨損失發展的能力，並且，在美國和許多其它國家，雌激素替代是絕經後骨質疏鬆公認的治療方法。
以低水平施用雌激素時，對骨有好的影響，但長期的雌激素替代療法已引起各種疾病，包括增加子宮和乳腺癌的危險。這些嚴重的副作用使得許多婦女拒絕這種治療方法。其它可減少癌症危險的治療方法，如孕激素與雌激素的結合施用，使得某些患者有規律地撤退性失血，對於大多數老年婦女是不能接受的。擔心這些與雌激素替代療法有關的明顯令人不滿的副作用。以及雌激素逆轉存在的骨損失的能力有限，提供了一種強動力，促使研製其它可有效治療骨損失但不引起令人討厭的副作用的治療方法。
在骨質疏鬆治療中，另一種方法是使用抗雌激素。通常，抗雌激素抑制(拮抗)體內的雌激素活性。抗雌激素與雌激素受體結合，儘管認為抗雌激素與雌激素受體之間的相互作用涉及雌激素結合的受體的不同區域。一些抗雌激素一方面表面為激動劑與拮抗劑特性的藥物學特性。另一方面，這些化合物產生某些類似雌激素的效果，同時在表達受體的細胞中，拮抗通常與施用雌激素相同的其它作用。由於某些抗雌激素的這種混合作用，它們發生與雌激素替代療法相關的相等反作用。
已知表現出上述混合的激動劑/拮抗劑作用的一種抗雌激素是三苯氧胺，一種用於乳腺癌治療的藥物。在降低乳腺腫瘤生長的能力方面，三苯氧胺作為一種雌激素拮抗劑而起作用，在降低健康和患乳腺癌婦女血清膽固醇含量的能力方面，它又作為一種激動劑而起作用(Love等人，Annals Int. Med.，115，860-864(1991))。三苯氧胺也可以增加乳腺癌患者的骨密度(Love等人，N.Eng.J.Med.，326，852-856(1991))。至少有一項研究表明，用三苯氧胺引起的可能的骨密度增加限於腰椎，而在用三苯氧胺治療的某些乳腺癌患者範圍內，報導的是骨損失。此外，已經表明三苯氧胺治療會增加絕經後婦女的體重(Love等人，Ann.Int.Med.，同上)。
明顯地需要改進的抗骨質疏鬆劑，它可以增加骨密度而不會引起副作用。不幸地是，目前還沒有迅速且有效地篩選大量化合物的方法，以鑑定表現所需的抗骨質疏鬆作用的化合物。由於這種篩選方法在鑑定改進的抗骨質疏鬆化合物中要消耗大量的時間和錢財，所以非常需要研製一種快速試驗大量化合物的方法，以鑑定可能具有抗骨質疏鬆作用的化合物。
已經肯定，雌激素通過與雌激素受體結合而發揮作用，然後，雌激素/雌激素受體複合物與DNA結合。該激素/受體複合物經這種DNA結合來調節基因表達(Kumar，Cell 55，145-156(1988))。抗雌激素也與雌激素受體結合。儘管這些抗雌激素/受體複合物也與DNA結合，但通常它們不能調節基因表達。雌二醇/雌激素受體複合物和羥三苯氧胺/雌激素受體複合物均在體內與稱作雌激素反應性元件的DNA結合區結合(Kumar，Cell出處同上)。
配體/受體複合物的構型是某些爭論的問題。然而，最近的研究表明，在與雌二醇結合的雌激素和與4-羥三苯氧胺或ICI 164，384結合的相同雌激素受體間存在構型差異(Klinge等人，J.Ster.Biochem.Mol.Biol.43，249-262(1992))。
在努力合理地找出發展改進的抗骨質疏鬆藥物的問題過程中，研究人員已研究了在骨維持中起作用的已知蛋白質。已知影響骨重建和骨代謝的一種蛋白質是轉化生長因子β(TGFβ)。儘管普遍認為是一個單個化合物，但實際上，現在已經知道TGFβ是一個分子家族，包括至少三種異構體TGFβ-1、TGFβ-2和TGFβ-3。(參見Arrick等人，Canc.Res.50，299-303(1990))。本發明人注意到，卵巢切除會引起大鼠骨中TGFβ-3的顯著減少(本發明人收集的資料未公開);其他人也注意到關於TGFβ(不特別說明異構體)水平的相同的關係。(參見Finkelman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，12190-12193(1992))。另外，本發明還發現給卵巢切除的大鼠施用雷洛昔芬(一種抗雌激素)，這種大鼠會貯存TGFβ-3濃度，達到等於或高於對照動物中所發現的水平。TGFβ-3水平與雌激素或抗雌激素循環水平之間的直接關係，以及TGFβ(不特別說明異構體)在骨重建和代謝中起顯著作用的發現，說明骨質疏鬆可能是由於體內TGFβ-3的表達降低而引起的。(參見Noda等人，Endocrin.12，2991-2994(1989))。
TGFβ從大量來源中分離出來表現出各種不同作用的發現削弱了TGFβ-3水平的降低會引起骨損失的假設。例如，它抑制間質細胞和上皮細胞的生長，它誘導蛋白多糖、纖維蛋白連接素、纖溶酶原激活劑的生物合成，並且對於成纖維細胞、巨噬細胞和平滑肌細胞具化學趨向性。(參見Flaumenhaft等人，J.Cell.Bio.120(4)，995-1002(1993))。
此外，抗雌激素如三苯氧胺，或託瑞米芬(toremifene)誘導人胎兒成纖維細胞在沒有雌激素受體的情況下分泌TGFβ(沒有涉及異構體)。(Colletta等人，Br.J.Cancer.62，405-409(1990))。已經發現TGFβ刺激成骨細胞的骨形成並抑制破骨細胞的形成和破骨細胞的活性。(Mundy，「Clinical Application of TGFβ」，Ciba Fourdation Symposium No.157，137-151，Wiley，Chichester)。TGFβ抑制一種人子宮內膜癌細胞系(Ishikawa)的分裂，但對於另一種上述細胞系(HEC-50)則是促分裂的。Murphy等人，J.Ster.Biochem，Molec.Bio.，41，309-314(1992))。
在乳腺癌活組織檢查中，用三苯氧胺進行的3個月的抗雌激素治療與細胞外TGFβ-1的誘導有關。(Butta等人，Cancer Res.，52，4261-4264(1992))。當將一種人子宮內膜癌細胞系(HEC-50)暴露於雌二醇或某種抗雌激素時，在含1% ctFBS(木炭兩次解吸過的FBS)的培養基中生長的所述細胞中發現TGFβ-1mRNA的濃度有所降低。(Gong等人，Canc.Res.52，1704-1709(1992))。
用T-47D和MDA-MB-231細胞系表達TGFβ-2。用雌二醇處理這些細胞系降低了TGFβ-2mRNA的表達，但三苯氧胺沒有表現出相同的作用。TGFβ-3在富集骨細胞培養物的成骨細胞中以比TGFβ-1高3到5倍的速率誘導有絲分裂、膠原合成、鹼性磷酸酶活性(Arrick等人，Canc.Res.50，299-303(1990))。
在Sporn等人的J.Cell Bio.，105，1039-1045(1987);Massague，Cell，49，437-438(1987)，和Moses，Cell，63，245-247(1990)中綜述了TGFβ的一般特性。這些文獻一般性地描述了TGFβ在體外和體內系統中表現的特性。
上述的表達複合模型表明各種TGFβ異構體的表達調節是一個獨特複雜的機制。已經克隆並描述了基因TGFβ-1，TGFβ-2和TGFβ-3各自的啟動子區(Kin等人，J.Biol.Chem.，264，402-408(1989);Noma等人，Growth Factor，4，247-255(1991);Lafyatis等人，J.Biol.Chem.265，19128-12136(1990))。
已經描述了TGFβ-2和TGFβ-3啟動子的特徵，並報導它們含cAMP反應性元件、AP-1位點、AP-2位點和SP-1位點。Noma等人指明TGFβ-2啟動子活性取決於所研究的啟動子區域和誘導測定所選的細胞系。
在國際專利申請No.PCT/US92/00419中描述了至少一種用於篩選大量化合物的生物學活性的方法，該申請在權利要求中要求了轉錄調節生長因子表達的方法。該專利公開了鑑定化合物的檢測方法，所述化合物能夠通過人生長激素基因的啟動子區、c-ErbB2基因、K-ras序列的啟動子和巨細胞病毒的早期啟動子和增強子誘導轉錄。該申請主要是針對確定各種癌基因的調控的問題。
到目前為止，鑑定可能表現抗骨質疏鬆作用的化合物實際上要求在流行病學研究的基礎上隨機研究各個化合物，在達到所需效果和其它時間消耗及無效方法方面，利用有關的化合物。由目前篩選方法和所述無效試驗的經濟花費引起的推延迫切需要經濟有效的方法，來鑑別值得進一步研究的潛在的抗骨質疏鬆藥物。


圖1描述了TGFβ-1基因的啟動子區。
圖2描述了TGFβ-2基因的啟動子區。
圖3描述了TGFβ-3基因的啟動子區。
圖4描述在存在對照化合物、雌激素、雷洛昔芬、三苯氧胺的情況下，在表達構建體轉染的細胞中報導基因的相對表達水平，所述構建體含有與CAT基因可操作連接的TGFβ-1啟動子，與CAT基因可操作連接的TGFβ-2啟動子，或與CAT基因可操作連接的TGFβ-3啟動子。通常，含TGFβ-3構建體的細胞表達最高水平的報導基因，接著是含TGFβ-2構建體和TGFβ-1構建體的細胞。
圖5描述存在雌激素，雷洛昔芬和雌激素與雷洛昔芬結合物的情況下，在雌激素反應性元件或部分TGFβ-3啟動子的控制下報導基因的誘導。該圖說明兩種調節序列所表現出的明顯不同的調節方式。
圖6是一個柱形圖，說明存在及缺乏雌激素受體的情況下，在用含部分TGFβ-3啟動子序列的表達構建體轉染並暴露於對照化合物、雌激素、雷洛昔芬、和雌激素與雷洛昔芬結合物的細胞中，報導基因表達的相對水平。雌激素受體對於由雌激素和抗雌激素誘導報導基因的表達是必需的。
圖7描述由實施例Ⅺ中列出的缺失構建體表達的雌激素受體(ER)的各個區域。另外，表示出在用各種ER突變體和含TGFβ-3啟動子和螢光素酶基因的表達構建體轉染的細胞中，可達到的相對倍數誘導作用。
圖8描述存在各種濃度雌二醇、雷洛昔芬、三苯氧胺和ICI 164，384的情況下，在用含有TGFβ-3啟動子和CAT基因轉染的細胞中，可達到的報導基因的表達水平。概括地說，雷洛昔芬在全部各種濃度下均是最強的誘導劑，接著是ICI 164，384、三苯氧胺，在該系統中，雌激素是最弱的誘導劑。
