含有穩定態1，2-二氧環乙烷及與之以狹窄的間距相聯繫的螢光化合物的組合物及其應用的製作方法

2023-05-09 09:41:36 2

專利名稱：含有穩定態1，2-二氧環乙烷及與之以狹窄的間距相聯繫的螢光化合物的組合物及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及含有螢光化合物和穩定態1，2-二氧環乙烷的組合物，所述1，2-二氧環乙烷可由包括酶在內的化學試劑觸發，而產生很強的化學發光作用。更具體地講，本發明涉及一種大幅度增強化學發光的方法，該方法涉及在一有組織的集合體內分子間能量轉移至一種螢光化合物。正如一種膠束，該集合體在二氧環乙烷與螢光化合物之間保留了一個狹窄的間距。
1.發光的機制在化學反應過程中放熱的化學反應釋放能量。實際上在所有情況下，量都是以振動激發或熱的形式出現。但有少數化學過程產生光或化學發光作用，而不產生熱。產生光的機制包括高能物質(常常是有機過氧化物，例如，1，2-二氧環乙烷)經熱分解或催化分解而產生呈三重態或單一態的電子激發態的反應產物。單一激發態的螢光導致所謂的直接化學發光作用。化學發光的量子產額是單一態化學激發和螢光的，量子產額的產物。通常用效率表示這些定量;即效率(%)＝Φ×100.可以利用從三重態或單一態產物到螢光受體的能量轉移來產生間接的化學發光作用。間接化學發光作用的量子產額是單一態或三重態的化學激發、能量轉移及能量受體螢光的量子產額的產物。
2.生物發光中的二氧環乙烷中間體.
1968年，McCapra提出在包括熒火蟲系統在內的各種生物發光反應中，1，2-二氧環乙烷可能是關鍵的高能中間體。(F.McCapra，Chem，Commun.，155，(1968))。儘管這類物質顯然很不穩定，並且一直沒有分離出或被光譜鑑定過，但是通過O18標記實驗清楚地證實了它是該反應的中間體。(O.Shimomura and F.H Johnson，Photochem.Photobid.，30，89(1979))。
3.首次合成真正的1，2-二氧環乙烷.
1969年，kopecky和Mumford報導通過β-溴氫過氧化物的鹼催化環化作用首次合成了二氧環乙烷(3，3，4-三甲基-1，2-二氧環乙烷)。(K.R.Kopecky and C.Mumford，can.J.Chem.，47，709(1969))。正如McCapra預言的那樣，事實上該二氧環乙烷在加熱至50℃時分解成丙酮和乙醛並產生化學發光，。但是該過氧化物比較不穩定，不能在室溫(25℃)下貯存而不迅速分解。另外，化學發光效率很低(低於0.1%)。
Bartlett，和Schaap，Mazur和Foote.分別開發了另一更方便的合成1，2-二氧環乙烷的途徑。在分子氧及光敏染料的存在下，使適當取代的鏈烯烴產生光氧化，以很高的收率產生二氧環乙烷。
(P.D.Bartlett and A.P.Schaap，J.Amer.Chem.Soc.，92，3223(1970)and S.Mazur and C.S.Foote，J.Amer.Chem.Soc.，92，3225(1970))。該反應的機制包括光化學產生稱之為單一態氧的亞穩定物，後者與鏈烯經歷2+2環加成得到二氧環乙烷。研究表明，採用該反應可以製得各種二氧環乙烷。(A.P.Schaap，P.A.Burns，and K.A.Zaklika，J.Amer.Chem.Soc.，99，1270(1977);K.A.Zaklika，P.A.Burns，and A.P.Schaap，J.Amer.Chem.Soc.，100，318(1978);K.A.Zaklika，A.L.Thayer，and A.P.Schaap，J.Amer.Chem.Soc.，100，4916(1978);K.A.Zaklika，T.Kissel，A.L.Thayer，P.A.Burns and A.P.Schaap，Photochem.Photobiol.，30，35(1979);and A.P.Schaap，A.L.Thayer，and K.Kees，Organic Photochemical Synthesis，H，49(1976)).在這一研究過程中，開發了一種用於光氧化聚合物鍵合的敏化劑(a polymerbound sensitizer)。(A.P.Schaap，A.L.Thayer，E.C.Blossey，and D.C.Neckers，J.Amer.Chem.Soc.，97，3741(1975);and A.P.Schaap，A.L.Thayer，K.A.Zaklika，and P.C.Valenti，J.Amer.Chem.Soc.，101，4016(1979)).
這種新型敏化劑已獲得專利權並以商品名「SENSITORTM」出售。(美國專利4，315，998(2/16/82);加拿大專利1，044，639(12/19/79))。有關這一產品應用的文獻已超過50篇。
4.由具有立體位阻的鏈烯烴類製備穩定的二氧環乙烷Wynberg發現具有立體位阻的鏈烯烴類[如二金剛烷聯烯(adam antylideneadamantane)]經光氧化，得到一種很穩定的二氧環乙烷。(J.H.Wieringa，J.Strating，H，Wynberg，and W.Adam，Tetrahedron Lett.，169(1972))。Turro和Schaap的協作研究表明該二氧環乙烷的分解活化能為37 Kcal/mol，室溫(25℃)半衰期超過20年(N.J.Turro，G.Schuster，H.C.Steinmetzer，G.R.Faler，and A.P.Schaap，J.Amer.Chem.Soc.，97，7110(1975))。事實上，這是迄今文獻報導中最穩定的二氧環乙烷。Adam和Wynberg最近建議可將官能化的亞金剛烷基金剛烷1，2-二氧環乙烷用於生物醫學目的(W.Adam，C.Babatsikos，and G.Cilento，Z.Naturforsch.，39b，679(1984);H.Wynberg，E.W.Meijer，and J.C.Hummelen，Bioluminescence and Chemiluminescence，M.A.DeLuca and W.D.McEloroy(Eds.)Academic Press，New York，P.687，1981;and J.C.Hummelen，T.M.Luider，and H.Wynberg，Methods in Enzymology，133B，531(1986))，但是，將這一異常穩定的過氧化物用於化學發光的標記所需要的檢測溫度為150至250℃。顯然，這些條件不適宜在水介質中測定生物分析物。McCapra，Adam，和Foote指出將螺旋稠環或多環烷基與二氧環乙烷結合有助於穩定那些沒有龐大立體基團時很不穩定的二氧環乙烷。(F.McCapra，I.Beheshti，A，Burford，R.A.Hann，and K.A.Zaklika，J.Chem.Soc.，Chem.Commun.，944(1977);W.Adam，L.A.A.Encarnacion，and K.Zinner，Chem.Ber.，116，839(1983);G.G.Geller，C.S.Foole，and D.B.Pechman.Tetrahedron Lett.，673(1983);P.Lechtken，Chem.Ber.，109，2862(1976);and P.D.Bartett and M.S.Ho，J.Amer.Chem.Soc.，96，627(1974))
5.取代基對二氧環乙烷化學發光的影響在過氧環上連接特殊的取代基可以改變二氧環乙烷的穩定性和化學發光效率。(K.A.Zaklika，T.Kissel，A.L.Thayer，P.A.Burns，and A.P.Schaap，Photochem.Photobiol.，30，35(1979);A.P.Schaap and S.Gagnon，J.Amer.Chem.Soc.，104，3504(1982);A.P.Schaap，S.Gagnon，and K.A.Zaklika，Tetrahedron Lett.，2943(1982);and R.S.Handley，A.J.Stern，and A.P.Schaap，Tetrahedron Lett.，3183(1985))。下文示出的具雙環系統的結果闡述了各種官能團對二氧環乙烷性質的巨大影響。由2，3-二芳基-1，4-二噁烯衍生的羥基取代二氧環乙烷(X＝-OH)在室溫(25℃)的分解半衰期為57小時，並在稍高溫度下加熱時，產生很低水平的發光作用。相反，該二氧環乙烷在-30℃與鹼產生一線蘭光。動力學研究顯示，在25℃時去質子的二氧環乙烷(X＝O-)的分解比質子形式(X＝OH)快5.7×106倍。
由於兩種競爭分解機制引起了這兩種二氧環乙烷的性質差別。(K.A.Zaklika，T.Kissel，A.L.Thayer，P.A.Burbs，and A.P.Schaap，Photochem.Photobiol.，30，35(1979);A.P.Schaap and S.Gagnon，J.Amer.Chem.Soc.，104，3504(1982);A.P.Schaap，S.Gagnon，and K.A.Zaklika，Tetrahedron Lett.，2943(1982);and R.S.Handley，A.J.Stern and A.P.Schaap，Tetrahedron Lett.，3183(1985))。多數二氧環乙烷的裂解方式是O-O鍵均裂並形成雙自由基。另一機制適用於帶有像O-取代基與低氧化電位的二氧環乙烷。其引發裂解的方式是電子在分子內由取代基向過氧化物鍵的反鍵軌道轉移。
6.二氧環乙烷的化學觸發上文介紹了文獻中的第一個實例(A.P.Schaap and S.Gagnon，J.Amer.Chem.Soc.，104，3504(1982))。但是，羥基取代的二氧環乙烷和由二芳基-1，4-二噁烯衍生的任何其他二氧環乙烷的例子，由於極不穩定而沒有任何用途。它們在25℃時半衰期僅為幾小時。無論是該二氧環乙烷還是前體鏈烯都無法迴避製備衍生物的條件少量的胺.(T.Wilson，Int.Rev.Sci.Chem.，Ser.TWO，9，265(1976))和金屬離子[T.Wilson，M.E.Landis，A.L.Baumstark，and P.D.Bartlett，J.Amer.Chem.Soc.，95，4765(1973);P.D.Bartlett，A.L.Baumstark，and M.E.Landis，J.Amer.Chem.Soc.，96，5557(1974)]即可破壞這些未經穩定的二氧環乙烷，並且不能將它們用於酶觸發所需的水性緩衝液。
7.在均相溶液中涉及二氧環乙烷的能量轉移型化學發光.
