一種連續色譜的方法及其設備與流程

2023-05-12 17:00:31

本發明涉及一種連續色譜的方法及其裝備，特別涉及一種多柱連續色譜的方法及其裝備。

背景技術：

色譜分離純化技術是獲得高純度化合物必備的重要手段。在所有分離純化技術中，色譜是產能最低、成本最高、操作人員素質要求高，操作精細、費時、耗力的技術。多年來，人們一直致力於提升色譜技術的產能、降低其成本，並使其操作簡單方便。

分離對象一般含有前雜、目標化合物和後雜。根據分離的難易，色譜分為置換色譜（displacementchromatography）和洗脫色譜（elutionchromatography）。置換色譜適於保留值與目標化合物保留值差異很大的雜質的分離，一般用於目標化合物的富集或初步純化。洗脫色譜適於目標化合物與相鄰雜質的精細分離。根據色譜過程的連續性，色譜又分為連續色譜（continuouschromatography）和單柱色譜（batchchromatography）。連續洗脫色譜又細分為模擬移動床（simulatedmovingbed，smb）和連續單柱色譜（continuousbatchchromatography，cbc）。相對而言，連續色譜具有更高的分離能力、更高的產能和更低的消耗。

smb技術由broughton博士首創，1961年美國油品公司（uop）公開了smb在石油化工上應用（美國專利2985589）。此後，smb技術得到不斷的完善提高【美國專利3706812、4157267、4267054、4293346、4312678、4313015、4332623、4359430、4379751、4402832、4412866、4461649、4533398、5064539、5127957、5387347、6331250、6896811、7229558、7479228、8282831、8496836等，其中值得關注的有varicol技術（wo-a-2004/039468）、powerfeed技術（journalofchromatographya,2003,1006:87-99）、modicon技術(wo2004/014511)和溶劑梯度模式（美國專利4031155）等】，使得smb成為應用最廣泛的色譜模式。

儘管有一次smb用於多組份混合物分離的報導（美國專利6331250、7479228和8282831等），但是，很難高產能地獲得高純度目標化合物，這類技術一般利用smb的強大產能對多組份混合物進行粗分離，以降低後續色譜的負荷、增強後續色譜的產能。原理上，smb僅適於2組份混合物的分離，當smb用於三組份混合物的分離時，要麼在同一裝置上分離兩次，要麼用2套smb裝置聯動。smb的產能一般為單柱色譜的2～10倍，連續單柱色譜的產能為單柱色譜的2～4倍。因而，對於多組份混合物的分離，smb不一定比連續單柱色譜更具優勢。對於某些2組份混合物的分離，連續單柱色譜比smb更具優勢。這激起了人們對連續單柱色譜的研究。

單柱色譜在一支滿足分離所需長度的色譜柱上依次進行上樣、洗脫前雜、洗脫目標化合物和洗脫後雜等操作。單柱色譜的填料利用率低、溶劑用量大、耗時長、產能低。可以在軟體的控制下，使上述單柱色譜過程自動連續進行。但是，此連續過程的產能取決於進樣頻率，而進樣頻率由多組份混合物的總峰寬度決定（前一樣品的後雜不能疊蓋後一樣品的目標峰，後一樣品的前雜不能疊蓋前一樣品的目標峰）。因而，這種連續單柱色譜對單柱色譜的缺陷沒有本質性改善。

snyder等（美國專利4204952，1980年）將一短一長兩支色譜柱組成分離所需長度的色譜柱，在短柱上除去大量的前雜和後雜，經過粗分的目標混合物再由長柱進行精細分離；由此極大地降低了總峰寬度、提高了進樣頻率、增強了色譜分離能力，使產能提高了一倍以上。該技術裝備簡單，可以使用兩種不同分離特性的填料。但是，在短柱和長柱上所進行的上樣、洗脫前雜、洗脫目標化合物和洗脫後雜等操作仍然依次進行，耗時仍然較長，產能提升的空間有限。

aumann等（美國專利8496836，2013年）構建一個多柱系統，系統分為5個區：上樣除前雜區，分離區，目標化合物洗脫區，目標化合物-後雜混合物洗脫區和後雜洗脫區。其特點是，上樣除前雜、分離、目標化合物洗脫、目標化合物-後雜混合物洗脫和後雜洗脫等在不同的區同時進行，降低了色譜過程所需時間。但是，該技術中，進入分離區的樣品僅僅除去了大量前雜，沒有除去後雜，對總峰寬度和色譜負荷的降低有限，對進樣頻率、分離能力和產能的提升不顯著。該技術裝備相對複雜，並且不能使用兩種不同分離特性的填料。

