阿樸菲及氧化阿樸菲類生物鹼的用途的製作方法

2023-05-24 23:23:06 3

專利名稱：阿樸菲及氧化阿樸菲類生物鹼的用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及中藥鑽山風的總生物鹼、鹼鹽的用途，更具體地指從它們分離獲得的阿樸菲及氧化阿樸菲生物鹼的抗炎、免疫抑制的用途。
背景技術：
鑽山風Fissistigma oldhamii(Hemsl.)Merr.又名瓜馥木、廣香藤，為番荔枝科(Annonaceae)瓜馥木屬植物瓜馥木的根或藤莖。分布於浙江、江西、福建、臺灣、湖南、廣東、海南、廣西、雲南等地。有祛風除溼，活血止痛之功效，主治風溼痺痛，腰痛，胃痛，跌打損傷[《中華本草》編委會編.中華本草[M].第二分冊，上海上海科學技術出版社，1997，3.1594-1595]。鑽山風為治療關節炎的民間草藥，文獻報導其酸性部分具有抗關節炎作用；總生物鹼有鎮痛活性、對心律不齊與慢性心肌供血不足患者均有一定療效、對W256、S37、S180等瘤株均有抑制作用[徐昌瑞等.中草藥，1983，144-6]。
國內外學者已對鑽山風的化學成分進行許多研究，從中已分離得到了14個生物鹼、1個呋喃酮、2個環戊烯酮及2個有機酸。鑽山風糖漿是以鑽山風為君藥的複方製劑，已列入中華人民共和國衛生部藥品標準《中藥成方製劑》第10冊中，國內的毛有昌對複方鑽山風糖漿進行了劑型改進，對丸劑、顆粒劑、合劑等新劑型進行了專利保護，發明專利已公開[申請號03118319.0，03118320.4，03124524.2]；同時對複方中君藥鑽山風的總生物鹼的提取工藝及相關的製劑進行了專利申請保護[申請號03118278.X]。所保護的總鹼提取工藝僅是生物鹼的一般提取方法，並沒有對總鹼的單體成分及含量進行深入的研究，同時對總鹼也未進行任何相關的生物學測試，以驗證新的單味藥的提取部位具有原先單味藥或複方類似的生物學效應。

發明內容
本發明的目的在於提供阿樸菲類、氧化阿樸菲類生物鹼、鑽山風總生物鹼鹽、鑽山風總生物鹼的醫學用途。
本發明者通過對複方鑽山風糖漿(通過大孔吸附樹脂去除水溶性成分)和鑽山風總鹼及其鹽在與風溼性關節炎相關的體外篩選模型T/B淋巴細胞的增殖反應(免疫調節)、血小板集聚試驗(心血管系統，血栓形成)、人環氧化酶-2(hCox-2)抑制劑篩選(抗炎、鎮痛)等生物活性評價，結果表明複方鑽山風糖漿和鑽山風總鹼對T/B淋巴細胞均有較強抑制作用，且活性相當。都無拮抗血小板集聚作用(心血管系統，血栓形成)、無抑制人環氧化酶-2(hCox-2)活性；對總鹼進行系統分離純化、生物活性評價，發現阿樸菲和氧化阿樸菲生物鹼具有強的抑制活性，說明鑽山風糖漿劑、鑽山風的抗炎活性是通過免疫抑制起作用，作用的物質基礎是生物鹼類成分，從而完成了本發明。
本發明通過下列步驟實施本發明提供的阿樸菲類、氧化阿樸菲類生物鹼是通式(1)、(2)所示化合物或其藥學上可接受的鹽或它們的光學異構體。
其中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7選自H、OH、O-acyl、OMe、OEt，OnPr(n代表正)、OiPr(i代表異)、F、Cl、Br、NH2、NO2或CN；R8選自H、C1-C10的烷基、醯基。通式(2)所示氧化阿樸菲類生物鹼，當R2、R3、R5、R6均為OMe，即化合物氧化海罌粟鹼(oxoglaucine)除外。
也可以是通式(3)、(4)所代表的化合物或其藥學上可接受的鹽或它們的光學異構體作為活性成分 其中，R1、R2、R3、R4、R5選自H、OH、O-acyl、OMe、OEt，OnPr(n代表正)、O′Pr(i代表異)、F、Cl、Br、NH2、NO2或CN；R6選自H、C1-C10的烷基、醯基。
鑽山風總鹼的化學成分研究鑽山風4公斤，用95％乙醇提取3次，合併乙醇提取液，減壓回收溶劑得幹浸膏86g，先用適量的200mL 2％鹽酸和100mL氯仿溶解分配，酸水相再用100mL氯仿再萃取2次，然後用氨水調節水相的pH到9-10，用100mL氯仿萃取3次，合併氯仿相，減壓濃縮得32g總生物鹼樣品。經矽膠(200-300目)柱層析，CHCl3-CH3OH梯度洗脫，再經MCI柱層析(CH3OH-H2O梯度洗脫)，Sephadex LH-20(CH3OH洗脫)及ODS柱層析，得化合物瓜馥木鹼甲(calycinine)，275mg)、瓜馥木甲素(N-methyl-2，3，6-trimethoxymorphinandien-7-one，28mg)、木番荔枝鹼(xylopine，220mg)、可列班寧(crebanine，12mg)、異構月桂鹼(isolaureline，5mg)、巴婆鹼(asimilobine，15mg)、3-甲氧基瓜馥木鹼甲(3-methoxycalycinine，13mg)、紫堇塊莖鹼(corytuberine，12mg)、4，5-二氧代去氫巴婆鹼(4，5-dioxodehydroxyasimilobine，33mg)、異波爾定鹼(isoboldine，25mg)、氧化瓜馥木鹼甲(oxocalycinine，10mg)、海罌粟鹼(glaucine，7mg)、去甲頭花千金藤二酮B(norcepharadione B，6mg)、氧化木番荔枝鹼(oxoxylopine，6mg)、1，2，3甲氧基氧化阿樸菲(1，2，3-trimethoxyoxoaporphine，25mg)。

