澱粉脫支酶的製作方法

2023-05-13 00:25:16 2

專利名稱：澱粉脫支酶的製作方法
技術領域：
本發明涉及被設計成用於包括液化步驟和糖化步驟的澱粉轉化過程的新型澱粉脫支酶、特別是支鏈澱粉酶和異澱粉酶，並涉及這類酶的生產方法以及這類酶在澱粉轉化過程中的用途。
背景技術：
將澱粉諸如玉米、馬鈴薯、小麥、木薯和稻米的澱粉用作商業上大規模生產糖的原料，所生產的糖諸如高果糖糖漿、高麥芽糖糖漿、麥芽糖糊精、直鏈澱粉、G4-G6寡糖類和其它諸如脂肪替代品這樣的碳水化合物產品。澱粉的降解澱粉通常由約80％的支鏈澱粉和約20％的直鏈澱粉組成。支鏈澱粉是一種支鏈的多糖，其中直鏈α-1,4 D-葡萄糖殘基由α-1,6糖苷鍵連接。支鏈澱粉部分被α-澱粉酶所降解，所述的α-澱粉酶可水解α-1,4-糖苷鍵以便生成支鏈和直鏈寡糖。被延長的α-澱粉酶引起的支鏈澱粉的降解導致生成所謂的對由α-澱粉酶產生的進一步水解不敏感的α-極限糊精。脫支酶可以將支鏈寡糖類水解成直鏈寡糖類。將直鏈寡糖類水解成D-葡萄糖的葡糖澱粉酶可以將剩餘的支鏈寡糖類解聚成D-葡萄糖。
直鏈澱粉是一種由通過α-1,4-糖苷鍵彼此連接的D-吡喃葡萄糖單位組成的直鏈多糖。直鏈澱粉被α-澱粉酶降解成較短的直鏈寡糖類，該直鏈寡糖類被葡糖澱粉酶解聚成D-葡萄糖。
在將澱粉轉化成糖的情況中，澱粉被解聚。解聚過程由預處理步驟和兩個或三個連續加工步驟即液化過程、糖化過程和取決於所需終產品的任意異構化過程組成。天然澱粉的預處理天然澱粉由在室溫下不溶於水的微粒組成。當加熱含水澱粉漿時，所述的微粒膨脹並最終破裂，從而使澱粉分子分散入溶液。在這種「膠凝」過程中，粘度顯著增加。在一般的工業化過程中如果固體的含量為30-40％，那麼必須將澱粉稀釋或使其「液化」以便於處理。目前在大多數情況中通過酶降解來獲得這種粘度的降低。液化在液化步驟中，長鏈澱粉被α-澱粉酶(例如TermamylTM，商購自Novo Nordisk A/S,Denmark)降解成較小的支鏈和直鏈單位(麥芽糖糊精)。液化過程一般在約105-110℃下進行約5-10分鐘，隨後在約95℃下進行約1-2小時。pH通常在約5.5-6.2的範圍。為了確保酶在這些條件下的最佳穩定性，加入鈣例如1mM的鈣(40ppm的游離鈣離子)。在這種處理步驟後，液化的澱粉具有的「右旋糖當量值」(DE)為10-15。糖化在液化過程後，通過加入葡糖澱粉酶(例如AMGTM，商購自NovoNordisk A/S)和脫支酶諸如異澱粉酶(參見例如美國專利4,335,208)或支鏈澱粉酶(例如PromozymeTM，商購自Novo Nordisk A/S)(參見例如美國專利4,560,651)而將麥芽糖糊精轉化成右旋糖。在該步驟前，使pH值降至低於4.5、例如約3.8，維持高溫(95℃以上)例如約30分鐘的期限，從而使液化的α-澱粉酶失活以便減少稱作「潘糖前體」的短寡糖類的形成，所述的「潘糖前體」不能被脫支酶合適地水解。
然後使溫度降至60℃、加入葡糖澱粉酶和脫支酶並使糖化過程進行約24-72小時。
一般來說，當在液化步驟後使α-澱粉酶變性時，少量產物中包括不能被支鏈澱粉酶或AMG降解的潘糖前體。如果來自液化步驟的活性澱粉酶在糖化過程中出現(即沒有變性)，那麼其濃度可以為1-2％乃至更高，由於它明顯降低糖化產率，所以是非常不需要的。由於該原因，所以另外優選的情況是α-澱粉酶是一種能夠將澱粉分子降解成長的支鏈寡糖類(諸如例如FungamylTM-樣α-澱粉酶)而不是較短的支鏈寡糖類的酶。異構化當所需的終產品糖是例如高果糖糖漿時，可以通過酶異構化將右旋糖糖漿轉化成果糖。在糖化過程後，使pH值增至6-8的範圍，優選pH約為7.5，並通過離子交換除去鈣。然後使用例如固定化葡糖異構酶(諸如SweetzymeTM，商購自Novo Nordisk A/S)將右旋糖糖漿轉化成高果糖糖漿。脫支酶將可以作用於支鏈澱粉的脫支酶分成兩類分別為異澱粉酶類(E.C.3.2.1.68)和支鏈澱粉酶類(E.C.3.2.1.41)。異澱粉酶可水解支鏈澱粉和β-極限糊精中的α-1,6-D-糖苷支鏈鍵且可以通過異澱粉酶不作用於普魯蘭並通過其對α-極限糊精的有限作用而與支鏈澱粉酶區別開來。
當將酸穩定的ermamylTM-樣」α-澱粉酶用於維持整個糖化過程中澱粉酶的活性時(沒有失活)，應考慮到降解特異性。在這方面需要維持α-澱粉酶在糖化過程始終的活性，這是因為這樣可使得澱粉葡糖苷酶(amyloglucidase)的添加量降低，在經濟上有利並且可減少AMGTM的縮合產物異麥芽糖，由此增加DE(右旋糖當量)數值。
從上述討論中明顯看出公知的澱粉轉化過程按照一系列步驟進行，這是因為對各種酶的不同需要根據例如溫度和pH來決定。因此，要求能夠改造這些酶中的一種或多種以便全部過程可以按照更為經濟和有效的方式進行。在這方面，一種可能性是改造另外的熱不穩定性脫支酶以便使它們在高溫下更為穩定。本發明涉及這類熱穩定性脫支酶，其應用可產生將在下面詳細討論的許多重要的優點。本發明還涉及具有可變的底物特異性的澱粉脫支酶。
發明概括本發明的一個目的是由此提供在高溫下適用於澱粉轉化過程的熱穩定性脫支酶例如支鏈澱粉酶和異澱粉酶，特別是使用基因工程技術以便鑑定和合成合適的酶變體。本發明的另一個目的是提供具有可變的底物特異性的新型澱粉脫支酶。
從最廣泛的方面來說，本發明的特徵由此可以在於涉及具有關於例如熱穩定性或底物特異性的改善特性的新型澱粉脫支酶，並涉及生產這類酶的方法，以及這類酶在澱粉轉化過程中的用途。
在一個特定的方面中，本發明涉及一種親代澱粉脫支酶的基因工程變體，該酶變體在pH4-6的範圍內具有比親代酶改善的熱穩定性。
本發明的另一個方面涉及一種親代澱粉脫支酶的基因工程變體，該酶變體比親代酶具有增加的對支鏈澱粉和/或糖原的活性。
本發明的進一步方面涉及一種用於生產具有增加的熱穩定性的澱粉脫支酶變體的方法，該方法包括下列步驟-鑑定親一代澱粉脫支酶中的一種或多種胺基酸殘基和/或與熱穩定性相關的胺基酸區；-通過親一代和親二代澱粉脫支酶的胺基酸序列對比來鑑定親二代澱粉脫支酶中的一種或多種同源胺基酸殘基和/或胺基酸區；和-使親二代澱粉脫支酶中的一種或多種同源胺基酸殘基和/或胺基酸區發生突變以便產生具有增加的熱穩定性的酶變體。
本發明的另外一個方面涉及一種用於生產具有改變的底物特異性的澱粉脫支酶變體的方法，該方法包括下列步驟-鑑定親一代澱粉脫支酶中與對所需底物具有的特異性相關的至少一種胺基酸環中的一種或多種胺基酸殘基；-通過親一代和親二代澱粉脫支酶的胺基酸序列對比來鑑定親二代澱粉脫支酶中至少一種相應的環中的一種或多種同源胺基酸殘基；和-使親二代澱粉脫支酶中至少一種環中的一種或多種同源胺基酸殘基發生突變以便產生具有改變的底物特異性的酶變體。
至少在本發明上下文中，術語「環」指的是所述序列中的β-鏈/摺疊部分後的序列部分。所述的「β-鏈/摺疊」可以通過對本發明的序列與具有公知三維結構的序列進行多重序列對比來鑑定。這類序列對比可以使用獲自例如UWGCG軟體包(Program Manual for theWisconsin Package，版本8,1994年8月，Genetics Computer Group,575 Science Drive,Madison,Wisconsin,USA 53711)的標準序列對比程序來進行。
公知的三維酶結構商購自Brookhaven資料庫。它們的實例是米麴黴TAKA α-澱粉酶的三維結構(Swift等，1991)；黑色麴黴酸性澱粉酶的三維結構(Brady等，1991)；豬胰α-澱粉酶的結構(Qian等，1993)；和大麥α-澱粉酶的三維結構(Kadziola等，1994，《分子生物學雜誌》(Joural of Molecular Biology)239:104-121；A.Kadziola,丹麥哥本哈根大學化學系論文(Thesis,Dept of Chemistry,U.ofCopenhagen,Denmark))。
本發明還提供了一種用於將澱粉轉化成一種或多種糖的方法，該方法包括使用至少一種如本文所述的酶變體使澱粉脫支的步驟。發明詳述在本發明的上下文中，術語「熱穩定的」一般指的是本發明的脫支酶變體比相關的親代酶具有改善的熱穩定性這一事實。熱穩定性的改善程度可以根據諸如親代酶的熱穩定性和酶變體的應用即主要是用於液化還是用於糖化或用於這兩個步驟這樣的因素而變化。從下面的討論中明顯看出為了進行糖化，所述的酶變體應在至少約63℃、優選至少約70℃的溫度下的糖化步驟中將酶活性保持在基本的程度；同時設計成用於液化步驟的酶變體應能夠在至少約95℃的溫度下將酶的活性維持在基本的程度。
本發明酶變體的改善的熱穩定性尤其可以根據下列標準中的一種或多種來定義在一個實施方案中，本發明的酶變體具有由使用下述方法的差示掃描量熱法(DSC)定義的改善的熱穩定性。
在另一個實施方案中，本發明的酶變體具有由在本文所述的「液化的T1/2檢測試驗」中使用pH5.0和95℃的溫度條件下增加的半衰期(T1/2)來定義的改善的熱穩定性，所述的半衰期的增加至少約為5％、優選至少約為10％、更優選至少約為15％、更優選至少約為25％、最優選至少約為50％，諸如至少100％。根據該定義的酶變體適用於澱粉轉化過程中的液化步驟。
另一方面或另外，可以將適用於液化的酶變體定義為具有由在本文所述的「液化後殘餘活性的檢測試驗」中使用pH 5.0和95℃的溫度條件下增加的殘餘酶活性所定義的改善的熱穩定性，所述的殘餘酶活性的增加至少約為5％、優選至少約為10％、更優選至少約為15％、更優選至少約為25％、最優選至少約為50％。
在另一個實施方案中，本發明的酶變體具有由在本文所述的「糖化的T1/2檢測試驗」中使用pH4.5和70℃的溫度條件下增加的半衰期(T1/2)來定義的改善的熱穩定性，所述的半衰期的增加至少約為5％、優選至少約為10％、更優選至少約為15％、更優選至少約為25％、最優選至少約為50％，諸如至少100％。這類變體適用於澱粉轉化過程中的糖化步驟。
另一方面或另外，可以將適用於糖化的酶變體定義為具有由在本文所述的「糖化後殘餘活性的檢測試驗」中使用pH4.5和63℃的溫度條件下增加的殘餘酶活性所定義的改善的熱穩定性，所述的殘餘酶活性的增加至少約為5％、優選至少約為10％、更優選至少約為15％、更優選至少約為25％、最優選至少約為50％。優選的情況是，在70℃的溫度下檢測時也可以觀察到這種改善的熱穩定性。
本文對於給定的酶變體和給定的一組溫度、pH和時間的條件所用的術語「基本活性」指的是在與上述改善的熱穩定性相關的上述給定的一組條件下所述酶變體的相對酶活性與親代酶的相對活性相比至少約為25％，優選至少約為50％、特別是至少約為60％、尤其是至少約為70％，諸如至少約為90％或95％，例如至少約為99％。
「來源於」給定酶(「親代酶」)的酶變體指的是親代酶的胺基酸序列已經被修飾，即經過如下所述的置換、缺失、插入和/或環轉移以便產生所述的酶變體。就由象微生物這樣的生物體產生的親代酶而言，其中本發明的酶變體來源於該親代酶，該酶變體可以通過適當轉化用於產生親代酶的相同或相似的微生物或其它生物體來產生。
本發明的熱穩定性脫支酶的一個優點在於它們在糖化步驟前能夠同時進行液化和脫支步驟。這在以前是不可能的，因為具有可接受的特異性活性的公知支鏈澱粉酶和異澱粉酶是熱不穩定性的並且在高於60℃的溫度下失活。(某些來自熱球菌屬的熱穩定性支鏈澱粉酶是公知的，但是它們在高溫下具有極低的特異性活性且由此不適合於本發明的目的)。在與α-澱粉酶共同起作用的液化過程中，通過使用本發明的熱穩定性脫支酶脫支，可以減少潘糖前體的形成，由此降低了終產物中潘糖的含量並增加了總體糖化產率。按照這種方式也能夠延長液化過程的時間而不會危害大量潘糖前體的形成。通過延長液化步驟，使DE產率從10-15增加至例如15-20，從而減少了對葡糖澱粉酶的需求。這種降低的對葡糖澱粉酶的需求反過來對減少不需要的異麥芽糖形成是有利的，從而導致葡萄糖的產率增加。此外，降低葡糖澱粉酶的添加量能夠使糖化步驟在高於現有技術中所用的正常的約30-35％底物濃度(較高的DS、乾燥物質濃度)的條件下進行。這可以降低下遊蒸發過程的成本、例如在高果糖玉米糖漿加工過程中的成本，且還可以減少糖化反應的時間，由此增加生產能力。另外一個優點在於在液化過程中所用的α-澱粉酶在這種情況中不需要失活/變性。
