一種高葉綠素多櫱大麥的複合選育方法

2023-05-12 20:53:16

一種高葉綠素多櫱大麥的複合選育方法
【專利摘要】本發明提供高葉綠素含量和/或多莖櫱數大麥的複合選育方法、製備麥綠素產品的方法和提高大麥葉綠素含量和/或莖櫱數。本發明的方法包括取大麥小孢子發育處於單核早期和/或中期的小穗，2-10℃處理10-30天；收穫小孢子，培養小孢子，再生獲得純合加倍單倍體；和培養所述純合加倍單倍體；從而篩選獲得葉綠素含量高和/或莖櫱數多的大麥，已將所述大麥製備成所需的麥綠素產品。本發明通過雜交技術將多個優異性狀聚合，利用小孢子培養技術對目標性狀進行快速純合穩定，在人工可控環境下進行多指標篩選，最終獲得高葉綠素含量多莖櫱的大麥種質材料。該材料通過田間種植或水培方式可作為麥綠素等營養保健產品生產的優良種質材料。
【專利說明】一種高葉綠素多櫱大麥的複合選育方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於農業【技術領域】，具體涉及一種高葉綠素含量和多莖櫱大麥材料的篩選培育方法。【背景技術】
[0002]麥類作物的幼苗是一種傳統中草藥，我國早在《本草綱目》和《傷寒紀要》中的記載了麥苗的藥用價值。1969年，日本學者荻原義秀博士發表了《禾本科植物綠葉成分及作為穩定的藥品、食品研究》一文，並致力於商品化開發。1991年，他利用「超低溫快速噴霧乾燥法」的技術，將大麥嫩苗榨汁濃縮成粉末，稱為「麥綠素」(Barely Green)，並向國際市場推廣。目前市場上的麥綠素產品是以大麥或小麥等麥類作物分櫱盛期的嫩葉(麥高20-30cm)為主要原料，輔以糊精等配料加工而成的。麥綠素富含蛋白質、葉綠素、大量的活性酶(如SOD酶、過氧化氫酶、澱粉酶、蛋白酶等)、0_胡蘿蔔素、多種維生素，以及多種微量元素(郭建華，2008)。
[0003]現代生物試驗和臨床研究證實，麥綠素具有以下9個方面生理功能:(1)促進損傷DNA的恢復作用；(2)消炎鎮痛；(3)增強免疫力及防癌、抗癌、抗輻射作用；(4)抑制愛滋病病毒作用；(5)降血壓；(6)抗潰瘍；(7)清除體內多餘自由基，抗衰老及防治心腦血管疾病；(8)防治糖尿病；(9)加速傷口癒合，促進造血，消除口臭(喬文靜，2009)。美國FDA已批准大麥嫩葉汁作為食品增補劑。在日本，大麥嫩葉汁製品已獲得日本健康協會認定的健康食品的標誌(牛廣財，2011)。目前國外已研製開發出麥葉系列產品，如小麥纖維食品、大麥葉促康食品、麥草葉飲料、麥綠素可樂、青麥酶營養品等等，日本還推出了在大麥嫩葉汁粉中添加糊精、酵母、胡蘿蔔粉、高麗參粉的營養滋補品。
[0004]麥綠素產品具有良好的營養保健功能，有著廣闊的市場前景，麥綠素的主要生產基地在美國、加拿大、澳洲等，由於它的純天然性和保健作用，迎合了人們「回歸自然」的追求，因而風靡北美、歐洲、澳大利亞、東南亞，每年銷售額已達23~27億美元(黃相國，2003)。大麥功能產品的生產將會增加大麥種植產業的附加值，使農民增收，據報導，每畝可生產鮮葉500kg，產值可達1000元以上，農民收入比種植常規大麥和其它冬季作物高出一倍以上(武紅霞，2002)。
[0005]但目前生產麥綠素的專用大麥品種缺乏，嚴重限制了麥綠素產品的開發與利用。目前功能大麥的選育在我國還未引起足夠重視，傳統的育種目標並不能滿足功能大麥選育的要求。傳統的育種目標主要是考慮品種的農藝性狀如籽粒產量與品質、抗病性等，而以生產麥綠素專用的大麥品種原料取自營養生長期，因此，需要重新考慮其選育目標。對麥綠素專用大麥品種選育，要求苗期生長快，拔節時莖葉產量高，葉綠素等營養含量高。