化合物瓜馥木鹼甲白色針晶(CHCl3-CH3OH)，mp 156℃，碘化鉍鉀試劑反應呈橙色(+)；分子式C18H17NO4；EI-MS m/z311[M]+，310[M-1]+，294[M-17]+，282[M-29]+，267，252，238，224，209，181，152，126，119，90；1H NMR(CDCl3)δ6.60(1H，s，H-3)，6.50(1H，s，H-8)，6.46(1H，s，H-10)，6.09，5.95(2H，d，J＝1.2Hz，O-CH2O)，3.81(3H，s，OCH3-9)；13C NMR(CDCl3)δ160.7(C-9)，155.1(C-11)，145.8(C-2)，138.9(C-1)，139.2(C-7a)，129.7(C-1b)，128.3(C-3a)，114.6(C-1a)，111.3(C-11a)，107.8(C-8)，107.6(C-3)，102.5(C-10)，100.1(O-CH2-O)，55.4(OCH3-9)，53.7(C-6a)，43.1(C-5)，39.0(C-7)，29.7(C-4)。以上MS、1H NMR和13C NMR數據與文獻報導的瓜馥木鹼甲[徐昌瑞(Xu CR)，謝平(Xie P)，朱英(Zhu Y)等.瓜馥木化學成分研究(1)[J].中草藥(Chin Tradit Herb Drugs)，1983，14(4)4-6；Guinaudeau H，Leboeuf M and Cave A.J NatProd，1983，46(6)761-835.]數據一致，鑑定該化合物為瓜馥木鹼甲。
化合物瓜馥木甲素白色針晶(CHCl3-CH3OH)，mp 112-113℃，碘化鉍鉀試劑反應呈橙色(+)；分子式C20H23NO4；EI-MS m/z341[M]+，326[M-CH3]+，313[M-CO]+，298[M-CH3-CO]+，282，270，256，139；1H NMR(CDCl3)δ6.80(1H，s，H-8)，6.63(1H，s，H-5)，6.36(1H，s，H-4)，6.33(1H，s，H-1)，3.88(3H，s，OCH3-2)，3.85(3H，s，OCH3-3)，3.80(3H，s，OCH3-6)，3.72(1H，d，J＝6.0Hz，Hβ-9)，3.35(1H，d，J＝18.0Hz，Hα-10)，3.06(1H，dd，J＝6.0，18.0Hz，Hβ-10)，2.60(2H，m，H-16)，2.46(3H，s，N-CH3)，1.92(2H，m，H-15)；13C NMR(CDCl3)δ181.1(C＝O)，161.6(C-14)，151.6(C-6)，148.5(C-3)，148.2(C-2)，130.0(C-12)，128.7(C-11)，122.6(C-8)，119.0(C-5)，110.5(C-1)，108.7(C-4)，60.9(C-9)，56.4(OCH3-3)，56.1(OCH3-2)，55.3(C-6)，45.7(C-16)，42.4(C-13)，41.7(N-CH3)，41.0(C-15)，32.8(C-10)。以上MS、1H NMR和13C NMR數據與文獻報導的瓜馥木甲素[Wu JB，Cheng YD，Chiu NY，et al.Planta Med，1993，59(1)179-180.]數據一致，鑑定該化合物為瓜馥木甲素。
化合物木番荔枝鹼白色針晶(CHCl3)，碘化鉍鉀試劑反應呈橙色(+)；分子式C18H17NO3；EI-MS m/z295[M]+，294[M-1]+，280[M-17]+，282[M-29]+，265，251，236，221，208；1H NMR(CDCl3)δ8.02(1H，d，J＝8.7Hz，H-11)，6.87(1H，dd，J＝2.4，8.7Hz，H-10)，6.79(1H，d，J＝2.4Hz，H-8)，6.53(1H，s，H-3)，6.06，5.93(2H，d，J＝1.2Hz，O-CH2-O)，3.84(3H，s，OCH3-9)；13C NMR(CDCl3)δ159.0(C-9)，146.8(C-2)，137.3(C-1)，139.2(C-7a)，129.7(C-1b)，128.3(C-3a)，114.6(C-1a)，111.3(C-11a)，107.8(C-8)，107.6(C-3)，102.5(C-10)，100.7(O-CH2-O)，55.5(OCH3-9)，53.7(C-6a)，43.7(C-5)，37.8(C-7)，29.7(C-4)。以上MS、1H NMR和13C NMR數據與文獻報導的木番荔枝鹼[徐昌瑞(Xu CR)，謝平(Xie P)，朱英(Zhu Y)等.中草藥(Chin Tradit HerbDrugs)，1983，14(4)4-6；Roblot F，Hocquemiller R and Cave A.J Nat Prod，1983，46(6)862-873.]數據一致，鑑定該化合物為木番荔枝鹼。
