應用抗體分子對腫瘤血管進行選擇性定向的製作方法

2023-05-04 13:31:11 1

專利名稱：應用抗體分子對腫瘤血管進行選擇性定向的製作方法
技術領域：
本發明涉及應用抗體分子對腫瘤血管系統進行定向(targeting)。特別的，本發明涉及與纖連蛋白的ED-B結合且被證實其能用於腫瘤定向的抗體分子的用途。在本發明的不同的實施方案中，採用了不同分子形式的抗體分子。在某些實施方案中，抗體分子包括人IgG1。在其他的實施方案中，抗體分析是小免疫球蛋白(mini-immunoglobulin)，例如通過將scFv抗體分子融合到在COOH末端天然地含有半胱氨酸的分泌型IgE異構體的恆定CH4結構域生成這種小免疫球蛋白，這形成一個共價連接的二聚體。在例如腫瘤定向的本發明的不同方面和實施方案中利用了血漿清除率、體內穩定性和其他有用的特性。根據臨床的需要和疾病，可以將不同抗體分子形式的不同的體內特性用於不同的診斷和/或治療目的。
由於非人源化的單克隆抗體具有免疫原性(1 Shawlert et al.，1985；2Miller et al.，1983)、差的藥代動力學特性(3 Hakimi et al.，1991；4 Stephenset al.，1995)以及對所補充的效應物功能無效(5 Riechmann et al.，1988；6Junghens et al.，1990)，因此儘管它們具有用作治療藥物的巨大潛能，但是在臨床試驗中很少地採用非人源化的單克隆抗體(mAbs)。最近對來源於噬菌體展示庫的分離的人抗體片段的研究解決了這些問題，再次激活了這些研究並再燃起利用這些藥物治療重大疾病的希望。事實上，這些分子可用作新的診斷和治療工具的理想構架(11 Reichert，2001；12 Huls etal.，1999)。此外，這些抗體可以被「成熟」為達到(即使沒有必要，但也至少是合意的)用於臨床的微微摩爾範圍內的親和力(13 Pini et al.，1998)。
然而，用於選擇性轉送診斷劑或治療劑的人抗體片段的臨床應用需要高度特異的靶。對於腫瘤，最常用的靶是細胞表面抗原，但它常既不豐富也不穩定。而在腫瘤進展過程中，腫瘤周圍的微環境發生了巨大的改變，它形成了具有用於基於抗體的腫瘤治療的靶的「腫瘤環境」(14Neriand Zardi，1998)。事實上，變化的腫瘤微環境本身是個可以被定向的致癌物的概念正逐漸成為一致的意見。因此，能有效地將治療藥物轉送到腫瘤微環境的分子代表著腫瘤治療的有希望的和重要的新工具(15 Bissel，2001；14 Neri and Zardi，1998)。
纖連蛋白(FN)是一種細胞外基質(ECM)成分，它廣泛地表達於各種正常的組織和體液中。通過對FN前mRNA(pre-mRNA)的不同的剪切可以生成不同的FN異構體，這個過程是被細胞因子和細胞外pH值所調節的(16 Balza et al.，1988；17 Carnemolla et al.，1989；18 Borsi et al.，1990；19 Borsi et al.，1995)。FN分子可以完全地包含或不包含完整的III型重複ED-B，也稱為外型III型重複B(EIIIB)(20 Zardi et al.，1987)。ED-B在不同的物種中是高度保守的，因此在廣泛被研究的哺乳動物中有著100％同源性(人、兔、鼠、狗)以及與雞的相似結構域有著96％同源性。在正常成人組織中免疫組化不能測定到含有ED-B的FN異構體(B-FN)，除非是遭受生理重建(例如，子宮內膜和卵巢)及傷口癒合期間的組織(17 Carnemolla et al.，1989；21ffrench-Constant，et al.，1989)。相反的，它在腫瘤和胎兒組織中是高表達的(17 Carnemolla et al，1989)。此外，已經證實B-FN是血管生成的標記物(22 Castellani et al.，1994)以及內皮細胞沿著含有B-FN的ECM纖維遊走並侵入腫瘤組織(23 Tarli et al.1999)。
已經描述了應用特異於BF-N異構體(24 Carnemolla et al.，1996；23Tarli et al.，99；25 Viti et al.，99；26 Neri et al.，97；27 Demartis et al.，2001)的人重組抗體，scFv(L19)(13 Pini et al.，98)對腫瘤血管進行選擇性定向。抗體可應用於將治療性放射性核素或毒性物質選擇性轉送到腫瘤血管的體內診斷性(免疫閃爍描繪術)和治療性方法中。另外，Birchler et al.(28 1999)顯示將化學結合於光敏劑的scFv(L19)選擇性地聚集於血管生成的鼠角膜模型的新生的血管中，在用近紅外線照射後，它導致了眼新生血管的完全和選擇性阻塞。
更最近的，Nilsson et al.(29 2001)報導了scFv(L19)與組織因子的細胞外結構域的免疫綴合物介導了不同類型的鼠腫瘤模型的選擇性梗死。此外，scFv(L19)和IL-2或IL-12的融合蛋白已經顯示出增強了這兩種細胞因子的治療作用(30 Halin et al.，submitted；31 Carnemolla et al.，2002)。也可參見WO01/62298中融合蛋白在包括腫瘤的病理性血管發生病變治療上的用途。最後，既然L19與鼠及人的ED-B有著同等好的反應，因此它可以被用於臨床前和臨床研究。
也見於PCT/GB97/01412、PCT/EP99/03210、PCT/EP01/02062和PCT/IB01/00382。
不同的抗體形式已經顯示在體內穩定性、清除率和對腫瘤定向的作用上有著不同的特性(32 Wu et al.，2000)。Li(33 Li et al.，1997)描述了小免疫球蛋白或小免疫蛋白(SIP)。
本發明涉及scFv、小免疫球蛋白和完整IgG1等不同形式的L19人抗體分子的製備、特徵以及體內生物分布的研究。