Wilson和Schaap介紹了涉及二氧環乙烷的能量轉移型化學發光的第一個實例(T.Wilson and A.P.Schaap，J.Amer.Chem.Soc.，93，4126(1971))。熱分解很不穩定的二氧環乙烷(順式二乙氧基二氧環乙烷)得到單一和三重態激發的甲酸乙酯。加入9，10-二苯蒽和9，10-二溴蒽導至分別通過單一態-單一態和三重態-單一態的能量轉移而增強了了化學發光作用。因此，許多其他學者採用這些技術確定各種二氧環乙烷經熱分解而產生的化學激發態產物的收率(例如，參見W.Adam，In Chemical and Biological Generation of Exicited States，W.Adam and G.Cilento，Eds.Ch.4，Academic Press，New York，1892)。然而由於電子激發態物質的存在期短，所以在均相溶液中轉移能量需要高濃度的能量受體。而高濃度就帶來了自身弱化和重吸收的問題。本發明採用下述方法解決了這一問題，即採用1，2-二氧環乙烷和螢光能量受體最好將兩者加到能夠承擔有效的能量轉移的膠束中，而在本體溶液中無須高濃度的螢光物。
8.採用在膠束中的分子間能量，以增強二氧環乙烷化學發光作用。
水溶液中的膠束可以加速各種化學反應的速率(參見例如，E.H.Cordes和R.B.Dunlap，Acc.Chem.Res.，2，329(1969))。催化作用起因於在膠束假相中的底物的增溶作用以及靜電的、疏水的或極性的因素。有人已將水性膠束用於增加化學觸發二氧環乙烷的速率(A.P.Schaap，Final Technical Report to the Office of Naval Research，1987，P.16)。目前還未見報導採用諸如共表面活性劑的螢光化合物可增強化學發光效率的實驗。
有數篇報導介紹了在膠束環境內由化學反應增強化學發光作用。但沒有一篇報導利用向螢光共表面活性劑的能量轉移。有關膠束中穩定的二氧環乙烷尚無人研究。Goto已研究了在中性，陰離子和陽離子表面活性劑存在下的螢光素的化學氧化反應[T.Goto and H.Fukatsu，Tetrahedron Lett.，4299(1969)]。增強化學發光作用的原因在於與水溶液相比，在膠束中反應產物的螢光效率增加。有人報導了十六烷基三甲基胺溴化物膠束對於9，10-二氫吖啶酯類在鹼性水溶液中化學發光反應的影響(F.McCapra，Acc.Chem.Res.，9，201(1976))。但是，McCapra指出膠束環境並不「有助於激發反應」。相反，有人認為膠束是通過降低競爭速率，不發光的水解反應來提高發光率。同樣，Nikovauras和Gundermann分別研究了膠束對光澤精和魯米諾衍生物的化學發光反應的影響(C.M.Paleos，G.Vassilopoulos，and J.Nikokavouras，Bioluminescence and Chemiluminescence，Academic Press，New York，1981，P.729;K.D.Gundermann，Ibid.，P.17)。Shinkai觀察到相對於水而言，在膠束中可以提高不穩定的，非同標記的二氧環乙烷的化學發光率(S.Shinkai，Y.Ishikawa，O.Manabe，and T.Kunitake，Chem.Lett.，1523(1981))。這些作者推論在膠束的疏水中心的激發態產額高於在水中的產額。
僅有一篇文獻談到了用表面活性劑提高酶促產生的化學發光作用，該文獻即為Kricka和Deluca關於熒火蟲蟲螢光素酶系統的著作(L.J.Kricka和M.Deluca，Arch.Biochem.Biophyts.，217，674，(1983))。非離子去汙劑和聚合物通過增加酶的周轉來提高總體發光率。陽離子表面活性劑(如十六烷基三甲基胺溴化物，CTAB)實際上導致蟲螢光酶催化活性的競爭抑制。
一種用於提高魯米諾/過氧化酶反應的化學發光率的方法是加入6-羥基苯並噻唑衍生物或對位取代的苯酚(G.H.G.Thorpe，L.J.Kricka，S.B.Moseley，T.P.Whitehead，Clin.Chem.，31，1335(1985);G.H.G.Thorpe and L.J.Kricka，Methods in Enzymology，133，331(1986);and L.J.Kricka，G.H.G.Thorpe，and R.A.W.Stott，Pure Appl.Chem.，59，651(1987))。該作用機制還不清楚，但它確實不包括分子內或分子間能量轉移至共膠束螢光表面活性劑。
已將共膠束螢光探針用於研究膠束的動力學性質。(Y.Kubota，M.Kodama，and M.Miura，Bull.Chem.Soc..Jpn.，46，100(1973);N.E.Schore and N.J.Turro，J.Amer.Chem.Soc.，96，306(1974);and G.W.Pohl，Z.Naturforsch.，31C，575(1976))。但在文獻中還未見採用這些螢光材料通過能量轉移程序提高膠束中化學發光反應的實例。
9.化學發光的免疫測定在提交申請(序列號887，139)之前，未見報導將二氧環乙烷用作酶底物或將它們用於酶結合的測定。Wynberg採用穩定的二氧環乙烷作為「熱化學發光」標記物，用於免疫測定(J.C.Hummelen T.M.Luider，and H.Wynberg，Methods in Enzymology，133B，531(1986))。這些二氧環乙烷用來標記蛋白質之類的生物物質。通過將該樣品加熱到100至250℃來繼續進行分析以檢測由熱引起的化學螢光。這一技術不同於採用可觸發的二氧環乙烷作為酶底物的技術。
已將魯米諾衍生物，吖啶鎓酯類和光澤精作為化學發光標記物用於抗原，抗體和半抗原。(H.R.Schroeder and F.M.Yeager，Anal.Chem.，50，1114(1978);H.Arakawa，M.Maeda，and A.Tsuju，Anal.Biochem.，79，248(1979);and H.Arakawa，M.Maeda，and A.Tsuji，Clin.Chem.，31，430(1985).For reviews，seeL.J.Kricka and T.J.N.Carter，In Clinncal and Biochemical Luminescence，L.J.Kricka and T.J.N.Carter(Eds.)，Marcel Dekker，Inc.，New York，1982，Ch.8;L.J.kricka，Ligand-Binder Assays，Marcel Dekker，Inc.，New York，1985，Ch.7;F.McCapra and I.Beheshti，In Bioluminescence and ChemiluminescenceInstruments and Applications，Vol.I，K.Van Dyke(Ed.)，CRC Press，Inc.，Boca Raton，FL，1985，Ch.2，Note，in Particular，the section on dioxetanes，P.13;and G.J.R.Barnard.J.B.Kim，J.L.Williams，and W.P.Collins，Ibid，Ch.7)。涉及用酶標記抗原，抗體及半抗原的測定系統稱之為酶免疫測定。通過顏色或螢光顯現技術檢測上述酶標記物。最近，用魯米諾/過氧化氫，焦棓酚/過氧化氫，Pholas dactylus螢光素，或魯米諾在鹼性條件下測定過氧化酶結合物，從而奠定了發光酶免疫測定法的基礎。(L.J.Kricka and T.J.N.Carter，In Clinical and Biochemical Luminescence，L.J.Kricka and T.J.N.Carter(Eds.)，Marcel Dekker，Inc.，New York，1982，Ch.8)。在本人申請(序列號為887，139)之前，沒有任何酶結合的測定法介紹將二氧環乙烷用作酶催化底物，進而產生供檢測的光。
10.發光反應的攝影檢測.