圖9描述存在各種濃度雌二醇和雷洛昔芬的情況下，在用含有部分TGFβ-3啟動子和螢光素酶基因的表達構建體轉染的CHO細胞中，報導基因的有關表達。概括地說，雷洛昔芬除在低濃度外，都是較強的誘導劑。
圖10描述存在各種深度雌二醇和雷洛昔芬的情況下，在用含有TGFβ-3啟動子和螢光素酶基因的表達構建體轉染的MCF-7細胞中，報導基因的有關表達。在所有濃度下，雷洛昔芬都是較強的誘導劑。
圖11代表實施例Ⅹ中估計的化合物的化學結構。
圖12表示在用TGFβ-3啟動子/CAT表達構建體轉染並暴露於實施例Ⅹ所列的各種濃度化合物的MG63細胞中，報導基因表達的相對誘導水平。總之，化合物177366是最強的誘導劑，而98005沒有誘導作用。
圖13描述用於鑑定41個鹼基對的雷洛昔芬反應性元件的部分TGFβ-3啟動子，並描述在用質粒轉化的細胞中，雷洛昔芬對報導基因表達的有關誘導，所述質粒含有與報導基因可操作相連的TGFβ-3啟動子序列被指示部分。儘管用pB-301構建體達到的誘導倍數最高，但雷洛昔芬反應性元件(鹼基+35至+75)的存在，對於這些細胞中雷洛昔芬明顯誘導的轉錄顯然是必需的。
圖14描述對TGFβ-3啟動子的分析。按實施例Ⅺ中的說明，描述了主要的轉錄起始位點和CCCTC-基序。
圖15描述存在雌激素受體和各種濃度雌二醇及雷洛昔芬的情況下，在用含有LDLR啟動子和螢光素酶基因的表達構建體轉染的Hep 2細胞中，報導基因的有關表達。總之，雷洛昔芬是較強的誘導劑。
圖16描述存在各種深度雌二醇和雷洛昔芬但沒有雌激素受體的情況下，在用含有LDLR啟動子和螢光素酶基因的表達構建體轉染的Hep 2細胞中，報導基因的有關表達。在等於或低於10-6M的濃度時，任何一種化合物均不表現出誘導作用。高濃度雷洛昔芬誘導一些表達，這表明在所述濃度下的一種不同的、非-ER依賴性誘導機制。
圖17是一個流程圖，舉例說明可按本發明教導完成的步驟順序，以便評估化合物誘導與本文描述的調控元件可操作連接的報導基因轉錄的能力。期望在表現出實施例ⅩⅢ所述誘導模式的化合物與能夠作為活體內抗骨質疏鬆藥物起作用的所述化合物之間存在一種相互關係。
根據本發明，提供了新穎且有效的篩選化合物的方法，以確定這些化合物是否能夠調節來自含有雷洛昔芬反應性元件的啟動子的甾類激素-反應性基因的表達。也提供了基本由含有從TGFβ基因啟動子區分離的雷洛昔芬反應性元件的核苷酸序列組成的核酸及用其轉染的真核細胞。也提供了一種重組表達構建體，含有與報導基因可操作連接的雷洛昔芬反應性元件。也提供了一種治療骨折的方法，一種治療骨質疏鬆症的方法，一種治療骨折的方法，包括施用一種化合物，當它與雌激素受體結合時，能夠誘導從TGFβ基因啟動子區開始的雷洛昔芬反應性元件的轉錄。
本發明涉及新穎且有效的篩選化合物的方法，以確定那些化合物是否能調節由始自含有本文發現並描述的雷洛昔芬反應性元件的哺乳動物啟動子甾類激素-反應性基因的表達。本發明包括基本由含上述雷洛昔芬反應性元件的哺乳動物啟動子組成的核酸。在優選的實施方案中，含有雷洛昔芬反應性元件的啟動子得自人TGFβ-3或TGFβ-2基因的啟動子區。
本發明還包括含有啟動子的真核表達構建體，所述啟動子帶有與報導基因可操作相連的雷洛昔芬反應性元件。在優選的實施方案中，報導基因是氯黴素乙醯基轉移酶基因或螢光素酶基因。特別優選的是螢光素酶基因。本發明也提供用所述真核表達構建體轉染的細胞，當所述細胞暴露於雷洛昔芬或其它抗雌激素化合物時，能表達報導基因。
本發明還包括誘導骨形成的方法，包括施用有效量的一種化合物，當它與雌激素受體結合時，能夠從TGFβ-3基因啟動子區的雷洛昔芬反應性元件誘導轉錄。本發明也提供一種治療骨折的方法，包括施用有效量的一種化合物，當它與雌激素受體結合時，能夠從TGFβ-3基因啟動子區的雷洛昔芬反應性元件誘導轉錄。
在第一方面，本發明提供基本由含有雷洛昔芬反應性元件的核苷酸序列組成的核酸，其中所述元件來自哺乳動物，優選的是人的轉化生長因子β基因的啟動子區。在優選的實施方案中，轉化生長因子β基因是從TGFβ-2基因或人TGFβ-3基因。在本發明這一方面進一步優選的實施方案中，所述核酸基本由如本文進一步描述的下列質粒中的TGFβ-3基因的啟動子序列組成質粒pB-301(含位置-301到+110的TGFβ-3啟動子序列)、pB-221(含位置-221到+110的TGFβ-3啟動子序列)、pB-91(含位置-91到+110的TGFβ-3啟動子序列)、pB-60(含位置-60到+110的TGFβ-3啟動子序列)、pB-47(含位置-47到+110的TGFβ-3啟動子序列)、pB-38(含位置-38到+110的TGFβ-3啟動子序列)。
在第二方面，本發明提供含有核酸的重組表達構建體，所述核酸基本由含有與報導基因可操作相連的雷洛昔芬反應性元件的核苷酸序列組成，其中，所述元件來自哺乳動物，優選的是人的轉化生長因子β基因的啟動子區。在優選的實施方案中，轉化生長因子β基因是人TGFβ-2基因或人TGFβ-3基因。在優選的實施方案中，報導基因是氯黴素乙醯基轉移酶基因或螢光素酶基因。特別優選的是螢光素酶基因。在本發明這一方面進一步優選的實施方案中，所述核酸含有基本由TGFβ-3基因啟動子序列組成的啟動子序列，所述TGFβ-3基因啟動子序列含有如在本文進一步描述並與報導基因可操作相連的質粒pB-301(含位置-301到+110的TGFβ-3啟動子序列)、pB-221(含位置-221到+110的TGFβ-3啟動子序列)、pB-91(含位置-91到+110的TGFβ-3啟動子序列)、pB-60(含位置-60到+110的TGFβ-3啟動子序列)、pB-47(含位置-47到+110的TGFβ-3啟動子序列)、pB-38(含位置-38到+110的TGFβ-3啟動子序列)。
另一方面，本發明的重組表達構建體能夠在用上述構建體轉染的真核細胞中表達由所述構建體編碼的報導基因。在優選的實施方案中，所述真核細胞還表達一個雌激素受體蛋白或其突變衍生物。在特別優選的實施方案中，通過用雷洛昔芬或本文定義的其它抗-雌激素化合物處理所述細胞，能夠誘導由本發明重組表達構建體所攜帶的報導基因的表達。
本發明第三方面提供將本發明重組表達構建體導入其中的真核細胞。在優選的實施方案中，所述真核細胞是用本發明重組表達構建體轉染的細胞。在優選的實施方案中，本發明的真核細胞表達雌激素受體或其突變衍生物。在特別優選的實施方案中，通過用雷洛昔芬或本文所定義的其它抗-雌激素化合物處理所述細胞，能夠誘導報導基因在所述細胞中的表達。
本發明也提供篩選多種化合物的方法，以鑑別可作為抗骨質疏鬆藥物的那些化合物。本發明該實施方案的一個方面是提供篩選多種化合物的方法，以鑑別可作為抗骨質疏鬆藥物的那些化合物。由本發明這一方面提供的方法包括從多種化合物中鑑別能從哺乳動物啟動子雷洛昔芬-反應性元件誘導轉錄的化合物，它是一種特異性的轉錄誘導劑，不能從哺乳動物啟動子雌激素反應性元件誘導轉錄，並且是一種抗雌激素或非雌激素化合物。由該實施方案提供的方法還包括步驟(a)檢測化合物誘導從哺乳動物啟動子雷洛昔芬反應性元件轉錄的能力;(b)檢測化合物缺乏從沒有雷洛昔芬反應性元件的哺乳動物啟動子誘導轉錄的能力;(c)檢測化合物不能從雌激素反應性啟動子誘導轉錄的能力;和(d)檢測化合物在存在雌激素的情況下，抑制雌激素誘導的從雌激素反應性啟動子轉錄的能力。
在優選的實施方案中，(a)部分的檢測還包括確定所述化合物誘導與含有雷洛昔芬反應性元件的哺乳動物啟動子可操作相連的報導基因表達的能力的步驟。在另一優選的實施方案中，(b)部分的檢測還包括確定所述化合物不能誘導與哺乳動物啟動子可操作相連的報導基因表達的能力的步驟，其中，所述啟動子不含有雷洛昔芬反應性元件。本發明這一方面的另一優選的實施方案提供(c)部分的檢測還包括確定所述化合物不能誘導與雌激素反應哺乳動物啟動子可操作相連的報導基因表達的能力的步驟。在最後優選的實施方案中，本發明提供的(d)部分的檢測還包括確定所述化合物在雌激素存在情況下，抑制與雌激素反應哺乳動物啟動子可操作相連的報導基因的雌激素依賴性誘導表達的能力的步驟。
在本發明這一方面特別優選的實施方案中，雷洛昔芬反應性哺乳動物啟動子分離自哺乳動物優選的是人的轉化生長因子β基因。最優選的實施方案是，其中轉化生長因子β基因是人的TGFβ-2基因或人TGFβ-3基因。在其它優選的實施方案中，報導基因是氯黴素乙醯基轉移酶基因或螢光素酶基因。在本發明這一方面其它優選的實施方案中，雷洛昔芬反應性啟動子序列基本上由TGFβ-3基因的啟動子序列組成，所述啟動子序列含有質粒pB-301(含位置-301到+110的TGFβ-3啟動子序列);pB-221(含位置-221到+110的TGFβ-3啟動子序列)、pB-91(含位置-91到+110的TGFβ-3啟動子序列)、pB-60(含位置-60到+110的TGFβ-3啟動子序列)、pB-47(含位置-47到+110的TGFβ-3啟動子序列)、pB-38(含位置-38到+110的TGFβ-3啟動子序列)。它們如本文將進一步描述的，並可操作地與報導基因相連。
從對特定優選的實施方案和權利要求的更詳細描述中，可使本發明具體優選的實施方案變得清楚明白。
本說明書包括許多縮寫。本文所用的「TGFβ」指轉化生長因子β(不涉及異構體)。TGFβ-1、TGFβ-2和TGFβ-3具有本領域確定的意思，即代表轉化生長因子β基因的三種已知的異構體。本文所用的縮寫「CAT」表示氯黴素乙醯基COA轉移酶。「雌二醇」是一種雌激素，本文有時縮寫為E2。本文所用的縮寫「ER」表示雌激素受體蛋白質。
本文所用的術語「雷洛昔芬反應性元件」指含有哺乳動物TGFβ基因啟動子區核酸的核苷酸序列。所述啟動子區能夠誘導在暴露於雷洛昔芬和雌激素受體蛋白的宿主細胞中與雷洛昔芬反應性元件可操作相連的任何結構基因的轉錄。雷洛昔芬反應性元件包括，但不限於含有如在本文中進一步描述的下列質粒的TGFβ啟動子序列的核苷酸序列和與那些具有與之基本相同生物學活性的核酸，所述質粒為質粒pB-301(含位置-301到+110的TGFβ-3啟動子序列)、pB-221(含位置-221到+110的TGFβ-3啟動子序列)、pB-91(含位置-91到+110的TGFβ-3啟動子序列)、pB-60(含位置-60到+110的TGFβ-3啟動子序列)、pB-47(含位置-47到+110的TGFβ-3啟動子序列)、pB-38(含位置-38到+110的TGFβ-3啟動子序列)。該定義包括在TGFβ基因啟動子區的天然等位基因變異體。可以從任何種哺乳動物TGFβ啟動子，但最好是人的，得到分離的本發明雷洛昔芬反應性元件。