此外，還能夠在糖化過程中使用本發明的熱穩定性脫支酶，這種糖化過程因幾個原因是有利的。在常規的澱粉糖化過程中，過程溫度不超過60℃，因為存在糖化支鏈澱粉酶和AMGTM均不是充分熱穩定性的而不能使用較高的溫度這一事實。然而，當非常需要在高於約60℃、特別是高於63℃、例如約為70℃的溫度下進行該過程以便在相對長的糖化步驟過程中減少微生物生長時，它是不利的。此外，較高的過程溫度通常導致每mg酶中的活性較高(較高的特異性活性)，由此能夠降低所用酶的重量和/或獲得較高的總體酶活性。較高的溫度還在糖化過程後產生較高的乾物質含量，它對降低蒸發過程的成本來說是有利的。
儘管在用於液化過程時認為熱穩定性異澱粉酶比熱穩定性支鏈澱粉酶更為有利(因為異澱粉酶的特徵在於它們對支鏈澱粉具有特異性且對高分子量糊精具有活性)，但是優選的方法是改變支鏈澱粉酶的特異性以便在對較長的支鏈糊精具有改善的活性方面是更為「異澱粉酶樣」的。在各種支鏈澱粉酶中，在這方面存在主要差別，甚至在同樣來源於芽孢桿菌屬的支鏈澱粉酶中也是如此。用於測定穩定性和活性的方法熱穩定性通過經在加速強化的條件下溫育所述的酶而測定殘餘活性可以檢測支鏈澱粉酶和異澱粉酶的熱穩定性，所述的條件包括在pH4.5的不含穩定的糊精基質的50mM乙酸鈉緩衝液中(諸如在糖化過程中一般存在約35％的乾物質)。在例如63℃、70℃、80℃、90和95℃的等溫線上可以測定穩定性，從而確定1小時的時間期限過程中在定期間隔(例如每5或10分鐘1次)取自水浴中的樣品的殘餘活性。為了測定用於液化目的的穩定性，使用5.0的pH值、95℃的溫度和30分鐘的總檢測時間(「液化後對殘餘活性的檢測試驗」)。為了測定用於糖化目的的穩定性，使用4.5的pH值、63℃或70℃的溫度和30分鐘的總檢測時間(糖化後對殘餘活性的檢測試驗」)。
另一方面，可以將熱穩定性表示為「半衰期」(T1/2)，它被定義為在一組給定條件下所檢測的酶活性下降至檢測開始時原始活性的50％的時間。在這種情況中，「用於液化的T1/2檢測試驗」使用5.0的pH值和95℃的溫度，而「用於糖化的T1/2檢測試驗」使用4.5的pH值和70℃的溫度。或者，該檢測試驗將如上述對相應殘餘活性檢測試驗所述來進行。活性用於測定還原糖的Somogyi-Nelson法使用用於測定還原糖的Somogyi-Nelson法(《生物化學雜誌》(J.Biol.Chem.)153,375(1944))既可以測定支鏈澱粉酶的活性又可以測定異澱粉酶的活性。該方法以下列機理為基礎糖將銅離子還原成氧化亞銅，氧化亞銅與砷酸鹽鉬酸鹽試劑反應生成可用分光光度法測定的藍色。所測定的溶液中必須含有50-600mg的葡萄糖/升。用於Somogyi-Nelson法的程序如下樣品值將1ml的糖溶液吸入試管。加入1ml銅試劑。用玻璃珠塞住試管。將試管置於沸水浴上20分鐘。冷卻該試管。加入1ml的Nelson’s顯色試劑。振搖該試管但不反轉它。加入10ml的去離子水。反轉試管並劇烈振搖。在520nm處測定吸收度，在將液體轉入比色杯中之前立即反轉試管一次。
空白值與對樣品值所述的程序相同，不過用水替代糖溶液。
標準品值與對樣品值所述的程序相同。計算在0-2範圍內，吸收度與糖的量成正比。
試劑
1.Somogyi’s銅試劑將35.1gNa2HPO4·2H2O和40.0g酒石酸鈉鉀(KNaC4H4O2·4H2O)溶於700ml去離子水。加入100ml的1N氫氧化鈉和80ml的10％硫酸銅(CuSO4·5H2O)。將180g的無水硫酸鈉溶於該混合物並用去離子水將體積加至1升。
2.Nelson’s顯色試劑將50g的鉬酸銨溶於900ml去離子水。然後加入42ml的濃硫酸，隨後將6g的砷酸氫二鈉七水合物溶於50ml的去離子水，加入去離子水使體積達1升。在使用前使該溶液在37℃下穩定24-48小時並將其保存在置於暗處的加玻璃塞的棕色玻璃瓶中。
3．標準品將100mg的葡萄糖(無水)溶於1升去離子水。底物特異性用於測定和特徵化支鏈澱粉酶和異澱粉酶對各種底物(例如支鏈澱粉、糖原和普魯蘭)的作用和特異性曲線的方法由Kainuma等在《碳水化合物研究》(Carbohydrate Reseach)61(1978)345-357中描述。使用這些方法可以測定異澱粉酶或支鏈澱粉酶的相對活性並且可以評估與親代酶相對活性相比較的本發明酶變體的相對活性，例如，由此來確定支鏈澱粉酶變體是否比親代酶對高分子量糖類諸如支鏈澱粉具有所需增加的特異性。澱粉的轉化如上所述，在本發明的一個實施方案中，澱粉轉化過程包括在液化步驟中使用本發明的熱穩定性脫支酶與α-澱粉酶一起進行脫支的步驟。液化步驟一般在pH4.5-6.5、例如5.0-6.2、95-110℃的溫度範圍內進行1-3小時、優選1.5-2小時的期限。然而，優選pH儘可能低，例如4.5-5.0，條件是用於液化的酶在上述pH下具有足夠的穩定性。如果α-澱粉酶是鈣依賴性的，那麼在液化步驟中可以加入30-50ppm、諸如約40ppm(或0.75-1.25mM，諸如約1mM)用量的鈣以穩定酸。如上所述，在液化步驟後α-澱粉酶不需失活以便在這種情況中減少潘糖的形成。
可以用於液化步驟的特異性α-澱粉酶的實例包括地衣形芽孢桿菌α-澱粉酶，諸如商購的產品Termamyl、SpezymeAA、SpezymeδAA、Maxamyl和Kleistase；以及WO96/23874(NovoNordisk)和PCT/DK97/00197(Novo Nordisk)中所述的α-澱粉酶突變體。
可以用作本發明親代酶的異澱粉酶類包括但不限於來源於嗜熱acrhaebacterium嗜酸熱硫化葉菌(sulfolobus acidocaldarius的熱穩定性異澱粉酶(Maruta,K等(1996)《生物化學和生物物理學誌》(Biochimica et Biophysica Acta)1291,p.177-181)、來源於海洋紅嗜熱鹽菌(Rhodothermus marinus)的異澱粉酶(例如SEQ ID NO3的異澱粉酶)和來源於假單胞菌屬例如澱粉皮假單胞菌(Pseudomonasamyloderamosa)的異澱粉酶(例如EMBL資料庫寄存號J03871或基因庫寄存號N90389中公開的澱粉皮假單胞菌異澱粉酶)。
可以用作本發明親代酶的支鏈澱粉酶類的實例包括但不限於來源於例如熱球菌屬的熱穩定性支鏈澱粉酶或來源於例如芽孢桿菌屬菌株諸如Bacillus acidopullulyticus(例如PromozymeTM或SEQ ID NO 1)或Bacillus deramificans(例如SEQ ID NO 2或具有基因庫寄存號為Q68699的Bacillus deramificans支鏈澱粉酶)的蛋白質工程支鏈澱粉酶。
儘管現有技術用於糖化的方法使用不超過約60℃的溫度，但是本發明提供了可以在高溫下、即在至少約為63℃且優選在至少約為70℃下保持活性的熱穩定性脫支酶以便消除微生物生長的可能性。用於糖化的合適的葡糖澱粉酶的實例包括黑色麴黴(Aspergillus niger)葡糖澱粉酶諸如AMGTM。糖化過程一般在約4.0-4.5、優選約為4.0的pH下進行約24-72小時。
當所需的最終的糖產品是例如約50％果糖糖漿的高果糖糖漿時，在pH6-8左右、優選約為7.5下用一種異構酶使形成的D-葡萄糖異構化。合適的異構酶的實例是一種葡萄糖異構酶諸如來源於鼠灰鏈黴菌(Streptomyces murinus)的葡萄糖異構酶。該異構酶可以是一種固定化葡萄糖異構酶諸如Sweetzyme。
如果在液化步驟前加入，那麼通常除去鈣。支鏈澱粉酶和異澱粉酶工程支鏈澱粉酶和異澱粉酶屬於族13澱粉酶(Henrissat,B.等《生物化學雜誌》(Biochem.J.)293:781-788,1993)。這提示它們在由A、B和C結構域組成的分子中心部分具有相同的總體結構。B結構域在大小和結構上變化十分明顯，而認為其它兩種結構域一般具有高度的同源性。A結構域由α-8/β-8結構(β-桶)和β-鏈與α-螺旋(不過，在某些情況中螺旋可以不存在)之間的8個環組成。來源於β-桶的β-鏈部分的序列表明了底物結合區。這些區對於酶的特異性來說特別有意義(Svensson,B.等《生物化學協會學報》(Biochemical SocietyTransactions)第20卷；McGregor《蛋白質化學雜誌》(J.Prot.Chem.)7:399,1988)。然而，通過使用有關特異性序列的信息以及用於分析支鏈澱粉酶和異澱粉酶序列的一般策略，本發明提供了能夠改造這些酶所必需的工具，從而生產了具有改善的熱穩定性和/或特異性的變體。序列表本文參照下列序列表SEQ ID NO 1來自Bacillus acidopullulyticus的支鏈澱粉酶；SEQ ID NO 2來自Bacillus deramificans的支鏈澱粉酶；SEQ ID NO 3+SEQ ID NO 12來自海洋紅嗜熱鹽菌(Rhodothermusmarinus)的異澱粉酶；SEQ ID NO 4來自澱粉皮假單胞菌JD270的異澱粉酶(Chen,JH等(1990)《生物化學和生物物理學誌》(Biochimica et BiophysicaActa)1087,pp.307-315)(Brookhaven資料庫1BF2)；
SEQ ID NO 5來自肺炎克雷白氏桿菌(Klebsiella pneumoniae)的支鏈澱粉酶(Kornacker等《分子微生物學》(Mol.Microbiol.)4:73-85(1990))；SEQ ID NO 6來自產氣克雷白氏桿菌(Klebsiella aerogenes)的支鏈澱粉酶(Katsuragi等《細菌學雜誌》(J.Bacteriol.)169:2301-2306(1987))；SEQ ID NO 7來自假單胞菌屬種類SMP1的異澱粉酶(Tognoni,A.等，美國專利5,457,037)；SEQ ID NO 8來自Favobacterium odoratum的異澱粉酶(JP9623981,Susumu Hizukuri等)；SEQ ID NO 9來自嗜酸熱硫化葉菌(Sulfolobus acidocaldarius)的異澱粉酶ATCC33909(《生物化學和生物物理學誌》(Biochimica etBiophysica Acta)1291(1996),177-181,Kazuhiko Maruta,K等)；SEQ ID NO 10來自硫磺礦硫化葉菌(Sulfolobus solfataricus)的異澱粉酶(基因庫寄存號Y08256)；SEQ ID NO 11來自玉米(Zea mays)的異澱粉酶(寄存號U18908)SEQ ID NO 14:Bacillus acidopullulyticus pulB基因(SEQ IDNO:13)。支鏈澱粉酶的結構附

圖1表示4種不同的支鏈澱粉酶的胺基酸序列以及這些序列的對比(alignment)。以這種序列對比所產生的信息為基礎，能夠進行同源置換以便獲得所需的改善的熱穩定性和/或改變的底物特異性的特徵。
4種序列是SEQ ID NO 5、6、1和2。異澱粉酶的結構附圖2表示7種不同的異澱粉酶的胺基酸序列以及這些序列的對比。以這種序列對比所產生的信息為基礎，能夠進行同源置換以便獲得所需的改善的熱穩定性和/或改變的底物特異性的特徵。
7種序列是SEQ ID NO 4、7、8、9、10、3和11。
目前已經在Brookhaven資料庫中的1BF2號下公開了澱粉皮假單胞菌異澱粉酶的X-射線結構。該結構證明了序列對比法的總體情況，而且表明與所提示的對比具有一定的差異。從澱粉皮假單胞菌異澱粉酶(1BF2)的3D結構中推定的正確環數如下所示環 提示的 從結構中推定的1.210-230211-2312.250-292251-2953.319-376319-3304.401-436401-4365.461-479461-4686.482-485482-5037.530-539533-5808.605-636606-636支鏈澱粉酶和異澱粉酶的序列對比附圖3表示所選擇的支鏈澱粉酶和異澱粉酶(SEQ ID NO 1、2、3和4中的那些)的「關鍵對比序列(key alignment)」，換句話說，是表示相應序列中同源胺基酸殘基的最適宜的對比序列。虛線(「----」)表示推定的β-鏈位置。各組虛線後是環數，表明在環序列中的位置。在下面的表1中可以找到有關各環位置的信息。
通過將來自兩種或多種相關澱粉脫支酶「關鍵對比序列」的最為同源的序列與新型澱粉脫支酶的序列進行比較並對這兩種序列進行序列對比可以確定來自新型序列的殘基，這些殘基與來自關鍵對比序列的序列中的殘基同源。例如，通過使用來自UWGCG軟體包(Program Manualfor the Wisconsin Package，版本8,1994年8月，Genetics ComputerGroup,575 Science Drive,Madison,Wisconsin,USA 53711)的GAP程序可以發現這種同源性。然後通過使用教科書的編輯程序或其它合適的電腦程式可以將新型序列放入所述的關鍵對比序列中。
