調節心臟細胞中的磷酸酶活性的製作方法

2023-05-09 01:12:16

專利名稱：調節心臟細胞中的磷酸酶活性的製作方法
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背景可逆的蛋白磷酸化表示了介導外部效應分子和胞內事件之間精細串話的關鍵信號途徑一體化的細胞基礎。在心臟中，Ca2+循環和收縮性受到蛋白激酶和磷酸酶活性反應各種次級信使信號之間良好平衡的控制。
根據心臟的泵作用，在fight-or-flight情況的過程中，可以將人心臟輸出提高近5倍，且這與camp依賴性蛋白激酶(PKA)的β-腎上腺素激活相關。然後PKA磷酸化一組控制舒張-收縮耦合循環的關鍵調節Ca2+調控蛋白，如受磷蛋白、理阿諾鹼受體、L-型通道Ca2+和肌鈣蛋白I(Bers，D.M.，2002 Nature；415198-205)。
儘管蛋白激酶及其含磷蛋白底物，已經充分表徵了心臟泵作用的基礎強化作用，但對逆轉提高的心肌收縮性的蛋白激酶的相似研究，沒有得到充分的發展。來自常見基因家族的填塞物，主要的Ser/Thr磷酸酶(1型、2A型和2B型(鈣調磷酸酶)，是高度同源的蛋白質(40-50％)(Cohen，P.，1990 Phosphoprotein Res；24230-5)，在控制心臟收縮性和肥大中起著關鍵作用。已經表明蛋白磷酸酶2A催化亞基的超表達降低心肌功能並導致病理性的心肌肥大(Brewis，N.等，2000Am J Physiol Heart Circ Physiol；279H1307-18；Gergs，U.等，2004 J Biol Chem.)。此外，鈣調磷酸酶，是一種鈣依賴性磷酸酶，通過調節NFAT轉錄因子活性誘導肥大。5令人感興趣地，這種磷酸酶的抑制在體內和體外阻滯了心肌肥大(Brewis，N.等，2000；Molkentin，J.D.，1998 Cell；93215-28)。
在人和實驗性心力衰竭中，與肌質網(SR)相連的1型磷酸酶的活性顯著提高，表明這可能是降低功能、擴張型心肌病和早產兒死亡的起作用因素(Huang等，1999 Circ Res；85848-55；Sande，J.B.，等，2002 Cardiovasc Res；53382-91；Boknik，P.等，2000 NaunynSchmiedebergs Arch Pharmacol；362222-31；Gupta，R.C.等，1997Circulation；96(增補1)I-361；Neumann，J.1997 J Mol Cell Cardiol；29265-72；Carr，A.N.等，2002，Mol Cell Biol；224124-35)。然而，β-腎上腺素能反應性中磷酸酶抑制的作用在之前是未知的。
發明概述特別地，發現了心臟細胞中磷酸酶抑制劑的表達可以用來治療心臟病，例如，心力衰竭。降低磷酸酶活性可以提高β-腎上腺素能反應性。
因此，一方面中，本公開的特徵在於一種方法，包括將調節細胞中磷酸酶活性例如1型磷酸酶活性的試劑給予心臟細胞，例如心肌細胞。心臟細胞可以在體外或在體內。例如，心臟細胞可以在患者的心臟中。該方法可以用於治療患者，例如患有心臟病的患者，例如心力衰竭。通常，患者是哺乳動物，例如，人或非人哺乳動物。
1型磷酸酶包括，但不限於，PP1cα、PP1cβ、PP1cδ和PP1cγ。
一實施方案中，試劑是包括編碼抑制磷酸酶活性例如1型磷酸酶活性的蛋白質序列的核酸。可以以有效降低待治療細胞中磷酸酶活性和/或提高β-腎上腺素能反應性的含量來給藥試劑。
另一實施方案中，試劑是提高內源核酸表達的核酸，該內源核酸編碼抑制磷酸酶活性的蛋白質。例如，核酸可以包括編碼轉錄因子的序列，例如工程化的轉錄因子，如嵌合鋅指蛋白。再一實施例中，核酸是整合至內源核酸之中或附近的調節序列，例如，整合至編碼磷酸酶抑制劑-1(「I-1」)的基因之中或附近，該內源核酸編碼抑制磷酸酶活性的蛋白質。
再一實施方案中，試劑是可以提供基因表達的核酸調節劑的核酸。例如，核酸可以是表達這樣的核酸調節劑，例如，dsRNA(例如，siRNA)、反義RNA或核酶的核酸。
可以使用病毒顆粒，例如病毒或病毒樣顆粒來遞送試劑。病毒顆粒可以源自腺相關病毒、腺病毒或慢病毒。
一實施方案中，通過注射引入病毒顆粒，例如，直接注射至心臟中，例如，直接注射至左心室表面。另一實施方案中，將病毒顆粒引入循環系統的內腔中，例如，引入患者心臟的室或內腔中或心臟的血管中。例如，可以打開心包膜並將化合物注射至心臟中，例如，使用注射器和導管。可以將化合物引入主動脈的內腔中例如主動脈根、引入冠狀動脈中或引入心臟的內腔中。可以將病毒顆粒引入冠狀動脈中。例如，還可以使用順行性或逆行性阻塞來限制血流以提高在血管中例如在冠狀動脈中的停留時間。
一實施方案中，通過經由皮膚的注射來引入病毒顆粒，例如，從股動脈逆行至冠狀動脈。再一實施方案中，例如使用斯滕特固定模引入病毒顆粒。例如，將病毒顆粒塗覆於斯滕特固定模上並將該斯滕特固定模插入血管中，如冠狀動脈、外周血管或腦動脈。
一實施方案中，引入病毒顆粒包括例如部分或完全限制通過冠狀動脈的血流，將病毒遞送系統引入冠狀動脈的內腔中，並允許心臟泵動，同時血液的冠狀靜脈流出得到限制。可以例如通過膨脹至少一個、兩個或三個血管成形術擴張氣囊來進行通過冠狀血管血流的限制。限制通過冠狀血管的血流可以持續，例如，至少一分鐘、兩分鐘、三分鐘或四分鐘。例如可以通過血管成形術擴張氣囊內腔的順行性注射來進行病毒顆粒進入冠狀動脈的引入。限制的冠狀血管可以是左前降動脈(LAD)、遠端迴旋支動脈(LCX)、大冠狀靜脈(GCV)、心中靜脈(MCV)或前心室內靜脈(AIV)。可以在冠狀血管的缺血預處理後進行病毒顆粒的引入，例如，通過限制血流，例如通過膨脹至少一個、兩個或三個血管成形術擴張氣囊來進行預處理。冠狀血管的缺血預處理可以持續至少一分鐘、兩分鐘、三分鐘或四分鐘。
一實施方案中，引入病毒顆粒包括限制血液流出心臟的主動脈流，例如部分或全部，將病毒遞送系統引入循環系統的內腔中並使心臟泵動，例如，對抗封閉的系統(isovolumically)，同時限制血液的主動脈流出。通過將血流改變方向至冠狀動脈來進行血流流出心臟的主動脈流的限制。可以通過夾緊例如夾緊肺動脈來完成血液的主動脈流限制。例如可以使用導管或例如直接注射來進行病毒顆粒的引入。可以通過遞送至主動脈根來進行病毒顆粒的引入。
一實施方案中，給藥的病毒顆粒數量是，例如，至少1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015或1×1016單位(例如，基因組或斑形成單位)，或，例如，1×109至1×1018或1×1011至1×1016之間。
還可以使用病毒顆粒以外的工具來遞送試劑，例如，脂質體或其他非病毒遞送載體。
另一方面中，公開的特徵在於可以進入細胞的病毒顆粒。該顆粒包括編碼非病毒蛋白的核酸，例如，降低磷酸酶活性的蛋白或調節心臟活動的蛋白。病毒顆粒可以是病毒或病毒樣顆粒。一實施方案中，病毒顆粒源自腺相關病毒。腺相關病毒是血清型1(AAV1)、血清型2(AAV2)、血清型3(AAV3)、血清型4(AAV4)、血清型5(AAV5)、血清型6(AAV6)、血清型7(AAV7)、血清型8(AAV8)或血清型9(AAV9)。例如，病毒顆粒是修飾的腺相關病毒或重建的病毒或病毒樣顆粒，例如，可以感染細胞，例如，肌細胞，例如心肌細胞。
另一實施方案中，病毒顆粒源自慢病毒或腺病毒。
調節心臟活動的蛋白實例包括調節磷酸酶活性的蛋白(例如，1型磷酸酶抑制劑，例如，I-1)或肌質膜Ca2+ATPase(SERCA)，例如，SERCA1(例如，1a或1b)、SERCA2(例如，2a或2b)或SERCA3。
公開的特徵還在於包括一劑或多劑在此所述的病毒遞送系統的製劑。一劑可以包括，例如，病毒遞送系統的1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015或1×1016單位(例如，基因組或斑形成單位)。一實施方案中，一劑中至多為1×1019單位的病毒遞送系統。製劑可以是無細胞製劑，例如，藥物製劑，例如，適於引入患者中的製劑。製劑還可以含有低於10、5、1、0.1或0.001％pfu野生型病毒(例如，可以複製且不包括非病毒核酸序列的病毒)。一實施方案中，製劑無野生型病毒。
公開的特徵還在於包括降低例如心肌細胞中磷酸酶活性的試劑的斯滕特固定模。例如，可以將試劑塗覆於斯滕特固定模上。例如，試劑可以在病毒顆粒內並將病毒顆粒塗覆於斯滕特固定模的一個或多個表面上，例如，接觸血管的表面。「斯滕特固定模」是為了植入體腔內來防止或抑制內腔閉合而構造的醫療裝置。可以構造斯滕特固定模來植入例如血管內，如動脈或其他體腔、孔或導管，如尿道。通常斯滕特固定模由生物相容金屬或塑料製得。如在此所用的，「塗覆或含有」試劑的斯滕特固定模意思是含有固定在表面或包含在內的試劑的斯滕特固定模，使得允許將試劑從斯滕特固定模釋放出來，因此，將試劑遞送至斯滕特固定模附近的組織中。
可以通過將斯滕特固定模植入患者受折磨的血管中來治療患者。血管是例如冠狀動脈，還可以是例如外周動脈或腦動脈。
術語「治療」意思是以有效改善與疾病相關的病症、症狀或參數或防止疾病進展的含量、方式和/或模式來給藥試劑，至基本上顯著的程度或至本領域技術人員可檢測的程度。有效量、方式或模式可以根據患者而改變並可以對患者定製。例如，給藥方式可以包括通過病毒或病毒樣顆粒的遞送。通過防止疾病的進展，治療可以防止受影響的或診斷的患者中或懷疑患有疾病的患者中疾病的惡化，而且治療可以防止處於疾病風險中或懷疑患有疾病患者的疾病或疾病症狀的發作。
如在此所用的，術語「心臟病」指的是削弱其正常功能的心臟的結構或功能異常。例如，心臟病可以是心力衰竭、缺血、心肌梗塞、充血性心力衰竭、心律不齊、移植排斥等。術語包括特徵在於收縮異常、Ca2+代謝異常的疾病和特徵在於心律不齊的疾病。
術語「心力衰竭」指的是多種疾病中的一種，其中心臟適當泵動來滿足身體需要的能力具有缺陷。許多情況中，心力衰竭是心肌細胞舒張-收縮耦合的各種步驟中細胞水平的一種或多種異常的結果。一種這樣的異常是SR功能缺陷。
如在此所用的，術語「心臟細胞」指的是以下的細胞(a)存在於患者中心臟的一部分，(b)體外維持心臟的一部分，(c)心臟組織的一部分或(d)從患者心臟分離的細胞。例如，細胞可以是心肌細胞。
如在此所用的，術語「心臟」指的是存在於患者中的心臟或維持於患者體外的心臟。
如在此所用的，術語「心臟組織」指的是源自患者心臟的組織。
如在此所用的，術語「體細胞基因轉移」指的是將基因轉移至體細胞中，相對於將基因轉移至種系中。
如在此所用的，術語「化合物」指的是使用本發明的方法可以有效地遞送至患者心臟的化合物。這樣的化合物可以包括，例如，基因、藥物、抗生素、酶、化學物質、化學物質的混合物或生物大分子。
如在此所用的，術語「限制血流」指的是基本上阻斷通過血管的血流，例如，進入遠端主動脈及其分支的血流。例如，至少50％流出心臟的血液得到限制，優選75％和更優選80、90或100％流出心臟的血液得到限制。例如可以用夾子阻塞主動脈和肺動脈來限制血流。
「病毒遞送系統」指的是可以將包括非病毒序列的核酸引入哺乳動物細胞中的病毒顆粒，例如，病毒或病毒樣顆粒。病毒遞送系統自身可以或不可以勝任病毒複製。
