一種大黃魚抗菌肽hepcidin基因啟動子序列及其應用的製作方法
2023-05-24 15:23:16 2
專利名稱：一種大黃魚抗菌肽hepcidin基因啟動子序列及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種抗菌肽基因啟動子，尤其是涉及一種大黃魚抗菌肽hepcidin基因啟動子序列及其應用。
背景技術：
Hepcidin是近年來新發現的一類具有獨特性質的小分子抗菌肽。Krause等(1.Krause A, Neitz S，Magert HJ，et al.LEAP-1，a novel highly disulfide-bondedhuman peptide,exhibits antimicrobial activity[J].FEBS Lett, 2000，480:147-150)首次從人血液中分離純化了一條小分子抗菌肽，並將其命名為肝臟表達的抗菌肽(LEAPl)。隨後，Park 等(2.Park C H, Valor e E V, Waring A J，et al.Hepcidin, aurinary antimicrobial peptide synthesized in the I iver[J].J BiolChem, 2001，276(11):7806-7810)從人尿液中也分離到這條小分子抗菌肽，並將其命名為hepcidin。目前，編碼h印cidin的基因已從包括魚類在內的各種脊椎動物中相繼得到克隆。與其他抗菌肽不同，hepcidin在各物種間具有較高的結構保守性，一般在成熟肽區域含有8個保守的半胱氨酸，可形成4對二硫鍵，使其分子結構高度緊縮(3.Hunter H N，FultonD B,Ganz T，et al.The solution structure of human hepcidin, a peptide hormonewith antimicrobial activity that is involved in iron uptake and hereditaryhemochromatosis [J].J Biol Chem，2002，277 (40): 37597-37603)。研究表明，hepcidin 具有廣泛的抗細菌、病毒、真菌和原生動物的生物學活性(4、Cuesta A，Meseguer J，EstebanM A.The antimicrobial peptide hepcidin exerts an important role in the innateimmunity against bacteria in the bony fish gilthead seabream[J].Mol Immunol,2008,45(8):2333 - 2342)。最近研究表明，h印cidin在維持機體鐵平衡中起著關鍵性的調控作用，參與多種代謝疾病的發病過程(5.Nemeth E and T Ganz.Regulation of ironmetabolism by hepcid in[J].Annu Rev Nutrj2006, 26;323-42.)D 鑑於 hepcidin 功能的重要性，研究其基因表達調控機制以實現對其基因表達的準確控制顯得尤為重要。Courselaud 等(6、Courselaud B，Troadec MB, Fruchon S，et al.Strain and gendermodulate hepatic hepcidinland2mRNA expression in mice[J].Blood Cell Mol Dis，2004,32:283-289)對人和鼠h印cidin基因5』側翼序列的啟動子活性進行了分析，發現它們在人肝細胞瘤及鼠肝細胞中具有很強的啟動子活性。進一步研究發現hepcidin啟動子區域存在多個轉錄因子結合位點，其具有複雜的表達調控機制。目前，hepcidin基因已從近20個魚種中相繼得到克隆。與人類及其他哺乳類動物只存在一個hepcidin基因拷貝不同(除鼠具有兩個hepcidin基因拷貝外)，魚類hepcidin基因存在多個基因拷貝，如真觸Pagrosomus major、S盧魚Lateolabrax japonicus、石斑魚Epinephelus drummondhay1、黑鯛 Sparus macrocephlus 等魚種 hepcidin 均存在多個基因拷貝(7、王克堅，海洋魚類和青蟹抗菌肽hepcidin和scygonadin的研究[J].