圖1顯示了舉例說明不同蛋白結構的模型。AFN亞基的結構域結構的模型。用灰色顯示了進行選擇性剪切的蛋白序列。如所示的，重組抗體L19的抗原決定簇定位於重複ED-B內。B-D相應地用於表示L19(scFv)(B)、L19-SIP(C)、和L19-IgG1/κ構建體的圖解。
圖2顯示了SK-MEL-28瘤在裸鼠中的生長曲線(三角)以及F9瘤在129小鼠品系中(圓圈)的生長曲線。繪製了體積(mm3)對時間(天)的曲線。每個數據點為六隻鼠的平均值±SD。
圖3顯示了不同的L19形式的體積排阻(size exclusionchromatography)色譜的結果。在圖A、B和C中相應地顯示了在放射性碘標記後L19形式的scFv、小免疫球蛋白及IgG1的體積排阻色譜值(Superdex 200)。圖D、E和F相應地顯示了靜脈注射放射性碘標記的L19形式的scFv、小免疫球蛋白及IgG1後的所示時間內血漿的體積排阻色譜值(Superdex 200)。在注射後的不同時間點，被測血漿中L19-SIP或L19-IgG1的曲線值沒有測定到變化，而在注射L19(scFv)2後3h觀察到了更高分子量的第二個峰。
圖4顯示了用不同的放射性碘標記的L19抗體分子形式在SK-MEL-28腫瘤負荷鼠的生物分布試驗的結果。報告了在i.v.注射後的所示時間內腫瘤內(圖4A)和血液內(圖4B)％ID/g的差異。在圖4C中繪製了腫瘤-血％ID/g比例曲線。L19(scFv)曲線用稜形表示，而L19小免疫球蛋白曲線用正方形表示，以及L19 IgG1用三角形表示。
圖5顯示了用放射性碘標記的L19(scFv)(正方形)與L19小免疫球蛋白(稜形)在F9腫瘤負荷鼠的生物分布試驗結果。報告了在i.v.注射後的所示時間時腫瘤內(A)和血液內(B)％ID/g的差異。
在一個方面，本發明提供了一種與人纖連蛋白的ED-B結合的特異性結合構件(member)，它包括L19 VH結構域和一個VL結構域、任意的一個L19 VL結構域，並且其中特異性結合構件包含包括與εs2-CH4融合的所述抗體VH結構域和抗體VL結構域並二聚體化的小免疫球蛋白，或包含整個IgG1抗體分子。
在Pini et al.(1998)J.Biol.Chem.27321769-21776中揭示了L19 VH結構域和L19 VL結構域的序列，Pini et al.的這些序列在此完全併入作為參考。
通常地，一個VH結構域與一個VL結構域的配對提供了一個抗體的抗原結合位點。在一個優選的實施方案中，L19 VH結構域與L19 VL結構域配對，因此形成了包括L19 VH與L19 VL結構域的抗體的抗原結合位點。在其他的實施方案中，L19 VH與除L19 VL以外的其他VL結構域配對。輕鏈的雜亂性(promiscuity)在本領域是熟知的。
可以從L19 VH或VL結構域得到一個或更多個CDR並將其結合到合適的框架中。下面將進一步地討論這個問題。SEQ ID NO.1、2、和3相應地顯示了L19 VH CDR 1、2、和3。SEQ ID NO.1、2、和3相應地顯示了L19 VL CDR 1、2、和3。
在此展示了VH和VL結構域的變體以及它們的CDR的序列，它們可以應用於針對ED-B的特異性結合構件中，利用序列變更或突變以及篩選方法的方式可以生成這些變體。
如所討論的，根據本發明可以採用任一VH和VL結構域的可變區結構域的胺基酸序列變體，在此特異性地闡述了它們的序列。特殊變體可以包括一個或多個胺基酸序列變更(一個胺基酸殘基的添加、缺失、取代和/或插入)，可以是小於20個變更、小於15個變更、小於10個變更或小於約5個變更、4、3、2或1個變更。變更可以發生於一個或多個框架區域和/或一個或多個CDR。
根據本發明的特異性結合構件可以是與能結合於ED-B並包含L19VH結構域和L19 VL結構域所形成的抗原結合位點的特異性結合構件競爭性結合抗體的構件。體外容易測定結合構件之間的競爭，例如利用ELISA和/或通過將特殊的報告分子標記於結合構件，並在存在有其他非標記的結合構件時測定該標記的構件，這樣能鑑別與相同的抗原決定簇或重疊的抗原決定簇相結合的特異性結合構件。
因此，本明的進一步的方面採用了含有人抗體的抗原結合位點的特異性結合構件，它與L19競爭性結合到ED-B。
根據本發明的特異性結合構件至少可以以L19的親和力與ED-B結合，在適當的條件下可以比較不同的結合構件的結合親和力。
除了抗體序列，根據本發明的特異性結合構件可以包括其他的胺基酸，例如形成肽或多肽，例如摺疊結構域、或是賦予分子除了與抗原結合的能力外的其他功能特徵。本發明的特異性結合構件可以具有可測定的標記物，或可以綴合一種毒素或酶(例如通過肽鍵或連接體)。
對於病理性血管生成疾病或病變的治療，本發明的特異性結合構件可以綴合一種毒素分子，例如一種殺生物劑分子或細胞毒性分子，它們可以選自白介素-2(IL-2)、阿黴素、白介素-12(IL-12)、幹擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)以及組織因子(優選的為截斷的組織因子(truncated tissue factor)，例如殘基1-219)。見，例如WO01/62298。
在更多的方面，本方面提供了一種包含編碼根據本發明的特異性結合構件的序列的分離的核酸，以及製備特異性結合構件的方法，它包括在能生成所述特異性結合構件並將其回收的條件下表達所述核酸。
根據本發明的特異性結合構件可以用於人體或動物體的治療或診斷方法，例如治療(可以包括預防性治療)人患者的疾病或病變的方法，包括給所述患者施用有效量的本發明的特異性結合構件。根據本發明的治療病變包括腫瘤，尤其是實體瘤，以及其他的病理性血管生成病變，包括類風溼關節炎、糖尿病視網膜病變、年齡相關性黃斑變性、以及血管瘤。
在另一個方面，提供了一種生產本發明的特異性結合構件的方法，該方法包括引起編碼核酸的表達。這樣一種方法可以包括在生產所述特異性結合構件的條件下培養宿主細胞。
生產方法可以包括產物的分離和/或純化步驟。
生產方法可以包括將產物加工成含有至少一種附加成分例如藥用可接受賦形劑的組合物。
下面進一步地詳細闡述了本發明的這些和其他的方面。
術語特異性結合構件(Specific binding member)它描述了一對彼此具有結合特異性的分子中的一個構件。特異性結合對的構件可以是天然起源的或是整個地或部分地合成生產的。分子對的一個構件在它的表面或穴內具有能特異性結合併互補於該分子對的另一個構件的特殊的空間或極性組合的區域。因此，分子對的構件具有能彼此特異性結合的特性。特異性結合對類型的實例為抗原-抗體、生物素-抗生物素蛋白、激素-激素受體、受體-配體、酶-底物。本應用是有關於抗原-抗體類型的反應。
抗體分子它描述了一種無論是天然的或部分或整個合成生產的免疫球蛋白。該術語也覆蓋了任何含有抗體結合結構域的多肽或蛋白。含有抗原結合結構域的抗體片段是那些Fab、scFv、Fv、dAb、Fd以及微型雙功能抗體。本發明是有關於完整IgG1抗體分子及如所述的含有εs2-CH4的小免疫球蛋白。
可以用DNA重組技術的方法從原始的抗體分子生成保持有原始抗體分子的特異性的其他抗體分子。這些技術可以包括將編碼抗體的免疫球蛋白可變區、或互補決定區(CDR)的DNA引入到不同的免疫球蛋白的恆定區，或恆定區加上框架區域。見，例如，EP-A-184187、GB 2188638A或EP-A-239400。
可以用多種方法改造抗體，術語「抗體分子」應當被理解為覆蓋所有的具有所需特異性的抗體的抗原結合結構域的特異性結合構件或物質。因此，該術語覆蓋了抗體片段和衍生物，包括任何含有免疫球蛋白的抗原結合結構域的多肽，無論它是天然的或整個或部分合成的。所以還包括含有與另一個多肽融合的免疫球蛋白的結合結構域或其等價物的嵌合分子。EP-A-0120694和EP-A-0125023描述了對嵌合抗體的克隆和表達。
抗原結合結構域它描述了抗體分子的一部分，包括能特異性結合併互補於抗原的一部分或全部的區域。其中如果抗原是巨大的，那麼抗體可以只結合於抗原的特殊部分，這部分被稱為抗原決定簇。抗原結合結構域可以被一個或多個抗體的可變區所提供(例如稱為含有VH結構域的Fd抗體片段)。優選地，抗原結合結構域包括抗體輕鏈可變區(VL)和抗體重鏈可變區(VH)。
特異性它所指的是特異性結合對中的一個構件沒有顯示出對除它的特異性結合配體外的其他分子任何顯著結合的狀態。術語可適用於例如抗原結合結構域是特異於多種抗原所攜帶的特殊的抗原決定簇，其中具有抗原結合結構域的特異性結合構件能結合攜帶有抗原決定簇的各種抗原。
包含常用的意思是包括，也就是說容許存在一或多種特徵或成分。
分離的這指的是根據本發明發明的特異性結合構件或編碼這些結合構件的核酸通常所處的狀態。構件或核酸是游離的，或基本游離於它們所天然相關的物質，例如其他的多肽或游離於在它們的天然環境中所發現的核酸、或游離於當用DNA重組技術進行體外或體內製備時所製備它們的環境(例如細胞培養基)。可以用稀釋物或佐劑加工構件和核酸分子以及因為實踐目的仍保持其為分離的，例如如果將構件用於包被用於免疫檢測的微量滴定板時，一般將構件和凝膠或其他載體混合；或者當構件用於診斷或治療時，用藥用可接受載體與其混合。特異性結合構件可以被天然地或通過異種真核細胞體系(例如CHO或NSO(ECACC 85110503)細胞)糖基化，或它們可以是非糖基化(例如如果通過原核細胞內表達生成)。
「基本如同展示的」指的是本發明的的CDR或VH或VL結構域與在此所展示的序列的特定區域完全一致或高度相似。「高度相似」意思是在CDR和/或VH或VL結構域可以發生從1個到5個，優選的從1個到4個例如1到3或1或2、或3或4個取代。
用於攜帶本發明的CDR的結構一般是抗體的重鏈或輕鏈序列或它們的主要部分，其中CDR定位於對應於重組免疫球蛋白基因所編碼的天然發生的VH和VL抗體可變結構域的CDR位點。參照於Kabat，E.A等(Sequences of Proteins of Immunological Interest.5th Edition.USDepartment of Health and Human Services.1991)及其更新(現可自網際網路查到http//immuno.bme.nwu.edu，或使用任何搜索工具查找″Kabat″)可以測定出免疫球蛋白可變結構域的結構和位點。
優選地，攜帶基本如同展示的CDR胺基酸序列作為人可變結構域或它們的主要部分的CDR。基本如同展示的L19 VH CDR3和/或L19 VLCDR3可以被用於本發明的優選的實施方案中，以及優選的它們中的每個CDR3都可被用作為人重鏈或輕鏈或它們的主要部分的可變結構域。
免疫球蛋白可變結構域的主要部分將包括至少三個CDR區域，以及它們之間的框架區域。優選地，該部分也將包括第一和第四框架區域的每個區域或兩個區域的至少約50％、這50％將是第一框架區域的C末端50％以及第四框架區域的N末端50％。可變結構域的主要部分的N末端或C末端附加殘基可以是那些一般與天然發生的可變結構域區域不相關的殘基。例如，利用DNA重組技術製成的本發明特異性結合構件的構建體可以造成引入所導入的促進克隆或其他操作步驟的連接劑所編碼的N或C末端殘基。其他的操作步驟包括引入連接劑，將本發明的可變結構域進一步地連接到包括免疫球蛋白重鏈、其他可變結構域或如下所詳細描述的蛋白標記物的蛋白序列。
在根據本發明的IgG1抗體中，VL結構域可以以C末端連接到包括人Cκ或Cλ鏈，優選的CK鏈的抗體輕鏈的恆定結構域。
可以用可測定的或功能性的標記物標記本發明的特異性結合構件。下面描述了可測定的標記物，它包括放射性標記物，例如鎝、銦、釔、銅、鑥或錸的放射性同位素，特別是94mTc、99mTc、186Re、188Re、111In、86Y、88Y、177Lu、64Cu和67Cu，利用在此所描述的抗體成像領域中已知的傳統化學將它們連接到本發明的抗體上。
標記物也包括酶標記物，例如辣根過氧化物酶。標記物進一步地包括可以被與例如標記的抗生物素蛋白的特異可測定亞基結合測定的化學亞基例如生物素。
在此所闡述的特異性結合構件(L19-SIP)特別地適合於用例如94mTc、99mTc，186Re、188Re、203Pb、67Ga、68Ga、43Sc、47Sc、110mIn、111In、97Ru、62Cu、64Cu、67Cu、68Cu、86Y、88Y、90Y、121Sn、161Tb、153Sm、166Ho、105Rh、177Lu、172Lu和18F同位素進行放射性標記，以及隨後用於放射性診斷和放射性治療。99mTc是特別優選的用於標記的放射性同位素，下面的試驗部分描述了一個合適方案。