下面的表1提供了有關所關注的選擇區在各種所選擇的支鏈澱粉酶和異澱粉酶的環中的位置的信息，這些環區相對於產生本發明酶變體的修飾而言是一般關注的。下面的環3構成結構域B(MacGregor,1988)，而其它的環屬於結構域A。表1
如果對於表1中給定的酶和環來說列出了1個以上的區，那麼首先列出的區(即a．)是在每種情況中所述環的預測的長度。下一個區(即b．)是優選用於修飾的區，而最後的區(即c．)是最優選的。
通過在一個或多個這些環中進行修飾即置換、缺失、插入和/或環轉移可以生產具有關於改善的熱穩定性和/或改變的底物特異性的所需特性的工程蛋白質。本發明的酶變體可以含有任意合適的一種或多種置換、缺失、插入和/或環轉移的組合以便獲得改善的熱穩定性和/或改變的活性的所需特性。
按照本發明，SEQ ID NO:1的環區即369-397(a．表示的區)可以適當被相應的SEQ ID NO.4的空間排列的區即176-195(即a．表示的區)所取代。此外，環1的371-385區(SEQ ID NO:1)(即b．表示的區)可以相應地被環1的179-193區(SEQ ID NO.4)(即b．表示的區)所取代。
在本發明的上下文中，將簡化名稱用於表示給定位置上的胺基酸置換。例如「G81P」指的是81位上的甘氨酸殘基被脯氨酸殘基所置換，而「F489G,A」指的是489位上的苯丙氨酸殘基被甘氨酸或丙氨酸所置換。對改善的熱穩定性的改造當對改善的熱穩定性進行改造時，親一代和親二代酶之一或兩者可以是異澱粉酶或支鏈澱粉酶。為了獲得異澱粉酶和支鏈澱粉酶的改善的熱穩定性，我們可以使用如下進一步所述的序列同源性信息將目標主要集中在已經證實對於穩定性來說是重要的B區。熱穩定性-序列同源性可以將幾種不同的手段用於獲得增加的熱穩定性的目的，它們包括脯氨酸置換法、Gly至Ala置換法以及Asn和Gln置換法。下面提供了這些手段的進一步內容和實例。
脯氨酸置換法
建議將脯氨酸置換法即用脯氨酸殘基取代一個或多個非脯氨酸胺基酸殘基的方法作為用於獲得以異澱粉酶和支鏈澱粉酶的序列對比為基礎的熱穩定性的一種手段。可能的脯氨酸置換的實例在下面提供。
異澱粉酶在澱粉皮假單胞菌異澱粉酶(SEQ ID NO 4)中脯氨酸置換的位置包括G81P、G99P、T18P、T199P、Q202P、T221、Q226P、A238P、T278P、R286P、A294P、G467P、G64P、V67P、E69P、A549P、G713P、T719P和D736P；而優選S356P、T376P、T278P、N348P和S454P。
在海洋紅嗜熱鹽菌(R.marinus)異澱粉酶(SEQ ID NO 3)中脯氨酸置換位置包括G154P、N305P和N669P；而優選R588P和K480P。
支鏈澱粉酶在B.acidopullulyticus支鏈澱粉酶(SEQ ID NO 1)中優選的位置包括A210P、V215P、L249P、K383P、S509P、T811P和G823P。
在B.deramificans支鏈澱粉酶(SEQ ID NO 2)中優選的位置包括G306P、V311P、L345P、D605P、T907P、和A919P。
Gly至Ala的置換例如在澱粉皮假單胞菌異澱粉酶(SEQ ID NO 4)中G181AAsn(N)和Glin(Q)的置換新的殘基選自所有20種可能的胺基酸殘基，而優選從序列對比中觀察到的同源位置上的殘基，優選Leu、Ile、Phe、Ala、Thr、Ser和Tyr。特別關注如下SEQ ID NO 1:
環1:N379、N384環2:N426、Q432、N434、N437、N444、N446環3:N486、N490、Q502、N512、N515、N521環4:-
環5:Q596環6:N616、N621、Q628環7:N679、N681、Q684環8:N720、N722、N731、Q732SEQ ID NO 2:
環1:N475、N480環2:N522、N533、N590環3:N582、N608、N611、N617環4:-環5:Q691、Q698環6:N712、N717環7:N764、N775環8:N815、N817、N820SEQ ID NO 3:
環1:-環2:N227、N232環3:N286、N305、N314、N315、N327、N333環4:-環5:Q405環6:-環7:N482、N485、N489、N496、N500、Q513環8:N54、N548、N549、Q553、N555、N560、Q562SEQ ID NO 4:
環1:Q218、Q225環2:Q254、Q257、N258、N261、N266、N270、Q271、N272、N280環3:N322、N348、N358、Q359、N364、N370、N372、N375
環4:N408、N412、N421、N424、N428環5:N468、Q471、Q477環6:-環7:N547、N550、N551、N553、N567、Q572環8:Q615、N617、N618、N619、N622對於改善熱穩定性對環2和3中的修飾是特別關注的。環2是所關注的，因為它與序列N-末端部分中的另一個結構域發生相互作用。環3是所關注的，因為它可能與位於結構域A和結構域B之間的鈣結合位點有關。對改變的底物特異性的工程化當對改變的底物特異性進行工程化時，親一代和親二代酶之一或兩者可以是異澱粉酶或支鏈澱粉酶，不過，本發明目的所特別關注的是獲得支鏈澱粉酶對高分子量支鏈澱粉物質諸如糖原和支鏈澱粉具有改善的特異性；換句話說，例如通過環1-8、優選環1、2、4和5中的修飾將「異澱粉酶樣」特異性轉移給支鏈澱粉酶。
為了將異澱粉酶樣活性轉移給支鏈澱粉酶，特別關注的是從異澱粉酶至支鏈澱粉酶的環轉移，例如通過將來自異澱粉酶的環5插入支鏈澱粉酶環5的位點或通過將來自異澱粉酶的環1插入具有表1中所示編號的支鏈澱粉酶環1的位點。序列知識中的活性、序列同源性和總β-鏈、α-螺旋以及環位置使用來自例如澱粉皮假單胞菌異澱粉酶(SEQ ID NO:4)(高異澱粉酶活性)的序列信息可以將活性即特異性活性或特異性轉移給支鏈澱粉酶。使用來自例如B.acidopullulyticus支鏈澱粉酶(SEQ ID NO:1)的序列信息可以將活性即特異性活性或特異性轉移給異澱粉酶。對環分析特別存在於來自異澱粉酶中的β-鏈(或所建議的支鏈澱粉酶中的β-鏈)末端的環序列開始處的特異性殘基。
對所有的支鏈澱粉酶來說，如下所述建議的改變用於相應於所討論的兩種支鏈澱粉酶的那些同源位置提供的具有異澱粉酶樣活性的支鏈澱粉酶通過在B.acidopullulytieus(SEQ ID NO:1)和B.deramificans(SEQ ID NO:2)支鏈澱粉酶的β-鏈後的環區中的置換可以提供它
為了將澱粉皮假單胞菌異澱粉酶對高分子量支鏈澱粉物質的高活性轉移給海洋紅嗜熱鹽菌(R.marinus)異澱粉酶或其它異澱粉酶或轉移給支鏈澱粉酶，如上所述進行序列對比。如上所述通過評估序列同源性並考慮酶的「結構」，可以推定用於突變的策略。
從澱粉皮假單胞菌轉移高活性優選在不以任何實質性的程度失去海洋紅嗜熱鹽菌(R.marinus)異澱粉酶的熱穩定性的條件下進行。儘管通常難以在不改變熱穩定性的條件下改變底物活性，但是所關注的是本發明在海洋紅嗜熱鹽菌(R.marinus)異澱粉酶中以及在更具有熱穩定性的支鏈澱粉酶中獲得了較高的活性而同時又基本上保持了較高的熱穩定性。這一結果能夠通過下列步驟實現將欲突變的異澱粉酶和支鏈澱粉酶與「關鍵對比序列」進行序列對比並選擇欲突變的親代酶以及使用獲自這類胺基酸序列對比的信息欲突變的特異性胺基酸殘基和區。
以這些理論為基礎，下面的表提供了可以進行可能的突變以便獲得對高分子量澱粉物質具有較高活性的海洋紅嗜熱鹽菌(R.marinus)(SEQ ID NO 3)的實例。用於SEQ ID NO 3的較高活性的突變；環1:K183E、L184Q、H185D、P186T、E187S、V188I、E190A、P191Q；優選L184Q、P186T、E187S、P191Q；環2:H222Q、A223E、K224T、V225Q、H226N、R228A、H229N、L230D、231與232之間的插入片段VPN、E232S、R233D、G234A、L235N、R236Q、N242M、P243T、L244E、C245N、A248S、E250D、P251R；優選K224T、V225Q、R228A、P251R；環3:G289A、V293T、L294W、294與295之間插入的TSSDPTT、G295A、P296T、T297I、L298Y、F300W、I303L、R306A、A307T、K310E、A311L、D312T、P313S、N314G、缺失的P316、R317Q、F318Y、L319F、V320Y、Y322N、T325I、N327A、T328N、L329F、D330N、V331T、G332Y、P334T；優選P296T、R306A、P313S、缺失的P316、V331T、P334T；環4:A404S、A405V、A407G；環5:D397A、V398I、P400G、G401N、G402S、V405L、H407G、W410Q、Q411G；環6:R418L、Y419F、A422S、V423L、R425Q、F426A、W427Q；環7:F469M、E472K、L474V、V475Y；環8:L542Y、S543L、Q5446L、H447Q。定點誘變一旦分離了編碼DNA序列的異澱粉酶或支鏈澱粉酶並鑑定了用於突變的所需位點，則可以使用合成的寡核苷酸引入突變。這些寡核苷酸含有位於所需突變位點側翼的核苷酸序列。在一種特殊的方法中，在攜帶酶基因的載體中生成一種DNA的單鏈缺口即編碼所述酶的序列。然後使具有所需突變的合成的核苷酸退火而產生單鏈DNA的同源部分。接著用DNA聚合酶Ⅰ(克列諾片段)填充剩餘的缺口並使用T4連接酶連接構建體。這種方法的特殊實例在Morinaga等的(1984)《生物技術》(Biotechnology)2,p.646-639中描述。美國專利4,760,025中公開了通過對彈夾進行最低限度改變來引入編碼多種突變的寡核苷酸的技術方案。然而，用Morinaga的方法甚至可以在任意的時間引入更大量的突變，這是因為可以引入不同長度的大量的寡核苷酸。
Nelson和Long(1989)在《分析生物化學》(AnalyticalBiochemistry)180,p.147-151中描述了將突變引入編碼酶的DNA序列的另一種方法。它包括3步生成含有通過使用化學合成的DNA鏈作為PCR反應中引物之一而引入的所需突變的PCR片段。通過用限制性內切核酸酶裂解可以從PCR生成的片段中分離攜帶突變的DNA片段並將其重新插入表達質粒。隨機誘變隨機誘變在翻譯成上述所示的胺基酸序列的基因的至少三部分中或在完整基因內作為定位誘變或區域特異性隨機誘變合適地進行。
通過使用本領域中任意公知的方法可以方便地進行編碼親代酶的DNA序列的隨機誘變。
與上述相關，本發明的進一步方面涉及一種用於生產親代酶變體的方法，其中所述的變體表現出比親代改善的熱穩定性，該方法包括下列步驟(a)使編碼親代酶的DNA序列進行隨機誘變；(b)在宿主細胞內表達步驟(a)中獲得的突變DNA序列；和(c)篩選表達具有比親代酶改變的特性(例如熱穩定性)的酶變體的宿主細胞。
優選使用摻雜的引物進行上述本發明方法的步驟(a)。
例如，通過使用合適的物理或化學誘變劑、通過使用合適的寡核苷酸或通過使DNA序列進行PCR產生的誘變可以進行所述的隨機誘變。此外，通過使用任意組合的這些誘變劑可以進行所述的隨機誘變。例如，所述的誘變劑可以是誘導轉換、顛換、倒位、混雜、缺失和/或插入的一種誘變劑。
適合於本發明目的的物理或化學誘變劑的實例包括紫外線(UV)照射、羥基胺、N-甲基-N』-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、O-甲基羥基胺、亞硝酸、甲磺酸乙酯(EMS)、亞硫酸氫鈉、甲酸和核苷酸類似物。當使用這類誘變劑時，一般通過下列步驟來進行誘變在發生所述誘變的適宜條件下和有精選的誘變劑存在的情況下保溫編碼欲誘變的親代酶的DNA序列並選擇具有所需特性的突變DNA。
