在分子診斷試劑的光激活檢測中改進選擇性的方法

2023-05-17 16:03:46

專利名稱：在分子診斷試劑的光激活檢測中改進選擇性的方法
技術領域：
本發明是在(美國)政府支持下，根據由美國能源部授予洛克希德馬丁能源系統公司的第DE-AC05-84OR21400號合同而進行的。洛克希德馬丁能源系統以及橡樹嶺聯合大學已經向諸發明人放棄發明權。根據由美國能源部授予的第DE-AC05-84OR21400號合同，政府在此項發明中享有權利。
本發明一般地涉及用於從遠方實現一種或多種分子試劑的空間選擇光激活以及用於改進由此產生的諸診斷信號的檢測的方法與裝置。為了實現光激活而講授的本方法利用非線性光學激發的諸特性，以便以高度的空間的和分子的特異性將一種試劑從一種分子能級推向另一種。本方法的諸特性可用於激活各種內源性和外源性的成像試劑，特別是在人和動物的疾病診斷中提供獨特的優點。具體地說，在近紅外到紅外輻射的波長範圍內，使用非線性激發方法有利於在深部組織中諸診斷試劑的受控激活，跟當前使用的各種方法和各種輻射相比，近紅外和紅外輻射在一個較小範圍內被吸收和散射。將這些非線性激發方法與先進的信號編碼和處理方法相結合，大大地增加了在諸診斷信號檢測中的靈敏度。
在許多領域中，特別是在醫學診斷領域中，迫切地需要一種能夠選擇性地控制各種分子試劑的遠方激活，並且在激活過程中產生很少的副作用。在激發方面所期待的改進包括改進對激活部位和深度的空間的和時間的控制，減少對其他處於同一位置的或最接近的分子試劑或結構的不希望有的激活，並且在所希望的分子試劑與不希望的分子試劑的激活中增加前者的優先權。已經研製了各種線性的和非線性的光學方法，用以在非常特殊的條件下對某些這樣的試劑提供某些這樣的改進。然而，一般來說，這些方法的性能和可用性尚未達到所期望的程度。具體地說，需要這樣的幾種改進的光激活方法，它們可以被用來對多種分子診斷試劑進行選擇性的光激活，並且在這種光激活的應用的控制上提供改進的性能。
將光輻射作為一種對分子探測器進行遠方激活的手段來應用已經有很多年的歷史了。具體地說，線性的光學激發方法已經作為一種對分子診斷試劑進行半選擇性激活的手段而被廣泛地應用。當一種目標試劑，例如一種分子診斷試劑，經受一種由單光子提供能量吸收的特定的光化學或光物理過程(例如螢光發射)時，便產生線性的光學激發。在許多情況下，這些過程是非常有效的，並且這些過程的使用對多種應用來說是有吸引力的。不幸的是，這些線性方法並不總是像所希望的那樣成功。例如，已經強有力地證明，用紫外輻射來激發某些分子探測器會使人和動物產生疾病，諸如誘發皮膚癌，還有其他不希望的副作用。而且，主要是由於該入射的用於探測的輻射在接近這些試劑的線性吸收波長帶的波長時出現光學散射和吸收，其結果是，在分子試劑的線性光學激發中，為了達到所期待的穿透深度，人們已經投入了最大的努力。作為一個例子，Wachter和Fisher(E.A.Wachter和W.G.Fisher，「用於在高分子基質合成物中評估結構弱點的方法與裝置」，美國專利5,483,338號)講授了一種在分子探測器試劑中能夠靈敏地進行化學變化成像的快速光學方法；然而，由於該入射探測器輻射的散射和吸收，該方法僅適用於局部分析。Vo-Dinh和他的同事(T.Vo-Dinh,M.Panjehpour,B.F.Overholt,C.Farris,F.P.Buckley Ⅲ和R.Sneed，「在食管癌活體診斷中使用微分歸一化螢光(Dnf)指標」，外科和醫學中的雷射，16(1995)41-47；以及M.Panjehpour,B.F.Overholt,J.L.Schmidhammer,C.Farris,P.F.Buckley，和T.Vo-Dinh，「食管癌的光譜學診斷新的分類模型，改進的測量系統」，胃腸內窺術，41(1995)577-581)講授了將類似的線性的光學探測器方法用於檢測人體中的患病組織；然而，由於該入射探測器輻射的散射和吸收，這個方案也因為達不到所期望的穿透深度以及局限於檢測表面損傷而受到困擾。同樣，由於這種類型的激發與激發功率線性相關，這樣的方法不能提供沿著該光學路徑對探測器激發位置進行限制的有效手段。事實上，由於入射光輻射被周圍的基質所散射和吸收，在探測器分子種類的激發中不良的特異性，以及缺乏用以精確地控制激活的範圍和深度的適當的物理機制，使得所有使用線性光學激發的實例實質上都受到基本性能限制的困擾。