已將瞬攝影膠片和X-線膠片用於記錄由數種化學發光作用和生物發光反應產生的光發射。(L.J.Kricka and G.H.G.Thorpe，Methods in Enzymology，133，404(1986)and references therein.see alsoM.M.L.Leong，C.Milstein，and R.Pannel，J.Histochem.Cytochem.，34，1645(1986);R.A.Bruce，G.H.G.Thorpe，J.E.C.Gibbons，P.R.Killeen，G.Ogden，L.J.kricka，and T.P.Whitehead，Analyst，110，657(1985);J.A.Matthews，A.Batki，C.Hynds，and L.J.Kricka，Anal.Biochem.，151，205(1985);and G.H.G.Thorpe，T.P.Whitehead，R.Penn，and L.J.Kricka，Clin.Chem.，30，806(1984))在本人的申請(序列號為887，139)之前，文獻中沒有出現由化學或酶觸發穩定的二氧環乙烷引起的化學發光作用的攝影檢測實例。
因此，本發明的目的之一是提供一種方法和組合物，用於提高可觸發的1，2-二氧環乙烷的化學發光作用。本發明的目的之二是提供可用於免疫測定，並可以和酶結合的DNA探針一起使用的方法和組合物。參照下列說明書和附圖，本發明的上述目的和其他目的則更加顯而易見。


圖1示出磷酸酯取代的二氧環乙烷2C在二甲苯中熱分解的Arrhenius圖。
圖2示出二氧環乙烷2b的鹼觸發反應的化學螢光量子產額與十六烷基三甲基銨溴化物(CTAB)濃度的函數關係圖。圖2a表示二氧環乙烷與螢光共表面活性劑和CTAB表面活性劑形成的理想化結構。
圖3表示在2-氨基-2-甲基-1-丙醇(221)緩衝液(PH 10∶3)中，於37℃，在100ml含鹼性磷酸酶的人體血清中，濃度為10-5M的二氧環乙烷2c的化學發光強度與時間的關係圖。
圖4示出了二氧環乙烷2c的log(平穩期光強度)與log(血清毫升數，1-100)的關係圖。
圖5示出了二氧環乙烷2c的log(50秒光強度)與log(血清毫升數，1-100)的關係圖。
圖6示出了化學螢光光譜(曲線A)，不加CTAB和發光共表面活性劑3時，在221緩衝液中觸發二氧環乙烷2c產生的化學螢光;(曲線B)加入CTAB和3後，二氧環乙烷經酶觸發而產生的能量轉移化學螢光。
圖7示出了在3ml 221緩衝液中，在CTAB螢光劑和2.7×10-15摩爾鹼性磷酸酶存在下(實驗D)，二氧環乙烷2C光強度與時間的關係圖。無酶的試劑空白的光強度等於時間為0時的光強度。
圖8示出了在0至3分鐘內，log(光強度積分值)與log(鹼性磷酸酶摩爾數)的關係圖。
圖9示出了在加有CTAB/螢光劑和2.3×10-17摩爾鹼性磷酸酶的200ml 221緩衝液中，二氧環乙烷c的光強度與時間的關係圖。無酶試劑空白的光強度等於時間為0時的光強度。
圖10示出了在0至30分鐘內，log(光強度積分值)與log(鹼性磷酸酶摩爾數)的關係圖。
圖11是採用ASA3000 Polaroid Type 57膠片對由二氧環乙烷2c引起的化學發光進行攝影檢測的結果。將含有鹼性磷酸酶，二氧環乙烷，Mg(OAC)2，CTAB，螢光素表面活性劑3的221緩衝液(100ml)在Dynatech ImmulonTM槽中，於37℃保溫1小時，然後在該溫度攝影15分鐘。鹼性磷酸酶的量為A，2700渺摩爾;B，250渺摩爾;C，23渺摩爾;D，無酶(不可見)試劑對照。
圖12是採用ASA3000 Polaroid Type 57膠片對由二氧環乙烷2c引起的化學發光進行攝影檢測的結果。將含有鹼性磷酸酶，二氧環乙烷，Mg(OAC)2，CTAB，螢光素表面活性劑3的221緩衝液(100ml)在Dynatech ImmulonTM槽中，於37℃保溫1小時，然後在該溫度攝影30分鐘。鹼性磷酸酶的量為A，250渺摩爾;B，23渺摩爾;C，2渺摩爾;和D，無酶(不可見)試劑對照。
圖13示出了在100μl含有CTAB/螢光劑，1.3ngS-抗原和鹼性磷酸酶結合物抗體的221緩衝液中，二氧環乙烷2c的光強度與時間的關係圖。無酶試劑空白的光強度等於時間為0的光強度。
圖14示出了在0至15分鐘內，log(光強度積分值)與log(塗敷在微槽上的S-抗原ng數)的關係圖。
圖15是在221緩衝液(100μl)中，用二氧環乙烷2c，Mg(OAC)2，CTAB，螢光素表面活性劑3對S-抗原進行化學螢光測定。繼發光計實驗後，將7個ImmulonTM槽在37℃保溫30分鐘，然後用ASA 3000 Polaroid Type 57膠片在同一溫度進行15分鐘攝影。從較低的左側向較高的右側S-抗原的量依次為112，56，28，14，7，3.5和1.3ng，在最右側的最後一個槽只含有試劑(不可見)。
圖16是對S-抗原的化學發光測定。用50ng S-抗原塗敷四個槽，與MAbA9-C6單克隆抗原體反應，與抗鼠IgG-鹼性磷酸酶結合物反應，然後在221緩衝液(100μl)中用二氧環乙烷2C，Mg(OAC)2，CTAB，和螢光素表面活性劑3進行測定。將該槽在45℃保溫1小時，然後，在同一溫度用ASA3000 Polardid Type 57膠片進行30秒的攝影。中心的對照槽(不可見)只含有置於CATB/螢光素緩衝液中的二氧環乙烷。
本發明涉及一種發光方法，該方法包括提供一種螢光化合物和與之以狹窄的間距相聯繫的下式所示穩定的1，2-二氧環乙烷化合物;
式中ArOX是具有由X-氧基取代的芳基環，當通過致活劑觸發該化合物，除去X時，它形成不穩定的氧化物中間體1，2-二氧環乙烷化合物，該不穩定的1，2-二氧環乙烷化合物隨後分解，並釋放出電能，而形成光和兩個下式所示的羰基化合物
式中X是化學易變基團，在活性試劑的作用下可以將它除去，進而行成不穩定的氧化物中間體1，2-二氧環乙烷;其中A是鈍性有機基團，它可產生光並可用致活劑分解穩定的1，2-二氧環乙烷，在分解過程中，螢光化合物接受由不穩定氧化物中間體分解時而產生的電子能，並產生光，它的強度比單獨觸發二氧環乙烷時產生的光的強度大。
特別是，本發明涉及一種發光方法，該方法包括提供一種螢光化合物和與之具有狹窄的間距關係的下式所示穩定的1，2-二氧環乙烷;
式中R1和R2一起，以及R3和R4一起連接成以螺旋稠合亞烷基，後者可以含有雜原子(N，S，O或P)，和芳環，在式中R1和R2中或R3和R4中至少有一個是芳基，具有由X-氧基取代的芳環的上式化合物當該取代基由選自酸，鹼，鹽，酶，無機和有機催化劑，電子授體等的致活劑觸發，除去X時，便形成不穩定的氧化物中間體1，2-二氧環乙烷，這樣，不穩定的1，2-二氧環乙烷分解，釋放出電子能，形成光和兩個下式所示的含羰基化合物
式中，未經X-氧基團取代的R1，R2，R3或R4是含碳原子或雜原子的有機基團所述有機基團可為穩定的1，2-二氧環乙烷化合物提供穩定性;式中X是化學易變基團，在致活劑的作用下它被除去，形成不穩定的氧化物中間體;在致活劑的作用下使穩定的1，2-二氧環乙烷分解，在分解過程中螢光化合物接受由不穩定氧化物中間體分解而產生的電子能，並產生光強度大於單獨觸發二氧環乙烷所產生的光。
本發明還涉及觸發時能產生光的組合物，該組合物包括螢光化合物和下式所示的穩定的1，2-二氧環乙烷
式中ArOX代表由X-氧基團取代的芳基，在致活劑的作用下，觸發該化合物除去X，而形成不穩定的氧化物中間體1，2-二氧環乙烷化合物，然後，後者分解，釋放出電子能，形成光和下式所示的兩個含羥基化合物
式中X是化學易變基團，在致活劑的作用下可將該基團除去，形成不穩定的氧化物中間體1，2-二氧環乙烷;式中A是可產生光的鈍性有機基團;在該組合物中，在致活劑作用下，穩定的1，2-二氧環乙烷分解，螢光化合物接受由不穩定氧化物中間體分解而產生的電子能，並產生光強度大於單獨觸發二氧環乙烷所產生的光。
該組合物所採用的優選二氧環乙烷與所述方法相同。
本發明還涉及發光的方法，該方法包括提供一種螢光化合物和與之具有小間距關係的下式所示穩定的二氧環乙烷化合物。
式中R1選自烷基，烷氧基，芳氧基，二烷基，或芳氨基，三烷基或芳基甲矽烷氧基和包括與R2螺旋稠合芳基在內的芳基，其中R2是芳基(可包括R1)並且該R2還可以由X-氧基團取代，後者在致活劑的作用下除去X，形成不穩定的氧化物中間體1，2-二氧環乙烷化合物，所述致活劑選自酸，鹼，鹽，酶，無機和有機催化劑，電子授體;結果不穩定的1，2-二氧環乙烷化合物分解，釋放出電子能，形成光和下式所示兩個含羰基的化合物;
式中X是化學易變基團，經致活劑作用除去X形成不穩定的氧化物中間體;式中R3和R4選自芳基，雜烷基和烷基，R3和R4可以以螺旋稠合多聚環烷基和多聚環芳基的形式連在一起;在致活劑的作用下，穩定的1，2-二氧環乙烷分解，其中螢光化合物接受由不穩定氧化物中間體分解而產生的電子能，並產生光強度大於單獨觸發二氧環乙烷所產生的光。
與激發態二氧環乙烷產物相比，任何在其單一激發態具有較低能量的螢光化合物均可用於提高化學發光效率。最好將長鏈烷烴(最好是8至20個碳原子)連接到螢光劑上，這樣它可起到共表面活性劑的作用，使該物質能結合入所設計的系統中去。螢光劑的實例包括任何螢光染料;芳香化合物(包括萘類，蒽類，芘類，聯苯類);吖啶類;香豆素類;
噸類;酞菁類;芪類;呋喃類;噁唑類;噁二唑類;和苯並咪唑類。最好採用能與所述螢光化合物形成膠束的表面活性劑，這樣可以使1，2-二氧環乙烷貼近螢光化合物。文獻(Chapter 1，page 1至18，「Catalysis·in Micellar and Macromolecular Systems」published by Academic Press，(1975).)介紹了可能的表面活性劑兩性離子類;陽離子類(銨鹽，吡啶鎓鹽，硫鎓鹽);陰離子(硫酸鹽，磺酸鹽，羧酸鹽);中性(聚氧乙烯衍生物，環糊精，長鏈酯，長鏈醯胺);和天然表面活性劑(類脂)。
