包括具有生物相容性的聚合物塊和細胞的細胞構建體的製作方法

2023-05-08 22:49:46 4

專利名稱：包括具有生物相容性的聚合物塊和細胞的細胞構建體的製作方法
技術領域：
本發明涉及包括具有生物相容性的聚合物塊和細胞的細胞構建體，其中多個聚合物塊以鑲嵌模式布置在這樣的多個細胞之間的空間內。本發明還涉及製備所述細胞構建體的方法。
背景技術：
幫助陷於功能障礙或功能不全的活組織/器官再生的再生醫學的實際應用目前正在進行中。再生醫學是新的醫療技術，其使用3種因子(即細胞、支架和生長因子)來使活組織恢復與原有組織中相同或相似的形式或功能，所述活組織不再僅通過生物體內在具有的自然癒合能力來恢復。近年來，已經逐漸實現使用細胞的治療。其實例包括使用自體細胞培養的表皮，使用自體軟骨細胞的軟骨治療，使用充質幹細胞的骨再生治療，使用成肌細胞的心肌細胞片層(sheet)治療，使用角膜上皮片層的角膜再生治療，以及神經再生治療。這些新型治療與基於人造材料(骨修補材料或透明質酸注射)的常規替代醫學不同，其幫助活組織的修復或再生並且因此產生高的療效。實際上，產品如使用自體細胞培養的表皮或培養的軟骨已經被投放市場。然而，因為要被移植的細胞主要以薄片形式移植或以懸浮液狀態移植，所以目前的技術不能提供具有足夠厚度的組織。活組織原本是厚的，並且由於其厚度所以使得肌肉能夠迫使心臟搏動或允許在關節軟骨處的平滑運動。對於一般的使用細胞的組織再生，不能提供厚的組織被認為是主要的問題。例如，使用細胞片層的心肌再生被認為需要細胞片層的多層構建體以再生厚的組織。Okano等最近已經使用溫度應答性培養皿開發了細胞片層。該細胞片層不需要用酶如胰蛋白酶處理並且因此保持細胞-細胞結合以及黏著蛋白(非專利文獻I至6)。預期這樣的細胞片層製備技術可用於心肌組織的再生。因為之前的細胞片層不能形成血管網絡，所以難以再生足夠厚的組織(非專利文獻5和7)。這是因為向中心部分的細胞的營養供應在被允許變厚的細胞片層中喪失，由此細胞死亡。Okano等也認為200 μ m以上的厚度不可能達到，並且正在開發細胞片層，所述細胞片層還含有引入其中的血管上皮細胞以在細胞片 層中形成血管網絡(非專利文獻8)。然而，這不能充當實際的解決方案，原因在於存在以下問題除了目標細胞，必須製備另一個細胞源，即血管內皮細胞；難以在細胞片層中均勻地誘導血管；並且即使可以通過這種方式提供營養物的遞送路徑，在該方法中，準備的營養遞送路徑也必須精確地連接到外部營養遞送路徑。同樣，對於骨再生，已經開發了包含被添加到基質中的培養的細胞的骨再生片層。已經提出了通過將包含被培養成片狀形狀的充質幹細胞的培養的細胞片層和包含形成片狀形狀的生物可降解物質的生物可降解片分層放置製備的骨再生片層(專利文獻I)。此外，存在用於誘導間充質組織再生的片層，其中分化自間充質細胞的間充質組織前體細胞和胞外基質附著到多孔片上(專利文獻2)。這些發明是這樣的方法，其涉及將附著有培養的成骨細胞的片層放置到身體中並通過體內的膜骨化由成骨細胞形成骨皮質。然而，成骨細胞樣細胞不能在分層狀態中培養，並且由於此問題，具有成骨細胞層的片層不能提供細胞層的厚度超過100 μ m的再生片層。然後，專利文獻3已經報導了可以通過培養方法的發展/優化形成厚度為200 μ m以上的片層，但是根據此報導，僅實現了約210 μ m的骨皮質組織層的形成。如上所述，為許多組織修復提供作為厚的組成物的細胞是有難度的挑戰。其主要原因是僅通過擴散到由細胞組成的三維構建體中，營養物的滲透是不足夠的。已經設計了使用膠原的凝膠包埋培養作為解決該問題的一種方法(非專利文獻9)。然而，包埋在凝膠中的細胞不能從根源上解決該問題，原因在於細胞從凝膠的中心部分向外部區域移動並且因此，不均勻地存在於凝膠中以致中心部分的細胞密度降低。此外，通過凝膠包埋製備的三維細胞構建體不能與另一個三維構建體結合/融合併且因此，形成的三維構建體的尺寸不 能在在細胞接種時製備的尺寸之上。因此，不能採取製備小的凝膠然後將該凝膠彼此融合以製備細胞均勻分布於其中的構建體的方法。此外，專利文獻4描述了通過使用無機陶瓷小珠連接細胞來實現三維培養。然而，無機陶瓷在水保持、溶液交換、營養物擴散和緩衝能力方面較差並且實際上不能提供厚的細胞組成物。實際上，在專利文獻4的實施例中，細胞結合成150至460 μ m的顆粒，在其上有厚的PLLA無紡布層(Icm)，該層僅增加了外觀厚度。實際包含細胞的層僅是在無機陶瓷小珠的表面上的最厚為數十μ m的層。即使不具有細胞的Icm PLLA無紡布被認為是構建體，它也僅僅是具有明顯不均勻的細胞分布的構建體。因此，目前為止僅提供有具有在構建體中的不均勻的細胞分布的三維細胞構建體或具有非常薄的細胞層的構建體。現有技術文獻專利文獻專利文獻I :日本專利公布(Kokai)號2003-275294A(2003)專利文獻2 :日本專利公布(Kokai)號2006-116212A (2006)專利文獻3 :日本專利公布(Kokai)號2009-240766A (2009)專利文獻4 :日本專利公布(Kokai)號2004-267562A (2004)非專利文獻非專利文獻I Shimizu, T.等，Circ. Res. 90，e40_48 (2002)非專利文獻2 :Kushida, A.等，J. Biomed. Mater. Res.(生物醫學材料研究雜誌)51，216-223(2000)非專利文獻3 :Kushida, A.等，J. Biomed. Mater. Res.(生物醫學材料研究雜誌)45，355-362 (1999)非專利文獻4 Shimizu, T. , Yamato,M. , Kikuchi,A. & Okano, T. , Tissue Eng.(組織工程)7,141-151 (2001)非專利文獻5 Shimizu, T等,J. Biomed. Mater. Res.(生物醫學材料研究雜誌)60,110-117(2002)非專利文獻6 Harimoto, Μ.等，J. Biomed. Mater. Res.(生物醫學材料研究雜誌)62，464-470(2002)非專利文獻7 Shimizu, T. , Yamato, M. , Kikuchi, A. & Okano, Τ.，Biomaterials (生物材料)24，2309-2316 (2003)
非專利文獻8 :Inflammation and Regeneration (炎症和再生)卷 25Νο· 32005,p. 158-159. The 26th annual meeting of the Japanese Society ofInflammationand Regeneration (日本炎症和再生協會第 26 屆年會)-Pursuing fusion betweeninflammation research and regenerative medicine (追求炎症研究和再生醫學間的融合)-Mitsuo Okano非專利文獻 9 !Sustained growth and three-dimensional organization ofprimary mammary tumor epithelial cells embedded in collagen gel (包埋在膠原凝膠中的原髮乳腺腫瘤上皮細胞的持續生長和三維組織).J Yang, JRichards, P Bowman, RGuzman,J Enami,K McCormick,S Hamamoto,DPitelka,和 S Nandi. PNAS,1979年7 月 I 日，卷 76ηο·73401-3405發明概述本發明要解決的目標本發明的一個目的是提供細胞構建體，其厚度足以用於組織再生並且包括均勻分布在其中的細胞。本發明的另一目的是提供這樣的細胞構建體，其可以不使用不同於目的細胞的細胞製備。本發明的另一個目的是 提供可以自發地彼此融合的三維細胞構建體。解決目標的手段本發明的發明人通過以鑲嵌模式在三維上布置生物相容的聚合物塊(即，包含具有生物相容性的聚合材料的塊(mass))和細胞，成功地形成了三維細胞構建體，該三維細胞構建體允許營養物從三維細胞構建體的外部遞送到三維細胞構建體的內部，具有足夠的厚度，並且包含均勻分布在其中的細胞。此外，他們發現三維細胞構建體能夠通過存在於其外周的細胞的作用而自發地彼此融合。已經基於這些發現完成了本發明。本發明的實施方案涉及以下方面[I]包括具有生物相容性的聚合物塊和細胞的細胞構建體，其中多個所述聚合物塊被布置在多個所述細胞之間的空間內。[2]根據[I]所述的細胞構建體，其中所述聚合物塊的尺寸為I μ m至700 μ m。[3]根據[2]所述的細胞構建體，其中所述聚合物塊的尺寸為10 μ m至300 μ m。[4]根據[I]至[3]中任一項所述的細胞構建體，其中厚度或直徑為400μπι至3cm。[5]根據[4]所述的細胞構建體，其中厚度或直徑為720 μ m至1cm。[6]根據[I]至[5]中任一項所述的細胞構建體，其中所述聚合物塊和所述細胞之間的比率為0. 0000001 μ g至I μ g所述聚合物塊/個細胞。[7]根據[I]至[6]中任一項所述的細胞構建體，其通過溫育具有生物相容性的聚合物塊和包含細胞的培養液的混合物來製備。[8]根據[I]至[7]中任一項所述的細胞構建體，其中所述具有生物相容性的聚合物是生物可降解材料。[9]根據[I]至[8]中任一項所述的細胞構建體，其中所述具有生物相容性的聚合物是多肽、聚乳酸、聚乙醇酸、PLGA、透明質酸、糖胺聚糖、蛋白聚糖、軟骨素、纖維素、瓊脂糖、羧甲基纖維素、殼多糖或脫乙醯殼多糖。[10]根據[I]至[9]中任一項所述的細胞構建體，其中所述具有生物相容性的聚合物是明膠、膠原、彈性蛋白、纖連蛋白、ProNectin、層粘連蛋白、生腱蛋白、血纖蛋白、絲心蛋白、巢蛋白、血小板反應蛋白或RetroNectin。[11]根據[I]至[10]中任一項所述的細胞構建體，其中所述具有生物相容性的聚合物是交聯的。[12]根據[11]所述的細胞構建體，其中所述交聯是利用醛、縮合劑或酶來進行。[13]根據[I]至[12]中任一項所述的細胞構建體，其中所述具有生物相容性的聚合物是重組明膠。[14]根據[13]所述的細胞構建體，其中所述具有生物相容性的聚合物在一個分子中具有兩個或更多個細胞黏著信號。