為了在某些應用中在光激活的選擇性方面獲得特定的改進，以及為了解除由線性激發方法所帶來的種種限制，已經使用了各種非線性的光學激發方法。事實上，眾所周知，該非線性過程包括由一個分子同時吸收兩個光子的光，以實現等效於具有這兩個光子的能量的兩倍的一個單光子的吸收的激發，這個過程具有減少激發光子被基質吸收和散射，改進了的對激發區域的空間控制，以及降低了的導致樣本光化學和光物理損傷的可能性等特殊的優點。在雙光子激發方法的許多實例中，已經使用了從單模、連續波(CW)雷射器到具有超過1GW的峰值功率的脈衝Q-開關雷射器。例如，Wirth和Lytle(M.J.Wirth和F.E.Lytle，「在光密介質中的雙光子激發螢光」，分析化學，49(1977)2054-2057)講授了將非線性光學激發用作對存在於光密介質中的目標分子進行激發的一種手段；該方法在限制該探測器輻射跟該介質本身的不希望有的直接交互方面看來是有用的，並且提供了一種在強烈吸收或散射的基質中有效地激發目標分子試劑的有效手段。Wirth進一步地開發了對激活區域進行改進的空間控制的方法(M.J.Wirth和H.O.Fatunmbi，「在雙光子光譜學中的非常高的可檢測性」，分析化學，62(1990)973-976)；尤其是，Wirth講授了使一種使用一個顯微鏡的成像系統在目標分子試劑的激發中獲得極高的空間選擇性的方法。
Denk等進一步地應用了類似的控制方法(W.Denk,J.P.Strickler和W.W.Webb，「雙光子雷射顯微術」，美國專利第5,034,613號)，他講授了一種利用非線性雷射激發在細胞或亞細胞規模上對各種分子螢光試劑的光激活過程進行內部的高度三維控制的特殊的從上面照明的共焦雷射顯微鏡。但是，Denk專注於顯微術，其中一部顯微鏡被用來觀察載玻片上的樣本。這部顯微鏡被用來激發被添加到生物樣品中的、形成一種光密介質的分子螢光試劑，在Denk看來，從雷射器向下行進的光是作為被一面鏡子反射到一個目標平面的結果。然後，螢光將沿著同一條光路反向行進，通過一個物鏡，一系列的鏡面，最後(到達)一個光電倍增管。因此，光僅僅聚焦到一個載玻片的該目標平面上並反射回來。非線性雙光子激發被用來從實質上限制激發以及隨後的螢光信號的檢測，該螢光信號產生於一個物鏡焦點處的一個共焦區域，由此，通過準確地控制焦點的深度使三維成像的對比度得以改善。通過使用一種從上面照明的配置，由該激發物鏡收集所發出的螢光。通過控制光激發而產生的處於細胞和亞細胞水平上的基於照明的諸圖像被顯示於安裝在一個鏡臺上的目標樣本之中。而且，Denk講授了這種顯微鏡方案的一個主要好處是，基於用損傷較小的近紅外激發輻射來替代紫外激發輻射，減少了位於該焦平面上的由光誘發的壞疽。
在Denk等人後來的工作中(W.Denk,D.W.Piston，和W.W.Webb，「在雷射掃描顯微鏡中的雙光子分子激發」，載於生物共焦顯微鏡手冊，第二版，J.B.Pawley編，Plenum出版社，紐約，1995，第445-458頁)，講授了一種用於收集從雙光子激發螢光標記物產生的顯微圖像數據的外部全面積檢測方法。這種被作者稱為「迄今尚未試驗過」的方法，不需要採用從上面照明的方法(見第452頁)來收集反向散射的螢光。Denk指出，若該顯微鏡的物鏡不讓所發出的螢光波長通過，則這個方案可能是有用的，但它「易受到室內的環境光線的汙染的影響」。在這項工作以及Denk早期的專利(第5,034,613號)中，尚未見到用於或參與降低來自環境光線或來自散射的激發光的背景幹擾的明顯的方法。
事實上，雙光子激發過程的眾所周知的低效率可以轉化為散射的、不吸收的激發光對螢光發射的一個非常高的比值。使用各種用以降低來自散射的激發光，以及來自環境光線和來自其他環境的與儀器的背景噪聲源的幹擾的調製方法已有許多先例。在雙光子激發螢光這個領域中，Lytle和他的同事(R.G.Freeman,D.L.Gilliland，和F.E.Lytle，「正弦調製的雙光子激發螢光的二次諧波檢測「，分析化學，62(1990)2216-2219；以及W.G.Fisher h1 F.E.Lytle，」空間濾波的雙光子激發螢光的二次諧波檢測「，分析化學，65(1993)631-635)講授了通過使用二次諧波檢測方法來抑制散射的雷射器激發光的各種巧妙方法當用一種頻率進行激發光的正弦調製，並在兩倍於該頻率(這就是該激發調製頻率的二次諧波)的頻率上進雙光子激發螢光的檢測時，來自散射的激發光的各種幹擾實質上被消除。並且通過適當地選擇該調製頻率以避免電子的和其他噪聲頻率(的幹擾)，就能使對儀器的和環境的幹擾的抑制能力達到極高的程度。
