重金屬整治系統的製作方法

2023-05-12 22:40:26 3

專利名稱：重金屬整治系統的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於產生耐受包括汞、鉛、鋅和鎘的重金屬且能夠螯合和累積這些重金屬的基因修飾細菌以用於生物整治(bioremediation)受汙染液體和固體的分子生物學領域。背景描述具有相對高的密度的金屬化學元素常常被稱為重金屬。重金屬甚至在低濃度下是有毒的。有毒的重金屬包括汞、鎘、鉛、鋅和銀。在重金屬當中，汞、鉛和鎘被認為是特別有毒的。汞已經作為工業過程和天然過程的副產物被引入環境中且可以高的濃度累積在土壤和沉積物中。Patra,M.和 Sharma A. ,Bot. Rev. 66 =379-422(2000)。在美國，燃煤發電廠每年放出約48噸的汞，而在亞洲和非洲，燃煤發電廠每年釋放多於1500噸。2009年2月8日檢索的CleanAir Mercury Rule (清潔空氣萊規則).美國環境保護局(「EPA」) 2009, www.epa. gov/air/mercuryrule/basic. htm。全世界每年來自所有源的萊排放估計在4800-8300噸。2009 年 2 月 8 日檢索的Mercury Human Exposure (萊人類暴露)，EPA 2008, www. usepa.gov/mercury/exposure, htm。汞化合物是神經毒素和電子在細胞中運輸的強力阻斷劑。所有的汞形式是有毒的並對人類健康和對環境帶來風險。開發成本有效的和高效的整治系統是極其重要的。當前從環境清潔汞的整治策略包括衝洗、化學還原/氧化、挖掘、回收和廠外處置。這些方法是成本高的、環境破壞性的和無效的。Karenlampi, S.等人，Environ.Pollut. 1007 =225-231 (2000)。其他方法例如玻璃化和混凝土覆蓋使得該地方不能用且對於整治大面積是不切實際的。用當前技術從環境整治一磅汞的成本是數千美元。Hussein，H.等人，Env. Sci. Technol. 41 :8439-8446(2007)。與汞一樣，其他重金屬例如鉛和鎘帶來嚴重的環境威脅且必須被整治。鉛是可以累積在軟組織和骨中的強力的神經毒素。因為其毒性，鉛已經被EPA和其他機構禁止進入消費者產品中，包括油漆、汽油、水管、玩具以及其他的。EPA將飲用水中的鉛含量限制為小於0. 015ppm。鉛在2007綜合環境反應、補償和責任法(Comprehensive EnvironmentalResponse Compensation, and Liability Act, CERCLA)危險物質的優先級表中排在第二。當前在多個消費者應用中，尤其在電池中廣泛使用鎘已經增加了該重金屬的環境汙染。鎘已經被表明是高毒性的，造成嚴重的中毒、骨退化、細胞酶抑制和細胞膜破壞。如在汞的情況一樣，當前的整治或捕獲鉛和鎘的方法依賴於使用物理化學方法，包括使用離子交換樹脂、沉澱和提取、埋藏、原地覆蓋和廠外處置。Kim，S.等人.J. Biosci. Bioeng. 99 109-114(2005)。這些方法是成本高的和/或對正被主張保護的環境是破壞性的。需要新的技術來促進被汙染環境的整治。使用有機體來整治被汙染環境的生物整治可以提供潛在低的成本和環境友好的方法。例如，細菌可以將某些有毒化合物分解為它們的無毒代謝物。然而，重金屬元素例如汞、鎘和鉛不能被解毒為無毒代謝物。通過揮發汞的汞生物整治方法依賴於mer操縱子的表達，mer操縱子管理Hg2+的運輸和還原。mer操縱子基因之一，merA，編碼汞離子還原酶，該酶是催化Hg2+至Hg°的轉化的酶。Hgci是低揮發性的、低反應性和低毒性形式的萊。Jackson, ff. J.和Summers, A. 0.,J. Bacteriol. 151 :962-970 (1982)。然而，在揮發過程中，元素汞釋放到環境中，在環境中它可以被轉化為毒性更大的形式。揮發方法的另一個缺點是其不適合於水處理，因為細菌將揮發的元素汞釋放到正被整治的相同的水中。細菌並不具有在允許汞在細胞內部累積的同時提供對汞的高抗性的內源性機制。 基因工程已經用於將來自其他有機體的基因與增加汞抗性和累積的目標結合。已知為螯合劑(chelator)或螯合劑(sequestration agent)的分子已經被提出作為合適的重金屬清除劑，其可以在有機體內被表達，目標是從土壤或水回收重金屬。細菌系統中的金屬硫蛋白和多磷酸鹽(polyphosphate)已經被包含在一些重金屬的解毒中。在大腸桿菌中被表達的這兩種物質可以螯合汞、鎘和鉛，且因此保護細菌免於某些水平的這些重金屬元素。然而，至今結果是令人氣餒的。細菌不能夠有效地螯合這些元素且並不經受得住高水平的這些重金屬。這些結果歸因於螯合劑蛋白劑的穩定性的察覺到的缺乏，產生具有對重金屬弱的耐受性的細菌系統。金屬硫蛋白被哺乳動物、植物和真菌中存在的mt基因編碼。Sousa，C.等人，J. Bacteriol. 180 :2280-2284(1998)。然而，已經表明金屬硫蛋白(MT)當在細菌中被表達時是不穩定的。Berka，T.等人，J. Bacteriol. 170 :21_26 (1988)。因為發現MT蛋白當在細菌中被表達時是不穩定的，所以mt基因已經與穩定劑例如穀胱甘肽-S-轉移酶(GST)融合，產生GST-MT 融合。Chen，S.和 Wilson D. B. ,Appl. Env. Microbiol. 63 :2442-2445 (1997)。各種GST-MT構建體包括釀酒酵母(GST-YMT)、人類(GST-HMT)和豌豆(pea) (GST-PMT)。含有GST-HMT的細胞沒有被表明為產生可溶的MT蛋白，且該構建體並不賦予對汞的任何抗性。表達YMT和PMT構建體的細胞已經被表明耐受具有至多5 u M汞的液體，至多5 u M汞是幾乎無毒的水平。更重要地，表達這兩個構建體的細胞看來並不累積汞或保護細胞免於汞，除非細胞還工程化為表達mer操縱子的汞轉運基因。也已經進行各種不成功的嘗試來工程化靶向細菌周質的粗糙脈孢菌(N.crassa)的mt基因和其他人類mt基因的多個拷貝。然而，這些蛋白的不穩定性和不溶性已經不斷阻止它們用作有效的整治劑。Valls，M.和Lorenzo，V. , FEMS Micro. Reviews，26 :327-338(2002)。雖然這些融合蛋白賦予對於汞的某些有限的耐受性，但該效應並不能明確地歸因於MT蛋白，因為還已知GST，即融合配偶體，結合重金屬例如萊。Chen, S.和 Wilson D. B. , Appl. Environ. Microbiol. 63 :2442-2445 (1997)；Deng, X.和 Wilson D.B., Appl. Microbiol. Biotechnol. 56 :276-279 (2001) ；Custodio,
H.M.等人，Arch. Environ. Occup. Health 60:17-23(2005)。因此，已經推斷出，用金屬硫蛋白基因修飾的轉基因細菌在細胞中沒有提供足夠的抗性。Beattie, J. H.等人，Toxicol. Lett. 157 :69-78(2005) ；Odawara, F.等人，J. Biochem. 118 :1131-1137(1995) ；Park, J. D.等人，Toxicology. 163 :93-100(2001)。對該失敗給出的解釋包括小的金屬硫蛋白肽被細胞蛋白酶快速降解、低的蛋白收率和可能的對細胞溶質中的氧化還原路徑的幹擾。Sousa，C.等人，J. Bacteriol. 180 :2280-2284(1998)；Yang, F.等人，Protein Expr. Purif. 53 :186-194 (2007)。並且，用金屬硫蛋白基因工程化細菌以增強對鋅的抗性的嘗試已經證明是無效的。Odawara, F.等人，同上。在細菌中表達的金屬硫蛋白融合基因已經顯示僅僅提供對鎘毒性的臨界耐受性，最多 50mg/ 升(約 150 u M)。Odawara, F.等人，同前；Keasling, J. D.，和 Hupf, G. A. AppliedEnv. Microbiol. 62 :743-746 (1996)。這些研究並不表明細菌可以在高的鎘濃度中生長良好，這是因為在50mg/L的鎘之後，轉基因細胞與在沒有鎘的培養基(media)中生長的轉基因細胞相比生長顯著降低。其他人關注於工程化多磷酸鹽激酶(polyphosphate kinase,「ppk」)基因以在細 菌中表達。PPk酶負責已知吸收(螯合)汞的正磷酸鹽的長線型聚合物的合成。與mt相似，僅ppk融合構建體已被提出和利用。例如，產氣克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes)ppk基因已經與假單胞菌衍生的merT和merP基因融合。