廈門大學學報(自然科學版)，2011，50(2):418-424)。一些魚類h印cidin基因的組織表達譜及在免疫刺激條件下的表達調控也已明確。然而，目前對魚類hepcidin基因的表達調控機制仍不清楚。本申請人前期通過對病毒類似物poly (1:C)誘導大黃魚脾臟組織cDNA文庫的表達序列標籤(expressed sequence tag, EST)分析，發現了多條編碼大黃魚抗菌肽hepcidin 基因的 EST 序列(8、Zheng ff, Liu G, Ao J, et al.Expression analysis ofimmune-relevant genes in the spleen of large yellow croaker Pseudosciaenacrocea stimulated with poly 1:C[J].Fish Shellfish Immunol,2006,21(4):414_30)o進一步研究發現，這些EST序列由不同的hepcidin基因拷貝所編碼。由於啟動子是決定基因表達及其調控的關鍵因素，為了了解大黃魚抗菌肽hepcidin基因的表達調控機制，我們採用基因組步移 的方法克隆了一種大黃魚抗菌肽hepcidin基因啟動子區序列，經報告基因分析實驗證明了該大黃魚抗菌肽hepcidin基因啟動子區具有較強的啟動子活性。該大黃魚抗菌肽h印cidin基因啟動子的克隆及其強啟動子活性的驗證，在理論上將為研究大黃魚hepcidin基因的表達調控機理提供良好的實驗系統，在應用方面為利用該強啟動子構建表達載體高效表達外源基因或將該啟動子應用於轉基因魚構建創造了條件，具有重要的理論和實際意義。
發明內容
本發明的目的之一在於提供一種大黃魚抗菌肽hepcidin基因啟動子序列。本發明的目的之二在於提供一種大黃魚抗菌肽h印cidin基因啟動子的克隆與活性分析方法。本發明的目的之三在於提供一種大黃魚抗菌肽h印cidin基因啟動子的應用。本發明所述一種大黃魚抗菌肽h印cidin基因啟動子序列為:ATAAATCCCAACAAATGTGGAGCCATCGTAGTTGTATTTGTTGACTTTTGATGTTGTGGTCACCCAAAGCAAGCAAGCAGGCCAGCTGGGTTATCAGTGAACGAGACAGACTGACGCAGGGGTCCCGCGGCATGTTGTTTCACTAATTGAGTCAGCCCGGGCAATTTGGATAGACTTTGAAGATATAATGAGAATTCAAATGGCCCATGATTTTATCAGCATGCTCAGTCCACCGTTTATCAGTTTGTACCTTTATTTTGCCTTTTCTGTTATTTCATTTCCACCATTATTGATTTTCGGATTTATTCACAGCCTGATGTTGTTCTCGAATTGTTTTCCTACTCTGACAGATTAATTAATCTTAAAGTGTTTATCGCCGCTTCACTGATAAGAGGAAAAATAATCCTCACAATCTTGAGTAGAGTTCTTGGGTTTTTTTTCTATGCACATGTAACAATCTGGATTATTATCATTATGTAACTGTCATTACATTCACACGGTTGTAATTTCACACTGTTAATATATTTATGAACCTAACATGCTGTGTGGCAGGAAATTAGTAATGATATTTTAATGAAACAAGCAGCTGTCCTTTGTCTGGATTTCAATATATCATTCTTACATAATGAAGAACCTAACATGCACAATATAGAAAATGACAGGGAATATATATATAAAGATACAAAATATATAATGATATAGGCTAGATTTGTATTGTAAAAAAAAAAACTTGGGGCAATGCACTTCTTCGCTTTCCAGACATAAACATAATCACATTACATTATATTCGTTTTTATCTAATGCATATTGAAACACCTTGACTCTGAAATGGGAGGTTTTTAATCCTGGCTACTATTCCGCTGCTCTCAAAGGGATGTAATTTGGTTCAACTGCAGGTTCCTGTGTATTATGCAAAAACTGAATGTGTTGAAAATGAGGGGCTAATTATTCCATTTGAGAGGTTGTAATTACATCCTTTAGACTGAGCAATGGATATTCCAAAGTGGCTCCCTCTCTCCTTAGTGAAGGATTTCCTGGGTCGAAGCAAGTGCAGCTCACTCATCCGTGCAATAGATTGACCCGAGCAGTCTTGGCCTTTGCTGTGGGAATCCCCAGTTTCCAGTTTGTTCCAGCAAAAGTCATATTTCTACATGACTCTATAGAGCGCTGCCTCAATACAGGATACATATTGCTTTCTCATATATTGTAAAAACGATGTCAGCAGCAGCAGCAGCAGCTTGTTCATGTGTGGAATTATGTGTCCTGTCTGCGGAAAGTAATTTAATTTAAAAGTTCATAGTTGATTTGATATTGTTGAACAGACGGTGGAGCCCACAATCAAAAATAGATCAGAGAATTTCCACCAGTGTTGCAGCATTTAAAAAAAAAAAAAAAAGAGGAGAAAATGAGGAGGTCAAAATTTCCCCAGTGGAGTTAGGTAACTGCTGCCAGGAAGGGGTTGGGCCTCCCGGAGTGATGAGGCAACACTGAGCTCAAGTGTGTATAAATACCAGAACACTCTGCATGCTCAACCATCAGACAGCAGGAAGGAGTTGACAAGGGTCACCAAAAGATCTGAAGAAATCCTCTTGACTAGACGATCACCATCCATCACTGGAGCTGAAAAAATAAATTGAAGATATTGTGGTGCTCTTTGGTGGCCTGACACCCATGAGAAAAAAGACCCATCAGGTCTAATCTGCAAAGGATTTAATAACTAAACCATTTTTTCCAAAAAAAGCTAAAATGAAGGCATTCAGCATTGCAGTT。本發明所述一種大黃魚抗菌肽hepcidin基因啟動子的克隆與活性分析方法，包括以下步驟:I)米用Clontech公司GenomeWalker Universal Kit試劑盒分別構建4種限制性內切酶的大黃魚基因組單酶切文庫，所用的4種DNA核酸內切酶為Dra 1、EcoR V、Pv μ II和 St μ I ;2)採用兩輪降落PCR方法從上述基因組單酶切文庫中擴增出大黃魚h印cidin基因啟動子區序列，將擴增的PCR產物連接到TaKaRa公司pMD18T-Simple載體並測序；3)將大黃魚h印cidin基因啟動子區片段插入Clontech公司綠色螢光蛋白報告基因載體PEGFP-1中，使載體所帶增強型綠色螢光蛋白(EGFP)基因位於該啟動子區的控制下，構建得到的重組載體命名為pEGFP-Phepcidin ;通過脂質體介導轉染法將重組載體pEGFP-Ph印cidin轉入鯉魚上皮瘤細胞EPC中，24h後在螢光顯微鏡下可觀察到轉染重組質粒pEGFP-Ph印cidin的細胞呈現強的綠色螢光，而轉染空載體pEGFP-1的細胞無綠色螢光出現，從而證明了所克隆的大黃魚h印cidin基因啟動子區能夠有效驅動綠色螢光蛋白在EPC細胞中的表達，因而具有啟動子活性；4)採用Promega公司雙螢光素酶報告基因檢測系統定量分析該啟動子的活性以及細菌脂多糖LPS和病毒雙鏈 RNA類似物polyl:C刺激對其活性的影響，將該大黃魚h印cidin基因啟動子區片段插入Promega公司螢光素酶報告基因載體pGL3-Basic中，使螢火蟲螢光素酶基因位於該啟動子的控制下，構建得到重組載體pGL3-Ph印cidin ;用重組載體pGL3-Ph印cidin和海腎螢光素酶對照報告基因載體pRL_TK共同轉染EPC細胞，48h後收集轉染細胞用雙螢光素酶報告基因檢測系統分別讀取螢火蟲螢光素酶和海腎螢光素酶的酶活性值，通過計算二者酶活性值的比值得出轉染細胞中螢光素酶的相對活性；同時，以空載體pGL3-Basic和海腎螢光素酶對照報告基因載體pRL_TK共同轉染EPC細胞的螢光素酶相對活性作為對照，計算出該啟動子的相對活性；進一步用不同濃度的LPS和polyl: C刺激重組載體pGL3-Phepcidin轉染的EPC細胞,通過比較刺激前後重組載體pGL3-Phepcidin轉染的EPC細胞中螢光素酶相對活性的變化，確定該大黃魚hepcidin基因啟動子的活性是否受到LPS和polyl:C免疫刺激的影響。