[15]根據[13]所述的細胞構建體，其中所述重組明膠由下式表示A-[(Gly-X-Y)Jm-B其中A表示任何胺基酸或胺基酸序列；B表示任何胺基酸或胺基酸序列；總共η個X中的每個獨立地表示任何胺基酸；總共η個Y中的每個獨立地表示任何胺基酸；η表示3至100的整數；m表示2至10的整數；並且總共η個Gly-X-Y中的每個可以是彼此相同的或不同的。[16]根據[13]或[15]所述的細胞構建體,其中所述重組明膠由下式表示Gly-Ala-Pro- [ (Gly-X-Y) 63] 3_Gly其中總共63個X中的每個獨立地表示任何胺基酸；總共63個Y中的每個獨立地表示任何胺基酸；並且總共63個Gly-X-Y中的每個可以是彼此相同的或不同的。[17]根據[13]至[16]中任一項所述的細胞構建體，其中所述重組明膠具有以下任一 (I)由SEQ ID NO 1表示的胺基酸序列，或⑵與由SEQ IDNO 1表示的胺基酸序列具有80%或更高同源性並具有生物相容性的胺基酸序列。[18]製備根據[I]至[17]中任一項所述的細胞構建體的方法，所述方法包括溫育具有生物相容性的聚合物塊和包含細胞的培養液的混合物的步驟。[19]根據[18]所述的方法，其中所述溫育具有生物相容性的聚合物塊和包含細胞的培養液的混合物的步驟包括用新鮮培養基交換培養基。[20]根據[19]所述的方法，其中所述溫育具有生物相容性的聚合物塊和包含細胞的培養液的混合物的步驟包括用分化或生長培養基來交換培養基。[21]根據[18]至[20]中任一項所述的方法，其中所述溫育具有生物相容性的聚合物塊和包含細胞的培養液的混合物的步驟還包括另外加入具有生物相容性的聚合物塊。[22]通過根據[18]至[21]中任一項所述的方法製備的細胞構建體。[23]通過將多個根據[I]至[17]中任一項所述的細胞構建體融合獲得的細胞構建體。[24]製備根據[23]所述的細胞構建體的方法，所述方法包括將多個根據[I]至中任一項所述的細胞構建體進行融合的步驟。[25]製備細胞構建體的方法，所述方法包括將多個包括多個具有生物相容性的聚合物塊和多個細胞的細胞構建體進行融合的步驟，其中I個或多個聚合物塊被布置在一些或所有的由所述多個細胞形成的多個空間內。[26]根據[25]所述的製備細胞構建體的方法，其中所述聚合物塊的尺寸為I μ m至 700 μ m。[27]根據[25]或[26]所述的製備細胞構建體的方法，其中在融合前細胞構建體的厚度或直徑為10 μ m至1cm，並且在融合後細胞構建體的厚度或直徑為400 μ m至3cm。[28]製備細胞構建體的方法，所述方法包括進一步將第二聚合物塊加入到細胞構建體並將其溫育，所述細胞構建體包括多個具有生物相容性的第一聚合物塊和多個細胞，其中I個或多個聚合物塊被布置在一些或所有的由所述多個細胞形成的多個空間內。[29]根據[28]所述的製備細胞構建體的方法，其中所述第一聚合物塊的尺寸為IumM 700 μ m。 [30]根據[28]或[29]所述的製備細胞構建體的方法，其中所述第二聚合物塊的尺寸為I P m至700 μ m。[31]根據[28]至[30]中任一項所述的製備細胞構建體的方法，其中在加入所述第二聚合物塊和溫育後，厚度或直徑為400 μ m至3cm。[32]通過根據[25]至[31]中任一項所述的製備細胞構建體的方法製備的細胞構建體。[33]根據[32]所述的細胞構建體，其被用於細胞移植、細胞培養或毒力評估。發明效果本發明的細胞構建體具有足以用於組織再生的厚度並且包括均勻分布在其中的細胞。本發明的細胞構建體可以在不使用不同於目的細胞的細胞情況下製備。此外，本發明的細胞構建體能夠自發地彼此融合。本發明的細胞構建體可用於旨在再生遭受損傷或功能障礙的生物組織或器官的再生醫學。附圖簡述[圖I]圖I顯示使用重組明膠微塊(micro-block)製備的鑲嵌細胞塊(mosaiccell mass)的第7天(軟骨分化培養基)的立體顯微鏡照片。[圖2]圖2顯示使用天然明膠微塊製備的鑲嵌細胞塊的第7天(軟骨分化培養基)的立體顯微鏡照片。[圖3]圖3顯示含重組明膠微塊的鑲嵌細胞塊的切片(HE染色，放大率X5)的照片。[圖4]圖4顯示含重組明膠微塊的鑲嵌細胞塊的切片(HE染色，放大率X10)的照片。[圖5]圖5顯示含重組明膠微塊的鑲嵌細胞塊的切片(HE染色，放大率X40)的照片。[圖6]圖6顯示鑲嵌細胞塊的融合。[圖7]圖7顯示來自鑲嵌細胞塊的融合(三個鑲嵌細胞塊的融合)的HE染色切片(放大率X5)的照片。[圖8]圖8顯示來自鑲嵌細胞塊的融合(三個鑲嵌細胞塊的融合)的HE染色切片(放大率X 10)的照片。[圖9]圖9顯示來自鑲嵌細胞塊的融合(三個鑲嵌細胞塊的融合)的HE染色切片(放大率X 20)的照片。[

圖10]圖10顯示來自鑲嵌細胞塊的融合(三個鑲嵌細胞塊的融合)的HE染色切片(放大率X5)的照片。[圖11]圖11顯示來自鑲嵌細胞塊的融合(三個鑲嵌細胞塊的融合)的HE染色切片(放大率X 10)的照片。[圖12]圖12顯示具有增加的體積的鑲嵌細胞塊的立體顯微鏡照片(隨時間的變化)。[圖13]圖13顯示來 自於具有增加的體積的鑲嵌細胞塊的立體顯微鏡照片的直徑隨時間的變化。[圖14]圖14顯示來自於具有增加的體積的鑲嵌細胞塊的立體顯微鏡照片的面積隨時間的變化。[圖15]圖15顯示通過從具有增加的體積的鑲嵌細胞塊的立體顯微鏡照片計算確定的體積(4/3 Jir3)隨時間的變化。[圖16]圖16顯示含重組明膠微塊的鑲嵌細胞塊的切片(第7天(在生長培養基下),放大率X 5)。[圖17]圖17顯示含重組明膠微塊的鑲嵌細胞塊的切片(第7天(在生長培養基下)，放大率X10) O[圖18]圖18顯示具有增加的體積的第21天的HE切片的照片(放大率X5)(在生長培養基下加入重組明膠塊)。[圖19]圖19顯示具有增加的體積的第21天的HE切片的照片(放大率X40)(在生長培養基下加入重組明膠塊)。[圖20]圖20顯示具有增加的體積的第21天的HE切片的照片(放大率X5和X 20)(在軟骨分化培養基下加入重組明膠塊)。[圖21]圖21顯示GAG的譜數據。[圖22]圖22顯示在鑲嵌細胞塊中產生的GAG的量隨時間的變化。[圖23]圖23顯示由在鑲嵌細胞塊中的細胞生產/保留的ATP的量(第7天)。[圖24]圖24顯示使用PLGA微塊製備的鑲嵌細胞塊的第2天(生長培養基)的立體顯微鏡照片。[圖25]圖25顯示由心肌細胞和重組明膠微塊組成的鑲嵌細胞塊作為整體同步搏動的方式。[圖26]圖26顯示由表達GFP的HUVEC和重組明膠微塊組成的鑲嵌細胞塊(50，000個細胞+0. 03mg微塊的鑲嵌細胞塊，以及300，000個細胞+0. 2mg微塊的鑲嵌細胞塊)的螢光顯微鏡照片和顯微鏡照片。實施本發明的實施方案下文中，將詳細描述本發明的實施方案。本發明的細胞構建體包括具有生物相容性的聚合物塊和細胞，其中多個聚合物塊被布置在多個細胞之間的空間內。其一個方面的實例包括這樣的細胞構建體，其包括多個具有生物相容性的聚合物塊和多個細胞，其中一個或多個聚合物塊被布置在一些或全部的由多個所述細胞形成的多個空間內。根據本發明的聚合物塊的形狀不受特別限制並且是，例如，無定形的、球形的、顆粒狀的、粉末狀的、多孔的、纖維狀的、紡錘狀的、扁平的和片狀的形狀，優選是無定形的、球形的、顆粒狀的、粉末狀和多孔的形狀，更優選無定形的形狀。術語"無定形的"表示不均勻的表面形狀，例如，具有表面不規則性的物質，如石頭。在本發明的細胞構建體中，多個聚合物塊被布置在多個細胞之間的空間內。在本文中，"細胞之間的空間"不一定是由組成細胞產生的封閉空間，而只需要有細胞在其側面即可。不要求所有細胞都應當在它們之間產生這樣的空間。可以有這樣的區域，其中細胞彼此接觸。經由聚合物塊的細胞之間的每個空間的距離，即，從特定細胞到所選的與該特定細胞最接近的細胞的距離，不受特別限制並且優選是聚合物塊的尺寸。優選的距離也在聚合物塊的優選尺寸範圍內。