為了直接地標記特異性結合構件，首先用例如氯化錫(II)、Tris(2-羧乙基)膦(TECP)的適當的還原試劑還原半胱氨酸橋接的分子並生成游離的半胱氨酸SH基團，它可以與例如Tc或Re同位素反應。在這個特殊的過程中，在存在有例如酒石酸鈉和API的輔助配體時，用例如氯化錫(II)的還原試劑還原從即時反應體系中生成的permetalates(在下面的試驗部分提供有細節)。
利用預先與螯合配體的結合可以進行用例如銦、釔、鑭系元素或鎝和錸直接標記特異性結合構件的氨基或巰基。螯合配體優選的來自乙二胺四乙酸(EDTA)、二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)、環己基1，2-二氨五乙酸(CDTA)、乙烯甘油-O，O』-雙(2-氨乙基)-N，N，N′，N′-乙醯乙酸(HBED)、三乙烯四氨基己乙酸(TTHA)、1，4，7，10--四氮雜環十二烷-N，N，N-四乙酸(1，4，7，10-tetraazacyclododecane-N，N′，N″-tetraacetic acid，DOTA)、1，4，7-三氮雜環壬烷-N，N′，N″-三乙酸(1，4，7-triazacyclononane-N，N′，N′-triaceticacid，NOTA)、1，4，8，11-四氮雜環十四烷-N，N′，N″，N-四乙酸(1，4，8，11-tetraazacyclotetradecane-N，N′，N″，N-tetraacetic acid，TETA)、巰基乙醯二甘氨酸(mercaptoacetyl diglycine，MAG2)、巰基乙醯三甘氨酸(mercaptoacetyl triglycine，MAG3)、巰基乙醯甘氨醯半胱氨酸(mercaptoacetyl glycyl cysteine，MAGC)、半胱氨酸甘氨醯半胱氨酸(cysteinyl glycyl cysteine，CGC)。螯合配體具有適宜的結合基團，例如活性酯基、馬來醯亞胺、硫氨基甲醛或α-滷化乙醯胺基團。對於將螯合配體結合到例如賴氨酸殘基的ε-NH2基團，不需要對L-19-SIP的預先還原。
將本發明的特異性結合構件設計用於針對人或動物對象的診斷或治療方法，優選以人為對象。
因此，本發明的進一步的方面提供了治療方法，包括施用所提供的特異性結合構件及包含該特異性結合構件的藥用組合物，以及提供了該特異性結合構件在生產用於施用的藥物中的用途，例如用於製備藥物或含有用藥用可接受賦形劑加工的特異性結合構件的藥用組合物的方法。
本發明的特異性結合構件所能提供治療價值的臨床適應證包括腫瘤例如實體腫瘤、也包括其他的病理性血管生成病變，包括類風溼關節炎、糖尿病視網膜病變、年齡相關性黃斑變性以及血管瘤。
根據本發明的特異性結合構件可以用於治療人或動物身體的方法，例如治療(可以包括預防性治療)人患者的疾病或病變的方法，它包括給所述患者施用有效量的本發明的特異性結合構件。在別處討論了根據本發明所治療的病變。
因此，本發明的進一步的方面提供了治療方法包括施用所提供的特異性結合構件、含有這種特異性結合構件的藥用組合物，以及這種特異性結合構件用於生產施用的藥物的用途，例如用於製備藥物或含有用藥用可接受賦形劑加工的特異性結合構件的藥用組合物的方法。
根據本發明，可以將所提供的組合物施用於個體。施用量優選的是「治療有效量」，就是足以顯示出對患者有益療效的量。這些有益療效可以是至少改善至少一個症狀。確切的給藥量以及給藥速度和給藥時間將依賴於所治療疾病的性質和嚴重性。例如決定劑量的治療處方是在全科醫生和其他醫生的職權範圍內。抗體的合適劑量是本領域熟知的，見Ledermann J.A.et al.(1991)Int J.Cancer 47659-664；Bagshawe K.D.et al.(1991)Antibody，Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4915-922所述。
可以單獨施用或和其他的治療同步或序貫地聯合施用組合物，這依賴於所治療的病變。
本發明的特異性結合構件包括那些含有抗體的抗原結合結構域的構件，可以通過任何合適的途徑，通常是通過注射到血液和/或直接注射到需治療的部位例如腫瘤而施用於所需要治療的患者。精確的劑量依賴於多種因素治療途徑、治療區域(例如腫瘤)的大小和定位、抗體確切的性質(例如，整個IgG1抗體分子、小免疫球蛋白分子)以及連接於抗體分子的任何可測定標記物或其他分子的性質。常用的抗體劑量是在10-50mg範圍內。
這是單次治療成人患者的劑量，它可按比例地調整以用於治療兒童和嬰兒，也可以根據分子量比例調整其他抗體形式的劑量。根據醫生的判斷，可以每天、每周兩次、每周或每月間隔地重複治療。
通常以藥用組合物形式施用本發明的特異性結合構件，它包括至少一種除特異性結合構件以外的成分。
因此根據本發明的藥用組合物以及根據本發明用法的組合物可以包括除了活性成分以外的藥用可接受的賦形劑、載體、緩衝劑、穩定劑或其他本領域人員所熟知的其他材料。這些材料應當是無毒的且不幹擾活性成分的療效。載體或其他材料的準確性質依賴於給藥的途徑、它可以是口服的或例如經靜脈內注射的。
對於靜脈內注射或病變局部注射，活性成分應當是可腸外給藥的水溶液形式，它應是無熱原的並具有合適的pH值、滲透壓和穩定性。本領域相關人員能製備所用的適宜的溶液，例如等滲介質，例如氯化鈉注射液、Ringer注射液、加入乳酸鹽的Ringer注射液。可以按需包含有防腐劑、穩定劑、緩衝劑、抗氧化劑和/或其他添加劑。
可以單獨施用或和其他治療同步或序貫地聯合施用組合物，這依賴於所治療的病變。其他治療可以包括施用適宜劑量的疼痛緩解藥物例如非甾體類抗炎藥物(例如阿斯匹林、撲熱息痛、布洛芬或酮洛芬)或阿片類例如嗎啡、或止吐藥。
本發明提供了一種包括引起或容許在此所提供的特異性結合構件與ED-B結合的方法。要注意的是，這樣的結合可以發生在體內，例如在施用特異性結合構件之後、或施用編碼特異性結合構件的核酸後，或結合可以發生在體外，例如ELISA、Western印跡、免疫細胞化學法、免疫沉澱或親和色譜法中。
可以測定與ED-B結合的特異性結合構件的量。該量可能與測試標本中抗原的量相關，標本可以是診斷相關的標本，可以是治療相關的標本。
通過適當的方法可以測定標本中的抗體反應性。放射免疫法(RIA)是一種可能的方法。將放射活性標記的抗原與未標記的抗原(測試標本)混合併容許其與抗體結合。將結合抗原和非結合抗原完全分開並測定與抗體結合的放射活性抗原的量。測試標本中抗原越多那麼與抗體結合的放射活性抗原就越少。利用結合有報告分子的抗原或類似物，用非放射活性抗原也可以進行競爭性結合檢測。報告分子可以是螢光染料、具有獨立吸收或發射光譜特性的發光或雷射染料。適宜的螢光染料包括螢光素、羅丹明、藻紅蛋白和德克薩斯紅。適宜的顯色染料包括二氨基聯苯胺。
其他報告物包括大分子膠狀粒子或特殊材料例如被染色的乳膠珠、磁性或常磁性的、能直接或間接地形成可肉眼觀察到的可測定信號的生物或化學活性物質、電可測定的或其他可記錄的物質。例如這些分子可以是催化發生或改變顏色或引起電特性改變的反應的酶。它們可以是分子可激動的，使得能量狀態之間的電轉換可以造成特徵性的吸收或發射光譜。它們可以包括用於和生物傳感器相結合的化學實體。可以採用生物素/抗生物素蛋白或生物素/抗生物素鏈菌素蛋白以及鹼性磷酸酶檢測系統。
可以用單個抗體-報告物綴合物所生成的信號獲得標本中(正常或測試標本)相關結合抗體的定量的絕對或相對數據。
本發明可以進一步擴展到與任何特異性結合構件競爭地與ED-B結合的特異性結合構件，該特異性結合構件與抗原結合併包括一個V結構域，該結構域包括基本如同在此所展示的胺基酸的CDR，優選包括含有SEQ ID NO.3的VH CDR3的VH結構域。體外容易測定結合構件之間的競爭，例如通過在存在其他未標記結合構件時，用特異的報告物分子標記一個能測定的結合構件，這能鑑別與相同抗原決定簇或重疊抗原決定簇結合的特異性結合構件。利用例如Carnemolla等(24 1996)所描述的ELISA可以測定競爭性。
本發明進一步提供了編碼本發明的特異性結合構件的分離的核酸。核酸可以是DNA或RNA。
本發明也提供了包括至少一個同上的多核苷酸的質粒、載體、轉錄或表達盒形式的構建體。
本發明也提供了一種含有一種或多種所述的構建體的重組宿主細胞。編碼所提供的特異性結合構件的核酸本身形成了本發明的一個方面，生產該編碼產物的方法也同樣形成了本發明的一個方面，方法包括從編碼核酸中表達。通過在適宜的條件下培養含有核酸的重組宿主細胞可以容易地獲得表達。在表達生成之後，然後適當地使用任一合適的技術可以分離和/或純化特異性結合構件。
根據本發明可以提供分離的和/或游離於它們的天然環境的基本純化或同源形式的特異性結合構件和編碼核酸分子及載體，或者對於核酸，它是游離於或基本游離於除外編碼所需功能的多肽的核酸的原始核酸或基因。根據本發明核酸可以包括DNA或RNA以及可以是全部或部分合成的核酸。參照於在此所展示的核苷酸序列包括具有特異性序列的DNA分子，以及包括具有特異性序列的RNA分子，其中U取代了T，除非文中有其他的需要。
在各種不同的宿主細胞中克隆和表達多肽的體系是熟知的。適宜的宿主細胞包括細菌、哺乳動物細胞、酵母和昆蟲杆狀病毒體系。本領域可獲得的用於異種多肽表達的哺乳動物細胞系包括中國倉鼠卵巢細胞、HeLa細胞、幼年倉鼠腎臟細胞、NSO小鼠黑色素瘤細胞和許多其他的細胞。常用的並優選的細菌宿主是大腸桿菌。
本領域已經較好地建立了抗體和抗體片段在例如大腸桿菌的原核細胞中的表達。有關綜述見例如Pluckthun，A.Bio/Technology 9545-551(1991)。本領域人員也可進行在真核細胞培養中的表達，並作為一種生產特異性結合構件的選擇，見最近的綜述例如M.E.(1993)Curr.OpinionBiotech.4573-576；Trill J.J.et al.(1995)Curr.Opinion Biotech 6553-560。
可以選擇或構建含有包括啟動子序列、終止子序列、多腺苷序列、增強子序列、標記基因和其他適宜的序列的適當的調節序列的適宜載體。載體可以是適宜的質粒、病毒噬菌體或噬菌體質粒。進一步的詳細說明見，例如，Molecular Cloninga Laboratory Manual3nd edition，Sambrook etal.，2001，Cold Spring Harbor Laboratory Press。
在Current Protocols in Molecular Biology，Second Edition，Ausubel etal.eds.，John Wiley Sons，1992中詳細地描述了許多已知的擴增核酸的技術和方法，例如製備核酸構建體、生成突變、測序、將DNA導入到細胞以及基因表達、和蛋白分析。在此一併參考Sambrook et al.和Ausubelet al.的闡述。
因此，本發明的進一步的方面提供了含有在此所闡述的核酸的宿主細胞。仍是進一步的方面提供了一種包括將這樣的核酸導入到宿主細胞的方法。導入可以採用任何一種可獲得的技術。對於真核細胞，合適的技術可以包括磷酸鈣轉染、DEAE-Dextran、電穿孔、脂質體介導的轉染以及利用逆轉錄病毒或例如牛痘的其他病毒對昆蟲細胞和昆蟲杆狀病毒的轉化。對於細菌細胞，合適的技術可以包括氯化鈣轉化、電穿孔和利用細菌噬菌體的轉染。
在導入後緊接著的是引起或容許核酸的表達，例如通過在容許基因表達的條件下培養宿主細胞。
在一個實施方案中，將本發明的核酸整合到宿主細胞的基因組中(例如染色體)。根據標準技術通過將促進重組的序列包含於基因組中可以促進整合。
本發明也提供了一種方法，包括在表達體系中用如上所述的構建體表達所述的特異性結合構件或多肽。
根據說明書包括以下實驗性實施例所揭示的內容，本發明的進一步的方面和實施方案對於本領域人員是顯而易見的。
本申請中任何地方所提及的所有文獻均併入一併作為參考。