當使用寡核苷酸進行誘變時，可以在變化的位置上在合成寡核苷酸的過程中用三種非親代核苷酸摻入或嵌入所述的寡核苷酸。可以進行摻入(doping)或嵌入(spiking)步驟以便避免出現不需要胺基酸的密碼子。如果認為合適，通過任何公開的技術例如使用PCR、LCR或任意DNA聚合酶和連接酶可以將經摻入或嵌入的寡核苷酸引入編碼葡糖澱粉酶的DNA中。
優選使用「恆定隨機摻入」來進行摻入過程，其中預先確定了各位置上野生型和突變型的百分比。此外，摻入過程可以直接定向於優先選擇引入某些核苷酸，且由此優先選擇引入一種或多種特定胺基酸殘基。可以進行摻入過程例如以便在各位置上引入90％的野生型和10％的突變型。在選擇摻入方案中的另外的考慮以遺傳以及蛋白質結構的約束因素為基礎。通過使用特別是確保避免引入終止密碼子的DOPE程序可以實施所述的摻入方案(Jensen,LJ,Andersen,KV,Svendsen,A，和Kretzschmar,T(1998)《核酸研究》(Nucleic Acids Research)26:697-702)。
當使用PCR產生的誘變時，在增加錯摻核苷酸的條件下使編碼親代葡糖澱粉酶的經化學處理或非處理的基因進行PCR(Deshler 1992；Leung等《技術》(Technique)第1卷，1989,pp.11-15)。
通過例如將含有親代酶的質粒轉入突變株、使該突變株與所述的質粒一起生長並從所述的突變株中分離突變的質粒可以將大腸桿菌(Fowler等《分子基因遺傳學》(Molec.Gen.Genet.)133,1974,pp.179-191)、啤酒糖酵母(S,cereviseae)或任意其它微生物生物體的突變株用於編碼酶的DNA的隨機誘變。隨後可以將所述的突變質粒轉入表達生物體。
所誘變的DNA序列可以方便地存在於由表達親代酶的生物體製備的基因組或cDNA文庫中。另一方面，所述的DNA序列可以存在於合適的載體諸如質粒或噬菌體上，照此可以通過與誘變劑一起或與誘變劑接觸來培養它。所誘變的DNA還可以通過整合入所述細胞的基因組或通過存在於掩蔽在細胞中的載體上而存在於宿主細胞中。最終，所誘變的DNA可以是分離型。可以理解的是進行隨機誘變的DNA序列優選是cDNA或基因組DNA序列。
在某些情況中，可以在進行表達步驟(b)或篩選步驟(c)之前便利地擴增突變的DNA序列。這類擴增可以按照本領域中公知的方法來進行，目前優選的方法是使用以親代酶的DNA或胺基酸序列為基礎製備的寡核苷酸引物的PCR產生的擴增法。
在用誘變劑培養或接觸誘變劑後，通過在允許發生表達的條件下培養攜帶所述DNA序列的合適宿主細胞來表達突變的DNA。用於這一目的的宿主細胞可以是一種已經用任選存在於載體上的所述突變的DNA序列轉化的宿主細胞或一種在誘變處理過程中攜帶編碼親代酶的DNA序列的宿主細胞。合適的宿主細胞的實例如下革蘭氏陽性菌諸如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、Bacillus alkalophilus、解澱粉芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、蘇雲金芽孢桿菌、淺青紫鏈黴菌或鼠灰鏈黴菌；和革蘭氏陰性菌諸如大腸桿菌。
突變DNA序列可以進一步包括編碼允許表達所述突變DNA序列的功能的DNA序列。定位隨機誘變隨機誘變可以有利地定位於上述親代酶的一部分上。例如，當已經將某些酶的區域鑑定為對給定酶的特性來說特別重要時並且當預計所修飾的區可產生具有改善的特性的變體時，上述定位誘變是有利的。當已經闡明親代酶的三級結構且該結構與所述酶的功能相關時，通常可以鑑定這類區。
通過使用如上所述PCR產生的誘變技術或本領域中公知的其它合適的技術方便地進行定位、或區域特異性、隨機誘變。另一方面，例如，通過插入合適的載體可以分離編碼所修飾的部分DNA序列的DNA序列，且隨後通過使用如上所述的任意誘變方法可以使所述的部分進行誘變。與其它親代酶的同源性在一個實施方案中，本發明還涉及具有與SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4中任意一種的同一性程度至少約為60％、優選至少約為70％、優選至少約為80％、優選至少約為90％、優選至少約為93％、更優選至少約為95％、甚至更優選至少約為97％且最優選至少約為99％的胺基酸序列並具有支鏈澱粉酶或異澱粉酶活性的分離的親代多肽類的變體(下文稱作「同源多肽類」)。在一個優選的實施方案中，這種同源親代多肽類具有的胺基酸序列與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4中任意一種的不同之處在於相差5個胺基酸、優選相差4個胺基酸、更優選相差3個胺基酸、甚至更優選相差2個胺基酸且最優選相差1個胺基酸。
將胺基酸序列的同源性確定為表明從第二種序列衍生第一種序列的兩種序列之間的同一性程度。通過使用任意常用的算法、優選通過使用來自GCG軟體包版本8(1994年8月)、應用缺口補償錯誤值即缺口生成補償為3.0且缺口延伸補償為0.1的缺口程序(GeneticComputer Group,575 Science Drive,Madison,Wisconsin,USA53711)可以確定「同源性」(同一性)。
所述的親代多肽類優選含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4中任意一種的胺基酸序列或其等位變體或其具有支鏈澱粉酶或異澱粉酶活性的片段。
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的片段是具有從這些胺基酸序列的氨基和/或羧基末端缺失的一種或多種胺基酸的多肽類。
等位變體指的是含有相同染色體位點的基因的任意兩種或多種可選擇形式。等位變異通過突變自然發生且可以在群體內產生多態性。基因突變可以是沉默的(在編碼的多肽中沒有變化)或可以編碼具有改變的胺基酸序列的多肽類。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。
在另一個實施方案中，所分離的具有支鏈澱粉酶或異澱粉酶活性的親代多肽類由核酸序列編碼，所述的核酸序列在極低的嚴格條件、更優選在低嚴格條件、更優選在中等嚴格條件、更優選在中度-高度嚴格條件下、甚至更優選在高嚴格條件下且最優選在極高嚴格條件下與核酸探針雜交，所述的核酸探針在相同條件下與(ⅰ)SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13的核酸序列；(ⅱ)(ⅰ)的亞序列；或(ⅲ)(ⅰ)或(ⅱ)的互補鏈雜交(J.Sambrook,E.F.Fritsch，和T.Maniatus,1989，《分子克隆》(Molecular Cloning)，「實驗室手冊」(ALaboratory Manual)，第2版，Cold Spring Harbor,New York)。SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13的亞序列可以是至少100個核苷酸或優選至少200個核苷酸。此外，該亞序列可以編碼分別具有支鏈澱粉酶或異澱粉酶活性的多肽片段。親代多肽類也可以是具有支鏈澱粉酶或異澱粉酶活性的等位變體或多肽類的片段。
可以將SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13的核酸序列或其亞序列以及SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的胺基酸序列或其片段用於設計核酸探針以便按照本領域中眾所周知的方法從不同屬或種的菌株中鑑定並克隆編碼具有支鏈澱粉酶或異澱粉酶活性的多肽類的DNA。特別地，可以將這類探針用於在標準DNA印跡過程後與所關注屬或種的基因組或cDNA雜交以便鑑定並分離其中相應的基因。這類探針可以比完整序列短很多，但是至少應有15個核苷酸、優選至少有25個核苷酸且更優選至少有35個核苷酸長。也可以使用較長的探針。既可以使用DNA探針又可以使用RNA探針。一般將所述的探針進行標記以便檢測相應的基因(例如用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白標記)。這類探針也包括在本發明內。
因此，可以對由這類其它生物體製備的基因組DNA或cDNA文庫篩選與如上所述探針雜交並編碼具有支鏈澱粉酶或異澱粉酶活性的多肽的DNA。來自這類其它生物體的基因組或其它DNA可以用瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯醯胺凝膠電泳或其它分離技術來分離。可以將來自所述文庫的DNA或所分離的DNA轉到或固定在硝酸纖維或其它合適的載體物質上。為了鑑定與SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13或其亞序列同源的克隆或DNA，將所述的載體物質用於DNA印跡。為了本發明的目的，雜交表明在極低至極高嚴格條件下核酸序列與符合SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13中所示核酸序列、其互補鏈或其亞序列的核酸探針雜交。使用X光片來檢測在這些條件下核酸探針與之雜交的分子。
對於至少有100個核苷酸長度的較長探針來說，優選至少在45℃(極低的嚴格條件)、更優選至少在50℃(低嚴格條件)、更優選至少在55℃(中等嚴格條件)、更優選至少在60℃(中-高度嚴格條件)、甚至更優選至少在65℃(高度嚴格條件)且最優選至少在70℃(極高的嚴格條件)下將載體物質最終用2×SSC、0.2％SDS洗滌3次，每次15分鐘。
對於約有15個核苷酸至約70個核苷酸長度的較短探針來說，將嚴格條件定義為在標準DNA印跡過程後在5℃-10℃和低於使用Bolton和McCarthy計算法(1962，《美國國家科學院學報》(Proceedings of the National Academy of Sciences USA)48:1390)計算的Tm以及在0.9MNaCl、0.09M Tris-HCl pH7.6、6mM EDTA、0.5％NP-40、1XDenhardt’s溶液、1mM焦磷酸鈉、1mM磷酸一氫鈉、0.1mMATP和0.2mg酵母RNA/ml中進行的預雜交、雜交和雜交後洗滌。
對於約有15個核苷酸至約70個核苷酸長度的較短探針來說，將載體物質在6×SCC+0.1％SDS中洗滌1次、15分鐘，並使用6×SSC在5℃-10℃和低於計算的Tm條件下洗滌2次、每次15分鐘。
本發明還涉及通過下列步驟生產的分離的核酸序列(a)在極低、低、中等、中-高度、高度或極高嚴格條件下使DNA與SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13的序列或其互補鏈或其亞序列雜交；和(b)分離所述的核酸序列。所述的亞序列優選是至少有100個核苷酸的序列諸如編碼具有支鏈澱粉酶或異澱粉酶活性的多肽片段的序列。
所關注的親代多肽類具有至少20％、優選至少40％、更優選至少60％、甚至更優選至少80％、甚至更優選至少90％且最優選至少100％的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的成熟多肽的支鏈澱粉酶或異澱粉酶活性。
通過下列非限制性實施例來進一步解釋本發明。實施例實施例1供體生物體Bacillus acidopullulyticus含有編碼pulB基因的DNA序列(SEQ ID NO:13)的支鏈澱粉酶(Kelly，A.P.,Diderichsen,B.,Jorgensen,S.和McConnett,D.J.(1994)「Bacillusacidopullulyticus支鏈澱粉酶B基因的分子遺傳學分析」-《FEMS微生物學通訊》(FEMS Microbiology Letters)115,97-106)。其它菌株大腸桿菌菌株通過使用來自由提供者所述的BIO-RAD的GenePulserTM電穿孔儀進行電穿孔來製備並轉化大腸桿菌SJ2細胞(Diderichsen,B.,Wedsted,U.,Hedegaard,L.,Jensen,B.R.,Sjφholm,C.(1990)「編碼α-乙醯乳酸脫羧酶，即一種來自短芽孢桿菌(Bacillus brevis)的胞外酶的aldB的克隆」-《細菌學雜誌》(J.Bacteriol.)172,4315-4321)。