綜上所述，分離領域迫切需求進樣頻率更高、分離能力更強的連續單柱色譜方法與裝備，以進一步提高產能、降低成本。

技術實現要素：

針對上述問題，本發明的目的在於提供一種進樣頻率更高、分離能力更強的連續單柱色譜方法與裝備，可進一步提高產能、降低成本。

為實現上述目的，本發明採用以下技術方案：由多支短色譜柱構建連續色譜系統，該系統分為兩大區：粗分離區和精分離區。粗分離區由五個亞區組成：上樣區、去前雜區、去後雜1區、樣品洗脫區、去後雜2區，依次定義為ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ和ⅴ區。精分離區由兩個亞區組成：精分離區和樣品洗脫區，依次定義為ⅵ和ⅶ區。亞區由1～n（n=1、2、3、4、5、6或7）支色譜柱串聯構成，色譜柱與色譜柱之間由管道或/和閥門接口連接；在該系統上的色譜方法為：多組份樣品在ⅰ區脈衝進樣；一次進樣後，經閥門切換，ⅰ區末柱進位為ⅱ區首柱，在ⅱ區除去前雜（將目標化合物洗脫至剛穿透ⅱ區）；經閥門切換，ⅱ區末柱進位為ⅳ區首柱，樣品在ⅳ區將目標化合物洗脫至剛好完全進入ⅳ區末柱；在ⅲ和ⅴ區除去後雜；經閥門切換，ⅳ區末柱進位為ⅵ區首柱，樣品在ⅵ區進行精細分離（將目標化合物洗脫至剛穿透ⅵ區）；經閥門切換，ⅵ區末柱進位為ⅶ區首柱，在ⅶ區洗脫分段收集目標化合物和含有少量後雜的目標化合物；上述方法通過閥門切換、泵的啟停或/和流速調控等智能控制實現。

本發明所提供的上述方法及其裝備中，採用同一幾何尺寸的的色譜柱。所述色譜柱的直徑為10～2000mm，色譜柱直徑大小直接決定產能的高低。各亞區色譜柱的總長度與各亞區的職能相關，主要由樣品屬性、填料屬性和填料粒度決定，柱長與填料粒度呈反比關係，並受均一性裝填技術的影響；亞區內色譜柱的長度為50～600mm，最短柱長應能容納一次上樣量內所有的目標化合物。

本發明所提供的上述方法及其裝備中，所述色譜柱可以都裝填同一種填料，也可以粗分離區內的色譜柱都裝填一種填料，精分離區內的色譜柱都裝填另一種填料，如粗分離區內色譜柱裝填填料的吸附性能為：a＜b＜c，精分離區內色譜柱裝填填料的吸附性能為：a＜c＜b。

本發明所提供的上述方法及其裝備中，所述閥門為多流路旋轉閥、單流路多口旋轉閥或/和截止閥，其中以多流路旋轉閥最為簡潔。

本發明所提供的上述方法及其裝備中，所述色譜柱之間的連接方式為：閥體-閥接口-色譜柱-閥接口-閥體-閥接口-色譜柱-閥接口-閥體-，或閥體-閥接口-色譜柱-管道-(色譜柱)n-管道-色譜柱-閥接口-閥體-。當亞區色譜柱的連接方式為：閥體-閥接口-色譜柱-管道-(色譜柱)n-管道-色譜柱-閥接口-閥體時，首柱與末柱之間的n支色譜柱不參與色譜柱循環；此時n支短色譜柱可用一支等長的長色譜柱替代。