將結合本發明的詳述來進一步地詳細描述本發明的這些和其他特徵。
附圖簡述可以結合附圖來理解通過舉例給出的以下詳述，但不是將本發明限制於所述的特定實施方案，附圖在此引入作為參考。現在通過非限制性實施例和參照附圖來描述本發明的各種優選特徵和實施方案，其中


圖1A和1B呈現了結果，表明磷酸酶抑制劑-1(「I-1」)磷酸化在衰竭的人心臟中顯著降低(A)9個非衰竭供體(D)和10個衰竭(F)心臟勻漿中I-1的蛋白水平(上圖)和磷酸化(中間)的代表性免疫印跡。在相同的印跡中測定了鈣調蛋白水平(CSQ，下圖)並用作內部控制。(B)人心臟中I-1蛋白水平的定量揭示了沒有改變。然而，I-1磷酸化在衰竭的人心臟中顯著降低。*表示P＜0.05vs.非衰竭供體心臟。
圖2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G和2H顯示了衰竭人心臟的心肌細胞中組成型活性I-1蛋白的表達結果(A-D)用直光(左圖)或螢光(右圖)觀察表達(上圖)β-半乳糖苷酶-GFP(對照)或(下圖)I-1T35D-GFP的分離的衰竭人肌細胞。成功感染的細胞顯示出綠色(右圖)。(E)Ad.GFP和(F)Ad.I-1T35D感染的細胞反應最大濃度異丙基腎上腺素的心肌細胞收縮的代表性痕跡。在100nM異丙基腎上腺素下Ad.GFP和Ad.I-1T35D感染的細胞中(G)細胞收縮和(H)再次伸長的速率定量。*表示P＜0.05。值是3-5個人心臟的至少8-12個細胞的平均。
圖3A顯示了免疫印跡，描繪了表達的活性抑制劑-1蛋白高於內源抑制劑-1水平～25倍，導致1型磷酸酶活性15％的降低。*P＜0.05，每組n＝6。圖3B以柱狀圖的形式顯示了來自3個月大的I-1*和野生型(WT)中心臟收縮性Langendorff體內測定的壓力測量值，表明抑制劑-1心臟呈現出顯著提高的壓力產生速率(±dP/dt)。圖3C以柱狀圖的形式顯示了肌細胞收縮速率的測量值。圖3D以柱狀圖的形式顯示了鈣瞬變幅度的測量值。*P＜0.05v.s.WT和#P＜0.05vs.WT+ISO，每組n＞來自6-8個心臟的30個心肌細胞。
圖4A顯示了免疫印跡(和相同的柱狀圖定量)，描繪了SERCA2、受磷蛋白(PLN)、集鈣蛋白(CSQ)、二氫吡啶受體(DHPR)、肌鈣蛋白I(TnI)和理阿諾鹼受體(RYR2)的水平。*P＜0.05，各自對於WT和TG，n＝至少5個心臟。圖4B顯示了免疫印跡(和相同的柱狀圖定量)，描繪了活性抑制劑-1心臟中Ser16和Thr7的受磷蛋白的磷酸化，以及理阿諾鹼受體和肌鈣蛋白I的磷酸化(mol Pi/mol RyR)。*P＜0.05，對於WT和TG，n＝至少5個心臟。圖4C在上圖中用圖描繪了WT vs.活性抑制劑-1心肌細胞中的電流-電壓相關性。下圖中，圖4C用圖描繪了I-1*OE心肌細胞中(vs.野生型)L-型Ca2+通道的鈣依賴性鈍化動力學。*P＜0.05，n＝每組5個心臟和每組至少25個心肌細胞。
圖5A以柱狀圖的形式顯示了主動脈縮窄後6周時野生型vs.轉基因小鼠的超聲波心動描記測定的結果(Vcfc，左心室末端收縮和末端舒張直徑，和h/r速率)。P＜0.05，n＝每組5隻小鼠。圖5B以柱狀圖形式顯示了野生型vs.轉基因小鼠的測重分析的結果。*P＜0.05vs.假手術組，WT縮窄和I-1*縮窄心臟之間p＜0.05；n＝每組4-5。圖5C顯示了柱狀圖，顯示了顯微鏡水平的野生型vs.轉基因小鼠的心臟。
圖6A在左圖中顯示了WT縮窄和I-1*縮窄心臟的心臟橫截面的代表性圖像(100X和40x)。在右圖中，圖6A以柱狀圖的形式顯示了縮窄WT和I-1*心肌細胞的橫截面積。*P＜0.001vs.假手術；WT縮窄和I-1*縮窄心臟之間P＜0.05；每組n＞120個心肌細胞。圖6B以柱狀圖的形式顯示了MAP-激酶蛋白的定量免疫印跡結果。*P＜0.05，每組n＝4隻小鼠。圖6C以柱狀圖的形式顯示了定量免疫印跡的結果，描繪了肌質網蛋白(SERCA)、集鈣蛋白(CSQ)和受磷蛋白(PLN)的水平以及受磷蛋白和理阿諾鹼受體的磷酸化水平。*P＜0.05，每組n＝4隻小鼠。
圖7A以柱狀圖形式顯示了假手術的非衰竭心臟、感染GFP(Ad.GFP)的衰竭心臟和感染活性抑制劑-1(Ad.I-1*)的衰竭心臟組中心室內壓力的測量值。*P＜0.05vs.非衰竭假手術的組，每組n＝7-9隻小鼠。圖7B以柱狀圖形式顯示了等容舒張係數(tau)的測量值。gP＜0.10vs.非衰竭組，每組n＝7-9隻大鼠。圖7C顯示了心臟左心室壓力vs.左心室尺寸環(P-V環)，如通過非衰竭心臟、衰竭+GFP心臟和衰竭+活性抑制劑-1心臟中壓電晶體所測定的。每組n＝7-9大鼠。圖7D以柱狀圖形式顯示了最大的倒電容(Emax)，源自末端收縮壓-尺寸相關性。*P＜0.05，每組n＝7-9大鼠。
圖8A以柱狀圖形式顯示了衰竭vs.非衰竭心臟組中SERCA2、受磷蛋白(PLN)和心臟理阿諾鹼受體(RYR2)水平的定量免疫印跡結果。圖8B以柱狀圖形式顯示了衰竭vs.非衰竭心臟組中Ser16和Thr17處受磷蛋白以及Ser2809處理阿諾鹼受體的磷酸化水平。圖8C以柱狀圖形式顯示了衰竭vs.非衰竭心臟組中MAP-激酶激活(p38、ERK和JNK)的水平。*P＜0.05vs.NF和#P＜0.05vs.F+GFP，每組n＝4個心臟。
圖9A顯示了印跡，描繪了抑制劑-1、受磷蛋白和RGL的PP1共同免疫沉澱的結果。圖9B顯示了印跡，描繪了將內源的PKA-磷酸化抑制劑-1(10nM至1000nM)加入PP1免疫沉澱的複合物中的結果，如根據蛋白磷酸酶1的受磷蛋白解離所測量的。(n＝3)
圖10以柱狀圖形式顯示了衰竭vs.非衰竭心臟組中CaM-激酶活性。
圖11A和11B描繪了核酸序列(SEQ ID NO1)，GenBank登錄號No.NM_006741，編碼磷酸酶抑制劑-1(「I-1」)蛋白(SEQ ID NO2)，GenBank登錄號No.NP_006732.2。
詳述磷酸酶活性在心力衰竭中得到了提高。降低心肌細胞中的磷酸酶活性(例如，磷酸酶1活性)可以緩解一種或多種與心力衰竭相關的症狀。降低的磷酸酶活性與減弱的β-腎上腺素能反應性相關。
一實施方案中，可以通過抑制1型磷酸酶來降低磷酸酶活性。1型磷酸酶包括但不限於PP1cα、PP1cβ、PP1cδ和PP1cγ。參見Sasaki等(1990)Jpn J Cancer Res.811272-1280，在此將其內容引入作為參考。磷酸酶抑制劑-1(或「I-1」)蛋白是1型磷酸酶的內源抑制劑。提高I-1水平或活性可以恢復衰竭人心肌細胞中的β-腎上腺反應性。
特定的實施方案中，可以給予組成型活性的I-1蛋白。在此列舉的一個這樣的構建體需要I-1 cDNA的平截來編碼頭65個胺基酸並引入核苷酸改變來用天冬氨酸(GTCAsp35)替代PKA磷酸化位點(GGTThr35)，形成組成型活性抑制劑。製備組成型活性抑制劑的另一種方法是用穀氨酸替代天冬氨酸來置換蘇氨酸35。這些置換也可以在全長抑制劑分子中形成。表達I-1T35D的衰竭人心肌細胞在基礎條件下呈現正常的收縮功能並將它們的β-腎上腺素功能恢復到正常。因此，抑制劑-1的遞送完全恢復了功能並翻轉了預先存在心力衰竭情況中的重塑。
還可以使用其它磷酸酶抑制劑和I-1的其他變體。這樣其他抑制劑的實例包括磷酸酶抑制劑2；岡田酸或caliculin；和nipp1，這是蛋白磷酸酶1的內源核抑制劑。一實施方案中，磷酸酶抑制劑是蛋白磷酸酶1特異性的。
用於降低磷酸酶活性的其他方法包括給予提高磷酸酶抑制劑例如I-1活性的小分子、給予降低1型磷酸酶活性的小分子、給予降低1型磷酸酶活性或表達的核酸，或給予提高磷酸酶抑制劑活性或表達的核酸。
心力衰竭中的磷酸酶活性以跳動(beat-to-beat)為基礎的心肌功能是受到身體交感緊張高度調節的過程。在很短的時間內，心臟可以通過提高心臟輸出反應工作量的增加來支持外周代謝組織的需要。這種提高了心臟變力狀態的適應性機制很大部分受到心肌β-受體的兒茶酚胺依賴性激活的控制。在受到刺激或激活時提高了收縮強度的心肌細胞上發現了這些受體。在細胞水平，β-受體的刺激(Koch，W.J.等，2000 Annu Rev Physiol；62237-60)導致cAMP水平的提高、cAMP-依賴性蛋白激酶(PKA)的激活和能量代謝涉及的酶以及關鍵調節蛋白的磷酸化，招募來調節收縮性和提高中風體積。主要的調節含磷蛋白包括受磷蛋白(PLB)、理阿諾鹼受體、L-型Ca2+通道、肌鈣蛋白I和C-蛋白。
PLB是基礎心肌收縮性的主要調節劑並且是結合β受體並提高哺乳動物心臟中心臟細胞收縮強度的β-激動劑收縮和鬆弛作用的關鍵調節劑(Brittsan，A.G.等，2003 Circ Res；92769-76)。PLB的磷酸化減輕了SERCA的抑制，其很大程度上刺激了胞質體鈣再次螯合至肌質網(SR)中的速率和含量，增強了心肌的舒張。這種提高的鈣循環特徵與提高的SR鈣含量相關，這允許在隨後的收縮過程中釋放提高的量子鈣。總起來說，這些情況導致提高的收縮和舒張功能。
蛋白磷酸化的提高和提高的心臟功能在有效和高度調節的過程中受到蛋白磷酸酶的逆轉。兩大類絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶，稱為1型和2型磷酸酶，調節心肌收縮性能(Neumann，J.等，1997 J Mol CellCardiol；29(1)265-72)。蛋白磷酸酶1(「PP1」)佔據顯著含量的心肌酶活性，並意味著是調節磷酸酶的關鍵類別。PP1在很大程度上與膜級分以及糖原顆粒相關且在糖原分解和糖原合成中是重要的。通過大的、非催化靶向亞基來錨定這些部位，這用來提高底物利用率和特異性。此外，這種酶通過兩種熱和酸穩定性蛋白抑制劑-1和-2來調節。在蘇氨酸-35通過PKA磷酸化時，磷酸酶抑制劑-1(「I-1」)是主要的生理調節劑和有效的抑制劑(Endo，S.等，1996 Biochemistry；35(16)5220-8)。PP1的抑制，消除了對抗PKA蛋白磷酸化的作用，導致心臟中β-激動劑反應的擴大(Ahmad，Z.J.1989 Biol Chem；2643859-63；Gupta，R.C.等，1996 Circulation；(增補1)I-361)。
這種通過蛋白激酶和磷酸酶來微調心臟調節蛋白磷酸化在心力衰竭中變得更重要，因為期望通過β-受體的去敏化降低cMAP水平(Koch，Lefkowitz等，2000)將導致PKA的激活，同時蛋白磷酸酶1的水平和活性得到提高。
適用於體細胞基因轉移的病毒載體治療性核酸，例如，降低磷酸酶活性的核酸或提供表達的核酸調節劑的核酸(例如，dsRNA、反義RNA或核酶)，例如，如在此所述的，可以引入用作基因轉移方案一部分的基因構建體中。方法包括患者基因插入病毒載體中，例如源自逆轉錄病毒(例如，複製缺陷逆轉錄病毒)、腺病毒(例如，複製缺陷、第一代或容易消化的、第二代腺病毒)、腺相關病毒(例如，1-6型中的任何一種)、慢病毒和單純皰疹病毒-1的重組載體，或重組細菌或真核質粒。還可以將病毒載體用於直接轉染細胞。遞送治療性核酸的病毒顆粒可以由修飾的病毒製得。修飾的病毒可以包括至少一個病毒序列的改變，例如，一個或多個病毒基因的替換、刪除或鈍化。
