用於培養人細胞的裝置和方法
2023-05-04 16:13:46 2
專利名稱：用於培養人細胞的裝置和方法
技術領域：
本發明涉及用於培養人細胞尤其是造血細胞的裝置和方法。
背景技術：
造血細胞在骨髓中由全能幹細胞產生，全能幹細胞能夠複製其自身並且產生所有其它的造血細胞。這種幹細胞產生祖細胞，例如紅細胞樣祖細胞和髓細胞樣祖細胞，這些細胞定向分化成專門的細胞類型。祖細胞產生分化的具有有限的增殖能力或不能增殖的細胞。在人中，幹細胞和祖細胞表達CD34抗原，而更為分化的造血細胞則不表達該抗原。
造血細胞衍生自患者或合適供者的骨髓、外周血或臍帶血。當患者的凝血和抗感染功能由於(例如)化療而受到削弱時，這些細胞可用於重建患者的這些功能。
無關供者的臍帶血正越來越多地被用作骨髓清除性(myeloablative)治療後進行同種異體移植時的造血細胞來源。雖然利用臍帶血有幾種優勢，但是與可從骨髓或外周血中獲得的細胞相比，對臍帶血的利用受到有限的細胞數目的限制。
希望提供一種增加臍帶血細胞數目的方法，從而這些臍帶血細胞可用於治療成年患者。美國專利號5,635,387描述了培養造血細胞的方法。『387專利描述了在沒有基質細胞層或基質細胞條件培養基的條件下培養造血細胞的方法，據信該方法在該領域最初的發展中起到了重要作用。當前的擴增方法在細胞擴增室或細胞擴增袋中進行，這些細胞擴增室或細胞擴增袋並非專用於該目的。沒有使用專用系統造成幾個問題。例如，大多數系統不是封閉的系統，這意味著人幹細胞的擴增需要熟練的操作人員和昂貴的設備以進行成功的擴增。即使是熟練的人員和設備非常好的實驗室使用，這種開放的流程也不能保證終產物的無菌，不能達到現有管理推薦和/或指導中所提供的無菌操作要求。現有的封閉循環系統提供並非為人幹細胞擴增專門設計的非專用系統；而且，這種系統需要複雜、昂貴的設備才能操作。
大多數幹細胞擴增方法現在利用含有來自動物的產品的試劑進行操作。使用來自動物的產品使得這些擴增的細胞群不能在臨床上使用。當前，用並非為造血幹細胞擴增而特別設計的不同的培養基來進行造血幹細胞的擴增。具體地說，所用試劑不是由確定的培養基和專用於造血幹細胞擴增的生長因子混合物組成。當前所用的培養基具有不同的濃度和生長因子組合，常常不能滿足特定的調節需要如apirogenicity，不具有使用者友好性，並且沒有昂貴的設備和熟練的人員就難以使用。
本領域仍然需要用於培養人造血幹細胞的改進的裝置和方法，這些裝置和方法能夠實現這些細胞數目的擴增，獲得良好的細胞回收，同時又保持無菌和不損害細胞存活力。
本文所述的發明提供了可用於培養人造血幹細胞的裝置。然而，該裝置也可用於培養人的其它細胞，包括其它類型的人類幹細胞、人肌肉細胞、人皮膚細胞等。
發明概述本發明提供了一種生物反應器，其包括反應室；第一埠，適於引入細胞；第二埠，適於氣體交換，所述第二埠包括濾器；第三埠，適於引入細胞培養基；第四埠，適於細胞取樣；以及第五埠，適於在細胞培養後將其收穫。
本發明提供一種體外增加人造血細胞數目的方法，該方法包括提供上述的生物反應器；將人造血細胞引入所述第一埠；通過第三埠引入培養基；和在足以增加細胞數目的條件和時間下培養細胞。
本發明提供一種體外增加人CD34陽性造血細胞數目的方法，該方法包括提供CD34陽性人造血細胞；以1×104-5×106細胞/毫升的初始濃度將CD34陽性細胞接種到含有培養基的生物反應器中，所述培養基含有有效擴增CD34陽性細胞的生長因子和營養培養基，其中所述生長因子包括Flt-3L、血小板生成素、白介素-3和幹細胞因子；以及在足以增加CD34陽性細胞數目的條件和時間下培養CD34陽性細胞。