此外，在所述結構中，細胞在根據本發明的聚合物塊的側面。不要求細胞存在於所有聚合物塊之間。可以有這樣的區域，其中聚合物塊彼此接觸。經由細胞的聚合物塊之間的距離，即，從特定聚合物塊到所選的與該特定聚合物塊最接近的聚合物塊的距離，不受特別限制並且優選是一個所用細胞或包含細胞群體的細胞塊的尺寸，例如，10 μ m至1000 μ m,優選10 μ m至100 μ m,更優選10 μ m至50 μ m。(I)具有生物相容性的聚合物材料(1-1)聚合物材料在本發明中使用的具有生物相容性的聚合物不受該聚合物是否在體內降解的特別限制，只要它對生物體具有親和性即可。其優選由生物可降解材料組成。非生物可降解材料具體地是選自由以下組成的組的至少一種材料PTFE、聚氨酯、聚丙烯、聚酯、氯乙烯、聚碳酸酯、丙烯醯、不鏽鋼、鈦、聚矽氧烷和MPC。生物可降解材料具體地是選自由以下組成的組的至少一種材料多肽、聚乳酸、聚乙醇酸、PLGA、透明質酸、糖胺聚糖、蛋白聚糖、軟骨素、纖維素、瓊脂糖、羧甲基纖維素、殼多糖和脫乙醯殼多糖。它們之中，多肽是尤其優選的。在本文中，這些聚合物材料可以被給予設計以增強細胞黏著性。方法如[1]「將基質表面覆蓋以細胞黏著性基底(纖連蛋白、玻連蛋白和層粘連蛋白)或細胞黏著序列(RGD序列、LDV序列、REDV 序列、HGSR 序列、F1DSGR 序列、RYVVLPR 序列、LGTIPG 序列、RNIAEIIKDI 序列、IKVAV序列、LRE序列、DGEA序列和HAV序列(由胺基酸單字母編碼指示))肽」，[2] 「基質表面的胺化或陽離子化」，和[3] 「基質表面的等離子處理或基於電暈放電的親水處理」可以被用作具體方法。多肽的類型不受特別限制，只要它具有生物相容性即可。多肽優選是例如，明膠、膠原、彈性蛋白、纖連蛋白、ProNectin、層粘連蛋白、生腱蛋白、血纖蛋白、絲心蛋白、巢蛋白、血小板反應蛋白或RetroNectin,最優選明膠、膠原或缺端膠原(atelocollagen)。天然明膠或重組明膠優選作為在本發明中使用的明膠。重組明膠是更優選的。在本文中，天然明膠指由天然來源的膠原形成的明膠。以下在本說明書中將描述重組明膠。用於本發明的具有生物相容性的聚合物的親水性值"1/I0B"值優選為O至I. O,更優選為O至O. 6,進一步優選為O至O. 4。IOB是基於由AtsushiFujita提出的表示有機化合物的極性/非極性的有機概念圖的親水性和疏水性的指標。其細節描述於例如"Pharmaceutical Bulletin (藥物公報)",卷 2，2，pp. 163-173 (1954), " Journalof Japanese Chemistry (日本化學雜誌)"卷 11,10, pp. 719-725 (1957)和"FragranceJournal (香味雜誌)"，卷50，pp. 79-82(1981)。簡言之，該方法包括假定甲烷(CH4)是所有有機化合物的來源並且所有其他化合物是甲烷衍生物，為碳原子數、取代基、改性部分、環等中的每個選擇特定的數值，加入得分以確定有機值(OV)和無機值(IV)，並且將該值繪製在圖表上，其中有機值在X軸上而無機值在Y軸上。有機概念圖上的IOB是指有機概念圖上的無機值(IV)與有機值(OV)的比率，S卩，"無機值(IV)/有機值(OV)"。對於有機概念圖的細節，參見"Shinban Yuuki Gainenzu-Kiso to Ouyou- (New Edition, The OrganicConceptual Diagram, its Fundamentals and Applications in English (英文新版，有機概念圖，其原理和應用))〃，(Yoshio Koda 等，Sankyo Publishing Co. , Ltd. , 2008)"。在本說明書中，親水性和疏水性由"1/Ι0Β"值(IOB的倒數)指示。此符號表示"1/Ι0Β"值越小("1/Ι0Β"值越接近0)，它越親水。用於本發明的聚合物的"1/Ι0Β"值被設置在上述範圍內，由此親水性得到增強並且吸水性得到加強。推測所得的聚合物有效地作用於營養物的保持並且，結果，有助於細胞在本發明的三維細胞構建體(鑲嵌細胞塊)中的穩定性和生存力。在用於本發明的具有生物相容性的聚合物是多肽的情況中，其由總平均親水性(GRAVY)值指示的親水性和疏水性的指標優選為-9. O至O. 3，更優選-7. O至O. O。總平均 親水性(GRAVY)值可以通過以下文獻的方法獲得「Gasteiger E. ,Hoogland C. ,GattikerA.，Duvaud S.，Wilkins M. R.，Appel R. D.，Bairoch A. ；Protein Identification andAnalysis Tools on the ExPASy Server (在ExPASy伺服器上的蛋白質鑑定和分析工具)；(In) John M. Walker (ed) The Proteomics Protocols Handbook (蛋白質組學方案手冊)，Humana Press(2005). pp. 571-607」 和 「Gasteiger E. , Gattiker A.，Hoogland C.，Ivanyi
I.，Appel R. D. , Bairoch A. ExPASy the proteomics server for in-depth proteinknowledge and analysis (ExPASy :用於深度蛋白質知識和分析的蛋白質組學伺服器).；Nucleic Acids Res.(核酸研究)31 :3784-3788 (2003) 」。用於本發明的聚合物的GRAVY值被設置在上述範圍內，由此親水性得到增強並且吸水性得到加強。推測所得的聚合物有效地作用於營養物的保持並且，結果，有助於細胞在本發明的三維細胞構建體(鑲嵌細胞塊)中的穩定性和生存力。(1-2)交聯在本發明中使用的具有生物相容性的聚合物材料可以是交聯的或可以不是交聯的。那些交聯的是優選的。本領域中已知的任何方法，如熱交聯、化學交聯、使用醛(例如甲醛和戊二醛)的交聯、使用縮合劑(碳二亞胺、氨腈等)的交聯、酶交聯、光交聯、UV交聯、疏水相互作用、氫鍵或離子相互作用可以用作交聯方法。使用戊二醛的交聯方法或熱交聯方法是優選的。光交聯的實例包括基於對包含引入其中的光反應性基團的聚合物的光照的那些，或基於在光敏劑存在下光照的那些。光反應性基團的實例包括肉桂基、香豆素基團、二硫代氨基甲醯基、咕噸染料和莰醌。在使用酶進行交聯的情況中，酶不受特別限制，只要它具有在聚合物材料之間交聯的作用。可以優選使用轉穀氨醯胺酶和漆酶，最優選使用轉穀氨醯胺酶進行交聯。可以進行使用轉穀氨醯胺酶的酶交聯的蛋白質的具體實例不受特別限制，只要它們是具有賴氨酸殘基和穀氨醯胺殘基的蛋白質。轉穀氨醯胺酶可以來源於哺乳動物或可以來源於微生物。其具體實例包括ACTIVA系列(由Ajinomoto Co. , Inc.生產，哺乳動物來源的轉穀氨醯胺酶，作為試劑銷售)，例如，來源於豚鼠肝的轉穀氨醯胺酶、來源於山羊的轉穀氨醯胺酶和來源於兔的轉穀氨醯胺酶(由Oriental Yeast Co.，ltd.，Upstate USAInc.或Biodesign International生產),以及來源於人的凝血因子(因子XIIIa, HaematologicTechnologies,Inc.)。聚合物材料的交聯包括兩個步驟將聚合物材料溶液與交聯劑混合的步驟，以及使所得的溶液進行反應的步驟。在本發明中，用交聯劑處理聚合物材料的混合溫度不受特別限制，只要溶液可以被混合。該溫度優選為O°C至100°C，更優選為O°C至40°C，進一步優選為O°C至30°C，進一步優選為3°C至25°C，進一步優選為3°C至15°C，進一步優選為3°C至10°C，尤其優選為3V至7V。對於使聚合物材料和交聯劑進行反應的步驟，溫度可以升高。反應溫度不受特別限制，只要交聯進行。考慮到聚合物材料的變性或降解，該溫度基本為-10(TC至200°C，更優選為0°C至60°C，更優選為(TC至40°C，進一步優選為3°C至25°C，進一步優選為3°C至 15°C，進一步優選為3°C至10°C，尤其優選為3°C至7°C。即使不使用交聯劑，也可以進行聚合物材料的交聯。交聯方法的具體實例包括但不限於熱交聯方法。不使用交聯劑的交聯方法的反應溫度不受特別限制，只要可以進行交聯。該溫度優選為-100°C至500°C，更優選為(TC至300°C，進一步優選為50°C至300°C，進一步優選為100°C至 250°C，進一步優選為 120°C至 200°C。(1-3)重組明膠在本發明中重組明膠是指多肽或蛋白樣物質，其通過基因重組技術製備並具有類似於明膠的胺基酸序列。對於可以用於本發明的重組明膠，它優選具有重複的由表徵膠原的Gly-X-Y (X和Y各自獨立地表示任何胺基酸)表示的序列(多個Gly-X-Y序列可以是相同的或彼此不同的)。