實施例材料和方法scFv、小免疫蛋白(SIP)和IgG1構建體scFv(L19)的製備和表達scFv(L19)是一種特異性針對於纖連蛋白ED-B結構域的親和力成熟(Kd＝5.4×10-11M)的抗體片段(13 Pini et al.，1998)。將scFv(D1.3)(7McCafferty et al.；26 Neri et al.，1997)，即小鼠抗雞卵清溶菌酶scFv，作為對照。根據Pini et al.(34 1997)在大腸桿菌株HB2151(Maxim Biotech，San Francisco CA)中表達這些scFv。
小免疫球蛋白(Mini-immunoglobulin)為了構建L19小免疫蛋白(L19-SIP)基因(圖1C)，利用相應地含有ApaLI和BspEI限制性位點的引物BC-618(gtgtgcactcggaggtgcagctgttggagtctggg-SEQ ID NO.8)及BC-619(gcctccggatttgatttccaccttggtcccttggcc-SEQ ID NO.9)，根據廠家的說明書用Pwo DNA聚合酶通過聚合酶鏈反應(PCR)擴增編碼scFv(L19)的DNA序列。將擴增產物插入到pUT-εSIP載體的ApaLI/BspEI位點，它提供了具有細胞外介質蛋白分泌所需的分泌信號的scFv基因。在用人IgE分泌型異構體IgE-S2(εs2-CH4；35 Batista et al.，1996)的CH4結構域取代人恆定γ1-CH3結構域後，從先前描述的pUT-SIP-long(33 Li et al.，1997)可生成pUT-εSIP載體。CH4是一種容許IgE分子二聚體化的結構域，這些εs2異構體在其末端含有半胱氨酸，它可以通過鏈間二硫鍵穩定IgE二聚體。在最終的SIP分子中，通過短GGSG連接體將ScFv(L19)連接到εs2-CH4結構域上。為了得到構建體pcDNA3-L19-SIP，用HindIII和EcoRI限制性酶從質粒pUT-εSIP-L19中分離出SIP基因，並將其克隆進哺乳動物表達載體pcDNA3(Invitrogen，Groningen，The Netherlands)中，該載體含有巨細胞病毒(CMV)啟動子，以便生成構建體pcDNA3-D1.3-SIP。
用引物BC-721(ctcgtgcactcgcaggtgcagctgcaggagtca-SEQ ID NO.10)和BC-732(ctctccggaccgtttgatctcgcgcttggt-SEQ ID NO.11)擴增編碼scFv(D1.3)的DNA序列，並將其插入到PUT-SIP載體的ApaLI/BspEI位點，然後用HindIII和EcoRI限制性酶從質粒pUT-εSIP-D1.3中分離出D1.3-SIP基因，並將其克隆進pcDNA3。
將這些構建體用於按生產商所優化的粘附細胞的方案用FuGENE 6轉染試劑轉染SP2/0鼠黑色素瘤細胞(ATCC，American Type CultureCollection，Rockville，MD，USA)。將轉染瘤(transfectoma)生長於補充有10％FCS和選擇性應用750μg/ml慶大黴素(G418，Calbiochem，San Diego，CA)的DMEM中。
IgG1為了製備完整的IgG1，用HindIII和XhoI從先前描述的L19-pUTeSIP分離出L19重鏈(L19-VH)的可變區以及它的分泌肽序列，並將它們插入到含有完整人γ1恆定重鏈基因的pUC-IgG1載體中。然後用HindIII和EcoRI從pUC-IgG1-L19-VH中分離出重組IgG1基因並將其克隆到pcDNA3中，得到構建體pcDNA3-L19-IgG1。
為了製備完整的L19輕鏈，用相應地含有ApaLI和BsiWI限制性位點的引物BC-696(tggtgtgcactcggaaattgtgttgacgcagtc-SEQ ID NO.12)和BC-697(ctctcgtacgtttgatttccaccttggtcc-SEQ ID NO.13)通過PCR從L19-pUT-εSIP(上述的)擴增出L19-VL。在用ApaLI和BsiWI消化後，將擴增產物插入到含有分泌信號序列及人恆定κ輕鏈序列的載體pUT-SEC-hCκ中。然後用HindIII和XhoI從pUT-SEC-hCκ-L19-VL分離出重組輕鏈基因並將其插入到通過將維持基因轉移到G418而來源於pcDNA3載體的哺乳動物表達載體pCMV2Δ中，以獲得構建體CMV2Δ-L19-κ。
如上所述用這些等摩爾量(equimolar amount)的構建體共轉染SP2/0鼠黑色素瘤細胞。在ELISA中篩選慶大黴素選擇克隆的分泌嵌合免疫球蛋白、完整重鏈及輕鏈的能力。
利用Maxiprep體系從Qiagen(Hilden，Germany)純化所有的DNA構建體，並用ABI PRISM dRhodamine Terminator Cycle Sequencing ReadyReaction Kit(Perkin Elmer，Foster City，CA)確定構建體雙鏈的DNA序列。除BsiWI(New England Biolabs，Beverly，MA)以外的所有限制性酶都來自Roche Diagnostics(Milan，Italy)，在RE消化後，利用Qiaquick方法(Qiagen)從瓊糖膠中還原插入物和載體。
抗體的純化和質控根據Carnemolla et al.(24 1996)所描述的方法，用免疫親和色譜法純化不同的抗體。
按照生產商的說明書(24 Carnemolla et al.，96)用與瓊脂糖4B(Amersham Pharmacia Biotech.，Uppsala，Sweden)綴合的ED-B免疫純化所有不同的L19抗體形式，而用與瓊脂糖4B(Amersham Pharmacia)綴合的雞卵清溶菌酶分離柱純化D1.3抗體。
免疫純化的抗體形式L19-SIP和L19-IgG1不需要進一步的純化，用pH值為7.4的PBS在4℃將其透析。因為從免疫親和色譜法獲得的scFv包含有兩種形式，單體的和二聚體的，因此需要如Demartis et al.(27 2001)所描述的第二個純化步驟來分離後一種形式。製備成批的不同的抗體形式，並利用在還原和非還原條件下的SDS-PAGE、免疫組化、體積排阻色譜(Superdex 200，Amersham Pharmacia Biotech)以及ELISA試驗對其進行分析。
十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、體積排阻色譜和免疫組化依照Carnemolla et al.(24 1996)在給定條件的培養介質中進行篩選ELISA試驗。為了揭示不同的L19抗體形式的表達，將含有包含有L19所識別的抗原決定簇的FN的ED-B結構域的重組片段7B89(24Carnemolla et al.，1996)固定於Maxisorp免疫板(Nunc，Roskilde，Denmark)。為了測定ELISA試驗中的D1.3抗體，將雞卵清雞溶菌酶(Sigma)固定於EIA板的NH2表面(Costar，Cambridge，MA)。將按照生產商的說明書稀釋的綴合了過氧化物酶的兔抗人IgE(Pierce，Rockford，IL)用作為檢測SIP的第二抗體。對於IgG1，使用綴合過氧化物酶的兔抗人IgG(Pierce)。對於含有標記序列FLAG的scFv，相應地將鼠抗人FLAG單克隆抗體(M2，Kodak)和綴合過氧化物酶的山羊抗鼠抗體(Pierce)用作為第二和第三抗體。在所有的情況中，利用過氧化物酶的底物ABTS(Roche)測定固定抗原的免疫反應性，並測定了在405nm的分光光度吸光度。
利用快速蛋白液態色譜法(FPLC；Amersham Pharmacia)用Superdex200(Amersham Pharmacia)色譜柱分析純化的抗體在天然條件下的凝膠濾過值。如Castellani et al.(22 1994)所描述的進行不同組織晶體切片上的免疫組化，在還原或非還原條件下依照Carnemolla et al.(17 1989)進行4-18％梯度的SDS-PAGE。
動物和細胞株無胸腺裸鼠(8周大裸/裸CD1雌性)來自Harlan Italy(Correzzana，Milano，Italy)，129(克隆SvHsd)株鼠(8-10周大小，雌性)來自HarlanUK(Oxon，England)。鼠胚胎畸胎癌細胞(F9)、人黑色素瘤來源細胞(SK-MEL-28)及鼠骨髓瘤細胞(SP2/0)購自American Type CultureCollection(Rockville，MD)。為了誘導腫瘤，用16×106SK-MEL-28細胞皮下注射裸鼠，以及用3×106F9細胞處理129株鼠。用下面的公式測定腫瘤體積(d)2×D×0.52，其中d和D分別是用測徑器測量的腫瘤的短徑和長徑。依照國內立法(Italian law no.116 of 27 January，1992)並參照於用於科學目的的動物保護方法飼養、處理和處死動物。
重組抗體的放射性碘標記依照生產商的說明書利用IODO-GEN預先包被的碘標記的管(Pierce)激活Na125I(NEN Life Science Products，Boston，MA)，按照Chizzonite間接方法(36 Riske et al.，1991)完成蛋白的放射性碘標記。在報導的實施方案中，用1.0mCi Na125I碘標記的0.5mg蛋白。利用0.25％BSA預先處理及PBS平衡的PD10柱(Amersham Pharmacia)從游離125I中分離出放射性標記的分子。用晶體γ計數器(Packard Instruments，Milano，Italy)測定標本的放射活性。對放射性標記蛋白的免疫反應性檢測在用200μl含0.25％BSA的PBS溶液飽和的ED-B瓊脂糖柱中進行。將200μl含0.25％BSA PBS溶液的已知量的放射性碘標記的抗體應用於柱的頂部並容許其進入柱。然後用1.5ml 0.25％BSA PBS溶液洗脫柱以去除非特異性結合的抗體。最後用1.5ml 0.1M pH11的TEA洗脫免疫反應性的結合材料。計數未結合和結合材料的放射性活性並計算出免疫反應性抗體的百分比。免疫反應性一直高於90％。
為了進一步分析放射性碘標記的抗體，將200μl已知量的放射性標記的蛋白加入到Superdex 200柱中。放射性碘標記後不同蛋白的儲存體積沒有不同。對於三種碘標記的L19抗體形式以及它們的陰性對照，從Superdex 200柱的放射活性收復率是100％(圖3A、3B和3C)。
生物分布試驗為了阻斷125I在胃的非特異性聚集以及在甲狀腺的濃聚，在注射放射性標記的抗體前30分鐘讓鼠口服溶於20mg水性高氯酸鈉(Carlo Erba，Italy)。在生物分布試驗期間每24h間隔重複該步驟。用100μl鹽水中的0.1nmol不同的放射性標記的抗體(相應的為6μg scFv、8μg SIP和18μgIgG)注射到瘤負荷鼠的尾部靜脈。在每個時間點處死三隻動物，取出含有腫瘤的不同器官，稱重並在γ計數器計數，然後用5％甲醛pH值7.4的PBS溶液固定，用於依照Tarli et al.(23 1999)進行的微量自動放射性顯像。
取出的血液標本也將其用於血漿製備，利用已經描述的免疫反應性檢測和凝膠濾過分析測定放射性標記的分子在血液中的穩定性。在兩種測定中都使用200μl血漿。不同器官的放射活性成分表示為每克注射劑量的百分比(％ID/g)。使用MacIntosh Program Kaleidagraph(SynergySoftware，Reading PA，USA)，通過最小平方極小化處理(a least squaresminimization procedure)計算放射性碘標記的抗體的血液清除參數，公式為X(t)＝A exp(-(αt))+B exp(-(βt)其中X(t)為放射性標記的抗體在時間t的％ID/g。該公式描述了雙指數的血清除值，其中α期的幅度被定義為A×100/(A+B)以及β清除期的幅度被定義為B×100/(A+B)。α和β是與相應的血液清除相的半衰期相關的速度參數。T1/2(α期)＝ln2/α＝0.692.../α；T1/2(β期)＝ln2/β＝0.692.../β；對應於每隻小鼠的2.5ml體積的血液，假定X(0)等於40％。
結果抗體的製備應用不同的L19(13 Pini et al.，1998)抗體形式(scFv、小免疫球蛋白和完整的人IgG1)以及它們在體內對腫瘤血管進行定向中的作用。