本發明所提供的上述方法及其裝備中，所述多組份樣品最少包括1個前雜a、1個後雜c和1個目標化合物b共3個組份。

本發明所提供的上述方法及其裝備中，所述脈衝進樣的頻率與閥門切換頻率相等，進樣一次，切換一次，或切換一次，進樣一次。

本發明所提供的上述方法及其裝備中，洗脫各區的流動相可以相同，也可以不相同，流動相可以是等度的，也可以是線性、擬線性或非線性的。

本發明所提供的上述方法及其裝備，可根據具體分離對象進行多種適應性修改，如：將ⅰ區與ⅱ區合併、省去ⅲ區、ⅶ區與ⅱ區有連通管道（用於循環含少量後雜的目標化合物）、ⅶ區採用逆流洗脫，以及將粗分離區與精分離區構建為兩套獨立的系統，兩套系統通過同步聯動實現分離過程等。

本發明由於採取以上技術方案，其具有以下優點：1、多組份樣品在粗分離區除去大量的前雜和後雜後，再經精分離區進行精細分離，由此極大地降低了精分離區色譜負荷和總峰寬度、增強了色譜分離能力、提高了進樣頻率、提高了產能；2、粗分離區和精分離區的各色譜過程在各自不同的亞區同時進行，進一步降低了色譜過程所需時間，提升了產能；3、粗分離區和精分離區可使用分離屬性不同的填料，可進一步提升色譜的分離能力。

本發明提供了一種進樣頻率更高、分離能力更強的連續單柱色譜方法與裝備，可進一步提高產能、降低成本，可滿足分離領域的切實需求。

附圖說明

圖1是本發明所提供方法及其裝備的結構與色譜過程的原理示意圖；

圖2是本發明所提供的10位7流路旋轉閥-12柱-1填料系統的結構與色譜過程的示意圖；

圖3是本發明所提供的12位7流路旋轉閥-12柱-2填料系統的結構與色譜過程的示意圖；

圖4是本發明所提供的8位6流路旋轉閥-8柱-2填料系統的結構與色譜過程的示意圖；

圖5是本發明所提供的單流路旋轉閥（截止閥組）-8柱-2填料系統的結構與色譜過程的示意圖；

圖6是本發明所提供的單流路旋轉閥（截止閥組）-12柱-1填料系統的結構與色譜過程的示意圖；

圖7是本發明所提供的單流路旋轉閥-截止閥-12柱-1填料系統的結構與色譜過程的示意圖。

具體實施方式

下面結合附圖和實施例對本發明進行詳細的描述。

實施例一

如圖1所示，本實施例所提供的裝備系統由1個12位7流路旋轉閥、12支裝填同一種填料的色譜柱、7臺泵、2個檢測器和1個收集器構建，該系統分為兩大區：粗分離區和精分離區。粗分離區由五個亞區組成：上樣區（1號柱）、去前雜區（2和4號柱）、去後雜1區（3號柱）、樣品洗脫區（5和7號柱）、去後雜2區（6號柱），依次定義為ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ和ⅴ區（虛線框）。精分離區由兩個亞區組成：精分離區（8、9、10和11號柱）和樣品洗脫區（12號柱），依次定義為ⅵ和ⅶ區。亞區由1～4支色譜柱串聯構成，色譜柱與色譜柱之間由管道通過閥門的接口連接。7臺泵獨立輸送多組份樣品液f和6種流動相s2～s7。6種流動相可以全部或部分相同，也可以完全不同；流動相可以是等度的，也可以是線性、擬線性或非線性的。ⅱ區4號柱出口端與檢測器相連，以檢測器信號控制流動相s2供液泵的啟動與停止。ⅵ區11號柱出口端與檢測器相連，以檢測器信號控制旋轉閥的切換。ⅰ區進樣泵和ⅳ區流動相s4的供液泵為定時啟停控制。ⅶ區12號柱出口端與收集器相連，收集器採用定時收集控制。該系統適於多組份樣品的分離。