優選地，在分子中包含細胞黏著信號的兩個或多個序列。具有來源於膠原的部分胺基酸序列的胺基酸序列的重組明膠可以被用作在本發明中使用的重組明膠。例如，可以使用在 EP1014176、US6992172、W02004/85473 和 W02008/103041 中描述的那些，儘管重組明膠不限於它們。在本發明中使用的優選的重組明膠是具有以下方面的重組明膠用於本發明的重組明膠具有基於天然明膠的原有性能的極好的生物相容性，由於是非天然來源的所以不用擔心BSE等，並且還具有極好的非感染性。此外，因為與天然明膠相比用於本發明的重組明膠是均質的並且其序列是確定的，所以根據交聯或以下所述的那些，它可以被精確設計以在強度或降解性方面具有小的變化。重組明膠的分子量優選為2KDa至lOOKDa，更優選為2. 5KDa至95KDa，進一步優選為5KDa至90KDa，最優選為IOKDa至90KDa。重組明膠具有由表徵膠原的Gly-X-Y表示的序列的重複。在本文中，多個Gly-X-Y序列可以是相同的或彼此不同的。在Gly-X-Y中，Gly表示甘氨酸，而X和Y各自表示任何胺基酸(優選地，除甘氨酸外的任何胺基酸)。與其他蛋白質相比，表徵膠原的GXY序列在明膠/膠原的胺基酸組成和序列中是非常特殊的部分結構。在該部分中，甘氨酸佔全部的約1/3並且以三個胺基酸中有一個的比率出現在胺基酸序列中。甘氨酸是最簡單的胺基酸。其在分子鏈上的位置較少受限制，並且甘氨酸對在凝膠化期間螺旋結構的再生貢獻很大。優選的是，亞胺基酸(脯氨酸或羥基脯氨酸)應當大量地包括在由X和Y表示的胺基酸中，並佔所有胺基酸的10%至45%。優選的是，序列中優選80%以上，更優選95%以上，最優選99%以上的胺基酸應當是GXY重複結構。在通常的明膠中，關於極性胺基酸，帶電荷的那些和不帶電荷的那些以I : I的比率存在。在本文中，極性胺基酸專門指半胱氨酸、天冬氨酸、穀氨酸、組氨酸、賴氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸和精氨酸。其中，極性不帶電荷的胺基酸指半胱氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸。極性胺基酸與組成用於本發明的重組明膠的所有胺基酸的比率為10至40 %，優選20至30 %。此外，優選的是，不帶電荷的胺基酸與極性胺基酸的比率應當為5%至小於20%，優選小於10%。進一步優選的是，選自絲氨酸、蘇氨酸、天冬醯胺、酪氨酸和半胱氨酸的任何一個胺基酸，優選兩個以上的胺基酸不應當包含在序列中。 通常，多肽中充當細胞黏著信號的最小胺基酸序列是已知的(例如，"MedicinaPhilosophica",卷 9, No. 7 (1990), ρ· 527, Nagai Shoten Co·,Ltd·)。優選的是，用於本發明的重組明膠在分子中應當具有兩個以上的這些細胞黏著信號。根據可以與之黏著的多類細胞，具體序列優選RGD序列、LDV序列、REDV序列、YIGSR序列、PDSGR序列、RYVVLPR序列、LGTIPG序列、RNIAEIIKDI序列、IKVAV序列、LRE序列、DGEA序列和HAV序列，更優選RGD序列、HGSR序列、F1DSGR序列、LGTIPG序列、IKVAV序列和HAV序列,尤其優選RGD序列(由胺基酸單字母編碼指示)。在RGD序列中，ERGD序列是優選的。由細胞生產的基質的量可以通過使用具有細胞黏著信號的重組明膠來改善。在例如使用充質幹細胞作為細胞的軟骨分化的情況中，糖胺聚糖(GAG)的生產可以得到改善。對於RGD序列在用於本發明的重組明膠中的布置，優選的是，RGD序列之間的胺基酸的數目應當為O至100，優選25至60，並且不應當是均勻確定的。從細胞黏著/生長的角度，此最小胺基酸序列的含量優選為每個蛋白分子3至50個序列，更優選每個蛋白分子4至30個序列，尤其優選每個蛋白分子5至20個序列，最優選每個蛋白分子12個序列。在用於本發明的重組明膠中，RGD基序與胺基酸總數的比率優選為至少O. 4%。在重組明膠包括350個以上的胺基酸的情況中，優選的是，每一段350個胺基酸應當包括至少一個RGD基序。RGD基序與胺基酸總數的比率更優選為至少0.6%，進一步優選為至少0.8%，進一步優選為至少1.0%，進一步優選至少1.2%，最優選至少1.5%。RGD基序在重組明膠中的數目優選為每250個胺基酸至少4個，更優選6個，進一步優選8個，進一步優選12至16個。O. 4%的RGD基序比率對應於每250個胺基酸至少一個RGD序列。因為RGD基序的數目是整數，所以由251個胺基酸組成的明膠必須包含至少兩個R⑶序列以滿足O. 4%的特徵。優選地，本發明的重組明膠包含至少兩個R⑶序列/250個胺基酸，更優選至少三個RGD序列/250個胺基酸，進一步優選至少四個RGD序列/250個胺基酸。在另一方面中，本發明的重組明膠包括至少4個RGD基序，優選6個，更優選8個，進一步優選12至16個RGD基序。此外，重組明膠可以被部分水解。 優選的是，用於本發明的重組明膠應當具有由A [ (Gly-X-Y) n]mB表示的重複結構。m優選為2至10，更優選為3至5。η優選為3至100，更優選為15至70，最優選為50至65。優選的是，多個天然存在的膠原序列單元應當與重複單元結合。在本文中，天然存在的膠原可以是任何天然存在的膠原並且優選為I型、II型、III型、IV型和V型膠原，更優選為I型、II型和III型膠原。在另一個實施方案中，膠原的來源優選是人、牛、豬、小鼠或大鼠，更優選人。用於本發明的重組明膠的等電點優選為5至10，更優選為6至10，進一步優選為
7至 9. 5。優選地，重組明膠不被去氨基化。優選地，重組明膠不具有端肽。 優選地，重組明膠是基本純的膠原材料，其由編碼天然膠原的核酸製備。用於本發明的重組明膠尤其優選是具有以下任一的重組明膠(I)由SEQ ID NO 1表示的胺基酸序列；或(2)與由SEQ ID NO : I表示的胺基酸序列具有80%以上(更優選90%以上，最優選95%以上)的同源性並且具有生物相容性的胺基酸序列。用於本發明的重組明膠可以通過本領域技術人員已知的基因重組技術製備並且可以根據在例如 EP1014176A2、US6992172、W02004-85473 或 W02008/103041 中描述的方法製備。具體地，獲得編碼預定的重組明膠的胺基酸序列的基因，並且將其結合到表達載體中從而製備重組表達載體，然後將該重組表達載體引入到合適的宿主中以製備轉化體。將獲得的轉化體在合適的培養基中培養，由此製備重組明膠。由此，製備的重組明膠可以從培養物中收集從而製備用於本發明的重組明膠。(1-4)具有生物相容性的聚合物塊在本發明中，使用包含上述具有生物相容性的聚合物材料的塊(block)(塊(mass))。聚合物塊的製備方法不受特別限制。例如，可以使用粉碎機(New Power Mill,etc.)將包含聚合物的固體物質粉碎，然後通過篩子篩分以獲得具有所需大小的塊。每個聚合物塊的尺寸優選為I μ m至700 μ m,更優選10 μ m至700 μ m,進一步優選
10μ m至300 μ m,進一步優選20 μ m至150 μ m,尤其優選25 μ m至106 μ m。此外,聚合物塊可以是等於或長於700 μ m的長線狀形式(其厚度在上述尺寸範圍內)，並且可以是片層或凝膠形式(具有在上述尺寸範圍內的厚度)。通過採用此優選範圍，細胞可以更均勻地存在於構建體中。(2)細胞可以根據本發明的細胞構建體的目的來合適地選擇用於本發明的細胞。其類型不受特別限制。此外，根據細胞構建體的使用目的，所用的細胞可以是一種類型的，或者可以使用多個類型的組合。此外，所用的細胞優選動物細胞，更優選來源於脊椎動物的細胞，尤其優選來源於人的細胞。來源於脊椎動物的細胞(尤其，來源於人的細胞)的類型可以是以下中任一多能細胞、體幹細胞、前體細胞和成熟細胞。例如，例如，ES細胞、GS細胞或iPS細胞可以用作多能細胞。例如，充質幹細胞(MSC)、造血幹細胞、羊膜細胞、臍帶血細胞、來源於骨髓的細胞、心肌幹細胞、來源於脂肪的幹細胞或神經幹細胞可以用作體幹細胞。例如，來源於皮膚、真皮、表皮、肌肉、心肌、神經、骨、軟骨、內皮、腦、上皮、心臟、腎、肝、胰、脾、口腔、角膜、骨髓、臍帶血、羊膜或頭髮的細胞可以用作前體細胞和成熟細胞。例如，ES細胞、iPS細胞、MSC、軟骨細胞、成骨細胞、骨原細胞、間充質細胞、成肌細胞、心肌細胞、心臟成肌細胞、神經細胞、肝細胞、β細胞、成纖維細胞、角膜內皮細胞、血管內皮細胞、角膜上皮細胞、羊膜細胞、臍帶血細胞、來源於骨髓的細胞或造血幹細胞可以用作來源於人的細胞。此夕卜，細胞的來源可以是自體細胞和異體細胞中任一。當組合使用多種類型的細胞時，這樣的組合的實例是血管細胞和其他細胞的組合。血管細胞的實例包括血管內皮細胞、血管內皮前體細胞和造血幹細胞。組合使用血管細胞和其他細胞，可以將血管引入至本發明的細胞構建體中，並且營養物、氧氣和其他物質可以得到供應。(3)細胞構建體