本發明所述一種大黃魚hepcidin基因啟動子的應用如下:I)所述大黃魚h印cidin基因啟動子的克隆及其啟動子活性的驗證，為研究大黃魚hepcidin基因的表達調控機理提供良好的實驗系統；2)所述大黃魚h印cidin基因啟動子可用於構建表達真核載體在魚類細胞或哺乳動物細胞中高效表達外源基因；3)所述大黃魚hepcidin基因啟動子具有活性強、穩定好等優點，可應用於轉基因魚構建。本發明的突出優點和技術效果如下:本發明採用基因組步移的方法克隆了一種大黃魚hepcidin基因啟動子，提供了一種大黃魚抗菌肽h印cidin基因啟動子序列；經報告基因分析實驗證明了該大黃魚h印cidin基因啟動子具有活性強、穩定好等優點。因此，該大黃魚h印cidin基因啟動子的克隆及其強啟動子活性的驗證，在理論上將為研究大黃魚h印cidin基因的表達調控機理提供良好的實驗系統，在應用方面為利用該強啟動子構建表達載體高效表達外源基因或將該啟動子應用於轉基因魚構建創造了條件，具有重要的理論和實際意義。
圖1為重組載體pEGFP-Ph印cidin轉染EPC細胞的螢光顯微鏡觀察圖(100X)。在轉染細胞中可觀察到強的綠色螢光，說明了大黃魚hepcidin基因啟動子能夠驅動綠色螢光蛋白在EPC細胞中的表達。圖2為重組 載體pEGFP-Ph印ci din轉染EPC細胞的普通光學顯微鏡觀察圖(100X)。可觀察到細胞生長良好。圖3為採用雙螢光素酶報告基因檢測系統定量分析大黃魚hepcidin基因啟動子的活性以及免疫刺激對其活性的影響。在圖3中，pGL3-Basic表示空載體pGL3-Basic轉染EPC細胞的螢光素酶相對活性(作為對照)；U為重組載體pGL3-Ph印cidin轉染EPC細胞的螢光素酶相對活性；LPS-6、LPS-8分別表示在6 μ g/mL、8 μ g/mL LPS刺激條件下重組載體pGL3-Ph印cidin轉染EPC細胞的螢光素酶相對活性；poly1:C-10、polyl:C-100分別表示在10ng/mL、100ng/mL polyl:C刺激條件下重組載體pGL3_Phepcidin轉染EPC細胞的螢光素酶相對活性；縱坐標表示以空載體pGL3-Basic轉染EPC細胞的螢光素酶相對活性作為I倍，重組載體轉染EPC細胞中螢光素酶相對活性的增加倍數。從圖3可知，重組載體pGL3-Ph印cidin轉染EPC細胞中的螢光素酶相對活性為空載體pGL3-Basic轉染EPC細胞的10.7倍，說明了該大黃魚h印cidin基因啟動子具有較強的轉錄活性，而且其啟動子活性不受LPS和polyl: C刺激的影響，具有穩定啟動基因表達的特性。
具體實施例方式1.大黃魚h印cidin基因啟動子的克隆1.1米用Clontech公司的GenomeWalker Universal Kit試劑盒分別構建4種限制性內切酶的大黃魚基因組單酶切文庫，所用的4種DNA核酸內切酶為Dra 1.EcoR V.Pvy II和Sty I。具體操作為:1.1.1基因組純度分析。A:^ IyL大黃魚基因組DNA在0.6%的瓊脂糖凝膠上電泳。B:用核酸內切酶Dra I試切。體系為:
基因組 DNA (O, I μ g/μ L) 3 μ LDra I (IOunits/μ L)1.5 μ L10Xiira I 緩衝液2uL
雙蒸水補至20 y L1.1.2基因組酶切消化。A:標記5個1.5mL的離心管DLl，DL2，DL3，DL4和一個陽性對照。B:各內切酶酶切體系組分包括:
基因組 DNA (0.1 Pg/μ U 25 P L 限制內切酶(IOunits/PL)8pL
限制內切酶緩衝液(10X )IOyL