具體地說，本發明涉及使用穩定的下式所示1，2-二氧環乙烷化合物的方法和組合物
式中，R1選自含1至8個碳原子的低級烷基，R2選自芳基，二芳基，多環芳香基稠合環(R2可以是取代或未取代的)，R3C-選自含有6至30個碳原子的多環烷基，式中OX是一取代在芳環上的氧基，該基團由致活劑激發，除去X，形成不穩定的氧化物中間體1，2-二氧環乙烷化合物，所述致活劑選自酸，鹼，鹽，酶，無機和有機催化劑，電子授體源;X是化學易變基團，在致活劑的作用下可將X除去，形成不穩定的氧化物中間體，其中(Ⅰ)化合物在致活劑存在下分解，產生光和含羰基的下式兩個化合物
本發明還涉及使用式(Ⅱ)所示穩定的1，2-二氧環乙烷化合物的方法和組合物，式(Ⅱ)為
式中ArOX是螺旋稠合的芳基，該基團含有一個環取代的X-氧基團，其中，在致活劑作用下觸發ArOX除去X形成不穩定的氧化物中間體1，2-二氧環乙烷化合物，所述致活劑選自酸，鹼，鹽，酶，無機和有機催化劑，電子授體;X是化學易變基團，在致活劑的作用下可將X除，形成不穩定的氧化物中間體1，2-二氧環乙烷，這樣不穩定的1，2-二氧環乙烷化合物分解，形成光和兩個下式所示的含羰基衍生物R3C＝O和-OArC＝O其中，R3C-選自含有6至30個碳原子的多環烷基。在該結構中，R1和R2是連在一起的。
就下式所示結構而言
(1)當R1不與R2結合時，該基團最好是烷基，烷氧基，二烷基或芳氨基，三烷基或芳基甲矽氧烷基。所述烷基最好含有1至8個碳原子。R1也可以是含有6至14個碳原子的脂肪環或芳香基，其中包括稠合芳環化合物。當R1與R2結合時，它們提供了含有6至30個碳原子的芳基。
(2)R2是由X-氧(OX)基團取代的芳基，該芳基可以是苯基，聯苯基，稠合苯基或其他芳基;R2可以含有6至30個碳原子，並且也可以包括其他取代基。X是在致活劑作用下可以被除去的任何易變基團，例如，-OX基團可以選自羥基，烷基或芳基羧基酯，無機含氧酸鹽，特別是磷酸鹽和硫酸鹽，烷基或芳基甲矽烷氧基和氧吡喃糖苷基團。
(3)R3和R4可以與R1相同。在下列實施例中，R3和R4結合在一起形成多環亞烷基(為了便於合成和比較尤為如此);但是可以使用任何有機基團。該多環亞烷基最好含有6至30個碳原子。
即使穩定的1，2-二氧環乙烷化合物可被致活劑觸發，但它們在室溫(20-35℃)下具有相當長的半衰期。所有的先有技術化合物要麼在室溫下不穩定，要麼其熱分解溫度高達50℃或更高，因此，對大多數應用目的而言，它們是不適用的。
所述致活劑可以是化學致活劑或酶致活劑。在某些情況下，需要(F-)1當量，而在其他情況(酶促)下，僅需要極少量即可。在有關該題目的任何標準化學論著中都介紹了這類致活劑，其中包括酸，鹼，鹽，酶和其他無機及有機催化劑。所採用的試劑取決於被致活的穩定1，2-二氧環乙烷所處的條件及具體的1，2-二氧環乙烷上X基團的易變程度。可採用電子授體除去X，這些電子授體包括還原劑及其他電子源。
1，2-二氧環乙烷分解，形成兩個含羰基的化合物和光。不穩定1，2-二氧環乙烷中間體的結構式為
一般，通過氧加成於適宜的鏈烯形成-ArOX取代的1，2-二氧環乙烷。通過烷基和/或芳基取代的下式所示含羰基化合物合成這些鏈烯化合物
在極性有機溶劑(尤其是四氫呋喃)中，在氫化鋁鋰或其他金屬氫化物存在下，上述物質與過渡態滷代金屬鹽(尤其是氯化鈦)和叔胺鹼反應。該反應一般在回流的四氫呋喃中進行，一般在約4至24小時內完成該反應。
穩定的1，2-二氧環乙烷的製備及化學觸發已發現通過化學和酶促方法可以觸發熱穩定的二氧環乙烷，進而產生所要求的化學發光作用(A.P.Schaap，專利申請序號.887，139 7月17日提交，A.P.Schaap，R.S.Handley，and B.P.Giri，Tetrahedron Lett.，935(1987);A.P.Schaap，T.S.Chen，R.S.Handley，R.DeSilva，and B.P.Giri，Tetrahedron Lett.，1155(1987);and A.P.Schaap，M.D.Sandison，and R.S.Handley，Tetrahedron Lett.，1159(1987))。為此，推出了具有下述幾個關鍵特徵的用於生產二氧環乙烷的新合成方法(1)利用螺旋稠合金剛烷基的穩定效應制得了在環境溫度下「存放壽命」達數年的二氧環乙烷;(2)將某一殘基摻入該結構，使該羰基裂解產物具有直接化學發光作用;(3)得到了觸發穩定的二氧環乙烷分解導致其化學發光的新方法。
在THF中，採用三氯化鈦/LAH，使2-金剛烷酮與芳香酯或酮反應，製得了所需要的鏈烯(A.P.Schaap，1986年7月17日提交的專利申請書，序號為887，139)。該申請是採用McMurry法，由酮和酯進行分子間縮合形成乙烯基酯的首篇報導。儘管McMurry早就研究過酮和酯官能團的分子反應，但他僅用該方法製得了環酮，而未製得乙烯酯(J.E.McMurry and D.D.Miller，J.Amer.Chem.Soc.，105，1660(1983))。
使這些乙烯酯光氧化，得到易於操作的二氧環乙烷，這些化合物具有理想的熱穩定性。例如，下文所示的二氧環乙烷的活化能為28.4Kcal/mol，25℃半衰期是3.8年。該二氧環乙烷存於鄰二甲苯中的樣品在實驗臺上放置了幾個月，但仍未檢測到其分解。
在室溫下，通過用氟離子除去甲矽烷保護基，可以方便地觸發該二氧環乙烷化學發光分解。產生不穩定的芳基氧化物，後者裂解產生很強的蘭光。芳基氧化物取代的二氧環乙烷的半衰期在25℃時是5秒鐘。在DMSO中，其化學發光光譜在470nm處呈現最大吸收，該最大吸收值相同於在這些條件下，酯裂解產物(3-羥基苯甲酸甲酯)的陰離子螢光及消耗二氧環乙烷溶劑的螢光。顯然沒有來自金剛烷酮螢光的化學發光作用產生。相對於魯米諾標準測定的該氟觸發分解的化學發光量子產額為0.25(或化學發光效率為25%)。在這些條件下，校正酯的螢光量子產額(φF＝0.44)，得到形成單一激發態酯的效率為57%，這是迄今報導的在實驗室製得的二氧環乙烷的最高單一態化學激發效率。
酶促觸發1，2-二氧環乙烷。
生物測定(例如，涉及酶的免疫測定及核酸探針)廣泛地利用各種底物，這些底物通過與酶反應，要麼生色，要麼產生螢光。序列號為887，139的申請書介紹了第一個可以起到化學發光酶底物作用的二氧環乙烷(A.P.Schaap，1986年7月17日提交;A.P.Schaap，R.S.Handley，and B.P.Giri，Tetrahedron Lett.，935(1987);A.P.Schaap，T.S.Chen，R.S.Handley，R.Desilva，and B.P.Giri，Tetrahedron Lett.，1155(1987);Tetrahedron Lett.，1159(1987))。在生物系統中採用這些過氧化物要求在酶促反應溫度下表現熱穩定的，並且在含水緩衝液中不會很快出現自發分解反應的二氧環乙烷。在前一段落中介紹的螺旋稠合金剛烷基二氧環乙烷滿足了這些要求。已製備了帶有官能團的1，2-二氧環乙烷，該化合物經酶促修飾可產生芳基氧化物的形成。這一不穩定中間體分解可產生螢光。已合成的1，2-二氧環乙烷可被各種酶觸發，這些酶包括芳基酯酶，乙醯膽鹼酯酶，鹼性磷酸酶。鑑於磷酸酶十分廣泛地用於酶結合的免疫測定和核酸探針中，因此該酶具有十分重要的意義。
例如，採用由3-羥基-9H-呫噸-9-酮和2-金剛烷酮製得的磷酸取代1，2-二氧環乙烷，可以觀察到鹼性磷酸酶引起的酶促觸發作用。該二氧環乙烷是熱穩定的，活化能為30.7Kcal/mol，25℃時半衰期為12年。該二氧環乙烷不僅在有機溶劑中穩定，而在水性緩衝液中也僅呈現很慢的自發分解作用。
採用取自牛腸黏膜的鹼性磷酸酶[每毫升3.2M硫酸銨溶液含5.3mg蛋白(1100單位/mg蛋白)的混懸液]和在0.75M2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩衝液中的磷酸酯保護的二氧環乙烷，PH 10.3進行觸發實驗。將50μl等份(0.013umol)的磷酸酯-二氧環乙烷原液加到3ml 37℃的緩衝液中，由此得到最終濃度為4.2×10-6M的二氧環乙烷溶液。將1μl(最終蛋白濃度＝1.8ug/ml)鹼性磷酸酶注入上述溶液，即可導致突然發光，該發光作用經歷3分鐘後衰退。在這一期間，來自緩衝液中二氧環乙烷緩慢的無酶促水解的對照螢光僅為酶促方法所產生螢光的0.2%。總體光發射與二氧環乙烷濃度呈線性關係。發射衰退率是酶濃度的函數，而由於酶的反轉，總體光發射與酶濃度無關。在緩衝液中，於室溫下，得到了磷酸酶催化分解的化學發光光譜。將這一化學發光光譜與在緩衝液中消耗的反應混合物的螢光光譜及羥基呫噸酮裂解產物的螢光光譜作一比較表明由於酶促二氧環乙烷中磷酸酯基裂解，進而產生不穩定的二氧環乙烷芳基氧化物，後者產生羥基呫噸酮的單一激發態陰離子，由此引起光發射。
1，2-二氧環乙烷化合物和螢光表面活性劑的合成
(a)X＝H(b)X＝Ac(c)X＝PO3Na2儀器除另有說明外，核磁共振(NMR)譜由Nicolet NT300TM型或General Electric QE300TM型攝譜儀測得，以CDCl3作溶劑，用四甲基矽甲烷作內標物。紅外線(IR)光譜由NicoletTM或Beckman Acculab8TM攝譜儀測得。質譜由KratosTM或AEI MS-90TM質譜儀測得。由Varian Cary 219TM分光光度計測得紫外光譜和可見光吸收光譜。由Spex FluorologTM螢光分光光度計記錄螢光光譜。採用Spex螢光計測得化學發光光譜。由本實驗室製做的照度計測得化學發光作用的動力學及量子產額數據。將採用RCA A-31034A砷化鎵光電倍增管(冷至-78℃)的儀器和Ortec光子計數電子儀聯接於Apple ⅡeTM和MacintoshTM計算機。使用Midwest Microlabs，Indianapolis進行元素分析。用Thomas HooverTM毛細管熔點測定儀(未經校正)測定熔點。用Cahn 4700/TM型電子天枰精確稱重。
材料.