在本發明中，使用上述具有生物相容性的聚合物塊和細胞，在三維上將多個聚合物塊以鑲嵌的模式布置在多個細胞之間的空間內。這使得能夠從三維細胞構建體的外部向其內部遞送營養物，並且它導致具有足夠厚度的三維細胞構建體的形成。同時，三維細胞構建體能夠通過存在於其外周的細胞的作用而自發地彼此融合。可以通過下述方法將本發明的細胞構建體的厚度或直徑調整至所需水平。下限優選215 μ m，400 μ m是更優選的，並且730 μ m是最優選的。厚度或直徑的上限不受特別限制。通常，上限優選3cm，更優選2cm，並且更優選1cm。細胞構建體的厚度或直徑優選為400 μ m至3cm,更優選500 μ m至2cm,並且進一步優選720 μ m至1cm。在實例中，首先製備720 μ m以上的細胞構建體(圖3)，然後通過融合製備813-μ m厚的細胞構建體(圖10)。本發明的細胞構建體的特徵在於包含聚合物塊的區域和包含細胞的區域以鑲嵌模式布置。本文使用的術語"細胞構建體的厚度或直徑"如下定義。當在細胞構建體中選擇給定點A時，在通過點A的直線之中，將細胞構建體分開以使從細胞構建體的外部到點A的距離最小的線段的長度被指定為"線段A"。選擇在細胞構建體中使線段A的長度最大化的點A，並將線段A的長度指定為"細胞構建體的厚度或直徑"。本發明的細胞構建體能夠具有足夠的厚度並且包括均勻分布在其中的細胞。因此，這樣的細胞構建體可以優選用於細胞移植、細胞培養、毒力評估或其他目的。當本發明的細胞構建體用於這樣的目的時，優選地，根據本發明的細胞構建體的厚度或直徑可以在上述範圍內。此外，在使用本發明的細胞構建體在製備本發明的細胞構建體的方法(下述)中作為融合前的細胞構建體或作為加入第二聚合物塊前的細胞構建體的情況中，細胞構建體的厚度或直徑的範圍優選為10 μ m至Icm,更優選10 μ m至2000 μ m,進一步優選15 μ m至1500 μ m,最優選 20 μ m 至 1300 μ m。在本發明的細胞構建體中，細胞和聚合物塊之間的比率不受特別限制並且聚合物塊/細胞的比率優選為O. 0000001 μ g至I. O μ g，更優選為O. 000001 μ g至O. I μ g，進一步優選為O. 00001 μ g至O. 01 μ g，最優選為O. 00002 μ g至O. 006 μ go通過採用上述範圍，細胞可以更均勻地存在。此外，通過採用上述範圍作為下限，細胞可以在用於上述應用期間發揮作用。通過採用上述範圍作為上限，任選存在於聚合物塊中的組分可以被供應到細胞。在本文中，聚合物塊中的組分的實例包括但不特別限於包含在下述培養基中的組分。(4)製備細胞構建體的方法本發明的細胞構建體可以通過以交替的方式放置由具有生物相容性的聚合物材料和細胞組成的塊(mass)(塊(block))來製備。製備方法不受特別限制並且優選的方法包括形成聚合物塊並且之後將細胞接種於其中。具體地，本發明的細胞構建體可以通過溫育具有生物相容性的聚合物塊和包含細胞的培養液的混合物來製備。例如，細胞和事先製備的具有生物相容性的聚合物塊以鑲嵌的模式布置在容器中或布置在保持在容器中的液體中。該布置的方式優選為使用自然聚集、自由下落、離心或攪拌以促進或控制由細胞和生物相容性基質組成的鑲嵌模式的順序形成。所用的容器優選是由低細胞黏著性材料或非細胞黏著性材料製成的容器，更優選由聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、玻璃、聚碳酸酯或聚對苯二甲酸乙二酯製成的容器。優選地，容器應當具有平的、U形的或V形的底部。通過上述方法獲得的鑲嵌模式的細胞構建體可以通過例如以下方法被製成具有所需尺寸的細胞構建體(I)分別地將製備的鑲嵌模式的細胞塊彼此融合，或(2)在分化培養基或生長培養基下增加其體積。 用於此融合或體積增加的方法不受特別限制。例如，在溫育具有生物相容性的聚合物塊和包含細胞的培養液的混合物的步驟中，用分化培養基或生長培養基代替培養基，由此可以增加細胞構建體的體積。優選地，在溫育具有生物相容性的聚合物塊和包含細胞的培養液的混合物的步驟中，可以向其中加入額外的具有生物相容性的聚合物塊，以製備具有所需尺寸的其中均勻存在細胞的細胞構建體。包括分別使製備的鑲嵌模式的細胞塊彼此融合的方法具體是用於製備細胞構建體的方法，所述方法包括融合多個細胞構建體(包括多個具有生物相容性的聚合物塊和多個細胞，其中I個或多個聚合物塊被布置在一些或全部的由多個細胞形成的多個空間內)的步驟。根據用於製備本發明的細胞構建體的方法的"具有生物相容性的聚合物塊(類型、尺寸等)"、"細胞"、"細胞之間的空間"、"獲得的細胞構建體(尺寸等)"、"細胞和聚合物塊之間的比率"等的優選範圍類似於與上述本發明的細胞構建體相關的優選範圍。此外，每個細胞構建體在融合前的厚度或直徑優選為ΙΟμπι至1cm，而融合後的厚度或直徑優選為400 μ m至3cm。在本文中，每個細胞構建體在融合前的厚度或直徑更優選為10 μ m至2000 μ m,進一步優選為15 μ m至1500 μ m,最優選為20 μ m至1300 μ m,而融合後的厚度或直徑更優選為500 μ m至2cm,進一步優選為720 μ m至1cm。上述通過向其中加入額外的具有生物相容性的聚合物塊來製備具有所需大小的細胞構建體的方法具體是這樣的製備細胞構建體的方法，所述方法包括向細胞構建體(包括多個具有生物相容性的第一聚合物塊和多個細胞，其中一個或多個聚合物塊被布置在一些或全部的由所述多個細胞形成的多個空間內)另外加入第二聚合物塊並將其溫育的步驟。在本文中，"具有生物相容性的聚合物塊(類型、尺寸等)"、"細胞"、"細胞之間的空間"、"獲得的細胞構建體(尺寸等)"、"細胞和聚合物塊之間的比率"等的優選範圍類似於與上述本發明的細胞構建體相關的優選範圍。在本文中，優選的是，要被融合的細胞構建體應當以O至50μπι，更優選O至20 μ m,進一步優選O至5 μ m的間隔放置。在細胞構建體的融合中，細胞或由細胞生產的基質被認為通過細胞生長/擴散而起黏合劑的作用，以致連接細胞構建體。可以通過採用上述範圍來促進細胞構建體之間的黏著。根據本發明的每個第一聚合物塊的尺寸優選為I μ m至700 μ m,更優選為10 μ m至700 μ m,進一步優選為10 μ m至300 μ m,進一步優選為20 μ m至150 μ m,尤其優選為25 μ m至106 μ m。此外，根據本發明的每個第二聚合物塊的尺寸同樣優選為I μ m至700 μ m，更優選為10 μ m至700 μ m,進一步優選為10 μ m至300 μ m,進一步優選為20 μ m至150 μ m,尤其優選為25 μ m至106 μ m。通過用於製備本發明的細胞構建體的方法獲得的細胞構建體的厚度或直徑的範圍優選為400 μ m至3cm,更優選為500 μ m至2cm,進一步優選為720 μ m至1cm。對於進一步向細胞構建體中加入第二聚合物塊以及將它們溫育，優選的是，添加第二聚合物塊的速度應當根據所用細胞的生長速率合適地進行選擇。具體地，如果以快的速度加入第二聚合物塊，則細胞向細胞構建體的外部區域移動從而降低均勻的細胞分布。如果以慢的速度加入它們，則形成具有高比率細胞的位點從而降低均勻的細胞分布。因此， 考慮所用細胞的生長速率來選擇速度。通過用於製備本發明的細胞構建體的方法製備的細胞構建體可以具有所需的構型和尺寸，以及足夠的厚度。因為細胞可以均勻地分布於其中，所以同樣，該細胞構建體可以優選用於細胞移植、細胞培養、毒力評估或其他用途。下文中，將參考實施例來更具體地描述本發明。然而，不意欲將本發明限於實施例。
實施例實施例I :重組明膠作為重組明膠製備下述CBE3(描述於W02008-103041中)。CBE3分子量51.6kD結構GAP[ (GXY) 63] 3G胺基酸的數目571RGD序列的數目12亞胺基酸含量33%基本上100%的胺基酸是GXY重複結構。CBE3的胺基酸序列不包含絲氨酸、蘇氨酸、天冬醯胺、酪氨酸和半胱氨酸。CBE3具有ERGD序列。等電點9.34，GRAVY 值:_0· 682，1/I0B 值0. 323胺基酸序列(序列表中的SEQ ID NO :1)(除了末端部的X變為了" P"以外，與W02008/103041 中的 SEQ ID NO :3 相同) GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGP I GPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G實施例2 製備重組明膠微塊使用重組明膠CBE3製備作為基質塊的無定形微塊。將IOOOmg重組明膠溶解在9448yL超純水中。在加入152yL IN HCl後，將400yL 25%戊二醛以I. 0%的終濃度加入其中，並在50°C反應3小時以製備交聯的明膠凝膠。將此交聯的明膠凝膠浸入IL O. 2M甘氨酸溶液中並在40°C振蕩2小時。然後，將交聯的明膠凝膠在5L超純水中振蕩洗滌I小時，並將該超純水用新鮮的超純水替換，接著再次洗滌I小時。重複該步驟以完成總計6次洗滌操作。將經如此洗滌的交聯的明膠凝膠在_80°C冷凍達5小時，然後在凍幹機(EYELA，FDU-1000)中凍幹。使用 New Power Mill (OsakaChemical Co. , Ltd. , New Power MillPM-2005)將獲得的凍乾產物粉碎。以最大的轉數進行粉碎達總計5分鐘(I分鐘X5輪)。通過不鏽鋼篩將獲得的顆粒篩分以獲得25至53 μ m和53至106 μ m的重組明膠微塊。實施例3 製備天然明膠微塊使用天然明膠(Nippi,Inc. ,Nippi明膠/高級明膠APAT)製備作為基質塊的無定形微塊。將IOOOmg天然明膠溶解在9448 μ L超純水中。在加入152 μ L IN HCl後，以1.0%的終濃度向其中加入400 μ L 25%戊二醛並在50°C反應3小時以製備交聯的明膠凝膠。將該交聯的明膠凝膠浸入IL O. 2M甘氨酸溶液中並在40°C振蕩2小時。然後，將交聯的明膠凝 膠在5L超純水中振蕩洗滌I小時，並將該超純水用新鮮的超純水替換，接著再次洗滌I小時。重複該步驟以完成總計6次洗滌操作。將經如此洗滌的交聯的明膠凝膠在-80°C冷凍達