雙蒸水補至100 μ LC:低速渦旋5 IOs並瞬時離心，37°C過夜消化。I.I.3基因組DNA純化。A:在上述每一個反應管中加入等體積的苯酚。B:低速渦旋5 IOs並瞬時離心。C:把上層水相轉移至另外一個1.5mL離心管中，並加入等體積的氯仿。D:低速渦旋5· IOs並瞬時離心，轉移上層水相至另外一個新的離心管中，並向水相加入2倍體積冰冷的95%乙醇，1/10體積的乙酸鈉(pH=4.5)和20 μ g的糖苷。E:低速潤旋5 IOs並在4°C條件下以14000r/min離心15min。F:棄上清並用100 μ L冰冷的80%乙醇洗滌，然後在4°C條件下以14000r/min離心 IOmin0G:棄上清並在空氣中乾燥後用20 μ L TE緩衝液(ρΗ=7.5)溶解。1.1.4接頭Adaptor連接到經上述4種限制性內切酶分別消化的基因組片段上。
A:連接體系:經限制性內切酶消化的基因組DNA4PL
接頭 GenoraeWalker Adaptor (25 μ Μ)1.9 μ L
連接緩衝液(IOX)1.6PL
Τ4 DNA 連接酶(6 units/ μ L)0.5 μ LB:連接條件:16°C過夜連接。C:終止連接條件:70°C 5min。D:每管加入75 μ L TE緩衝液(ρΗ=7.5)，即獲得4種限制性內切酶的大黃魚基因組單酶切文庫，用於啟動子的克隆。1.2採用兩輪降落PCR方法擴增出大黃魚hepcidin基因啟動子序列，具體步驟按Genomeffalker Universal Kit試劑盒說明書進行。具體步驟如下:1.2.1第一輪降落PCR反應體系:10XAdvantage 2 PCR緩衝液5pL
dNTP混合物(各2.5raM)2pL
接頭引物API (10 μ M)IpL
基因特異引物GSPl (IOuM)IpL
上述各酶切文庫DNAI P L
Advantage 2 DNA聚合R體系(50 X)IpL
雙蒸水補至50 μ L
PCR程序: 7個循環 94°C 25s
72V 3min32個循環 940C 25s67°C 3rain67°C 7min。1.2.2第二輪降落PCR:分別以第一輪PCR產物為模板，利用巢式接頭引物AP2和
基因特異引物GSP2進行，其他成分和反應體系與第一輪相同。
PCR程序: 5個循環 94°C 25s
72 °C 3min 20個循環 94O 25s 67 °C 3min 67°C 7rain 。1.3擴增得到的PCR產物連接到TaKaRa公司pMD18T_Simple vector載體進行序列測定與組裝，從而獲得該大黃魚hepcidin基因啟動子序列。2.大黃魚h印cidin基因啟動子的活性分析2.1採用綠色螢光蛋白報告基因載體檢測啟動子活性2.1.1含大黃魚h印cidin基因啟動子區片段的重組載體pEGFP-Ph印cidin的構建將大黃魚h印cidin基因啟動子區片段插入Clontech公司綠色螢光蛋白報告基因載體pEGFP-Ι中，使載體所帶增強型綠色螢光蛋白(EGFP)基因處於該啟動子區的控制下，構建得到的重組載體命名為pEGFP-Phepcidin。具體步驟:A:合成帶有限制性核酸內切酶Xho I位點的正向引物:5』 -AAGCTCGAGATAAATCCCAACAAATGT -3』 ；帶有 Hind III 位點的反向引物:5，-CCCAAGCTTAACTGCAATGCTGAAT-3，。B:用 TAKARA 公司 PrimeSTAR HS DNA Polymerase 聚合酶體系進行 PCR 擴增。PCR反應體系為:
IOX PrimeSTAR HS DNA Polymerase 緩衝液5nL
dNTP混合物(各2.5πιΜ)2pL
止:向引物(10 μ Μ)IyL
反向引物(10 μ Μ)I P L
基因組模板(lOOng/ μ L)0.5 μ L
PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5units/μ I)0.5 μ L
雙蒸水補至50 u LPCR程序如下:
1.94 0C 2min
2.94°C 20s
3.60 °C 15s
4.72°C 30s返回至第2步30個循環；.5.72 °C IOmin
6.4V 暫停反應C:用Omega公司膠回收試劑盒進行PCR產物回收。D:回收後的PCR產物和載體pEGFP-Ι分別進行Xho I/Hind III雙酶切。酶切體系:
10 X _切反應緩衝液2PL
核酸內切酶IAo IIpL
核酸內切酶Hind IIIIuL
載體 50ng/PCR 產物 200ng".-1OuL
雙蒸水補至20 μ L
酶切條件:37°C反應過夜。E:用膠回收試劑盒分別回收上述經Xho I/Hind III雙酶切的PCR產物和載體pEGFP-Ι，並用TAKARA公司T4DNA連接酶連接經雙酶切的PCR產物和載體pEGFP-Ι，連接體系:
雙酶切的載體 pEGFP-1 (20ng/pL)IpL
雙酶切的PCR產物(20ng/uL)7.5μ L
10X Τ4 DNA連接酶緩衝液I μ L
T4 DNA 連接酶(6imits/ μ L)0.5 μ L
雙蒸水補至10 H L
反應條件:16°C反應過夜。F:上述連接產物轉化大腸桿菌E.coli DH5 α感受態細胞，經菌落PCR篩選陽性克隆，用小量質粒試劑盒提取質粒，並經測序確認啟動子區片段插入的正確性，從而獲得含大黃魚hepcidin基因啟動子區片段的重組載體pEGFP-Phepcidin。2.1.2重組載體pEGFP-Ph印ci din轉染EPC細胞及螢光顯微鏡觀察A:將EPC細胞以I X IO5個/mL的細胞密度接種於24孔細胞培養板，每孔0.5mL細胞懸液，於25 °C生化培養箱培養過夜。B:用Invitrogen公司Lipofectamine 2000轉染試劑分別將重組載體pEGFP-Ph印cidin和空載體pEGFP-Ι轉入EPC細胞，每孔各0.4 μ g質粒。轉染24h後在螢光顯微鏡下觀察，結果可發現轉染重組質粒pEGFP-Ph印cidin的細胞呈現強的綠色螢光(圖1和2)，而轉染空載體pEGFP-Ι的細胞無綠色螢光出現，從而證明了所克隆的大黃魚hepcidin基因啟動子區能夠有效驅動綠色螢光蛋白在EPC細胞中的表達，因而具有啟動子活性。2.2採用雙螢光 素酶報告基因檢測系統定量分析大黃魚hepcidin基因啟動子的活性2.2.1含大黃魚h印cidin基因啟動子區片段的重組載體pGL3_Ph印cidin的構建將大黃魚h印cidin基因啟動子區片段插入Promega公司螢光素酶報告基因載體pGL3-Basic中，使螢火蟲螢光素酶基因位於該啟動子的控制下，構建得到重組載體pGL3_Phepcidin。具體步驟與2.1.1重組載體pEGFP-Phepcidin的構建步驟相同。獲得的含大黃魚hepcidin基因啟動子區片段的重組載體pGL3_Phepcidin經測序進行確認。2.2.2細胞轉染與螢光素酶酶活分析 A:將EPC細胞以I X IO5個/mL的細胞密度接種於24孔細胞培養板，每孔0.5mL細胞懸液，於25 °C生化培養箱培養過夜。B:用 Invitrogen 公司 Lipofectamine 2000 轉染試劑將 0.4 μ g 重組載體pGL3-Ph印cidin和2ng海腎螢光素酶對照報告基因載體pRL-ΤΚ共轉染EPC細胞。同時，用0.4 μ g空載體pGL3-Basic和2ng海腎螢光素酶對照報告基因載體pRL-ΤΚ共轉染的EPC細胞作為對照。48h後收集轉染細胞，用雙螢光素酶報告基因檢測系統分別讀取螢火蟲螢光素酶和海腎螢光素酶的酶活性值，通過計算二者酶活性值的比值得出轉染細胞中螢光素酶的相對活性。同時，以空載體pGL3-Basic和海腎螢光素酶對照報告基因載體pRL-ΤΚ共同轉染的EPC細胞作為對照，計算出該啟動子的相對活性。螢光素酶酶活測定的方法參考Promega公司雙螢光素酶報告基因檢測系統說明書進行，具體步驟為:a.轉染EPC細胞48h後，用無鈣離子的磷酸鹽緩衝液洗滌2次；b.每孔加入100 μ L PLB裂解液(Passive Lysis Buffer,試劑盒提供)於室溫下裂解細胞15min，期間輕緩晃動培養板，使其裂解完全，離心收集細胞裂解液上清；c.在檢測管中將100 μ L螢光素酶測試試劑II LARII和20 μ L上述細胞裂解液上清混合，螢火蟲螢光素酶的活性立即用化學發光檢測儀LUminOmeterTD20/20測量；f.向檢測管中加入IOOyL Stop&Glo試劑，將上述反應猝滅，同時啟動海腎螢光素酶反應，測量海腎螢光素酶活性；g.分別讀取螢火蟲螢光素酶和海腎螢光素酶的酶活性值，計算二者酶活性值的比值得出轉染細胞中螢光素酶的相對活性。同時，以空載體pGL3-Basic和海腎螢光素酶對照報告基因載體pRL-ΤΚ共同轉染的EPC細胞作為對照，計算出該啟動子的相對活性(圖3)。C:對於免疫刺激實驗,在上述重組載體pGL3_Ph印cidin和海腎螢光素酶對照報告基因載體pRL-ΤΚ共轉染EPC細胞24h後，分別在細胞培養基中加入終濃度為6 μ g/mL和8 μ g/mL的LPS，及10ng/mL和100ng/mL的polyl: C，繼續培養24h，收集轉染細胞，用上述雙螢光素酶報告基因檢測系統分別計算在不同濃度LPS和polyl: C刺激條件下轉染細胞中螢光素酶相對活性，並與未經處理轉染細胞中螢光素酶相對活性相比較。從圖3可以發現，不同濃度LPS和poly1:C的刺激不能明顯地改變轉染細胞中螢光素酶的相對活性，說明了該大黃魚hepcidin基因啟動子不受LPS和polyl: C免疫刺激的影響，具有穩定啟動基因表達的的特 性。