枯草芽孢桿菌(B.subtilis)PL1801。該菌株是帶有破裂的apr和npr基因的枯草芽孢桿菌DN1885(Diderichsen,B.,Wedsted,U.,Hedegaard,L.,Jensen,B.R.,Sjφholm,C.(1990)「編碼α-乙醯乳酸脫羧酶，即一種來自短芽孢桿菌的胞外酶的aldB的克隆」-《細菌學雜誌》(J.Bacteriol.)172,4315-4321)。
如Yasbin,R.E.,Wilson,G.A.和Young,F.E.在(1975)「枯草芽孢桿菌溶原菌株中的轉化和轉染用於感受態細胞中原噬菌體的選擇性誘導的證據」-《細菌學雜誌》(J.Bacteriol.)121,296-304中所述來製備和轉化感受態細胞。質粒pMOL944。該質粒是主要含有使質粒能夠在枯草芽孢桿菌中繁殖的成分、卡那黴素抗性基因並帶有強啟動子和克隆自地衣形芽孢桿菌(B.licheniformis)ATCC14580的amyL基因的信號肽的pUB110衍生物。所述的信號肽含有SacⅡ位點，這使得能夠方便地用所述信號肽克隆編碼蛋白質浸液成熟部分的DNA。這可導致對直接定向於細胞外部的前蛋白質進行表達。通過常規的基因工程法來構建該質粒並簡述如下。
pMOL944的構建用唯一的限制酶NciⅠ來消化pUB110質粒(McKenzie,T.等，1986,《質粒》(Plasmid)15:93-103)。用NciⅠ來消化從在質粒pDN1981(P.L.Jφrgensen等，1990《基因》(Gene)96,p37-41)上編碼的amyL啟動子擴增的PCR片段並將其插入NciⅠ消化的pUB110以便得到質粒pSJ2624。
所用的兩種PCR引物具有如下序列#LWN5494 5′-GTCGCCGGGGCGGCCGCTATCAATTGGTAACTGTATCTCAGC-3′#LWN5495 5′-GTCGCCCGGGAGCTCTGATCAGGTACCAAGCTTGTCGACCTGCAGAATGAGGCAGCAAGAAGAT-3′引物#LWN5494將NotⅠ位點插入質粒。
然後用SacI和NotI消化質粒pSJ2624並用SacⅠ和NotⅠ消化在pDN1981上編碼的amyL啟動子上擴增的新PCR片段並將這種DNA片段插入SacⅠ-NotⅠ消化的pSJ2624以便得到質粒pSJ2670。
這一克隆過程取代了使用相同啟動子進行的第一個amyL啟動子的克隆，但是方向相反。用於PCR擴增的兩種引物具有如下序列#LWN5938 5｀-GTCGGCGGCCGCTGATCACGTACCAAGCTTGTCGACCTGCAGAATGAGGCAGCAAGAAGAT-3′#LWN5939 5｀-GTCGGAGCTCTATCAATTGGTAACTGTATCTCAGC-3′用限制酶PstⅠ和BclⅠ消化質粒pSJ2670並用PstⅠ和BclⅠ消化由編碼鹼性澱粉酶SP722(專利號WO9526397-A1)的克隆DNA序列擴增的PCR片段並將其插入以便得到質粒pMOL944。用於PCR擴增的兩種引物具有如下序列#LWN7864 5｀-AACAGCTGATCACGACTGATCTTTTAGCTTGGCAC-3′#LWN7901 5｀-AACTGCAGCCGCGGCACATCATAATGGGACAAATGGG-3′引物#LWN7901將SacⅡ位點插入質粒。
枯草芽孢桿菌中支鏈澱粉酶pulB的亞克隆和表達。
使用由這兩種寡核苷酸組成的PCR引物組對編碼本發明DNA序列的pulB進行PCR擴增pulB．上．saCⅡ5′-CAT TCT GCA GCC GCG GCA GAT TCT ACC TCG ACA GAA GTC-3′pulB．下．NotⅠ5′-GTT GAG AAA A GC GGC CGC TTC TTT AAC ACA TGC TAC GG-3′限制位點SacⅡ和NotⅡ如下描述。
pulB上SacⅡ引物恰好位於pulB基因的信號序列之後且在pMOL944載體中克隆後產生與amyL信號序列的信號融合物。
pulB下引物恰好位於pulB基因的mRNA終止子之後。
基因組DNA的製備使菌株Bacillus pullulyticus(ID noxxxx)在液體TY培養基中增殖。16小時後在30℃和300rpm下培養，收集細胞並通過Pitcher等所述的方法(Pitcher,D.G.,Saunders,N.A.,Owen,R.J.(1989)「用硫氰酸胍快速提取細菌基因組DNA」-《微生物學應用通訊》(Lett.Appl.Microbiol.)8,151-156)來分離基因組DNA。
將如上所述分離自B.pullulyticus的染色體DNA用作使用Amplitaq DNA聚合酶(Perkin Elmer)按照製造商的說明進行的PCR反應的模板。在含有200μM的各dNTP、2.5個單位的Amplitaq聚合酶(Perkin Elmer,Cetus,USA)和100pmol的各引物的PCR緩衝液(10mM Tris-HCl,pH8.3、50mMKCl、1.5mMMgCl2、0.01％(w/v)明膠)中引發PCR反應。
使用DNA熱循環儀(Landgraf,Germany)進行PCR反應。一種情況是在94℃下保溫1分鐘；隨後使用在96℃下變性10秒、在60℃下退火30秒和在72℃下延伸150秒組成的循環方案進行30個循環的PCR。通過在0.7％瓊脂糖凝膠(NuSieve,FMC)中的電泳來分析5μl等份的擴增產物。2.5kb大小的DNA片段外觀表明對基因片段進行了適當的擴增。PCR片段的亞克隆使用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen,USA)、按照製造商的說明純化如上所述生成的45μl等份的PCR產物。用50μl的10mMTris-HCl,pH8.5來洗脫純化的DNA。
用SacⅡ和NotⅠ消化5μg的pMOL944和25μl純化的PCR片段、使其在0.8％的低膠凝溫度瓊脂糖(SeaPlaque GTG,FMC)凝膠中電泳、從凝膠中切下相關的片段並使用QIAquick Gel提取試劑盒(Qiagen,USA)按照製造商的說明進行純化。然後將分離的PCR DNA片段與SacⅡ-NotⅠ消化和純化的pMOL944連接。在16℃下，使用0.5μg的各DNA片段、1U的T4DNA連接酶和T4連接酶緩衝液(BoehringerMannheim,Germany)使連接過程過夜進行。將該連接混合物用於轉化感受態枯草芽孢桿菌PL2306。將轉化的細胞鋪平板固定在LBPG-10μg/ml的卡那黴素-0.1％AZCL-普魯蘭-瓊脂平板上。在37℃下培養18小時後，觀察到陽性表達克隆的支鏈澱粉酶的細胞為被藍色環包圍的集落。在上述所用的瓊脂平板上將一種這樣的陽性克隆重新劃線幾次，將該克隆稱作PULxxx。在37℃下使該克隆PULxxx在TY-10μg/ml的卡那黴素中生長過夜，並在次日使用Qiaprep旋式質粒小量製備試劑盒#27106、按照製造商對枯草芽孢桿菌質粒製備的建議將1ml細胞用於從該細胞中分離質粒。支鏈澱粉酶的表達在30℃下，在2個500ml帶擋板的搖瓶中使PULxxx以300rpm在含有10μg/ml卡那黴素的25×200mlBPX培養基中生長。
pulB序列(SEQ ID NO:14)AAAAAATGCTTAATAGAAGGAGTGTAATCTGTGTCCCTAATACGTTCTAGGTATAATCATTTTGTCATTCTTTTTACTGTCGCCATAATGTTTCTAACAGTTTGTTTCCCCGCTTATAAAGCTTTAGCAGATTCTACCTCGACAGAAGTCATTGTGCATTATCATCGTTTTGATTCTAACTATGCAAATTGGGATCTATGGATGTGGCCATATCAACCAGTTAATGGTAATGGAGCAGCATACGAGTTTTCTGGAAAGGATGATTTTGGCGTTAAAGCAGATGTTCAAGTGCCTGGGGATGATACACAGGTAGGTCTGATTGTCCGTACAAATGATTGGAGCCAAAAAAATACATCAGACGATCTCCATATTGATCTGACAAAGGGGCATGAAATATGGATTGTTCAGGGGGATCCCAATATTTATTACAATCTGAGTGATGCGCAGGCTGCAGCGACTCCAAAGGTTTCGAATGCGTATTTGGATAATGAAAAAACAGTATTGGCAAAGCTAACTAATCCAATGACATTATCAGATGGATCAAGCGGCTTTACGGTTACAGATAAAACAACAGGGGAACAAATTCCAGTTACCGCTGCAACAAATGCGAACTCAGCCTCCTCGTCTGAGCAGACAGACTTGGTTCAATTGACGTTAGCCAGTGCACCGGATGTTTCCCATACAATACAAGTAGGAGCAGCCGGTTATGAAGCAGTCAATCTCATACCACGAAATGTATTAAATTTGCCTCGTTATTATTACAGCGGAAATGATTTAGGTAACGTTTATTCAAATAAGGCAACGGCCTTCCGTGTATGGGCTCCAACTGCTTCGGATGTCCAATTACTTTTATACAATAGTGAAACAGGACCTGTAACCAAACAGCTTGAAATGCAAAAGAGTGATAACGGTACATGGAAACTGAAGGTCCCTGGTAATCTGAAAAATTGGTATTATCTCTATCAGGTAACGGTGAATGGGAAGACACAAACAGCCGTTGACCCTTATGTGCGTGCTATTTCAGTCAATGCAACACGTGGTATGATAGTCGATTTAGAAGATACGAATCCTCCTGGATGGAAAGAAGATCATCAACAGACACCTGCGAACCCAGTGGATGAAGTAATCTACGAAGTGCATGTGCGTGATTTTTCGATTGATGCTAATTCAGGCATGAAAAATAAAGGGAAATATCTTGCCTTTACAGAACATGGCACAAAAGGCCCTGATAACGTGAAAACGGGTATTGATAGTTTGAAGGAATTAGGAATCAATGCTGTTCAATTACAGCCGATTGAAGAATTTAACAGCATTGATGAAACCCAACCAAATATGTATAACTGGGGCTATGACCCAAGAAACTACAACGTCCCTGAAGGAGCGTATGCAACTACACCAGAAGGAACGGCTCGCATTACCCAGTTAAAGCAACTGATTCAAAGCATTCATAAAGATCGGATTGCTATCAATATGGATGTGGTCTATAACCATACCTTTAACGTAGGAGTGTCTGATTTTGATAAGATTGTTCCGCAATACTATTATCGGACAGACAGCGCAGGTAATTATACGAACGGCTCAGGTGTAGGTAATGAAATTGCGACCGAGCGTCCGATGGTCCAAAAGTTCGTTCTGGATTCTGTTAAATATTGGGTAAAGGAATACCATATCGACGGCTTC