在該系統上的色譜方法為：多組份樣品f在ⅰ區脈衝進樣，進樣頻率與閥門切換頻率相等，進樣一次，切換一次；一次進樣後，經閥門切換，ⅰ區1號柱進位為ⅱ區2號柱，在ⅱ區由流動相s2洗脫除去前雜（將目標化合物洗脫至剛好穿透4號柱）；經閥門切換，ⅱ區4號柱進位為ⅳ區5號柱，在ⅳ區由流動相s4將目標化合物洗脫至剛完全進入7號柱；經閥門切換，ⅳ區7號柱進位為ⅵ區8號柱，樣品在ⅵ區由流動相s6洗脫經過8號、9號、10號和11號柱進行精細分離（將目標化合物洗脫至剛穿透11號）；經閥門切換，ⅵ區11號柱進位為ⅶ區12號柱，在ⅶ區由流動相s7洗脫，並分段收集目標化合物和含有少量後雜的目標化合物；在ⅲ和ⅴ區分別由流動相s3和流動相s5除去後雜。上述方法通過旋轉閥沿虛線箭頭方向的步進切換而實現，步進步幅為30°，色譜柱在12支色譜柱上循環，如首次切換後：ⅰ區為12號柱，ⅱ區為1號和3號柱，ⅲ區為2號柱，ⅳ區為4號和6號柱，ⅴ區為5號柱，ⅵ區為7號、8號、9號和10號柱，ⅶ區為11號柱。在該系統上，粗分離區和精分離區各色譜過程在各亞區內同時進行。

實施例二

圖2所示的本實施例同樣是由12支裝填同一種填料的色譜柱所構建的系統，其結構與實施例一所提供系統基本相同，色譜方法和功能與實施例一所提供系統完全相同，它們的差異為：1、本實施例用1個10位7流路旋轉閥構建系統，閥位比實施例一少2位；2、ⅵ區4支色譜柱中，中間2支（62和63）與首柱和末柱串聯，置於閥外，不佔閥位，不參與色譜柱循環；3、本實施例的步進步幅為36°。

本實施例所提供的裝備系統的特徵在於：節約閥位可降低旋轉閥直徑；閥外2支短色譜柱可用一支等長色譜柱替代。

實施例三

如圖3所示，本實施例所提供的裝備系統由1個12位7流路旋轉閥、12支色譜柱、7臺泵、2個檢測器和1個收集器構建；該系統分為兩大區：粗分離區和精分離區。粗分離區由五個亞區組成：上樣區（1號柱）、去前雜區（2和4號柱）、去後雜1區（3號柱）、樣品洗脫區（5和1』號柱）、去後雜2區（6號柱），依次定義為ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ和ⅴ區（虛線框）。精分離區由兩個亞區組成：精分離區（2』、3』、4』和5』號柱）和樣品洗脫區（6』號柱），依次定義為ⅵ和ⅶ區。亞區由1～4支色譜柱串聯構成，色譜柱與色譜柱之間由管道通過閥門的接口連接。7臺泵獨立輸送多組份樣品液f和6種流動相s2～s7。6種流動相可以全部或部分相同，也可以完全不同；流動相可以是等度的，也可以是線性、擬線性或非線性的。ⅱ區4號柱出口端與檢測器相連，以檢測器信號控制流動相s2供液泵的啟動與停止。ⅵ區5』號柱出口端與檢測器相連，以檢測器信號控制旋轉閥的切換。ⅰ區進樣泵和ⅳ區流動相s4的供液泵為定時啟停控制。ⅶ區6』號柱出口端與收集器相連，收集器採用定時收集控制。該系統適於多組份樣品的分離。

在該系統上的色譜方法為：多組份樣品f在ⅰ區脈衝進樣，進樣頻率與閥門切換頻率相等，進樣一次，切換一次；一次進樣後，經閥門切換，ⅰ區1號柱進位為ⅱ區2號柱，在ⅱ區由流動相s2洗脫除去前雜（將目標化合物洗脫至剛好穿透4號柱）；經閥門切換，ⅱ區4號柱進位為ⅳ區5號柱，在ⅳ區由流動相s4將目標化合物洗脫至剛完全進入1』號柱；經閥門切換，ⅳ區1』號柱進位為ⅵ區2』號柱，樣品在ⅵ區由流動相s6洗脫經過2』號、3』號、4』號和5』號柱進行精細分離（將目標化合物洗脫至剛穿透5』號）；經閥門切換，ⅵ區5』號柱進位為ⅶ區6』號柱，在ⅶ區由流動相s7洗脫，並分段收集目標化合物和含有少量後雜的目標化合物；在ⅲ和ⅴ區分別由流動相s3和流動相s5除去後雜。上述方法通過旋轉閥沿虛線箭頭方向的步進切換而實現，步幅為60°。如首次切換後：ⅰ區為6號柱，ⅱ區為1號和3號柱，ⅲ區為2號柱，ⅳ區為4號和6』號柱，ⅴ區為5號柱，ⅵ區為1』號、2』號、3』號和4』號柱，ⅶ區為5』號柱。在該系統上，粗分離區和精分離區各色譜過程在各亞區內同時進行。