示範性的腺病毒載體包括(Ad.RSV.lacZ)，其包括Rous肉瘤病毒啟動子和lacZ報告基因，以及(Ad.CMV.lacZ)，其包括巨細胞病毒啟動子和lacZ報告基因。參見，例如，USSN10/914,829。可以用編碼蛋白或表達的核酸調節劑的序列來替代lacZ序列。例如WO96/13597、WO97/15679、Miyamoto等(2000)Proc Natl Acad SciUSA 97(2)793-8，和Trapnell等，Curr.Opin.Biotchnol.5(6)617-625，1994中描述了病毒載體的製備和使用方法。
腺相關病毒是非致病性的人細小病毒，能夠位點特異性地整合至染色體19中。Fisher等，Nature Medicine 3(3)306-312，1997。然而，病毒的複製需要輔助病毒，如腺病毒。Fisher等，Nature Medicine3(3)306-312，1997。可以用非病毒基因來替代AAV編碼片段，且修飾的病毒可以用來感染分裂和非分裂的細胞。Xiao等，J.Virol.70(11)8098-8108，1996；Kaplitt等，Ann.Thorac.Surg.621669-1676，1996。示範性的AAV製備和使用方法描述於Fisher等，NatureMedicine 3(3)306-312，1997；Xiao等，J.Virol.70(11)8098-8108，1996；Kaplitt等，Ann.Thorac.Surg.621669-1676，1996中。
AAV16是特異性的並在心臟中給予快速表達。例如，USSN10/914,829證明了在大型動物的心臟中使用AAV16的基因轉移是有效的並可以導致長效的基因表達。
已經產生了用於產生修飾的AAV顆粒的方法。例如，使生長於培養物中的細胞產生修飾的AAV顆粒。從細胞收集顆粒並純化。AAV顆粒的示例生產方法包括將三個元件遞送至生產者細胞中1)兩側為AAV ITR序列(例如，調節磷酸酶活性的序列)的目標基因，2)AAV rep和cap基因，和3)輔助病毒蛋白(「輔助功能」)。用於遞送頭兩個的常規方案是通過用含有合適重組基因盒的質粒DNA來轉染細胞。通常通過用輔助病毒如腺病毒(Ad)感染細胞來提供輔助功能。(Samulski等，1998；Hauswirth等，2000)。
慢病毒是能夠感染非分裂細胞的逆轉錄病毒的亞群。L.Naldini等報導了基於人免疫缺陷病毒(HIV)的慢病毒載體系統，能夠將異種基因序列轉導至非增殖性Hela細胞和大鼠成纖維細胞中，以及轉導至人初級巨噬細胞和最終分化的神經元中。Science 272，263-267(1996)。US6,521,457描述了基於馬傳染性貧血病毒的慢病毒載體。US6,428,953描述了其他的慢病毒載體和用於生產慢病毒顆粒的方法。
為了產生慢病毒顆粒和其他病毒顆粒，將編碼目標試劑(例如，降低磷酸酶活性的試劑)的核酸可操作地連接包裝信號。將核酸包裝於表達病毒結構蛋白的細胞中。例如，細胞可以包括編碼病毒結構蛋白但缺乏包裝信號的核酸。
非病毒方法也是可用的。例如，可以遞送質粒DNA，例如，使用陽離子脂質體(lipofectin)或衍生的(例如，綴合抗體的)、聚賴氨酸綴合物、gramacidin S、人造病毒包膜或其他這樣的胞內載體，以及在體內進行基因構建體的直接注射或CaPO4沉澱。
已經成功使用腺病毒(Ad)載體將基因轉移至心血管組織中，該病毒載體具有通過巨細胞病毒(CMV)或Rous肉瘤病毒(RSV)啟動子驅動的強烈的、非組織特異性基因表達盒。涉及用病毒載體轉導心臟細胞來遞送血管生成因子如血管內皮細胞生長因子(VEGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)和肝細胞生長因子(HGF)的臨床試驗正在進行中。在動物模型體內已經使用了病毒的主動脈內或冠狀內注射。在一個研究中，大鼠中Ad-SERCA2a病毒載體的心臟內注射足以誘導鈣操作中的生理改善。參見Miyamoto等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97793-98。腺病毒載體也已經用於體內來表達β2腎上腺素受體(β-AR)(參見Maurice等，1999，J.Clin.Invest.10421-9和Shah等，2001，Circulation.1031311)。從囊腫性纖維化研究已知的，對於提高的功能不需要組織中所有細胞的轉導。例如，缺乏功能性鈉通道的上皮層內少如6-10％細胞的野生型鈉通道的表達對於正常的鈉離子轉運就足夠了(Johnson等，1992，Nat.Genet 221-5)。將這稱為旁觀者效應。
啟動子可以是，例如，平滑肌特異性啟動子，如平滑肌α肌動蛋白啟動子、SM22a啟動子；心臟特異性啟動子，如心臟肌球蛋白啟動子(例如，心臟肌球蛋白輕鏈2v啟動子)、肌鈣蛋白T啟動子或BNP啟動子。啟動子還可以是，例如，病毒啟動子，如CMV啟動子。組織特異性啟動子已經用來提高心肌基因表達的特異性(Rothmann等，1996，Gene Ther.3919-26)。
在體外使用培養的大鼠新生兒細胞以及在來自體內的系統中使用大鼠乳頭狀肌肉浸液證明了通過腺相關病毒(AAV)遞送載體心肌細胞基因的效率(Maeda等，1998，J.Mol.Cell.Cardiol.301341-8)。報導了來自體內的AAV載體轉移接著同繫心髒移植獲得了高效率標記基因表達(Svesson等，1999，Circulation.99201-5)。
例如，在US公開的申請2002-0032167中描述了獲得具有高度一致性的高水平體內cardiotopic基因轉移的方法(平均60-70％的心肌細胞)。病毒載體的其他製備和使用方法描述於WO96/13597、WO96/33281、WO97/15679和Trapnell等，1994，Curr.Opin.Biotechnol.5(6)617-625；Ardehali等，1995，J.Thorac.Cardiovasc.Surg.109716-720；Dalesandro等，1996，J.Thorac.Cardiovasc.Surg.111416-422；Sawa等，1995，Circ 92，II479-11482；Lee等，1996，J.Thorac.Cardiovasc.Surg.111，246-252；Yap等，19996，Circ.94，I-53；和Pellegrini等，1998，Tranpsl.Int.11，373-377。
還可以使用非病毒遞送載體給藥主體多核苷酸。如在此所用的「非病毒遞送載體」(在此也稱為「非病毒載體」)意思是包括含有裸露的或稠合的多核苷酸(例如，多核苷酸和陽離子化合物(例如，葡聚糖磷酸鹽)的製劑))的化學製劑，以及混合佐劑如病毒顆粒的裸露的或稠合的多核苷酸(即，目標多核苷酸沒有包含在病毒顆粒內，而是轉化製劑由裸露的多核苷酸和病毒顆粒(例如，腺病毒顆粒)構成)(參見，例如，Curiel等，1992 Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.6247-52)。因此，「非病毒遞送載體」可以包括由多核苷酸加上病毒顆粒構成的載體，其中病毒顆粒不含有目標多核苷酸。示例「非病毒遞送載體」包括細菌質粒、病毒基因組或其部分，其中待遞送的多核苷酸不是殼體化的或包含於病毒顆粒內，和包括部分病毒基因組和部分細菌質粒和/或噬菌體的構建體。術語還包括天然和合成的聚合物和共聚物。術語進一步包括基於脂質的載體。
基於脂質的載體包括陽離子脂質體，如Felgner等公開的(U.S.專利No.5,264,618和5,459,127；PNAS 847413-7417，1987；Annals N.Y.Acad.Sci.772126-139，1995)；它們還可以由中性或負電荷磷脂或其包括人造病毒包膜的混合物構成，如Schreier等所公開的(U.S.專利No.5,252,348和5,776,625)。
非病毒遞送載體包括基於聚合物的載體。基於聚合物的載體可以包括天然和合成的聚合物和共聚物。例如，聚合物是生物可降解的，或可以從患者容易地消除。天然產生的聚合物包括多肽和多糖。合成的聚合物包括，但不限於，聚賴氨酸和聚乙撐亞胺(PEI；Boussif等，PNAS 927297-7301，1995)，該分子還可以作為稠合劑。這些載體可以溶解、分散或懸浮於分散液體如水、乙醇、鹽溶液及其混合物中。多種合成聚合物是本領域已知的並可以使用。
基因治療構建體的藥物製劑可以包括基因遞送系統和可接受的稀釋劑，或可以包括其中包埋基因遞送載體的緩釋基質。或者，可以從重組細胞例如逆轉錄載體完整地產生完整的基因遞送系統，藥物製劑可以包括一種或多種產生基因遞送系統的細胞。然而，通常製劑是無細胞的。製劑通常包括沒有中斷病毒顆粒將核酸遞送至細胞中的能力的物質。
待遞送的核酸還可以配製成DNA-或RNA-脂質體複合製劑。這樣的複合物包括通過陽離子電荷(靜電作用)結合基因材料(DNA或RNA)的脂質混合物。可以用於本發明中的陽離子脂質體包括3θ-[N-(N』，N』-二甲基-氨基乙烷)-氨基甲醯]-膽固醇(DC-Chol)、1，2-二(油醯氧-3-三甲基胺基丙烷(DOTAP)(參見，例如，WO98/07408)、賴氨醯磷脂醯乙醇胺(L-PE)、脂多胺如脂精胺、N-(2-羥乙基)-N，N-二甲基-2，3-二(十二烷基氧)-1-丙烷溴化銨、二甲基二十八烷基溴化銨(DDAB)、二油醯磷脂醯乙醇胺(DOPE)、二油醯基磷脂醯膽鹼(DOPC)、N(1，2，3-二油醯氧)丙基-N，N，N-三乙銨(DOTMA)、DOSPA、DMRIE、GL-67、GL-89、Lipofectin和Lipofectamine(Thiery等，(1997)Gene Ther.4226-237；Felgner等，Annals N.Y.Acad.Sci.772126-139，1995；Eastman等，Hum.Gene Ther.8765-773，1997)。U.S.專利No.5,858,784中描述的多核苷酸/脂質製劑也可以用於在此所述的方法中。這些脂質中的許多是可購得的，例如，從Boehringer-Mannheim，和Avanti Polar Lipids(Birmingham，Ala.)購得。還包括U.S.專利No.5,264,618、5,223,263和5,459,127中找到的陽離子磷脂。可以使用的其他合適的磷脂包括磷脂醯膽鹼、磷脂醯絲氨酸、磷脂醯乙醇胺、神經鞘磷脂、磷脂醯肌醇等。還包括膽固醇。
病毒遞送還可以通過多種方法中的任何一種將包括多單位病毒遞送系統的製劑遞送至患者的心臟細胞。
例如，可以全身引入病毒遞送系統的藥物製劑，例如，通過靜脈內注射，且目標細胞中蛋白的特異性轉運主要產生於通過基因遞送載體、由控制受體基因表達的轉錄調節序列引起的細胞類型或組織類型表達或其組合提供的轉錄特異性。其他實施方案中，重組基因的最初遞送受到更多限制，進入動物中的引入完全限於局部。例如，可以通過導管(參見U.S.專利5,328,470)或通過定向注射(例如，Chen等，(1994)PNAS913054-3057)來引入基因遞送載體。