以下將描述本發明的其它特點和優勢，其中部分可從這些描述顯而易見地得知。通過在書面說明書和權利要求書中具體描述的用於培養人細胞的裝置和方法，可實現和獲得本發明的目的和其它優點。
應理解，前面的一般性描述和下面的詳述都是示範性和闡釋性的，意在提供如權利要求所要求的本發明的進一步解釋。
附圖簡述
圖1所示為本發明生物反應器的透視圖。
圖2所示為圖1生物反應器的頂視圖。
圖3所示為可與本發明生物反應器一起使用的管道和無菌袋的頂視圖。
發明詳述本發明提供了一種生物反應器，其包括反應室；第一埠，適於引入細胞；第二埠，適於氣體交換，所述第二埠包括濾器；第三埠，適於引入細胞培養基；第四埠，適於細胞取樣；以及第五埠，適於在細胞培養後將其收穫。在本發明的一個實施方式中，第二埠的濾器是氣體可透過性膜濾器。在本發明的另一個實施方式中，第三埠包括濾器。在本發明的又一個實施方式中，所述生物反應器還包括適於引入培養基的第六埠，所述第六埠包括濾器。
在本發明的一個實施方式中，第一埠包括可刺穿的帽。在本發明的另一個實施方式中，第四埠包括可刺穿的帽。在本發明的一個實施方式中，該生物反應器適於在細胞培養後通過將細胞導出第五埠來收穫細胞。
在本發明的一個實施方式中，所述反應室具有25cm2-600cm2的擴增表面積。在本發明的另一個實施方式中，所述反應室具有150cm2-250cm2的擴增表面積。在本發明的一個實施方式中，所述反應室由光潔的(clear)、組織培養處理的塑料製成。
在本發明的一個實施方式中，該生物反應器包括第一埠附近的標籤，該標籤說明可通過第一埠引入細胞。在本發明另一個實施方式中，該生物反應器包括第二埠附近的標籤，該標籤說明可通過第二埠交換氣體。在本發明又一個實施方式中，該生物反應器包括第三埠附近的標籤，該標籤說明可通過第三埠引入培養基。在本發明一個實施方式中，該生物反應器包括第四埠附近的標籤，該標籤說明可通過第四埠對反應室中的內容物取樣。在本發明另一個實施方式中，該生物反應器包括(i)第三埠附近的標籤，該標籤說明可在第0天通過第三埠引入培養基，和(ii)第六埠附近的標籤，該標籤說明可在第7天通過第六埠引入培養基。所有的標籤都可以附在所述生物反應器上或者澆鑄到生物反應器上。
所述生物反應器可用於培養人細胞，包括人造血幹細胞、其它類型的人幹細胞、人肌肉細胞、人皮膚細胞等。
本發明提供一種試劑盒，其包括本發明所述的生物反應器和連接於第五埠的管道。在本發明一個實施方式中，所述試劑盒包括另外的管道以及一個或多個無菌袋。在本發明另一個實施方式中，所述試劑盒還包括第一容器中的營養培養基，以及第二容器中的生長因子Flt-3L、血小板生成素、白介素-3和幹細胞因子。在本發明另一個實施方式中，生長因子存在的濃度為Flt-3L，1.9微克/毫升；血小板生成素，1.9微克/毫升；白介素-3，0.17微克/毫升；以及幹細胞因子，1微克/毫升。
本發明提供一種體外增加人造血細胞數目的方法，該方法包括提供本文所述的生物反應器；將人造血細胞引入第一埠；通過第三埠引入培養基；和在足以增加細胞數目的條件和時間下培養細胞。在本發明一個實施方式中，細胞經培養之後，通過第五埠收穫細胞。在本發明另一個實施方式中，該生物反應器還包括適於引入培養基的第六埠，所述第六埠包括濾器，通過第三埠引入培養基之後7天，通過第六埠引入培養基。