本實施例所提供裝備系統的構件、分區、亞區數以及亞區內色譜柱數和系統運行模式都與實施例一相同，它們的差異為：1、本實施例使用2種不同的填料，1～6號柱用一種填料，1』～6』號柱用另一種填料；2、兩種不同填料的色譜柱相間分布；3、本實施例的步進步幅為60°。本實施例所提供裝備系統的特徵在於：色譜柱的循環僅在填料相同的柱上進行。

實施例四

如圖4所示，本實施例所提供的裝備系統由1個8位6流路旋轉閥、8支色譜柱（裝填2種不同的填料，1～4號柱用一種填料，1』～4』號柱用另一種填料）、6臺泵、2個檢測器和1個收集器構建；該系統分為兩大區：粗分離區和精分離區。粗分離區由五個亞區組成：上樣區（1號柱）、去前雜區（2號柱）、樣品洗脫區（3和1』號柱）、去後雜區（4號柱），依次定義為ⅰ、ⅱ、ⅲ和ⅳ區（虛線框）。精分離區由兩個亞區組成：精分離區（2』和3』號柱）和樣品洗脫區（4』號柱），依次定義為ⅴ和ⅵ區。亞區由1～2支色譜柱串聯構成，色譜柱與色譜柱之間由管道通過閥門的接口連接。6臺泵獨立輸送多組份樣品液f和5種流動相s2～s6。5種流動相可以全部或部分相同，也可以完全不同；流動相可以是等度的，也可以是線性、擬線性或非線性的。ⅱ區2號柱出口端與檢測器相連，以檢測器信號控制流動相s2供液泵的啟動與停止。ⅴ區3』號柱出口端與檢測器相連，以檢測器信號控制旋轉閥的切換。ⅰ區進樣泵和ⅲ區流動相s3的供液泵為定時啟停控制。ⅵ區4』號柱出口端與收集器相連，收集器採用定時收集控制。該系統適於後雜量少或無後雜的樣品分離（一般經過smb粗分離的樣品，或置換色譜初步純化後再經結晶等非色譜技術處理後樣品）。

在該系統上的色譜方法為：多組份樣品f在ⅰ區1號柱脈衝進樣，進樣頻率與閥門切換頻率相等，進樣一次，切換一次；一次進樣後，經閥門切換，ⅰ區1號柱進位為ⅱ區2號柱，在ⅱ區由流動相s2洗脫除去前雜（將目標化合物洗脫至剛好穿透2號柱）；經閥門切換，ⅱ區2號柱進位為ⅲ區3號柱，在ⅲ區由流動相s3將目標化合物洗脫至剛完全進入1』號柱；經閥門切換，ⅲ區1』號柱進位為ⅴ區2』號柱，樣品在ⅴ區由流動相s5洗脫經過2』號和3』號柱進行精細分離（將目標化合物洗脫至剛穿透3』號柱）；經閥門切換，ⅴ區3』號柱進位為ⅵ區4』號柱，在ⅵ區由流動相s6洗脫，並分段收集目標化合物和含有少量後雜的目標化合物；在ⅳ由流動相s4洗脫除去後雜。

上述方法通過旋轉閥沿虛線箭頭方向的步進切換而實現，步幅為90°，色譜柱循環僅在填料相同的柱上進行。如首次切換後：ⅰ區為4號柱，ⅱ區為1號柱，ⅲ區為2號和4』號柱，ⅳ區為3號柱，ⅴ區為1』號和2』號柱，ⅵ區為3』號柱。在該系統上，粗分離區和精分離區各色譜過程在各亞區內同時進行。