本文所用的抗雌激素包括全部和部分雌激素拮抗劑。本文描述的實施例中所用的所有雌二醇是17β-雌二醇。
術語「有效量」指化合物的量，當給哺乳動物施用時，所述化合物與雌激素受體結合，能夠誘導雷洛昔芬反應性元件的轉錄。根據具體的環境，包括施用的化合物、施用途徑、被治療的具體條件以及類似的考慮來確定所施用化合物的具體劑量。
術語「有效地」指當在本文描述的體外檢測中測試所述化合物時(參見實施例Ⅴ、Ⅵ、Ⅹ和ⅩⅣ)，化合物以低於或等於10nM(1×10-8M)的最小有效濃度與雌激素受體結合，誘導從雷洛昔芬反應性元件的轉錄。
根據其距離、核苷酸數、從基因的主要轉錄起始位點(在圖1-3中將該起始位點作為+1)開始來鑑別所有部分的啟動子序列。數字前的負號(-)表示5′到起始位點的核苷酸序列，數字前的正號表示3′到起始位點的核苷酸。用SEQ ID NO 1-3中標明的數字鑑別這些序列，並且與圖1-3的數字對應。
從本公開的角度，可以用化學合成法、體外擴增[包括但不限於聚合酶鏈反應(PCR)]或從天然產生的來源(如哺乳動物細胞培養物、來自所述細胞的基因組DNA或所述DNA的文庫)或將這些方法結合起來得到編碼本發明雷洛昔芬反應性元件的DNA。
可以將雷洛昔芬反應性元件有效地與報導基因可操作相連並通過使用適當的載體、構建體及本領域熟知的方法，如DNA介導的基因轉移方法(包括但不限於轉染、電穿孔和病毒介導的感染)瞬時或穩定地轉化適當的宿主細胞。本文所用的術語「重組表達構建體」是指能夠直接表達與本發明雷洛昔芬反應性元件可操作相連的報導基因的DNA構建體。
當DNA區彼此在功能上有關時，它們是可操作相連的。例如，如果一個啟動子能控制一個編碼序列的轉錄，則它與該序列是可操作相連的;如果可將一個核糖體結合位點定位以便進行翻譯，則它與編碼序列是可操作相連的。
可以用標準方法，如酶活性測定、比色法、化學發光法、樣品中存在的放射性、ELISA、抗體結合、放射免疫或本領域專業人員已知的定量方法將編碼結構蛋白的報導基因定量，可根據所選的宿主和所選的轉化方法改變所用的報導基因。有用的報導基因包括但不限於氯黴素乙醯基轉移酶、螢光素酶、β-半乳糖苷酶、鹼性磷酸酶或任何其它可確定數量的蛋白質產品。在本發明優選的實施方案中，報導基因是螢光素酶。
轉染細胞是用經重組DNA技術生產的雷洛昔芬反應性元件-報導基因重組表達構建體轉染的細胞。已經用重組雷洛昔芬反應性元件-報導基因表達構建體轉染的細胞(作為所述細胞的特徵或由於雌激素受體編碼表達構建體的共轉染)將在適當的環境下(即暴露於一種抗雌激素或其它誘導劑)表達報導基因的基因產物。例如，適用於本發明的一個優選的細胞系MCF-7，能夠表達雌激素受體。對於所述細胞系，單獨用重組雷洛昔芬反應性元件-報導基因表達構建體轉染，可以產生適用於本發明的細胞。另外，MG63細胞以雷洛昔芬-依賴性方式表達報導基因，僅當雷洛昔芬反應性元件-報導基因表達載體和雌激素受體表達載體的共轉染時。
由多細胞生物得到的細胞培養物是適於表達雷洛昔芬反應性元件-報導基因表達構建體的宿主。理論上講，可以使用任何天然表達雌激素受體或經遺傳工程方法修飾的表達雌激素(或其部分受體)的高等真核細胞。如在實施例中所說明的，哺乳動物細胞是優選的。在細胞培養物中繁殖所述細胞已成為一種常規方法。(參見Tissue Culture，Academic Press，Kruse Patterson，編輯(1973))。有用的宿主細胞的實例是MCF-7、MG63、HeLa、RL95.2、Hep G2和CHO細胞(所有的均可從美國典型培養物收集中心，Rockville，Maryland得到)。根據本發明的目的。使用MCF-7細胞系是特別優選的，由於該細胞系可以表達雌激素受體。
按下文實施例所述，可以用表達雌激素受體或部分受體並含有雷洛昔芬反應性元件-報導基因表達構建體的宿主細胞評估化合物通過雷洛昔芬反應性元件誘導轉錄的能力。在本發明優選的實施方案中，如果存在化合物比沒有化合物的情況下，報導基因的表達可增加2倍，就認為該化合物經調節元件(包括但不限於從TGFβ啟動子或其缺失構建體得到的核酸)可誘導轉錄。在不太優選的實施方案中，如果化合物誘導的轉錄比對照高50%，則認為化合物是轉錄誘導劑。然而，總之，上述可檢測的誘導足以表明由化學化合物生產的誘導。
在本發明具體篩選方法的實踐中(見實施例ⅩⅢ)，由於質粒pB-301表現出對雷洛昔芬的高水平反應性，所以使用該質粒是優選的。其它實施方案使用含有包括位置-38到+75 TGFβ-3啟動子區的構建體。在本發明所有操作實施方案中，將雷洛昔芬反應性元件以能夠轉錄的方式與報導基因可操作相連，由於該元件對於允許本文描述的雷洛昔芬反應誘導是必需的。
完成本發明篩選方法步驟的順序可以改變，在某些情況下，有些步驟可以取消。下列實施例是本發明說明性的具體的實施方案和其各種用途。它們僅僅用於解釋目的，而不以任何方式限制本發明。
實施例1構建報導質粒A.phTG12、pTGF-1和pB-499作為開發用於篩選用效抗骨質疏鬆藥物的細胞系的第一步，首先是從A. Roberts，National Institutes of Health，Laboratory of Chemoprevention(NIH/NCI，Bethesda，MD)得到一系列編碼氯黴素乙醯轉移酶基因(CAT)(Gorma等人，Molec.Cell.Biol.，2，1044-1051(1982))的報導質粒，其中的CAT基因經操作連接至TGFβ-1、TGFβ-2和TGFβ-3基因的啟動子序列上。這些質粒分別被命名為phTG12(TGFβ-1)、pTGF-1(TGFβ-2)和pB-499(TGFβ-3)。編碼上述啟動子的每個序列可見於下列文獻，即Kim等人，J. Biol. Chem.，264，402-408(1989))(TGFβ-1);Noma等人，Growth Factor，4，247-255(1991)(TGFβ-2)和Lafyatis等人，J.Biol.Chem.，265，19128-19136(1990)(TGFβ-3)。TGFβ-1的啟動子序列已被遞交到GenBank/EMBL資料庫，入藏登記號為JO 4431。TGFβ-1、TGFβ-2和TGFβ-3啟動子序列分別示於圖1、圖2和圖3中，並分別以SEQ IC NO∶1、SEQ IC NO∶2和SEQ ID NO∶3表示。
另外，利用常規的克隆技術(參見Sambrook，Fritsch，and Maniatis，Molecular CloningA Laboratory Manual，2d ed.，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Horbor，New York，下文稱為Sambrook等人)將每一TGFβ啟動子亞克隆到一個商售的CAT構建體(例如，以pCAT為基礎的CAT構建體，Promega，Madison，WI)中即可生產經操作與每一TGFβ啟動子序列相連的含CAT的報導質粒。
為了鑑定應答抗雌激素雷洛昔芬的TGFβ-3基因啟動子區，分析了由含有部分TGFβ-3基因啟動子序列的構建體指導下的CAT報導基因的表達。從A.Roberts獲得六個TGFβ-3啟動子缺失/CAT報導構建體。這些質粒的命名及每一質粒中所含啟動子區的範圍如下pB-301 -301-+110(對應於圖3和SEQ ID NO∶3中的1896-2306)pB-221 -221-+110(對應於圖3和SEQ ID NO∶3中的1976-2306)pB-91 -91-+110(對應於圖3和SEQ ID NO∶3中的2106-2306)pB-60 -60-+110(對應於圖3和SEQ ID NO∶3中的2137-2306)
pB-47 -47-+110(對應於圖3和SEQ ID NO∶3中的2150-2306)pB-38 -38-+110(對應於圖3和SEQ ID NO∶3中的2159-2306)如下所述構建另外兩個TGFβ-3啟動子缺失構建體。其中的第一個構建體含有對應於啟動子序列中-38-+75位的人TGFβ-3啟動子區序列，這段序列相當於圖3和SEQ ID NO∶3中的2159-2271(參見Lafyatis等人，出處同上)。第二個啟動子缺失構建體包含對應於啟動子序列中-38-+35位的人TGFβ-3啟動子區序列，這段序列相當於圖3和SEQ ID NO∶3中的2159-2231。在本領域中完善建立的手段將用於鑑定自轉錄起始位點的距離開始需被鑑定的所有啟動子序列。
上述質粒的製備過程如下，利用DNA/RNA合成儀(Model 394，Applied Biosytems Inc.，Foster City，CA)根據製造商的說明在β-氰乙基磷醯胺糖醇合成條件下合成對應於每一質粒所需的TGFβ-3啟動子序列長度的寡核苷酸。利用常規方法(Sambrook et al.，出處同上)合成，純化和混合用於每個質粒構建體的寡核苷酸互補對，並使之退火形成對應於合適TGFβ-3啟動子序列的雙鏈DNA。合成HindⅢ和XbaⅠ限制性酶識別位點分別在序列的3′和5′端作為適宜的突出末端。然後將雙鏈啟動子序列連接到經HindⅢ/XbaⅠ消化的CAT報導質粒pB-301上，並在標準條件下於細菌中增殖。以此產生的含TGFβ-3啟動子-38-+75區的報導質粒稱為pTGFβ+75CAT，而含有TGFβ-3啟動子的-38-+35區的質粒被稱為pTGFβ+35CAT。這些質粒如下面的實施例Ⅴ所述用於CAT檢測中。