在本發明一個實施方式中，所述人造血細胞是CD34-陽性。在本發明另一個實施方式中，所述培養基含有可有效擴增人造血細胞的生長因子和營養培養基，其中所述生長因子包括Flt-3L、血小板生成素、白介素-3和幹細胞因子。在本發明的實施方式中，所述人造血細胞衍生自人臍帶血、人骨髓或人外周血。
本發明提供一種體外增加人造血細胞數目的方法，該方法包括提供CD34-陽性的人造血細胞；以1×104-5×106細胞/毫升的初始濃度將CD34-陽性細胞接種到含有培養基的生物反應器中，所述培養基含有可有效擴增CD34-陽性細胞的生長因子和營養培養基，其中所述生長因子包括Flt-3L、血小板生成素、白介素-3和幹細胞因子；和在足以增加CD34-陽性細胞數目的條件和時間下培養CD34-陽性細胞。在本發明一個實施方式中，所述CD34-陽性細胞衍生自人臍帶血、人骨髓或人外周血。在另一個實施方式中，以初始細胞數目為5×105-1.5×106個細胞將CD34-陽性細胞接種到生物反應器中。在另一個實施方式中，所述生物反應器的擴增表面積是25cm2-600cm2。
在本發明一個實施方式中，CD34-陽性人造血細胞的數目增長至少3倍。在另一個實施方式中，所述造血生長因子基本上由Flt-3L、血小板生成素、白介素-3和幹細胞因子組成。在另一個實施方式中，在培養步驟之後，從培養基中收穫人造血細胞。在本發明實施方式中，培養CD34-陽性細胞4-20天。在另一個實施方式中，培養CD34-陽性細胞7天，然後在第7天，加入另外的營養培養基和生長因子，再培養CD34-陽性細胞5天，然後收穫。
在本發明一個實施方式中，所述生長因子基本上由Flt-3L、血小板生成素、白介素-3和幹細胞因子組成。在培養步驟開始時，這些生長因子以下面的濃度存在Flt-3L，0.01-0.1微克/毫升；血小板生成素，0.01-0.1微克/毫升；白介素-3，0.001-0.01微克/毫升；以及幹細胞因子，0.01-0.1微克/毫升。在另一個實施方式中，所述生長因子基本上由Flt-3L、血小板生成素、白介素-3和幹細胞因子組成。在培養步驟開始時，這些生長因子以下面的濃度存在Flt-3L，0.05微克/毫升；血小板生成素，0.05微克/毫升；白介素-3，0.0043微克/毫升；以及幹細胞因子，0.025微克/毫升。在另一個實施方式中，所述培養基和生物反應器不包括基質細胞或基質細胞條件培養基。
本發明提供一種試劑，所述試劑基本上由生長因子Flt-3L、血小板生成素、白介素-3和幹細胞因子組成，這些生長因子以下面的濃度存在Flt-3L，1.9微克/毫升；血小板生成素，1.9微克/毫升；白介素-3，0.17微克/毫升；和幹細胞因子，1微克/毫升。
本發明提供一種試劑盒，其包括生物反應器、第一容器中的營養培養基、以及第二容器中的生長因子Flt-3L、血小板生成素、白介素-3和幹細胞因子。在一個實施方式中，所述試劑盒包括一個或多個注射器。在另一個實施方式中，所述試劑盒還包括管道和一個或多個無菌袋。在試劑盒的另一個實施方式中，所述生長因子以下面的濃度存在Flt-3L，1.9微克/毫升；血小板生成素，1.9微克/毫升；白介素-3，0.17微克/毫升；以及幹細胞因子，1微克/毫升。
在本發明一個實施方式中，人細胞在生物反應器中從臍帶血開始培養。在營養和生長培養基中孵育一段合適的時間後，收集細胞，洗滌以除去殘留試劑，然後使其即可使用。