圖1顯示了用於表達不同的L19抗體形式的構建體。利用特異於非相關抗原的scFv的可變區(D1.3；7 McCafferty；26 Neri et al.，1997)製備相似的構建體。
為了生成SIP和IgG1，用圖1所示的構建體轉染SP2/0鼠骨髓瘤細胞並用G418選擇穩定的轉染瘤。通過ELISA確定出最佳生產者並將這些克隆擴增用於抗體純化。所有的三種L19抗體形式的純化是依據利用與瓊脂糖綴合的重組ED-B的免疫親和色譜。ScFv(L19)的產量為約8mg/l，L19-SIP為10mg/l，L19-IgG1為3mg/l。對於所用的特異於雞蛋溶菌酶的scFv(D1.3)的陰性對照，利用scFv D1.3的可變區構建了D1.3-SIP。在與瓊脂糖綴合的雞蛋溶菌酶上純化這兩種抗體。相應的產量是8和5mg/l。我們將商品化可獲得的人IgG1/κ(Sigma)用作為L19 IgG1的對照。
在還原和非還原條件下都進行了對三種純化L19形式的SDS-PAGE分析。對於scFv(L19)，如期望的一樣在還原和非還原條件下(未顯示)顯示的分子量都為約28kDa。L19-SIP在非還原條件下表現為近80kDa的分子量，而在還原條件下分子量為約40kDa。這些結果表明超過95％的天然分子以共價連接的二聚體形式存在。如所期望的那樣，L19-IgG1在非還原條件下顯示出約180kDa的主帶，而在還原條件下顯示出兩條對應於約55kDa重鏈和約28kDa輕鏈的條帶。
通過體積排阻色譜分析獲得了三種L19抗體形式的洗脫值。在所有的三種情況中都測定到代表著大於98％的正常分布的單一峰值。利用標準校對曲線，scFv(L19)2的外顯分子量為60kDa，L19-SIP為80kDa，以及L19-IgG1為180kDa。此外，證實不存在經常出現於重組蛋白製備中並可能使得體內研究所獲得的結果無效的分子聚集。對純化的對照蛋白進行的SDS-PAGE和體積排阻色譜(Superdex 200)給出了相似的結果。
利用這三種不同的L19抗體形式，對裸鼠中所誘導的SK-MEL-28人黑色素瘤細胞以及129株鼠中所誘導的F9鼠畸胎癌細胞的晶體切片進行免疫組化分析。在0.25-0.5nM低的濃度得到了最佳結果。所有的三種純化的L19抗體識別完全一致的結構。
放射性標記的L19抗體形式的體內穩定性將SK-MEL-28人黑色素瘤和F9鼠畸胎瘤用於體內生物分布研究。SK-MEL-28瘤有著相對緩慢的生長速度，而F9瘤卻生長迅速(圖2)。因此，使用SK-MEL-28瘤能進行長時間的試驗(最長到144h)，而F9瘤用於短時間的生物分布研究(最長到48h)。當腫瘤生長到近0.1-0.3cm3進行所有的生物分布試驗。為了比較不同的抗體形式，注射了100μl無菌鹽水的相同摩爾量的抗體形式。在注射前，將放射性碘標記的化合物用0.22μm濾過，並檢測了免疫反應性以及凝膠濾過值(見材料和方法)。放射性標記蛋白的免疫反應性始終大於90％。
圖3A-C報告了對放射性碘標記的L19抗體形式的凝膠濾過分析(Superdex 200)的數值。
在距離注射的不同時間間隔時從治療動物中取出血液標本，並用凝膠濾過色譜分析血漿中所存在的放射活性的免疫反應性。所有的三種L19抗體形式的凝膠濾過值都顯示為單一主峰，具有注射蛋白的分子量。僅僅scFv的數值顯示出具有更高分子量的第二峰，提示有聚集的形成(圖3D-F)。此外，在scFv(L19)2中觀察到形成了不能從Superdex 200柱上洗提的大分子量的聚集物。事實上，當L19SIP和L19-IgG從Superdex 200柱的回收率為所應用的放射活性的90-100％時，scFv(L19)2的放射活性的產量為約55％。僅僅在用0.5M NaOH洗滌色譜柱後才回收到剩餘的放射活性，這表明大的聚集物被阻滯於柱濾器中(表1)。
表1也報告了血漿中所進行的免疫反應性測定的結果(見材料和方法)。在試驗結束後，血漿中的L19-SIP和L19-IgG1保持了與初始試劑一樣的免疫反應性。相反的，在注射3h後，血漿中的scFv(L19)2的免疫反應性減少到小於40％。
比較生物分布試驗表2a、b、c和圖4報告了放射性標記的L19抗體在SK-MEL-28瘤負荷鼠的生物分布試驗中所得到的結果。
表2a、b、c顯示了在距離靜脈注射放射性標記的抗體的不同時間時，組織和器官包括腫瘤的％ID/g的平均值(SD)。
圖4顯示了在試驗的不同時間時腫瘤和血中不同抗體形式的％ID/g的差異，以及腫瘤和血％ID/g之間的比值。所有的三種L19抗體形式都選擇性地聚集於腫瘤內，表3中報告了腫瘤和其他器官的％ID/g的比值。
如微量自動放射顯像所證實的那樣，抗體只聚集在腫瘤血管上，其中可以見無在正常器官血管的特異性聚集。相反的，在腫瘤或在正常組織內都沒有發現放射性碘標記的對照分子的特異性聚集(表2a、b、c)。
如同通過計數尿標本所證實的那樣，所有三種抗體形式都顯示出清除主要是由腎臟介導的。和所預期的一樣，scFv(L19)2的清除是更快的，而完整L19-IgG1的清除是更慢的。通過雙指數函數曲線計算生成了表4所報告的半衰期值。
圖5描述了用放射性碘標記的scFv(L19)2和L19SIP在F9畸胎瘤腫瘤模型上所獲得的腫瘤和血％ID/g(SD)的差異。因為F9畸胎瘤的高血管生成活性，在i.v.注射3和6個小時時，腫瘤中所聚集的放射活性分子是SK-MEL-28瘤內的3到4倍，並且持續更高達48h的試驗持續時間。和SK-MEL-28瘤一樣，用微量自動化放射顯像證實了在腫瘤血管內的特異性聚集，而在注射對照分子後沒有發現特異性的腫瘤聚集。在表5中報告了在i.v.注射後的不同時間時F9腫瘤和其他器官內的L19(scFv)和L19SIP的％ID/g。
還原型L19-SIP的合成將422μl含有375μg(5nmol)L19-SIP的PBS溶液加入到50μl TCEP溶液(14.34mg TCEP xHCl/5ml Na2HPO4水溶液，0.1M，pH＝7.4)中。在37℃輕輕地搖晃反應混合物1個小時。用NAP-5柱(Amersham，洗提液PBS)通過凝膠色譜法純化還原型L19-SIP。對分離產物的SDS-PAGE分子證實L19-SIP定量轉換定為還原型L19-SIP。
產量100.3μg/200μl PBS(26.7％)。
Tc-99m-L19-SIP的合成將3.0mg L-酒石酸二鈉放置於小瓶中，緊接著加入200μl含有100.3μg還原型L19-SIP的PBS溶液，並用100μl Na2HPO4緩衝水溶液(1M，pH＝10.5)稀釋。加入85μl Tc-99m發生器洗脫液(24h)和10μlSnCl2溶液(5mg SnCl2/1ml 0.1M HCl)。在37℃搖晃反應混合物半小時。用NAP-5柱(Amersham，洗脫液PBS)通過凝膠色譜法純化Tc-99m標記的L19-SIP。
放射化學產率35.6％。
放射化學純度90.2％(SDS-PAGE)。
特異活性26.4MBq/nmol。
免疫反應性91.4％。
Tc-99m-MAG2-L19-SIP羧基甲基-t-丁基二硫化物的合成將1L含有21.75ml(0.312mol)1-巰基乙酸、43.5ml(0.312mol)三乙胺和100g(0.312mol)N-(叔-丁基巰基)-N，N′-雙-BOC-肼(N-(tert.-butylthio)-N，N′-di-BOC-hydrazine)的EtOH(abs.)溶液在逆流下加熱60h。在加壓下蒸發EtOH使得最終的體積為約200ml。將剩餘物倒入到1.81H2O中並用5摩爾NaOH將所得到的懸浮液的pH值調整為7.14。濾除Di-BOC-肼並用半量濃度的HCl將所得溶液的pH值調整為2.2。用600ml CH2Cl2從水中提取粗材料3次。在MgSO4上乾燥混合有機層，並在減壓下蒸發溶劑得到41.1g黃色油。該材料對於進一步的分析是足夠純的。
N-(苄氧羰基-Gly)Gly叔-丁酯(Z-(N-Gly)Gly叔-丁酯(N-(benzyloxycarbonyl-Gly)Gly t-butyl ester(Z-(N-Gly)Gly t-butyl ester)將1.41含有35.02g(114mmol)Z-Gly-O琥珀醯亞胺及15g(114mmol)Gly-O-tBu的CH2Cl2液在室溫N2氣下攪拌20h。用250ml 1％水性檸檬酸洗滌有機層3次，用200ml半飽和水性NaHCO3洗滌2次以及用200ml水洗滌1次。在非水性的MgSO4上乾燥有機層。在減壓下蒸發CH2Cl2得到36.5g(99％)黃色油狀的Z-Gly-Gly-O-tBu。粗材料對於進一步的分析是足夠純的。
Gly-Gly叔-丁酯將36.5g(113mmol)Z-Gly-Gly-O-tBu溶解於11THF中，緊接著加入3.65g活性碳鈀(10％)。在室溫H2氣下攪拌混合物3h。用N2淨化懸浮液、過濾(PTFE濾膜0.45nm)並在減壓下濃縮濾過液得到20.3g(95％)黃色油狀的Gly-Gly-O-tBu。粗材料對於進一步的分析是足夠純的。羧基甲基-t-丁基二硫化物甘氨醯甘氨酸t-丁酯(Carboxy methyl-t-butyldisulfide glycyl glycine t-butylester)將430ml含有23.85g(115.6mmol)DDC的CH2Cl2溶液逐滴加入到11含有21.76g(115.6mmol)Gly-Gly-O-tBu、20.84(115.6mmol)羧基甲基-t-丁基二硫化物及13.3g(115.6mmol)NHS的CH2Cl2溶液中。將所得到的懸浮液在室溫N2氣下攪拌過夜。將所得到的溶液過濾後，用400ml半飽和水性NaHCO3洗滌三次和用400ml水洗滌一次。在減壓下將幹有機層(MgSO4)蒸發。用梯度範圍從CH2Cl2/MeOH 99∶1到CH2Cl2/MeOH98.5∶1.5的溶劑在矽膠上通過層析法純化粗產物。分離到26.1g(64％)的黃色油狀物。
巰基乙醯甘氨醯甘氨酸(Mercaptoacetyl glycyl glycine)將26.32g(75.09nmol)羧基甲基-t-丁基二硫化物甘氨醯甘氨酸-丁酯在N2氣下溶解於233ml TFA中。在室溫下攪拌所得溶液20分鐘。在減壓(5-10×10~2mbar)下蒸發TFA，並另外攪拌乾燥所得油2h(5-10×10~2mbar)。加入250ml Et20後，沉澱出白色粉末以及攪拌懸浮液3h。濾過沉澱物並重懸於100ml Et20中。攪拌所得懸浮液過夜，濾過產物並在減壓下室溫中乾燥產物得到20.46g(92.5％)白色粉末。
巰基乙醯甘氨醯甘氨酸NHS酯將巰基乙醯甘氨醯甘氨酸(1g，3.4mmol)和N-羥基琥珀醯亞胺(391mg，3.4mmol)混合於乾燥的平底燒瓶中並溶解於無水的DMF(4ml)。在攪拌反應混合物的同時加入含有DDC(700mg，3.4mmol)的無水二惡烷。在15分鐘內開始形成沉澱(DCU)。1h後通過真空過濾去除沉澱物。用冷二惡烷洗滌沉澱物。從濾過液中去除二惡烷。通過加入二乙醚從剩餘的DMF溶液中沉澱出產物。過濾分離產物，用冷二乙醚洗滌，並在真空乾燥器中乾燥。產量為1.33(99％)。
Tc-99m-MAG2-ε-HN(Lys)-L19-SIP的合成用300μl四硼酸鈉緩衝液(0.1M，pH8.5)稀釋111μl含有200μg(2.66nmol)非還原型L19-SIP的PBS，並利用Slide-A-Lyzer 10,000MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)用200ml磷酸緩衝液(0.1M，pH8.5)透析兩個1h。加入50μl巰基乙醯甘氨醯甘氨酸NHS酯溶液(0.5mg溶解於500μl磷酸緩衝液，0.1M，pH8.5)並在37℃加熱反應混合物3h。並利用Slide-A-Lyzer 10,000 MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)，每次用200ml磷酸緩衝液(0.1M，pH8.5)透析兩個1h及1個17h(過夜)。往小瓶中加入3.0mg L-酒石酸二鈉後加入90μl Tc-99m發生器洗脫液(每天洗脫)以及加入25μl SnCl2溶液(5mg SnCl2/1ml 0.1M HCl)。在37℃搖晃反應混合物0.5h。用NAP-5柱(Amersham，洗脫液PBS)通過凝膠色譜法純化Tc-99m標記的L19-SIP。