所用的鄰二甲苯來自Burdick and Jackson實驗室，並符合動力學測定及光譜測定的使用要求。經過用氫化鈣進行真空蒸溜，得到無水DMF和DMSO。由Aldrich化學公司購得重水，1，4-二噁烷-d8，氯仿-d，螢光素胺(異構體1)和其他化學試劑。由Sigma化學公司購得鹼性磷酸酶樣品。從各種市場渠道購得氧化矽，氧化鋁和其他固體載體，並且不用進一步純化直接使用。
鏈烯類的合成.金剛烷(1a)給500ml的燒瓶裝上回流冷凝器，125ml的加料漏鬥和通氮管。採用熱空氣槍和吹氮法使該裝置乾燥。加入40ml無水THF，並在冰浴中冷卻該燒瓶。迅速地加入TiCl3(1.5g，10mmol)，然後在攪拌下分次加入LAH(0.19g，5mmol)。除去冷卻浴，使該黑色混合物溫熱至室溫。將三乙胺(0.7ml，5mmol)加到該攪拌混懸液中，並回流15分鐘，此後，在15分鐘內向該回流混合物滴加3-羥基苯甲酸甲酯(152mg，1mmol)和2-金剛烷酮(300mg，2mmol)的20ml無水THF溶液。在反應混合物冷卻至室溫後再繼續回流15分鐘，並用100ml蒸溜水稀釋。用3×50ml份的乙酸乙酯提取上述水溶液。合併有機層，用水洗滌，用MgSO4乾燥，濃縮，經矽膠層析，用15%乙酸乙酯/己烷洗脫，得到240mg(87%)1a，為白色固體，m.p.133-4℃。1H NMR(CDCL3)δ1.64-1.96(M，12H)，2.65(S，1H)，3.24(S，1H)，3.32(S，3H)，5.25(S，1H，OH用D2O交換)，6.70-7.30(M，4H)，13C NMR(CDCL3)δ28.45，30.36，32.36，37.30，39.10，39.33，57.82，114.60，116.16，122.19，129.24，137.24，155.62;MS m/e(rel intensity)271(20，M+1)，270(100，M)，253(7.3)，213(35.1)，121(41.7)，93(9.4);精確分子量計算值270.1619，測定值270.1616. 金鋼烷(1b)在通氮下，將羥基鏈烯la(0.75g，2.8mmol)溶於10ml CH2Cl2和吡啶(5.2g，65.8mmol).將該溶液在水中冷卻，然後用注射器滴加乙醯氯(2.6g，33mmol)的1ml CH2Cl2溶液，在0℃5分鐘後經矽膠TLC(用20%乙酸乙酯/己烷作展開劑)表明la完全被乙醯化，除去溶劑後，用30ml醚洗滌固體殘留物，用水(3X25ml)洗滌醚液，用M9SO4乾燥，並蒸發至幹.所得產物經矽膠層析，用20%乙酸乙酯/己烷洗脫，得到0.45g油狀的1b 1H NMR(CDCl3)δ1.79-1.96(m，12H)，2.27(s，3H)，2.66(s，1H)，3.26(s，1H)，3.29(s，3H)，6.99-7.36(m，4H);13C NMR(CDCl3)δ20.90，28.13，30.07，31.99，36.99，38.99，39.01，57.59，120.34，122.14，126.55，128.66，132.19，136.90，142.59，150.42，169.04;MS m/e(rel intensity)312(100，M)，270(25)，255(19.3)，213(20.7)，163(12.2)，121(30.7)，43(30)，IR(neat)3006，2925，2856，1725，1600，1438，1362，1218，1100cm-1;元素分析按C29H24O3計算值C，76.92;H，7.69，測定值C，76.96;H，7.85. 金剛烷二鈉鹽(1C).
將羥基烯1a(500mg，1.58mmol)溶解在5ml無水吡啶(用鹼性氧化鋁乾燥)中，將該溶液慢慢加到由三氯氧磷(1ml，10.7mmol)和5ml吡啶組成的冷卻混合物，其加料速度應將反應溫度維持在5℃下，三十分鐘後，終止反應，並將二氯磷醯化產物倒在由20g冰和1ml 10N氫氧化鈉組成的混合物上。將該混合物移至分液漏鬥中，用5X30ml CH2Cl2進行洗滌。在冰箱內過夜冷卻後，從水溶液中沉澱出產物，其固體產物先用二氯甲烷洗滌三次每次用10ml，再用冷水洗滌三次每次用10ml，然後將該白色固體在減壓下乾燥，得到400mg(1.02mmol 64%)磷醯化烯1c1H NMR(D2O/P-二噁烷-d8)δ1.67-1.83(m，12H)，2.50(s，1H)，3.04(s，1H)，3.19(s，3H)，6.7-7.2(m，4H);13C NMR(D2)δ 28.29，30.44，32.45，36.99，38.89，57.98，120.16，120.85，123.74，128.89，133.15，136.11，142.68，154.45;31p NMR(D2O/P-二噁烷-d8)δ1.586.
螢光素表面活性劑的合成5-(N-十四烷醯基氨基)螢光素(3)於室溫，攪拌下，將肉豆蔻醯氯(2.18g，8.83mmol)的THF溶液滴加到螢光素胺-異構體1(Aldrich化學公司出品)(3.07g，8.85mmol)的無水吡啶(經鹼性氧化鋁乾燥)溶液中，滴加時間是12小時.矽膠薄板層析(20%MeOH/苯作展開劑)表明轉化為極性較低的產物，將該反應物倒入冰水中，過濾分離固體沉澱，得到4g橙色固體，經柱層析(用10%MeOH/苯洗脫)得到500mg純淨的產物，為橙色固體;mp.185-190℃，1H NMR(CDCl3)δ0.88(t，3H)，1.27(m，20H)，1.74(m，2H)，2.42(t，2H)，6.54-8.32(m，9H);13C NMR(CDCl3)δ13.05，22.27，25.34，28.90，29.01，29.17，29.31，31.61，36.65，101.00，110.25，112.43，114.93，124.41，126.58，127.86，128.77，140.41，147.00，152.89，160.28，169.96，173.65;MS(FAB)m/e(rel intensity)558(10，M+1)，402(14.7)，388(14.2)，374(12.5)，348(28.1)，302(35，2)，213(36.4)，165(36.4)，133(50).
3的性質與Melecular Probes，Inc.出品的市售產品所介紹的性質相符.
1-十六烷醯基-6-羥基-2-苯並噻唑醯氨(4)的合成.
將6-羥基-2-苯並噻唑羧酸甲酯(60mg，0.30mmol)[見F.McCapra and Z.Razani，Chem.Commun.，153(1976)]和1-十六烷胺(430mg，1.8mmol)溶於甲醇中，將該溶液回流兩天後，薄層層析(用40%乙酸乙酯/己烷作展開劑)顯示苯並噻唑羧酸酯轉化為較小極性的物質，蒸除甲醇，殘留物經層析(2%乙酸乙酯/己烷洗脫)純化，以除去過量的1-十六烷胺.然後再進行層析，用50%乙酸乙酯/己烷洗脫，得到白色固體狀的433mg(27%);mp.82-4℃;
1H NMR(丙酮-d6)δ0.83(t，3H)，1.32(br.26H)，1.66(m，2H)，3.43(t，2H)，7.10-7.88(m，3H)，8.15(br，1H，OH用D2O交換;13C NMR(苯-d6)δ14.29，23.05，27.08，29.58，29.66，29.75，29.86，30.13，32.28，39.98，(丙酮-d6)δ107.51，117.69，125.61，139.33，147.80，157.63，160.48，162.12，MS(m/e(rel.intensity)418(M+，33.7)，360(14.1)，240(61.1)，178(77.3)，151(39.1)，97(28.6)，83(34.7);Exact masscalcd.418.2653，found 418.2659 for C24H38N2O2S.
1，2-二氧環乙烷的製備，光氧化方法.
一般將5-10mg鏈烯樣品溶解在置於光氧化管中的5ml二氯甲烷中，加入約40mg聚苯乙烯鍵合的Rose Bengal(sensitox I)[此類敏化劑參見A.P.Schaap，A.L.Thayer，E.C.Blossey and D.C.Neckers，J.Amer.Chem.Soc.，97，3741(1975)]，並與氧氣噴嘴連接，緩慢地向該溶液中通入5分鐘氧氣，並將該裝置浸漬在含乾冰/2-丙醇的半鍍銀Dewar燒瓶中.在連續通入氧氣泡的同時，用250瓦或1000瓦鈉燈(General Electric Lucalox)及紫外濾光片照射該樣品，用TLC監測反應進程.一般可檢測到高度穩定二氧環乙烷的點，其Rf值稍低於鏈烯.在室溫下過濾金鋼烷取代的二氧環乙烷，用旋轉蒸發器蒸發，並用適宜的溶劑重結晶.
4-(3-羥基苯基)-4-甲氧基螺[1，2-二氧環乙烷-3，2′-金鋼烷](2a)在Sensitox I存在下，·於-78℃，在8ml二氧甲烷中，用1000瓦的鈉燈照射羥基鏈烯1a(100mg).鏈烯和二氧環乙烷在TLC(用20%乙酸乙酯/己烷作展開劑)中呈現相同的Rf值.因此，在出現痕量的裂解產物時即停止反應.過濾除去光敏劑，並將溶劑蒸發.採用1HNMR來檢測已被氧化的所有起始原料.用戊烷/苯將二氧環乙烷2a重結晶，得到一白色固體MP135℃1H NMR(CDCl3)δ1.04-2.10(m，12H)，2.21(s，1H)，3.04(s，1H)，3.24(s，3H);6.48(s，1H，OH用D2O交換)，6.93-7.30(m，4H).13C NMR(CDCl3)δ25.81，25.95，31.47，31.57，32.27，32.86，33.07，34.58，36.30，29.83，95.88，112.08，116.46，129.34，136.11，156.21.