merT和merP基因促進萊的內在化。融合意味著提高穩定性，且選擇融合組分部分是由於相信汞內在化將被限制，這還將限制表達PPk基因的細菌的生物整治效果。Pan-Hou, H.等人，Biol. Pharm. Bull. 24 1423-1426(2001) ；Pan-Hou, H.等人，FEMS Microbiol. Lett. 10325 :159-164 (2002)。表達這些構建體的細菌能夠從溶液累積高達16 y M汞和24 ii M的有機汞化合物。在元素汞的存在下的細菌生長在16 ii M汞時被完全破壞。當將表達構建體的工程化的細菌放在海藻酸鹽珠上時，已經顯示出增加的對萊的抗性。然而，萊整治失效，且細菌在40-80 ii M萊的存在下喪失生活力。Kyono, M.等人，Appl. Microbiol. Biotechnol. 62 :274-278 (2003)。植物整治和真菌整治(非工程化的有機體)已經成為試圖通過使鉛累積在根或葉中來生物整治鉛的方法。Huang, L. Z.等人，Biodegradation 20:651-660(2009) ；Vimala,R.和Das, N.，J. , Hazard. Mat. 168 :376-382(2009)。現今沒有提出對於鉛的有效的細菌生物整治技術。由上述系統實現的工程化的細菌對重金屬的低的抗性水平排除了它們作為有效的生物整治系統的應用。甚至在具有低的汞濃度的水中，這些系統將不是有效的，因為汞將以高於由系統耐受的濃度的濃度累積在細胞內。發明概述在本發明的一個方面，本發明提供了一種用於表達細菌中的重金屬螯合基因的載體，其包括以下功能連接的元件載體骨架，轉錄組成型啟動子序列,其源自質體16S rrn基因，翻譯增強子元件序列，其源自噬菌體17基因10，螯合劑的編碼序列，其中載體是在細菌中。在一個優選的實施方式中，載體還包括3』UTR不依賴P因子的翻譯終止子。優選地，3』 UTR是質體rpsl6轉錄終止子或大腸桿菌rrnB轉錄終止子。更優選地，3』 UTR是質體rpsl6轉錄終止子。在另一個實施方式中，螯合劑由mt、ppk或半乳糖苷酶(IacZ)基因編碼,且基因在細菌中被表達。根據一個實施方式，螯合劑是由PPk合成的多磷酸鹽，且細菌抵抗高達約100 PM汞、至少約IOOOii M鋅、至少約250 ii M鎘或至少約3，OOOii M鉛。在又一個實施方式中，mt基因是哺乳動物金屬硫蛋白。更優選地，螯合劑由小鼠mtl基因序列編碼，且細菌抵抗高達約160 ii M汞、至少250 ii M鎘、1,000 ii M鋅或3，OOOii M鉛。在還另一個實施方式中，螯合劑由￠-半乳糖苷酶(IacZ)基因序列編碼，且細菌抵抗高達約140 u M汞和至少250 ii M鎘、1，000 ii M鋅或3，000 y M鉛。在還另外的另一個實施方式中，載體骨架是質粒骨架。
在另一個方面，本發明提供了一種包括轉基因螯合劑的細菌，其中細菌抵抗在至少約25 ii M和至少約IOOii M之間的Hg。在一個優選的實施方式中，螯合劑基因從強啟動子轉錄，並側翼為選定的5』UTR和任選的選定的3』UTR，例如至少在4，000和8，500拷貝之間的穩定的轉錄物每ng總mRNA對應於螯合劑基因，更優選地在6，000和7，500拷貝之間的穩定的轉錄物每ng總mRNA對應於螯合劑基因。在還更優選的實施方式中，螯合劑基因從源自質體16S rrn基因的轉錄組成型啟動子序列轉錄，螯合劑基因側翼為源自噬菌體T7基因10的5』UTR翻譯增強子元件序列。仍還更優選地，螯合劑基因從源自質體16S rrn基因的轉錄組成型啟動子序列轉錄，且側翼為源自噬菌體17基因10的5』 UTR轉錄增強子元件序列和質體rpsl6基因3』 UTR不依賴P因子的翻譯終止子序列。在一個優選的實施方式中，螯合劑編碼序列對應於mtl基因，且細菌抵抗高達約160 u M汞或抵抗至少約250 ii M鎘、1，000 ii M鋅或3，000 y M鉛。在另一個優選的實施方式中，螯合劑編碼序列對應於P -gal ( ^ -半乳糖苷酶/IacZ)基因，且細菌抵抗高達約140 U M汞或抵抗至少約250 ii M鎘、1，000 ii M鋅或3，000 y M鉛。在還另一個優選的實施方式中，螯合劑編碼序列對應於P-gal基因，且細菌抵抗高達約140 ii M汞或抵抗至少約1，OOOii M鋅或3，000 y M鉛。在仍還另一個優選的實施方式中，螯合劑編碼序列對應於ppk基因，且其中細菌抵抗約250 ii M鎘、1，000 ii M鋅或3，000 y M鉛。在另外的實施方式中，細菌包括功能上連接於轉基因表達系統的mt、ppk或^ -gal基因序列，所述系統還包括轉錄組成型啟動子,其源自質體16S rrn基因，翻譯增強子元件，其源自噬菌體17基因10，和不依賴P因子的轉錄終止子序列。在還另外的實施方式中，細菌當在包含汞、鎘、鋅或鉛的液體環境中時，累積汞、鋪、鋒或鉛且在萊的存在下在著色上變深。在還又一實施方式中，細菌當在包含汞、鎘、鋅或鉛的液體環境中時，累積汞、鎘、鋅或鉛，且細菌形成聚集體和沉澱物。在不同的還又一實施方式中，細菌當在包含汞的液體環境中時，累積汞，且細菌形成聚集體和沉澱物。根據一個實施方式，細菌是大腸桿菌、假單胞菌(Pseudomonas)、藍細菌(Cyanobacteria)或芽抱桿菌(Bacillus)。在不同的實施方式中，當包括mt、ppk或P -gal基因序列的細菌在生物過濾器上生長時，其可以從受汙染液體除去重金屬。且其被便利地處理，例如從液體除去。在另一個不同的實施方式中，半乳糖苷酶裂解5-溴-4-氯-3-吲哚基-P-D-吡喃半乳糖苷(X-gal)的能力由於重金屬的存在而與重金屬的濃度按比例地降低。在另一個方面，本發明提供了一種用於從液體清除汞汙染的方法，該方法包括將表達mt、ppk或P -半乳糖苷酶基因的細菌培養物加入所述液體中，其中所述細菌培養物中的細菌抵抗在約25 ii M Hg和至少約100 UM Hg之間的Hg，和在足以允許所述汞的螯合的一段時間之後從所述液體除去所述細菌。根據方法的一個實施方式，在所述細菌形成塊(clump)之後除去所述細菌。根據一個優選的實施方式，細菌通過篩分、抽吸或從過濾器除去細菌來除去。根據另一個方面，提供了一種監測汞水平的方法，該方法包括將表達￠-半乳糖苷酶基因的細菌培養物加入液體中，其中細菌培養物中的細菌抵抗在約25 ii M Hg和至少約140 u M Hg之間的Hg，和·將X-gal加入樣品中和測試樣品以確定細菌代謝5_漠_4_氣_3_ [!引噪基-0-D-卩比喃半乳糖苷(X-gal)以產生藍色著色的能力以便確定萊在樣品中的濃度。在另一個實施方式中，本發明提供了一種從液體清除汞汙染的方法，該方法包括將所述液體放在包括固體基質的裝置中，其中所述基質還包括￠-半乳糖苷酶，而沒有細胞載體；和當所述液體被從所述固體基質洗脫時，收集所述液體。在另一個方面，本發明提供了一種用於檢測重金屬汙染的試劑盒，該試劑盒包括流體容器，指示劑條上的表達￠-半乳糖苷酶(3-galactosidase)或￠-半乳糖苷酶(3-galactosidase enzyme)的細菌培養物，X-gal,和顯示著色的圖表，所述著色對應於與指示劑條上的表達￠-半乳糖苷酶或￠-半乳糖苷酶的細菌培養物接觸的液體中的Hg的各種濃度。根據一個實施方式，試劑盒還包括比色增強劑(colorimetric enhancer)。在又一個方面，本發明提供了一種用於檢測重金屬汙染的試劑盒，該試劑盒包括流體容器，表達P -半乳糖苷酶、ppk或mtl的細菌培養物,和顯示深的著色的指示劑條，所述深的著色對應於表達￠-半乳糖苷酶、ppk或mtl的所述細菌培養物當在液體中各種濃度的所述重金屬的存在下生長時的著色。附圖簡述圖I闡明細菌在所指示的濃度的汞的存在下生長的能力。使培養物在汞中生長16小時，之後它們的生長作為培養物的光密度(0D_)的函數被測量。圖IA表示未被轉化的細菌。圖IB表示工程化的細菌培養物，包括表達P-gal蛋白的所指示的質粒。圖IC表示工程化的細菌培養物，包括表達mtl蛋白的所指示的質粒。圖ID表示工程化的細菌培養物，包括表達ppk酶的所指示的質粒。圖2闡明細菌在所指示的濃度的汞的存在下生長的能力。使培養物在汞中生長120小時，且它們的生長作為培養物的光密度(OD6J的函數被測量。圖2A表示未被轉化的細菌。圖2B表示表達P-gal蛋白的工程化的細菌培養物。圖2C表示表達mtl蛋白的工程化的細菌培養物。圖2D表示表達ppk酶的工程化的細菌培養物。圖3闡明根據本發明製備的構建體的轉錄功效。從螯合劑的mRNA製備cDNA。mRNA拷貝數被計算並被歸一化為總的所提取的RNA。圖3A比較在未被轉化的細菌(「wt」)中和在用P16s-gl0-mtl-3』 UTR遺傳構建體轉化的細菌中從mRNA轉錄物體外產生的cDNA。圖3B比較在wt細菌中和在用P16s-glO-ppk-3』UTR遺傳構建體轉化的細菌中從mRNA轉錄物體外產生的cDNA。圖4是根據本發明的一個方面的用於受汙染液體的生物整治的設備的圖示。