放射化學產率55.1％。
放射化學純度94.5％(SDS-PAGE)。
特異性活性15.2MBq/nmol。
免疫反應性81.1％。
Re-188-L19-SIP的合成將3.0mg L-酒石酸二鈉放置於小瓶中，緊接著加入310μl含有150μg還原型L19-SIP的PBS溶液，並用100μl Na2HPO4緩衝水溶液(1M，pH＝10.5)稀釋。加入100μl Tc-99m發生器洗脫液(24h)和50μl SnCl2溶液(5mg SnCl2/1ml 0.1M HCl)。在37℃搖晃反應混合物1.5小時。用NAP-5柱(Amersham，洗脫液PBS)通過凝膠色譜法純化Tc-99m標記的L19-SIP。
放射化學產率34.8％。
放射化學純度97.2％(SDS-PAGE)。
特異活性13.5MBq/nmol.。
免疫反應性91.7％。
合成用於將EDTA、CDTA、TETA、DTPA、TTHA、HBED、DOTA、NOTA、D03A、以及類似類型的螯合劑綴合於半胱氨酸SH基團的還原型L19-SIP將50μl TECP溶液(14.34mg TCEP xHCl/5ml水性Na2HPO4，0.1M，pH＝7.4)加入到422μl含有375μg(5nmol)L19-SIP的PBS溶液中。在37℃輕輕地搖晃反應混合物1小時。用NAP-5柱(Amersham，洗脫液乙酸鈉緩衝液，0.1M，pH5.0)通過凝膠色譜法純化Tc-99m標記的還原型L19-SIP。對分離產物的SDS-PAGE分子證實L19-SIP定量轉換定為還原型L19-SIP。產量105.7μg/200μl(28.2％)。
In-111-MX-DTPA-馬來醯亞胺-S(Cys)-L19-SIP-R(R＝還原型)的合成將200μl含有105μg(2.8nmol)還原型L19-SIP的乙酸鈉緩衝液(0.1M，pH5.0)與50μl溶解的1，4，7-三氮-2-(N-馬來醯亞胺乙烯基p-氨基)苄基-1，7-雙(羧甲基)-4-羧甲基6-甲基庚烷(1，4，7-triaza-2-(N-maleimidoethylene p-amino)benzyl-1，7-bis(carboxymethyl)-4-carboxymethyl 6-methylheptane)(500μl 0.1M，pH5.0乙酸鈉緩衝液中含有0.25mg DTPA-馬來醯亞胺)在37℃反應3h。利用Slide-A-Lyzer 10,000 MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)用200ml乙酸鈉緩衝液(0.1M，pH6)透析兩次各1h。加入80μl[In-111]InCl3溶液(HCl，1N，40MBq，Amersham Inc.)並在37℃加熱反應混合物30分鐘。
用NAP-5柱(Amersham，洗脫液PBS)通過凝膠色譜法純化In-111標記的DTPA-馬來醯亞胺-S(Cys)-L19-SIP。
放射化學產率51.6％。
放射化學純度97.2％(SDS-PAGE)。
特異性活性7.9MBq/nmol。
免疫反應性88.5％。
合成MX-DTPA-馬來醯亞胺(1，4，7-三氮-2-(N-馬來醯亞胺乙烯基p-氨基)苄基-1，7-雙(羧甲基)-4-羧甲基6-甲基庚烷)將512mg(1mmol){[3-(4-氨基-苯基)-2-(雙-羧甲基-氨基)-丙基]-[2-(雙-羧甲基-氨基)-丙基]-氨基}乙酸(Macrocyclics Inc.Dallas，TX，U.S.A.)和707mg(7mmol)三乙胺溶解於3ml幹DMF中。逐滴加入1ml含有400mg(1.5mmol)3-(2，5-Dioxo-2，5-二氫-吡咯-1-基)-丙酸2，5-二氧-吡咯烷-1-基酯(Aldrich)的幹DMF。在50℃攪拌溶液5h。緩慢加入30ml二乙醚。將反應混合物進一步攪拌30min。過濾收集沉澱物。用RP-HPLC(乙氰-∶水-∶三氟乙酸/3∶96.9∶0.1→99.9∶0∶0.1)。產率61％(405mg，0.61mmol)。MS-ESI664＝M++1。
In-111-MX-DTPA-ε-HN(Lys)-L19-SIP的合成用300μl四硼酸鈉(0.1M，pH8.5)稀釋111μl含有200μg(2.66mmol)非還原型L19-SIP的PBS溶液，並利用Slide-A-Lyzer 10,000 MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)用200ml四硼酸鈉緩衝液(0.1M，pH8.5)透析兩次各1h。加入50μl 1，4，7-三氮-2-(p-異硫氰醯)苄基-1，7-雙(羧甲基)-4-羧甲基-6-甲基庚烷(MX-DTPA)(0.33mg MX-DTPA溶解於500μl四硼酸鈉緩衝液0.1M，pH8.5)並將反應混合物在37℃加熱3h。利用Slide-A-Lyzer 10,000 MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)每次各用200ml乙酸鈉緩衝液(0.1M，pH6.0)透析1h兩次以及17h一次(過夜)。
加入80μl[In-111]InCl3溶液(HCl, 1N，40MBq，Amersham Inc.)並在37℃加熱反應混合物30分鐘。用NAP-5柱(Amersham，洗脫液PBS)通過凝膠色譜法純化In-111標記的MX-DTPA-ε-HN(Lys)-L19-SIP。
放射化學產率72.4％。
放射化學純度80.3％(SDS-PAGE)。
特異性活性8.8MBq/nmol。
免疫反應性77.5％。
In-111-DOTA-C-Benzyl-p-NCS-E-HN(Lys)-L19-SIP的合成用300μl四硼酸鈉(0.1M，pH8.5)稀釋108μl含有200μg(2.66mmol)非還原型L19-SIP的PBS溶液，並利用Slide-A-Lyzer 10,000 MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)用200ml四硼酸鈉緩衝液(0.1M，pH8.5)透析1h兩次。加入50μl 1，4，7，10-四氮-2-(p-異硫氰醯)苄基環十二烷-1，4，7，10-四乙酸(苄基-p-SCN-DOTA)(Macrocyclics Inc.，Dallas TX，U.S.A.)(1.5mg苄基-p-SCN-DOTA溶解於5ml四硼酸鈉緩衝液0.1M，pH8.5)並將反應混合物在37℃加熱3h。利用Slide-A-Lyzer 10,000 MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)每次各用200ml乙酸鈉緩衝液(0.1M，pH6.0)透析1h兩次以及17h一次(過夜)。
加入80μl[In-111] InCl3溶液(HCl，1N，40MBq，Amersham Inc.)並在37℃加熱反應混合物30分鐘。用NAP-5柱(Amersham，洗脫液PBS)通過凝膠色譜法純化In-111標記的DOTA-C-Benzyl-p-NCS--HN(Lys)-L19-SIP。
放射化學產率70.8％。
放射化學純度92.1％(SDS-PAGE)。
特異性活性10.1MBq/nmol。
免疫反應性75.1％。
Y-88-MX-DTPA-ε-HN(Lys)-L19-SIP的合成用300μl四硼酸鈉(0.1M，pH8.5)稀釋110μl含有200μg(2.66mmol)非還原型L19-SIP的PBS溶液，並利用Slide-A-Lyzer 10,000 MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)用200ml四硼酸鈉緩衝液(0.1M，pH8.5)透析1h兩次。加入50μl MX-DTPA溶液(0.33mg MX-DTPA溶解於500μl四硼酸鈉緩衝液0.1M，pH8.5)並將反應混合物在37℃加熱3h。利用Slide-A-Lyzer 10,000 MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)每次各用200ml乙酸鈉緩衝液(0.1M，pH6.0)透析1h兩次以及17h一次(過夜)。
加入100μl[Y-88] YCl3溶液(HCl，1N，75MBq，Oak Ridge NationalLab.)並在37℃加熱反應混合物30分鐘。用NAP-5柱(Amersham，洗脫液PBS)通過凝膠色譜法純化Y-88標記的Y-88-MX-DTPA-ε-HN(Lys)-L19-SIP。
放射化學產率68.1％。
放射化學純度91.5％(SDS-PAGE)。
特異性活性11.4 MBq/nmol。
免疫反應性70.5％。
Lu-177-DOTA-C-Benzyl-p-NCS-ε-HN(Lys)-L19-SIP的合成用300μl四硼酸鈉(0.1M，pH8.5)稀釋120μl含有200μg(2.66mmol)非還原型L19-SIP的PBS溶液，並利用Slide-A-Lyzer 10,000 MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)用200ml四硼酸鈉緩衝液(0.1M，pH8.5)透析1h兩次。加入50μl苄基-p-SCN-DOTA溶液(1.5mg溶解於5ml四硼酸鈉緩衝液0.1M，pH8.5)並將反應混合物在37℃加熱3h。利用Slide-A-Lyzer 10,000 MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)每次各用200ml乙酸鈉緩衝液(0.1M，pH6.0)透析1h兩次以及17h一次(過夜)。
加入200μl[Lu-177] LuCl3溶液(HCl，1N，80MBq，NRH-Petten，Netherlands)並在37℃加熱反應混合物30分鐘。用NAP-5柱(Amersham，洗脫液PBS)通過凝膠色譜法純化Lu-177標記的DOTA-C-Benzyl-p-NCS-E-HN(Lys)-L19-SIP。
放射化學產率72.2％。
放射化學純度94.9％(SDS-PAGE)。
特異性活性18.3MBq/nmol。
免疫反應性73.4％。
給腫瘤負荷裸鼠單次靜脈注射In-111-MX-DTPA-L19-SIP後的器官分布及排洩給F9(畸胎瘤)負荷動物(體重約25g)靜脈注射約37kBq劑量的本發明的標記肽。在施用該肽後的不同時間點，用γ計數器測定了不同器官內的放射活性以及排洩物的放射活性。
表6顯示了In-111-MX-DTPA-L19-SIP在F9(畸胎瘤)負荷裸鼠的生物分布(平均值±SD，n＝3)。
給腫瘤負荷裸鼠單次靜脈注射Tc-99m-L19-SIP後的器官分布及排洩給F9(畸胎瘤)負荷動物(體重約25g)靜脈注射約56kBq劑量的標記肽。在施用該肽後的不同時間點，用γ計數器測定了不同器官內的放射活性以及排洩物的放射活性。另外，依照腫瘤和血液的肽濃度測定了不同時間的腫瘤血液比。
表7顯示了Tc-99m-L19-SIP在F9(畸胎瘤)負荷裸鼠的生物分布(平均值±SD，n＝3)。
表8顯示了Tc-99m-L19-SIP在F9(畸胎瘤)負荷裸鼠的腫瘤血液比(平均值±SD，n＝3)。
在動物試驗中證實放射性標記肽具有有利的特性。例如，Tc-99m-L19-SIP和In-111-MX-DTPA-ε-HN(Lys)-L19-SIP表現出高水平的腫瘤聚集，在注射後(p.i.)1小時為每克注射劑量的17.2(Tc-99m)或12.9(In-111)％(ID/g)。在p.i.24小時時觀察到顯著的腫瘤滯留為9.4(Tc-99m)或13.0(In-111)％ID/g。因此，腫瘤對其的攝取比其他已知的In-111或Tc-99m標記的抗體片段更高(e.g.Kobayashi et al.，J.Nuc.Med.，Vol.41(4)，pp.755-762，2000；Verhaar et al.，J.Nuc.Med.，Vol.37(5)，pp.868-872，1996)。在24hp.i.化合物的血液清除使得它們的腫瘤/血液比相應的為13∶1和6∶1。