用於產生造血細胞的培養基含有營養培養基和生長因子(細胞因子)。各種營養培養基和生長因子都可用於培養造血細胞。可用於本發明的合適營養培養基包括X-VIVO 20(可購自Cambrex，East Rutherford，美國新澤西州)，或其它無血清培養基。可在營養培養基中補充加入1-20％的自體血漿或異源血漿。
可包括在營養培養基中的生長因子或細胞因子包括人Flt-3L、血小板生成素(TPO)、白介素3(IL-3)、幹細胞因子(SCF)、人GM-CSF(粒細胞巨噬細胞集落刺激因子)和G-CSF(粒細胞集落刺激因子)、白介素1、2和4-7，以及促紅細胞生成素。
圖1和2說明了本發明的一種實施方式，其中生物反應器10包括反應室15。該室具有允許培養基分布並促進細胞生長的合適形狀。該室包含與生物材料相容或已經處理成與生物材料相容的透明聚合材料。
生物反應器15有5個埠(20，21，22，24，26)。埠20(有標籤40「細胞(Cells)」)具有可刺穿的帽以注射細胞。埠21(有標籤42「氣體(Gas)」)具有與外部環境進行氣體交換的濾器。埠22(有標籤44「第0天(Day 0)」)具有用於在操作流程開始時注射培養基和生長因子的濾器。埠24(有標籤46「第7天(Day 7)」)具有用於在以後的時間中如第7天注射培養基和生長因子的濾器。埠26(有標籤48「取樣(Sampling)」)具有可刺穿的膜以進行細胞取樣。
通過埠22和24，用注射器遞送培養基，通過埠21交換氣體。交換的氣體包括氧氣和二氧化碳(CO2)。優選地，將CO2含量控制在所需水平，例如5％。用生理溫度孵育生物反應器的內容物，即優選37℃，雖然溫度可在25℃-37℃之間。溼度優選保持在約100％。一旦完成孵育，造血細胞通過管道線31經出口28脫離生物反應器，所述出口28可通過管道31利用常規的無菌對接系統與收集袋7相連。生物反應器15向埠28傾斜，細胞流入收集袋7(如圖3所示)。在優選實施方式中，培養時間為10-14天。預先與收集袋7相連的袋8可通過線9裝入洗滌鹽水溶液。可通過線12將洗滌溶液引入收集袋7。用無菌濾器11保證洗滌液體的無菌性。
在本發明一個實施方式中，造血細胞通過以下方式產生首先通過埠22將X-VIVO 20營養培養基和生長因子引入反應器。所述生長因子包括IL3、TPO、SCF和Flt3-L。將所選擇的CD34+細胞通過埠20注射入反應室，將生物反應器放置在處於生理溫度和控制的氣氛中的培養箱中。孵育所需的一段時間後，通過埠24加入另外的X-VIVO 20營養培養基和生長因子(如上所述)。
然後將生物反應器返回到培養箱中。在第二次孵育時間結束時，將生物反應器從培養箱中取出，將細胞收集在收集袋中。
本發明所用試劑通常保存於4℃。優選地，提供的試劑為兩個細胞因子混合物小瓶(細胞因子混合物A和細胞因子混合物B)和兩個培養基小瓶(培養基A和培養基B)。「A」瓶的內容物在第0天加入到反應室中，「B」瓶的內容物在第7天加入反應室。用注射器將試劑引入反應器。
實施例用可通過商業途徑獲得的聚苯乙烯組織培養瓶(例如可從Becton DickinsonLabware，Franklin Lakes，NJ，USA購得的貨號35-3028)來製備生物反應器，所述生物反應器具有以下裝備(1)在培養瓶的上部提供5個埠。兩個埠有聚醚碸(PES)0.2微米濾器。兩個埠有可穿孔的連接體；一個埠有氣體可透過性濾膜；(2)第六埠將所述組織培養瓶連接到用於在培養階段結束時收集細胞的500ml無菌袋。所述生物反應器的擴增表面積是約175cm2的組織培養處理的聚苯乙烯。