5小時，然後在凍幹機(EYELA, FDU-1000)中凍幹。使用 New Power Mill (Osaka ChemicalCo. ,Ltd. ,New Power MillPM-2005)將獲得的凍幹的產物粉碎。以最大的轉數進行粉碎達總計5分鐘(I分鐘X5輪)。通過不鏽鋼篩將獲得的顆粒篩分以獲得25至53μπι和53至106 μ m的天然明膠微塊。實施例4 :使用重組明膠微塊製備鑲嵌細胞塊利用生長培養基(TakaraBio Inc. ;MSCGM_CD (TM) BulletKit (TM))將來源於人骨髓的充質幹細胞(hMSC)調整到500000個細胞/mL。在加入實施例2中製備的重組明膠微塊至 I. 0mg/mL 後，將 100 μ L 混合物接種到 Sumilon Celltight X96U 平板(SumitomoBakelite Co.，Ltd.，U形底部)並靜置18小時，以製備直徑約為1mm、由重組明膠微塊和hMSC細胞組成的球形鑲嵌細胞塊(0. (K^yg聚合物塊/細胞)。然後，用軟骨分化培養基(Takara Bio Inc. ；hMSC Differentiation BulletKit(TM), Chondrogenic, TGF-β 3)(200 μ L)來替代培養基。在第7天，形成直徑(=厚度)為I. 54mm的球形鑲嵌細胞塊(圖I)。在本文中，該鑲嵌細胞塊被製備成球形，原因在於其是在U形平板中製備的。在第3、7、10、14、17和21天進行培養基替換。實施例5 :使用天然明膠微塊製備鑲嵌細胞塊利用生長培養基(TakaraBio Inc. ;MSCGM_CD (TM) BulletKit (TM))將來源於人骨髓的充質幹細胞(hMSC)調整到500000個細胞/mL。在加入實施例3中製備的天然明膠微塊至I. 0mg/mL後，將100 μ L混合物接種到Sumilon Celltight X96U平板並靜置18小時，以製備直徑約為1mm、由天然明膠微塊和hMSC細胞組成的球形鑲嵌細胞塊(0. 002 μ g聚合物塊/細胞)。然後，用軟骨分化培養基(Takara Bio Inc. ；hMSC DifferentiationBulletKit (TM), Chondrogenic, TGF- β 3) (200 μ L)來替代培養基。在第 7 天，形成直徑(=厚度)為I. 34mm的球形鑲嵌細胞塊(圖2)。在本文中，該鑲嵌細胞塊被製備成球形，原因在於其是在U形平板中製備的。利用生長培養基(TakaraBio Inc. ;MSCGM_CD (TM) BulletKit (TM))將來源於人骨髓的充質幹細胞(hMSC)調整到500000個細胞/mL。通過將條件變為終濃度為O. 005mg/mL、O. 01mg/mL、0. lmg/mL、0. 2mg/mL> I. Omg/mL和2. Omg/mL來製備在實施例3中製備的天然明膠微塊，將100 μ L每種混合物接種到Sumilon Celltight X96U平板並靜置18小時以成功地製備直徑稍小於Imm的球形鑲嵌細胞塊(O. 00001,0. 0002,0. 0004,0. 002和O. 004 μ g聚合物塊/細胞)。實施例6:樣品分析製備在實施例4中使用重組明膠微塊製備的鑲嵌細胞塊的組織切片。在從實施例4中製備的培養基中的鑲嵌細胞塊去除培養基後，通過加入200 μ L PBS洗滌所得的鑲嵌細胞塊，並將此PBS除去。將洗滌步驟重複兩次。然後，將經洗滌的鑲嵌細胞塊浸入10%福馬林中，並進行福馬林固定達2天。然後，將所得的細胞塊包埋在石蠟中以製備組織切片。將切片用HE(蘇木精-伊紅)染色，並且分析細胞和明膠微塊的狀態。結果顯示在圖3、4和5中。可以由此確認製備了其中明膠微塊和細胞以鑲嵌模式布置的三維構建體；並 且細胞以正常狀態存在於鑲嵌細胞塊中。此外，從此橫截面切片，顯示可以製備厚度為至少720 μ m以上的鑲嵌細胞塊。實施例7 :鑲嵌細胞塊的融合檢測在實施例4中製備的鑲嵌細胞塊是否可以融合，即，所布置的鑲嵌細胞塊是否能夠通過自然融合形成較大的三維構建體。將在實施例4中製備的第6天的兩個、三個或四個鑲嵌細胞塊布置在Sumilon CelltightX96U平板中並培養5天。結果,顯示位於每個鑲嵌細胞塊外周上的細胞使所述鑲嵌細胞塊彼此結合，由此鑲嵌細胞塊自然融合。圖6顯示利用立體顯微鏡拍攝的照片。關於在融合起始日(稱作第6天)的鑲嵌細胞塊，鑲嵌細胞塊僅僅彼此鄰近放置。與此對比，在從融合起始日起的第5天(稱作第11天)，新的層在鑲嵌細胞塊之間形成，表明了鑲嵌細胞塊融合的方式。同樣，圖7、8、9、10和11顯示製備融合的鑲嵌細胞塊的組織切片以及用HE染色其橫截面(使用10%福馬林進行固定，並且使用石蠟包埋進行包埋)的結果。從圖中清楚可見，通過細胞和由細胞產生的胞外基質在鑲嵌細胞塊之間形成融合層，從而使鑲嵌細胞塊彼此融合和結合。由此顯示，本發明中製備的鑲嵌細胞塊能夠自然融合併且能夠通過該融合形成較大的構建體。因此證明，使用本發明實現了具有厚度的細胞片層的製備和更立體的三維構建體的製備。實施例8 :在生長培養基下使用重組明膠微塊製備鑲嵌細胞塊利用生長培養基(TakaraBio Inc. ;MSCGM_CD (TM) BulletKit (TM))將來源於人骨髓的充質幹細胞(hMSC)調整到500000個細胞/mL。在加入實施例2中製備的重組明膠微塊至I. Omg/mL後，將100 μ L混合物接種到Sumilon Celltight X96U平板並靜置18小時，以製備直徑約為Imm的球形鑲嵌細胞塊(O. 002 μ g聚合物塊/細胞)。然後，培養基的體積增加至200 μ L，並且培養鑲嵌細胞塊，每3天替換培養基。在第7天，形成直徑(=厚度)為I. 34mm的球形鑲嵌細胞塊(在本文中，由於其在U形平板中製備，所以該鑲嵌細胞塊被製備成球形)。第7天的鑲嵌細胞塊的切片照片顯示在圖16和17中。如從圖中清楚可見，在此橫截面切片上，甚至是厚度較小的位點的厚度也達到至少624μπι以上。實施例9 :鑲嵌細胞塊體積的增加(在生長培養基下)將O. Img在實施例2中製備的重組明膠微塊懸浮在生長培養基(Takara BioInc. ;MSCGM-ra(TM)BulletKit(TM))中，並將其在培養基替換期間加入到在實施例8中製備的第三天(第3天)的鑲嵌細胞塊中。隨後，在第7、10、14、17和21天在培養基替換時加入O. Img的重組明膠微塊。在立體顯微鏡下在對該鑲嵌細胞塊的觀察中的直徑(作為兩個不同直徑的平均值計算)、拍照的鑲嵌細胞塊的面積、以及計算的體積(從以上確定的直徑根據4/3 π r3計算而來)中的每一個隨時間的變化顯示在圖12、13、14和15中。結果，在第21天最終形成平均直徑(=厚度)為3. 41mm的球形鑲嵌細胞塊。由此證明可以製備尺寸達至少3. 41mm的鑲嵌細胞塊。還證明可以通過依靠 該方法繼續增加體積來增加尺寸。此時的組織切片(HE染色)顯示在圖18和19中。如從圖中清楚可見，細胞和重組明膠微塊以鑲嵌模式布置。此外，因為作為樣品，鑲嵌細胞塊的尺寸約為3_並且小，所以極難正確地產生通過球的中心的橫截面。因此，雖然球的最深的部分沒有在切片中獲得，但是即使是在樣品中收集到該切片的部分也顯示具有至少I. 17_的厚度。如在圖12、13和14中所示，在第7、10、14、17和21天培養基替換期間不加入重組明膠微塊培養的情況下，在鑲嵌細胞塊中直徑不改變。在不加入重組明膠微塊培養的鑲嵌細胞塊中，僅由細胞和細胞產生的胞外基質組成的層狀結構由增殖的細胞在鑲嵌細胞塊的最外層形成。結果，形成這樣的狀態，其中營養的擴散被細胞和所產生的胞外基質的層封鎖，從而防止細胞進一步增殖(尺寸增大(sized up))。這就是直徑不變的原因。