化合物可列班寧碘化鉍鉀試劑反應呈橙色(+)；mp 115-117℃，分子式C20H21NO4；ESI-MS m/z340[M+H]+；1H NMR(CDCl3)δ8.02(1H，d，J＝8.7Hz，H-11)，6.88(1H，d，J＝8.7Hz，H-10)，6.53(1H，s，H-3)，6.06，5.92(2H，d，J＝1.2Hz，O-CH2-O)，3.91(3H，s，OCH3-9)，3.82(3H，s，OCH3-8)，2.59(3H，s，N-CH3)。以上1H NMR數據與文獻報導的可列班寧[Guinaudeau H，Leboeuf M andCave A.J Nat Prod，1983，46(6)761-835.]數據一致，鑑定該化合物為可列班寧。
化合物異構月桂鹼碘化鉍鉀試劑反應呈橙色(+)；mp 108-110℃，分子式C19H19NO3；ESI-MS m/z310[M+H]+；1H NMR(CDCl3)δ8.01(1H，d，J＝8.7Hz，H-11)，6.87(1H，dd，J＝1.8，8.7Hz，H-10)，6.83(1H，d，J＝1.8Hz，H-8)，6.52(1H，s，H-3)，6.07，5.94(2H，d，J＝1.5Hz，O-CH2-O)，3.85(3H.s，OCH3-9)，2.57(3H，s，N-CH3)。以上1H NMR數據與文獻報導的異構月桂鹼[Guinaudeau H，Leboeuf M and Cave A.J Nat Prod，1983，46(6)761-835.]數據一致，鑑定該化合物為異構月桂鹼。
化合物巴婆鹼碘化鉍鉀試劑反應呈橙色(+)；mp 177-179℃，分子式C17H17NO2；EI-MS m/z267[M]+，266[M-H]+，252[M-15]+，236[M-31]+，224[M-43]+，206；1H NMR(CDCl3)δ8.28(1H，d，J＝7.5Hz，H-11)，7.24～7.30(3H，m，H-10，9，8)，6.69(1H，s，H-3)，3.59(3H，s，OCH3-1)，2.57(3H，s，N-CH3)。以上1H NMR數據與文獻報導的巴婆鹼[Guinaudeau H，Leboeuf M and Cave A.J NatProd，1983，46(6)761-835.]數據一致，鑑定該化合物為巴婆鹼。
化合物3-甲氧基瓜馥木鹼甲白色針晶(CHCl3-CH3OH)，mp 165℃，碘化鉍鉀試劑反應呈橙色(+)；分子式C19H19NO5；EI-MS m/z341[M]+，310[M-1]+，326[M-15]+，310[M-31]+，296，282，267；1H NMR(CDCl3)δ6.49(1H，d，J＝2.4Hz，H-10)，6.44(1H，d，J＝2.4Hz，H-8)，6.07，5.93(2H，d，J＝1.5Hz，O-CH2-O)，4.03(3H，s，OCH3-3)，3.80(3H，s，OCH3-9)；13C NMR(CDCl3)δ160.3(C-9)，154.5(C-11)，140.5(C-3)，140.2(C-1)，138.8(C-7a)，134.1(C-2)，130.8(C-1b)，120.8(C-3a)，111.4(C-11a)，108.7(C-1a)，107.8(C-8)，103.5(C-10)，100.1(O-CH2-O)，59.7(OCH3-3)，55.5(OCH3-9)，53.9(C-6a)，42.9(C-5)，39.0(C-7)，24.4(C-4)。以上MS、1H NMR和13C NMR數據與文獻報導的3-甲氧基瓜馥木鹼甲[Guinaudeau H，Leboeuf M and Cave A.J Nat Prod，1983，46(6)761-835；Roblot F，Hocquemiller R and Cave A.J Nat Prod，1983，46(6)862-873.]數據一致，鑑定該化合物為3-甲氧基瓜馥木鹼甲。
化合物紫堇塊莖鹼白色針晶(CH3OH)，mp 240℃，碘化鉍鉀試劑反應呈橙色(+)；分子式C18H21NO4；EI-MSm/z327[M]+，326[M-1]+，312[M-15]+，310[M-31]+，284[M-43]+，266；1H NMR(DMSO-d6)δ6.78(1H，d，J＝8.1Hz，H-9)，6.62(1H，d，J＝8.1Hz，H-8)，6.13(1H，s，H-3)，3.72(6H，s，OCH3-2，10)，2.63(3H，s，N-CH3)；13C NMR(DMSO-d6)δ149.1(C-2，10)，146.3(C-1)，144.6(C-11)，128.2(C-1b)，125.2(C-3a)，122.0(C-7a)，121.1(C-11a)，119.9(C-1a)，116.6(C-8)，110.3(C-9)，110.0(C-3)，62.5(C-6a)，55.8(OCH3-10)，55.5(OCH3-2)，42.0(N-CH3)，34.0(C-7)，26.9(C-4)。以上MS、1H NMR數據與文獻報導的紫堇塊莖鹼[Guinaudeau H，Leboeuf M and CaveA.J Nat Prod，1975，38(4)275-338.]數據一致，鑑定該化合物為紫堇塊莖鹼。