在第0天，用無菌注射器通過具有0.2微米(μm)無菌濾器的埠引入營養培養基和生長因子的混合物。所述營養培養基和生長因子的混合物通過以下方式製備混合細胞因子組合物(細胞因子混合物A)和60ml X-VIVO 20培養基(培養基A)，所述細胞因子組合物(細胞因子混合物A)含有懸浮在1560微升營養培養基中的0.270μg(微克)IL3、3.0μg TPO、1.5μg SCF和3.0μg Flt3-L。在第0天加入營養培養基和生長因子之後，用另一個專用埠將所選的CD34+細胞接種到生物反應器中。例如，將1.2×106個所選的細胞接種到61.5毫升營養培養基中(起始細胞濃度約為20,000細胞/毫升)。所述CD34+細胞的最小存活力為80％，最小純度為70％。
在37℃、約100％溼度、含有約5％CO2的空氣氣氛中孵育生物反應器內容物。培養或孵育一周後(即第7天)，用無菌注射器通過另一個具有0.2微米(μm)無菌濾器的專用埠引入營養培養基和生長因子的混合物。通過以下方式製備營養培養基和生長因子的混合物混合細胞因子組合物(細胞因子混合物B)和30ml X-VIVO 20培養基(培養基B)，所述細胞因子組合物(細胞因子混合物B)含有懸浮在776微升營養培養基中的0.135μg(微克)IL3、1.5μg TPO、0.75μgSCF和1.5μg Flt3-L。
在培養階段結束時，通過專用的埠將生物反應器的內容物導出生物反應器並流入無菌袋中。用標準方法洗滌細胞以除去殘留的細胞因子。
該方法通常產生3-40倍的CD34+細胞擴增，總細胞數目擴增30-300倍，平均約200倍。細胞存活力大於80％。
提供上面的說明書和附圖是出於描述本發明實施方式的目的，而非以任何方式限制本發明。對本領域一般技術人員顯而易見的是，可對本發明培養細胞的裝置和方法進行各種改動和變化而不脫離本發明的精神或範圍。因此，只要這些改動和變化落在所附權利要求及其等價形式的範圍內，則本發明包括這些改動和變化。
權利要求
1.一種生物反應器，包括反應室；第一埠，適於引入人細胞；第二埠，適於氣體交換，所述第二埠包括濾器；第三埠，適於引入培養基；第四埠，適於細胞取樣；和第五埠，適於在細胞培養後將其收穫。
2.如權利要求1所述的生物反應器，其特徵在於，所述第二埠的濾器是氣體可透過性膜濾器。
3.如權利要求1和2中的一項所述的生物反應器，其特徵在於，所述第三埠包括濾器。
4.如權利要求1-3中的一項所述的生物反應器，其特徵在於，所述生物反應器還包括適於引入培養基的第六埠，所述第六埠包括濾器。
5.如權利要求1-4中的一項所述的生物反應器，其特徵在於，所述第一埠包括可刺穿的帽。
6.如權利要求1-5中的一項所述的生物反應器，其特徵在於，所述第四埠包括可刺穿的帽。
7.如權利要求1-6中的一項所述的生物反應器，其特徵在於，所述生物反應器適於在細胞培養後將細胞導出所述第五埠而收穫人細胞。
8.如權利要求1-7中的一項所述的生物反應器，其特徵在於，所述反應室具有25cm2-600cm2的擴增表面積。
9.如權利要求1-8中的一項所述的生物反應器，其特徵在於，所述反應室具有150cm2-250cm2的擴增表面積。
10.如權利要求1-9中的一項所述的生物反應器，其特徵在於，所述反應室由光潔的組織培養處理的塑料製成。
11.如權利要求1-10中的一項所述的生物反應器，其特徵在於，所述生物反應器包括所述第一埠附近的標籤，該標籤說明可通過所述第一埠導入細胞。