另一方面，當在培養基替換時不斷地加入重組明膠微塊時，這些重組明膠微塊總是與增殖的細胞一起以鑲嵌模式配合，由此由細胞和重組明膠微塊組成的鑲嵌結構可以繼續得以維持，即使是在細胞增殖後。結果，由重組明膠微塊提供的營養供應通路始終得到保證，並且不產生由細胞和所生成的胞外基質無意形成的外層。可以對所得的鑲嵌細胞塊進行尺寸增大。實施例10 :鑲嵌細胞塊的體積的增加(在軟骨分化培養基下)將O. Img在實施例2中製備的重組明膠微塊(O. Img)懸浮在軟骨分化培養基(Takara Bio Inc. ；hMSC Differentiation BulletKit (TM), Chondrogenic, TGF-β 3)中，並在培養基替換期間將其加入到在實施例4中製備的第三天(第3天)的鑲嵌細胞塊。隨後，在第7、10、14、17和21天在培養基替換時加入O. Img的重組明膠微塊。在立體顯微鏡下在對該鑲嵌細胞塊的觀察中的直徑(作為兩個不同直徑的平均值計算)、拍照的鑲嵌細胞塊的面積、以及計算的體積(根據4/3 π r3從以上確定的直徑計算而來)中的每一個隨時間的變化顯示在圖12、13、14和15中。結果，在第21天最終形成平均直徑(=厚度)為2. 05mm的球形鑲嵌細胞塊。由此證明可以製備尺寸達至少2. 05mm的鑲嵌細胞塊。還證明可以通過依靠該方法繼續增加體積來增加尺寸。此時的組織切片(HE染色)顯示在圖20和21中。如從圖中清楚可見，細胞和重組明膠微塊以鑲嵌模式布置。此外，因為作為樣品，鑲嵌細胞塊的尺寸約為2_並且小，所以極難正確地產生通過球的中心的橫截面。因此，雖然球的最深的部分沒有在切片中獲得，但是即使是在樣品中收集到該切片的部分也顯示具有至少897 μ m的厚度。如在圖12、13和14中所示，在第7、10、14、17和21天培養基替換期間不加入重組明膠微塊培養的情況下，在鑲嵌細胞塊中直徑不改變。在不加入重組明膠微塊培養的鑲嵌細胞塊中，僅由細胞和細胞產生的胞外基質組成的層狀結構由增殖的細胞在鑲嵌細胞塊的最外層形成。結果，形成這樣的狀態，其中營養的擴散被細胞和所產生的胞外基質的層封鎖，從而防止細胞進一步增殖(尺寸增大)。這就是直徑不變的原因。另一方面，當在培養基替換時不斷地加入重組明膠微塊時，這些重組明膠微塊總是與增殖的細胞一起以鑲嵌模式配合，由此由細胞和明膠微塊組成的鑲嵌結構可以繼續得以維持，即使是在細胞增殖後。結果，由重組明膠微塊提供的營養供應通路始終得到保證，並且不產生由細胞和所生成的胞外基質無意形成的外層。可以對所得的鑲嵌細胞塊進行尺寸增大。實施例11 :確定在鑲嵌細胞塊中製備的GAG的量(隨時間的變化)對於在實施例4和5中製備的鑲嵌細胞塊(hMSC細胞+重組明膠以及hMSC細胞+天然明膠)以及僅使用細胞製備的細胞塊(不使用明膠塊，通過與在實施例4中相同的方法製備)，確定每個鑲嵌細胞塊中的糖胺聚糖的量。通過使用二甲基亞甲基藍染料的方法進行測量(Farndale 等，Improved quantitation and sulphated glycosaminoglycansby use of dimethylmethyIene blue (通過使用二甲基亞甲基藍的改善的定量和硫酸化的糖胺聚糖).Biochimica et Biophysica Acta (生物化學和生物物理學學報)883(1986) 173-177)，並且使用 Sulfated GAG Quantification Kit (硫酸化 GAG 定量試劑盒)(Seikagaku Biobusiness Corp.)作為試劑。測量在530nm處的吸光度以進行量化。 如在圖21中所示,確認通過該方法看到在525-530nm處的特徵吸收峰。確定GAG的量隨時間的過去的結果顯示在圖22的圖表中。結果，在不使用明膠微塊的情況下製備的細胞塊中產生的糖胺聚糖(GAG)的量低，而在使用天然明膠微塊製備的鑲嵌細胞塊以及使用重組明膠微塊製備的鑲嵌細胞塊中產生的GAG的量極其高。由此可以確認在實施例4和5中製備的鑲嵌細胞塊中，軟骨分化得到促進；並且製備的鑲嵌細胞塊具有細胞的功能(具有產生GAG的能力)。此外，產生的GAG的量在使用重組明膠微塊製備的鑲嵌細胞塊中比在使用天然明膠微塊製備的鑲嵌細胞塊中顯著更高。這證明，與天然明膠微塊產生的那些相比，使用重組明膠微塊製備的鑲嵌細胞塊能夠維持更高的細胞活性以及基質生成活性，並且顯示使用重組明膠能夠實現的基質生成量是使用天然明膠所不可能實現的。實施例12 :鑲嵌細胞塊的ATP定量確定在每個鑲嵌細胞塊中由細胞產生/保留的ATP(腺苷三磷酸)的量。已知ATP是一般生物體的能量源。可以通過確定合成/保留的ATP的量來了解細胞的活性代謝狀態和活性狀態。在測量中使用CellTiter-Glo (Promega Corp.)。為進行比較，對於在實施例4和5中製備的鑲嵌細胞塊(hMSC細胞+重組明膠以及hMSC細胞+天然明膠)以及僅使用細胞製備的細胞塊(不使用明膠塊，通過與在實施例4中相同的方法製備)，使用CellTiter-Glo來確定在每個鑲嵌細胞塊中的ATP的量，上述細胞塊都是第7天的。結果顯示在圖23中。因此清楚的是，產生/保留的ATP的量在使用明膠微塊製備的鑲嵌細胞塊中比在僅使用細胞製備的細胞塊中顯著更高(P < ο. οι)。這表明，微塊以鑲嵌模式配合，由此由微塊提供進入鑲嵌細胞塊的營養供應通路，並且與在僅由細胞組成的塊中相比，細胞的高活性代謝狀態得到更好的維持。進一步證明，產生/保留的ATP的量在使用重組明膠微塊製備的鑲嵌細胞塊中比在使用天然明膠微塊製備的鑲嵌細胞塊中顯著更高。由此證明，與天然明膠微塊產生的那些相比，使用重組明膠微塊製備的鑲嵌細胞塊展示更高的細胞存活並且在此鑲嵌細胞塊中的細胞是活的。據顯示，使用重組明膠能夠實現的細胞存活的改善是使用天然明膠所不可能實現的。實施例13 :製備PLGA微塊
將O.3g PLGA(聚乳酸-乙醇酸共聚物)；ffako Pure Chemical Industries,Ltd.,PLGA7520)溶解在二氯甲烷(3mL)中。將PLGA溶液在乾燥機(EYELA，FDU-1000)中真空乾燥以獲得PLGA的乾燥產物。將PLGA的乾燥產物利用New Power Mill (Osaka ChemicalCo. ,Ltd. ,New Power MillPM-2005)粉碎。以最大轉數進行粉碎(10秒X20輪)。通過不鏽鋼篩將獲得的顆粒篩分從而獲得25至53 μ m和53至106 μ m的PLGA微塊。PLGA:" 1/I0B"值0· 0552·實施例14 :使用PLGA製備鑲嵌細胞塊使用生長培養基(TakaraBio Inc. ;MSCGM_CD (TM) BulletKit (TM))將來源於人骨髓的充質幹細胞(hMSC)調整至500000個細胞/mL。在加入在實施例13中製備的PLGA微塊(通過改變條件使終濃度為O. lmg/mL、0. 2mg/mL、I. Omg/mL和2. Omg/mL來製備)後，將100 μ L每種混合物接種到Sumilon Celltight X96U平板並靜置18小時，以製備直徑略小於Imm的球形鑲嵌細胞塊(O. 0002,0. 0004,0. 002和O. 004 μ g的聚合物塊/細胞)。然後，將培養基的體積增加至200 μ L，並且培養每種鑲嵌細胞塊，每3天替換培養基。在本文中，由於在U形平板中製備，所以該鑲嵌細胞塊被製備成球形。第2天的PLGA鑲嵌細胞塊的立體顯微鏡照片顯示在圖24中。實施例15 :製備瓊脂糖微塊將超純水(IOOmL)加入到5g瓊脂糖粉末，並通過使用微波爐加熱來溶解粉末。使所獲得的5%的瓊脂糖溶液回到室溫以獲得固體物質。將該固體物質在-80°C冷凍5小時然後在凍幹機(EYELA，FDU-1000)中凍幹以獲得瓊脂糖的凍乾產物。使用New PowerMill (Osaka Chemical Co. , Ltd. ,New Power Mill PM-2005)將瓊脂糖的凍乾產物粉碎。以最大轉數進行粉碎(10秒X 20輪)。通過不鏽鋼篩將獲得的顆粒篩分從而獲得25至53 μ m和53至106 μ m的瓊脂糖微塊。IOB 值3.18實施例16 :使用瓊脂糖製備鑲嵌細胞塊使用生長培養基(TakaraBio Inc. ;MSCGM_CD (TM) BulletKit (TM))將來源於人骨髓的充質幹細胞(hMSC)調整至500，000個細胞/mL。在加入在實施例15中製備的瓊脂糖微塊(通過改變條件使終濃度為0. lmg/mL和I. Omg/mL來製備)後，將100 μ L每種混合物接種到Sumilon Celltight X96U平板並靜置18小時，以製備直徑略小於Imm的球形鑲嵌細胞塊(0. 0002和0. 002 μ g的聚合物塊/細胞)。然後，將培養基的體積增加至200 μ L，並且培養每種鑲嵌細胞塊，每3天替換培養基。在本文中，由於在U形平板中製備，所以該鑲嵌細胞塊被製備成球形。實施例17 :使用心肌細胞製備鑲嵌細胞塊使用用於心肌細胞的培養基(Primary Cell Co. ,Ltd ;用於心肌細胞的CMCM培養基)將新生SD大鼠心肌細胞(rCMC)調整至500000個細胞/mL。