因此，眾所周知，在實驗室條件下，可以在波長約為線性單光子激發所用波長的兩倍的條件下，用雙光子激發的螢光去激發分子螢光團，並且，眾所周知，由此實現的激發可以改進對激發部位的三維空間控制，可以減少由於激發光在光密介質中的吸收與散射而產生的幹擾，以及減少沿著激發路徑對經受顯微鏡觀察的活細胞樣本的附帶損傷。
然而，被所列舉的這些例子證明了的現有技術的實質清楚地說明了各種能用於診斷以及用於其他活體顯微鏡成像的光激活方法具有許多有吸引力的特徵，一種以前從來沒有被講授過的用以獲得一種或多種分子試劑的選擇性光激活的通用方法，其高度的空間控制(能力)能滿足醫學診斷界多種多樣的需求。具體地說，以前一直未講授過可在醫學診斷應用中有意義的尺度上達到這類控制的實用方法。
因此，本發明的一個目的是，提供一種通用方法，它以高度的空間控制(能力)對一種或多種分子試劑進行選擇性的光激活。
本發明的另一個目的是，提供這樣一種方法，它能滿足醫學診斷界多種多樣的需求。
本發明的又一個目的是，提供一種實用的方法，用以實現對醫學診斷應用有意義的尺度進行控制。
考慮到上述的和其他的諸目的和諸優點，本發明一般地提供一種用於對植物或動物組織的一個特定體積進行成像的方法，其中該植物或動物組織含有至少一種光活性分子試劑。本方法包括下列諸步驟用光來處理該植物或動物組織的特定體積，上述光足以使得包含在該植物或動物組織的特定體積中的光活性分子試劑進入雙光子同時激發狀態，對處於該植物或動物組織的特定體積中的至少一種光活性分子試劑進行光激活，由此產生至少一種已被光激活的分子試劑，其中該至少一種已被光激活的分子試劑發射能量，檢測由該至少一種已被光激活的分子試劑所發射的能量，並產生一個已檢測的能量信號，它是該植物或動物組織的特定體積的特徵所在。本發明還提供一種用於(某種)材料的一個特定體積的成像方法，其中該材料含有至少一種光活性分子試劑。
在本發明的一個優選實施例中，足以使至少一種光活性分子試劑進入雙光子同時激發狀態的光是雷射。同樣被推薦的是，足以使該光活性分子試劑進入雙光子同時激發狀態的這種光是一束聚焦光束，並且更加受推薦的是，該聚焦光束是已聚焦的雷射。
本發明的另一個優選實施例還包括用至少一種光活性分子試劑來處理該材料、植物或動物組織的第一步驟，其中該材料、植物或動物組織的特定體積保留該至少一種光活性分子試劑中的至少一部分。更加被推薦的是，該至少一種光活性分子試劑是從下列各種光活性分子試劑組成的組中選出的它們是補骨脂素，5-甲氧基補骨脂素〔5-MOP〕,8-甲氧基補骨脂素〔8-MOP〕,4,5』,8-三甲基補骨脂素〔TMP〕,4』-氨甲基-4,5』,8-三甲基補骨脂素〔AMT〕,5-氯甲基-8-甲氧基補骨脂素〔HMT〕，當歸根素(異補骨脂素)，5-甲基當歸根素〔5-MIP〕,3-羧基補骨脂素，卟啉，血卟啉衍生物〔HPD〕,PhotofrinⅡ，苯並卟啉衍生物〔BPD〕，原卟啉Ⅸ〔PpⅨ〕，染料血卟啉醚〔DHE〕，多血卟啉酯類〔PHE〕，原卟啉的13,17-N,N,N-二甲基乙基乙醇胺酯〔PH1008〕，四(3-羥苯基)-卟啉〔3-THPP〕，四苯基卟啉單磺酸鹽〔TPPS1〕，四苯基卟啉二磺酸鹽〔TPPS2a〕，二血卟啉醚，meso-四苯基卟啉，meso-四(4N-甲基吡啶)卟啉〔T4MpyP〕，八(4-叔丁基苯基)四吡嗪紫菜嗪〔OPTP〕，酞菁，四(4-叔丁基)酞菁〔t4-PcH2〕，四(4-叔丁基)酞菁鎂〔t4-PcMg〕，氯化鋁酞花青磺化的酞菁〔CASPc〕，氯化鋁酞花青酞菁四硫酸鹽〔AlPcTS〕，單磺化的鋁酞菁〔AlSPc〕，二磺化的鋁酞菁〔AlS2Pc〕，三磺化的鋁酞菁〔AlS3Pc〕，四磺化的鋁酞菁〔AlS4Pc〕，矽酞菁〔SiPcⅣ〕，鋅