12.如權利要求1-11中的一項所述的生物反應器，其特徵在於，所述生物反應器包括所述第二埠附近的標籤，該標籤說明可通過所述第二埠交換氣體。
13.如權利要求1-12中的一項所述的生物反應器，其特徵在於，所述生物反應器包括所述第三埠附近的標籤，該標籤說明可通過所述第三埠引入培養基。
14.如權利要求1-13中的一項所述的生物反應器，其特徵在於，所述生物反應器包括所述第四埠附近的標籤，該標籤說明可通過所述第四埠對反應室的內容物取樣。
15.如權利要求4所述的生物反應器，其特徵在於，所述生物反應器包括(i)第三埠附近的標籤，該標籤說明可在第0天通過第三埠引入培養基，和(ii)第六埠附近的標籤，該標籤說明可在第7天通過第六埠引入培養基。
16.如權利要求11所述的生物反應器，其特徵在於，所述標籤附在生物反應器上或澆鑄到生物反應器上。
17.一種試劑盒，包括權利要求1-16中的一項所述的生物反應器和連接第五埠的管道。
18.如權利要求17所述的試劑盒，還包括另外的管道和一個或多個無菌袋。
19.如權利要求17和18中的一項所述的試劑盒，還包括第一容器中的營養培養基，和第二容器中的生長因子Flt-3L、血小板生成素、白介素-3和幹細胞因子。
20.如權利要求19所述的試劑盒，其特徵在於，所述生長因子以以下濃度存在Flt-3L1.9微克/毫升；血小板生成素 1.9微克/毫升；白介素-3 0.17微克/毫升；和幹細胞因子1微克/毫升。
21.一種體外增加人造血細胞數目的方法，包括提供權利要求1-16中的一項所述的生物反應器；將人造血細胞導入第一埠；通過第三埠導入培養基；和在足以增加細胞數目的條件和時間下培養所述細胞。
22.如權利要求21所述的方法，其特徵在於，在培養所述細胞後，通過第五埠收穫所述細胞。
23.如權利要求21和22中的一項所述的方法，其特徵在於，所述生物反應器還包括適於引入培養基的第六埠，所述第六埠包括濾器，在通過第三埠引入培養基之後7天，通過第六埠引入培養基。
24.如權利要求21-23中的一項所述的方法，其特徵在於，所述人造血細胞為CD34-陽性。
25.如權利要求21-24中的一項所述的方法，其特徵在於，所述培養基含有可有效擴增人造血細胞的生長因子和營養培養基，其中所述生長因子包括Flt-3L、血小板生成素、白介素-3和幹細胞因子。
26.如權利要求21-25中的一項所述的方法，其特徵在於，所述人造血細胞衍生自人臍帶血。
27.如權利要求21-25中的一項所述的方法，其特徵在於，所述人造血細胞衍生自人骨髓。
28.如權利要求21-25中的一項所述的方法，其特徵在於，所述人造血細胞衍生自人外周血。
29.一種體外增加人造血細胞數目的方法，包括提供CD34-陽性的人造血細胞；以1×104-5×106細胞/毫升的初始濃度將所述CD34-陽性細胞接種到含有培養基的生物反應器中，所述培養基含有可有效擴增CD34-陽性細胞的生長因子和營養培養基，其中所述生長因子包括Flt-3L、血小板生成素、白介素-3和幹細胞因子；和在足以增加所述CD34-陽性細胞數目的條件和時間下培養所述CD34-陽性細胞。
30.如權利要求29所述的方法，其特徵在於，所述CD34-陽性細胞衍生自人臍帶血。
31.如權利要求29所述的方法，其特徵在於，所述CD34-陽性細胞衍生自人骨髓。
32.如權利要求29所述的方法，其特徵在於，所述CD34-陽性細胞衍生自人外周血。