在加入在實施例2中製備的重組明膠微塊至0. 5、I. O或3. Omg/mL後,將100 μ L每種混合物接種到Sumilon CelltightX96U平板(Sumitomo BakeliteCo. ,Ltd. ,U形底部)並靜置18小時，以製備直徑約為I至2mm、由重組明膠微塊和rCMC細胞組成的鑲嵌細胞塊(0. 001,0. 002和0. 006 μ g的聚合物塊/個細胞)。在第3、7、10、14、17和21天進行培養基替換。在第I天和第3天的階段，已經能夠確認rCMC鑲嵌細胞塊作為整個構建體同步搏動(圖25)。因為在說明書中難以顯示運動的圖像，所以圖25是通過在O. 2秒後從運動的圖像捕獲相同位點的靜止圖像而獲得的圖像。如從用三角標記的位點清楚可見，在兩張圖像中整個構建體移動。這可以顯示，甚至使用心肌細胞也能夠形成本發明的三維細胞構建體(鑲嵌細胞塊)，並且還證明獲得了作為細胞構建體的包含心肌細胞的鑲嵌細胞塊，其作為整個構建體同步搏動。實施例18 :使用表達GFP的HUVEC (人臍靜脈內皮細胞)製備鑲嵌細胞塊使用用於內皮細胞的培養基(Kurabo Industries Ltd.;培養基200S，LSGS，抗菌劑GA溶液)將表達GFP的人臍靜脈內皮細胞(GFP-HUVEC ；Angio-Proteomie)調整至500000個細胞/mL。在加入在實施例2中製備的重組明膠微塊至O. 3、I. O或3. Omg/mL後，將 100 μ L 每種混合物接種到 Sumilon Celltight X96U 平板(Sumitomo Bakelite Co.,Ltd.，U形底部)(O. 0006,0. 002和O. 006 μ g聚合物塊/個細胞)。同樣地，也將細胞調整 至1，500, 000個細胞/mL，並且在加入在實施例2中製備的重組明膠微塊至I. Omg/mL後，將100 μ L 或 200 μ L 混合物接種到 Sumilon Celltight X96U 平板(Sumitomo Bakelite Co.,Ltd.，U形底部)並製備。將它們全部分別靜置18小時，以製備直徑約為I至2_、由重組明膠微塊和GFP-HUVEC細胞組成的鑲嵌細胞塊。在第3、7、10、14、17和21天進行培養基替換。圖26顯示50000個細胞+0. 03mg微塊的鑲嵌細胞塊和300000個細胞+0. 2mg微
塊的鑲嵌細胞塊的顯微鏡照片和螢光顯微鏡照片。因為GFP-HUVEC細胞發射GFP螢光，所以容易通過螢光顯微鏡來了解在鑲嵌細胞塊中的分布。由此顯示，甚至使用血管內皮細胞也能夠製備本發明的三維細胞構建體(鑲嵌細胞塊)。還證明，可以使用各種細胞(如充質幹細胞、心肌細胞和血管內皮細胞)來形成本發明的細胞構建體(鑲嵌細胞塊)。同時顯示，可以使用各種聚合物塊(如重組明膠塊、動物明膠塊、PLGA塊和瓊脂糖塊)來形成本發明的細胞構建體(鑲嵌細胞塊)。這證明可以使用各種細胞種類和各種聚合物塊種類來形成本發明的三維細胞構建體(鑲嵌細胞塊)。
權利要求
1.細胞構建體，其包括具有生物相容性的聚合物塊和細胞，其中多個所述聚合物塊被布置在多個所述細胞之間的空間內。
2.根據權利要求I所述的細胞構建體,其中所述聚合物塊的尺寸為IU m至700 ii m。
3.根據權利要求2所述的細胞構建體，其中所述聚合物塊的尺寸為10ii m至300 ii m。
4.根據權利要求I至3中任一項所述的細胞構建體，其中厚度或直徑為400ii m至3cm。
5.根據權利要求4所述的細胞構建體，其中厚度或直徑為720ii m至1cm。
6.根據權利要求I至5中任一項所述的細胞構建體，其中所述聚合物塊和所述細胞之間的比率為0. 0000001 y g至I y g所述聚合物塊/個細胞。
7.根據權利要求I至6中任一項所述的細胞構建體，其通過溫育所述具有生物相容性的聚合物塊和包含所述細胞的培養液的混合物來製備。
8.根據權利要求I至7中任一項所述的細胞構建體，其中所述具有生物相容性的聚合物是生物可降解材料。
9.根據權利要求I至8中任一項所述的細胞構建體，其中所述具有生物相容性的聚合物是多肽、聚乳酸、聚こ醇酸、PLGA、透明質酸、糖胺聚糖、蛋白聚糖、軟骨素、纖維素、瓊脂糖、羧甲基纖維素、殼多糖或脫こ醯殼多糖。
10.根據權利要求I至9中任一項所述的細胞構建體，其中所述具有生物相容性的聚合物是明膠、膠原、彈性蛋白、纖連蛋白、ProNectin、層粘連蛋白、生腱蛋白、血纖蛋白、絲心蛋白、巢蛋白、血小板反應蛋白或RetroNectin。
11.根據權利要求I至10中任一項所述的細胞構建體，其中所述具有生物相容性的聚合物是交聯的。
12.根據權利要求11所述的細胞構建體，其中所述交聯是使用醛、縮合劑或酶來進行。
13.根據權利要求I至12中任一項所述的細胞構建體，其中所述具有生物相容性的聚合物是重組明膠。
14.根據權利要求13所述的細胞構建體，其中所述具有生物相容性的聚合物在ー個分子中具有兩個或更多個細胞黏著信號。
15.根據權利要求13所述的細胞構建體，其中所述重組明膠由下式表示 A- [ (Gly-X-Y) n] m-B 其中A表示任何胺基酸或胺基酸序列；B表示任何胺基酸或胺基酸序列；總共n個X中的每個獨立地表示任何胺基酸；總共n個Y中的每個獨立地表示任何胺基酸；n表示3至100的整數；m表示2至10的整數；並且總共n個Gly-X-Y中的每個可以是彼此相同的或不同的。
16.根據權利要求13或15所述的細胞構建體，其中所述重組明膠由下式表示Gly-Ala-Pro- [ (Gly-X-Y) 63] 3_Gly 其中總共63個X中的每個獨立地表示任何胺基酸；總共63個Y中的每個獨立地表示任何胺基酸；並且總共63個Gly-X-Y中的每個可以是彼此相同的或不同的。
17.根據權利要求13至16中任一項所述的細胞構建體，其中所述重組明膠具有以下任 (1)由SEQID NO :I表示的胺基酸序列，或 (2)與由SEQID NO :1表示的胺基酸序列具有80%或更高同源性並具有生物相容性的胺基酸序列。
18.製備根據權利要求I至17中任一項所述的細胞構建體的方法，所述方法包括溫育具有生物相容性的聚合物塊和包含細胞的培養液的混合物的步驟。
19.根據權利要求18所述的方法，其中所述溫育具有生物相容性的聚合物塊和包含細胞的培養液的混合物的步驟包括用新鮮培養基交換培養基。
20.根據權利要求19所述的方法，其中所述溫育具有生物相容性的聚合物塊和包含細胞的培養液的混合物的步驟包括用分化或生長培養基來交換培養基。
21.根據權利要求18至20中任一項所述的方法，其中所述溫育具有生物相容性的聚合物塊和包含細胞的培養液的混合物的步驟還包括另外加入具有生物相容性的聚合物塊。
22.通過根據權利要求18至21中任一項所述的方法製備的細胞構建體。
23.通過將多個根據權利要求I至17中任一項所述的細胞構建體融合獲得的細胞構建體。
24.一種製備根據權利要求23所述的細胞構建體的方法，所述方法包括將多個根據權利要求I至17中任一項所述的細胞構建體進行融合的步驟。
25.—種製備細胞構建體的方法，所述方法包括將多個細胞構建體融合的步驟，所述細胞構建體包括多個具有生物相容性的聚合物塊和多個細胞，其中I個或多個聚合物塊被布置在ー些或所有的由所述多個細胞形成的多個空間內。
26.根據權利要求25所述的製備細胞構建體的方法，其中所述聚合物塊的尺寸為Iμπι至 700 μ m。
27.根據權利要求25或26所述的製備細胞構建體的方法，其中在融合前細胞構建體的厚度或直徑為10 μ m至1cm，並且在融合後細胞構建體的厚度或直徑為400 μ m至3cm。
28.一種製備細胞構建體的方法，所述方法包括進ー步將第二聚合物塊加入到細胞構建體並將其溫育，所述細胞構建體包括多個具有生物相容性的第一聚合物塊和多個細胞，其中I個或多個聚合物塊被布置在ー些或所有的由所述多個細胞形成的多個空間內。
29.根據權利要求28所述的製備細胞構建體的方法，其中所述第一聚合物塊的尺寸為IumM 700 μ m。
30.根據權利要求28或29所述的製備細胞構建體的方法，其中所述第二聚合物塊的尺寸為I μ m至700 μ m。
31.根據權利要求28至30中任一項所述的製備細胞構建體的方法，其中在加入所述第ニ聚合物塊和溫育後，厚度或直徑為400 μ m至3cm。
32.通過根據權利要求25至31中任一項所述的製備細胞構建體的方法製備的細胞構 建體。
33.根據權利要求32所述的細胞構建體，其用於細胞移植、細胞培養或毒カ評估。
全文摘要
本發明的一個目的是提供一種細胞三維構建體，其具有足以用於組織再生的厚度並包括在其中均勻分布的細胞。本發明提供包括具有生物相容性的聚合物塊和細胞的細胞構建體，其中多個聚合物塊被布置在多個細胞之間的空間內。
文檔編號A61L27/00GK102858381SQ201180011860
公開日2013年1月2日 申請日期2011年3月1日 優先權日2010年3月1日
發明者中村健太郎 申請人:富士膠片株式會社