(Ⅱ)酞菁〔ZnPc〕，雙(二異丁基十八烷基甲矽烷氧基)矽2,3-萘酞菁(naphthalocyanine)〔isobOSINC〕，鍺Ⅳ八丁氧基酞菁〔GePc〕，若丹明101〔Rh-101〕，若丹明110〔Rh-110〕，若丹明123〔Rh-123〕，若丹明19〔Rh-19〕，若丹明560〔Rh-560〕，若丹明575〔Rh-575〕，若丹明590〔Rh-590〕，若丹明610〔Rh-610〕，若丹明640〔Rh-640〕，若丹明6G〔Rh-6G〕，若丹明700〔Rh-700〕，若丹明800〔Rh-800〕，若丹明B〔Rh-B〕，磺基若丹明101(sulforhodamine 101)，磺基若丹明640，磺基若丹明B，香豆素1，香豆素2，香豆素4，香豆素6，香豆素6H，香豆素7，香豆素30，香豆素47，香豆素102，香豆素106，香豆素120，香豆素151，香豆素152，香豆素152A，香豆素153，香豆素311，香豆素307，香豆素314，香豆素334，香豆素337，香豆素343，香豆素440，香豆素450，香豆素456，香豆素460，香豆素461，香豆素466，香豆素478，香豆素480，香豆素481，香豆素485，香豆素490，香豆素500，香豆素503，香豆素504，香豆素510，香豆素515，香豆素519，香豆素521，香豆素522，香豆素523，香豆素535，香豆素540，香豆素540A，香豆素548,5-乙氨基-9-二乙氨基苯並[a]吩噁嗪鎓鹽〔EtNBA〕,5-乙氨基-9-二乙氨基苯並[a]吩噻嗪鎓鹽〔EtNBS〕,5-乙氨基-9-二乙氨基苯[a]吩硒嗪鎓鹽〔EtNBSe〕，氯丙嗪，氯丙嗪衍生物，葉綠素衍生物，細菌葉綠素衍生物，金屬-配基絡合物，二氯化三(2,2』-雙吡啶)釕(Ⅱ)(RuBPY)，二氯化三(2,2』-雙吡啶)銠(Ⅱ)(RhBPY)，二氯化三(2,2』-雙吡啶)鉑(Ⅱ)(PtBPY)，脫鎂葉綠甲酯-酸a，部花青540，維生素D,5-氨基-乙醯丙酸，photosan，二氫卟酚e6，二氫卟酚e6亞乙基二醯胺，單-L-天冬氨醯基二氫卟酚e6，以及吩噁嗪尼羅藍衍生物，芪，芪衍生物，以及4-(N-(2-羥乙基)-N-甲基)-氨基苯基)-4』-(6-羥基己基磺醯基)芪(APSS)。同樣，更加受推薦的是，至少有一種光活性分子試劑是至少一種對在該材料、植物組織或動物組織的特定體積中的特定材料或組織具有特異性的生物性光活性分子試劑，甚至更加受推薦的是，至少有一種生物性光活性分子試劑含有從下列各種光活性分子試劑組成的小組中選出的一個片段，它們是DNA,RNA，胺基酸，蛋白質，抗體，配基，半抗原，碳水化合物受體或複合試劑，脂類受體或複合試劑，蛋白質受體或複合試劑，螯合劑，以及膠囊載體，並且還要更加受推薦的是，至少有一種生物性光活性分子試劑進一步地包括一種當受到足以使它進入雙光子同時激發狀態的光(的照射)時被光激活的光活性分子試劑的一個片段。
在本發明的又一個優選實施方案中，用足以激勵包含在該材料、植物組織或動物組織的特定體積中的至少一種光活性分子試劑進入雙光子同時激發狀態的光來處理該材料、植物組織或動物組織的特定體積的步驟還包括從光源中用一種特定類型的調製(方式)對光進行調製的步驟，由此產生一束已調製光，以及用足以使包含在該材料、植物組織或動物組織的特定體積中的至少一種光活性分子試劑進入雙光子同時激發狀態的該已調製光來處理該材料、植物組織或動物組織的特定體積的步驟。同樣受推薦的是，本發明還包括對具有該特定類型的調製(方式)的已檢測的能量信號進行解調的諸步驟，上述步驟產生一個已解調的能量信號，它是該材料、植物組織或動物組織的特定體積的特徵所在。
更加受推薦的是，對具有該特定類型的調製(方式)的已檢測的能量信號進行解調的步驟包括，在一個兩倍於該特定類型的調製(方式)的頻率上，對已檢測的能量信號進行解調，由此檢出該特定類型的調製(方式)的二次諧波。同樣更加受推薦的是，作為該材料、植物組織或動物組織的特定體積的特徵的該已解調的能量信號，代表了存在於該材料、植物組織或動物組織之中的至少一種光激活的分子試劑的壽命的變化。
通過以下結合諸附圖對本發明的諸優選實施例的詳細說明，本發明的上述的和其他的特徵和優點將進一步地被人們所知曉，在諸附圖中