B.含有TGFβ-3啟動子缺失構建體的螢光素報導質粒及不含啟動子區的對照質粒pTGFβ-301LUC、pTGFβ-38LUC、pTGFβ+75LUC、pTGFβ+35LUC和pLUC構建四種含有在TGFβ-3啟動子序列的轉錄調控下被表達的螢光素酶基因(REF)及其改變的缺失之衍生物的質粒。質粒pTGFβ-301LUC的製備是通過用HindⅢ消化pB-301，然後用細菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段(Boehringer-Mannheim，Indianapolis，IN)進行處理使HindⅢ消化產生的突出末端平端化。用XbaⅠ消化，釋放出對應於-301-+110位的TGFβ-3啟動子部分。該片段被亞克隆入SamⅠ/XbaⅠ消化的pSP73(Promega)中，產生穿梭載體pSPTGFβ-301。
在細菌體內進行擴增後，用NdeⅠ和HindⅢ消化被分離和純化的pSPTGFβ-301的製備物，在經0.8%瓊脂糖凝膠(BRL-Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD)電泳分開後分離含啟動子序列的片段。用NdeⅠ/HindⅢ消化含螢光素酶的構建體pLDLRLUC10(如1993年3月3日申請、申請號為08/018，985的美國專利申請所描述，並被進一步描述於下文的C部分中)，並在經瓊脂糖凝膠電泳後純化。然後混合、連接這些分離的片段，並用於轉化細菌(Sambrook等人，出處同上)。
通過BamHⅠ/XbaⅠ雙酶切的消化作用分別從pB-38、pTGFβ+75CAT和pTGFβ+35CAT中首先切除TGFβ-3的啟動子序列構建質粒pTGFβ-38LUC、pTGFβ+75LUC和pTGFβ+35LUC。用NheⅠ/BamHⅠ消化製備以pGL2為基礎的含螢光素酶的質粒(或「pGL2LUC」)(Promega)並通過將適宜的TGFβ-3啟動子序列連接入含螢光素酶的質粒而製備每一種重組質粒。這些質粒將被用於下面的實施例Ⅵ中所述的螢光素酶檢測中。
含有螢光素酶基因但不攜帶TGFβ-3基因部分的對照質粒是通過用限制性酶XbaⅠ和HindⅢ消化pTGFβ+75LUC質粒DNA來構建的。在標準條件下(Sambrook et al.，出處同上)通過加入所有四種dNTP的Klenow酶反應將凸出的末端填平。在生產商建議的條件下將上述的平末端與T4 DNA連接酶(Boehringer Mannheim)連接。
C.含LDLR啟動子的報導質粒pLDLRLUC101993年3月3日申請、申請號為08/018，985的美國專利申請(下文稱為985申請)描述了質粒pLDLRLUC10。下面將詳細地描述該質粒的構建過程用聚合酶鏈反應擴增人LDL受體啟動子的1546 bp序列。反應混合物含有下列每一種合成的寡核苷酸20pmol5′-GCGCCATATGAGTCTTAACTGCCAAAAATTCTTATCATCAAT-3′(SEQ ID NO∶4)5′-AAGCAAGCTTTCGCAGCCTCTGCCAGGCAGTGTCCCGACCCGGA-3′(SEQ ID MO∶5)和1μg由腺癌細胞系P3UCLA純化的人基因組DNA、dATP、dGTP、dCTP和TTP各200μM、2.5U Taq DNA聚合酶、10mM Tris-HCl pH9.3、50mM KCl、15mM MgCl2和0.1%明膠，終體積100μl，上述混合物進行由96℃ 15秒、55℃ 30秒和72℃ 1秒組成的循環共30次。反應物在1%瓊脂糖凝膠上電泳、分離1546 bp條帶，用HindⅢ和NdeⅠ消化。該片段與預先也用HindⅢ和NdeⅠ消化過的質粒pSP72(Promega)連接。所得的載體pNLDLRP用NdeⅠ和HindⅢ消化，消化物在1%瓊脂糖凝膠上電泳，從中再次分離1546 bp的LDL受體序列。
是用HindⅢ和BglⅡ消化質粒pSV2-珠蛋白，然後連接一個NruⅠ-XhoⅠ接頭到載體中構建質粒載體pSV2。質粒pSV2珠蛋白公開於US4，775，624中，該專利文獻併入本文作為參考。上述接頭含有下列順序5′-AGCTTCGCGACTCGAGA-3′(SEQ ID NO∶6)5′-GATCTCTCCAGTCGCGA-3′(SEQ ID NO∶7)所得的載體被命名為pSV2-H NXB，因為它含有一個BamHⅠ位點、一個NruⅠ位點、一個XhoⅠ位點和一個BglⅡ位點。將含有熒火蟲螢光素酶基因(REF)的質粒pAlc4(NRRL B-18783)的HindⅢ-BglⅡ片段連接入質粒pSV2-HNXB的HindⅢ-BglⅡ位點。
分離上述的1546 bp片段，並克隆入含有熒火蟲螢光素酶報導基因和已被NdeⅠ完全消化和由HindⅢ部分消化的載體pSV2中。所得載體pLDLRLUC10含有指導熒火蟲螢光素酶基因表達的人LDL受體啟動子、氨苄青黴素抗性標誌基因和複製起點。
實施例Ⅱ人雌激素受體表達質粒含雌激素受體的哺乳動物表達構建體pCMVER和pRSV-ER得自B.S.Katzenellenbogen，Department of Physiology and Biophysics，University of Illinois(Urbana-Champaign，IL)，也可參見Reese and Katzenellenbogen，J.Biol Chem.，266，10880-10887(1990)。這些質粒被用於如下文實施例Ⅶ所述的表達檢測中。
實施例Ⅲ構建含雌激素反應性元件/螢光素酶基因的質粒設計併合成對應於來自非洲蟾蜍卵黃蛋白原的雌激素反應性元件(ERE)的互補寡核苷酸(相當於-341位--310位)[Metzger et al.，Nature，334，31-36(1988)]，然後退火，形成基本如實施例Ⅰ所述雌激素反應性元件的雙鏈區。合成含有XhoⅠ限制性酶識別位點的序列以用於側接ERE序列，所說的元件具有下列核苷酸序列(分別如SEQ ID NO∶8和SEQ ID NO∶9所示)5′-TCG-AGA-AAA-GTC-AGG-TCA-CAG-TGA-CCT-GAT-CAA-AC-3′3′-CT-TTT-CAG-TCC-AGT-GTC-ACT-GGA-CTA-GTT-TGA-GCT-5′雙鏈ERE被亞克隆入經XhoⅠ消化的pGL12基質粒(Promega)中，藉此，螢光素酶基因被置於ERE的轉錄影響之下，該質粒命名為pGL2ERELUC並被用於如下所述(實施例Ⅵ)的進一步實驗中。
實施例ⅣDNA轉染A.細胞培養在由Dulbecco改良的Eagle培養基和F12培養基(兩者以3∶1的比例混合，得自GIBCO，Grand Island，NY)組成的培養基(稱為3∶1培養基)中培養哺乳動物細胞，所說培養基不含酚紅，含10%胎牛血清(FBS;Hyclone，Logan，UT)。細胞以4天的間隔傳代。轉染的前一天，通過將細胞與1ml 0.05%胰蛋白酶/5.3mM乙二胺四乙酸四鈉(GIBCO)的溶液在室溫下一起保溫5分鐘來處理細胞，然後以1×106細胞/10cm培養皿的密度將細胞接種於含10%用活性炭解吸過的FBS(csFBS;Hyclone)的3∶1培養基中。
B.TGFβ構建體和人ER構建體瞬時的共同轉染利用ProFection哺乳動物轉染系統(Promega)在MG63(人骨肉瘤)細胞中進行共同轉染實驗。將10μg含TGFβ啟動子的報導質粒DNA與5μg含人雌激素受體(ERE)的表達質粒(pRSV-ER或pCMV-ER，得自B.S.Katzenellenbogen Department of Physiology and Biophysics，University of Illinois，也可參見Reese and Katzenellenbogen，J.Biol Chem.，266，10880-10887，1990)或pRSV(對照)質粒混合，共同被沉澱，然後轉染入10cm培養皿中的2-4×106個細胞中。在細胞與DNA沉澱物於37℃一起保溫15小時後，通過用Dulbecco磷酸緩衝鹽液(D-PBS;GIBCO)洗滌細胞兩次以除去DNA沉澱物。用含10%csFBS的新鮮3∶1培養基再次培養細胞。在適當時候加入待測其調節報導基因表達的能力的化合物，並根據下文所述進行測定。
C.TGFβ構建體和人ER構建體穩定的共同轉染用MCF-7細胞進行轉染實驗，使得被轉染的質粒序列穩定地整和到受體細胞的基因組中。在這些實驗中，將含有TGFβ啟動子的質粒DNA與編碼可選擇標誌的DNA混合。例如，將60μg含TGFβ啟動子的質粒DNA(pTGFβ-301LUC、pGL2LUC或pGL2ERELUC)與60μg pSV2HYG衍生的、含潮黴素抗性基因的質粒pSV2HYGtB(進一步描述於1992年9月29日申請、申請號為07/953，633的美國專利申請中，該文獻併入本文作為參考混合，並利用上述ProFection系統(Promega)轉染2×106個MCF-7細胞。37℃培養過夜後，如上所述從細胞中洗去沉澱物。然後將細胞用含10% FBS的新鮮3∶1培養基在37℃重新培養48小時，此時的細胞一般達到了融合。如上所述用胰蛋白酶處理細胞，再將每個培養皿中的內容物裝入兩個10cm培養皿的含10%FBS 3∶1培養基中。通過在添加了200μg/ml潮黴素B(Calbiochem-Novabiochem，LaJolla，CA)的培養基中培養細胞來選擇潮黴素抗性。每兩天用添加了潮黴素B的新鮮培養基更換上述選擇培養基，但不擾亂細胞的選擇實驗過程。於選擇培養基中生長約14天後可見克隆的菌落。分離這類克隆，並用無菌吸移管管尖移至24孔細胞培養板(Flow Laboratories，Mclean，VA)的各孔中。這種克隆在選擇培養基中生長並維持。
為了鑑定已用含螢光素酶基因的質粒序列成功地進行了共轉染的潮黴素抗性克隆，用聚合酶鏈反應(PCR)檢測轉染體DNA中的螢光素酶cDNA衍生的DNA序列。合成相當於螢光素酶cDNA序列的355-373位(有意義引物)和929-911位(反義引物)的寡核苷酸PCR引物。在基本上如生產商所述的條件下利用Perkin-Elmer GeneAmp PCR System 9600進行PCR共35次循環，每個PCR循環包括94℃ 45秒、55℃ 45秒和72℃ 2分鐘。