一種示範性的執行中，將製劑直接注射至心臟組織中。US10/914,829描述了用於直接注射的方案。直接注射或病毒載體進入心肌中的應用可以將轉染基因的表達限於心臟中(Gutaman等，1993，Cric.Res.731202-7；French等，1994，Circulation.902414-24)。
另一種示範性的執行中，將製劑引入一個或多個冠狀動脈的腔內。可以限制流出冠狀動脈的血液。可以順行性遞送製劑並使之停留在動脈中一至五分鐘，例如一至三分鐘。
可以通過相似的方法來遞送非病毒載體。
示例斯滕特固定模斯滕特固定模可以塗覆或可以含有降低磷酸酶活性的試劑，如在此所述的試劑。製備用於遞送治療劑的斯滕特固定模(生物可降解和非生物可降解)的方法是公知的(參見，例如，U.S.專利No.5,163,952、5,304,121、6,391,052、6,387,124、6,379,382和6,358,556、6,605,110、6,605,114、6,572,645、6,569,194、6,545,748、6,541,116、6,527,801、6,506,437)。一實施方案中，使用本領域已知的技術將斯滕特固定模塗覆治療劑，例如，在此所述的試劑，如降低磷酸酶活性的核酸，。
一實施方案中，斯滕特固定模是不鏽鋼斯滕特固定模或nytinol網狀裝置。例如，可以在PCI程序過程中(經皮冠狀幹預)將斯滕特固定模遞送至導管上的冠狀動脈。斯滕特固定模通過氣囊的擴張或通過自身的膨脹遞送設計可以在動脈中展開。示例可購得的斯滕特固定模包括Gianturco-Roubin斯滕特固定模(例如，來自CookCardiology)、Multilink、Duet、Tetra、Penta、Zeta斯滕特固定模(例如，來自Guidant)；Nir，Wall斯滕特固定模、Taxus(例如，來自SCIMED/Boston Scintific)、GFX/S系列斯滕特固定模(例如，來自Medtronic/AVE)、velocity和Cypher斯滕特固定模(例如，來自JohnsonJohnson/Cordis)。
例如，斯滕特固定模可以塗覆介導核酸縮合或壓縮的聚合陽離子，例如，如U.S.6,596,699中所述的。可以使用線性聚陽離子如聚-L-賴氨酸、聚鳥氨酸、聚精氨酸等。聚合物可以是同型聚合物，如聚賴氨酸、聚鳥氨酸或聚精氨酸，或可以是雜聚合物，包括由賴氨酸、鳥氨酸、精氨酸等形成的隨機聚合物。更多複合的分子也可以用作聚陽離子，如支鏈或直鏈聚氮丙啶等。可以使用各種天然形成的核酸粘合劑中的任何一種，如精胺或亞精胺，並包括在聚陽離子的定義內。可以相似地使用魚精蛋白，也可以如此使用各種組蛋白中的任何一種。可以相似地使用聚醯胺胺樹狀大分子，其中末端氨基通過靜電方式結合核酸，形成正電荷的縮合物。可以特異性地修飾聚陽離子來提供形成所需縮合物的最佳特徵。例如，已經報導了18個殘基的重複賴氨酸連結著色氨酸和烷基化半胱氨酸殘基形成具有至少等於聚賴氨酸特性的縮合物(McKenzie等，J.Peptide Res.54311-318(1999))。通常，聚陽離子是正電荷的，並在約pH6至約8具有淨正電荷或具有高於約五個的正電荷殘基。聚陽離子具有與負電荷的數量相比更高數量的正電荷。聚陽離子包括天然核酸結合蛋白和重組核酸結合蛋白，如胺基酸的同型-或雜-聚合物或結合天然或重組核酸分子中發現的一個或多個核酸序列並形成核酸縮合物的合成化合物。
將治療劑如核酸塗覆至醫療裝置如斯滕特固定模上的其他方法包括用如U.S.5,674,192或6,409,716中所述的可膨脹水凝膠聚合物塗覆醫療裝置。水凝膠塗層的特徵在於摻入足量核酸的能力，核酸通常是水溶液形式，且是可膨脹的使得施加壓力時可以將水溶液有效地擠出塗層，例如，通過膨脹或擴展斯滕特固定模。這種方式的藥物給藥能夠使藥物是位點特異性的，使得可以將高濃度的釋放限於直接應用至受影響的組織。斯滕特固定模還可以塗覆含有核酸的病毒顆粒。
將治療劑如核酸結合斯滕特固定模或其他醫療裝置的其他方法是本領域已知的，參見例如，U.S.6,024,918、U.S.6,506,408；U.S.5,932,299。
一些實施方案中，在此所述的斯滕特固定模，除了塗覆或含有降低磷酸酶活性的試劑外，還可以塗覆第二種治療劑。例如，斯滕特固定模還可以含有一種或多種雷帕黴素、紫杉醇和放線菌素-D、凝血酶抑制劑、抗血栓形成劑、血栓溶解劑、溶栓劑、血管痙攣抑制劑、鈣通道阻斷劑、血管擴張劑、抗高血壓劑、抗微生物劑、抗生素、表面糖蛋白受體的抑制劑、抗血小板劑、抗有絲分裂劑、微管抑制劑、抗分泌劑、肌動蛋白抑制劑、重塑抑制劑、反義核苷酸、抗代謝物、抗增殖性劑、抗癌化療劑、抗炎甾醇或非甾醇抗炎劑、免疫抑制劑、生長激素拮抗劑、生長因子、多巴胺激動劑、放療劑、肽、蛋白質、酶、胞外基質成分、自由基清除劑、螯合劑、抗氧化劑、抗聚合酶、抗病毒劑、光能治療劑和基因治療劑。
治療評價可以通過測定治療對心臟功能或心肌細胞功能如收縮性相關參數的作用來評價治療。例如，可以使用上述的方法測量SR Ca2+ATPase活性或胞內Ca2+濃度。此外，可以使用Strauss等，Am.J.Physiol.，2621437-45，1992中所述的方法測量心臟或心臟組織的力量輸出。
還可以通過對患者的作用來評價治療，例如，根據治療領域的技術人員認為與特定治療相關的參數。例如，在治療心力衰竭中，示例參數可以與心臟和/或肺功能相關。心臟參數包括脈搏、EKG信號、內徑減損、心率、心臟收縮性、心室功能，例如，左心室末端舒張壓(LVEDP)、左心室收縮壓(LVSP)、Ca2+代謝，例如，胞內Ca2+濃度或峰或靜止Ca2+、力量輸出、心臟的鬆弛和壓力、力量頻率關係、心臟細胞存活或凋亡或離子通道活性，例如，鈉鈣交換、鈉通道活性、鈣通道活性、鈉鉀ATPase泵活性、肌球蛋白重鏈的活性、肌鈣蛋白I、肌鈣蛋白C、肌鈣蛋白T、原肌球蛋白、肌動蛋白、肌球蛋白輕鏈激酶、肌球蛋白輕鏈1、肌球蛋白輕鏈2或肌球蛋白輕鏈3、IGF-1受體、PI3激酶、AKT激酶、鈉-鈣交換、鈣通道(L和T)、集鈣蛋白或鈣網蛋白。評價可以包括進行血管造影術(例如，定量血管造影術)和/或血管內超聲(IVUS)，例如，在治療之前、之後或之中。
心臟細胞的繁殖通過使心臟細胞移出黏附合適底物(例如，培養皿)的心臟組織的部分或通過分解組織來獲得心臟細胞培養物，例如，通過機械或酶來產生心臟細胞的懸浮液。例如，可以使用胰蛋白酶、膠原酶、彈性蛋白酶、透明質酸酶、DNase、鏈黴蛋白酶、dispase或其各種組合。胰蛋白酶和鏈黴蛋白酶獲得最完整的分解但可能損傷細胞。膠原酶和dispase獲得不太完整的分解但有害性較低。分離組織(例如，心臟組織)和分解組織來獲得細胞(例如，心臟細胞)的方法描述於FreshneyR.I.，Culture of Animals Cells，A Manual of Basic Technique，第三版，1994。
核酸抑制劑磷酸酶活性的調節劑可以是核酸，如siRNA、反義RNA、形成三-螺旋的核酸或核酶，其可以降低磷酸酶例如1型磷酸酶的表達。
例如，通過使用雙鏈RNA的基因沉默來改變基因表達(Sharp(1999)Genes and Development 13139-141)。RNAi，也稱為雙鏈RNA幹擾(dsRNAi)或小幹擾RNA(siRNA)，已經在多種生物體中得到了廣泛的證明，包括哺乳動物細胞、線蟲C.elegans(Fire，A.等，Nature，391，806-811，1998)。
可以將dsRNA遞送至細胞或生物體來對抗磷酸酶。例如，與編碼磷酸酶的核酸互補的dsRNA可以沉默磷酸酶例如1型磷酸酶的蛋白表達。dsRNA可以包括與磷酸酶編碼片段或非編碼片段互補的片段，編碼片段例如，5』編碼片段、編碼磷酸酶核心結構域的片段、3』編碼片段，非編碼片段例如，5』或3′未翻譯片段。例如可以通過轉錄兩個方向的盒(在體外或體內)來產生dsRNA，例如，通過在盒的任一側包括T7啟動子。選擇盒中的插入片段使得其包括與磷酸酶編碼核酸互補的序列。不需要全長序列，例如，外顯子，或19-50個核苷酸或50-200個核苷酸。序列可以來自轉錄產物的5』一半，例如，ATG的1000、600、400或300個核苷酸內。請參閱，HISCRIBETMRNAi轉錄試劑盒(New England Biolabs，MA)和Fire，A.(1999)TrendsGenet.15，358-363。還可以將dsRNA消化成較小的片段。參見，例如，US專利申請2002-0086365和2003-0084471。
一實施方案中，使用siRNA。siRNA是小的雙鏈RNA(dsRNA)，任選地包括突出物。例如，雙鏈體片段約18至25個核苷酸長，例如，約19、20、21、22、23或24個核苷酸長。通常，siRNA序列與目標mRNA精確互補。
「核酶」是在RNA中的特異性位點分裂的酶RNA分子。可以根據公知的方法來設計特異性分裂編碼磷酸酶或磷酸酶例如1型磷酸酶表達需要的核酸的核酶。
人造轉錄因子可以工程化人造轉錄因子，如嵌合鋅指蛋白，與編碼磷酸酶抑制劑或磷酸酶基因中或附近的序列相互作用，例如，在基因的啟動子或增強子中的位點，例如，在mRNA起始位點的1000、700、500或200個核苷酸內，或在基因中染色質可接近位點的50、20、10個核苷酸內。參見，例如，US6,785,613。可以設計人造轉錄因子以在基因編碼磷酸酶抑制劑(例如，I-1)的情況中激活基因的表達，或例如在基因編碼磷酸酶的情況中抑制基因的表達。
可以從文庫設計或選擇人造轉錄因子。例如，通過體外(例如，使用噬菌體展示，U.S.專利No.6,534,261)或體內選擇，或通過基於識別密碼子的設計(參見，例如，WO00/42219和U.S.專利No.6,511,808)來製備人造轉錄因子。參見，例如，Rebar等，(1996)Methods Enzymol 267129；Greisman和Pabo(1997)Science 275657；Isalan等，(2001)Nat.Biotechnol 19656；和Wu等(1995)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 92344，其中特別是，用於形成各種鋅指結構域文庫的方法。
任選地，可以將鋅指蛋白融合轉錄調節結構域，例如，融合激活結構域來激活轉錄或融合抑制結構域來抑制轉錄。鋅指蛋白自身可以通過遞送至細胞的異種核酸來編碼或蛋白自身可以遞送至細胞(參見，例如，U.S.專利No.6,534,261)。包括鋅指蛋白編碼序列的異種核酸可以可操作地連接誘導型啟動子，例如，以能夠精細控制細胞中鋅指蛋白的水平。
給藥可以通過標準方法將調節磷酸酶活性的試劑例如在此所述的試劑給藥於患者。例如，可以通過多種不同途徑中的任何一種來給藥試劑，包括靜脈內、皮內、皮下、口服(例如，吸入或攝取)、經皮(局部)和經黏膜。一實施方案中，通過注射來給藥試劑，例如，動脈內、肌內或靜脈內。