CGTTTCGATCTTATGGCTCTTTTAGGAAAAGACACCATGGCCAAAATATCAAAAGAGCTTCATGCTATTAATCCTGGCATTGTCCTGTATGGAGAACCATGGACTGGCGGTACCTCTGGATTATCAAGCGACCAACTCGTTACGAAAGGTCAGCAAAAGGGCTTGGGAATTGGCGTATTCAACGATAATATTCGGAACGGACTCGATGGTAACGTTTTTGATAAATCGGCACAAGGATTTGCAACAGGAGATCCAAACCAAGTTAATGTCATTAAAAATAGAGTTATGGGAAGTATTTCAGATTTCACTTCGGCACCTAGCGAAACCATTAACTATGTAACAAGCCATGATAATATGACATTGTGGGATAAAATTAGCGCAAGTAATCCGAACGATACACAAGCAGATCGAATTAAGATGGATGAATTGGCTCAAGCTGTGGTATTTACTTCACAAGGGGTACCATTTATGCAAGGTGGAGAAGAAATGCTGCGGACAAAAGGCGGTAATGATAATAGTTACAATGCCGGGGATAGCGTGAATCAGTTCGATTGGTCAAGAAAAGCACAATTTGAAAATGTATTCGACTACTATTCTTGGTTGATTCATCTACGTGATAATCACCCAGCATTCCGTATGACGACAGCGGATCAAATCAAACAAAATCTCACTTTCTTGGATAGCCCAACGAACACTGTAGCATTTGAATTAAAAAATCATGCCAATCATGATAAATGGAAAAACATTATAGTTATGTATAATCCAAATAAAACTGCACAAACTCTCACTCTACCAAGTGGAAATTGGACAATTGTAGGATTAGGCAATCAAGTAGGTGAGAAATCACTAGGCCATGTAAATGGCACGGTTGAGGTGCCAGCTCTTAGTACGATCATTCTTCATCAGGGTACATCTGAAGATGTCATTGATCAAAATTAATATTGATTAAGAAATGATTTGTAAAACATTTAAGTCCATTTACACGGGATACTGTGTAAATGGATTTTAGTTTTATCCGTAGCATGTGTTAAAGAAGTAAATAGTAAATGGCAATTT所表示的用於兩種擴增引物的靶物培養基TY(如Ausubel所述，F.M.等(編輯)「分子生物學最新方案」John Wiley和Sons,1995)。
LB瓊脂(如Ausubel所述，F.M.等(編輯)「分子生物學最新方案」John Wiley和Sons,1995)。
LBPG是用0.5％葡萄糖和0.05M磷酸鉀(pH7.0)補充的LB瓊脂。
將AZCL-普魯蘭加入到LBPG瓊脂中至來自Megazyme,Australia的AZCL-普魯蘭為0.5％。
BPX培養基在EP 0 506780中描述(WO 91/09129)。實施例2Bacillus acidopullulyticus支鏈澱粉酶(PromozymeTM)的純化通過對Bacillus acidopullulyticus發酵來純化Bacillusacidopullulyticus支鏈澱粉酶(如EP63,909中所述)，使該支鏈澱粉酶分泌入培養基。
將助濾劑加入到培養肉湯中，將該肉湯通過濾布過濾。將該溶液進一步通過賽氏厚度濾板過濾，從而產生澄明溶液。通過在10kDa截斷的聚醚碸膜上超濾來濃縮濾液，隨後用蒸餾水滲濾(dialfiltration)以降低傳導性。將濃縮酶的pH調節至pH4.5。所濃縮酶的傳導性為0.7mS/cm。
將濃縮的支鏈澱粉酶加樣至用20mM CH3COOH/NaOH,pH4.5平衡的S-Sepharose FF柱，並用線性NaCl梯度(0→0.5M)洗脫該酶。支鏈澱粉酶的活性洗脫為單峰。將收集的具有支鏈澱粉酶活性的級分轉入Sephadex G25柱上的20mM KH2PO4/NaOH,pH7.0中。通過加樣至用20mMKH2PO4/NaOH,pH7.0平衡的Q-Sepharose FF柱來進一步純化所述的酶。在洗滌柱後，用線性NaCl梯度(0→0.5M)洗脫該支鏈澱粉酶。收集具有支鏈澱粉酶活性的級分並在Sephadex G25柱上將緩衝液交換成20mMCH3COOH/NaOH,pH4.5。然後將支鏈澱粉酶加樣至用20mMCH3COOH/NaOH,pH4.5平衡的SOURCE 30S柱。在洗滌柱後，用增加的線性NaCl梯度(0→0.2M)洗脫支鏈澱粉酶活性。收集具有支鏈澱粉酶活性的級分並用截斷10kDa的再生的纖維素膜在超濾室上濃縮。將濃縮的酶加樣至用20mMCH3COOH/NaOH、200mMNaCl,pH4.5平衡的Superdex200的體積排阻柱。通過SDS-PAGE分析洗脫自Superdex200柱的級分並收集純的支鏈澱粉酶級分。
所述的支鏈澱粉酶在SDS-PAGE上遷移為具有Mr=100kDa的帶。
基本上以同樣方式可以純化其它的支鏈澱粉酶和異澱粉酶。
Sepharose、Sephadex、SOURCE和Superdex是由AmershamPharmacia Biotech擁有的商品名。實施例3支鏈澱粉酶和異澱粉酶的熱穩定性通過DSC(差示掃描量熱法)可以檢測支鏈澱粉酶和異澱粉酶的熱穩定性。將熱變性溫度Td作為以恆定程序化加熱速率加熱酶溶液後獲得的差示熱分析圖上變性峰的峰值(Cp對T)。實驗可以將例如來自Har Scientific(Utah,USA)DSC Ⅱ裝置的合適的DSC裝置用於本實驗。將50mM緩衝溶液用作pH10(50mM甘氨酸緩衝液)、pH7(50mM HEPES緩衝液+10mM EDTA)或pH4(50mM檸檬酸鹽緩衝液)下酶的溶劑(約2mg/ml)。如上所述可以純化該酶。將750μl酶溶液轉入標準1ml密封哈斯特洛伊耐蝕鎳基合金安瓿(HartScientific)。將安瓿進行量熱法實驗並冷卻至5℃15分鐘。在DSC掃描前進行熱平衡。在5℃-95℃的範圍內以約90K/小時的掃描速率進行DSC掃描。使用約+/-2℃的精確度測定變性溫度。將結果表示為對作為pH函數的變性峰的峰值。實施例4活性脫支活性試驗下列結果表明特異性活性(活性/mg純的酶)高度依賴於酶的種類。異澱粉酶對高分子量支鏈澱粉物質諸如糖原和支鏈澱粉酶具有極高的活性，而支鏈澱粉酶對這些底物的活性極低。活性單位反映出在10分鐘保溫期過程中形成的還原末端的數量。使用支鏈澱粉酶觀察到了相反的情況，即對高分子量支鏈澱粉物質諸如糖原和支鏈澱粉具有低活性，而對例如普魯蘭具有高活性。
當酶脫支與液化過程中α-澱粉酶的作用一起發生時對支鏈澱粉和糖原具有高活性是特別優選的。另一方面，當在糖化步驟中發生酶脫支時即在液化過程後當高分子量成分被斷裂成較小的寡糖時，對小的寡核苷酸諸如普魯蘭具有高活性是優選的。如果可以將支鏈澱粉酶改變成對高分子量化合物諸如支鏈澱粉具有高活性(特異性)，那麼當在液化過程中加入支鏈澱粉酶時，這種改變是極為優選的。
所用的底物家兔肝臟的糖原和普魯蘭。預試驗已經證實需要高濃度的底物以便當開始進行線性試驗時底物不是限制因素。在本發明的上下文中，「高」底物濃度為10％w/v。Somogyi-Nelson試驗測定了通過酶降解所述底物而形成的還原末端的量。由於正常的試驗時間達到了3小時，所以還原末端的形成受到相當的限制，即使在酶濃度較高的情況下(10％w/v)也是如此。這意味著該試驗測定了在極高的背景值上還原末端的相對較小的差異，其中的背景值遠高於酶處理過程中可測定的吸收度差異。由於這一原因，如下用NaBH4氧化糖原和普魯蘭中的還原末端以便降低底物背景的水平將1000mg的糖原溶於40ml已經加入0.2％NaOH的水中。在攪拌過程中謹慎加入800mgNaBH4。在25℃下，將該溶液攪拌48小時，此後通過加入Amberlite IR-118H即一種除去硼離子並終止反應的陽離子交換劑來終止反應。過濾該溶液以除去基質並蒸發至得到10ml。將該溶液對去離子水充分透析以便除去殘餘的硼離子。發現該方法將背景值減少至少到十分之一。
按照Somogyi-Nelson法、使用50mM乙酸鈉、在pH值為4.5、5.0和5.5且溫度為50℃(異澱粉酶)或60℃(支鏈澱粉酶)下進行該試驗，反應時間為10分鐘。將葡萄糖用作標準品，由含有0-200mg葡萄糖/升的溶液構建標準曲線。表3來自家兔肝臟的糖原溫度 pH PUN/mg來自B.acidopullulyticus60℃ 4.5 50的支鏈澱粉酶(SEQ ID NO 1)60℃ 5.0 4960℃ 5.5 51來自B.deramificans 60℃ 4.5 37的支鏈澱粉酶(SEQ ID NO 2)60℃5.03160℃5.530來自假單胞菌屬的異澱粉酶50℃4.52829(SEQ ID NO 4)50℃5.0285850℃5.52709普魯蘭來自B.acidopullulyticus 60℃4.5402的支鏈澱粉酶(SEQ ID NO1)60℃5.041460℃5.5393來自B.deramificans的60℃4.5288支鏈澱粉酶(SEQ ID NO 2)60℃5.027660℃5.5255來自假單胞菌屬的異澱粉酶50℃4.514(SEQ ID NO 4)50℃5.01450℃5.56SEQ ID NO 12:(2)SEQ ID NO:12的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度2181個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)
(ⅵ)原始來源(B)菌株海洋紅嗜熱鹽菌DSM 4252(ⅸ)特徵(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..2181(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:12:ATG TCA CAT AGC GCG CAA CCG GTT ACG TCG GTA CAG GCC GTC TGG CCC 48Met Ser His Ser Ala Gln Pro Val Thr Ser Val Gln Ala Val Trp Pro1 5 10 15GGC CGG CCT TAT CCG CTG GGT GCC ACC TGG GAC GGG CTG GGC GTC AAC 96Gly Arg Pro Tyr Pro Leu Gly Ala Thr Trp Asp Gly Leu Gly Val Asn20 25 30TTT GCC CTC TAC AGC CAG CAC GCC GAG GCG GTC GAA CTG GTG CTG TTC 144Phe Ala Leu Tyr Ser Gln His Ala Glu Ala Val Glu Leu Val Leu Phe35 40 45GAC CAC CCG GAC GAT CCC GCG CCT TCG CGC ACG ATC GAA GTG ACC GAA 192Asp His Pro Asp Asp Pro Ala Pro Ser Arg Thr Ile Glu Val Thr Glu50 55 60CGG ACA GGC CCG ATC TGG CAT GTG TAC CTG CCC GGC CTG CGT CCC GGC 240Arg Thr Gly Pro Ile Trp His Va1 Tyr Leu Pro Gly Leu Arg Pro Gly65 70 75 80CAG CTC TAC GGC TAT CGC GTC TAC GGA CCC TAC CGG CCG GAG GAA GGC 288Gln Leu Tyr Gly Tyr Arg Val Tyr Gly Pro Tyr Arg Pro Glu Glu Gly85 90 95CAC CGC TTC AAT CCG AAC AAG GTG CTG CTC GAC CCC TAC GCG AAG GCC 336His Arg Phe Asn Pro Asn Lys Val Leu Leu Asp Pro Tyr Ala Lys Ala100 105 110ATC GGC CGG CCC CTT CGC TGG CAC GAC AGC CTC TTC GGT TAC AAA ATC 384Ile Gly Arg Pro Leu Arg Trp His Asp Ser Leu Phe Gly Tyr Lys Ile115 120 125GGC GAT CCG GCC GGG GAT CTG TCG TTC TCC GAA GAA GAC AGC GCT CCG 432Gly Asp Pro Ala Gly Asp Leu Ser Phe Ser Glu Glu Asp Ser Ala Pro