最顯著的，In-111-MX-DTPA-ε-HN(Lys)-L19-SIP(22.5％ID/g)比Kobayashi et al.描述的其他高滯留的In-111標記的重組抗體片段(120％ID/g)表現出明顯更低的腎臟攝取和滯留。在24hp.i.腎臟的滯留是非常常見的問題並常阻礙了鑭系元素標記的化合物在放療中的應用。
試驗結果表明在此所描述的放射性免疫綴合物具有對於診斷性和治療性應用的傑出潛能，優選的通過腸外給藥而施用於患者。討論關於細胞毒性抗腫瘤藥物在正常組織中的分布比在腫瘤中更為有效的觀察(37 Bosslet et al.，1998)引起了探索將藥物選擇性轉送到腫瘤的可能性的一系列研究。然而，對腫瘤進行有效的定向有著兩個主要的要求1)腫瘤內的靶是特異的、充足的、穩定的並容易被來自血液的配體分子利用，以及2)具有適當的藥代動力學特性的配體分子，它容易從血液彌散到腫瘤並與靶具有高親和力以保證它在腫瘤內有效且選擇性聚集。
由於具有與眾不同的特性，腫瘤微環境是一種可能的泛腫瘤靶(pan-tumoral target)。事實上，腫瘤進展誘導了(以及隨後需要)腫瘤環境成分的顯著變化，特別是那些細胞外基質(ECM)。構成實體瘤ECM的分子與正常ECM的分子有著數量和質量上的差異。另外，所有的實體瘤都具有了多種這類腫瘤的ECM成分，這些成分代表了例如細胞侵襲(正常細胞侵襲到腫瘤組織和腫瘤細胞侵襲到正常組織中)和血管生成的常見性能和功能。本發明者已經關注到組成變化的腫瘤ECM的多種分子的含有ED-B結構域(B-FN)的FN異構體。
BF-N廣泛地表達於所有實體瘤的ECM中，因此它被廣泛地研究以及始終與血管生成過程相關(22 Castellani et al.，1994)，而且不存在於正常的成人組織中(17 Carnemolla et al.，1989)。將治療藥物靶向轉送到內皮下ECM克服了與實體瘤的間質高血壓(interstitial hypertension)相關的問題(38 Jain et al.，1988；39 Jain，1997；40 Jain RK，1999)。
L19(13 Pini et al.1998；25 Viti，Canc.Res.，23 Tarli，et al.，1999)，一種與FN的ED-B結構域具有高親和力的scFv，體內選擇性地並優選地聚集於腫瘤新生血管周圍，並且能將與它綴合的許多治療分子的任何一種分子選擇性地轉送並聚集到腫瘤實體中(28 Birchler et al.，1999；29 Nilsson，etal.，2001；30 Halin et al.2002；31 Carnemolla et al.，2002)。利用閃爍描繪術已經證實L19具有選擇性地定向腫瘤的能力。
本說明書報導了三種不同的L19抗體形式scFv、小免疫球蛋白/小免疫蛋白(SIP)和完整IgG1對腫瘤血管定向的作用，以及其藥代動力學。
通過將scFv(L19)與人IgE的分泌型異構體S2的εCH4結構域融合生成SIP分子。該εCH4是容許IgE分子二聚體化的結構域，以及S2異構體在其COOH末端含有半胱氨酸，它能通過鏈間二硫鍵穩定二聚體(35Batista et al.，1996)。IgE的FcεRI結合位點位於CH3結構域(41 Turner andKinet，1999；42 Vangelista et al.，1999；43 Garman et al.，2000)，所以根據本發明的實施方案，scFv與εCH4結構域的融合將不會激活任何導致高敏反應的信號。
已經研究了三種形式在兩種不同腫瘤模型中的表現鼠F9畸胎瘤和人SK-MEL-28黑色素瘤。第一種是快速生長的腫瘤，一旦種植在約2周時間內導致動物死亡。另一方面，SK-MEL-28表現為雙期生長曲線，具有早期的快速生長期，隨後為第二個慢生長期。先前已經顯示F9畸胎瘤中的ED-B量在腫瘤生長期間保持恆定(23Tarli，et al.，1999)；相反，聚集於SK-MEL-28黑色素瘤的ED-B與腫瘤生長的能力成正比(23 Tarli etal.，1999)，在第一期發現有豐富的ED-B，而在第二期的量較少。應用SK-MEL-28黑色素瘤可以進行長時間的生物分布研究，且沒有能引起曲解結果的腫瘤實體的動態差異(圖2)。
對三種L19抗體形式的體內穩定性的比較研究顯示，血漿L19-SIP和L19-IgG1在這個試驗期間保持有與注射前相同的免疫反應性和分子量。相反的，血漿scFv(L19)快速地散失了它的免疫反應性，並生成了太大而不能進入凝膠過濾層析柱的聚集物。這樣的scFv聚集物非常可能造成了腫瘤和肺的％ID/g之間的比率，因為聚集物可以聚集於肺的微血管中(表3)。對於所有的三種形式，血漿清除主要是通過腎臟清除，表現為具有α和β期的雙期曲線，如表4所報告的，它與分子大小成反比。
所研究的不同的抗體形式在腫瘤的聚集是分子的清除率和體內穩定性的結果。利用scFv，在注射放射性標記的抗體3h後觀察到每克注射劑量的最大百分比(％ID/g)，然後迅速減少。利用SIP，腫瘤內的％ID/g比scFv的高2-5倍，並在注射後4-6小時達到最高值。在F9和SK-Mel-28瘤中都觀察到了這種模式。相反的，在試驗期間IgG1在腫瘤內的聚集持續增高。然而，因為它的緩慢清除，比較於相同時間後的scFv的10比率以及SIP的70，144小時後％ID/g的腫瘤-血液比僅僅是3(圖4)。
在此所研究的三種抗體形式所表現出的體內穩定性、清除率和腫瘤定向能力的同樣出色的特性已經被用於各種診斷和/或治療目的，這依賴於臨床的需要和疾病。例如，在注射後即刻顯示出好的腫瘤-器官和腫瘤-血液比率的放射性標記的抗體對於體內診斷性閃爍描繪術是必需的，主要是因為在這些分析中使用短半衰期的同位素。
將抗體作為一種治療藥物的載體的不同嘗試是有可能的轉送到達它們的靶後才表現出它們的治療作用的物質(例如僅僅在靶才激活光敏物)，對此與轉送到腫瘤的絕對量是相關的；轉送甚至在到達靶之前就發揮出它們的治療和毒性作用的物質(例如發射物釔-90)，對此必須特別地關注於作為時間函數的腫瘤和血液聚集曲線下面積的比例，使得全身毒性最小化和抗腫瘤治療作用最大化。
例如，L19-SIP似乎是分子穩定性、清除率和腫瘤聚集的最佳的協調分子。已經描述(44 Hu.et al，1996；33 Li et al.，1997)了由scFv抗體片段與二聚體結構域結合構成的相似的融合蛋白，但是兩者都將γ1CH3用作為二聚體結構域。人εs2CH4的應用提供了一種生成共價穩定的二聚體的簡便方法。此外，在輕微充分的條件下可以容易地還原C末端半胱氨酸殘基所形成的二硫鍵橋以保持分子的整體結構，因此提供了用於易獲得的放射性標記或化學結合的反應基團。這個特性對於臨床應用似乎是特別有作為的。
L19-IgG1大量地聚集於腫瘤內，儘管這種聚集可以被緩慢的血液清除所抵消，可以利用去除循環抗體的三步方法使得它不僅可以用於治療目的也可以用於診斷性免疫閃爍描繪術(45 Magnani et al.2000)。
參考文獻1.Shawler et al.J.Immunol.，1351530-1535，19852.Miller et al.Blood，62988-995，1983.
3.Hakimi et al.J.Immunol.，1471352-1359，1991.
4.Stephens et al.Immunology，85668-674，1995.
5.Riechmann et al.Nature，332323-327，1988.
6.Junghans et al.Cancer Res.，501495-1502，1990.
7.McCafferty et al.Nature，348552-554，1990.
8.Lowman et al.Biochemistry，3010832-10838，19919.Nilsonn et al.Advanced Drug Delivery Reviews，43165-196，2000.
10.Winter et al.Annu.Rev.Immunol.，12433-455，1994.
11.Reichert.Nature Biotech.，19819-822，2001.
12.Huls et al.Nature Biotech.，17276-281，1999，13.Pini et al.J Biol Chem，27321769-21776，1998.
14.Neri and Zardi.Advanced Drug Delivery Reviews，3143-52，1998.
15.Bissel and Radisky.Nature Reviews-Cancer.，146-54，200116.Balza et al.FEBS Lett.，22842-44，198817.Carnemolla et al.J.Cell.Biol.，1081139-1148，198918.Borsi et al.FEBS Lett.，261175-178，199019.Borsi et al.J.Biol.Chem.，2706243-6245，1995.
20.Zardi et al.EMBO J.，62337-2342，1987.
21.ffrench-Constant et al.J.CellBiol.，109903-914，1989.
22.Castellani et al.Int J Cancer，59612-618，199423.Tarli et al.Blood，94192-198，1999.
24.Carnemolla et al.Int J Cancer，68397-405，199625.Viti et al.Cancer Res，59347-353，1999.
26.Neri et al.Nature Biotechnol，151271-1275，1997.
27.Demartis et al.Eur J Nucl Med，284534-4539，2001.
28.Birchler et′al.Nat Biotechnol，17984-988，199929.Nilsson et al.Cancer Res.，61711-716，2001.
30.Halin et al.Nature Biotechnol.In the press.2002.
31.Carnemolla et al.Blood，99，200232.Wu et al.Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.，978495-8500，2000.
33.Li et al.Protein Engineering，10731-736，199734.Pini et al.J.Immunol.Methods，206171-183，1997.
35.Batista et al.J.Exp.Med.，1842197-205，1996.
36.Riske et al.J.Biol.Chem.，26611245-11251，1991.
37.Bosslet et al.Cancer Res.，581195-1201，1998.
38.Jain and Baxter.Cancer Res.，487022-7032，1988.
39.Jain.Vascular and interstitial physiology of tumors.Role in cancerdetection and treatment.InR.Bicknell，C.E.Lewis and N.Ferrara(eds).Tumour Angiogenesis，pp.45-59.New YorkOxford University Press，1997.
40.Jain.Annu.Rev.Biomed.Eng.，1241-263，1999.
41.Turner and Kinet.Nature，402 Suppl.，B24-B30，1999.
42.Vangelista et al.Jour.Clin.Invest.，1031571-1578，1999.
43.Garman et al.Nature，406259-266，2000.
44.Hu et al.Cancer Res.，563055-3061，1996.
45.Magnani et al.Br.J.Cancer，82616-620，2000.
表1.在i.v.注射後不同時間點放射性標記抗體的免疫反應性(I*)和從superdex200的放射活性回收率(R)