化合物4，5-二氧代去氫巴婆鹼紅色粉末，mp 278-280℃，碘化鉍鉀試劑反應呈紅色(+)；難溶於甲醇，氯仿，水等溶劑；在丙酮，乙醇中呈黃綠色螢光。UV(CH3OH)λmax(logε)243(4.03)，287(4.62)，302(4.58)，315(4.56)，383(4.77)，444(4.63)nm；IRυmax(KBr)cm-13540，3476，3183，1671，1615，1398，1297；1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ4.05(3H，s，OCH3-1)，7.48(1H，s，H-7)，7.64，7.65(2H，m，H-9，10)，7.91(1H，m，H-8)，8.09(1H，s，H-3)，9.44(1H，m，H-11)，10.72(1H，s，OH-2)，12.01(1H，s，NH)；13C NMR(DMSO-d6，100MHz)δ59.6(CH3，CH3O-1)，111.9(CH，C-7)，117.0(CH，C-1)，117.2(C，C-1b)，124.0(C，C-1a)，124.7(C，C-3a)，126.0(C，C-11a)，126.6(CH，C-10)，127.1(CH，C-11)，127.8(CH，C-9)，128.3(CH，C-8)，130.3(C，C-6a)，132.4(C，C-8a)，151.0(C，C-2)，152.8(C，C-1)，155.6(C，C-5)，177.0(C，CO)；ESI-MS m/z 294[M+H]+，292[M-H]+；HRESI-MS m/z 294.0761(calc for C18H11NO5294.0766)。以上數據與文獻報導的4，5-二氧代去氫巴婆鹼[Hans A，Dieter F，Reiner W.J Nat Prod，1991，54(5)1331-1336.]數據一致，鑑定該化合物為4，5-二氧代去氫巴婆鹼。
化合物異波爾定鹼白色針晶(CHCl3)，mp 178-180℃，碘化鉍鉀試劑反應呈橙色(+)；分子式C19H21NO4；EI-MS m/z327[M]+，326[M-1]+，312[M-15]+，295，284[M-43]+，269，253；1H NMR(CDCl3)δ8.02(1H，s，H-11)，6.78(1H，s，H-8)，6.53(1H，s，H-3)，3.91，3.90(6H，s，OCH3-2，10)，2.54(3H，s，N-CH3)；以上MS、1H NMR數據與文獻報導的異波爾定鹼[Anis E，Ais I，Ahmed S，et al.Chem Pharm Bull，2002，50(1)112-114.]數據一致，鑑定該化合物為異波爾定鹼。
化合物氧化瓜馥木鹼甲紅色粉末，mp 276-278℃，碘化鉍鉀試劑反應呈橙色(+)；結合1H NMR、13C NMR和HREI-MS(m/z 321.0623[M]+)，推出其分子式為C18H11NO5；其1H NMRδH8.73(1H，d，J＝5.1Hz，H-5)，δH7.95(1H，d，J＝5.1Hz，H-4)，δH7.41(1H，s，H-3)，δH7.34(1H，d，J＝2.7Hz，H-8)，δH6.85(1H，d，J＝2.7Hz，H-10)，δH6.34(2H，s，O-CH2-O-1，2)，δH4.02(3H，s，OCH3)與oxoisocalycinine[Hocquemiller R，Debitus C，Roblot F，et al.J Nat Prod，1984，47(1)353-362.]相似；其1H-1H COSY顯示δH8.73的質子與δH7.95質子有遠程相關，δH7.34的質子與δH6.85質子有遠程相關；其NOESY譜顯示δH8.73的質子與δH7.95芳香質子有NOE效應，δH7.95質子與δH7.41質子有NOE效應，δH4.02的OCH3與δH7.34和δH6.85芳香質子有NOE效應，從而確定OCH3取代位置應在9位。根據以上數據，鑑定化合物G-15為oxocalycinine。經文獻檢索該化合物為一新化合物，命名為氧化瓜馥木鹼甲(oxocalycinine)。
氧化瓜馥木鹼甲的理化及波譜數據紅色粉末，mp 276-278℃，碘化鉍鉀試劑反應呈橙色(+)；UVλ(nm)384.0，277.2，245.0，208.8，357.8；1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ4.02(3H，s，OCH3)，6.34(2H，s，O-CH2-O-1，2)，6.85(1H，d，J＝2.7Hz，H-10)，7.34(1H，d，J＝2.7Hz，H-8)，7.41(1H，s，H-3)，7.95(1H，d，J＝5.1Hz，H-4)，8.73(1H，d，J＝5.1Hz，H-5)；13C NMR(75.0MHz，DMSO-d6)δ55.5(CH3，CH3O-9)，101.5(CH，C-10)，102.1(CH2，O-CH2-O)，102.7(CH，C-8)，107.9(CH，C-3)，113.6(C，C-8a)，122.4(C，C-1a)，124.0(CH，C-4，1b)，134.2(C，C-11a)，135.4(C，C-3a)，144.0(C，C-1)，144.1(CH，C-5)，146.5(C，C-2)，152.2(C，C-11)，156.8(C，C-6a)，160.3(C，C-9)，181.3(C，CO)；EI-MS m/z321[M]+(100)，320(55)，295(38)，292(20)，293(13)，277(11)，266(10)，265(51)，252(10)，250(42)，234(13)，222(23)，166(15)，164(27)，139(10)，84(52)，66(56)；HREI-MS m/z321.0623(calc for C18H11NO5321.0637)。