33.如權利要求29-32中的一項所述的方法，其特徵在於，以1×104-5×106細胞/毫升的起始濃度將所述CD34-陽性細胞接種到所述生物反應器中。
34.如權利要求29-33中的一項所述的方法，其特徵在於，所述生物反應器具有25cm2-600cm2的擴增表面積。
35.如權利要求29-34中的一項所述的方法，其特徵在於，所述CD34-陽性人造血細胞的數目至少增加3倍。
36.如權利要求29-35中的一項所述的方法，其特徵在於，所述CD34-陽性人造血細胞的數目至少增加5倍。
37.如權利要求29-36中的一項所述的方法，其特徵在於，所述生長因子基本由Flt-3L、血小板生成素、白介素-3和幹細胞因子組成。
38.如權利要求29-37中的一項所述的方法，還包括，在培養步驟之後，從培養基中收穫人造血細胞。
39.如權利要求29-38中的一項所述的方法，其特徵在於，培養所述CD34-陽性細胞4-20天。
40.權利要求29-39中的一項所述的方法，其特徵在於，培養所述CD34-陽性細胞7天，然後在第7天，加入另外的營養培養基和生長因子，再培養所述CD34-陽性細胞5天，然後收穫。
41.如權利要求29-40中的一項所述的方法，其特徵在於，所述生長因子基本由Flt-3L、血小板生成素、白介素-3和幹細胞因子組成，且在培養步驟開始時，這些生長因子以以下濃度存在Flt-3L 0.01-0.1微克/毫升；血小板生成素0.01-0.1微克/毫升；白介素-30.001-0.01微克/毫升；和幹細胞因子 0.01-0.1微克/毫升。
42.如權利要求29-41中的一項所述的方法，其特徵在於，所述生長因子基本由Flt-3L、血小板生成素、白介素-3和幹細胞因子組成，且在培養步驟開始時，這些生長因子以以下濃度存在Flt-3L 0.05微克/毫升；血小板生成素0.05微克/毫升；白介素-30.0043微克/毫升；和幹細胞因子 0.025微克/毫升。
43.如權利要求29-42中的一項所述的方法，其特徵在於，所述培養基和生物反應器不含有基質細胞或基質細胞條件培養基。
44.一種試劑，所述試劑基本上由生長因子Flt-3L、血小板生成素、白介素-3和幹細胞因子組成，且這些生長因子以以下濃度存在Flt-3L1.9微克/毫升；血小板生成素 1.9微克/毫升；白介素-3 0.17微克/毫升；和幹細胞因子1微克/毫升。
45.一種試劑盒，包括生物反應器、第一容器中的營養培養基和第二容器中的生長因子Flt-3L、血小板生成素、白介素-3和幹細胞因子。
46.如權利要求45所述的試劑盒，還包括管道和一個或多個無菌袋。
47.如權利要求45和46中的一項所述的試劑盒，其特徵在於，所述生長因子以以下濃度存在Flt-3L1.9微克/毫升；血小板生成素 1.9微克/毫升；白介素-3 0.17微克/毫升；和幹細胞因子1微克/毫升。
全文摘要
一種生物反應器(15)，其具有反應室；第一埠(20)，適於引入人細胞；第二埠(21)，適於氣體交換，所述第二埠包括濾器；第三埠(22)，適於引入細胞培養基；第四埠(26)，適於細胞取樣；以及第五埠(28)，適於在人細胞經培養後將其收穫。
文檔編號C12M3/00GK1993460SQ200480043519
公開日2007年7月4日 申請日期2004年7月12日 優先權日2004年7月12日
發明者G·曼布瑞尼, G·阿斯託瑞, I·潘扎尼, L·比吉, V·阿達米, W·馬蘭戈納, E·法拉斯卡 申請人:索林集團義大利有限公司, Crb荷蘭有限公司