4-(3-乙醯氧基苯基)-4-甲氧基螺[1，2-二氧環乙烷-3，2′-金鋼烷](2b)採用1000瓦的高壓鈉燈和400mg Sensitox I，在30ml CH2Cl2中，於-78C，使鏈烯1b(140mg，0.45mmol)光氧化.在矽膠上進行TLC分析(用20%乙酸乙酯/己烷作展開劑)表明在2.5小時內，轉化為極性更強的物質.過濾，並除去溶劑，得到油狀的2b1H NMR(CDCl3)δ 0.90-1.90(m，12H)，2.15(s，1H)，2.31(s，3H)，3.30(s，1H);3.32(s，3H)，6.61-7.45(m，4H)，13CNMR(CDCl3)δ 21.00，25.82，25.97，31.50，31.65，32.21，32.80，33.09，34.71，36.32，49.92，95.34，111.50，122.58，129.16，136.42，150.72，169.11.
4-甲氧基-4-(3-磷酸醯苯基)螺[1，2-二氧環乙烷-3，2′-金鋼烷]，二鈉鹽(2c)採用1000瓦的高壓鈉燈和Sensitox I，在2ml D2O/對-二噁烷-d8(11V/V)中，於10C，將鏈烯1c(50mg)光氧化.1H′NMR分析表明在45分鐘內明顯地轉化為二氧環乙烷2c.濾除光敏劑，將濾液作為原液用於化學發光試驗.1H NMR(D2O/對-二噁烷-d8δ0.91-1.70(m，12H)，2.08(s，1H)，2.80(s，1H)，3.07(s，3H)，7.00-7.26(m，4H);13C NMR(D2O/對-二噁烷-d8)δ28.95，30.95，32.98，37.65，39.53，58.31，120.62，121.64，123.55，129.31，132.45，136.57，143.98，155.30.
化學發光動力學方法.
由通氣溶液的化學發光作用的衰變來監測穩定二氧環乙烷的熱分解速率.給裝有磁力攪拌棒的Pyrex小瓶裝入3-4ml反應溶劑，用Teflon-線螺旋帽將該瓶封住，並將它置於測量化學發光照度計的恆溫樣品槽中.通過外循環水浴控制溫度，選擇合適的測定器放大值及光狹縫大小值。在達到熱平衡(約，3分鐘)時，加入等份的二氧環乙烷原液，其加入量應足以達到最終濃度(不超過10-4M)，加入方法是通過打開照度計頂部用移液管加入，或者用注射器通過直接蓋在上述小瓶上的避光用橡膠隔膜加入，用Teflon線螺旋帽將小瓶封死，以避免在採用高溫時出現蒸發.打開開關開始測量信號，一般至少要記錄化學發光衰變的3個半衰期.通過採用處理標準方差的電腦程式，由In(強度)對時間計算一級速率常數(K).相關係數(r)一般至少為0.999，在各重複樣品之間K的變化應小於5%.
由InK對1/T(Arrhenius方程)或Ink/t對l/T(Eyring方程)作圖，通過標準方差線性回歸分析計算二氧環乙烷分解作用的活化參數.測定在80-120℃之間的5至10個溫度下的重複試驗結果表明是一條直線，其相關係數為0.99或更好，例如，圖1表示磷酸醯取代二氧環乙烷2c在鄰二甲苯中熱分解的Arrhenius圖，Ea＝32.5kcol/mol，r＝0.999.由Arrhenius方程計算得到2c在25℃的半衰期為19年.二氧環乙烷在二甲苯中熱分解作用的活化能.
二氧環乙烷 (X) Ea Log A K(sec-1) at 25℃ t1/2at 25℃2a (OH) 28.3 12.5 5.38×10-94.1 yrs2b (OAC) 30.4 13.6 1.73×10-913 yrs2c (PO3Na2) 32.5 14.9 1.19×10-919 yrs上述結果表明在用適宜的化學試劑或酶觸發之前，這些類型的二氧環乙烷呈現出極高的穩定性(很長的半衰期).
化學發光量子產額的測定二氧環乙烷分解作用的化學發光量子產額(φCL)的定義是所發射的化學發光愛因斯坦與二氧環乙烷分解的摩爾數之比，在反應期間，由反應焓(△HR)加上Arrhenius活化能(Ea)所釋放出的能量，足以提供羰基裂解產物呈單一的激發態.因此，量子產額最大值是1.0.另一有意義的參數是化學激發量子產額(φCE)，其定義為所形成的激發態與所分解的二氧環乙烷之比.根據公式φCL＝φCEXφF，通過二氧環乙烷裂解的螢光量子產額(φF)，使化學激發量子產額(φCE)與化學發光量子產額相聯繫。
將與測定衰變動力學相同的方法通過下列修正。應用於測定化學發光量子產額。將精確等份的已知濃度二氧環乙烷原液加到3ml預先恆溫的有機溶劑或水性緩衝液中.然後加入適宜的化學試劑或酶以觸發該反應。採用冷卻至-78℃的RCA A-31034 A砷化鎵PMT的光子計數照度計收集總光強度.根據魯米諾與鹼在通氣DMSO中化學發光反應的已知精確量子產額，參照其標準係數，將光強度WS轉化為光子數。經測定魯米諾反應的化學發光量子產額為0.011(1.1%)(J.Lee and H.H.Seliger，photochem.photobiol.，15，227(1972);P.R.Michacl and L.R.Faulkner，Anal.Chem.，48.1188(1976))。
探測化學發光光譜.
採用Spex Fluorolog螢光光度計，在室溫下，使反應在樣品槽的1-cm2石英透明小容器中進行，由此測得由化學或酶觸發的二氧環乙烷的化學發光光譜.在波長掃描期間校正化學發光強度的衰變，是以比例的模式累積光譜來完成的，因此通過來自輔助檢測器(EMI 9781B)的信號將所觀察到的光譜分開，該輔助檢測器測定以時間為函數的總信號，該單色器譜帶通道一般為18nm，就弱發射樣品而言，要進行幾次相同掃描，併疊加在一起藉以改善信噪比。
二氧環乙烷的化學觸發.
1.用鹼觸發羥基取代的二氧環乙烷2a的化學發光。
在室溫下，用過量的四正丁基銨氫氧化物處理溶於DMSO中的10-4的二氧環乙烷2a溶液，由此導致深蘭色的化學發光，該發光作用經數分鐘衰變，該化學發光的發射最大值是470nm.裂解產物(3-羥基苯甲酸甲酯，MHB)陽離子的螢光相同於上述化學發光光譜.這些結果表明所述化學發光過程包括(a)鹼觸發得到不穩定芳基氧化物形式的二氧環乙烷，(b)然後該物質裂解產生單一激發態的MHB，(c)MHB發光，得到總量子產額(φCl)為0.25的螢光.
2.在水性膠束中催化乙醯氧基-取代的二氧環乙烷2a的鹼觸發化學發光通過分子間能量轉移增強化學發光效率。
可將陽離子表面活性劑，[如十六烷基三甲基銨溴化物(CTAB)]用於提高適宜地取代的二氧環乙烷在水溶液中化學發光的化學觸發速率.例如，CTAB催化乙醯氧取代的二氧環乙烷2b的鹼誘發螢光裂解.二氧環乙烷在表面活性劑形成的膠束中是可溶的，加入氫氧化鈉即可引起化學發光.陽離子首基與氫氧根陰離子的靜電吸引作用產生明顯的膠束催化作用.一般實驗所採用的濃度為[2b]＝9.1X 10-5M，[CTAB]＝2X 10-3M，和[OH]＝9.1×10-5M，溫度為37℃.
膠束環境可以導致更高的化學發光效率.
儘管2a和2b與鹼在DMSO中作用，光產量相當高，可達0.25，但這些二氧環乙烷在水中的光產量僅為8.9×10-6.造成其大幅度降低的根本原因是該裂解產物(MHB)在水只有很弱的發光作用.但是，正如下述實驗所證實，通過在膠束中觸發二氧環乙烷，可以提高其螢光產量.除CTAB的濃度在0至5×10-3M範圍內變化外，鹼觸發2b的條件與前述條件相同.圖2說明，當高於CTAB的臨界膠束濃度(cmc≌1×10-3M)時，化學發光量子產額(φCL＝1.7×10-4)提高19倍.在膠束環境中增加化學發光效率的原因在於φF和/或φCE增加.
在共表面活性劑膠束中摻入螢光首基，無論是對化學觸發二氧環乙烷還是對酶促觸發二氧環乙烷，均可大幅度提高化學發光產量.由於(如圖2a所示)在膠束中將可觸發二氧環乙烷和能量受體(螢光劑)緊密地束縛在一起，從激發態裂解產物到螢光表面活性劑之間的能量轉移是十分有效的.
例如，在水溶液中按下列最終濃度製得了含螢光素表面活性劑3和二氧環乙烷2b的CTAB膠束體CTAB(1.5×10-3M)，3(9×10-5M)和2b(9×10-5M).在37℃加入鹼即可產生很強的黃色光(化學發光)而不是發射一般的蘭光，其化學發光效率是1.4%(φCL＝0.014)，比2b在不加CTAB和3時所產生的螢光強500倍.
用苯並噻唑醯胺表面活性劑4進行了同樣的試驗.化學發光效率是0.3%，λMaN是506nm.
酶促觸發生磷酸醯取代二氧環乙烷2c.
1.用人體血清鹼性磷酸酶觸發2c的化學發光.