圖1表示針對線性和非線性光學激發的示例性的諸能級圖；圖2表示針對單光子和雙光子激發的介於入射功率分布以及激發效率之間的關係；圖3表示一種覆蓋著從紫外到近紅外光譜區域的動物組織的示例性的吸收光譜；圖4表示一種覆蓋著從紫外到近紅外光譜區域的動物組織的散射光譜；圖5表示在入射短波長和長波長光時，組織的光學吸收和散射特性的總趨勢；圖6對使用單光子和雙光子兩種激發方法時，在組織中由光學引起的諸激發區域進行比較；圖7表示一種在溶液中的診斷試劑的線性激發的各種典型特性；圖8表示一種在溶液中的診斷試劑的非線性激發的各種典型特性；圖9表示均勻地分布於一個組織模型中的染料分子香豆素480的雙光子激發螢光的一張照片；圖10表示均勻地分布於一個腫瘤樣本中的染料分子香豆素480的雙光子激發螢光的一張照片；圖11表示用於使內源性的或外源性的諸成像試劑成像的本發明的一個特定的優選實施例的一張圖；圖12表示用於使內源性的或外源的諸成像試劑成像的本發明的一個變通的優選實施例的一張圖，其中使用調製來改善成像性能；以及圖13表示用於諸表面特徵的視頻圖形成像的本發明的第二個變通的實施例的一張圖。
在這裡被說明的本發明利用諸分子試劑的非線性光學激發的獨特的物理特性去實現對這些試劑的光激活的改進的空間控制。此外，已經表明，非線性光學激發在醫學診斷試劑和其他試劑的光激活過程中還具有一些優點，包括減少附帶的激發以及沿著激發路徑的損傷，減少在有害的光波波長中的暴露，以及減少起源於環繞該被激發的試劑的環境的吸收和散射過程所引起的幹擾。
在本次公開中所講授的本發明的基本的重要性在於使用非線性的、同時的雙光子光學激發過程，以高度的空間控制和改進了的穿透深度對一種或多種分子診斷試劑進行遠程光激活。這些分子試劑可以是被添加到待觀察系統中的各種外源性試劑，或者它們也可以是該系統的內源性成分。示例性的外源性的診斷試劑包括各種補骨脂素類衍生物，而示例性的各種內源性試劑包括各種芳香族胺基酸以及各種核酸。雙光子激發在一個約為對應的單光子吸收波長帶的兩倍的波長下進行。通過將一束光學輻射波束聚焦到一個待觀察的樣本之上，該診斷試劑可以在一個基本上被限制在該聚焦光束的共焦區域之內的一個位置上被激發。該共焦區域，Zc，被定義為延伸在一段距離2πw02/λ之內的區域，這裡w0是光束腰部的最小直徑，並且λ是該光學輻射的波長。與此相對比，當使用線性激發方法時，激發基本上沿著全部光學路徑發生，使得激發的空間定位在很大程度上顯得不確定。因此，使用雙光子激發過程大大地增加了沿光學路徑的激發的解析度。還有，由於激發是在相對於對應的線性激發過程而言的長波長下進行的，所以激發能量的散射和吸收也大大地減少了。對於厚的、光學上稠密的各種樣本，例如人體組織來說，這就意味著雙光子激發方法可能達到的深度比使用線性激發方法時可能達到的深度要大得多。由於涉及所發出的光束的原點的空間信息已經被編碼並且與該激發焦點相關，因此對從該診斷試劑發出的光不要求無散射地直接被檢出或被成像。通過移動這個焦點相對於該樣本的位置，就能顯現出所發出的光的一個二維或三維圖像。還有，通過調製該激發光並在檢測裝置中使用適當的解調方法，可以顯著地改善對散射的激發光以及其他幹擾的抑制。
本發明打算主要地用於各種組織的疾病和各種組織的其他特性、例如人的乳腺癌，的活體檢測與成像。然而，一旦本發明被充分地公開之後，顯而易見，所講授的方法和裝置將會有許多附加的應用，並且，正如Denk等所講授的那樣，這些方法和裝置可以應用於雙光子雷射掃描顯微術的領域，以便在這些儀器的性能特性方面獲得實質性的改進。為了開始這種充分的公開，複習一下關於線性和非線性光學激發的物理學基礎知識將是有用的。
線性與非線性激發的比較-能級圖的形成圖1表示幾種線性與非線性光學激發過程的典型的分子能級圖。在這種由簡化的查布隆斯基(Jablonski)圖組成的表示中，垂直方向對應於能量的變化，而水平方向則從左到右表示事件的序列。水平實線表示量子力學上允許的諸分子能級，而水平的虛線則表示不允許的、諸虛擬能級。量子力學上允許的諸分子能級是相當長壽命的，並且一個分子在吸收能量(例如由一個適當能量的光子所提供的能量)時的激發概率是很高的。可以通過各種激發過程來達到諸虛擬能級，但是跟被允許的分子能級躍遷相比，它們只有非常短的壽命(根據海森堡不確定性原理的預測，其量級為10-15秒)，只有在特定激發條件下，它們才會變得顯著。在查布隆斯基圖中的直箭頭表示輻射能量的轉移過程朝上的箭頭表示能量的吸收，而朝下的箭頭則表示輻射的發射，例如一個光子的螢光或磷光的發射。波浪形的箭頭表示非輻射的能量轉移過程，例如振動弛豫。該直線的或波浪形的箭頭的垂直長度跟在一個給定過程中吸收或發射的能量成正比。