可以將試劑，例如編碼磷酸酶抑制劑的核酸、多肽、片段或類似物、調節劑(例如，有機化合物和抗體(在此也稱為「活性化合物」)摻入適於給藥於患者例如人的藥物組合物中。這樣的組合物通常包括多肽、核酸分子、調節劑或抗體和藥物學上可接受的載體。如在此所用的術語「藥物學上可接受的載體」用來包括與藥物給藥相容的任何溶劑、分散介質、衣料、抗細菌和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑等。這樣的介質和試劑用於藥物學上活性物質是已知的。除非任何常規介質或試劑與活性化合物不相容，否則可以在本發明的組合物中使用這樣的介質。還可以將輔助活性化合物摻入組合物中。
可以將藥物組合物配製成與其打算的給藥途徑相容。用於非腸道、皮內或皮下應用的溶液或懸浮液可以包括以下成分無菌稀釋劑，如用於注射的水、鹽溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗細菌劑，如苯甲醇或甲基對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，如抗壞血酸或硫酸氫鈉；螯合劑，如乙二胺四乙酸；緩衝劑，如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽和用於調節滲透壓的試劑，如氯化鈉或葡聚糖。可以用酸或鹼如鹽酸或氫氧化鈉來調節pH。可以將非腸道製劑封裝於安瓿、可隨意處置的注射器或由玻璃或塑料製成的多劑量小瓶中。
適於注射使用的藥物組合物包括無菌水溶液(在水溶性的情況中)或分散體和用於無菌溶液或分散體臨時製備的無菌粉末。對於靜脈內給藥，合適的載體包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF、Parsippany，NJ)或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。在所有的情況中，組合物必須是無菌的並應當流動至存在易於注射性的程度。在製造和存儲條件下必須是穩定的並必須防止微生物如細菌和真菌的汙染作用。載體可以是溶劑或含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)及其合適混合物的分散介質。例如，可以通過使用衣料如卵磷脂、通過在分散體的情況中維持所需的粒徑和通過使用表面活性劑來維持合適的流動性。可以通過各種抗細菌和抗真菌劑獲得微生物作用的防止，例如，對羥基苯甲酸甲酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、水楊乙汞等。在許多情況中，組合物中優選包括等滲劑，例如，糖、多元醇如甘露醇、山梨糖醇、氯化鈉。通過在組合物中包括延遲吸收的試劑例如一硬脂酸鋁和明膠來引起可注射組合物的延長吸收。
通過將所需量的活性化合物(例如，在此描述的試劑)摻入含有上述一種或組合配料中的合適溶劑中，按照需要，接著過濾滅菌來製得無菌注射液。通常，通過將活性化合物摻入含有基礎分散體介質和所需的來自上述那些的其它配料的無菌載體中來製備分散體。在用於製備無菌注射液的無菌粉末的情況中，優選的製備方法是真空乾燥和冷凍乾燥，其從之前無菌過濾的溶液產生活性成分加上任何其他所需成分的粉末。
口服組合物通常包括惰性稀釋劑或可食載體。它們可以封裝於明膠膠囊中或壓製成片劑。對於口服治療給藥的目的，將活性化合物與賦形劑摻合併以片劑、錠劑或膠囊形式來使用。還可以使用用作漱口水的流體載體來製備口服組合物，其中可以將流體載體中的化合物口服應用，並發出沙沙聲，吐出或吞咽。可以作為組合物的一部分包括藥物學上相容的結合劑和/或佐劑物質。片劑、丸劑、膠囊、錠劑等可以含有以下成分中的任何一種，或相似性質的化合物粘合劑，如微晶體纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形劑，如澱粉或乳糖；崩解劑，如藻朊酸、Prinogel或玉米澱粉；潤滑劑，如硬脂酸鎂或Sterotes；助流劑，如膠體二氧化矽；甜味劑，如蔗糖或糖精；或調味劑，如薄荷、甲基水楊酸酯或橙子香精。
還可以通過經黏膜或經皮方式來全身給藥。對於經黏膜或經皮給藥，在製劑中使用適於待穿透屏障的滲透劑。通常這樣的滲透劑是已知的，例如，用於經黏膜給藥包括，去汙劑、膽汁鹽和梭鏈孢酸衍生物。通過使用鼻噴霧或栓劑來實現經黏膜給藥。對於經皮給藥，將活性化合物配製成膏劑、油膏、凝膠或霜劑，如本領域通常已知的。
一實施方案中，將活性化合物與保護化合物對抗從體內快速消除的載體如受控釋放製劑一起配製，包括植入物和微膠囊化遞送系統。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，如乙烯乙烯醋酸酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。製備這樣製劑的方法是本領域技術人員清楚的。也可以從Alza Corporation和NovaPharmaceuticals，Inc商業獲得材料。脂質體懸浮劑(包括靶向受病毒抗原的單克隆抗體感染的細胞的脂質體)也可以用作藥物學上可接受的載體。可以根據本領域技術人員已知的方法來製備這些，例如，如U.S.專利No.4,522,811中所述的。
可以將藥物組合物和給藥說明書包括於容器、包裝或分配器中。
優選的實施方案中，將藥物組合物注射至受影響的血管，例如動脈，或器官，例如，心臟。
小分子試劑可以通過小分子篩選來鑑定調節磷酸酶活性例如抑制磷酸酶活性的小分子試劑。可以將一種或多種候選物分子接觸磷酸酶並評價來測定候選分子是否與磷酸酶相互作用或是否調節磷酸酶的酶活性。可以在體外或體內來實現接觸。在體外測試中，例如，可以使用高度純化的成分，例如，使用具有磷酸酶活性的重組蛋白，例如，至少人磷酸酶的催化片段。可以在體外評價磷酸酶的酶活性。
例如，如所述的(Endo，S.等(1996)Biochemistry 35，5220-5228)在30μl含有50mM Tris-HCl(pH7.4)、1mM DTT、0.5mM MnCl2、10μM[32P]磷酸酶和0.5μg/mlPP1的反應混合物中測定蛋白磷酸酶1活性。通過將1μl PP1加入20μl含有剩餘測試化合物的測試混合物中來抑制反應。在30℃ 20分鐘後，通過將10μl 50％三氯醋酸加入測試混合物中來終止反應。然後將測試混合物在冰上冷卻並離心。將上清液的20μl等分試樣點在濾紙上並置於閃爍計數器中來測定釋放的[32P]Pi的量。如所述的在30℃ 30分鐘準備用於PP1測試的[32P]磷酸酶。將[32P]磷酸酶在50mM Tris HCl，pH7.4，1mM EDTA，1Mm DTT中滲析並儲存於-80℃直至使用(請參閱Huang等，Proc Natl Acad SciUSA.2000年5月23日；97(11)5824-9)。
在許多測試治療化合物和天然提取物文庫的藥物篩選程序中，為了在給定的時間段內最大化所測量的測試化合物的數量，高通量測試是理想的。
可以從使用各種濃度的測試化合物獲得的數據產生劑量反應曲線來測定測試化合物的效率。此外，還可以進行對照測試來提供比較的基線。在對照測試中，在測試化合物不存在下孵育心臟細胞。
「化合物」或「測試化合物」可以是任何化合物，例如，大分子(例如，多肽、蛋白複合物或核酸)或小分子(例如，胺基酸、核苷酸、有機或無機化合物)。測試化合物可以具有低於約每摩爾10,000克的化學式量，低於約每摩爾5,000克，低於每摩爾1,000克，或低於約每摩爾500克。測試化合物可以是天然產生的(例如，草藥或天然產物)、合成的或兩者。大分子的實例是蛋白質、蛋白質複合物和糖蛋白、核酸，例如，DNA、RNA和PNA(肽核酸)。小分子的實例是肽、擬肽(例如，類肽)、胺基酸、胺基酸類似物、多核苷酸、多核苷酸類似物、核苷酸、核苷酸類似物、有機或無機化合物，例如，雜有機化合物或有機金屬化合物。測試化合物可以是通過在此所述方法測定的唯一物質。或者，可以連續或同時測試一組測試化合物。
例如，如上所述(例如，基於關於激動劑的信息)或使用多種組合文庫方法中的任何一種來獲得測試化合物。一些示例文庫包括生物文庫；類肽文庫(具有肽功能性，且具有能抵抗酶降解但仍然保持生物活性的新的、非肽主鏈分子的文庫(參見，例如，Zuckermann，R.N.等(1994)J.Med.Chem.372678-85)；空間上可編址的平行固相或溶液相文庫；需要去卷積的合成文庫方法；「one-bead-one-化合物」文庫方法；和使用親和性色譜選擇的合成文庫方法。例如，可以使用這些方法來產生肽、非肽寡聚物或小分子文庫化合物(參見，例如，Lam(1997)Anticancer Drug Des.12145)。
組合化學文庫的製備和篩選是本領域技術人員公知的。這樣的組合化學文庫包括，但不限於，肽文庫(參見，例如，U.S.專利5,010,175，Furka，Int.J.Pept.Prot.Res.37487-493(1991)和Houghton等，Nature 35484-88(1991))。還可以使用產生化學多樣性文庫的其他化學物質。這樣的化學物質包括但不限於類肽(例如，PCT公開No.WO91/19735)、編碼的肽(例如，PCT公開No.WO93/20242)、隨機生物寡聚物(例如，PCT公開No.WO92/00091)、苯並二氮類(例如，U.S.專利No.5,288,514)、diversomers如乙內醯脲、苯丙二氮和二肽(Hobbs等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 906909-6913(1993))、vinylogous多肽(Hagihara等，J.Amer.Chem.Soc.1146568(1992))、具有葡萄糖支架的非肽擬肽(Hirschmann等，J.Amer.Chem.Soc.1149217-9218(1992))、類似有機合成的小化合物文庫(Chen等，J.Amer.Chem.Soc.116.2661(1994))、寡氨基甲酸鹽(Cho等，Science2611303(1993))和/或肽基磷酸鹽(Campbell等，J.Org.Chem.59658(1994))、核酸文庫(參見Ausubel，Berger和Sambrook，全部上文)、肽核酸文庫(參見，例如，U.S.專利5,539,083)、抗體文庫(參見，例如，Vaughn等，Nature Biotechnology，14(3)309-314(1996)和PCT/US96/10287)、碳水化合物文庫(參見，例如，Liang等，Science，2741520-1522(1996)和U.S.專利5,593,853)、小有機分子文庫(參見，例如，苯並二氮，Baum C EN，1月18日，p33(1993)；類異戊二烯，U.S.專利5,569,588；噻唑啉酮和metathiazanone，U.S.專利5,549,974；吡咯烷，U.S.專利5,525,735和5,519,134；嗎啉代化合物，U.S.專利5,506,337；苯並二氮，5,288,514，等)。在現有技術中可以找到分子文庫合成方法的其他實例，例如在DeWitt等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.906909；Erb等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9111422；Zuckermann等(1994)J.Med.Chem.372678；Cho等(1993)Science 2611303；Carrell等(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.332059；Carell等(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.332061；和Gallop等(1994)J.Med.Chem.371233。