將含螢光素酶的潮黴素抗性克隆與如上所述的雌激素或raloxifene一起保溫，通過測定存在於細胞提取物中的酶活性量分析對報導基因表達的影響。為了測定螢光素酶，在含有0.1M磷酸鹽緩衝液(pH7.8)/1% Triton X-100(Boehringer Mannheim)/2mM EDTA和1mM二硫蘇糖醇(DTT，Boehringer Mannheim)的白細胞裂解劑中裂解細胞，並用由Analytical Luminescence Laboratory(San Diego，CA)改良的最佳未增強的螢光素酶測定方案進行檢測。然後將這類用TGFβ報導基因構建體穩定轉染的細胞的克隆用於如下所述(實施例ⅩⅢ)的新型抗骨質疏鬆篩選測定法中。
實施例Ⅴ分析由雌激素和抗雌激素激活的TGFβ啟動子介導的轉錄現有技術已知，用雌激素和三苯氧胺可以不同程度地誘導TGFβ-1、TGFβ-2和TGFβ-3基因的表達(參見背景技術及相關技術部分)。利用上述含有TGFβ啟動子的質粒可在下述一系列體外表達測定中描述所說可誘導性的程度和方式的特徵。
利用ProFection系統(Promega)以pRSVER質粒與phTG12或pTGF-1或pB2-499一起瞬時地共轉染MG63細胞的培養物，對於每個被轉染的培養物而言，滴加含DNA的磷酸鈣培養物至每一培養皿中，並在培養基中充分混勻。培養基的pH值要精確地維持在pH7.2-7.4。被轉染的培養物在5% CO2中於37℃培養過夜。之後，通過從所有培養物的培養皿中吸出培養基隨後再用D-PBS洗各皿兩次而去除沉澱物。對於每個被共轉染的細胞系，用含有10% csFBS和下列成分之一的10ml新鮮培養基替換緩衝液a.10μl乙醇(激素載體)＝對照;
b.溶於乙醇濃度為10-4M的10μl 17β-雌二醇(Sigma)(「estradiol」);
c.溶於乙醇濃度為10-4M的10μl雷洛昔芬(Eli Lilly Laboritories);
d.溶於乙醇濃度為10-4M的10μl三苯氧胺(Sigma)。
在與上述激素製備物(或載體對照)一起孵育24小時後，用D-PBS洗細胞兩次。然後用rubber policeman和1ml D-PBS將細胞從培養皿中刮下。在臺式離心機(MicroMax Model，IEC，Newark，NY)中以8，000rpm離心兩分鐘收集細胞。去掉上清細胞團丸重懸於150μl 0.25M Tris-HCl溶液(pH7.8)。通過在乾冰/乙醇浴中冷凍和在37℃水浴中融化的三次循環來裂解細胞，每個循環歷時3分鐘。被裂解的細胞製備物在4℃下以15，000rpm離心5分鐘，除去細胞碎片。將含有可溶性細胞裂解物的上清液移至新的一套試管中，以測定氯黴素乙醯轉移酶(CAT)活性。
在對這類細胞裂解物進行測定之前，用商售測定劑(BioRad Laboratories，Richmond，CA)首先確定每一裂解物中的蛋白質含量。含100μg總蛋白的每一細胞裂解物與CAT測定緩衝液
-氯黴素)混合15小時。經此保溫後，通過用900μl乙酸乙酯強烈地抽提反應混合物而中止反應。以14，000rpm短暫離心1分鐘分離出有機相和水相，將大約800μl有機相移至一套新的試管中。蒸發乙酸乙酯以濃縮CAT催化的反應產物。
用95∶5(V/V)氯仿/甲醇混合物作為上行緩衝液，藉助薄層色譜分辨乙醯化和未乙醯化的氯黴素。用Batascope 603印跡分析儀(Betagen，Intelligenetics Inc，Mountain View，CA)檢測被分辨的每種氯黴素的放射活性。計算乙醯化的量相對於總量的百分比，得到每種被測轉染體的相對CAT活性(本文所表示的全部CAT活性均是以此為基礎計算的)。每一測定進行兩次。
用MG63轉染細胞系進行上述實驗所得的結果示於圖4中。有代表性實驗的結果列表顯示如下 Fold induction是在與對照進行比較的基礎上計算出來的。
這些實驗表明，CAT報導基因的轉錄是由雌激素和抗雌激素雷洛昔芬和三苯氧胺誘導的，雷洛昔芬表現出的效力強於雌激素，尤其反映在對TGFβ-3啟動子的誘導作用上。相反，用於該實驗的TGFβ-1啟動子區(-1032-+727位)沒有對雌二醇或雷洛昔芬產生應答。
實施例Ⅵ雌激素和雷洛昔芬對TGFβ-3啟動子和卵黃蛋白原啟動子的ERE的不同誘導作用前文實施例中所得結果表明，TGFβ-3啟動子對雌激素和「抗雌激素」化合物如雷洛昔芬和三苯氧胺都具有轉錄反應性，並且由雷洛昔芬誘導的轉錄其程度相對要大於應答雌激素所產生的轉錄誘導作用。該實施例說明編碼非洲蟾蜍蛋白卵黃原的基因在體內以完全相反的方式應答，也就是說，卵黃蛋白原基因的轉錄受到雌激素的強烈誘導，而僅僅受到雷洛昔芬的微弱誘導。此外，當同時給予雷洛昔芬和雌激素兩種化合物時，雷洛昔芬強烈地拮抗雌激素誘導的產生卵黃蛋白原的誘導作用。此結果表明在上述實施例Ⅵ中所測定的報導質粒中指導報導基因轉錄的TGFβ啟動子序列包含一個新的雷洛昔芬反應性元件，其特徵在於有一個獨特的雌激素及抗雌激素反應性方式。
利用前文實施例所述的報導基因測定系統進一步研究了上述雌激素和抗雌激素反應性方式。如實施例Ⅳ所述，用pB-301和pRSVER瞬時地共轉染MG63細胞培養物。用濃度在10-9M-10-5M之間10倍增長變化的雌二醇和雷洛昔芬處理上述瞬時轉染的培養物以檢測報導基因表達的轉錄激活。通過測定10-8M雷洛昔芬對報導基因應答相同於單用雌激素時的系列濃度的雌激素的誘導作用的影響，也檢測了雌激素和雷洛昔芬的聯合作用，這些測定基本上如實施例Ⅴ進行。
用經pGL2ERELUC和pRSVER瞬時轉染的MG63細胞培養物完成了類似的測定。但在這些測定中，與雌激素聯用的雷洛昔芬的用量是變化的，以致於雷洛昔芬濃度是混合物中雌激素濃度的20倍(即10-9M雌激素/2×10-8雷洛昔芬;10-8雌激素/2×10-7M雷洛昔芬等)。
用各種激素含量和各種激素組合處理轉染的細胞，然後用D-PBS洗兩次。細胞在與200μl白細胞裂解劑(如實施例Ⅵ所述)一起於4℃保溫20分鐘後被裂解，用rubber policeman刮下移至微型離心機管中。細胞裂解物以14，000rpm離心1分鐘除去細胞碎片。然後檢測細胞提取物(上清液部分)的蛋白含量和螢光素酶活性。
螢光素酶的測定過程如下。加50μl每一細胞提取物至微量滴定板各孔的100μl試劑A緩衝液(含4.0mM A7P/15mM MgSO4/30mM麥黃酮(tricine)緩衝液(pH7.8)/10mM DTT)中。再向各孔加入100μl 1mM D(-)螢光素(溶於0.1M KPO4pH7.8，Boehringer Mannheim)，用ML3000微量滴定板發光計測量所產生的光量(條件為整合閃點模式、高增益、整合窗＝10秒，22℃)。螢光素酶活性被計算為總的光產量比上各細胞裂解物樣品中的蛋白質含量。
這些檢測結果制表顯示如下
上述實驗結果如圖5所示。
這些結果清楚地說明在TGFβ基因啟動子中存在一個對抗雌激素具有反應性的獨特啟動子區。當雷洛昔芬作為由基因(如卵黃蛋白原基因)的含ERE啟動子啟始的轉錄的有效拮抗劑時，本文發現它在誘導由TGFβ-3啟動子開始的轉錄中充當超級激動劑。令人感興趣的是，在低濃度時，雷洛昔芬與雌激素協同誘導本發明報導質粒中TGFβ-3啟動子的轉錄，這表明被雷洛昔芬誘導的基因轉錄可以由新的機制所介導。
實施例Ⅶ用雌激素和抗雌激素激活TGFβ-3的雌激素受體依賴性基因現有技術已經知道雌激素與抗雌激素兩者影響TGFβ產生的能力依賴於雌激素受體(ER)的表達，但尚不清楚在哪一級水平(即轉錄、翻譯或翻譯後)上產生上述影響。因此，利用本發明含TGFβ啟動子的構建體進行了一系列實驗，以研究所推定的報導基因表達的誘導作用對ER表達的依賴性，ER表達的缺乏實際上削弱了TGFβ-3的表達，無論是否存在雌二醇或雷洛昔芬。通過應用突變的ER蛋白已經確定ER分子的不同結構區負責雌激素和雷洛昔芬的誘導作用。
A.TGFβ-3的ER依賴性誘導作用如實施例Ⅳ所述製備用於共轉染的NG63細胞培養物，用pB2-499和pRSVER共轉染其中的一份培養物，另一份培養物用pB2-499和pRSV載體質粒(對照)共轉染。然後，基本如實施例Ⅴ所述測定了下列化合物通過TGFβ-3基因的雷洛昔芬反應性元件誘導轉錄的能力(a)乙醇;
(b)17β-雌二醇(10-7M);
(c)雷洛昔芬(2×10-6M);
(d)17β-雌二醇(10-7M)和雷洛昔芬(2×10-6M)一個上述實驗的結果列於下表中，而薄層色譜所產生的代表性實例如圖6所示。
上述結果清楚地表明，ER的表達對於應答雌激素、抗雌激素及其結合，TGFβ-3基因啟動子介導的報導基因表達的誘導作用是需要的。
B.分析誘導TGFβ-3啟動子所需的ER蛋白結構區現有技術已經公開ER蛋白質中稱為「E」的區域為結合雌激素所必需，而「C」區為結合DNA所需(參見kumar et al.，EMBO J.9，2231-2236，1986)。同樣也很清楚地知道，「C」區為含ERE基因的ER激活所需，而「E」區為雌激素依賴的誘導性所需。
為了確定ER中涉及誘導TGFβ-3啟動子轉錄的區域，如實施例Ⅳ所述製備用於共轉染的MG63細胞培養物。用pTGFβ-301LUC和下列含有各種ER缺失突變體的表達質粒之一的混合物轉染細胞a.pCMV-ER
b.pCMV-ER△A/Bc.pCMV-ER△B/C/Dd.pCMV-ER△E/Fe.pCMV-ER1-530f.pCMV-ERL540Q參見Reese Katzenellenbogen，J.Biol Chem.，266，10880-10887，1990，圖7中進一步說明了這些質粒中各缺失的範圍。
用載體(10μl乙醇)或10-7M雷洛昔芬處理其轉染的細胞，以檢測上述突變ER介導雷洛昔芬誘導的TGFβ-3激活的能力。雷洛昔芬誘導的螢光素酶活性在基礎活性值上的增加被計算為在如圖7所示的各種突變ER形式存在下由雷洛昔芬產生的倍數誘導作用。