通過將1c在二噁烷/水(V/V 11)中進行光氧化製得二氧環乙烷2c的原液.從健康供體中採集新鮮血樣，離心除去紅血細胞，得到實驗用血清.將3ml濃度為10-5M的2c溶液[溶劑是0.75M的2-氨基-2-甲基-1-丙醇(221)緩衝液(PH10.3)]在37℃用100μl血清處理，得到了圖3所示典型的強度對時間的關係圖，圖3中在時間為零時注入血清，在這些條件下，光強度達到接近2.3×104計數/秒的恆定水平.2c在無酶促水解時所產生的對照螢光信號還不到酶促產生的值的0.05%，採用100至1μl血清進行一系列實驗表明(圖4)在平穩狀態的光強度與酶濃度直接成正比，也可以方便地採用在任何其它時間位點的光強度以提供直接測量酶濃度(圖5)。
2.用來自牛小腸粘液的鹼性磷酸酶觸發2c化學發光.
牛小腸粘液鹼性磷酸酶由Sigma Chemical Co.得到，為每毫升3.2M(NH4)2SO4溶液含5.1mg蛋白質的混懸液，在標準的實驗中，將50μl濃度為2.56×10-3M二氧環乙烷2c原液的221緩衝液加到含8.0×10-4M Mg(OAc)2的221緩衝液(0.75M，PH9.1)中，使二氧環乙烷的最終濃度達4.3×10-5M.在37℃將10μl等分的稀釋酶注入該溶液，產生化學發光，其量子產額為3.1×10-5.正如化學觸發那樣，加入CTAB(1.13×10-3M)，使φCL中度增加至2.1×10-4.加入表面活性劑後酶促觸發動力無明顯改變.
3.用鹼性磷酸酶觸發2c的化學發光在水性膠束中通過分子間能量轉移提高化學發光效率.
在膠束中摻入螢光素共表面活性劑3可以戲劇性地提高酶觸發光的效率，在37℃用3ml含有下列物質的溶液進行鹼性磷酸酶與二氧環乙烷2c反應的試驗2c(4.3×10-5M)，221緩衝液(0.75M，PH0.91)，Mg(OAc)2(8.0×10-4M)，CTAB(1.13×10-3M)，螢光素表面活性劑3(5.6×10-5M).加入鹼性磷酸酶(Sigma，牛小腸粘液)使蛋白最終濃度達12pg/ml，由此產生長達45分鐘的化學發光.將整個發光過程的光強度積分，得到φC1＝0.015(1.5%化學發光效率，與不加CTAB和3的酶促反應相比，增加了500倍).另外與化學觸發2b相比，該化學發光光譜從正常發射蘭光(圖6，曲線A)位移至典型的螢光素髮射光譜(圖6，曲線B)，由此證明涉及能量轉移過程。應該強調的是通過螢光劑3的蘭色光的簡單再吸收和隨後的螢光，不可能是正如在不能引致增強效率的過程中那樣的光譜遷移的機理。
為了檢驗該化學發光方法對評價溶液中鹼性磷酸酶濃度的敏感性，採用將購自Sigma的樣品稀釋製得的酶原液進行了一系列實驗.根據對樣品中酶濃度的保守估計，假設每ml樣品中的5.1mg蛋白是100%純的鹼性磷酸酯酶.將分子量140，000也用於計算酶的摩爾量。反應條件如上所述採用2c，CTAB，螢光劑3的那樣，所不同的是在3ml溶液中最終酶的量分別是A=3.6×10-12摩爾 D=2.7×10-15摩爾B=3.3×10-13摩爾 E=2.5×10-16摩爾C=3.0×10-14摩爾 F=2.3×10-17摩爾在上述條件下，2c在緩衝液/共膠束環境無酶促水解而產生的對照化學發光相當慢，由此而產生的恆定信號僅為幾個計數/秒(圖7)，圖7示出了用3ml中磷酸酶濃度為2.7×10-15M的酶進行酶促觸發時一般的強度對時間的關係圖(實驗D).在30-60分鐘內，隨著濃度增加光強度增加，此後光強度保持恆定，直到消耗完二氧環乙烷為止.如果在用照度計分析儀前，將含有二氧環乙烷和酶的樣品在37℃-45℃保溫數分鐘，可以省去預穩定時間.
無論是總體光強度還是在某一特定時間的強度與酶量的關係圖均有很好的相關性.例如，圖8示出了log(從零時至3分鐘總體酶促螢光)與log(鹼性磷酸酶摩爾數)的關係圖.每一過程的重複性好於4%，如圖8所示.相關係數＞0.99.
如上所述的酶促觸發實驗也可在購自Dynatech，Inc，由透明聚苯乙烯製得的ImmumlonTM微滴槽中進行.單獨使用該槽，並將其置於可恆溫加熱的避光容器中.採用光導纖維技術使槽底與如前所述的光子計數照度計相連，由此檢測化學發光.這一實驗裝置可採用十分小的反應體積.例如，所進行的一系列實驗中，在200μL221緩衝液中，二氧環乙烷2c，CTAB和3與鹼性磷酸酶反應的量僅為5X10-15至2X10-18摩爾(或2渺摩爾).圖9示出了用2.3X10-17摩爾酶進實驗的光強度對時間的關係圖.對酶樣品純度更實際的估計應為10%.在這些條件下，從圖10中可以看出採用二氧環乙烷2c的這一化學發光技術能夠檢測到濃度低於0.2渺摩爾的鹼性磷酸酶.
採用X-線膠片及瞬時膠片(instant film)攝影也可以檢測由酶促觸發2c產生的化學發光.例如，圖11和12示出了在ASA300 PolaroidTMType 57膠片上記錄的化學發光.將含有二氧環乙烷2c(4.3×10-5M)，Mg(OAc)2(8.0×10-4M)，CTAB(1.13×10-3M)，螢光素表面活性劑3(5.6×10-5M)的221緩衝液(100μl，0.75M，PH9.1)，採用前述相同的酶原液，在不同量鹼性磷酸酶存在下，於Dynatech Immalon槽中保溫，在37℃將該槽保溫一小時，然後將該槽直接置於避光保溫器中的膠片上，在同一溫度攝影15分鐘.記錄在膠片上的光強度顯然可用於測量酶濃度.
4.化學發光酶結合的測定酶促觸發適宜取代的二氧環乙烷為酶結合的生物測定提供了超敏感的檢測方法，例如，用鹼性磷酸酶作為測定標記物的酶結合的免疫測定及DNA探針可以採用磷酸醯取代二氧環乙烷2c.前述檢測方法是利用與該酶反應產生顏色或發螢光的底物.對於視網膜蛋白，S-抗原的酶結合的免疫吸附劑測定(ELISA)說明了採用二氧環乙烷2c的化學發光技術的敏感性.採用L.A.Donoso的方法(L.A.Donoso，C.F.Merryman，K.E.Egelberg，R.Naids，and C.Kalsow，Investigation Ophthalmology Visual Science，26，561(1985))，用不同量的S-抗原(112，56，28，14，7，3，1.3ng)塗敷7支一組的ImmulonTM槽，並使之與鼠體生長的單克隆抗體(MA6A9-C6)反應，最後與抗-鼠IgG偶合的鹼性磷酸酶反應.然後在每個槽中加入100μl含有Mg(OAc)2(8.0×10-4M)，CTAB(1.13×10-3M)，螢光素表面活性劑3(5.6×10-5M)的221緩衝液(0.75M，PH9.1)，進行化學發光測定，將該槽置於微量照度計中，並在3分鐘內平衡至37℃，注入10μl於221緩衝液的二氧環乙烷2c原液，使2c的最終濃度達1.36×10-4M.圖13示出了典型的化學發光強度與時間的關係圖.試劑的對照螢光很低並且恆定在15-20計數/秒(圖13).如圖14所示，整體光強度與塗敷在槽上的抗原量相關.在用照度計實驗之後，將含有相同溶液的槽進行攝影檢測實驗(圖15)，將7個槽置於一容器中，並在37℃保溫30分鐘，然後在一避光保溫器中，用ASA300 PolaroidTMType 57膠片在相同溫度下攝影15分鐘.如圖15所示，記錄在膠片上的光強度也與塗敷在槽上的S-半抗原的量相關.圖16說明了該攝影測定的可重複性.用上述緩衝液和二氧環乙烷處理50ng抗原塗敷的4個槽，在45℃保溫1小時，然後在同一溫度用膠片攝影30秒.應該注意到在兩種攝影測定中，只含有緩衝液和二氧環乙烷的對照槽是看不到的，另外還說明由非酶促水解二氧環乙烷所產生的對照相當低.
5.在發光膠束存在下，用脲酶對羥基取代的二氧環乙烷2a進行酶促觸發採用160mgCTAB和12.4mg螢光素表面活性劑3在200mg蒸餾水中製成一溶液.將200mg脲素溶解在100ml蒸餾水中，並加入EDTA使最終濃度達0.4mM，由此製得一脲素溶液，將10ml各原液混合得到用於脲酶實驗的底物溶液.
將脲酶(Sigma)在室溫下保溫0.5至2小時以進行實驗，然後注入10μl 3×10-3M二氧環乙烷2a，用照度計和瞬時膠片監測所產生的化學發光，根據該螢光強度即可測定脲酶的濃度.
在優選方法和組合物中，二氧環乙烷的用量在約10-2至10-6M之間;表面活性劑用量大於約10-4M，共表面活性劑螢光素表面活性劑用量在約10-3至10-6M之間.當在溶液中只使用共表面活性劑時，其本身失活。通常二氧環乙烷對螢光化合物的摩爾比，無論是在溶液中還是在固體組合物中一般是在約1000∶1至1∶1之間.
為獲得最佳酶活性，採用緩衝液調節PH值，就磷酸醯(如X-氧基)取代的二氧環乙烷而言，PH值在9和10之間，這樣磷酸醯基的非酶促水解降至最低，產生很低的對照螢光，2-甲基-2-氨基-1-丙醇是優選的緩衝劑，其他緩衝劑是三(羥甲基)氨基甲烷和碳酸鹽。也可以採用無機鹽(如Mg(OAc)2)使酶活化.選擇緩衝系統應為酶提供最大催化活性，並為由二氧環乙烷裂解而產生的X-氧基(如磷酸醯基)提供一受體.