130 135 140TAC GCG CCG CTG GGA GCC GTC GTG GAG GGC TGT TTC GAG TGG GGC GAC480Tyr Ala Pro Leu Gly Ala Val Val Glu Gly Cys Phe Glu Trp Gly Asp145 150 155 160GAC CGC CCG CCG CGC ATT CCC TGG GAA GAC ACG ATC ATC TAC GAA ACG528Asp Arg Pro Pro Arg Ile Pro Trp Glu Asp Thr Ile Ile Tyr Glu Thr165 170 175CAC GTC AAG GGC ATC ACG AAG CTG CAT CCG GAA GTG CCG GAG CCG CTG576His Val Lys Gly Ile Thr Lys Leu His Pro Glu Val Pro Glu Pro Leu180 185 190CGG GGG ACG TAT CTG GGG CTG ACC TGC GAG CCG GTG CTG GAG CAC CTG624Arg Gly Thr Tyr Leu Gly Leu Thr Cys Glu Pro Val Leu Glu His Leu195 200 205AAG CAG CTG GGC GTC ACC ACG ATC CAG CTC CTT CCG GTG CAC GCA AAA672Lys Gln Leu Gly Val Thr Thr Ile Gln Leu Leu Pro Val His Ala Lys210 215 220GTG CAC GAT CGG CAC CTG GTC GAG CGC GGC CTG CGC AAC TAC TGG GGC720Val His Asp Arg His Leu Val Glu Arg Gly Leu Arg Asn Tyr Trp Gly225 230 235 240TAC AAT CCG CTC TGC TAC TTT GCG CCG GAG CCC GAG TAC GCC ACG AAC768Tyr Asn Pro Leu Cys Tyr Phe Ala Pro Glu Pro Glu Tyr Ala Thr Asn245 250 255GGG CCG ATC TCG GCC GTG CGC GAG TTC AAG ATG ATG GTG CGG GCG CTG816Gly Pro Ile Ser Ala Val Arg Glu Phe Lys Met Met Val Arg Ala Leu260 265 270CAT GCT GCC GGC TTC GAG GTG ATC GTC GAC GTG GTC TAC AAC CAC ACG864His Ala Ala Gly Phe Glu Val Ile Val Asp Val Val Tyr Asn His Thr275 280 285CGC GAA GGC GGC GTG CTG GGC CCC ACG CTG TCG TTC CGG GGC ATC GAC912Gly Glu Gly Gly Val Leu Gly Pro Thr Leu Ser Phe Arg Gly Ile Asp290 295 300AAC CGC GCC TAC TAC AAG GCC GAT CCG AAC AAC CCG CGC TTT CTG GTC960Asn Arg Ala Tyr Tyr Lys Ala Asp Pro Asn Asn Pro Arg Phe Leu Va1305 310 315 320GAT TAC ACG GGC ACC GGC AAC ACG CTG GAC GTG GGC AAC CCC TAC GTC1008Asp Tyr Thr Gly Thr Gly Asn Thr Leu Asp Val Gly Asn Pro Tyr Val325 330 335ATC CAG CTC ATC ATG GAC AGC CTG CGC TAC TGG GTC ACT GAA ATG CAC1056Ile Gln Leu Ile Met Asp Ser Leu Arg Tyr Trp Val Thr Glu Met His340 345 350GTC GAC GGC TTT CGG TTC GAC CTG GCC GCC GCG CTG GCC CGC GAG CTG1104Val Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Ala Ala Ala Leu Ala Arg Glu Leu355 360 365TAC GAC GTG GAC ATG CTC TCG ACC TTT TTT CAG GTC ATT CAG CAG GAC 1152Tyr Asp Val Asp Met Leu Ser Thr Phe Phe Gln Val Ile Gln Gln Asp370 375 380CCG GTG CTC AGC CAG GTC AAG CTC ATC GCC GAA CCC TGG GAC GTC GGG 1200Pro Val Leu Ser Gln Val Lye Leu Ile Ala Glu Pro Trp Asp Val Gly385 390 395 400CCG GGG GGG TAT CAG GTG GGA CAT TTT CCC TGG CAG TGG ACC GAG TGG 1248Pro Gly Gly Tyr Gln Val Gly His Phe Pro Trp Gln Trp Thr Glu Trp405 410 415AAC GGC CGC TAT CGT GAC GCC GTG CGC CGC TTC TGG CGG GGC GAT CGG 1296Asn Gly Arg Tyr Arg Asp Ala Val Arg Arg Phe Trp Arg Gly Asp Arg420 425 430GGC CTC AAC GGT GAG TTT GCC ACG CGC TTT GCC GGC TCC AGC GAT CTG 1344Gly Leu Asn Gly Glu Phe Ala Thr Arg Phe Ala Gly Ser Ser Asp Leu435 440 445TAC GAA CGT AGC GGT GGT CGT CCG TTC GCT TCG ATC AAC TTC GTC ACG 1392Tyr Glu Arg Ser Gly Arg Arg Pro Phe Ala Ser Ile Asn Phe Val Thr450 455 460GCG CAC GAC GGC TTC ACG CTG GAA GAC CTG GTC AGC TAC ACG AAA AAG 1440Ala His Asp Gly Phe Thr Leu Glu Asp Leu Val Ser Tyr Thr Lys Lys465 470 475 480CAC AAC GAA GCG AAT CTG GAA GGC AAC CGG GAC GGC ATG GAC GAA AAC 1488His Asn Glu Ala Asn Leu Glu Gly Asn Arg Asp Gly Met Asp Glu Asn485 490 495TAC AGC ACG AAC TGC GGG GTG GAG GGA CCC ACG CAG GAT CCG TCC GTG 1536Tyr Ser Thr Asn Cys Gly Val Glu Gly Pro Thr Gln Asp Pro Ser Val500 505 510CTG GCC TGC CGG GAA GCG CTC AAG CGC AGC CTG ATC AGC ACG CTC TTT 1584Leu Ala Cys Arg Glu Ala Leu Lys Arg Ser Leu Ile Ser Thr Leu Phe515 520 525CTC TCG CAG GGC GTG CCC ATG CTG CTG GGCGGC GAC GAG CTG TCG CGC 1632Leu Ser Gln Gly Val Pro Met Leu Leu Gly Gly Asp Glu Leu Ser Arg530 535 540ACG CAG CAC GGC AAC AAC AAC GCC TAT TGC CAG GAC AAC GAG ATC AGC 1680Thr Gln His Gly Asn Asn Asn Ala Tyr Cys Gln Asp Asn Glu Ile Ser545 550 555 560TGG TAC AAC TGG CAG CTC GAC ACG CGC AAG CAG CAG TTT CTG GAG TTC 1728Trp Tyr Asn Trp Gln Leu Asp Thr Arg Lys Gln Gln Phe Leu Glu Phe565 570 575GTG CGC CAG ACG ATC TGG TTT CGC AAG CAG CAT CGG AGC TTC CGG CGC 1776Val Arg Gln Thr Ile Trp Phe Arg Lys Gln His Arg Ser Phe Arg Arg580 585 590CGC CAT TTT CTG ACC GGA TTG CCC AAC GGC GGA AGG CCC CGA CGC AGT 1824Arg His Phe Leu Thr Gly Leu Pro Asn Gly Gly Arg Pro Arg Arg Ser595 600 605CTG GTG GCA CCT GAG GGT CGG CCC ATG CGC CAC GAG GAC TGG ACC AAC 1872Leu Val Ala Pro Glu Gly Arg Pro Met Arg His Glu Asp Trp Thr Asn610 615 620CCG GAG CTG ACG GCC TTC GGA CTG CTG CTG CAC GGC GAC GCC ATT CAG 1920Pro Glu Leu Thr Ala Phe Gly Leu Leu Leu His Gly Asp Ala Ile Gln625 630 635 640GGG ACC GAC GAG CAC GGA CGA CCG TTT CGC GAC GAC ACG TTT CTG ATT 1968Gly Thr Asp Glu His Gly Arg Pro Phe Arg Asp Asp Thr Phe Leu Ile645 650 655CTG TTC AAC AAC GGC AGC GAA GCC GTG CCG GTC GTG GTG CCG GAG GTA 2016Leu Phe Asn Asn Gly Ser Glu Ala Val Pro Val Val Val Pro Glu Val660 665 670TGC TCC TGT GGC AAG CCG CAC CAC TGG GAG GTG GTC CCG GTG TTT CAA 2064Cys Ser Cys Gly Lys Pro His His Trp Glu Val Val Pro Val Phe Gln675 680 685CGC AAT GTG GAG CCC CCC ACG TGC GCG CCC GGC GAG ACG CTG TCG CTC 2112Arg Asn Val Glu Pro Pro Thr Cys Ala Pro Gly Glu Thr Leu Ser Leu690 695 700CCG CCC GGC GTG CTG ACG GTG CTG GTG GCC GTA CCG CCG TTC TCG GAT 2160Pro Pro Gly Val Leu Thr Val Leu Val Ala Val Pro Pro Phe Ser Asp705 710 715 720GGA AAC ACG GAG CCG GCC TGA 2181Gly Asn Thr Glu Pro Ala *725
序列表110Novo Nordisk A/S120澱粉脫支酶130澱粉脫支酶14014116014170Patentln版本2.12101211862212PRT213Bacillus acidopullulyticus220221肽222(1)..(862)223支鏈澱粉酶4001Val Ser Leu Ile Arg Ser Arg Tyr Asn His Phe Val Ile Leu Phe Thr1 5 10 15Val Ala Ile Met Phe Leu Thr Val Cys Phe Pro Ala Tyr Lys Ala Leu20 25 30Ala Asp Ser Thr Ser Thr Glu Val Ile Val His Tyr His Arg Phe Asp35 40 45Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Asp Leu Trp Met Trp Pro Tyr Gln Pro Val50 55 60Asn Gly Ash Gly Ala Ala Tyr Glu Phe Ser Gly Lys Asp Asp Phe Gly65 70 75 80Val Lys Ala Asp Val Gln Val Pro Gly Asp Asp Thr Gln Val Gly Leu85 90 95Ile Val Arg Thr Asn Asp Trp Ser Gln Hys Asn Thr Ser Asp Asp Leu100 105 110His Ile Asp Leu Thr Lys Gly His Glu Ile Trp Ile Val Gln Gly Asp