生物文庫可以包括由核酸編碼的聚合物。這樣編碼的聚合物包括多肽和功能核酸(如核酸適配子(DNA、RNA)、雙鏈RNA(例如，RNAi)、核酶等)。可以使用生物文庫和非生物文庫來產生肽文庫。生物文庫的另一實例是dsRNA(例如，siRNA)或其前體的文庫。還表徵了可以加工或轉錄來產生雙鏈RNA(例如，siRNA)的核酸文庫。
可以在現有技術中找到分子文庫合成方法的實例，例如在DeWitt等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.906909；Erb等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9111422；Zuckermann等(1994)J.Med.Chem.372678；Cho等(1993)Science 2611303；Carrell等(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.332059；Carell等(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.332061；和Gallop等(1994)J.Med.Chem.371233。
化合物文庫可以存在於溶液中(例如，Houghten(1992)Biotechniques 13412-421)，或在珠子(Lam(1991)Nature 35482-84)、晶片(Fodor(1993)Nature 364555-556)、細菌(Lander，U.S.專利No.5,223,409)、孢子(Ladner U.S.專利No.5,223,409)、質粒上(Cull等(1992)Proc Natl Acad Sci USA 891865-1869)或在噬菌體上(Scott和Smith(1990)Science 249386-390；Devlin(1990)J.Mol.Biol.222301-310；Ladner上文)。在許多情況中，測試化合物文庫的高通量篩選方法包括一種或多種測試，例如，測試的組合。可以將來自每個測試的信息存儲於資料庫中，例如，用來鑑定可以作為最佳化或改進化合物先導的候選化合物，和用來鑑定SARs。
提供以下的實施例來作為本發明的進一步說明，且用來說明但不是限制本發明。
實施例實施例1.衰竭人心臟中的I-1及其磷酸化為了檢測I-1在衰竭的人心臟中的水平和磷酸化狀態，比較了來自九個非衰竭和十個初步診斷為擴張型心肌病(IDC)的衰竭人心臟的活體切片中的I-1水平。為了控制相等負荷的蛋白，將數據標準化至集鈣蛋白水平，因為這種SR蛋白的水平在衰竭和非衰竭樣品之間是相似的(
圖1A)。總I-1蛋白在供體和衰竭心臟之間沒有差異，但是衰竭心臟中的磷酸化程度顯著降低(～60％)(
圖1B)，表明了I-1得到了顯著鈍化，因此能夠抑制衰竭人心臟中的PP1活性。降低的I-1磷酸化可以反映出由於衰竭心臟與供體心臟相比較(10.9±1.3pmol/mg，n＝10，p＜0.05)降低的cAMP水平(5.8±0.7pmol/mg，n＝9)而引起的削弱的β-腎上腺素信號和降低的PKA激活。
實施例2.通過組成型活性I-1的PP1抑制提高了衰竭人心肌細胞中對β-激動劑的收縮反應I-1缺乏小鼠心臟顯示出降低的收縮參數。此外，在人心力衰竭的一些情況中，PP1活性得到提高。這種提高可以是，至少部分，是由於I-1的鈍化或去磷酸化，導致降低的功能。因此，提高I-1的活性在恢復衰竭人心肌細胞中減弱的β-腎上腺素能反應性中是有益的。
將組成型活性I-1蛋白(I-1T35D)的腺病毒介導的表達用於從人衰竭心臟分離的心肌細胞中(del Monte F等，Circulation.1999；1002308-11)。I-1T350構建體的設計需要I-1 cDNA的平截來編碼頭65個胺基酸和使用天冬氨酸(GTCD)引入核苷酸改變來替代PKA磷酸化位點(GGTThr35)，形成組成型活性抑制劑(Endo，S.等，Biochemistry.1996；355220-8)。在平行研究中，用編碼β-半乳糖酶的腺病毒感染心肌細胞來作為對照。兩種構建體還含有編碼作為轉染標記的綠色螢光蛋白的序列(GFP)(圖2B D)。
用β-gal或I-1T35D構建體感染的衰竭人心肌細胞在基礎條件下呈現出相似的收縮功能。然而，I-1T35D感染的響應異丙基腎上腺素(100nM)的心肌細胞呈現出與對照相比較顯著提高的心肌細胞收縮(圖2E F)、細胞收縮率(圖2G)和再次伸長(圖2H)和較低的舒張時間常數，tau(τ)(I-1T35D0.16±0.05，n＝8vs.GFP0.37±0.09，n＝10，p＜0.05)。此外，與對照相比較，I-1轉染細胞中的鈣信號50％衰減的時間(I-1T35D0.33±0.06，n＝8vs.GFP0.52±0.06，see，n＝10，p＜0.05)和鈣信號衰減的τ(I-1T35D0.36±0.10，n＝8vs.GFP0.70±0.09，n＝10，p＜0.05)得到了加速。
因此，抑制磷酸酶的蛋白的表達對於降低PP1活性是有效的，PP1活性是一種報導過的在人心力衰竭中升高的活性。此外，這些結果表明通過I-1T35D的PP1活性抑制顯著提高了衰竭人心臟中的β-腎上腺素能反應性。
實施例3.使用伴隨冠狀靜脈阻塞(CVB)的經皮順行性冠狀內基因轉移可以用來將基因遞送至心臟組織測試了不同AAV血清型遞送外源基因至心臟的能力。發現AAV6相對於其他AAV具有一些令人驚訝的和出乎意料的特性。AAV6在心臟中給予了最快的基因表達，以及最特異的和有效的表達(數據未顯示)。然而，其他AAV可以用於其它應用中，例如，其中心臟組織需要表達的不同過程的應用。
在綿羊和豬模型中進行使用伴隨冠狀靜脈阻塞(CVB)的經皮順行性冠狀內基因轉移。將導管插入左前降動脈(LAD)或左升動脈(LCX)並用標準血管重建術氣囊閉塞。在LAD和LCX分布中進行一分鐘缺血預處理(通過LAD和LCX的阻塞)來允許升高的病毒停留時間。預處理方案後，將導管插入大冠狀靜脈(GCV)或其分支之一併用標準楔氣囊導管暫時閉塞。全面地進行CVB，意味著近端GCV的閉塞，因此閉塞LAD和LCX分布中的靜脈排出，或選擇性地，在這種情況中，在LAD遞送過程中將前心室間靜脈(AIV)閉塞，相似地，在LCX遞送過程中將心中靜脈(MCV)的小孔閉塞。當動脈和靜脈氣囊擴張時，通過使用攜帶β-半乳糖苷酶的腺相關病毒(AAV6.β-gal)穿過擴張的血管重建術氣囊中心腔的注射來進行經皮順行性冠狀動脈內基因轉移(n＝5)。
用AAV6.β-gal基因轉移十二周後，從隔膜、前面、左側、後面和右邊的心室壁獲得10μm的心肌切片。將這些切片用含有0.5％戊二醛的磷酸鹽緩衝溶液(PBS)固定30分鐘，然後在含有30％蔗糖的PBS中30分鐘。然後將切片在含有5-溴-4-氯-3-吲哚基-α-D-半乳糖吡喃糖苷(X-gal)的溶液中孵育過夜。結果表明了β半乳糖苷酶在整個心肌的大範圍轉移(數據未顯示)。因此，使用全面CVB的5×1014基因組/ml濃度的AAV6.CMV.β-gal的順行性轉導導致靶向的心肌中顯著的基因表達，證明了在大型動物模型中的可行性和安全性。
進一步證實了使用冠狀靜脈阻塞的基因轉移。簡單地說，在豬中依賴於AAV6.CMV構建體成功地轉移了報告基因和編碼SERC2A的基因(數據未顯示)。
實施例4.活性抑制劑-1的體內表達提高了心臟功能為了測定降低的蛋白磷酸酶1活性的長期體內效果，以心肌細胞限制方式表達組成型活性的、平截的抑制劑-1(I-T35D；AA 1-65)。選擇抑制劑-1的這種形式是因為其特異性地抑制蛋白磷酸酶1，雖然濃度高於天然磷酸化抑制劑(Endo，S.等，Biochemistry.1996；355220-8)，且更突出的，其在心力衰竭中保持著活性，其中β-腎上腺素信號軸下調(Bristow，M.R.等，N Engl J.Med.1982；205-11)。
構建了5.6kb轉基因，由a-MHC啟動子後面接著小鼠I-T35D(AA1-65)cDNA和猿病毒40多腺苷酸化位點構成，並限制、凝膠純化，然後微注射至一細胞(one-cell)近交FVB/N胚胎的原核中。根據辛辛那提大學的Institutional Animal Care and Use Committees批准的方案來操縱TG小鼠。
獲得具有相似I-T35D表達水平(與WT相比～25倍)的三個轉基因系。如之前所描述的(Hoit，B.D.等，Cire.Res.1995；77632-7)，通過非入侵性超聲波心動描記術來測定體內心臟功能。對於每次實驗，用2.5％三溴乙醇(10μl/克體重)將小鼠麻醉，在盲條件下測定心臟功能。使用student’s t-測試和ANOVA，接著Neuman-Keuls t-測試來測定組之間的統計學差異。將數據表示為平均±標準誤差。對於每次實驗，在P值＜0.05建立統計學顯著性。在Psism3.0進行統計學分析。
通過M-模式和Doppler超聲波心動描記術檢測三個系與年齡和性別相適的野生性(WT)。在3個月大時，在活性抑制劑-1轉基因心臟中(n＝14)觀察到與野生型相比較(n＝5)周徑纖維縮短速率的提高(Vcf)(TG7.91±0.31，vs.WT6.28±0.54，circ/sec；P＜0.05)，且噴射時間得到了縮短(TG56.77±1.81，vs.WT64.0±2.07，msec；P＜0.05)。此外，在6個月大時，心臟功能得到了相似地提高，且壽命研究(19WT和19TG)表明沒有突然死亡的跡象，而Kaplan-Meier存活分析(直至2歲)揭示了死亡率沒有顯著差異。使用轉基因系之一(系C)進行了隨後的研究。存在心臟蛋白磷酸酶1活性的顯著降低(15％)(圖3A)，且整體PP1催化亞基蛋白水平或PP2A活性與WT相比較沒有補償性改變(數據未顯示)。
在4nM(選擇性抑制2A型磷酸酶的濃度)崗田酸和EDTA(0.5mM)、2B型磷酸酶抑制劑的存在下，使用32P標記的糖原磷酸酶作為底物檢測PP1活性(Carr，A.N.等，Mol.Cell Biol.2002；224124-35；Suzuki，Y.等，Mol.Cell Biol.2001；212683-94)。在其中利用不高於15％底物來保證反應的線性的條件下進行測試。
如之前所述的(Sato，Y.等，J.Biol Chem.1998；27328470-7)使用Langendorff灌注系統來檢測體外心臟功能。持續計算心率和心室內壓力的最大一階段導數(±dP/dt)。對於細胞功能，分離鈣耐受心肌細胞並將子集裝載Fura-2-AM(Zhao，W.等，Cardiovasc Res.2003；5771-81)。使用加有視頻(video-edged)的檢測系統測定基礎的和異丙基腎上腺素刺激的收縮參數和Ca2+瞬變。將細胞在0.5Hz步測。通過Felix計算機軟體(Photon Technology International，Lawrenceville，New Jersey，USA)分析數據。