圖5是細菌增強表達盒的示意圖。圖中涉及的限制性內切酶位點僅表示本發明的一個實施方式。Prrn是指轉錄啟動子。在優選的實施方式中，啟動子是質體16S rrn啟動子。5』UTR(非翻譯區)表示翻譯增強子元件。優選的5』UTR是來自噬菌體17的基因
10。轉基因優選地編碼螯合劑。在優選的實施方式中，螯合劑由lacZ、mtl或ppk基因編碼。3』UTR是指轉錄終止子。在優選的實施方式中，轉錄終止子是質體rpsl6終止子或大腸桿菌rrnB終止子。在特別優選的實施方式中，轉錄終止子是rpsl6終止子。圖6是表示在120 ii M汞中生長的表達IacZ和mtl基因的細菌的聚集的圖。圖6的圖是所觀察的聚集的Polaroid照片的示意圖。在工程化為表達IacZ基因(圖6A)和mtl基因(圖6B)的細菌的培養物中觀察到沉澱。圖7闡明工程化為表達螯合劑的細菌整治汞汙染的培養基，即使培養基對不表達螯合劑的細菌(「wt」)無害的能力。圖7A示出wt細菌在沒有汞的培養基；包含120iiM汞的培養基；和經處理的培養基中持續24小時的生長。經處理的培養基最初包含120 ii M汞並通過暴露於根據本發明工程化為表達IacZ基因的細菌120小時，隨後除去細菌細胞來處理。圖7B示出wt細菌在沒有汞的培養基；包含120 u M汞的培養基；和經處理的培養基中持續24小時的生長。經處理的培養基最初包含120 PM汞並通過暴露於根據本發明工程化為表達mtl基因的細菌120小時，隨後除去細菌細胞來處理。圖8闡明根據本發明工程化為表達IacZ基因的細菌確定液體樣品的重金屬汙染程度的用途。為了更易於目測，圖被選擇為呈現比色皿的Polaroid照片中捕獲的數據。(著色以其強度代表比色皿的Polaroid照片中觀察到的著色。)比色皿A在包含Oy M汞的培養基中生長；B在包含5 ii M汞的培養基中生長；C在包含IOii M汞的培養基中生長；且0在包含20 PM汞的培養基中生長。板(panel) I示出在所指示的水平的汞的存在下生長16小時之後的0D_測量結果。板II是板I中的測量結果的圖示。板III是如在板II的相應的比色皿中的細菌，但比色皿中加入100 u g/ml 5-溴-4-氯-3-卩引哚基-D-吡喃半乳糖苷(X-gal)底物每ml培養基。細菌與暴露於汞的水平成反比地喪失其裂解X-gal和產生典型藍色的能力。圖9證明了根據本發明的表達P-gal的細菌中半乳糖苷酶活性的減小。圖9A是在所指示的量的汞和IOOii g/ml X-gal的存在下生長的細菌的照片。每一個培養物小瓶下面的有色棒接近小瓶中的內容物的顏色並意圖用作與檢測試劑盒一起供應的顏色代碼。圖9B描繪了用於容納/培養培養物的管，包括表達P -gal的細菌、X-gal和被汙染流體。容器附有或伴有(attached thereto or comes accompanied by)指不細菌培養物在所指示的濃度的汞的存在下的預期的顏色強度的顏色圖表。圖9C是圖9B的示意圖。

圖10 示出表明包括 pBSK-P16S-glO-lacZ_3』 UTR( 「lacZ」)、pBSK-P16S-glO-mtl-3』 UTR( 「mtl」)和 pBSK-P16S-glO-ppk_3』 UTR( 「ppk」)表達盒的細菌細胞系耐受包含所指示的濃度的鎘、鉛和鋅的培養基並在該培養基中生長的能力的細菌生物測定。未被轉化的大腸桿菌菌株JM109用作對照。在補充有鋅、鎘和鉛的LB營養培養基中生長24h之後測量細菌培養物吸光度(0D 600nm)。圖IOA示出在1，000 y M的ZnCl2中生長的細菌細胞系。圖IOB示出在250 ii M CdCl2中生長的細菌系。圖IOC示出在3，OOOii M的乙酸鉛Pb (C2H3O2)2 3H20中生長的細菌克隆。圖11示出通過表達轉基因的基因的細菌螯合汞。根據本發明的被IacZ構建體轉化的細菌在37°C在包含120 ii M汞的培養基中生長120h。細菌通過離心、洗滌和再懸浮在 與初始培養物的體積相同的體積的培養基中來除去。處理再懸浮的細胞(「LacZ細菌」)以釋放任何汞並通過原子吸收光譜法來分析。經處理的培養基的汞濃度和表達IacZ基因的細菌的汞濃度從光譜測定法結果來計算。在這些圖中所描繪的實驗被執行多次。在顯示棒偏差(bar deviation)的圖(圖
I、圖2、圖3、圖7、圖10和圖11)中所描繪的實驗中，實驗被執行至少三份，且棒示出在結果內的一個標準偏差。除非另外指出，否則在這些圖中所描繪的其中細菌生長被測量的實驗中，每一種培養物的起始接種物(「種子」)是0. OlOD6tltl的起始培養物的相等大小的等分部分。在測試IacZ構建體的有效性的某些實驗中，細菌培養物(未被轉化的和被轉化的)包含200mg/ml IPTG0然而，應注意，在IacZ基因從組成型啟動子轉錄的實驗中，不需要由IPTG誘導表達。詳細描述本發明提供了安全的、高效的和成本有效的使用螯合劑(chelation agent)/螯合劑(sequestration agent)的重金屬整治方法。優選的實施方式集中在表達螯合劑的細菌細胞的使用上。三種示例性螯合劑已經在細菌中被表達，使得細菌抵抗高水平的重金屬且尤其是抵抗鉛、鎘、鋅和汞金屬硫蛋白(mt)、多磷酸鹽激酶(ppk)和￠-半乳糖苷酶蛋白。驚人地，現在已經表明螯合劑基因可以產生高水平的表達和宿主細胞對重金屬的抗性的方式在細菌中被表達。根據另一個優選的實施方式，採用基於非細胞的螯合劑。在基於細菌細胞的系統中，螯合劑蛋白被表達，而不一定是融合蛋白的一部分。不需要mer基因的同時表達。對於表達這些基因的細菌，不需要海藻酸鹽或相似化合物的支撐床。工程化的細胞經得起高水平的重金屬。這些驚人的觀察已經允許開發細胞的和基於蛋白的生物整治的有效方法，如本申請中所描述的。在本發明的一個實施方式中，提供載體以在宿主細菌細胞中引入和表達基因。載體是能夠在宿主細菌細胞中複製的核酸結構。載體骨架可以包括轉化標記物的基因，以指示載體對細菌細胞的轉化。轉化標記物可以是用於從不含載體的正常細胞區分和選擇存在載體的細胞的選擇性標記物基因。這樣的標記物是本領域技術人員熟知的。通常使用的選擇性標記物包括賦予對特定的抗生素例如氨苄青黴素的抗性的基因。一些載體骨架還可以包括僅僅指示哪些細胞被載體轉化的標記物基因。轉化標記物是本領域技術人員熟知的。通常使用的指示劑標記物基因是編碼￠-半乳糖苷酶的IacZ基因的序列。其他通常使用的轉化標記物包括各種螢光素酶基因和GFP。被轉化的細菌整治其在上面生長的液體或固體表面。可選擇地，固體表面通過暴露於液體而首先被浸泡/浙濾重金屬，且然後根據本發明工程化的有機體從液體除去重金屬。載體的一個組分是包括多個限制性內切酶識別序列的克隆位點，其中這些標記物以及另外的所需的核酸序列可以被引入載體中，且 通過轉化被引入細胞中。本發明的優選的載體是質粒。優選的質粒是工程化為允許表達轉基因的遺傳序列的質粒。存在大量的已知的和被表徵的載體。參見，例如Stanford資料庫http://genome-www. Stanford. edu/vectordb/vector_pages/plasmid_pages/Plasmid. html,上次訪問在2009年6月30日。允許相對容易地引入表達盒的質粒的實例是本領域熟知的和商業上可得到的。優選的載體是pBlueScript 。在一個特定的實施方式中，提供了用於在細菌細胞中表達螯合劑的質粒。質粒包括具有整合劑基因和允許質粒在細菌細胞中表達整合劑基因至聞水平的其他兀件的表達盒。其他元件(「基因表達元件」)包括啟動子序列、翻譯增強子序列和轉錄終止序列，全部以本領域技術人員充分理解的方式在功能上連接。應注意，儘管期望由於它們強烈增強表達的能力而選擇的全部三個表達元件的存在，但是螯合劑基因甚至在缺乏轉錄終止序列時被充分地表達至本文描述的水平。調整特徵的任何有效的組合可能產生令人滿意地高的和穩定的表達系統。本發明優選地用強的轉錄啟動子來實施。預期質粒可以包括不同類型的啟動子，例如組成型啟動子、誘導型啟動子、細胞特異性的或組織特異性的啟動子。同樣地，可能的是，以特定組合的其他有效的轉錄增強子和終止子可以產生令人滿意地高的和穩定的表達。在一個優選的實施方式中，利用源自質體16S rrn基因序列的組成型啟動子。Sriraman, P.等人，Plant Physiol. 117 1495-1499 (1998)和 Yukawa, M.等人，PlantMolecular Biology 23:359-365(2005)。16S rrn啟動子序列被集成為盒的功能元件。本發明的一個實施方式中提供的表達盒的另一個元件是翻譯增強子序列(「5』UTR」)。翻譯增強子序列增強質粒中的轉基因蛋白序列的翻譯。根據本發明的優選的翻譯增強子是噬菌體17基因105』增強子元件。Olins,P. 0.和Rangwala，S. H.，J. Biol.Chem. 264 :16973-16976 (1989)。