[0006]葉片是植物進行光合作用的重要器官，而葉綠素是植物進行光合作用的重要色素，其作用就是進行光能捕獲，其含量的高低不僅會影響葉色，而且會直接影響光合作用的效率，有研究表明在一定範圍內葉綠素的含量是與光合效率成正相關的。綠色植物都是依靠光合作用進行生物合成，完成其形態建成和生物量積累。綠色植物的葉綠素生物合成是一個由一系列酶參與合成的複雜過程，其中參與合成的酶和基因在高等植物中已比較清楚，但控制葉綠素含量的遺傳模式還不清楚。目前對葉綠素含量的篩選都是集中在大田篩選，採用葉綠素儀或葉綠素螢光儀進行實地測定。這種篩選方式存在一些問題，已有研究表明葉綠素的含量受到環境因素的影響明顯，不同生長周期的含量也會變化，大田環境複雜，種植條件受到各種因素影響和制約，葉綠素含量表現並不一致，另外葉綠素很大程度上受到隱性基因控制，篩選需要在高代進行，這將需要更長的時間獲得純合後代。
[0007]除了篩選高葉綠素含量，其地上部生物產量也是一個重要指標。分櫱莖葉是苗期地上部分的生物產量構成部分，要提高其生物產量，需要選擇分櫱多、莖葉生長旺盛的材料。大麥育種的篩選大多集中在生長成熟期，對苗期的地上部生物產量和葉綠素含量的篩選還未見報導。
[0008]本發明將提供一種克服目前大田篩選的一些問題，實施有效、快速選育高葉綠素含量多莖櫱的大麥的方法，包括:通過雜交技術將多個優異性狀聚合，利用小孢子培養技術對目標性狀進行快速純合穩定，在人工可控環境下進行多指標篩選，最終獲得高葉綠素含量多莖櫱的大麥種質材料。該材料通過田間種植或水培方式可作為麥綠素等營養保健產品生產的優良種質材料。

【發明內容】

[0009]本發明的目的在於高效、快速提供高葉綠素含量、多莖櫱數的大麥，且所述大麥的所述性狀能穩定遺傳。本發明通過以下方法實現該目的，所述方法具有具有穩定性和可重複性。
[0010]本發明一方面提供高葉綠素含量和/或多莖櫱數的大麥的方法包括:
[0011](I)取大麥小孢子發育處於單核早期和/或中期的小穗，低溫處理2-3周；
[0012](2)收穫小孢子，培養小孢子，再生獲得純合加倍單倍體；
[0013](3)水培所述純合加倍單倍體；
[0014]和篩選獲得葉綠素含量高和/或莖櫱數多的大麥。
[0015]本發明另一方面提供一種製備麥綠素產品的方法，所述方法包括:
[0016](I)取大麥小孢子發育處於單核早期和/或中期的小穗，低溫處理2-3周；
[0017](2)收穫小孢子，培養小孢子，再生獲得純合加倍單倍體；和
[0018](3)水培所述純合加倍單倍體，篩選獲得葉綠素含量高和/或莖櫱數多的大麥；和
[0019](4)將所述大麥製備成麥綠素產品。
[0020]本發明再一方面提供一種提高大麥葉綠素含量和/或莖櫱數的方法，所述方法包括:
[0021](I)取大麥小孢子發育處於單核早期和/或中期的小穗，2-10°C處理10-30天；
[0022](2)收穫小孢子，培養小孢子，再生獲得純合加倍單倍體；
[0023](3)水培所述純合加倍單倍體，獲得再生植株；
[0024]其中，所述再生植株為葉綠素含量提高和/或莖櫱數增多的植株。
[0025]應理解，所述「葉綠素含量提高」與「莖櫱數增多」是相對於起始大麥材料而言，即相對於步驟(1)的所述大麥小孢子未經本發明方法處理而獲得的大麥的葉綠素含量和莖櫱數而言。[0026]在一個具體實施例中，本發明上述方法在步驟(1)之前還包括:
[0027](a)選取一批葉色濃綠、苗期生長旺盛、分櫱較多的大麥材料，水培後測定2葉I心期的葉綠素含量，至分櫱期後開始統計分櫱數、植株高度和/或莖基部周長，根據這些統計指標篩選出葉綠素含量高、分櫱數多、生長迅速的品種；和
[0028](b)培養所述品種，獲得步驟(1)所述的小孢子；和
[0029](C)如果大麥材料只具有葉綠素含量高、分櫱數多、生長迅速中的一個目標性狀，則在花粉成熟後進行相互授粉雜交，獲得雜交代種子，繁育該代種子，獲得Fl代植株，從該Fl代植株獲得步驟(1)所述的小孢子。
[0030]在一個具體實施例中，本發明上述方法中，小孢子獲自葉綠素含量高和莖櫱數多的大麥。
[0031]在一個具體實施例中，本發明上述方法中，所述步驟(2)包括:
[0032](2a)消毒所述穗子，然後清洗；
[0033](2b)從所述穗子分離小孢子；
[0034](2c)於室溫、黑暗處理小孢子36-60小時；
[0035](2d)用誘導培養基懸浮小孢子，並將懸浮液接種於誘導培養基中，誘導愈傷；和
[0036](2e)將誘導所得愈傷組織轉入分化培養基，培養獲得再生苗，即所述純合加倍單倍體。
[0037]在一個具體實施例中，本發明上述方法中，分離小孢子時，在試管中加入穗子和含有4-8%甘露醇、1.0-1.5g/L的CaCl2和0.8-1.2g/L的2_(N_嗎啡啉)乙磺酸的提取液，用高速分散器超速旋切，過濾，離心濾液，從而獲得小孢子。
[0038]在一個具體實施例中，本發明上述方法中，誘導培養基以N6培養基為基本培養基，其中加有6-糠氨基嘌呤0.3-0.8mg/L、2，4- 二氯苯氧乙酸0.5-1.5mg/L、和麥芽糖70-120g/L ;分化培養基以MS為基本培養基，其中加有6-苄氨基腺嘌呤0.3-0.8mg/L、KT
1.0-2.0mg/L、萘乙酸 0.03-0.08mg/L 和麥芽糖 15_50g/L，用 3_8g/L 瓊脂粉固化。
[0039]在一個具體實施例中，本發明上述方法中，步驟(3 )之後還包括:
[0040]將小孢子培養獲得的再生植株放入大麥標準營養液中培養，進行再次篩選，選出葉綠素含量高和/或莖櫱數多的大麥，並收集其種子。
[0041]在一個具體實施例中，所述再次篩選是在人工可控環境下採用水培方式進行篩選。
[0042]在一個具體實施例中，所述人工可控環境包括:在人工氣候室內採用日光燈管照明，光照強度約1500-25001x，優選約1800-20001x ;保持室溫白天約18-22°C，優選約20°C，晚上約16-20°C，優選18°C，白天、夜晚的溫度波動約1_2°C。
[0043]在一個具體實施例中，所述麥綠素產品選自:大麥纖維食品、大麥葉促康食品、麥草葉飲料、麥綠素可樂、青麥酶營養品，以及在大麥嫩葉汁粉中添加糊精、酵母、胡蘿蔔粉、高麗參粉的營養滋補品。
[0044]在一個具體實施例中，本發明上述方法中，所獲得的小孢子用預處理液於室溫、黑暗預處理36-60小時，其中，所述預處理液含有4-8%甘露醇、1.0-1.5g/L的CaCl2和0.8-1.2g/L的2-(N-嗎啡啉)乙磺酸。
[0045]優選地，本發明獲得的大麥植株葉綠素含量和莖櫱數都提高。[0046]本發明提供方法具有以下特徵:
[0047]1.麥綠素產品原料取材一般是在6-7葉期，因此6-8周的水培即可完成培養過程，達到預定生長時期，期間可方便進行測定與取材。根據本文所述統計指標分別篩選出性狀優異的品種。本發明採用的是人工可控的統一培養條件，在人工氣候室完成，不受季節控制，篩選具有穩定性和可重複性。2葉1心期的是非常敏感的篩選時期，品種間的差異比較明顯，不明顯的品種在後期的連續測定中也可以進行比較。同時選擇分櫱數目作為一個評價地上部生物量的指標。