Langendorff灌注的心臟，其表示沒有神經激素或血液動力學影響的系統，還表示了提高的固有心臟收縮力。在表達活性抑制劑-1的心臟中，相對於野生型組(圖3B)，提高最大左心室壓了(23％)且+dP/dt和-dP/dt各自增加了39％和36％。此外，分離的鈣耐受性心肌細胞，呈現出提高(56％)的收縮分數(圖3C)。在基礎條件下，提高了表達活性抑制劑-1的心肌細胞中的+dL/dt和-dL/dt，以及收縮分數的程度(％FS)。此外，在異丙基腎上腺素刺激下(ISO)，提高了+dL/dt和-dL/dt。通過活性抑制劑-1表達還將心肌細胞收縮的速率(-dL/dt)和再次伸長(+dL/dt)提高了超過2倍(圖3C)。50％峰和50％舒張的時間也顯著降低。此外，用異丙基腎上腺素(100nM)最大限度地刺激心肌細胞時，心肌細胞收縮的速率(-dL/dt)和再次伸長(+dL/dt)持續提高(圖3C)。
機械參數的改變反映出相似的鈣循環提高。在基礎條件下，活性抑制劑-1心肌細胞中的鈣瞬變50％衰減(T50)的幅度和時間都得到了提高。在異丙基腎上腺素(100nM)刺激下，也縮短了T50。實際上，鈣瞬變的幅度提高了(71％)，反映出提高的SR鈣吸收和SR鈣裝載，Ca2+信號50％衰減的時間(T50)降低了(37％)(圖3D)，表明提高的SERCA2功能。
值得注意的，甚至在異丙基腎上腺素刺激下，活性抑制劑-1心肌細胞持續呈現縮短的T50，同時鈣瞬變的幅度與野生型心肌細胞沒有不同，與機械參數一致。這些對提高的基礎收縮性和增大的β-腎上腺素能反應性的發現支持抑制劑-1作為分子inotrope的作用。因此，該實施例顯示了具有活性抑制劑-1(I-1*)的心臟特異性表達的小鼠呈現出心臟1型磷酸酶活性的降低和心臟收縮性的提高。
實施例5.活性抑制劑-1對Ca2+操縱蛋白和糖原代謝的作用如上所述，關鍵調節磷蛋白如受磷蛋白、理阿諾鹼受體、肌鈣蛋白I和L-型鈣通道的β-腎上腺素受體依賴性蛋白磷酸化構成了控制Ca2+循環和心臟收縮性的關鍵調節機制。因此，在在此所述的轉基因模型中研究了這些關鍵物質的表達(圖4A)和磷酸化水平(圖4B)。
如之前所述的11，18，對心臟勻漿進行定量免疫印跡。使用蛋白Gdynabeads(Dynal Biotechnology Incorporated，Lake Success，NY)進行免疫沉澱實驗。簡而言之，將50μl PP1a抗體(Santa CruzBiotechnology，sc-6104)綴合磁性蛋白質G珠子，如製造商所述的使用0.2M triethanoalamine和20mM二甲基pimedilate。用珠子將500μl心臟勻漿孵育過夜，使用恆定的旋轉運動。用PBS加0.1％吐溫20洗滌珠子5X。最後，使用0.1M檸檬酸(pH2.8)洗脫結合PP1抗體的蛋白，然後在SDS-PAGE上分離，點漬並探測，如上所述。
首先證明了β-腎上腺素受體密度沒有差異，在放射配體結合研究中使用125I-iodocyanopindolol(數據未顯示)。如之前所述的(McGraw，DW和Liggett，SB，J.Biol.Chem.1997；2727338-44)進行放射配體結合研究。簡而言之，將小鼠心臟在含有5mM Tris、2mMEDTA pH7.4、苯甲脒(5μg/ml)和大豆胰蛋白酶抑制劑(5μg/ml)的緩衝劑中均質。將勻漿在40,000xg 4℃離心10分鐘。將所得到的沉澱重懸浮於10體積的均質緩衝劑中並再次離心。將沉澱重懸浮於測定緩衝劑中(75mM Tris，12.5mM MgCl2、2mM EDTA，pH7.4)，然後將等份試樣在250μl的總體積中室溫孵育2小時，用～400pM125I標記的iodocyanopindolol。在1μM普萘洛爾(propranolol)存在下測定非特異性結合。為了停止反應，加入冷的洗滌緩衝劑(10mM Tris，pH7.4)並通過Whatman GF/C玻璃纖維濾器進行真空過濾。
然而，與野生型心臟相比較(圖4B)，在cAMP依賴性(Ser16)和Ca2+-鈣調蛋白依賴性(Thr17)蛋白激酶位點都存在受磷蛋白磷酸化水平明顯的提高(～1.8倍)。令人感興趣地，心臟理阿諾鹼受體蛋白水平降低～30％(圖4A)，但是該通道的相對(mol Pi/mol RyR2)磷酸化不存在差異(圖4B)。這種對理阿諾鹼受體磷酸化的發現是令人驚訝的，因為蛋白磷酸酶1和蛋白磷酸酶2A都已經顯示出和理阿諾鹼受體大分子複合物共同免疫沉澱(Marx SO等，Cell.2000；101365-76)。
肌鈣蛋白I的蛋白或磷酸化水平的檢測表明活性抑制劑-1表達心臟中沒有改變(圖4B)。此外，不存在L-型Ca2+通道蛋白水平的改變。分離鈣耐受性心肌細胞並將具有清晰橫條紋且沒有自發收縮的細胞用於L-型Ca2+電流的測量。在恆定的電壓獲得電流記錄，並測定細胞電導和Ca2+激活(Bodi，I.等，J.Am.Coll.Cardiol.2003；411611-22)。電流-電壓相關性(I-V)的平均峰Ca2+電流(ICa)和穩定狀態激活在表達活性抑制劑-1和野生型心肌細胞之間是相似的。然而，激活抑制劑-1轉基因細胞中的ICa激活在比野生型細胞中的快(圖4C)，與之前在受磷蛋白敲除小鼠中的觀察相似(Masak，H.等，Am.J.Physiol.1997；272H606-12)。
重要地，研究了糖原代謝，且觀察到在表達活性抑制劑-1和野生型心臟之間的糖原合成和糖原磷酸活性沒有顯著差異。此外，這些心臟中的總體糖原累積不存在差異。因此，心肌中活性抑制劑-1的表達對糖原代謝不具有顯著作用，與之前對抑制劑-1消融的發現相一致，其沒有改變骨骼肌中的糖原代謝(Scrimgeour，AG等，J.Biol.Chem.1999；27420949-52)。
實施例6.活性抑制劑-1延遲了壓力超負荷中的功能退化和代償性心臟肥大為了檢測與提高的Ca2+循環相關的活性抑制劑-1表達是對抗由血液動力學應力引起的心臟重塑是保護性的假設，我們使轉基因小鼠和等基因野生型組接受橫向主動脈縮窄，接著在縮窄後6和12周連續超聲波心動描記測定(Kiriazis，H.等，Cardiovasc Res.2002；53372-81)。如之前所述的(Kiriazis，H.等，Cardiovasc Res.2002；53372-81)，對小鼠進行了橫向主動脈縮窄。簡而言之，使用27-規格針，使10周大的FVBN雄性野生型和轉基因小鼠接受橫向動脈縮窄。在縮窄之前和縮窄後的各個時間點進行超聲波心動描記術。在終點，測量橫主動脈梯度、以及肺、肝、心臟和體重，將心臟組織儲存用於隨後的組織生理學分析和生化研究。
雖然在這兩組之間的橫主動脈梯度相似(WT47.4±2.50；TG46.75±2.69，mmHg)，活性抑制劑-1小鼠沒有呈現出Vcfc下降，和h/r(壁厚度/半徑)比例增加(圖5A)，表明維持的功能和降低的壁張力或應力，如通過La Place’s定律所測定的。相反，WT經歷了～30％的Vcfc降低以及左心室末端舒張和末端收縮尺寸的顯著增加(P＜0.05)，表明心臟舒張的發展(圖5A)。
如之前所述的進行壓力測量。(del Monte F.，Circulation.2001；1041424-9)。使用等式P＝Poe-tτ-+PB計算等容舒張(τ)的時間過程，其中P是左心室等容壓，Po是在峰-dP/dt時的壓力，和PB是剩餘壓力。對於步測研究，將心外膜導線置於連接刺激器(GrassInstruments，MA)的心房附屬部分上。在動物子集中，將多個0.7mm壓電晶體(Sonometrics Co.，Canada)在二尖瓣閥門的水平沿著心室的短軸置於左心室的表面上來測量晶體間的距離。通過夾住下腔靜脈在不同的負荷條件下產生左心室壓-尺寸環。通過系列負荷條件下產生系列壓力尺寸環來獲得末端收縮壓-尺寸相關性並連接單個壓力-尺寸環的上左手拐角來產生最大斜率。
在研究的終點(12周)，相對於假對照(圖5B)，野生型中心臟對體重的比例提高了78％，活性抑制劑-1小鼠中提高了52％。與活性抑制劑-1縮窄的小鼠相比較(20％)，野生型中肺塞頻率也高得多(80％)。將肺塞限定為高於假對照2個標準偏差的肺重量。
心臟在顯微水平的進一步檢測揭示了縮窄的WT心臟中提高的空隙和血管周圍的纖維化(圖5C)--在野生型小鼠中具有中度至嚴重的多焦點和血管周圍的纖維化和活性抑制劑-1心臟中的中度至輕度纖維化。因此，實施例6表明了活性抑制劑-1表達保護了接受主動脈縮窄的小鼠免受心臟功能退化和形態退化。如之前所述的(Cohen，P.，Adv.Second Messenger Phosphoprotein Res.1990；24230-5)進行了使用HE、三色、PAS和TRITC標記的麥芽凝集素的心肌細胞橫截面積的組織病理學研究(Sigma ChemicalCo.，St.Louis，Missouri，USA)。特別地，對於細胞壁的麥芽凝集素標記，測定了每個心臟(n＝每組3個心臟)40個或更多細胞的橫截面積(來自多個切片)。麥芽凝集素染色表明了與縮窄的抑制劑-1心臟相比較(n＞來自每組3隻小鼠的120個心肌細胞)(圖6A)，縮窄WT中的心肌細胞截面面積得到顯著提高。已知抑制劑-1的抗增殖性效果，檢測了PKC、鈣調神經磷酸酶、CREB和MAP-激酶增殖性途徑。與WT組相比較，在縮窄的TS中存在p38和ERK1/2激活的顯著降低(圖6B)。
抑制劑-1的保護效果與受磷蛋白、SERCA和集鈣蛋白水平的任何改變不相關，但是Ser16處的受磷蛋白的磷酸化得到了顯著提高(圖6C)。值得注意的，沒有觀察到Thr處的受磷蛋白磷酸化或理阿諾鹼受體的Ser2809磷酸化的差異。因此，實施例同樣顯示了活性抑制劑-1表達保護了接受主動脈縮窄的小鼠免受細胞水平的心臟肥大，削弱了MAP-激酶途徑的激活並對受磷蛋白磷酸化具有有益效果。
實施例7.活性抑制劑-1表達拯救了過渡成衰竭的壓力超負荷肥大的大鼠模型為了研究通過腺病毒基因轉移的活性抑制劑-1的短期表達是否可以提高預先存在的心力衰竭情況中的血液動力學參數，使用了壓力超負荷誘導的心肌病的大鼠模型，其在縮窄後22周呈現出提高的左心室舒張尺寸和降低的收縮分數(del Monte F.，Circulation.2001；1041424-9)。從Charles River Laboratories(Wilmington，MA)獲得四周大的Wistar大鼠(70-80g)並如之前所述的進行主動脈窄縮(delMonte F.，Circulation.2001；1041424-9)。最初將動物隨機分成兩組一組30隻主動脈縮窄的動物和第二組32隻假手術的動物。所有動物在最初的手術中存活。