如材料和方法所述的測定了血漿的免疫反應性(％)和從superdex200的放射活性回收率(％)。
*為達到標準化，免疫反應性測定結果指的是i.v.注射前的免疫反應性的百分比數值。
Nd未測定表2a.放射性標記的L19和D1.3抗體片段在SK-MEL-28瘤負荷鼠中的生物分布試驗L19(scFv)

D1.3(scFv)

結果表示為每克注射劑量的組織抗體的百分比(％ID/g)±SDnd未測定
(表32)


(表33)


表2c.放射性標記的L1-IgG1和hIgG1κ在SK-MEL-28瘤負荷鼠中的生物分布試驗L19IgG1

hIgG1κ

結果表示為每克注射劑量的組織抗體的百分比(％ID/g)±SDnd未測定表3.放射性標記的L19抗體在SK-MEL-28瘤負荷鼠中的器官-腫瘤％ID/g比

表4.三種L19抗體形式血液清除的動力學參數

a)兩個半衰期部分的相對數量表5.放射性標記的L19(scFv)和L19 SIP在F9瘤負荷鼠中的生物分布試驗L19(scFv)

L19 SIP

結果表示為每克注射劑量的組織抗體的百分比(％ID/g)±SDnd未測定表6

表7

表8

權利要求
1.一種與人ED-B結合的特異性結合構件，包含一個包含抗體VH結構域和抗體VL結構域的抗原結合位點，其中抗體VH結構域選自由L19VH結構域、和包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH結構域所組成的組，其中VH CDR3是SEQ ID NO.3的L19 VH CDR3，VH CDR1任選地是SEQ ID NO.1的L19 VH CDR1，而VH CDR2任選地是SEQ IDNO.2的L19 VH CDR2；且其中抗體VL結構域任選地選自由L19 VL結構域、和包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的VL結構域所組成的組，其中VL CDR3是SEQ ID NO.6的L19 VL CDR3，VL CDR1任選地是SEQ ID NO.4的L19 VL CDR1，VL CDR2任選地是SEQ ID NO.5的L19 VL CDR2；所述的L19 VH結構域和L19 VL結構域序列是Pini等(1998)J.Biol.Chem.27321769-21776所公開的序列；其中所述的特異性結合構件包含一種小免疫球蛋白或包含一種完整的IgG1抗體分子，所述小免疫球蛋白包含與εs2-CH4融合的並二聚體化的所述抗體VH結構域和抗體VL結構域。
2.權利要求1的特異性結合構件，包含一種抗體VH結構域，所述抗體VH結構域包含具有SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的胺基酸序列的VH CDR，該特異性結合構件與包含L19 VH結構域和L19 VL結構域的抗體的ED-B結合結構域競爭性結合ED-B。
3.權利要求1或2的特異性結合構件，包含L19 VH結構域。
4.權利要求3的特異性結合構件，包含L19 VL結構域。
5.前述權利要求中任一項的特異性結合構件，其是包含εs2-CH4的小免疫球蛋白。
6.權利要求5的特異性結合構件，其中抗體VH結構域和抗體VL結構域存在於與εs2-CH4融合的scFv抗體分子內。
7.權利要求6的特異性結合構件，其中所述scFv抗體分子通過連接肽與εs2-CH4融合。
8.權利要求7的特異性結合構件，其中所述連接肽具有胺基酸序列GGSG(SEQ ID NO.7)。
9.權利要求1到4中任一項的特異性結合構件，其包含完整的IgG1抗體分子。
10.權利要求1到9中任一項的特異性結合構件，其綴合了一种放射性同位素。
11.權利要求10的特異性結合構件，其中放射性同位素是Tc、Re、In、Y或Lu中的一种放射性同位素。
12.權利要求10的特異性結合構件，其中放射性同位素選自由94mTc、99mTc，186Re、203Pb、67Ga、68Ga、43Sc、47Sc、110mIn、111In、97Ru、62Cu、64Cu、67Cu、68Cu、86Y、88Y、90Y、121Sn、161Tb、153Sm、166Ho、105Rh、177Lu、172Lu和18F組成的組。
13.一種分離的核酸，其包含編碼權利要求1到9中任一項的特異性結合構件的一或多種核苷酸序列。
14.用權利要求13的核酸轉化的宿主細胞。
15.一種生產特異性結合構件的方法，所述方法包括在用於生產所述特異性結合構件的條件下培養權利要求14的宿主細胞。
16.權利要求15的方法，進一步包括分離和/或純化所述特異性結合構件。
17.權利要求15或16的方法，進一步包括將所述特異性結合構件配製成包括至少一種附加成分的組合物。
18.權利要求15到17中任一項的方法，進一步包括將特異性結合構件結合於ED-B或ED-B的片段。
19.一種方法，包括將權利要求1到9中任一項的結合ED-B的特異性結合構件結合於ED-B或ED-B的片段。
20.權利要求18或19的方法，其中所述結合在體外進行。
21.權利要求18到20中任一項的方法，包括確定特異性結合構件與ED-B或ED-B的片段的結合的量。
22.一種包含權利要求1到9中任一項的特異性結合構件的組合物，用於治療人體或動物體的治療方法。
23.權利要求22的組合物，用於病理性血管生成病變的治療方法。
24.權利要求22的組合物，用於腫瘤的治療方法。
25.權利要求1到9中任一項的特異性結合構件在生產用於治療病理性血管生成病變的藥物中的用途。
26.權利要求1到9中任一項的特異性結合構件在生產用於治療腫瘤的藥物中的用途。
全文摘要
本發明涉及利用針對纖連蛋白的血管生成標記物ED－B結構域的人重組scFv，L19，在體內對腫瘤血管進行選擇性定向。在優選的實施方案中，使用具有L19可變區的完整人IgG1。在其他的實施方案中，採用了通過scFv L19和分泌型IgE異構體的恆定CH4結構域融合所生成的小免疫球蛋白，該恆定CH4結構域在其COOH末端天然地含有半胱氨酸並形成共價連接的二聚體。依賴於臨床的需要和疾病，可開發出具有不同體內性能的抗體形式，用於不同的診斷性和治療性目的。這些抗體可以如所述進行標記。
文檔編號A61K38/00GK1639195SQ03805705
公開日2005年7月13日 申請日期2003年3月11日 優先權日2002年3月11日
發明者蘿拉·博爾西, 芭芭拉·卡爾內莫拉, 恩裡卡·巴爾扎, 帕特裡齊亞·卡斯泰拉尼, 盧恰諾·扎爾迪, 馬蒂亞斯·弗裡貝, 克裡斯託夫-斯特凡·希爾格 申請人:菲洛根股份公司, 舍林股份公司