[0048]2.篩選目標圍繞大麥苗期葉綠素含量和地上部分生物產量兩個目標進行，不考察材料後生育期籽粒產量等性狀。
[0049]3.對初步篩選的含有較好目標性狀大麥材料，採用小孢子培養技術獲得純合加倍單倍體(DH)株系，種質所有性狀完全純合，隱性性狀可以當代表現。
[0050]4.對單一優異目標性狀的大麥材料採用雜交技術聚合目標性狀。
[0051]5.根據目標性狀選用不同指標進行大量篩選，篩選涉及初選材料、純合DH植株、雜交聚合性狀分離後代。
[0052]6.現有的大田篩選技術通常耗時2-3年，甚至更長時間，才有可能篩選得到具有上述目標性狀的可用來製備麥綠素產品的大麥材料，但篩選缺乏穩定性和可重複性。本發明由於對小孢子的特殊處理而可大大縮短該篩選時間，通常在一年內即可實現。
【具體實施方式】
[0053]本發明上述的方法包括:
[0054](I)取大麥小孢子發育處於單核早期和/或中期的小穗，低溫處理10-30天；
[0055](2)收穫小孢子，培養小孢子，再生獲得純合加倍單倍體；和
[0056](3)水培所述純合加倍單倍體。
[0057]所述「低溫」通常指2-10°C，例如3_5°C。低溫處理指在低溫下放置新鮮採摘的所述小穗。低溫處理的時間通常是10-30天，例如可以是14-21天不等。
[0058]小孢子通常取自葉綠素含量高、分櫱數多、生長迅速的親本材料種子種植得到的大麥。
[0059]本文中，「葉綠素含量高」指就所篩選的批次而言，葉綠素含量相對較高的植株，例如，指在所篩選批次中葉綠素含量排在前20%的株系，優選前10%，更優選前5%。當然可選自葉綠素含量最聞或相對最聞的幾株。
[0060]本文中，「分櫱數多」指就所篩選的批次而言，分櫱數多相對較多的植株，例如，指在所篩選批次中分櫱數排在前20 %的株系，優選前10 %，更優選前5 %。
[0061]本文中，「生長迅速」就所篩選的批次而言，生長速度相對較快的植株，例如，指在所篩選批次中生長速度排在前20 %的株系，優選前10 %，更優選前5 %。
[0062]通常，可首先根據目標性狀，選取一批葉色濃綠、苗期生長旺盛、分櫱較多的大麥材料，水培後測定2葉I心期的葉綠素含量，至分櫱期後開始統計分櫱數、植株高度和/或莖基部周長，根據這些統計指標分別篩選出性狀優異的品種，例如篩選出葉綠素含量高、分櫱數多、生長迅速的品種。
[0063]可採用已報導的標準大麥水培營養液(改良Hoagland溶液)進行水培，該營養源配方如下:
[0064]NH4NO3 (0.2mM)、KNO3 (5mM)、Ca NO3.2 (2mM)、MgSO4 (2mM)、KH2PO4 (0.1mM)、Na2Si03(0.5mM)、NaFe (III) - EDTA (0.05mM)、H3BO3 (0.01mM)、MnCl2 (0.005mM)、ZnSO4 (0.005mM)、CuSO4 (0.0005mM)、Na2MoO3 (0.000 ImM)，使用前溶液 pH 值用稀鹽酸調節至6.0左右。
[0065]水培可在人工氣候室內進行。採用日光燈管照明，光照強度約20001x，保持室溫白天20度，晚上18度，溫度波動1-2度。
[0066]然後，種植該品種的種子(即親本材料種子)，用於小孢子培養取材。可在大田中種植，或者，若植株篩選材料不多，也可在篩選後在人工氣候室種植。