本發明在特定的分子集合體，例如膠束中恰到好處地摻入穩定的二氧環乙烷和發光能量受體，使產生有效的能量轉移.這些方法適用於包括反向膠束，脂質體，微乳劑，膠片，單層體和聚合物.
最好將二氧環乙烷和受體置於溶液中或置於像膠片之類的固體上.固相有利於使這些分子定位在一起。
應當指出前述說明書僅用於說明，只有下文的權利要求書限制本發明.
權利要求
1.一種通過觸發產生光的組合物，其特徵在於在該組合物中含有(a)一種螢光化合物，和(b)下式所示的穩定1，2-二氧環乙烷，
式中ArOX代表由X-氧基取代的芳基，當在致活劑的作用下觸發除去X時，它形成不穩定的氧化物中間體1，2-二氧環乙烷化合物，該不穩定的1，2-二氧環乙烷化合物分解，釋放電子能，形成光和下式所示的兩個含羰基化合物，
式中X是化學易變基團，它在致活劑的作用下被除去，形成不穩定的氧化物中間體1，2-二氧環乙烷，並且式中A是能使光發生有機基團，在該組合物中，在致活劑的作用下，穩定的1，2-二氧環乙烷分解，並且螢光化合物接受由於不穩定氧化物中間體分解而產生的電子能，並產生光強度大於單獨觸發二氧環乙烷所產生的光。
2.一種通過觸發而產生光的組合物，其特徵在於在該組合物中含有(a)一種螢光化合物;和(b)下式所示的穩定的1，2-二氧環乙烷化合物
式中R1和R2一起以及R3和R4一起連接成螺旋稠合亞烷基，後者可以含有除碳原子之外的雜原子(N，S，O或P)和芳香環，在R1和R2中或R3和R4中至少有一個是被X-氧基取代的芳基，當它在選自酸，鹼，鹽，酶，無機和有機催化劑及電子授體的致活劑觸發下除去X時，形成不穩定的氧化物中間體1，2-二氧環乙烷化合物，該不穩定的1，2-二氧環乙烷化合物分解，釋放電子能，形成光和下式所示兩個含有羰基的化合物
式中未經X-氧基團取代的R1，R2，R3或R4是含碳原子的有機基團，該基團為穩定的1，2-二氧環乙烷化合物提供穩定性，並且式中X是化學易變基團，該基團在致活劑作用下它被除去，形成不穩定的氧化物中間體;其中致活劑使穩定的1，2-二氧環乙烷分解，在此過程中，所述螢光化合物接受由不穩定氧化物中間體分解而產生的電子能，進而產生光強度大於單獨觸發二氧環乙烷所產生的光。
3.一種產生光的組合物，其特徵在於在該組合物中含有(a)一種螢光化合物;和(b)下式所示的穩定的二氧環乙烷化合物
式中R1選自烷基，烷氧基，芳氧基，二烷氨基，三烷基或芳基甲矽氧基，和包括與R2螺旋稠合的芳基在內的芳基，其中R2是芳基，該芳基可包括R1，並且該R2還可以被X-氧基取代，該X-氧基在致活劑的作用下除去X，形成不穩定的氧化物中間體1，2-二氧環乙烷化合物，所述致活劑選自酸，鹼，鹽，酶，無機和有機催化劑，電子授體，該不穩定的1，2-二氧環乙烷化合物分解並釋放出電子能，形成下式所示兩個含羰基的化合物
式中X是化學易變基團，經致活劑作用除去X形成不穩定的氧化物中間體，其中R3和R4是選為自可以以螺旋稠合多環烷基和多環芳基的形式連在一起的芳基、雜芳基和烷基，其中在致活劑作用下，穩定的1，2-二氧環乙烷分解，其中螢光化合物接受由不穩定氧化物中間體分解而產生的電子能，並產生光強度大於單獨觸發二氧環乙烷而產生的光。
4.權利要求1所述的組合物，其中所述的二氧環乙烷與螢光化合物的摩爾比在約1000比1和1比1之間。
5.權利要求1所述的組合物，其中所述的螢光化合物是螢光素化合物。
6.權利要求1所述的組合物，其中在該組合物中含有陽離子表面活性劑。
7.權利要求2所述的組合物，其中R1是甲氧基，R2是由X-氧基取代的苯基，並且R3和R4連在一起構成金剛烷基。
8.權利要求7所述的組合物，其中X-氧基是選自羥基，三烷基或芳基甲矽氧基，無機含氧酸鹽，氧-吡喃糖苷，芳基羧基酯和烷基羧基酯，並且其中由致活劑中除去X。
9.權利要求8所述的組合物，其中所述的螢光化合物是螢光素化合物。
10.權利要求9所述的組合物，其中在該組合物中含有陽離子表面活化劑，其中所述的螢光化合物與形成共表面活性劑的烴鏈連接，在該組合物中，二氧環乙烷的存在量約為10-2至10-6M，表面活性劑存在量應大於10-4M，共表面活性劑存在量應為10-3至10-6M。
11.權利要求10所述的組合物，其中所述的表面活性劑是十四烷基三甲基銨鹽。
12.權利要求1所述的組合物，其中所述的二氧環乙烷和螢光化合物在膠束體，脂質體，反轉膠束體，微乳化劑，膠膜，單層體或聚合物中是以狹窄的間距相鄰。
13.權利要求2所述的組合物，其中所述的二氧環乙烷和螢光化合物在膠束體，脂質體，反轉膠束體，微乳化劑，膠膜，單層體或聚合物中是以狹窄的間距相鄰。
14.權利要求3所述的組合物，其中所述的二氧環乙烷和螢光化合物在膠束體，脂質體，反轉膠束體，微乳化劑，膠膜，單層體或聚合物中是以狹窄的間距相鄰。
15.權利要求1所述的組合物，其中所述的1，2-二氧環烷具有下式
式中X是一個基團，該基團與作為致活劑的酶反應而產生兩個含有羰基的下列化合物和光
16.權利要求15所述的組合物，其中所述的OX是磷酸酯基團而酶則是鹼性磷酸酶。
17.權利要求15所述的組合物，其中在組合物中混入了一種表面活性劑。
18.權利要求17所述的組合物，其中所述的表面活性劑是十六烷基三甲基銨鹽。
19.權利要求15所述的組合物，其中所述的螢光化合物是螢光素化合物。
20.權利要求19所述的組合物，其中在該組合物中混入了一種表面活性劑。
21.權利要求20所述的組合物，其中所述的表面活性劑是十六烷基三甲基銨鹽。
22.權利要求19所述的組合物，其中所述的螢光素化合物是螢光素表面活性劑。
23.權利要求22所述的組合物，其中所述的螢光素表面活性劑是由5-N-十四醯基氨基螢光素和1-十六醯基-6-羥基-2-苯並噻吖胺中選出。
24.權利要求23所述的組合物，其中在該組合物中混入了一種表面活性劑。
25.權利要求24所述的組合物，其中所述的表面活性劑是十六烷基三甲基銨鹽。
26.權利要求1所述的組合物，其中所述的該螢光化合物是一種螢光素表面活性劑。
27.權利要求26所述的組合物，其中所述的螢光素表面活性劑是由5-N-十四醯基氨基螢光素和1-十六醯基-6-羥基-2-苯並噻吖胺中選出。
28.權利要求27所述的組合物，其中在該組合物中混入了一種表面活性劑。
29.權利要求28所述的組合物，其中所述的表面活性劑是十六烷基三甲基銨鹽。
30.權利要求3所述的組合物，其中所述的螢光化合物是一種螢光素表面活性劑。
31.權利要求30所述的組合物，其中所述的螢光素表面活性劑是由5-N-十四醯基氨基螢光素和1-十六醯基-6-羥基-2-苯並噻吖胺中選出。
32.權利要求31所述的組合物，其中在該組合物中混入了一種表面活性劑。
33.權利要求32所述的組合物，其特徵在於該表面活性劑是十六烷基三甲基銨鹽。
34.權利要求1所述的組合物，其中在該組合物中的二氧環乙烷和螢光化合物是以狹窄的間距相聯繫的。
35.權利要求2所述的組合物，其中在該組合物中的二氧環乙烷和螢光化合物是以狹窄的間距相聯繫的。
36.權利要求3所述的組合物，其中在該組合物中的二氧環乙烷和螢光化合物是以狹窄的間距相聯繫的。
37.權利要求1所述的組合物，其中含有一種表面活性劑。
38.一種應用權利要求1的組合物檢測DNA的方法，該方法包括使被檢測的DNA與具有標記酶的DNA探針雜交，然後由標記酶產生可檢測的信號，該方法的特徵在於(1)在該組合物中提供(a)下式所示的二氧環乙烷
式中X是可與標記酶反應產生光的基團，(b)在探針和DNA雜交物的混合物中增強所述二氧環乙烷的發光作用的一種螢光化合物，和(2)檢測由標記酶與所述二氧環乙烷反應而產生的雜交物所發出的光。
39.權利要求38所述方法，其中，X是與作為標記酶的鹼性磷酸酶反應的磷酸基。
40.權利要求39所述方法，其中，所述的磷酸基是Po3Na2。
41.權利要求38所述方法，其中，X是與作為標記酶的酶反應的乙酸基。
全文摘要
本文介紹了涉及1，2-二氧環乙烷和螢光化合物的組合物及應用該組合物檢測DNA的方法。實際上，將可觸發的1，2-二氧環乙烷與表面活性劑及連接在烷烴上的螢光化合物預混合。經酶促觸發，得到一膠束態共表面活性劑或經證實與這些分子密切相關的其他分子。該組合物可用於為各種目的而採用的免疫測定和DNA探針。
文檔編號C07F9/12GK1088956SQ9312097
公開日1994年7月6日 申請日期1993年12月15日 優先權日1988年7月27日
發明者阿瑟·保羅·沙普 申請人:韋恩州立大學校董會