實施例五

本實施例是由截止閥或一種單流路多口旋轉閥構建與實施例四相同的系統。本實施例所提供的色譜系統的構件為：8支色譜柱（裝填2種不同的填料，1～4號柱用一種填料，1』～4』號柱用另一種填料）、6臺泵、2個檢測器和1個收集器、截止閥60隻，12件5通，4件4通，或12隻4進1出旋轉閥和4隻3進1出旋轉閥；即用60隻截止閥、12件5通和4件4通，或12隻4進1出旋轉閥和4隻3進1出旋轉閥替代實施例四中的1個8位6流路旋轉閥。60隻截止閥、12件5通和4件可構建4進1出（也可視為1進4出）閥閥組12組，3進1出（也可視為1進3出）閥閥組4組。4進1出閥閥組和3進1出閥閥組分別與4進1出旋轉閥和3進1出旋轉閥功能相同。

上述構件按圖5可構建成本實施例所提供的色譜系統，該系統的功能和色譜方法與施例四所提供的相同，其區別在於切換方法不同：1、本實施例所提供的色譜系統是通過截止閥的「開」「閉」實現切換，如圖5中開啟態閥門整體由右向左步進1位，便實現子色譜柱的步進切換；2、本實施例所提供的色譜系統可視為兩套獨立的系統，兩套系統通過同步聯動實現分離過程。

實施例六

本實施例是由截止閥或一種單流路多口旋轉閥構建與實施例一相同的系統。本實施例所提供的色譜系統的構件為：12支色譜柱（裝填同種填料）、7臺泵、2個檢測器和1個收集器、截止閥192隻，12件8通，12件10通，或12隻7進1出旋轉閥和12隻1進9出旋轉閥；即用192隻截止閥、12件8通和12件10通，或12隻7進1出旋轉閥和12隻1進9出旋轉閥替代實施例一中的1個12位7流路旋轉閥。192隻截止閥、12件8通和12件10通，可構建7進1出（也可視為1進7出）閥閥組12組，1進9出（也可視為9進1出）閥閥組12組。7進1出閥閥組和1進9出閥閥組分別與7進1出旋轉閥和1進9出旋轉閥功能相同。

由上述構件按圖6構建成本實施例所提供的色譜系統，該系統的功能和色譜方法與施例一所提供的相同，其區別在於切換方法不同：本實施例所提供的色譜系統是通過截止閥的「開」「閉」實現切換，如圖6中開啟態閥門整體由右向左步進1位，便實現子色譜柱的步進切換。

實施例七

本實施例是由另一種單流路多口旋轉閥構建與實施例一相同的系統。本實施例所提供的色譜系統的構件為：12支色譜柱（裝填同種填料）、7臺泵、2個檢測器和1個收集器、14隻12進1出旋轉閥、24件13通和12隻2進1出閥；即用14隻12進1出旋轉閥、24件13通和12隻2進1出閥替代實施例一中的1個12位7流路旋轉閥。

7隻12進1出旋轉閥與12件13通按相同順序同位並聯（如7隻閥的1號位由左至右接口按f、s2、s3、s4、s5、s6、s7的順序與一個13通並聯，7隻閥的2號位由左至右接口按f、s2、s3、s4、s5、s6、s7的順序與第二個13通並聯），將7隻閥的84個通路並聯12個通路，構成一個大閥組。14隻12進1出旋轉閥與24件13通可構建成2個大閥組。

2個大閥組、12隻2進1出閥和上述其它構件按圖7便可構建成本實施例所提供的色譜系統。該色譜系統的功能和色譜方法與施例一所提供的相同，其區別在於切換方法不同：本實施例所提供的色譜系統是通過截止閥的「開」「閉」實現切換，如圖7中開啟態閥門整體由右向左步進1位，便實現子色譜柱的步進切換。

本發明僅以上述實施例進行說明，本發明所提供裝備的構建和色譜過程的實施方法都是可以有所變化的。在本發明技術方案的基礎上，凡根據本發明原理對裝備構建和實施方法進行的改進或等同變換，均不應排除在本發明的保護範圍之外。