[0067]對於只有其中一個目標性狀優異的材料，在花粉成熟後可進行相互授粉雜交(正反雜交)，獲得雜交代種子。大田或人工氣候室種植代種子，獲得Fl代植株，用於小孢子培養取材。
[0068]可從大田或人工氣候室中種植的葉綠素含量高、分櫱數多、生長迅速的品種中選取中部小花小孢子發育處於單核早期、中期的小穗進行低溫處理10-30天，如前文所述。
[0069]低溫處理後，可採用本領域已知的技術獲取小孢子。包括消毒、高速離心等。
[0070]本文中，消毒通常用75%酒精浸泡20-60秒,飽和的漂白粉溶液消毒10_20分鐘。通常用75%酒精浸泡30秒，飽和的漂白粉溶液消毒15分鐘。本領域技術人員周知其它消毒手段。
[0071]消毒後，可用無菌水衝洗數次，例如3-4次。然後，每個試管接5-15個穗子，例如每管10個穗子。倒入10-20ml、優選15ml提取液，用高速分散器超速旋切，過濾(例如，用150目篩網過濾)，離心濾液(例如，以100父8離心5111111，重複3次)，收集小孢子。提取液優選含有4-8%甘露醇、1.0-1.5g/L的CaCl2和0.8-1.2g/L的MES (2_(N_嗎啡啉)乙磺酸)。在一個具體實施例中，提取液優選6%甘露醇、1.lg/L的CaCl2和0.976g/L的MES。
[0072]可任選地用預處理液於室溫(例如25°C)、黑暗預處理36-60小時，通常處理2天。預處理液的組成同提取液。
[0073]然後，可任選地用21% (質量體積百分比)麥芽糖純化小孢子，再用誘導培養基洗滌I次，然後用誘導培養基將小孢子密度調節至0.5-2.0X 105/ml，優選1.0X 105/ml，取大約Iml小孢子懸浮液接種於培養皿(例如，35X 15mm的培養皿中)，封口後室溫(25°C )暗培養，誘導愈傷；然後轉入分化培養基獲得再生苗。此處獲得植株為單細胞培養獲得的純合加倍單倍體(DH)。檢測出的單倍體可以用秋水仙鹼處理直接加倍變成加倍單倍體。
[0074]誘導培養基以N6培養基為基本培養基，其中加有6-糠氨基嘌呤(KT) 0.3-0.8mg/L、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)0.5-1.5mg/L、和麥芽糖70_120g/L。在一個【具體實施方式】中，誘導培養基添加有KT 0.4-0.6mg/L和2，4-D0.8-1.2mg/L,和麥芽糖80_100g/L。在一個【具體實施方式】中，誘導培養基添加有KT 0.5mg/L和2，4-D 1.0mg/L，和麥芽糖90g/L。
[0075]常規的N6培養基的成分基本如下表1所示，不同廠商或文獻所記載的不同成分的濃度或許有些許差別，但其功能都大致相同:
[0076]表1:N6培養基的配方(單位:mg/L):
[0077]
【權利要求】
1.一種生產高葉綠素含量和/或多莖櫱數的大麥的方法，所述方法包括: (1)取大麥小孢子發育處於單核早期和/或中期的小穗，2-10°C處理10-30天； (2)收穫小孢子，培養小孢子，再生獲得純合加倍單倍體； (3)水培所述純合加倍單倍體；和 (4)篩選獲得葉綠素含量高和/或莖櫱數多的大麥。
2.一種製備麥綠素產品的方法，所述方法包括: (1)取大麥小孢子發育處於單核早期和/或中期的小穗，低溫處理2-3周； (2)收穫小孢子，培養小孢子，再生獲得純合加倍單倍體；和 (3)水培所述純合加倍單倍體，篩選獲得葉綠素含量高和/或莖櫱數多的大麥；和 (4)將所述大麥製備成麥綠素產品。