當觀察到左心室收縮分數的降低高於25％時，進行基因轉移。將主動脈窄縮的30隻動物組再分成15隻兩組，每組接受Ad.I-1T35D或Ad.GFP。24隻假手術的動物組沒有接受任何基因轉移並以年齡相適的方式進行了研究。I-1T35D組中的一隻動物和GFP組中的一隻動物在基因轉移手術過程中死亡。之前已經描述了腺病毒遞送系統(BerriR.等，Circulation.2002；1061756-9)。在假手術大鼠中，沒有進行基因轉移。之前的研究已經表明了注射Ad.GFP的假手術大鼠的行為方式與非感染的假手術大鼠相似。使用基於導管方法的活性抑制劑-1或報導基因GFP的腺病毒基因遞送誘導了衰竭和非衰竭心臟中整個心室非常均勻的表達模式(Del Monte，F.等，Physiol Genomics.2002；949-56)。
產生腺病毒載體(Del Monte，F.等，Circulation.1999；1002308-11)並在大鼠心力衰竭模型(Beeri R等，Circulation.2002；1061756-9)中遞送(Beeri R等，Circulation.2002；1061756-9；Del Monte，F.等，Circulation.2001；1041424-9)。如之前所述的(Beeri R等，Circulation.2002；1061756-9；Del Monte，F.等，Circulation.2001；1041424-9)進行壓力測量和生化測定(終止時)。
免疫印跡研究也證實了用Ad.I-1*感染時活性抑制劑-1的表達和蛋白磷酸酶1活性得到顯著降低(60％)(數據未顯示)。衰竭對照組中左心室功能降低(圖7A)，但是活性抑制劑-1的基因轉移顯著提高了壓力升高的速率(+dP/dt)(圖7A)。還通過活性抑制劑-1表達將舒張參數標準化，如通過左心室收縮壓的最大下降速率(-dP/dt)的恢復以及通過等容舒張常數τ測量的壓力下降的時間過程所示的(圖7B)。
為了進一步定義負荷無關方式的心室功能，在動物子集中進行壓力-尺寸分析(圖7C)。如之前所述的進行壓力測量(Del Monte，F.等，Circulation.2001；1041424-9)。使用等式P＝Poe-tτ+PB計算等容舒張(τ)的時間過程，其中P是左心室等容壓，Po是在峰-dP/dt時的壓力，和PB是剩餘壓力。對於步測研究，將心外膜導線置於連接刺激器(Grass Instruments，MA)的心室附屬部分上。在動物子集中，將多個0.7mm壓電晶體(Sonometrics Co.，Canada)在二尖瓣閥門的水平沿著心室的短軸置於左心室的表面上來測量晶體間的距離。通過夾住下腔靜脈在不同的負荷條件下產生左心室壓-尺寸環。通過在系列負荷條件下產生系列壓力尺寸環來獲得末端收縮壓-尺寸相關性並連接單個壓力-尺寸環的上左手拐角來產生最大斜率。
為了改變負荷條件，在開胸動物中將下腔靜脈夾住，因此減小了心室體積。這使得可以計算末端收縮壓尺寸相關性，使用不同預負荷條件下的系列測量值(圖7C)。與未衰竭的相比較，感染對照病毒(Ad.GFP)的對照衰竭心臟中的末端收縮壓尺寸相關性的最大斜率(Emax，或最大倒電容)較低，表明了固有心肌收縮性和收縮儲備的降低狀態。活性抑制劑-1的表達完全恢復了末端收縮壓尺寸相關性對非衰竭水平的斜率(圖7D)，表明恢復了心臟面對提高的預負荷提高收縮性的能力。因此，按照上述的結果，活性抑制劑-1的急性腺病毒表達停止了壓力超負荷誘導的心力衰竭大鼠模型中的心臟功能障礙和心臟代償失調的進展。
如之前所述的(Margolis，S.S.，Embo J.2003；225734-45)，還使用(Schwinger，R.H.，Circulation.1995；923220-8)P-標記的髓磷脂鹼性蛋白(BEB目錄#1780S)進行了磷酸酶活性的其他測定，使用岡田酸來區分PP1和PP2A活性。測定了心肌勻漿中的糖原合成酶(GS)和糖原磷酸酶(GP)活性(Suzuki，Y.等，Mol.Cell Biol.2001；212683-94)。在7.2mM糖原合成酶活性的變構效應因子葡萄糖-6-磷酸鹽的存在或不存在下，通過來自UDP[14C]葡萄糖的[14C]葡萄糖轉移至糖原中來測定GS活性。在2mM糖原磷酸酶的變構激活劑AMP的不存在或存在下，通過測量來自[14C]葡萄糖-1-磷酸鹽的[14C]葡萄糖引入糖原中來測定糖原磷酸酶活性。
生化特徵揭示了衰竭心臟中SERCA2a水平顯著降低，與之前的報導相一致(Del Monte，F.等，Circulation.2001；1041424-9)，且這些水平在對照(Ad.GFP)或活性抑制劑-1基因轉移時保持降低。受磷蛋白或理阿諾鹼受體的水平沒有差異(圖8A)。cAMP-依賴性位點絲氨酸16處的受磷蛋白的磷酸化在衰竭心臟中顯著降低，但是活性抑制劑-1的腺病毒基因轉移與絲氨酸16的磷酸化實質性提高相關(圖8B)。令人感興趣的，感染對照或活性抑制劑-1病毒的衰竭組，呈現出受磷蛋白Thr-17磷酸化的提高(圖8B)。
進一步的檢測揭示了這些心臟中的CAM-激酶活性顯著提高(
圖10和表1，以下)。
表1
表1假手術或動脈縮窄後大鼠的超聲波心動描記測量PW舒張期過程中後期的壁厚度，LVDD舒張期過程中的左心室直徑，LVSD收縮期過程中的左心室收縮直徑，FS收縮分數，與相似時間段的假手術相比較*P＜0.05，與1 2周時的值相比較P＜0.05。
與非衰竭(NF)對照組相比較，衰竭(F)大鼠心臟中和感染Ad.I-1*或Ad.GFP的衰竭大鼠心臟中的CaM-激酶活性提高。令人感興趣的，所有衰竭組中的理阿諾鹼受體絲氨酸2809的磷酸化水平提高。活性抑制劑-1的感染對理阿諾鹼受體磷酸化沒有差異(圖8B)。
活性抑制劑-1基因轉移對MAP-激酶激活作用的檢測表明了激活的p38-MAP-激酶實質性的降低，ERK或JNK的激活沒有改變(圖8C)。
實施例8.心臟中抑制劑-1的作用機理以上發現表明了抑制劑-1表達與提高的受磷蛋白磷酸化相關。因此，抑制劑-1可以在體內選擇性地影響蛋白磷酸酶1底物。為了進一步證實這種觀察，使用蛋白磷酸酶1(a-isoform)催化亞基的抗體進行了免疫沉澱實驗。對於抑制劑-1競爭結合測試，如早先所述的進行免疫沉澱。除去未結合的心臟勻漿後，將珠子洗滌(5x，PBS加0.1％吐溫20)，然後用500μl不同終濃度(10nM至1000nM)的純化並磷酸化的抑制劑-1孵育。然後洗滌珠子(3x)並用0.1M檸檬酸(pH2.8)洗脫結合的蛋白質。值得注意的，抑制劑-1、靶向蛋白磷酸酶1亞基的SR/糖原(RGL)(Tang，P.M.等，J.Biol Chem 1991；26615782-9)和受磷蛋白與蛋白磷酸酶1共同免疫沉澱(圖9A)。用遞增濃度(10nM至1000nM)的純化並磷酸化的抑制劑-1孵育這種複合物，揭示了以劑量依賴性方式降低的受磷蛋白結合(圖9B)。
其他實施方案在以下權利要求內。
權利要求
1.治療患有心力衰竭患者的方法，所述方法包括以有效降低磷酸酶活性並因此提高β-腎上腺素能反應性的量，將包括編碼抑制磷酸酶活性的磷酸酶抑制劑蛋白的序列的核酸引入患者的心臟細胞中。
2.權利要求1的方法，其中磷酸酶抑制劑蛋白抑制1型磷酸酶。
3.權利要求1的方法，其中磷酸酶抑制劑蛋白是全長蛋白。
4.權利要求1的方法，其中磷酸酶抑制劑蛋白是組成型活性片段。
5.權利要求1的方法，其中磷酸酶抑制劑蛋白是磷酸酶抑制劑-1或其片段。
6.權利要求5的方法，其中磷酸酶抑制劑蛋白是磷酸酶抑制劑-1的組成型活性片段。
7.權利要求5的方法，其中磷酸酶抑制劑-1蛋白在位置35具有蘇氨酸。
8.權利要求5的方法，其中磷酸酶抑制劑-1蛋白在位置35具有天冬氨酸(T35D)。
9.權利要求5的方法，其中磷酸酶抑制劑蛋白包括磷酸酶抑制劑-1的胺基酸1-65，位置35的天冬氨酸(T35D)，且在胺基酸171、90、70、67、66、65、61或54處或之前平截。
10.權利要求5的方法，其中核酸進一步包括可操作連接編碼序列的啟動子。
11.權利要求10的方法，其中啟動子是組成型啟動子。
12.權利要求10的方法，其中啟動子在組織的子集中表達，其中至少一種是心肌。
13.權利要求10的方法，其中啟動子包括來自巨細胞病毒(CMV)或心臟特異性心臟肌鈣蛋白T的調節序列、肌球蛋白重鏈或肌球蛋白輕鏈。
14.權利要求1的方法，其中使用病毒顆粒來引入核酸。
15.權利要求14的方法，其中使用慢病毒顆粒來引入核酸。
16.權利要求14的方法，其中使用腺相關病毒顆粒來引入核酸。
17.權利要求16的方法，其中AAV顆粒是血清型AAV6。
18.權利要求1的方法，其中以有效導致肌細胞收縮、降低鬆弛的時間常數tau(τ)、加速鈣信號衰減的量來引入核酸。
19.權利要求1的方法，其中以有效提高受磷蛋白絲氨酸16磷酸化的量來引入核酸。
20.權利要求1的方法，其中以有效提高末端收縮壓力尺寸相關性的量來引入核酸。
21.權利要求1的方法，其中患者患有缺血、心律不齊、心肌梗塞、異常的心臟收縮性或異常的Ca2+代謝。
22.權利要求1的方法，其中患者是人。
23.權利要求1的方法，其中限制通過冠狀血管的血流並將病毒遞送系統引入冠狀動脈的腔內。
24.權利要求23的方法，在限制冠狀靜脈流出的同時允許心臟跳動。
25.權利要求23的方法，其中完全限制通過冠狀血管的血流。
26.權利要求23的方法，其中受限制的冠狀血管包括左前降動脈(LAD)、遠端迴旋支動脈(LCX)、大冠狀靜脈(GCV)、心中靜脈(MCV)或前心室內靜脈(AIV)。
27.權利要求23的方法，其中在冠狀血管缺血預處理後進行病毒遞送系統的引入。
28.權利要求1的方法，其中在限制血液流出心臟的動脈流時將載體注射至心臟中，因此允許載體流入並遞送至心臟。
29.權利要求1的方法，其中通過包括以下步驟的方法將載體注射至心臟中限制血液流出心臟的主動脈流，使得血流改變方向至冠狀動脈中；將載體注射至心臟、主動脈或冠狀口的腔內，使得載體流入冠狀動脈中；在限制血液的主動脈流出的同時允許心臟跳動；和恢復血液的流動。
30.權利要求1的方法，其中用導管將載體注射至心臟中。
31.權利要求1的方法，其中將載體直接注射至心肌中。
32.權利要求1的方法，所述方法還包括評價患者心臟功能的參數。
33.權利要求32的方法，其中心臟功能的參數是以下的一種或多種心率、心臟代謝、心臟收縮性、心室功能、Ca2+代謝或肌質膜Ca2+ATPase活性。
34.一種病毒遞送系統，其有效地將非病毒核酸序列引入心肌細胞中，該系統包括含有編碼抑制磷酸酶活性的蛋白的序列的核酸。
35.權利要求34的系統，其中蛋白質是I-1的組成型活性片段。
36.權利要求34的系統，其中病毒遞送系統源自腺相關病毒、腺病毒或慢病毒。
37.提供包括調節磷酸酶活性的核酸的病毒顆粒的方法，該方法包括將含有可操作地連接病毒包裝信號的核酸的宿主細胞接觸一種或多種提供能夠供給顆粒形成所需要病毒基因產物的成分的試劑，和從宿主細胞周圍的介質中收集包裝核酸但不含有可複製病毒的病毒顆粒。
38.權利要求37的方法，其中所述一種或多種試劑包括輔助病毒。
全文摘要
心臟細胞中磷酸酶抑制劑的表達可以用於治療心臟病，例如，心力衰竭。降低磷酸酶活性可以提高β－腎上腺素能反應性。
文檔編號A01N63/00GK101056539SQ200580038337
公開日2007年10月17日 申請日期2005年9月8日 優先權日2004年9月9日
發明者R·J·哈亞, F·德爾蒙特, E·克拉尼亞斯 申請人:綜合醫院公司, 辛辛那提大學