一個上述實驗的結果示於下表中 上述結果表明，激素結合區(「即雌激素受體分子的「E」區)是必需的，並足以介導雷洛昔芬刺激的、本發明報導質粒中報導基因的TGFβ-3啟動子介導的轉錄。ER分子的「C」區似乎不為上述過程所需。這一結果進一步支持了ER的激活基因轉錄新機制可牽涉TGFβ啟動子轉錄的觀點。
實施例Ⅷ雌激素和抗雌激素對TGFβ-3啟動子的激活已經發現雌激素和抗雌激素化合物對TGFβ啟動子介導的基因表達的轉錄激活作用是濃度依賴性。如實施例Ⅴ所述用pB-301和pRSVER瞬時地共轉染MG63細胞培養物。這類轉染細胞培養物被分成四組，每組十二份，四組培養物中的每一組都用於檢測一種雌激素或抗雌激素化合物分別誘導TGFβ-3啟動子轉錄的能力。對於每一組的十二份培養物而言，在有從10-9M-10-5M的六種濃度以10倍增加的特定雌激素或抗雌激素存在的複製培養物以及僅用載體處理的，套複製培養物(每個實驗性處理共十二份培養物)中進行檢測。如上所述，將激素溶解於乙醇中並用於培養物，所測試的四種雌激素和抗雌激素如下a.17β-雌二醇(Sigma Chemical Corp.，St.Louis，MO);
b.雷洛昔芬(Eli Lilly，Indianapolis，IN);
c.三苯氧胺(Sigma)d.ICI 164，384(描述於1988年7月20日發行的歐洲專利EP138504中)。
在用激素處理(或對照)24小時後，如實施例Ⅴ所述洗滌、收集、裂解細胞，並檢測CAT活性。一個上述實驗的結果列表顯示如下，並示於圖8中。
儘管所有的雌激素和抗雌激素都影響TGFβ-3啟動子的活性，但每種化合物均顯示出其各自獨特的劑量-反應曲線。雷洛昔芬是迄今最有效的激活劑，對報導基因的轉錄有超過20倍的誘導作用，並且其ED50在納摩爾濃度水平。與此相反，雌二醇僅表現出對報導基因表達4倍的誘導作用，其ED50比雷洛昔芬的高出二個數量級。三苯氧胺只在高濃度(即大於微摩爾)時激活TGFβ-3啟動子。ICI 164，384的ED50為10-7M，但該化合物在高濃度(10-5M)時似乎只有很小的活性。這些結果表明在TGFβ-3基因的啟動子區發現了稱為雷洛昔芬反應性元件(RRE)的新元件。該元件在雌激素和抗雌激素兩者存在下誘導轉錄，並且上述化合物中的每一種都有一個轉錄激活的特徵性劑量-反應圖。
實施例Ⅸ雷洛昔芬在CHO和MCF-7細胞中介導的TGFβ-3啟動子的轉錄激活已在各種細胞系中證明雷洛昔芬誘導TGFβ-3啟動子轉錄的能力不同於雌激素介導的誘導作用。
A.在CHO細胞中TGFβ-3的激活作用如實施例Ⅳ所述用pB-301和pRSVER瞬時地共轉染CHO細胞培養物，並用於測定雷洛昔芬和雌二醇通過雷洛昔芬反應性元件誘導轉錄的能力。在同樣的實驗中用10-9M-10-5M10倍遞增的六種濃度的雌二醇或雷洛昔芬處理十二份瞬間轉染的培養物(以及只用載體作對照的十二分培養物)。如上所述，將激素溶於乙醇中，並用於培養基中的培養物。
與激素製備物(或對照物)一起保溫24小時後，如實施例Ⅴ所述洗滌、收集、裂解細胞，並檢測CAT活性。其結果列表顯示如下，並如圖9所示。
這些結果表明，當在CHO細胞中進行檢測時，先前觀察到的TGFβ-3啟動子對雌激素和雷洛昔芬的反應性依然存在。
B.TGFβ-3在MCF-7細胞中的激活如實施例Ⅳ所述用pTGFβ-301LUC瞬時地轉染MCF-7細胞的培養物。這些培養用於檢測雷洛昔芬和雌二醇在這一細胞類型中誘導轉錄的能力。用0M、10-9M、10-8M、10-7M、10-6M和10-5M六種濃度之一的雌二醇或雷洛昔芬處理培養物。如前所述將激素溶解於乙醇中，並用於培養基中的培養物。
用激素製備物(或載體對照)處理24小時後，按照實施例Ⅵ的方法洗滌、收集、裂解細胞，並測定LUC活性。該實驗的結果列表顯示如下，而這類系列實驗的結果總結於圖10中。
(螢光素酶活性以成千的單位表示)在人子宮內膜癌細胞(RL59.2)、人宮頸癌細胞(Hela)和猴腎細胞(COS-1)(ATCC，Rockville，MD)中進行類似的實驗。發現在雌激素和雷洛昔芬所有測試的細胞類型中誘導由TGFβ-3啟動子開始的轉錄(在誘導作用的大小上不同)。這些結果表明雌激素和雷洛昔芬介導的對從TGFβ-3啟動子開始的報導基因轉錄的誘導作用並不限於特定的細胞類型中。然而，在不同細胞中表現出的不同誘導水平可能說明在這些細胞中涉及調節作用的其它因子的充分性。用螢光素酶和CAT作為報導基因所發現的TGFβ-3啟動子對雷洛昔芬和雌激素具有反應性的事實表明，該調節作用是從TGFβ-3啟動子開始的基因表達的共同特徵。
實施例Ⅹ用雷洛昔芬及相關化合物比較性誘導由TGFβ-3啟動子開始的報導基因的表達現有技術已知抗雌激素化合物能夠以劑量依賴性方式誘導TGFβ基因的表達[Knabbe等人，Am.J.Clin.Onc.，14(Suppl.2)，S15-S20(1991)]。而且，如上述實施例Ⅷ所示，已發現雷洛昔芬和三苯氧胺能夠以劑量依賴性方式誘導TGFβ-3基因的表達。
為了使化合物通過TGFβ-3啟動子的雷洛昔芬反應性元件產生的誘導轉錄的能力與其已知的在切除卵巢的大鼠中所證實的親子宮能力相關聯，進行了本實施例中所述的多個實驗。測試了七種在結構上與雷洛昔芬相關的化合物通過TGFβ-3啟動子的雷洛昔芬反應性元件誘導轉錄的能力。可以由其從親子宮性(LY112676、LY81099和LY13314)至抗親子宮性(LY113526、LY139482和LY177366)的體內活性譜來分辨所說的化合物，還包括一種已知在體內呈惰性的化合物(LY98005)。
上述化合物的IUPAC名稱和權利要求中要求了上述化合物的美國專利如下

上述化合物描述在圖11中。
測定雷洛昔芬、LY81099、LY98005、LY112676、LY113526、LY13314、LY139482和LY177366(Eli Lilly and Company，Indianapolis，Indiana)，比較其在不同濃度時誘導始自TGFβ-3基因啟動子的轉錄的能力。用0M、10-9M、10-8M、10-7M、10-6M和10-5M的上述化合物如實施例Ⅵ所述處理經pB-301和pRSVER瞬時共轉染的MG63細胞培養物。實驗結果以下列表格形式表明，並描述於圖12中。
顯示出體內親子宮特性的化合物(即雌激素類化合物)的ED50值大約為10-7M，並且對始自TGFβ-3啟動子的報導基因表達具有相對較低的倍數誘導作用，這非常類似於雌激素在實施例Ⅷ中所反映出的情形。與之相反，類似於雷洛昔芬的體內作用情況的化合物表明ED50值為10-9M和比雌激素性化合物相對大的倍數誘導作用。有關雷洛昔芬的體內數據已在1992年7月28日申請的美國專利申請(申請號為07/920，933)中給出，該文獻併入本文作為參考。總之，產生雌激素樣體內特性的化合物比產生抗雌激素樣體內特性的化合物表現出明顯小的通過TGFβ-3啟動子的轉錄誘導作用。
這些實驗結果證明了本文所述的含報導基因表達質粒作為鑑定潛在抗骨質疏鬆藥物的篩選技術的應用，因為那些具有雷洛昔芬樣誘導作用情形和ED50的化合物比在該測定中具有較低誘導作用情形和較高ED50的雌激素樣化合物顯示出相對更低的親子宮作用。
實施例Ⅺ雷洛昔芬反應性元件定位於TGFβ-3啟動子中的+35至+75區至少人TGFβ-3基因啟動子中的一部分雷洛昔芬反應性元件大概定位地+35至+75位的特定41個核苷酸序列。發現該序列對於介導雷洛昔芬誘導的上述TGFβ報導基因表達構建體中報導基因表達的轉錄激活作用所必需的。
A.通過對體外製備的TGFβ-3啟動子缺失突變體進行功能性分析來鑑定雷洛昔芬反應性元件如實施例Ⅰ所述，製備用pCMVER和多種TGFβ-3啟動子缺失報導構建體之一(包括pB-499、pB-301、pB-221、pB-91、pB-60、pB-47、pTGFβ-38LUC、pTGFβ+75LUC、pTGFβ+35LUC和pLUC)瞬時共轉染MG63細胞培養物。然後用乙醇(作為對照)或10-6M雷洛昔芬處理上述培養物，計算每一TGFβ-3啟動子缺失構建體用雷洛昔芬處理後誘導報導基因表達的程度相對於單用載體處理所得到的誘導程度，列表顯示如下，並描繪於圖13中
這些結果將至少一部分雷洛昔芬反應性元件定位於TGFβ-3啟動子序列的+35至+75位。
B.雷洛昔芬反應性元件的核苷酸序列TGFβ-3啟動子從-38至+110位的核苷酸序列描繪在圖14中。以上發現的雷洛昔芬序列是圖中以略圖形式描繪的序列。空心箭頭表示主要的轉錄起始位點(+1)。兩個黑箭頭表示兩個小的轉錄起始位點。「TATA」序列示以明框。推定的CCCTC基序用推定的雷洛昔芬反應性元件序列下一系列的水平箭頭表示。參見Lobanenkov et al，Omogene，5，1743-1753，1990。
由對TGFβ-3的分析可得出兩個結論。其一，在TGFβ-3啟動子區發現沒有與ERE同源的迴文序列。這個發現與在實施例Ⅶ中所表明的不需要ER的DNA結合活性的結果相一致。其二，ER介導的TGFβ-3的雷洛昔芬激活很可能需要能夠結合至雷洛昔芬反應性元件上的其它因子。一個很好的這類蛋白質的候選物是由Lobanenkov等人鑑定的，涉及c-myc基因調節的CTCF因子。這些結果使得可以鑑別作為在其啟動子中具有雷洛昔芬反應性元件的潛在雷洛昔芬可調基因的其它基因。而且，這類基因可用於鑑別具有用於實施例ⅩⅢ所述篩選程序中的雷洛昔芬反應性元件活性的遺傳元件。
本發明的雷洛昔芬反應性元件用於檢索GenBank序列庫。在該元件及下列基因的元件間發現了顯著的同源性GenBank/EMBL 資料庫入藏登記號 基因X56595 雞Ⅵ型膠原蛋白_-2X55373 人ETS-2啟動子區M30137 人ETS-2(5′側翼)D10231 小鼠葡萄糖運輸因子(增強子2)M12731 小鼠N-myc原癌基因M13945 小鼠pim-1原癌基因S63281 R.norvegicus N-myc基因X16995 小鼠N10基因M94152 大鼠腺苷受體M20131 大鼠細胞色素p450ⅡE1M34111 大鼠PTHrPJ05097 大鼠P物質受體M64236 大鼠P物質受體上述結果支持該元件作為一個能在各種組織和細胞類型中介導體內多向性生理作用的分離的和重要的調節單位存在。