化合物海罌粟鹼碘化鉍鉀試劑反應呈橙色(+)；mp 226-227℃，分子式C21H25NO4；EI-MS m/z355[M]+，354[M-1]+，340[M-15]+，324[M-31]+，308，297，281，265，250，162，140；1H NMR(CDCl3)δ8.10(1H，s，H-11)，6.79(1H，s，H-8)，6.59(1H，s，H-3)，3.93(3H，s，OCH3-9)，3.91(3H，s，OCH3-10)，3.89(3H，s，OCH3-2)，3.66(3H，s，OCH3-1)，2.56(3H，s，N-CH3)；以上MS、1H NMR數據與文獻報導的海罌粟鹼[Guinaudeau H，Leboeuf M and Cave A.J Nat Prod，1975，38(4)275-338.]數據一致，鑑定該化合物為海罌粟鹼。
化合物去甲頭花千金藤二酮B黃色粉末，mp 274-276℃，碘化鉍鉀試劑反應呈紅色(+)；難溶於甲醇，氯仿，水等溶劑；在甲醇中呈黃綠色螢光。UV(CH3OH)λmax(logε)213(4.35)，235(4.32)，240(4.32)，301(4.23)，313(4.69)，441(4.75)nm；IR υmax(KBr)cm-13475，3458，2947，1711，1584，1391，1291，1128，738；1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ4.03(3H，s，OCH3-2)，4.07(3H，s，OCH3-1)，7.46(1H，s，H-7)，7.64，7.65(2H，m，H-9，10)，7.89(1H，m，H-8)，8.09(1H，s，H-3)，9.37(1H，m，H-11)，12.02(1H，s，OH-5)；13C NMR(DMSO-d6，100MHz)δ56.5(CH3，CH3O-2)，60.1(CH3，CH3O-1)，112.6(CH，C-3)，112.7(CH，C-7)，118.2(C，C-1b)，123.6(C，C-1a)，124.6(C，C-3a)，125.9(C，C-11a)，126.9(CH，C-10)，127.2(CH，C-11)，128.0(CH，C-9)，128.4(CH，C-8)，130.1(C，C-6a)，132.4(C，C-8a)，152.7(C，C-2)，153.9(C，C-1)，155.5(C，C-5)，176.8(C，CO)；EI-MSm/z[M]+307(100)，279(71)，264(34)，263(24)，236(50)，221(41)，209(41)，193(56)，181(48)，164(66)，150(33)，125(21)，111(19)，97(29)，83(54)，69(29)，43(21)；HREI-MS m/z 307.0848(calc.for C18H11NO5307.0845)。以上數據與文獻報導的去甲頭花千金藤二酮B[Hans A，Dieter F，Reiner W.J Nat Prod，1991，54(5)1331-1336.]數據一致，鑑定該化合物為去甲頭花千金藤二酮B。
化合物氧化木番荔枝鹼紅色粉末，mp 319-321℃，碘化鉍鉀試劑反應呈紅色(+)；分子式C18H11NO4；EI-MS m/z305[M]+，290[M-15]+，275，247，234，217，204，176，149，117；1HNMR(CDCl3)δ8.87(1H，d，J＝5.1Hz，H-5)，8.48(1H，d，J＝9.0Hz，H-11)，7.99(1H，d，J＝2.7Hz，H-8)，7.73(1H，d，J＝5.1Hz，H-4)，7.26(1H，dd，J＝9.0，2.7Hz，H-10)，7.09(1H，s，H-3)，6.33(2H，s，O-CH2-O)，3.99(3H，s，OCH3-9)；以上MS、1H NMR數據與文獻報導的氧化木番荔枝鹼[Roblot F，HocquemillerR and Cave A.J Nat Prod，1983，46(6)862-873.]數據一致，鑑定該化合物為氧化木番荔枝鹼。
化合物1，2，3-甲氧基氧化阿樸菲橙色粉末，mp 188℃，碘化鉍鉀試劑反應呈紅色(+)；分子式C19H15NO4；EI-MS m/z321[M]+，306[M-15]+，291，278，263，248，235，220，192，164；1H NMR(CDCl3)δ9.04(1H，d，J＝8.4Hz，H-11)，8.90(1H，d，J＝5.7Hz，H-5)，8.15(1H，d，J＝5.7Hz，H-4)，8.50(1H，dd，J＝8.1，1.5Hz，H-8)，7.68(1H，m，H-10)，7.47(1H，m，H-9)，4.17(3H，s，OCH3)，4.09(3H，s，OCH3)，4.05(3H，s，OCH3)；以上1H NMR數據與文獻報導的1，2，3-甲氧基氧化阿樸菲[Bohlmann F，Zdero C，Ziesche J.Phytochemistry，1979，18(8)1375.]數據一致，鑑定該化合物為1，2，3-甲氧基氧化阿樸菲。