對圖1所示的第一份查布隆斯基圖來說，在吸收一個具有足夠的能量的光子4，使之能直接地引起該分子從一個第一被允許電子能級(通常是最低電子能級，或者基態，表示為S0)到達一個具有一個較高的總能級(在這裡表示為S1狀態)的第二被允許電子能級8的條件下，就出現單光子激發到一個被允許的能級2的情形。要注意的是，隨著它們的能量的增加，通過激發可以到達多個被允許的較高的電子能級，這些能級通常被表示為S1,S2，等等。該名稱S1表示一個符合於泡利不相容原理的單態的電子能級，其中所有電子的自旋都是成對的，並且這些成對的電子自旋都是方向相互相反的。對某些電子系統來說，還可能出現一個或多個三個一組的激發態(譯者注以下簡稱三態)10，在本例中表示為T1。三態與單態的區別在於，除了兩個以外，所有的電子自旋都是成對的。每一個被允許的電子能級(單態或三態)可以進一步地被細分為離散的諸振動能級12的一個集合；接著這些離散的振動能級12中的每一個還可以被細分為離散的旋轉的諸能級的一個集合。因此，由於大量的可能的振動的和旋轉的能態(的存在)，每一個被允許的電子能級，S0,S1,T1，等等，都構成一個由被允許的諸能級組成的一個複合能帶。在從一個光子4那裡吸收能量時，該分子被推上一個特定的獨特的電子與振動能級14，有時被稱為一個振子能級。然後該分子從這個激發態出發，經歷快速的內部轉換16，到達於例如在第二被允許的電子能級8中的被允許的最低激發振子能級18。這種內部轉換16典型地是非常快的，它出現在時間標尺上僅為10-12到10-15秒。最後，該受激分子可能經歷進一步的弛豫，例如通過碰撞去激活過程20，回到該初始的能級6。可能發生的弛豫過程包括從S1直接地躍遷到S0時出現的一個光子21的螢光發射，以及在系統內部從一個單態跨越到一個三態10之後出現的磷光。要注意的是，從單態到三態的電子躍遷，例如那些表示為S1→S0的那樣，構成了量子力學上允許的符合泡利不相容原理的各種躍遷。與此相對比，從一個單態到一個三態10的躍遷，例如S1→T1，由於諸電子自旋不保持成對，所以在量子力學上是被禁止的。然而，對某些分子系統來說，該S1狀態的壽命跟這些系統內部恆定的跨越速率常數相比顯得相當長，其結果是，內部轉換的概率大於0。從該三態10躍遷回到一個單態，例如T1→S0，可以經由被稱為一個光子24的磷光發射的輻射過程而發生。由於該過程的不被允許的性質，磷光與螢光相比，其特徵通常在於前者具有一個相當長的輻射壽命。單光子激發到一個被允許的能級2的一個例子就是，在400nm波長下，通過一個單光子4的吸收，引起該染料香豆素的分子從一個基電子態躍遷到一個激發電子態，其後跟隨著內部轉換16，並且接著發生一個光子21在480nm(波長)下的螢光發射。在這個例子中，激發概率跟入射光的輻射功率是線性相關的，因此，單光子激發到一個被允許的能級2，被稱為一個線性激發過程。
對圖1所示的第二份查布隆斯基圖來說，在吸收一個具有不充分的能量的光子28，因而無法直接地引起該分子躍遷到一個更高的被允許的電子能級8的條件下，就出現單光子激發到一個虛擬能級26的情形。或者，該分子被推上一個非常短壽命的虛擬能級30。這個虛擬能級30典型地將具有10-15秒量級的壽命。該被吸收的光子28從這個虛擬能級30出發的基本上在瞬間之內的再發射32將典型地經由例如彈性散射那樣的過程而發生。這個過程的一個重要的例子就是用800nm的光激發香豆素時產生的在800nm波長下的瑞利散射過程。另一個例子是當該分子回到與基態相關聯的各振動能級時的拉曼散射。在這些示例性的過程中，激發概率也是跟入射光輻射的功率線性相關的，因此，單光子激發到一個虛擬能級26也被稱為一個線性激發過程。