本發明中利用的增強子元件的序列被整合在表達盒的用於擴增mtl、ppk和IacZ基因的合成的5』基因側翼PCR寡核苷酸(引物)內。可以用於適當的生物整治策略的質粒的另一個元件由編碼本身是螯合劑或能夠產生螯合分子的酶的蛋白的基因序列組成。螯合劑蛋白和能夠產生螯合分子的酶兩者/任一個在本文可互換地被稱為「螯合劑(chelator agent)」或「螯合劑(sequestrationagent)」。換句話說,直接地是螯合劑或產生螯合分子(chelating molecule)或螯合分子(sequestering molecule)的任何基因產物是根據本發明的螯合劑。一些螯合劑的實例包括ppk、mtl、植物螯合肽、穀胱甘肽S轉移酶和merP。一種優選的這樣的螯合劑是金屬硫蛋白(MT)蛋白。金屬硫蛋白(MT)是以生物學鈍化形式螯合金屬離子的富含半胱氨酸的低分子量金屬結合肽。Hamer, D. H. , Annu.Rev. Biochem. 55 :913-51 (1986)。一種特別優選的mt基因源自小鼠(「mtl基因」)並編碼mtl蛋白。包含小鼠mtl cDNA的pCMV-SPORT 10載體獲自美國典型培養物保藏中心(ATCC)克隆 #MGC47147。還參見 Strausberg，R. L.等人，Proc Natl Acad Sci USA 99:16899-16903(2002)。mtl基因通過聚合酶鏈反應(PCR)從包含mtl基因的cDNA的質粒pCMV-SPORT 10擴增。mtl編碼序列的美國國家生物技術信息中心序列，gi# :BC036990，用於設計和開發通過PCR分離mtl編碼序列用於隨後克隆的PCR擴增引物。另一個優選的螯合劑基因序列是編碼多磷酸鹽激酶的ppk序列，多磷酸鹽激酶負責強烈螯合的多磷酸鹽的合成。無機多磷酸鹽是通過高能磷酸酐鍵連接的正磷酸鹽的帶負電荷的長線型聚合物鏈。Kornberg，A.，J. Bacteriol. 177 :491-496 (1995)。這些磷酸鹽聚合物可以在長度上變化且對於所有活的有機體是普遍存在的。由PPk基因編碼的酶多磷酸鹽激酶承擔從ATP聚合Y磷酸鹽以形成長的多磷酸鹽鏈。優選的PPk基因源自細菌，尤其是源自大腸桿菌，且優選的PPk螯合劑是從該基因表達的多磷酸鹽激酶和該多磷酸鹽激酶 的多磷酸鹽產物。在一個優選的實施方式中，PPk基因通過PCR使用從NCBI序列NC 000913設計的PCR擴增引物從大腸桿菌K12擴增。(ppk基因是上述NCBI序列上的2. 07kb區，從鹼基 2，621，066 至 2，623，132。) Akiyama, M.等人，J. Biol. Chem. 267 :22556-22561 (1992)和 Blattner, F. R.等人，Science. 277 :1453-1474(1997)。又一個優選的螯合劑基因序列是源自大腸桿菌K12的P -半乳糖苷酶的IacZ基因序列。K12的3，072鹼基對IacZ基因是大腸桿菌中的乳糖操縱子的一部分並表達酶￠-半乳糖苷酶，該酶催化二糖例如乳糖的水解。Kalnins，A.等人，EMBO 2 593-597 (1983)。大腸桿菌P -半乳糖苷酶是可由作為輔因子的鉀和鎂離子活化的464kDa四聚體蛋白。該酶由於其代謝X-Gal的能力而已被廣泛用於分子生物學和遺傳學，X-Gal是無色改性的半乳糖，其被代謝形成亮藍色的且可以作為指示劑或報告標記物起作用的不溶性產物(5-溴-4-氯吲哚)。IacZ基因通過PCR使用從NCBI序列NC 000913設計的PCR擴增引物從大腸桿菌K12基因組DNA擴增。(IacZ是3. 08kb區，從鹼基362，455至365，529。)Blattner, F. R.等人，Science. 277 :1453-1474(1997)。應注意，關於汞螯合，除非另外特別地論述，否則本發明本文通常是指並示例無機汞的螯合。然而，如果系統還包括功能性轉基因裂合酶，例如諸如merB基因，那麼本發明還允許有機汞螯合。Ruiz, 0.等人，Plant Physiol. 132 :1344-1352 (2003) ；Bizily S. , ProcNatl Acad Sci USA 96:6808-6813(1999)。本發明的一個實施方式中呈現的表達盒的另一個任選的元件由轉錄終止序列組成。在一個優選的實施方式中，轉錄終止序列是3』UTR不依賴P因子的轉錄終止子序列。優選的3』 -UTR序列的實例包括細菌的和質體衍生的rpsl6。對於細菌的rrnB終止子序列的描述由Abe，H.等人，Genes to Cells，4 :87-97 (1999)提供。特別優選的終止子是由Hayes, M. L.等人，Nucleic Acids Res. 34 :3742-3754 (2006)描述的質體衍生的 rpsl6 終止子(本文其他地方還稱為rpsT)，其中「T」代表「末端」。rpsl6基因轉錄終止子序列被整合為mtl、ppk和IacZ基因的合成的3』 PCR擴增寡核苷酸(引物)的一部分。產生包括這些遺傳元件的盒的常規方法是產生為轉基因的PCR引物的合成的寡核苷酸，其中兩個PCR引物分別包括5』控制元件(啟動子、增強子)和3』 -UTR。雖然在上文我們描述了被採用來獲得和製備以將特定的遺傳元件轉移到表達盒中的特定的分子方法(PCR、合成的寡核苷酸等)，但本領域技術人員應認識到，可選擇的引物、可選擇的設計和另外的方法學可以用來實現產生表達盒和包括這些遺傳元件的轉移載體的相同的目標。構建表達盒，該表達盒包括功能連接的用於表達的轉基因和基因表達控制元件。上面列出的是優選的元件源自質體16S rrn基因的啟動子；源自噬菌體T7基因10的5，UTR ;和rrnB序列或rpsl6轉錄終止子(3，-UTR),優選地rpsl6。(注意,在本專利說明書中，rpsl6和rpsT是對於相同的3』 -UTR可互換使用的名稱。)該盒包括細菌中使用的調整元件的想不到的組合，如下面進一步詳述的，該組合現在已經被證明在細菌中提供強的表達。根據一個實施方式，本發明的載體中的表達控制序列包括強啟動子和5』UTR,優選地16S rrn啟動子序列和噬菌體17基因105』UTR。在更優選的實施方式中，載體還包括3』 UTR，優選地rrnB或rpsl63』 UTR，還更優選地rpsl63』 UTR。根據優選的實施方式，細菌工程化為高度表達這些螯合劑轉基因序列。所得到的細菌抵抗高水平的重金屬汙染。作為推論，本文所描述的優選的啟動子5』 UTR和3』 UTR的組合包括用於高水平表達穩定的轉錄物和翻譯產物的優選的表達系統，無論被表達的轉基因是螯合劑還是一些其·他基因產物。用於將載體引入各種細胞和有機體的轉化方法是熟知的。例如，可以經由氯化鈣/熱激方法(化學感受態細胞方法)、電穿孔、經由質粒接合、粒子轟擊等等引入載體構建體。載體被轉化到有機體中以便表達螯合劑。在一個優選的實施方式中，載體被轉化到可以用於生物整治的有機體中，例如植物、真菌、藻類或細菌。在一個特別優選的實施方式中，有機體是細菌。優選的細菌是環境上普遍存在的、非挑剔生長的、在天然環境中易於供養(sustainable)的細菌。用本發明的編碼螯合劑的表達盒和/或轉基因轉化的特別優選的細菌是大腸桿菌、假單胞菌(例如，銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeuriginosa))、藍細菌(例如，共同念珠藍細菌(Nostoc commune)或悅目顫藍細菌(Oscillatoria amoena))和芽孢桿菌(例如臘狀芽孢桿菌(Bacillus cereus))。在本發明的優選的實施方式中，螯合劑基因序列是lacZ、mtl或ppk。表達P -半乳糖苷酶、金屬硫蛋白和多磷酸鹽激酶的轉基因細菌被表明能夠從液體除去重金屬和汞。上文所描述的細菌構建體已經在汞抗性和累積方面顯著提高至先前所報告的至少8倍的水平。P -半乳糖苷酶(「 P -gal」)是細菌中乳糖代謝所需要的四肽酶。P -gal是熟知的，這是因為其蛋白序列在1970年公諸於眾。不知P-gal蛋白螯合重金屬或汞。如下面的實施例中所描述的，^ -gal現在已經被表明具有對汞的高親和力並在被過表達時有效結合萊。未知P-gal可以賦予暴露於高濃度的萊的細菌抗性。並且，P-gal防止高濃度的鎘、鋅和鉛的有害影響。當￠-半乳糖苷酶表達盒(pBSK-P16S-glO-BY-rpst)被引入細菌中時，觀察到高水平的轉錄。此外，細菌變得抵抗高濃度的汞。未被轉化的細菌在暴露於5 ii g/ml Hg時顯示顯著的生長減弱且在較高的濃度下根本不生長，但是被表達P-gal的質粒轉化的細菌抵抗0、5、10、20、40、80、100、120、140和160 y M汞的測試濃度中的每一個。圖I和圖2中呈現的數據表明被轉化的細菌不僅經受得住高達約140 u M的汞濃度，而且實際上在這些汞水平下繁殖。其他數據(圖I和2中未示出)顯示被轉化的細菌還在160 u MHg下繁殖。