生物活性試驗1.鑽山風糖漿劑及鑽山風治療風溼性關節炎的作用機制研究鑽山風糖漿劑篩選樣品製備市售的鑽山風糖漿劑通過大孔吸附樹脂(D101型)，先用蒸餾水洗、棄去，再用95％的乙醇洗滌、減壓濃縮得送體外生物學評價樣品1。
鑽山風95％乙醇提取樣品製備鑽山風藥材經95％乙醇加熱沸騰提取3次，每次3小時，合併提取液，減壓濃縮得送體外生物學評價樣品2。
鑽山風總生物鹼樣品製備鑽山風95％乙醇提取樣品先用適量的2％鹽酸和氯仿溶解分配，酸水相用氯仿再萃取2次，然後用氨水調節水相的pH到9-10，用氯仿萃取3次，合併氯仿相，減壓濃縮得送體外生物學評價樣品3。
鑽山風總鹼鹽製備鑽山風藥材用2％硫酸加熱沸騰提取3次，每次3小時，合併提取液，上大孔樹脂，先用水洗、棄去，再再用95％的乙醇洗滌、減壓濃縮得送體外生物學評價樣品4。
我們選擇了與風溼性關節炎相關的體外生物學評價模型---T/B淋巴細胞的增殖反應(免疫調節)、血小板集聚試驗(心血管系統，血栓形成)、人環氧化酶-2(hCox-2)抑制劑篩選(抗炎、鎮痛)對上述樣品進行系統的評價，發現以上四者對T/B淋巴細胞均有較強抑制作用，而對血小板集聚試驗(心血管系統，血栓形成)、人環氧化酶-2(hCox-2)抑制(抗炎、鎮痛)等都沒有顯示活性。
表1.複方製劑及鑽山風不同提取部位的抑制T、B細胞增殖的活性

從表1的數據可以說明鑽山風總鹼可以代表鑽山風糖漿的抑制T、B細胞增殖的活性的有效成分。通過體外的幾種與風溼性關節炎相關的體外生物學評價模型，鑽山風糖漿臨床治療風溼性關節炎是通過免役抑制的機制起作用的。
3.鑽山風免疫生物活性篩選實驗模型名稱T、B淋巴細胞的增殖反應及細胞毒性實驗篩選方法BALB/C小鼠脾臟淋巴細胞在有絲分裂原ConA，LPS的刺激下，細胞的形態和代謝可發生一系列的變化，轉化為母細胞，並分化增殖。本實驗加入ConA(刀豆蛋白A)5ug/ml誘導T淋巴細胞增殖。加入LPS(脂多糖)10ug/ml誘導B淋巴細胞增殖。以3H-TdR摻入法定量測定細胞的增殖。活細胞內線粒體脫氫酶能將MTT有黃色還原成藍色的甲肷，甲肷產量與活細胞成正比。用有機溶劑溶解後，可用酶標儀檢測OD值。
測試體系體外表2.從鑽山風95％乙醇提取物中分離得到的單體的抑制T、B細胞增殖的活性

從表2的抑制T、B細胞增殖的活性成分主要為阿樸菲和氧化阿樸菲生物鹼類成分。據報導某些阿樸菲和氧化阿樸菲生物鹼類作為多巴胺激動劑，用於治療帕金森綜合症、偏頭疼、性功能障礙等(US2005143408)；某些阿樸菲和氧化阿樸菲生物鹼類通過保存或增加內皮性一氧化氮合成酶，可以預防、治療局部缺血性疾病(CN1566100)；阿樸菲和氧化阿樸菲生物鹼類還有用於治療B肝(CN1425652)、腫瘤(CN1267670)、十二指腸潰瘍(GB2105323)等等。保加利亞科學家Stefan Philipov等曾報導氧化阿樸菲oxoglaucine具有免疫調節功能(Pharmacological Research，1997，35(4)267-272；2000，41(1)101-107；DiagnosticMicrobiology and Infection Disease，2000，3817-20)。除oxoglaucine外，未見阿樸菲和氧化阿樸菲生物鹼類具有免疫抑制活性的報導。oxocalycinine是由本發明者發現的新化合物具有很強的免疫抑制活性。
作為本發明活性成分的通式(1)、(2)、(3)和(4)的阿樸菲和氧化阿樸菲生物鹼來自植物，例如，鑽山風Fissistigma oldhamii(Hemsl.)Merr.為番荔枝科(Annonaceae)瓜馥木屬植物瓜馥木的根或藤莖。它具有祛風除溼，活血止痛之功效，主治風溼痺痛，腰痛，胃痛，跌打損傷[《中華本草》編委會編.中華本草[M].
本發明的免疫抑制劑不局限於含有純化形式阿樸菲和氧化阿樸菲生物鹼作為活性成分的藥劑。其可以是含有植物如鑽山風的總生物鹼、總生物鹼鹽提取物作為包括阿樸菲和氧化阿樸菲生物鹼的活性成分的藥劑。鑽山風根或藤莖提取物可以是凍乾粉末形式或液體形式。


圖1是化合物Oxocalycinine的核磁共振氫譜。
圖2是化合物Oxocalycinine的核磁共振碳譜。
具體實施例方式
實施例11000克鑽山風藤莖或根(採自江西)，以2％硫酸水溶液(第一次3800毫升，第二次3000毫升，第三次3000毫升)熱提3次，每次3小時，過濾後上D101大孔樹脂，先用水洗，再用20％洗、棄去，50％的乙醇水溶液洗脫，減壓濃縮得總鹼硫酸鹽樣品6.4克。以紫外分光光度法測得總生物鹼硫酸鹽含量(以calycinine硫酸鹽為對照品，重量比)為53.4％。以高效液相法測得的calycinine硫酸鹽和xylopine硫酸鹽含量分別為6.4％、4.8％。
實施例21000克鑽山風藤莖或根(採自江西)，以2％硫酸水溶液(第一次3800毫升，第二次3000毫升，第三次3000毫升)熱提3次，每次3小時，過濾後用氨水調pH至8-9後，然後用乙醇調至成30％乙醇溶液後，上D101大孔樹脂，用30％、90％的乙醇水溶液洗脫，90％洗脫餾分減壓濃縮得總鹼樣品4.9克。以紫外分光光度法測得總生物鹼含量(以calycinine為對照品，重量比)為59.8％。以高效液相法測得的calycinine和xylopine含量分別為5.7％、5.3％。