實施例Ⅻ雌激素和雷洛昔芬誘導LDL受體啟動子激活LDL受體表達在調節血清LDL-膽固醇攝入過程中起重要作用。已知雌激素在體內誘導LDL受體的信使RNA(Ma等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83，792-796，1986)。如本實施例所示，ER介導雌激素對LDL受體啟動子序列的激活作用。雷洛昔芬也誘導LDL受體啟動子，但這種誘導作用是ER非依賴性的。
A.雌激素和抗雌激素在ER存在下誘導LDLR-LUC產生如實施例Ⅳ所述，用pLDLRLUC10和pRSVER共轉染ATCC HepG2細胞株。在實施例Ⅵ所述條件下將上述細胞與雌二醇和雷洛昔芬接觸。其結果制表顯示如下，系列實驗的結果描繪於圖15中。
B.沒有ER時雌激素和抗雌激素誘導的LDLR-LUC的產生如實施例Ⅳ所述，用pLDLRLUC10和pRSV載體質粒共轉染ATCCH2pG2細胞株。在實施例Ⅵ所述條件下將上述細胞與雌二醇和雷洛昔芬接觸。其結果制表顯示如下，有代表性的系列實施結果示於圖16中。

上述結果表示雷洛昔芬和雌激素兩者都具有誘導LDL受體表達的能力。該結果提供了一種用雌激素和雷洛昔芬在動物模型中和人體中降低血脂的解釋。
實施例ⅩⅢ篩選潛在抗骨質疏鬆藥物的方法在上述實施例的基礎上設計了用螢光素酶作為報導基因的測定法以篩選潛在的抗骨質疏鬆的藥物。
利用實施例Ⅳ中所述方法用pTGFβ-301LUC、pGL2LUC或pGL2ERELUC穩定地轉染MCF-7細胞培養物。然後將細胞用於圖17所描述的有創造性的方法中。
步驟1.用於篩選測定中的第一步是確定化合物誘導自TGFβ-3啟動子開始轉錄的能力用經pTGFβ-301LUC穩定轉染的MCF-7細胞、基本按實施例Ⅸ所述方法進行測定。細胞培養和測定條件要適合96孔微量滴定板形式。以產生大約50%融合的密度接種細胞至96孔板中。測試化合物選自各種來源，包括藥物研究記錄、化學生產商的產品目錄以及天然存在的來源，如發酵提取物。在含有測試化合物的生長培養基(如實施例Ⅳ所述)中培養細胞約24小時。然後在板中原位裂解細胞，裂解物進行定量蛋白測定和螢光素酶活性測定。誘導螢光素酶活性增加2倍以上的化合物被認為能夠用於進一步的試驗中。
步驟2.用如步驟1所述鑑定的化合物對已用pGL2LUC穩定轉染的細胞培養物進行測定，以確定這類化合物是普通的轉錄誘導劑。當這類普通的轉錄誘導劑缺乏作為雷洛昔芬反應性元件依賴性基因表達的調節子的潛在抗骨質疏鬆藥物所需的轉錄誘導特異性時，這類普通的誘導劑被排除於進一步的試驗之外。
步驟3.具有作為潛在抗骨質疏鬆所需轉錄誘導特異性(即能在pTGFβ-301LUC細胞中誘導轉錄誘導作用而不在用pGL2LUC轉染的細胞中誘導轉錄)的化合物是雷洛昔芬反應性元件依賴性基因表達的調節子，對其進行測定以明確這類化合物是否誘導始自雌激素反應性元件的轉錄。如實施例Ⅵ所述，在存在和缺乏雌二醇的情況下測定用pGL2ERELUC穩定轉染的細胞。在缺乏雌激素的情況下能激活pGL2ERELUC的化合物不具備進一步測試的資格，因為這些化合物在缺乏雌激素的情況下能夠誘導始自雌激素反應性元件的轉錄表明了在體內具有潛在的雌激素性活性。
步驟4.進一步測試完全符合步驟1-3標準的化合物，以確定這類化合物是抗雌激素類的，或是非雌激素類/非抗雌激素類的。為此，在雌二醇存在的情況下在用pGL2ERELUC穩定轉染的細胞中測試化合物。在該測定中所產生的對雌激素誘導的螢光素酶活性的抑制作用表明這類化合物具有抗雌激素性活性。抗雌激素性和非雌激素性化合物將由其劑量-反應方式和ED50值來描述特徵。可以進行進一步的實驗以確定這類化合物的劑量-反應類型，並將其與已知的抗雌激素(如雷洛昔芬)進行比較。參見實施例Ⅹ。
根據上述篩選方案，可以應用常規測定法，尤其是涉及適宜動物模型系統的體內測定法進一步描述如本文所述鑑定的化合物的抗雌激素性特徵。由本測定法鑑定的化合物可有利地和迅速地實現對具有所需抗骨質疏鬆特性的抗雌激素類化合物的開發。
實施例ⅩⅣ體外和體內活性間的相互關係進行下面的實驗以確定體外測定和絕經後骨質疏鬆體內模型間的相互關係。體外測定檢測測試化合物通過TGFβ-3啟動子的雷洛昔芬反應性元件誘導轉錄的能力。體內模型檢測除去卵巢的大鼠中骨(股骨)質密度的改變。下面的化合物將用於這些實驗中。
如US4，133，814(1979年1月9日出版)所述製備上述化合物，該文獻併入本文作為參考。
測定雷洛昔芬、088074、156678、171147和309503(Eli Lilly and Company)，以確定在小於10nM的濃度下[即最小有效濃度(MEC)＜10nM]對始自TGFβ-3基因啟動子的轉錄產生2倍誘導作用的能力(如由螢光素酶活性所測)。轉染前一天，用0.05%胰蛋白酶/5.3mM乙二胺四乙酸(EDTA)四鈉的溶液處理Hela細胞，產生單個細胞懸液。計數拆開的融合細胞，並稀釋至1×106細胞/ml的濃度。將3×106細胞和3∶1培養基加至t-150燒瓶中，培養過夜。第二天，從細胞中除去培養基，代之以新鮮培養基(25ml)。利用ProFection哺乳動物轉染系統(Promega)用pTGFβ-301LUC(10μg)、pCMVER(1μg)和pRSVβgal(1μg)瞬時共轉染細胞。將pTGFβ-301LUC(940μg)、pCMVER(94μg)和pRSVβgal(94μg)Cacl2(5.704ml)和無核酸酶的水(47ml)與2XHEPES(47ml)混合，同時搖晃，製得轉染液。所得溶液於室溫保溫30分鐘。將該轉染液(3ml)加至各燒瓶中。
細胞與轉染液保溫過夜後，去除培養基，用無Ca/Mg的磷酸鹽緩衝液(10ml，GIBCO)洗每個燒瓶。洗過的細胞用胰蛋白酶處理以分散細胞。用新鮮培養基3ml處理分散的細胞。經離心和除去培養基及胰蛋白酶製得細胞團丸。將細胞重懸於大約20ml培養基中計數。稀釋細胞至濃度為5×105細胞/ml。然後，5×104細胞(100μl)加至96孔板的各孔中，細胞培養過夜。
將測試化合物溶解於二甲亞碸，並初步稀釋到1∶1000。該稀釋過程的完成是通過將2μl藥物溶液加至深孔微量滴定板的1000μl培養基中(1∶500稀釋)，然後再將100μl稀釋的藥物溶液加入板中已有的100μl培養基中(1∶2稀釋)。對於每一種化合物篩選，如前所述將化合物稀釋1∶1000，再進一步稀釋1∶100。此外，用8個稀釋度的劑量-反應曲線測定最低有效濃度。化合物與細胞在96孔板中保溫過夜。
從細胞中除去培養基，用無Ca/Mg的磷酸鹽緩衝液(200μl)洗各孔。去掉鹽溶液，用60μl裂解液(100mM KPO4、0.2% Triton X-100，1mM DTT pH7.8)裂解細胞。所得溶液用於測定螢光素酶或β-半乳糖苷酶活性。螢光素酶活性測定基本如實施例Ⅵ所述，除了螢光素溶液含有100mg螢光素、9ml 1M N-甘氨醯甘氨酸、36ml 40mM EGTA、720ml 1M DTT、5.4ml 1M MgSO4和310ml水外。這些實驗的結果製成表Ⅻ顯示
a.「+」表示測試化合物對標準化的螢光素酶活性產生2倍的誘導作用，ED50＜10mMb.「+」表示骨質密度經統計學處理高於去除卵巢的動物還測試了上述化合物維持切除卵巢大鼠中骨質密度的能力。75天齡雌性Sprague Dawley大鼠(重量範圍225-275g)得自Charles River Laboratories(Portage，MI)。將其分成3組飼養，並可隨意取食(鈣含量大約1%)和水。室溫維持在22.2℃±1.7℃，最小相對溼度為40%。室內光周期為12小時明亮12小時黑暗。
得到大鼠一周後，在麻醉下[44mg/kg克他命和5mg/kg甲苯噻嗪(Butler，Indianapolis，IN)肌內給藥]對大鼠進行雙側卵巢切除術。術後當天動物清醒之後開始用載體或測試化合物進行處理。溶於0.5ml 1%羧甲基纖維素(CMC)中的口服劑量經管飼法施用。手術時及其後的每周稱重，以根據改變的體重調整劑量。平行於作為陰性和陽性對照的各實驗組評價施用載體或被處理且行卵巢切除術(ovex)大量及未行卵巢切除(完整的)大鼠。
每天對大鼠進行處理，歷時35天(6隻大鼠/治療組)，第36天用斷頭術將其處死。35天的時間周期足以使得骨密度最大程度降低(如本文所測)。切除右側股骨，在距髕骨溝1mm的遠側幹骺端用單光子吸光測定法進行掃描。光密度計檢測的結果表示了作為骨質含量指標的骨密度和髖度的計算值。一般說來，行卵巢切除術的大鼠與完整的載體處理對照相比其股骨密度降低約25%這些實驗結果示於表Ⅻ。
這些實驗結果表明，能有效誘導始自TGFβ-3基因啟動子區的雷洛昔芬反應性元件轉錄的化合物(如雷洛昔芬、156678和171147)也表現出能在行卵巢切除術的大鼠中保持骨密度。
不能誘導雷洛昔芬反應性元件轉錄的化合物(如088074和309503)也不能對行卵巢切除術動物的骨質密度的喪失表現出統計學意義上的顯著保護作用。
應該理解，前面公開的內容著重於本發明的某些具體實施方案，對其作出的所有改良或等價改變都落入如所附權利要求所述的本發明精神或範圍之內。
序列表(1)一般資料(ⅰ)申請人Yang，Na N(ⅱ)發明題目篩選抗骨質疏鬆藥物的材料和方法(ⅲ)序列數目9(ⅳ)通訊地址(A)收信人Eli Lilly and Company(B)街道Lilly Corporate Center(C)城市Indianapolis(D)州IN(E)國家U.S.A(F)郵政編碼46285(ⅴ)計算機可讀形式(A)介質類型Diskette-3.50英寸，1.44 Mb儲存(B)計算機IBM兼容(C)作業系統MS-DOS
(D)軟體PatentIn Release ＃1.0，Version ＃1.25(ⅵ)目前的申請資料(A)申請號US(B)申請日(C)分類號(ⅶ)在先申請資料(A)申請號US 08/081，610(B)申請日June 21，1993(C)分類號435(ⅷ)代理人/代理資料(A)姓名Leeds，James P.