權利要求
1.一種大黃魚抗菌肽hepcidin基因啟動子，其特徵在於其序列為: ATAAATCCCAACAAATGTGGAGCCATCGTAGTTGTATTTGTTGACTTTTGATGTTGTGGTCACCCAAAGCAAGCAAGCAGGCCAGCTGGGTTATCAGTGAACGAGACAGACTGACGCAGGGGTCCCGCGGCATGTTGTTTCACTAATTGAGTCAGCCCGGGCAATTTGGATAGACTTTGAAGATATAATGAGAATTCAAATGGCCCATGATTTTATCAGCATGCTCAGTCCACCGTTTATCAGTTTGTACCTTTATTTTGCCTTTTCTGTTATTTCATTTCCACCATTATTGATTTTCGGATTTATTCACAGCCTGATGTTGTTCTCGAATTGTTTTCCTACTCTGACAGATTAATTAATCTTAAAGTGTTTATCGCCGCTTCACTGATAAGAGGAAAAATAATCCTCACAATCTTGAGTAGAGTTCTTGGGTTTTTTTTCTATGCACATGTAACAATCTGGATTATTATCATTATGTAACTGTCATTACATTCACACGGTTGTAATTTCACACTGTTAATATATTTATGAACCTAACATGCTGTGTGGCAGGAAATTAGTAATGATATTTTAATGAAACAAGCAGCTGTCCTTTGTCTGGATTTCAATATATCATTCTTACATAATGAAGAACCTAACATGCACAATATAGAAAATGACAGGGAATATATATATAAAGATACAAAATATATAATGATATAGGCTAGATTTGTATTGTAAAAAAAAAAACTTGGGGCAATGCACTTCTTCGCTTTCCAGACATAAACATAATCACATTACATTATATTCGTTTTTATCTAATGCATATTGAAACACCTTGACTCTGAAATGGGAGGTTTTTAATCCTGGCTACTATTCCGCTGCTCTCAAAGGGATGTAATTTGGTTCAACTGCAGGTTCCTGTGTATTATGCAAAAACTGAATGTGTTGAAAATGAGGGGCTAATTATTCCATTTGAGAGGTTGTAATTACATCCTTTAGACTGAGCAATGGATATTCCAAAGTGGCTCCCTCTCTCCTTAGTGAAGGATTTCCTGGGTCGAAGCAAGTGCAGCTCACTCATCCGTGCAATAGATTGACCCGAGCAGTCTTGGCCTTTGCTGTGGGAATCCCCAGTTTCCAGTTTGTTCCAGCAAAAGTCATATTTCTACATGACTCTATAGAGCGCTGCCTCAATACAGGATACATATTGCTTTCTCATATATTGTAAAAACGATGTCAGCAGCAGCAGCAGCAGCTTGTTCATGTGTGGAATTATGTGTCCTGTCTGCGGAAAGTAATTTAATTTAAAAGTTCATAGTTGATTTGATATTGTTGAACAGACGGTGGAGCCCACAATCAAAAATAGATCAGAGAATTTCCACCAGTGTTGCAGCATTTAAAAAAAAAAAAAAAAGAGGAGAAAATGAGGAGGTCAAAATTTCCCCAGTGGAGTTAGGTAACTGCTGCCAGGAAGGGGTTGGGCCTCCCGGAGTGATGAGGCAACACTGAGCTCAAGTGTGTATAAATACCAGAACACTCTGCATGCTCAACCATCAGACAGCAGGAAGGAGTTGACAAGGGTCACCAAAAGATCTGAAGAAATCCTCTTGACTAGACGATCACCATCCATCACTGGAGCTGAAAAAATAAATTGAAGATATTGTGGTGCTCTTTGGTGGCCTGACACCCATGAGAAAAAAGACCCATCAGGTCTAATCTGCAAAGGATTTAATAACTAAACCATTTTTTCCAAAAAAAGCTAAAATGAAGGCATTCAGCATTGCAGTT。