包含質粒的細菌容易耐受在受汙染水和土壤中見到的相似濃度的汞，在這些濃度的汞下生長和複製。相似的實驗證明了細菌當根據本發明被P-gal轉化時，可以抵抗包含高達至少約250 鎘(參見圖10)的培養基並在該培養基中複製。並且，根據本發明被P-gal轉化的細菌能夠抵抗包含高達至少約1，000 PM鋅的培養基並在該培養基中有效地複製。該相同的轉基因細菌證明對高達至少約3，000 u M鉛的抗性。當mtl表達盒(pBSK-P16S-glO-mtl_rpst)被引入細菌中時,觀察到高水平的轉錄。參見圖3A。此外，細菌變得抵抗高濃度的汞。被表達mtl的質粒轉化的細菌抵抗20、40、60、80、100、120、140和160 y M汞的汞濃度。圖I和圖2中呈現的數據表明被轉化的細菌不僅經受得住高達至少約160 PM的汞濃度，而且實際上在這些汞水平下繁殖。應注意，細菌的生長速率與汞水平成比例地稍微下降。儘管如此，實現了細菌生長的飽和水平。包含質粒的細菌容易耐受在受汙染水和土壤中見到的相似濃度的汞，在這些濃度的汞下生長和複製。 相似的實驗證明了根據本發明表達mtl的細菌克隆可以抵抗包含高達至少約250 ii M鎘和高達至少IOOOii M鋅的培養基並在該培養基中複製。表達mtl的細菌克隆還呈現對高達至少約3，000 u M鉛的抗性。參見圖10。同樣地，當ppk表達盒被引入細菌中時，觀察到高水平的轉錄。參見圖3B。此外，細菌變得抵抗高濃度的汞。被表達mtl的上述質粒轉化的細菌抵抗20、40、60、80和IOOyM汞。圖I和圖2中呈現的數據表明被轉化的細菌不僅經受得住高達約100 u M的汞濃度，而且實際上在這些汞水平下繁殖。包含質粒的細菌容易耐受在受汙染水和土壤中存在的相似濃度的汞，在這些濃度的汞下生長和複製。相似的實驗證明了根據本發明表達ppk的細菌克隆可以抵抗包含高達約3，OOOii M鉛和1，OOOii M鋅的培養基並在該培養基中複製。另外，轉基因細菌抵抗高達約250 ii M的鎘。參見圖10。清楚地，包括質體16S rrn衍生的啟動子、T7基因10衍生的5』 UTR和細菌衍生的rrnB或質體衍生的rpsl63』 UTR的載體以高的拷貝數表達這些所闡明的螯合劑基因。作為推論，組合的這些表達控制序列可以用於以高的水平表達其他基因，具有如對於螯合劑基因看到的相似的拷貝數，或至少約4，000 ;4，500 ；5,000 ;5，500 ;6，000 ;6，500 ;7，000 ；7，500 ;8，000 ;8，500 全長拷貝每 ng 總 mRNA。細菌中包括強啟動子和/或適當的5』 UTR和3』 UTR以造成在細菌中生產至少約4，000 ;4，500 ;5，000 ;5，500 ;6，000 ;6，500 ;7，000 ;7，500 ;8，000 ;8，500 全長拷貝每 ng 總
mRNA的螯合劑mRNA的任何遺傳構建體，使得包括這樣的構建體的細菌能夠通過螯合重金屬同時抵抗包括重金屬的環境並在該環境中繁殖而有效地整治包含重金屬的液體或固體。優選地，細菌表達約6，000至7，500拷貝的螯合劑每ng總mRNA。具有包括￠-半乳糖苷酶基因的質粒的轉基因細菌還可以有效地用作用於檢測汞與汞汙染和溢出以及其他重金屬的生物傳感器。X-gal的裂解釋放5，5' -二溴_4，4' -二氯-靛，一種不溶性藍色化合物。在化合物X-Gal (和X-gal類似物)的存在下表達半乳糖苷酶的轉基因細菌產生容易地可區別的深藍色顏色反應。然而，現在觀察到藍色顏色的強度與汞的濃度成比例下降。參見圖8和圖9。同樣地，其他重金屬例如鎘的存在可以具有破壞X-gal (和X-gal類似物)的裂解和藍色化合物的產生的相同效果。這些特徵使得P-gal適合作為原位或體外生物傳感器。因此，￠-半乳糖苷酶在細菌中的表達保護細菌免於汞的有害影響，但也降低了酶代謝乳糖和乳糖類似物例如X-gal的能力。在本發明的一個方面，提供了用於檢測重金屬的試劑盒。根據一個實施方式，試劑盒包括流體的測試小瓶或容器、測試條上的表達3 -半乳糖苷酶或3 -半乳糖苷酶的細菌培養物、5-溴-4-氯-3-卩引哚基-0-D-卩比喃半乳糖苷(X-gal)和指不劑條。指不劑條包含確定￠-半乳糖苷酶還原X-gal的程度的顏色標記物。每一種標記物可以具有不同色調的藍色，這樣的顏色色調通過暴露於不同濃度的重金屬例如汞來預先確定。試劑盒用來實施檢測汞或包括鎘、鉛和鋅的其他重金屬的方法。該方法包括將測試樣品放在流體容器中的步驟。任選地，在測試樣品是固體的情況下，加入液體以從固體釋放汞/重金屬。加入X-gal。將流體與細菌培養物或包括P-gal蛋白的測試條接觸預定的時間段。接著，將培養物的顏色與指示劑條上的標記物進行比較以確定汞是否存在流體中和在流體中的濃度。在高的重金屬或汞濃度的一些情況下，試劑盒可以僅提供陽性/陰性 結果且並不指示全部濃度範圍。上述試劑盒的可選擇的實施方式還可以包括一組標準品。標準品可以包括各種具有在溶液中的各種濃度的Hg的標準容器。作為非限制性實例，容器可以具有以下Hg濃度A 0uM ；B 5uM ；C :10iiM ;和 D 20uMo試劑盒可以按以下方式利用。將指定體積的測試材料和液體(如果材料是固體)放在測試小瓶中，將一定體積的指示濃度的Hg標準品放在每一個標準小瓶中A :0 ii M ;B :5uM；C 10 u M5^PD 20 u M。將一定體積的轉基因細菌放在測試小瓶和標準小瓶中的每一個中。將X-gal加入到每一個小瓶。允許培養物溫育指定的時間段。優選地，溫育時間在約I分鐘和20分鐘之間，更優選地在5和10分鐘之間。在溫育時間結束之後，將測試小瓶的著色與標準小瓶的著色進行比較以便確定汞在樣品中的大致濃度。本領域技術人員應充分理解，可選擇的實施方式圍繞汞和其他重金屬逐漸地降低^-gal的與重金屬的濃度相關聯的裂解X-gal的能力的概念而被容易地設計。作為實例，但不限於這些實例，細菌以非液體形式(例如，凍幹的)被提供，包括P-gal的細菌是細菌的環境菌株，溫育在特定的溫度下例如在37°C或在室溫下進行，採用純化的P -gal而不是培養物混合物中表達0 -gal基因的細菌或P -gal表達載體或P -gal酶增加著色測定可以與汞的濃度相關聯的範圍。測試樣品是固體或固體的液體洗滌物。同樣地，可選擇的顏色測定和/或用於精確地測量顏色變化的光學儀器(例如，分光光度計、比色計)的使用是可能的。顏色效果增強技術的使用還是已知的和可能的。這些可選擇的設計和其他的是本領域技術人員熟知的並在本發明的範圍內。在本發明的又一個方面，￠-半乳糖苷酶蛋白本身，即不存在細胞載體，可以用作重金屬或汞的螯合劑，用作原位和體外應用的溢出清理系統的一部分。P-gal是商業上可得到的和可以通過熟知的標準分離技術容易地從表達酶的有機體純化。大量酶的分離可以通過其過表達和針對酶的抗體的商業可用性來促進。為了製造目的，P-gal在細胞中的表達可以通過加入IPTG來操縱/增加。P-gal蛋白的商業供應商是已知的，例如Sigma-Aldrich0同樣地，金屬硫蛋白和多磷酸鹽激酶的多磷酸鹽產物可以獨立地，即不存在細胞載體下作為包括鋅、鎘、鉛或汞的重金屬的螯合劑用於整治努力。此外，在本發明中已經表明，強啟動子或特定的5』 UTR和3』 UTR或優選地強的質體啟動子、噬菌體17增強子和有效的質體衍生的轉錄終止子序列的特定組合允許金屬硫蛋白(mtl基因)、多磷酸鹽激酶(ppk基因)和￠-半乳糖苷酶(IacZ基因)在細菌中表達至允許它們作為汞和其他金屬的有效的生物整治系統的用途和商業化的水平。上述質粒提供能夠產生這些和其他轉基因的高的mRNA轉錄和蛋白翻譯的增強的基因表達構建體。包括本發明的螯合劑的細菌獲得使得它們理想地適合於通過螯合的生物整治的性質。舉例來說，它們抵抗高水平的汞，持續延長的時間段。參見圖I和圖2。它們不僅抵抗高水平的汞，而且它們在這些水平下繁殖。在對照實驗中，未被轉化的細菌在5 ii M汞的存在下顯示減弱的生長，且在10 y M汞下不生長。相反，被表達pkk基因的構建體轉化的細菌在包含10 PM汞的培養基中顯示很少或沒有生長減弱且在高達約100 PM汞的濃度下生長。重要地，細菌繁殖隨著時間繼續。當在汞中生長120h之後測試相同的構建體時，IacZ構建體在高達約140 M汞下顯示隨著時間的進一步生長，在總生長水平上與在沒有汞下生長的未被轉化的細菌不能區別。mtl構建體在高達160 PM汞下顯示進一步生長(雖然 以稍微降低的生長速率)，在總生長水平上與在沒有汞下生長的被轉化或未被轉化的細菌不能區別，且在包含高達160 u M汞的培養基中減弱但顯著生長。ppk構建體在高達80 ii M汞下顯示進一步生長，在總生長水平上與在沒有汞下生長的未被轉化的細菌不能區別。PPk構建體在0-80 u M的任何汞濃度下顯示了小的生長減弱。可能的是，磷酸鹽可用性對被ppk基因轉化的細菌的生長具有小的影響。在包含120 ii M汞的液體通過暴露於包括本發明的螯合劑的細菌來處理的實驗中顯示了流體的成功的整治。參見圖7。在通過暴露於轉基因細菌處理包含汞的培養基120h之後，從培養基清除掉剩餘的細菌(導致「經處理的培養基」)。將未被轉化的(「wt」)細菌種子加入到經處理的培養基、包括0 ii M汞的新鮮培養基和包括120 U M汞的新鮮培養基。細菌在經處理的培養基和沒有汞的新鮮培養基中同樣地生長良好。這表明經處理的培養基具有低於5 u M的汞濃度。轉基因細菌不僅在這些高水平的汞下生長，而且螯合和除去重金屬。通過原子吸收光譜法分析產生的定量數據顯示轉基因細菌的整治功效。參見圖