對圖1所示的最後一份查布隆斯基圖來說，在同時吸收兩個光子中的第一個36以及兩個光子中的第二個38的條件下，出現兩個光子同時激發到一個被允許的能級34的情況。在這種情況下，兩個光子中的第一個36以及兩個光子中的第二個38的組合能量足以引起該分子從一個被允許的第一能級6(躍遷到)一個被允許的第二能級8。典型地，兩個光子中的第一個36、兩個光子中的第二個38各自的能量不足以直接地引起這個或者任何其他的被允許的電子能級躍遷。相反，兩個光子中的第一個36將該分子推上一個壽命非常短的虛擬能級30。這是跟第二份查布隆斯基圖所示的能級相同的虛擬能級。在從該虛擬能級30發生再發射32之前，兩個光子中的第二個38立即將該分子推上一個第二被允許的電子能級8。這種激發的結果等效於使用線性單光子激發達到一個被允許的能級2時所取得的結果。要注意的是，兩個光子中的第一個36以及兩個光子中的第二個38可以具有相等的或不相等的能量。同樣地，在該虛擬能級30經歷弛豫過程32回到初始的第一被允許電子能級6之前，該入射激發光束的瞬時輻照度，或Wm-2，必須相當高，以便在吸收兩個光子中的第二個38時產生明顯的效率。事實上，由於虛擬能級30的壽命僅為10-15秒的量級，所以通常使用具有非常高的峰值功率的諸脈衝激發源，以便有效地促進這些過程；由於這些激發源在該虛擬能級30的短促的壽命中能向該受激分子提供大量的光子，所以這樣的激發源通常是優先的。一旦該分子已經被推上第二被允許的電子能級8，它隨後經歷快速的內部轉換16，其後跟隨著進一步的弛豫過程，例如通過碰撞去激活過程20，一個光子21的螢光發射，或者系統內部跨越22到達一個三態10。在最後一種情況下，經由一個光子24的磷光發射，從三態10返回到單態的基態6的躍遷可能發生。值得注意的是，雙光子的同時激發具有到達於一個允許的能級2的單光子激發以及到達於一個虛擬能級26的單光子激發二者的諸特徵，特別是，一個虛擬能級30在將該分子從基態推上激發態的過程中起著一種關鍵的作用，並且一旦被推上一個激發能級，該分子將經歷跟到達於一個被允許的能級2的單光子激發所導致的結果相同的光化學和光物理過程。雙光子同時激發過程的一個例子就是通過同時吸收波長為800nm的兩個光子並隨後發射一個波長為480nm的螢光光子，將該染料香豆素分子從一個電子基態推上一個電子激發態。由於眾所周知的對瞬時光子輻照度的平方依賴性，到達於一個被允許的能級50的雙光子同時激發也被稱為一個非線性激發過程。線性與非線性激發過程的顯著差別將在下一節中加以鑑別。
要注意的是，除了圖1所示的示例性的諸能級圖以外，許多其他的各種能級躍遷過程以及各種能級狀態都是可能的，這取決於許多因素，包括分子系統的諸特性，它的環境，在能量的吸收和釋放形式下的特定的能量，以及它們的時間和空間的相互關係。一旦一個分子已經被激發到激發態，就可能發生各種物理的或化學的過程，包括一個光子的發光發射，光化學轉換，例如異構化或氧化，或光致電離。重要的是，正是該激發態的基本特性以及它的環境決定了該分子的最終結局。由於激發過程本身不會直接地影響該受激分子或者它的環境，所以一旦激發以後，負責將該分子推上激發態的那種機制對這個結局沒有明顯的影響。因此，一種在單光子激發條件下工作得很好的分子診斷試劑，可以期待在雙光子激發條件下也顯現出類似的特性。
線性與非線性的比較-功率依賴性和空間效應
當光與一個分子系統相互作用時，它引起一個極化過程，該極化過程正比於線性磁化率與所施加的電場強度的乘積。若這個電場很強，則該系統變得難以描述，並且在所引起的極化的描述中，應當包括高階的諸交互項。雙光子的同時激發被稱為一種非線性過程，這是因為它出現在來自兩個光子的電磁場通過這些高階項，特別是三階磁化率的虛部x(3)」，合併到一起，以便引起一次電子能級躍遷的時候。這是描述雙光子同時吸收的非線性的另一種方法。那就是，該分子系統非線性地響應該強電磁場。與此相對比，單光子激發過程可以用線性磁化率來描述，並且該激發過程與激發功率成正比。要注意的是，雙光子同時激發的截面典型地比一次等效的單光子激發過程的截面大約小十萬倍。這是由於在虛擬能級的極端短促的壽命時間內，兩個光子同時跟一個分子進行相互作用的概率是很低的。但是，能夠提供極高的峰值功率的光學激發源(例如各種鎖模雷射器)的可用性，通過增加瞬時入射功率並由此顯著地提高雙光子同時激發的效率，基本上能夠改善這種低效率的影響。例如，當使用連續波激發時，對一個特定的分子系統來說，雙光子激發的效率可以比單光子激發時所得到的效率低十萬倍。然而，若以一系列非常短的脈衝的形式發出同樣的平均光功率，則該峰值與平均功率的乘積的偏移將改變這個比值，使得它接近於1。