2.如權利要求1所述一種大黃魚抗菌肽hepcidin基因啟動子的克隆與活性分析方法，其特徵在於包括以下步驟: 1)採用Clontech公司GenomeWalkerUniversal Kit試劑盒分別構建4種限制性內切酶的大黃魚基因組單酶切文庫，所用的4種DNA核酸內切酶為Dra 1.EcoR ν、ΡνμΙΙ和Sty I ； 2)採用兩輪降落PCR方法從上述基因組單酶切文庫中擴增出大黃魚h印cidin基因啟動子區序列，將擴增的PCR產物連接到TaKaRa公司pMD18T-Simple載體並測序； 3)將大黃魚h印cidin基因啟動子區片段插入Clontech公司綠色螢光蛋白報告基因載體PEGFP-1中，使載體所帶增強型綠色螢光蛋白基因位於該啟動子區的控制下，構建得到的重組載體命名為pEGFP-Phepcidin ;通過脂質體介導轉染法將重組載體pEGFP-Ph印cidin轉入鯉魚上皮瘤細胞EPC中，24h後在螢光顯微鏡下可觀察到轉染重組質SpEGFP-Pkpcidin的細胞呈現強的綠色螢光，而轉染空載體pEGFP-1的細胞無綠色螢光出現，從而證明了所克隆的大黃魚h印cidin基因啟動子區能夠有效驅動綠色螢光蛋白在EPC細胞中的表達，因而具有啟動子活性；4)採用Promega公司雙螢光素酶報告基因檢測系統定量分析該啟動子的活性以及細菌脂多糖LPS和病毒雙鏈RNA類似物polyl: C刺激對其活性的影響，將該大黃魚hepcidin基因啟動子區片段插入Promega公司螢光素酶報告基因載體pGL3-Basic中，使螢火蟲螢光素酶基因位於該啟動子的控制下，構建得到重組載體pGL3-Ph印cidin;用重組載體pGL3-Phepcidin和海腎螢光素酶對照報告基因載體pRL_TK共同轉染EPC細胞，48h後收集轉染細胞用雙螢光素酶報告基因檢測系統分別讀取螢火蟲螢光素酶和海腎螢光素酶的酶活性值，通過計算二者酶活性值的比值得出轉染細胞中螢光素酶的相對活性；同時，以空載體pGL3-Basic和海腎螢光素酶對照報告基因載體pRL_TK共同轉染EPC細胞的螢光素酶相對活性作為對照，計算出該啟動子的相對活性；進一步用不同濃度的LPS和poly1:C刺激重組載體pGL3-Phepcidin轉染的EPC細胞,通過比較刺激前後重組載體pGL3_Phepcidin轉染的EPC細胞中螢光素酶相對活性的變化，確定該大黃魚hepcidin基因啟動子的活性是否受到LPS和polyl: C免疫刺激的影響。
3.如權利要求1所述一種大黃魚h印cidin基因啟動子在研究大黃魚h印cidin基因的表達調控機理中的應用。
4.如權利要求1所述一種大黃魚hepcidin基因啟動子在構建表達真核載體在魚類細胞或哺乳動物細胞中高效表達外源基因中的應用。
5.如權利要求1 所述一種大黃魚hepcidin基因啟動子在轉基因魚構建中的應用。
全文摘要
一種大黃魚抗菌肽hepcidin基因啟動子序列及其應用，涉及一種抗菌肽基因啟動子。克隆與活性分析方法構建4種限制性內切酶的大黃魚基因組單酶切文庫；從上述基因組單酶切文庫中擴增出大黃魚hepcidin基因啟動子區序列，將擴增的PCR產物連接到pMD18T-Simple載體；將基因啟動子區片段插入綠色螢光蛋白報告基因載體pEGFP-1中，使載體所帶增強型綠色螢光蛋白基因位於該啟動子區的控制下，構建得到的重組載體命名為pEGFP-Phepcidin；採用雙螢光素酶報告基因檢測系統定量分析該啟動子的活性以及細菌脂多糖LPS和病毒雙鏈RNA類似物polyI:C刺激對其活性的影響。
文檔編號C12Q1/68GK103233010SQ201310172759
公開日2013年8月7日 申請日期2013年5月10日 優先權日2013年5月10日
發明者陳新華, 汪玉華, 敖敬群 申請人:國家海洋局第三海洋研究所