(B)註冊號35，241(C)案卷號X-9088A(ⅸ)電訊資料(A)電話317-276-1667(B)電傳317-277-1917(2)SEQ ID NO∶1的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度2205鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅸ)特徵
(A)名稱/關鍵詞misc_RNA(B)位置1..2(D)其它資料/注＝「序號1相當於TGFβ-1啟動子的-1362」(ⅸ)特徵(A)名稱/關鍵詞misc_RNA(B)位置1363..1365(D)其它資料/注＝「相當於TGFβ-1到+1密碼子」(xi)序列描述SEQ ID NO∶1
(2)SEQ ID NO∶2的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度5578鹼基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅸ)特徵(A)名稱/關鍵詞TATA_信號(B)位置2248..2252(ⅸ)特徵(A)名稱/關鍵詞外顯子(B)位置2278..3980(ⅸ)特徵(A)名稱/關鍵詞內含子(B)位置3981..5578(ⅸ)特徵(A)名稱/關鍵詞misc_RNA(B)位置3635..3980(D)其它資料/注＝「CDS，起始密碼子＝1」(ⅸ)特徵(A)名稱/關鍵詞misc_RNA(B)位置1..2(D)其它資料/注＝「序號1相當於TGFβ-2，-2277」(xi)序列描述SEQ ID NO∶2



(2)SEQ ID NO∶3的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度3303鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅸ)特徵(A)名稱/關鍵詞mRNA
(B)位置2170..3303(ⅸ)特徵(A)名稱/關鍵詞mRNA(B)位置2214..3303(ⅸ)特徵(A)名稱/關鍵詞mRNA(B)位置2219..3303(ⅸ)特徵(A)名稱/關鍵詞misc_RNA(B)位置3301..3303(D)其它資料/注＝「CDS開始，起始密碼子＝1，轉譯M」(ⅸ)特徵(A)名稱/關鍵詞TATA_信號(B)位置2170..2176(ⅸ)特徵(A)名稱/關鍵詞misc_特徵(B)位置1896..2306(D)其它資料/注＝「pB-301 -301～+110」(ⅸ)特徵(A)名稱/關鍵詞misc_特徵(B)位置1976..2306(D)其它資料/注＝「pB-221 -221～+110」(ⅸ)特徵
(A)名稱/關鍵詞misc_特徵(B)位置2106..2306(D)其它資料/注＝「pB-91 -91～+110」(ⅸ)特徵(A)名稱/關鍵詞misc_特徵(B)位置2137..2306(D)其它資料/注＝「pB-60 -60～+110」(ⅸ)特徵(A)名稱/關鍵詞misc_特徵(B)位置2150..2306(D)其它資料/注＝「pB-47 -47～+110」(ⅸ)特徵(A)名稱/關鍵詞misc_特徵(B)位置2159..2306(D)其它資料/注＝「pB-38 -38～+110」(ⅸ)特徵(A)名稱/關鍵詞misc_特徵(B)位置2159..2271(D)其它資料/注＝「TGFβ-3位置-38到+75」(ⅸ)特徵(A)名稱/關鍵詞misc_特徵(B)位置2159..2231(D)其它資料/注＝「TGFβ-3位置-38到+35」(xi)序列描述SEQ ID NO∶3


AGCCTCAGTC TTTGGGATCT GGGGAGGCCG CCTGGTTTTC CTCCCTCCTTCTGCACGTCT 3240GCTGGGGTCT CTTCCTCTCC AGGCCTTGCC GTCCCCCTGG CCTCTCTTCCCAGCTCACAC 3300ATG 3303(2)SEQ ID NO∶4的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度42鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO∶4GCGCCATATG AGTCTTAACT GCCAAAATT CTTATCATCA AT 42(2)SEQ ID NO∶5的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度44鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO∶5AAGCAAGCTT TCGCAGCCTC TGCCAGGCAG TGTCCCGACC CGGA 44(2)SEQ ID NO∶6的資料
(ⅰ)序列特徵(A)長度17鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO∶6AGCTTCGCGA CTCGAGA 17(2)SEQ ID NO∶7資料(ⅰ)序列特徵(A)長度17鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO∶7GATCTCTCCA GTCGCGA 17(2)SEQ ID NO∶8資料(ⅰ)序列特徵(A)長度35鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型cDNA
(xi)序列描述SEQ ID NO∶8TCGAGAAAAG TCAGGTCACA GTGACCTGAT CAAAC 35(2)SEQ ID NO∶9資料(ⅰ)序列特徵(A)長度35鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO∶9TCGAGTTTGA TCAGGTCACT GTGACCTGAC TTTTC 3權利要求
1.一種含有從TGFβ基因啟動予區分離的雷洛昔芬反應性元件的核酸，其中的人TGFβ基因是TGFβ-2或TGFβ-3。
2.根據權利要求1的核酸，其中核酸的核苷酸序列含有選自下列序列的序列相當於圖3和SEQ ID NO∶3中所示的1896到2306的序列，相當於圖3和SEQ ID NO∶3中所示的1976到2306的序列，相當於圖3和SEQ ID NO∶3中所示的2106到2306的序列，相當於圖3和SEQ ID NO∶3中所示的2137到2306的序列，相當於圖3和SEQ ID NO∶3中所示的2150到2306的序列，相當於圖3和SEQ ID NO∶3中所示的2159到2306的序列，相當於圖3和SEQ ID NO∶3中所示的2159到2271的序列;和相當於圖3和SEQ ID NO∶3中所示的2159到2231的序列。
3.一種含有根據權利要求1或權利要求2的核酸和報導基因的重組表達構建體。
4.一種用根據權利要求3的重組表達構建體轉染的真核細胞。
5.一種篩選多種化合物以鑑別具有作為抗骨質疏鬆藥物能力的化合物的方法，該方法包括識別多種化合物中的某一化合物，它能夠誘導從哺乳動物啟動子的雷洛昔芬反應性元件開始的轉錄，它是一種非特異性轉錄誘導劑，但不能誘導哺乳動物啟動子的雌激素反應性元件的轉錄，並且它是一種抗雌激素或非雌激素化合物，該方法包括下列步驟(a)檢測該化合物誘導哺乳動物啟動子的雷洛昔芬反應性元件轉錄的能力;(b)檢測該化合物不能從誘導不含雷洛昔芬反應性元件的哺乳動物啟動子轉錄的能力;(c)檢測該化合物不能誘導雌激素反應性啟動子轉錄的能力;和(d)在存在雌激素的情況下檢測該化合物抑制雌激素誘導的雌激素反應性啟動子轉錄的能力。
6.一種化合物(a)能夠誘導TGFβ-3基因啟動子區的雷洛昔芬反應性元件的轉錄;(b)不能誘導沒有雷洛昔芬反應性元件的哺乳動物啟動子轉錄;(c)不能誘導雌激素反應性啟動子轉錄;和(d)在存在雌激素的情況下，能抑制雌激素誘導的雌激素反應性啟動子的轉錄;條件是該化合物不是下式的化合物或其可藥用的鹽 其中n是0、1或2R和R1分別是氫、羥基、C1-C6-烷氧基、C1-C6-醯氧基、C1-C6-烷氧基-C1-C6-醯氧基、R3取代的芳氧基、R3取代的芳醯氧基、R4取代的羰氧基、氯或溴;R2是選自吡咯烷基、哌啶子基或六亞甲基亞氨基的雜環;R3是C1-C3-烷基、C1-C3-烷氧基、氫或滷素;和R4是C1-C6-烷氧基或芳氧基。
全文摘要
本發明涉及鑑別治療骨質疏鬆治療藥物和降低血脂藥物的方法。本發明也涉及分離、克隆並使用來自含有稱為「雷洛昔芬反應性元件」的新調節元件的轉化生長因子β基因啟動子區的核酸。本發明還包括含有與報導基因可操作相連的雷洛昔芬反應性元件，以便雷洛昔芬反應性元件調節報導基因轉錄的真核細胞。本發明還提供鑑別抗骨質疏鬆藥物的方法，所述藥物誘導與所述雷洛昔芬反應性元件可操作相連的基因的轉錄，而不會引起與目前抗骨質疏鬆治療方式相關的有害或令人討厭的副作用。
文檔編號C07K14/46GK1102437SQ9410671
公開日1995年5月10日 申請日期1994年6月20日 優先權日1993年6月21日
發明者N·N·楊 申請人:伊萊利利公司