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aatgaaattg cgaccgagcg tccgatggtc 1620caaaagttcg ttctggattc tgttaaatat tgggtaaagg aataccatat cgacggcttc 1680cgtttcgatc ttatggctct tttaggaaaa gacaccatgg ccaaaatatc aaaagagctt 1740catgctatta atcctggcat tgtcctgtat ggagaaccat ggactggcgg tacctctgga 1800ttatcaagcg accaactcgt tacgaaaggt cagcaaaagg gcttgggaat tggcgtattc 1860aacgataata ttcggaacgg actcgatggt aacgtttttg ataaatcggc acaaggattt 1920gcaacaggag atccaaacca agttaatgtc attaaaaata gagttatggg aagtatttca 1980gatttcactt cggcacctag cgaaaccatt aactatgtaa caagccatga taatatgaca 2040ttgtgggata aaattagcgc aagtaatccg aacgatacac aagcagatcg aattaagatg 2100gatgaattgg ctcaagctgt ggtatttact tcacaagggg taccatttat gcaaggtgga 2160gaagaaatgc tgcggacaaa aggcggtaat gataatagtt acaatgccgg ggatagcgtg 2220aatcagttcg attggtcaag aaaagcacaa tttgaaaatg tattcgacta ctattcttgg 2280ttgattcatc tacgtgataa tcacccagca ttccgtatga cgacagcgga tcaaatcaaa 2340caaaatctca ctttcttgga tagcccaacg aacactgtag catttgaatt aaaaaatcat 2400gccaatcatg ataaatggaa aaacattata gttatgtata atccaaataa aactgcacaa 2460actctcactc taccaagtgg aaattggaca attgtaggat taggcaatca agtaggtgag 2520aaatcactag gccatgtaaa tggcacggtt gaggtgccag ctcttagtac gatcattctt 2580catcagggta catctgaaga tgtcattgat caaaattaat attgattaag aaatgatttg 2640taaaacattt aagtccattt acacgggata ctgtgtaaat ggattttagt tttatccgta 2700gcatgtgtta aagaagtaaa tagtaaatgg caattt 273權利要求
1．一種親代澱粉脫支酶的基因工程變體，該酶變體在pH4-6的範圍內比所述的親代酶具有改善的熱穩定性。
2．權利要求1的酶變體，其中所述的酶是支鏈澱粉酶。
3．權利要求1的酶變體，其中所述的酶是異澱粉酶。
4．權利要求1-3中任意一項的酶變體，其中所述的酶變體具有由差示掃描量熱法(DSC)、使用本文所述的方法定義的改善的熱穩定性。
5．權利要求1-3中任意一項的酶變體，其中所述的酶變體具有由在本文所述的「液化的T1/2檢測試驗」中使用pH5.0和95℃的溫度條件下增加的半衰期(T1/2)來定義的改善的熱穩定性，所述的半衰期的增加至少約為5％、優選至少約為10％、更優選至少約為15％、更優選至少約為25％、最優選至少約為50％，諸如至少100％。
6．權利要求1-3中任意一項的酶變體，其中所述的酶變體具有由在本文所述的液化後殘餘活性的檢測試驗」中使用pH5.0和95℃的溫度條件下增加的殘餘酶活性來定義的改善的熱穩定性，所述的殘餘酶活性的增加至少約為5％、優選至少約為10％、更優選至少約為15％、更優選至少約為25％、最優選至少約為50％。
7．權利要求1-3中任意一項的酶變體，其中所述的酶變體具有由在本文所述的「糖化的T1/2檢測試驗」中使用pH4.5和70℃的溫度條件下增加的半衰期(T1/2)所定義的改善的熱穩定性，所述的半衰期的增加至少約為5％、優選至少約為10％、更優選至少約為15％、更優選至少約為25％、最優選至少約為50％，諸如至少100％。
8．權利要求1-3中任意一項所述的酶變體，其中所述的酶變體具有由在本文所述的「糖化後殘餘活性的檢測試驗」中使用pH4.5和63℃的溫度條件下增加的殘餘酶活性所定義的改善的熱穩定性，所述的殘餘酶活性的增加至少約為5％、優選至少約為10％、更優選至少約為15％、更優選至少約為25％、最優選至少約為50％。
9．權利要求8的酶變體，它在70℃的溫度下檢測時具有增加的殘餘酶活性。
10．一種親代澱粉脫支酶的基因工程變體，該酶變體對支鏈澱粉和/或糖原具有的活性比所述的親代酶增加。
11．權利要求10的酶變體，其中所述的親代酶是支鏈澱粉酶。
12．權利要求11的酶變體，其中所述的支鏈澱粉酶由下列屬的細菌產生芽孢桿菌屬、例如Bacillus acidopullulyticus或Bacillusderamificans；或熱球菌屬；或克雷白氏桿菌屬、例如肺炎克雷白氏桿菌或產氣克雷白氏桿菌。
13．權利要求10的酶變體，其中所述的親代酶是異澱粉酶，例如由下列屬的細菌產生的異澱粉酶假單胞菌屬、例如澱粉皮假單胞菌；或來自硫化葉菌屬、例如嗜酸熱硫化葉菌或硫磺礦硫化葉菌；或紅嗜熱鹽菌屬、例如海洋紅嗜熱鹽菌。
14．權利要求10-13中任意一項的酶變體，其中所述的酶變體進一步具有如權利要求1-9中任意一項所定義的改善的熱穩定性。
15．一種用於生產具有增加的熱穩定性的澱粉脫支酶變體的方法，該方法包括下列步驟-鑑定親一代澱粉脫支酶中與熱穩定性相關的一種或多種胺基酸殘基和/或胺基酸區；-通過親一代和親二代澱粉脫支酶的胺基酸序列對比來鑑定親二代澱粉脫支酶中的一種或多種同源胺基酸殘基和/或胺基酸區；和-使親二代澱粉脫支酶中的一種或多種同源胺基酸殘基和/或胺基酸區發生突變以便產生具有增加的熱穩定性的酶變體。
16．權利要求15的方法，其中通過使位於環中、優選位於環2或3中的同源胺基酸殘基和/或胺基酸區發生突變來獲得增加的熱穩定性。
17．權利要求15的方法，其中突變在至少一種相當於下列位置的胺基酸殘基上進行SEQ ID NO:1的369-397、419-458、484-525、553-568、582-608、613-616、661-670和708-739位；SEQ ID NO:2的465-493、515-554、580-621、649-664、680-711、714-717、757-765和804-834位；SEQ ID NO:3的176-195、218-257、283-334、359-381、395-413、416-419、461-470和537-568位；和SEQ ID NO:4的210-230、250-292、319-376、401-437、461-479、482-485、533-580和605-636位。
18．權利要求15的方法，其中通過用脯氨酸殘基取代至少一種非脯氨酸殘基來獲得增加的熱穩定性。
19．權利要求15的方法，其中通過將至少一個Gly置換成Ala來獲得增加的熱穩定性。
20．權利要求15的方法，其中通過用另一種胺基酸殘基置換至少一個Asn或Gln殘基來獲得增加的熱穩定性，所述的另一種胺基酸殘基優選一種選自Leu、Ile、Phe、Ala、Thr、Ser和Tyr組成的組的胺基酸殘基。
21．權利要求18-20中任意一項的方法，其中所述的置換在環3、5和/或6中進行。
22．一種用於生產具有可變的底物特異性的澱粉脫支酶變體的方法，該方法包括下列步驟-鑑定親一代澱粉脫支酶中與對所需底物具有的特異性相關的至少一種胺基酸環中的一種或多種胺基酸殘基；-通過親一代和親二代澱粉脫支酶的胺基酸序列對比來鑑定親二代澱粉脫支酶中至少一種相應的環中的一種或多種同源胺基酸殘基；和-使親二代澱粉脫支酶中至少一種環中的一種或多種同源胺基酸殘基發生突變以便產生具有改變的底物特異性的酶變體。
23．權利要求22的方法，其中突變在至少一種相當於下列位置的胺基酸殘基上進行SEQ ID NO:1的369-397、419-458、484-525、553-568、582-608、613-616、661-670和708-739位；SEQ ID NO:2的465-493、515-554、580-621、649-664、680-711、714-717、757-765和804-834位；SEQ ID NO:3的176-195、218-257、283-334、359-381、395-413、416-419、461-470和537-568位；和SEQ ID NO:4的210-230、250-292、319-376、401-437、461-479、482-485、533-580和605-636位。
24．權利要求22的方法，其中突變在環1、2、4、5和/或7中進行。
25．權利要求22-24中任意一項的方法，其中所述的突變是環轉移。
26．權利要求22-25中任意一項的方法，其中所述的親一代澱粉脫支酶是異澱粉酶而親二代澱粉脫支酶是支鏈澱粉酶。
27．權利要求22-26中任意一項的方法，其中所述的改變的底物特異性是對支鏈澱粉和/或糖原的增加的活性。
28．權利要求15-27中任意一項的方法，其中通過將親二代澱粉脫支酶的胺基酸序列與關鍵對比序列中的最為同源的序列進行序列對比來在親二代澱粉脫支酶中鑑定適合於突變的同源胺基酸殘基和/或胺基酸區；其中所述的關鍵對比序列包括至少兩種相關澱粉脫支酶的胺基酸序列的對比序列。
29．權利要求28的方法，其中的關鍵對比序列包括至少兩種選自SEQ ID NO1、2、3和4組成的組的胺基酸序列的對比序列。
30．權利要求15-29中任意一項的方法，其中在與本文表1中鑑定的相應的環同源的親二代澱粉脫支酶的至少一種環中進行親二代澱粉脫支酶的突變。
31．一種用於將澱粉轉化成一種或多種糖的方法，該方法包括使用至少一種如權利要求1-30中任意一項所定義的酶變體使澱粉脫支的步驟。
32．權利要求31的方法，其中澱粉的轉化包括使用至少一種如權利要求1-6中任意一項所定義的酶變體和至少一種α-澱粉酶在至少約95℃溫度下進行液化的步驟。
33．權利要求32的方法，其中所述的酶變體是支鏈澱粉酶或異澱粉酶。
34．權利要求31-33中任意一項的方法，其中澱粉的轉化包括使用至少一種如權利要求1-4或7-9中任意一項所定義的酶變體和至少一種葡糖澱粉酶在至少約63℃、優選至少約70℃溫度下進行糖化的步驟。
35．權利要求34的方法，其中所述的酶變體是支鏈澱粉酶。
全文摘要
本發明涉及一種親代澱粉脫支酶即支鏈澱粉酶或異澱粉酶的基因工程變體,所述的酶變體在pH為4－6的範圍內具有比親代酶改善的熱穩定性和/或比親代酶增加的對支鏈澱粉和/或糖原的活性;本發明涉及生產具有改善的熱穩定性和/或改變的底物特異性的這類澱粉脫支酶變體的方法並涉及一種使用至少一種這類酶變體將澱粉轉化成一種或多種糖的方法。
文檔編號C12N9/44GK1309701SQ9980808
公開日2001年8月22日 申請日期1999年7月2日 優先權日1998年7月2日
發明者H·比斯加德－法蘭參, A·斯萬德森 申請人:諾沃奇梅茲有限公司