實施例31000克鑽山風藤莖或根(採自江西)，以80％乙醇水溶液(第一次3800毫升，第二次3000毫升，第三次3000毫升)熱提3次，每次3小時，過濾後濃縮至浸膏，浸膏再用200毫升2％硫酸捏溶，過濾後清夜上D101大孔樹脂，先用水洗，再用20％、50％的乙醇水溶液洗脫，50％的乙醇水溶液洗脫餾分減壓濃縮得總鹼鹽樣品6.0克。以紫外分光光度法測得總生物鹼硫酸鹽含量(以calycinine硫酸鹽為對照品，重量比)為51.8％。以高效液相法測得的calycinine硫酸鹽和xylopine硫酸鹽含量分別為6.0％、5.1％。
實施例41000克鑽山風藤莖或根(採自江西)，以80％乙醇水溶液(第一次3800毫升，第二次3000毫升，第三次3000毫升)熱提3次，每次3小時，過濾後濃縮至浸膏，浸膏再用200毫升2％硫酸捏溶，過濾後清液用氨水調pH至8-9後，然後用乙醇調至成30％乙醇溶液後，上D101大孔樹脂，用30％、90％的乙醇水溶液洗脫，90％的乙醇洗脫餾分減壓濃縮得總鹼鹽樣品4.7克。以紫外分光光度法測得總生物鹼硫酸鹽含量(以calycinine硫酸鹽為對照品，重量比)為59.9％。以高效液相法測得的calycinine和xylopine含量分別為5.7％、5.2％。
實施例51000克鑽山風藤莖或根(採自江西)，以2％磷酸水溶液(第一次3800毫升，第二次3000毫升，第三次3000毫升)熱提3次，過濾後濾液用氨水調pH至8-9後，然後用乙醇調至成30％乙醇溶液後，上D101大孔樹脂，用30％、90％的乙醇水溶液洗脫，90％的乙醇水溶液洗脫餾分減壓濃縮得總鹼樣品4.5克。以紫外分光光度法測得總生物鹼含量(以calycinine為對照品，重量比)為58.6％。以高效液相法測得的calycinine和xylopine含量分別為5.7％、5.4％。
實施例61000克鑽山風藤莖或根(採自江西)，以2％鹽酸水溶液滲漉提取3次，每次3天，3次滲濾液合併，過濾後濾液用氨水調pH至8-9後，然後用乙醇調至成30％乙醇溶液後，上D101大孔樹脂，用30％、90％的乙醇水溶液洗脫，90％的乙醇水溶液洗脫餾分減壓濃縮得總鹼樣品4.8克。以紫外方法測得總生物鹼含量(重量比)53.6％。以高效液相法測得的calycinine和xylopine含量分別為5.9％、4.7％。
實施例7calycinine和xylopine製備方法以2％硫酸酸水溶液提取的鑽山風總鹼(由實例2方法製備)20克，經矽膠(200-300目)柱層析，CHCl3-CH3OH梯度洗脫，收集CHCl3-CH3OH(15∶1～10∶1)部分，再經MCI柱層析，CH3OH-H2O梯度洗脫，CH3OH-H2O(60∶40)洗脫部分，再經Sephadex LH-20柱層析，CH3OH洗脫，合併，置於CHCl3-CH3OH中，放置，析出白色針晶，過濾，CH3OH洗滌，置乾燥器中，即得852mg calycinine；MCI柱CH3OH-H2O(65∶35)洗脫部分，再經Sephadex LH-20柱層析，CH3OH洗脫，合併，置於CHCl3-CH3OH中，放置，析出白色針晶，過濾，CH3OH洗滌，置乾燥器中，即得767mg xylopine。
calycinine硫酸鹽的製備方法calycinine用甲醇溶解，滴加硫酸，使其pH值達2，放置30min，TLC檢測為一個點，濃縮至小體積，經Sephadex LH-20柱層析，CH3OH-H2O洗脫，收集紫外下(254nm)有暗斑流分，合併，回收溶劑，即得。
xylopine硫酸鹽的製備方法xylopine用甲醇溶解，滴加硫酸，使其pH值達2，放置30min，TLC檢測為一個點，濃縮至小體積，經Sephadex LH-20柱層析，CH3OH-H2O洗脫，收集紫外下(254nm)有暗斑流分，合併，回收溶劑，即得。
實施例8 製備oxocalycinine的方法 i)將calycinine(G-1，100mg，0.32mmole)，無水酒精(30mL)及無水氫氧化鉀(0.8g)依序加入150mL的圓底瓶中，在70℃油浴中攪拌。在1小時內逐滴加入(3.4g，20mmole)的苄溴10mL無水DMF溶液，反應8小時後冷卻至室溫，濾除無機沉澱物，再以酒精洗滌沉澱，將濾液與洗滌液減壓濃縮後的殘留物溶於100mL氯仿，以10％氫氧化鈉水溶液(50mL)及水(50mL×3)連續抽提雜質，氯仿層再以無水硫酸鈉脫水，鹼壓濃縮所得殘留物再用Sephadex LH-20柱層析，CH3OH洗脫，得N-benzyl-11-benzyloxy-xylopine(144mg，產率92％)。
ii)將四乙酸鉛(95％，240mg，0.5mmole)加入化合物N-benzyl-11-benzyloxy-xylopine(123mg，0.25mmole)的乙酸溶液(5mL)中，在室溫下反應12小時。反應液加入水(100mL)，以氯仿(50mL×4)連續抽提，氯仿層再以飽合碳酸氫鈉水溶液(50mL)，10％硫代硫酸鈉水溶液(50mL)及水(50mL×2)連續洗滌，再以無水硫酸鈉脫水，減壓濃縮，所得殘留物再以矽膠柱層析，以氯仿-甲醇(80∶1)洗脫得11-benzyloxy-oxoxylopine(53mg，產率52％)。