11。原子吸收光譜法分析顯示在表達IacZ基因的轉基因的大腸桿菌細菌中非常高水平的汞累積。表達LacZ的大腸桿菌細胞在37°C在具有120 ii M Hg的LB培養基中生長120小時。製備用於光譜分析的細胞和培養基的方法基本上是根據環境保護局方法3010A。將細胞離心，在新鮮培養基中洗漆，再懸浮在小體積的培養基中，用70% (v/v)硝酸、30% (v/v)過氧化氫和濃HCl在95°C消化，達到等於它們生長的初始體積的體積且然後通過原子吸收光譜法分析。在離心細菌細胞之後獲得的上清液培養基也在相似的處理之後被分析。結果表明轉基因細菌在從培養基除去汞和將高濃度的汞累積在細菌細胞內部上是非常有效的。如所觀察的，大部分有毒的汞見於轉基因細菌，而培養基中的汞被除去至低於5 u M的無毒濃度。這些結果表明，轉基因的IacZ大腸桿菌具有通過螯合作用生物整治被汞高度汙染的液體同時最佳地生長的能力。在將被轉化細菌暴露於重金屬且尤其是汞之後，發現了關於這些細菌的另一個非常有用的性質。細菌在充分累積包括汞的重金屬之後，變成較深的色調。此外，其傾向於緊密地聚集和固定。可以從容器挖出這樣的聚集的細菌，以例如吸移液體的方式抽吸，而不一定需要細菌可以在其上生長的專用過濾器，或離心。聚集的細菌易於目測，因為其將著色變為深的色調。參見圖6 ;圖8，板II ;和圖9，板A。聚集和深色調性質可以單獨地或組合地良好地用在生物整治中。因此，本發明還提供用於從液體生物整治和吸收重金屬或汞的新穎的、簡單的和低成本的機制。根據本發明使用的一個方法包括將受汙染液體放在儲器中的第一步驟。在隨後的步驟中，將包括表達本發明的螯合劑(sequestration agent)/螯合劑(chelation agent)的質粒的細菌加入到受汙染液體中。允許細菌生長並從液體除去重金屬。當細菌除去汞且在細胞中達到高濃度的汞時，它們從溶液沉澱並形成緊密結合的聚集體。聚集體然後用篩裝置來回收。根據需要，加入另外的轉基因細菌。
另外一個例子，深的著色可用於指示過程已經發展到需要除去細菌的點，或作為工藝實際上在進行中的質量控制，且特定的色調水平可以通過將用於汞監測的上述這些與IacZ系統並聯的方法用於指示或監測受汙染環境中存在的汞的水平。在本發明的另一個實施方式中，表達根據本發明的螯合劑的細菌形成自持生物膜(self-sustained biofilm)以用作過濾系統的一部分以從液體和固體基質除去重金屬或汞。在一個優選的實施方式中，如圖4所描述的，提供了生物整治系統，其包括水儲器104 ；多孔固體基質108 ;在水儲器和/或在多孔固體基質中的細胞生物膜100，其中包括本發明的遺傳構建體的抵抗Hg的細菌組成生物膜100 ;多孔過濾器112 ;和經處理的水出口 116。遺傳工程化的細菌可以在多孔固體基質108上生長以形成生物膜100。因為細菌高度抵抗汞和其他重金屬，所以其有效地從液體除去汞，同時在細胞內部累積高濃度的汞。高的汞耐受性還允許細菌細胞分裂和生長，這延長了生物過濾器的使用壽命。細菌在過濾器上的著色可以指示它們的生物整治活性以及什麼時候需要細菌替換。在根據本發明使用的一個方法中，將受汙染水裝載到水儲器104。允許水穿過多孔固體基質208並接觸細胞生物膜100。生物膜中的細胞螯合重金屬汙染物，例如汞。乾淨的水穿過多孔過濾器112，在多孔過濾器112中除去從生物膜100移去(dislodged)的任何細胞物質以及其他雜質。乾淨的水然後通過經處理水出口 116釋放。本申請中所描述的序列的組合可以用作各種體外系統、細胞系統和包括細菌、藻類、植物、動物和真菌的有機體中新穎的生物整治系統。細胞或有機體可以被遺傳工程化為表達螯合劑，由此變得抵抗重金屬並通過螯合作用從培養基清除汙染物。有機體可以被回收且重金屬或汞可以被回收和循環用於工業應用。表達或包含被這些序列編碼的蛋白的體外系統、細胞或有機體還可以用作生物反應器的一部分或用於土壤、水和沉積物的原位整治。在根據本發明的另一個實施方式中，提供包括上述重金屬或汞螯合系統和重金屬/汞運輸機制的細菌細胞。在一個非限制性實例中，根據本發明的質粒還可以包括mer操縱子的merT和MerC基因的基因序列。質粒然後可以被轉化到提供了將汞或其他重金屬運輸到細胞質空間中和然後將汞螯合在細胞內的能力兩者的細菌細胞中。預期mer操縱子的其他基因還可以被利用以便增強重金屬在細胞內的螯合和提供對有機汞製劑例如甲基汞、二甲基汞和醋酸苯汞的抗性。可選擇地，其他重金屬運輸系統可以以如本發明中所描述的方式與本發明的螯合劑組合使用。設想可以產生包括編碼螯合劑的多於一個基因的細菌系統或其他有機體系統。這通過考慮到以下而更容易地製備螯合劑的細胞代謝效應(不同於螯合)是不同的且它們作為螯合劑的活性也是不同的(例如，直接螯合或形成多磷酸鹽分子)。因此，多於一種類型的螯合劑的存在預期被宿主細胞/有機體相對充分地耐受。實施例I.本發明的螯合劑提供對高濃度的汞、鎘、鋅和鉛的耐受性並允許細菌在高濃度的汞、鎘、鋅和鉛的存在下生長。在本發明的一個實施方式中，將包括以商標pBlueScript. (Stratagene)銷售的載體的質粒構建為以高水平表達轉基因。該載體中的表達盒包括質體16S rrn基因啟動子；5』 UTR翻譯增強子元件來自噬菌體17基因10 ;轉基因；和3』UTR不依賴P因子的終止子，如圖5所示的。在一個實施方式中，3』UTR是葉綠體rpsl6序列。來自基因10的5』UTR從合成的寡核苷酸產生。其他調節序列經由聚 合酶鏈反應來構建。遺傳元件被產生為包括在每一個元件的末端附近的方便的限制性內切酶位點。這些方法是本領域技術人員熟知的。參見,例如，Sambrook, J.和Rusell，D.，Molecular cloning A laboratory manual (分子克隆實驗室手冊) Cold Spring HarborLab press, Cold Spring Harbor,NY(2001)。產生多個質粒構建體，其中轉基因編碼lacZ、mtl 或 ppk。包含這些構建體的細菌克隆在包含不同濃度的HgCl2的LB培養基中生長16小時，如圖I所示的。在圖I中，圖IA表示未被轉化的大腸桿菌菌株JM109，圖IB表示包括PBSK-P16S-glO-lacZ-3』 UTR載體的轉基因的大腸桿菌，圖IC表示包括pBSK-P16S-glO-mtl-3』 UTR載體的轉基因的大腸桿菌，且圖ID表示攜帶pBSK-P16S-glO-ppk-3』UTR載體的轉基因的大腸桿菌克隆。將種子細菌接種物加入到細菌培養物燒瓶中，並將該燒瓶在37°C以用於培養細菌培養物的典型方式搖動溫育。在16小時溫育時間結束時，在0D_nm測量培養基(culture media)的吸光度。幾乎相同的構建體(但沒有P16S啟動子元件)還被工程化和被轉化到大腸桿菌。在這些P16-構建體(P16 minus construct)中，P16S啟動子從載體中去除，IacZ啟動子(the promoter was offthe vector, a IacZ promoter)。包括這些 P16S-構建體的工程化的細菌也顯示出在高水平的汞下增加的抗性和生長。例如，mtl基因構建體經受得住高達約20iiM Hg，且ppk構建體經受得住高達約40 ii M Hg。然而，清楚地，通過比較，包括P16S元件的構建體能夠經受得住顯著更高水平的汞。看來當兩種蛋白被以較低水平表達時，例如在pBSK-glO-mtl-rpsT和pBSK-glO-ppk-rpsT載體的情況下，多磷酸鹽激酶比金屬硫蛋白提供了更好的對Hg的抗性。當這些蛋白被過表達時，金屬硫蛋白比多磷酸鹽激酶提供更高的對抗Hg的有毒影響的保護。本發明不受具體的螯合劑的任何作用機理限制。儘管如此，以相對較低或較高水平表達PPk或mtl的細菌中的對汞的抗性的差異可以由兩種蛋白的作用機理來解釋。在金屬硫蛋白的情況下，因為其直接螯合Hg，所以較高的表達水平等於較高的抗性水平。這不同於多磷酸鹽激酶，多磷酸鹽激酶可以甚至在較低的酶濃度下產生較高水平的多磷酸鹽，這是因為其是酶。在較高的酶濃度下，Hg抗性的增量可能低於所預期的，這是因為酶底物在細胞中的可用性可能供應不足，由此限制其活性。多磷酸鹽激酶承擔了從ATP聚合Y磷酸鹽以形成長的多磷酸鹽鏈。