3.一種提高大麥葉綠素含量和/或莖櫱數的方法，所述方法包括: (1)取大麥小孢子發育處於單核早期和/或中期的小穗，2-10°C處理10-30天； (2)收穫小孢子，培養小 孢子，再生獲得純合加倍單倍體； (3)水培所述純合加倍單倍體，獲得再生植株； 其中，所述再生植株為葉綠素含量提高和/或莖櫱數增多的植株。
4.如權利要求1-3中任一項所述的方法，其特徵在於，所述方法在步驟(1)之前還包括: (a)選取一批葉色濃綠、苗期生長旺盛、分櫱較多的大麥材料，水培後測定2葉I心期的葉綠素含量，至分櫱期後開始統計分櫱數、植株高度和/或莖基部周長，根據這些統計指標篩選出葉綠素含量高、分櫱數多、生長迅速的品種；和 (b)培養所述品種，獲得步驟(1)所述的小孢子；和 (c)如果大麥材料只具有葉綠素含量高、分櫱數多、生長迅速中的一個目標性狀，則在花粉成熟後進行相互授粉雜交，獲得雜交代種子，繁育該代種子，獲得Fl代植株，從該Fl代植株獲得步驟(1)所述的小孢子。
5.如權利要求1-4中任一項所述的方法，其特徵在於，所述步驟(2)包括: (2a)消毒所述穗子，然後清洗； (2b)從所述穗子分離小孢子； (2c)於室溫、黑暗處理小孢子36-60小時； (2d)用誘導培養基懸浮小孢子，並將懸浮液接種於誘導培養基中，誘導愈傷；和 (2e)將誘導所得愈傷組織轉入分化培養基，培養獲得再生苗，即所述純合加倍單倍體。
6.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，步驟(2b)中，分離小孢子時，在試管中加入穗子和提取液，用高速分散器超速旋切，過濾，離心濾液，從而獲得小孢子，其中，所述提取液含有含有4-8%甘露醇、1.0-1.5g/L的CaCl2和0.8-1.2g/L的2_(N_嗎啡啉)乙磺酸。
7.如權利要求5或6所述的方法，其特徵在於， 誘導培養基以N6培養基為基本培養基，其中加有6-糠氨基嘌呤0.3-0.8mg/L、2，4- 二氯苯氧乙酸0.5-1.5mg/L、和麥芽糖70-120g/L ； 分化培養基以MS為基本培養基，其中加有6-苄氨基腺嘌呤0.3-0.8mg/L、KTl.0-2.0mg/L、萘乙酸 0.03-0.08mg/L 和麥芽糖 15_50g/L，用 3_8g/L 瓊脂粉固化。
8.如權利要求1-7中任一項所述的方法，其特徵在於，步驟(3)之後還包括:將小孢子培養獲得的再生植株放入大麥標準營養液中培養，進行再次篩選，選出葉綠素含量高和/或莖櫱數多的大麥，並收集其種子。
9.如權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述麥綠素產品選自:大麥纖維食品、大麥葉促康食品、麥草葉飲料、麥綠素可樂、青麥酶營養品，以及在大麥嫩葉汁粉中添加糊精、酵母、胡蘿蔔粉、高麗參粉的營養滋補品。
10.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，所獲得的小孢子用預處理液於室溫、黑暗預處理36-60小時，其中，所述預處理液含有4-8%甘露醇、1.0-1.5g/L的CaCl2和.0.8-1.2g/L的2 -(N-嗎啡啉)乙磺酸。
【文檔編號】A01H4/00GK103636505SQ201310713460
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月20日 優先權日:2013年12月20日
【發明者】劉成洪, 黃劍華, 王亦菲, 陳志偉, 陸瑞菊, 杜志釗, 何婷, 高潤紅, 徐紅衛, 郭桂梅 申請人:上海市農業科學院