iii)將11-benzyloxy-oxoxylopine(50mg，0.12mmole)乙溶於乙酸乙酯(25mL)，加入Pd-C(10mg)，加上一氫氣球，室溫攪拌過夜。用硅藻土過濾，將濾液減壓濃縮得褐色oxocalycinine(38mg，產率98％)。
實施例9抑制DNFB誘導的小鼠遲發性超敏反應(DTH)動物實驗樣品鑽山風總鹼硫酸鹽由實例1方法製備，以紫外分光光度法測得總生物鹼硫酸鹽含量(重量比)為52.8％。以高效液相法測得的calycinine硫酸鹽和xylopine硫酸鹽含量分別為6.2％、4.9％。鑽山風總鹼由實例2方法製備，以紫外分光光度法測得總生物鹼硫酸鹽含量(重量比)為59.8％。以高效液相法測得的calycinine硫酸鹽和xylopine硫酸鹽含量分別為5.8％、5.2％。
試驗動物Balb/c純系小鼠，6-8周齡，購於中科院上海實驗動物中心，動物合格證書號中科滬動管第99-003號。動物飼養於中科院上海藥物所清潔級動物房，12小時光/暗循環，24℃室溫，50-60％溼度。
試劑山地明(環抱菌素注射液，50mg/mL)由瑞士Novartis製藥公司生產，批號143MFD0600。
實驗方法i. Balb/c小鼠(雌性，6-8周齡)，每隻腳以20uL 0.5％DNFB致敏，次日加強(DNFB溶於[丙酮∶橄欖油＝4∶1]油劑中；ii. 第7-9天，鼠左耳內外兩側各10uL 0.4％DNFB進行攻擊；iii.攻擊前1小時灌胃一次，12小時後再給藥一次；iv. 攻擊後24-48小時，檢測各指標。
實驗結果在經典的DNFB誘導的小鼠遲發性超敏反應(DTH)模型上，檢測了鑽山風總鹼及總鹼鹽是否對細胞介導免疫反應具有免疫抑制活性作用。口服灌胃給藥，每日一次，共2次，結果顯示鑽山風總鹼硫酸鹽和鑽山風總鹼能顯著的抑制DTH這一細胞介導的免疫反應(見表3)。
表3 鑽山風總鹼硫酸鹽和鑽山風總鹼對DNFB誘導的小鼠遲發性超敏反應的抑制作用

*Balb/c小鼠，n＝10。
權利要求
1.一類鑽山風鹼、鑽山風鹽鹼包括結構式如下的阿樸菲、氧化阿樸菲類生物鹼及其藥學上可接受的鹽或它們的光學異構體 其中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7選自H、OH、O-acyl、OMe、OEt，OnPr(n代表正)、OiPr(i代表異)、F、Cl、Br、NH2、NO2或CN；R8選自H、C1-C10的烷基、醯基；通式(2)所示氧化阿樸菲類生物鹼，當R2、R3、R5、R6均為OMe，即化合物oxoglaucine除外；通式(3)、(4)所代表的化合物或其藥學上可接受的鹽或它們的光學異構體作為活性成分 其中，R1、R2、R3、R4、R5選自H、OH、O-acyl、OMe、OEt，OnPr(n代表正)、OiPr(i代表異)、F、Cl、Br、NH2、NO2或CN；R6選自H、C1-C10的烷基、醯基；的醫學用途作為免疫抑制劑在製備治療由免疫亢進、免疫失調、自身免疫引起的疾病的藥物中應用。
2.根據權利要求1所述的阿樸菲、氧化阿樸菲類生物鹼及其藥學上可接受的鹽或它們的光學異構體的醫學用途，其特徵在於包括如下化合物 calycinineN-methyl-2，3，6-trimethoxy-xylopinemorphinandien-7-one crebanine isolaureline asimilobine 3-methoxycalycininecorytuberine 4，5-dioxodehydroxyasimilobine isoboldine oxocalycinine glaucine norcepharadioneB oxoxylopine 1，2，3-trimethoxyoxoaporphine
3.根據權利要求1所述的阿樸菲、氧化阿樸菲類生物鹼及其藥學上可接受的鹽或它們的光學異構體的醫學用途，其特徵在於在製備由免疫亢進、免疫失調引起的疾病包括類風溼性關節炎、自身免疫性肝炎、胰島素依賴性糖尿病、潰瘍性結腸炎、多發性硬化、硬皮病、重症肌無力、多發肌炎、自身免疫性血細胞減少症、脈管炎綜合症或系統性紅斑狼瘡、過敏性疾病、移植排異反應。
4.根據權利要求3所述的阿樸菲、氧化阿樸菲類生物鹼及其藥學上可接受的鹽或它們的光學異構體的醫學用途，其特徵在於在製備治療過敏性疾病包括支氣管哮喘、過敏性鼻炎、特應性皮炎或花粉病的藥物中應用。
5.根據權利要求3所述的阿樸菲、氧化阿樸菲類生物鹼及其藥學上可接受的鹽或它們的光學異構體的醫學用途，其特徵在於在製備治療由骨髓造血幹細胞移植所致的移植物抗宿主疾病的藥物中應用。
全文摘要
本發明公開了阿樸菲類和氧化阿樸菲類生物鹼的用途。阿樸菲類和氧化阿樸菲類生物鹼是很有效的免疫抑制劑，其通過抑制T、B淋巴細胞的增殖反應用於治療自身免疫性疾病、炎症反應、或由自身免疫疾病及其相關疾病所導致的具有組織損傷或感染的功能異常、移植的排異反應、由骨髓(造血幹細胞)移植造成的移植物抗宿主疾病或過敏性疾病。
文檔編號A61P37/00GK1923813SQ20051002926
公開日2007年3月7日 申請日期2005年8月31日 優先權日2005年8月31日
發明者胡立宏, 左建平, 鄭宗平, 周宇, 鐘相根 申請人:中國科學院上海藥物研究所