圖I中概括的實驗結果顯示未被螯合劑轉化的大腸桿菌(「wt」)可以在包含高達約5yM Hg的培養基中生長，雖然生長在暴露於5yM汞之後減弱。用指示的質粒轉化的大腸桿菌顯示當以在20 ii M至高達約40 (pkk) ；80 ( ^ -gal) ;80 (mtl) y M萊範圍內的萊濃度下生長時在16小時時間內生長。在相似的實驗中，如圖2所示的，轉基因的大腸桿菌可以甚至在較高濃度的汞的存在下繼續生長，且培養物在以下LB培養基中溫育120小時之後實現較高的密度包含各種指示的濃度的Hg，高達約以下的汞濃度對於ppk構建體的100 ii M ;對於P -gal構建體的140 u M ;和對於mtl構建體的160 u M。因此，細菌抵抗這些高濃度的汞並在這些高濃度的汞下繼續生長。 實施例2.本發明的構建體(pBSK-P16S_glO-螯合劑_3』 UTR)將螯合劑元件轉錄至非常高的水平。mRNA從未被轉化的細菌和表達mtl和ppk的細菌克隆收集。總細胞RNA通過使用RNeasy微量試劑盒(RNeasy Mini Kit, Qiagen)和方案從在37°C在300rpm攪拌下在Luria Bertani (LB)肉湯中生長16小時的Iml細菌克隆和未被轉化的大腸桿菌JM109培養物分離。RNA樣品用100 u g/ml的濃度的DNA酶I處理。樣品通過隨機引物擴增使用AccuScript cDNA試劑盒(Stratagene)來標準化和逆轉錄。cDNA通過定量實時PCR使用具有擴增後融化曲線分析的兩步驟實時PCR擴增程序來分析。從合成的寡核苷酸產生基因特異性標準曲線用於定量。使用轉基因特異性引物的實時PCR產生與mRNA模板成比例的量的cDNA。用作來自未被轉化的細菌的模板mRNA的對照實驗顯示沒有轉基因的表達。轉基因特異性mRNA的拷貝數被計算和歸一化為存在的總mRNA。如圖3中可以見到的，克隆包含約7，000拷貝的每一種轉錄物每ng總mRNA。用包括B_gal元件的構建體獲得了相似的數據。本領域技術人員將認識到，這些數字表示轉基因被轉錄至非常高的水平。實施例3.包含本發明的螯合劑的細菌當它們累積汞時形成聚集體。當細菌在足夠高的濃度的汞中生長或在較低濃度下生長足夠長的時間時觀察到深的著色、聚集和沉澱。例如，如圖 6 所示的，pBSK-P16S-glO(5』 UTR)-mtl-3，UTR( 「mtl」)和 pBSK_P16S-glO(5』UTR)-lacZ-3』UTR(「lacZ」)樣品在包含120 y M Hg的LB培養基中溫育之後形成在容器的底部累積的聚集體。用在80 ii M汞的存在下生長的包括mtl或ppk基因的轉基因細菌也觀察到相似的效應。在約24小時之後觀察到變化且它們隨時間與累積成比例增加。三個細菌克隆全部在攪拌(以約280rpm)下在15ml錐形管中生長。在攪拌期間出現聚集和沉澱，而不需要靜止溫育。所測試的三種螯合劑中的每一種都出現這些顏色變化和沉澱效應。這提供細菌應何時被除去和替換的目視指示劑。該效應使得通過簡單地從液體篩分細菌而容易除去已經累積大量汞的細菌。已經在細菌克隆pBSK-P16S-glO-mtl_rpsT 和 pBSK-P16S-glO-ppk_rpsT 中觀察到這些聚集和沉澱效應。因此，看來不是基因型的直接功能，而是對汞的抗性和在細胞中累積汞的功能。僅在已經在等於或高於80 ii M的汞濃度下生長至少24小時的時間段的細菌中觀察到聚集和沉澱。在較低的汞濃度下，細胞將可能需要暴露於低濃度的汞較長的時間段。儘管如此，在細菌已經累積足夠的汞後，在較低濃度的汞下也出現顏色變化、聚集和沉澱。累積汞的轉基因細菌獲得深的顏色，這用作細胞中高的汞濃度的指示。細胞的加深可以在40 ii M Hg或更高下察覺到。聚集、沉澱和著色效應是在細菌細胞累積高的汞濃度之後識別和回收細菌細胞的非常有用的特徵；它們可以是有用的標記物以確定細胞何時即將從正被清潔的環境收穫，且還可以幫助降低將這些細菌系統應用於汞生物整治的成本。這是由於累積高濃度的汞而在細菌細胞中觸發的形態學變化的第一報告。實施例4.在通過暴露於包括本發明的構建體的細菌來處理培養基之後，經處理的培養基基本上不含重金屬；萊被螯合。如圖7所不的,將未被轉化的大腸桿菌JM109在沒有汞(0 u M)的LB培養基中、在經處理的培養基中和在具有120 u M HgCl2濃度的LB培養
基中培養。經處理的培養基是初始包含120 ii M HgCl2且細菌克隆pBSK-Prrn-5』UTR-lacZ-3』UTR 或 pBSK-Prrn-5』UTR-mtl-3』UTR 在其中生長 120 小時的 LB培養基。通過以13，OOOrpm離心2分鐘從液體培養基除去細菌細胞，且通過使液體培養基穿過0. 22 y M過濾器以除去從離心過程留下的任何轉基因細菌細胞而使液體培養基滅菌。經處理的培養基用未被轉化的大腸桿菌JM109再接種。在圖7A示出的實驗中，經處理的培養基是用包括pBSK-Prrn-5』UTR-lacZ-3』UTR(「lacZ」)構建體的細菌處理的培養基。在圖7B示出的實驗中，經處理的培養基是用包括pBSK-Prrn-5 』 UTR-mt 1_3 』 UTR (「mt I 」) 構建體的細菌處理的培養基。允許未被轉化的細菌在相應的經處理的培養基中在37°C在標準細菌培養條件下生長16小時，且然後測量培養物的0D_吸光度。結果顯示未被轉化的大腸桿菌在通過轉基因細菌處理的培養基中的正常生長速率。作為對照，包含120iiM Hg的新鮮培養基也被過濾滅菌並加入大腸桿菌JM109細菌。未被轉化的JM109細菌不能夠在包含120iiM HgCl2的培養基中生長。參見圖7A和圖7B。這表明本發明的轉基因克隆可以用於整治處理包含非常高濃度的汞的液體。該處理將Hg降低至無毒水平(小於約5 PM)並允許大腸桿菌JM109的正常生長。實施例5.汞被螯合在細菌內；轉基因細菌將汞降低至亞細菌抑制劑量。為了證實3 -半乳糖苷酶可以作為螯合劑，我們對從在具有120 ii M Hg的LB培養基中的5ml培養物在120小時之後獲得的pBSK-P16S-glO-lacZ-rpsT細菌小球(pellet)進行冷蒸汽原子吸收光譜法(CVAAS)分析。將細胞通過離心從培養物除去，洗滌並再懸浮在Iml LB培養基中。遵循 EPA 方法 30IOA (EPA 方法 3010A. Methods for Chemical Analysis of Water andWastes (用於化學分析水和廢物的方法)；美國環境保護局-Washington, DC, 1992)將細胞和上清液單獨地酸消化，使得達到5ml體積以維持初始的Hg比例，且然後通過CVAAS來分析。結果表明IacZ細菌克隆對於從培養基除去Hg是非常有效的，累積等於116 的濃度的Hg(圖11)。在120小時處理之後留在培養基中的濃度是2.7 ii M(圖11)。這些結果證實了顯示未被轉化的大腸桿菌在用pBSK-P16S-glO-lacZ-rpsT細菌克隆事先處理的培養基中非常好地生長的結果。從兩個研究明白的是，轉基因細菌能夠從液體培養物除去Hg至低於5 ii M的水平。實施例6. P -半乳糖苷酶生物測定 汞降低P -gal裂解X-gal的能力 如圖8所示的，包括pBSK-P16S-glO-lacZ-rpsl6質粒的細菌克隆在所指示的Hg+2濃度下生長。板I示出在0至20iiM Hg+2範圍內的Hg+2濃度下16小時之後的細菌生長測量結果(0D_J。然後對在所指示的Hg濃度下生長的每一種細菌製備雙份比色皿。參見板II和板III。將100 u g/ml X-gal加入到板III的比色皿。觀察到X-Gal至藍色顏色的轉化的降低與汞濃度的增加成比例，一直到20 ii M Hg+2。如板I和板II中觀察到的，轉基因克隆的細菌生長不受在該濃度範圍內的增加的汞濃度影響。這表明藍色顏色的降低是P-gal酶促活性的降低的因素而不是由於缺乏細菌生長。
為了更易於目測，圖8在板II和板III中呈現了包含樣品的實際比色皿的照片的圖。圖中的明暗是根據照片的明暗，並保存包含暴露於不同濃度的Hg的細菌的比色皿的相對暗度。板II是示出在0至20iiM Hg+2中16小時之後的細菌生長的比色皿的照片的精確圖再現。板III是示出￠-半乳糖苷酶對Hg+2的增加的暴露和螯合作用降低了該酶將X-gal底物轉化為藍色顏色代謝物的能力的比色皿的照片的精確圖再現。A0uM；B5uM；C10uM；D 20 u M0板II和板III中的比色皿「D」的色調在視覺上是相同的。圖9板A示出相似實驗的實際照片，其中表達P-gal的細菌克隆在37°C在100 u g/ml X-gal和所指示的濃度的汞的存在下生長16小時。如可以見到的，在40 y M汞下生長的培養物開始發展較深的顏色。該顏色變深是細胞中被螯合的汞累積的效應。在每一個小瓶底部的有色棒是被開發為模擬/捕獲培養物當暴露於所指示的濃度的汞時的色調的顏色編碼條。圖9板B示出用於檢測重金屬汙染的原型試劑盒。提供容器，其中加入測試液體以及濃的X-gal和表達P-gal的構建體或純化的P-gal。附接於培養管或在附近的是顏 色代碼圖，以允許目測比較測試結果與顏色圖。圖A是圖9B中的試劑盒的示意圖。在標準化條件下溫育一段時間之後，將培養物的顏色與顏色圖表進行比較。實施例7.螯合劑提供對鋅、鎘和鉛的抗性。未被轉化的大腸桿菌JM109( 「wt」)和表達lacZ、mtl和ppk基因的細菌培養物中的每一種用0. OlOD600的細菌接種並在補充有1，OOOii M ZnCl2 (圖 10 板 A) ；250uM CdCl2 (板 B);和 3，000 y M Pb (C2H3) 2) 2 3H20 (板 C)的LB培養基中生長24h。如圖10中可以見到的，wt細菌顯示對這些毒素的某一水平的抗性。然而，轉基因細菌的抗性顯著更大。很可能，這些細菌克隆可以在還更高水平的鋅、鎘和鉛的存在下繼續生長良好。包含PPk的克隆對鎘示出僅有限的抗性。克隆在鉛補充的培養基中顯示減弱的但顯著的生長。所有三種被轉化的細菌在鋅中的生長以及mt和P-gal克隆在鎘中的生長基本上不受阻礙。作為對照，wt和所有三種被轉化的細菌菌株在沒有補充重金屬的培養基中生長同樣良好(數據未示出)。上述本發明應結合所附的權利要求和附圖來閱讀。實施方式和實施例的描述使得人們能夠實踐本發明的各種實現，且它們並不意圖將本發明限制於優選的實施方式，而是作為本發明的特定的實施例。本領域技術人員將明白，他們可以容易地將所公開的概念和具體的實施方式用作用於修改或設計用於進行本發明的相同的目的的其他方法和系統的基礎。本文引用的包括出版物、專利申請、專利和網站內容的所有參考文獻據此通過引用併入，達到如同每一個參考文獻單獨地和明確地被表明通過引用併入且在本文中以其整體提出的相同程度。在描述本發明的上下文中的術語「一 (a) 」和「一(an) 」以及「該(the) 」和相似的指示物的使用被解釋為覆蓋單數和複數兩者，除非本文另外表明或明顯地同上下文相矛盾。除非本文另外表明，本文的值的範圍的列舉僅意圖用作單獨地指代落入該範圍的每一個單獨的值的速記方法，且每一個單獨的值被併入說明書中，如同其單獨地在本文被列舉。詞語「約」當伴隨數值時應被解釋為表示達到所陳述的數值的10%且包括所陳述的數值的10%的偏差。除非另外要求，本文提供的任何和所有的實例或示例性的語言(「例如」或「諸如」)的使用，僅意圖更好地闡明本發明且並不造成對本發明的範圍的限制。說 明書中的語言不應被解釋為表示對本發明的實踐必要的任何非要求保護的要素。
權利要求
1.一種用於在細菌中表達重金屬螯合基因的載體，所述載體包括以下功能連接的元件 載體骨架， 轉錄組成型啟動子序列，其源自質體16S rrn基因， 翻譯增強子元件序列，其源自噬菌體17基因10， 螯合劑的編碼序列， 其中所述載體是在所述細菌中。
2.如權利要求I所述的載體，還包括3』UTR不依賴P因子的轉錄終止子序列。
3.如權利要求2所述的載體，其中所述3』UTR終止子是質體rpsl6基因轉錄終止子或大腸桿菌rrnB基因轉錄終止子。
4.如權利要求3所述的載體，其中所述3』UTR轉錄終止子是質體rpsl6基因轉錄終止子。
5.如權利要求I所述的載體，其中所述螯合劑由mt、ppk或P-半乳糖苷酶(IacZ)基因編碼。
6.如權利要求5所述的載體，其中所述螯合劑是由ppk合成的多磷酸鹽，且所述細菌抵抗高達約 100 ii M 萊、250 ii M 鎘、1000 u M 鋅或 3，000 u M 鉛。
7.如權利要求5所述的載體，其中所述mt是哺乳動物金屬硫蛋白。
8.如權利要求7所述的載體，其中所述螯合劑由小鼠mtl基因序列編碼，且所述細菌抵抗高達約160 ii M汞、至少約250 ii M鎘、至少約1,000 PM鋅或至少約3，OOOii M鉛。
9.如權利要求5所述的載體，其中所述螯合劑由￠-半乳糖苷酶基因序列編碼，且所述細菌抵抗高達約140 ii M汞、至少約250 ii M鎘、至少約1,000 PM鋅或至少約3，OOOii M鉛。
10.如權利要求I所述的載體，其中所述載體骨架是質粒骨架。
11.一種細菌，該細菌包括轉基因螯合劑，其中所述細菌抵抗在至少約25iiM和約IOOii M之間的Hg。
12.如權利要求11所述的細菌，其中所述螯合劑基因從強啟動子轉錄並且側翼為選定的5』 UTR和任選的選定的3』 UTR，例如至少在4，000和8，500拷貝之間的穩定的轉錄物每ng總mRNA對應於所述螯合劑基因。
13.如權利要求12所述的細菌，其中至少在6，000和7，500拷貝之間的穩定的轉錄物每ng總mRNA對應於所述螯合劑基因。
14.如權利要求12所述的細菌，其中所述螯合劑基因從源自質體16Srrn基因的轉錄組成型啟動子序列轉錄。
15.如權利要求12所述的細菌，其中所述螯合劑基因側翼為源自噬菌體T7基因10的5』 UTR翻譯增強子元件序列和質體rpsl6基因3』 UTR不依賴P因子的轉錄終止子序列。
16.如權利要求11所述的細菌，其中所述螯合劑基因從源自質體16Srrn基因的轉錄組成型啟動子序列轉錄，並且側翼為源自噬菌體17基因10的5』 UTR轉錄增強子元件序列和質體rpsl6基因3』 UTR不依賴P因子的轉錄終止子序列。
17.如權利要求11所述的細菌，其中所述螯合劑編碼序列對應於小鼠mtl基因，且其中所述細菌抵抗高達約160 ii M汞、至少約250 ii M鎘、至少約1,000 PM鋅或至少約3，000 y M鉛。
18.如權利要求11所述的細菌，其中所述螯合劑編碼序列對應於P-gal基因，且其中所述細菌抵抗高達約140 u M汞、至少約250 u M鎘、至少約1，000 u M鋅或至少約3，000 u M鉛。
19.如權利要求11所述的細菌，其中所述螯合劑編碼序列對應於ppk基因，且其中所述細菌抵抗高達約100 U M汞、高達約250 u M鎘、至少約1，000 u M鋅或至少約3，000 u M鉛。
20.如權利要求11所述的細菌，所述細菌當處於包含汞的液體環境中時，累積汞且在著色上變深。
21.如權利要求11所述的細菌，所述細菌當處於包含汞、鎘、鋅或鉛的液體環境中時，累積汞、鎘、鋅或鉛且在著色上變深。
22.如權利要求11所述的細菌，所述細菌選自大腸桿菌、假單胞菌、藍細菌和芽孢桿菌。
23.如權利要求11所述的細菌，當所述細菌處於包含汞、鎘、鋅或鉛的液體環境中時，所述細菌累積汞、鎘、鋅或鉛，形成聚集體和沉澱物。
24.如權利要求11所述的細菌，所述細菌在用於方便處理的生物過濾器中生長以從汙染液體除去重金屬。
25.如權利要求11所述的細菌，其中所述螯合劑轉基因是￠-半乳糖苷酶，且￠-半乳糖苷酶裂解5-溴-4-氯-3-吲哚基-P-D-吡喃半乳糖苷(X-gal)的能力由於重金屬的存在而降低。
26.一種用於從液體清除汞汙染的方法，所述方法包括 將表達mt、ppk或P -半乳糖苷酶基因的細菌培養物加入所述液體中，其中所述細菌培養物中的細菌抵抗在約25 ii M Hg和至少約100 UM Hg之間的Hg，和 在足以允許所述汞的螯合的一段時間之後從所述液體除去所述細菌。
27.如權利要求26所述的方法，其中在所述細菌形成塊之後除去所述細菌。
28.如權利要求26所述的方法，其中聚集體通過抽吸、篩分或過濾器去除而從經歷清除汙染的液體收集。
29.如權利要求26所述的方法，其中所述細菌表達B-半乳糖苷酶，所述方法還包括將X-gal加入至少一個樣品中和測試所述樣品以確定所述細菌代謝5-溴-4-氯-3-吲哚基-0-D-卩比喃半乳糖苷(X-gal)以產生藍色著色的能力以便確定所述樣品中的萊濃度。
30.一種從液體清除汞汙染的方法，所述方法包括 將所述液體放在包括固體基質的裝置中，其中所述基質還包括3 -半乳糖苷酶，而沒有細胞載體；和 當所述液體被從所述固體基質洗脫時，收集所述液體。
31.一種用於檢測重金屬汙染的試劑盒，所述試劑盒包括 指示劑條上的表達3-半乳糖苷酶或3-半乳糖苷酶的細菌培養物， X-gal,和 顯示著色的圖表，所述著色對應於與指示劑條上的表達3 -半乳糖苷酶或￠-半乳糖苷酶的細菌培養物接觸的液體中的Hg的各種濃度。
32.如權利要求31所述的試劑盒，所述試劑盒還包括比色增強劑。
33.一種用於檢測重金屬汙染的試劑盒，所述試劑盒包括流體容器， 表達P -半乳糖苷酶、ppk或mtl的細菌培養物，和 顯示深的著色的指示劑條，所述深的著色對應於表達P -半乳糖苷酶、PPk或mtl的所述細菌培養物當在液體中各種濃度的所述重金屬的存在下生長時的著色。
全文摘要
本發明提供了通過細菌螯合重金屬的系統。該細菌表達ppk、mt和/或β-半乳糖苷酶(lacZ)基因且可以耐受至少25μM汞、1,000μM鋅、250μM鎘和3,000μMPb。該系統允許容易確定液體中重金屬汙染物的存在和容易收集已經螯合大量重金屬的細菌。還提供了一種在細菌中基因表達的系統，該系統包括噬菌體和質體基因表達元件並遞送特別高水平的蛋白表達和重金屬抗性。
文檔編號C12N1/21GK102753691SQ201080045997
公開日2012年10月24日 申請日期2010年8月20日 優先權日2009年8月20日
發明者奧斯卡·魯伊斯 申請人:泛美波多黎各大學