可以使用雙光子同時激發的非線性性質來獲得雙光子同時激發與線性激發相比在空間激發特性上的重大差異。例如，圖2表示當一束雷射束46被聚焦48到一種材料50之上時，單光子激發效率曲線40以及雙光子同時激發效率曲線42之間出現了顯著的差異，二者之間的差異程度是該雷射束亮度曲線44的一個函數。這種材料50可以是裝在透明小容器52的兩壁之間的一種雷射染料溶液。這種材料50的另一個例子可以是人的皮下組織。用一塊透鏡54對雷射束46進行聚焦48產生一束光束亮度曲線44，正如根據古典高斯光學理論所預測的那樣，上述曲線44作為一個通過該樣本的距離的函數而發生改變，在焦點56的中心處達到最大值。對於一個單光子過程來說，介於光束亮度(或者入射功率)以及激發效率之間的線性關係導致一單光子激發效率曲線40以線性規律跟隨著光束亮度曲線44而改變。與此相對比，對於雙光子同時激發過程來說，介於光束亮度(或者入射功率)以及激發效率之間的非線性關係導致一雙光子同時激發效率曲線42跟隨著光束亮度曲線44的平方而改變。因此，當使用雙光子同時激發時，可以利用對雷射束46的聚焦48將激發範圍基本上限制在一個小的焦點區域，或共焦區域內。與此相對比，當使用線性激發時，基本上沿著整個光路產生激發，使得激發的空間定位在很大程度上顯得不確定。
線性與非線性激發的比較-吸收與散射效應雙光子同時激發的截面可以比在單光子激發下所看到的小很多，在許多情況下，由於較長波長光輻射具有較低的基質吸收和光散射，因此，使用雙光子同時激發比使用單光子激發可能更有利。例如，圖3表示動物組織，例如人的真皮或肝臟的吸收光譜，它覆蓋著從紫外(UV)到近紅外(NIR)的光譜範圍。圖4表示動物組織，例如人的真皮或肝臟，在類似諸條件下的散射光譜66。具體地說，圖3說明，諸高能光子60(例如那些用於診斷試劑的線性激發的諸光子)，跟諸低能光子62(例如那些用於診斷試劑的非線性激發的諸光子)相比，經受多麼大的組織吸收。例如，人的皮膚強烈地吸收在400nm下的諸高能光子60，但對於在800nm下的諸低能光子62則是相對地透明的。這是由於皮膚中的各種色素、各種蛋白質以及各種遺傳物質，以及其它各種自然成分，對具有紫外光或可見光諸波長的諸高能光子60進行相當高的自然吸收的結果。還要注意到介於諸激發能量以及該診斷試劑的發光波長64之間的關係。不管使用諸高能光子60或者使用諸低能光子62來激發該試劑，其發光波長64將對應於由該試劑所決定的能量，而與施加於該試劑的那種激發方法無關。圖4進一步說明諸高能光子68與諸低能光子70相比，前者可能要經受多麼大的組織散射。任何一種光密介質，例如人的皮膚，都將在可見光或紫外光的各種波長上，例如400nm，強烈地散射高能光子68，但在近紅外(NIR)或紅外(IR)的各種波長上，例如800nm，呈現出針對低能光子70的很弱的散射。請注意，正如前面在圖3中所示的那樣，圖4表示該診斷試劑的發光波長72將典型地落在諸高能光子60以及諸低能光子62的波長之間。
在光學特性上的這些差異具有若干重要結果。首先，(機體)組織對波長較短的諸高能光子60的吸收可能導致不希望有的組織損傷。與此相對比，即使在該近紅外光的光功率比紫外光或可見光輻射的功率大許多倍的情況下，在諸低能光子62(例如近紅外光)的輻射下，所受到的各種影響都可以忽略不計。其次，(機體)組織對諸高能光子68的固有的高吸收和散射可能導致非常淺的組織穿透深度，而諸低能光子70通常具有更大的穿透深度。由於散射的諸高能光子60將引起診斷試劑沿著它們的散射路徑發光，所以準備穿透組織的諸高能光子60傾向於產生一個沿著與激發路徑相垂直的方向而延伸的漫射的發光區域；但由於對雙光子激發的平方依賴關係，採用低能光子62的輻射將產生一個被更準確地限定的激發圖形，它並沒有因為散射的低能光子62的出現而被明顯地弄模糊。因此，當使用例如那些處於紫外光或可見光光譜區域之內的高能光子68時，照明以及隨後的諸表面下特性的檢出就是困難的或者是不可能的。與此相對比，當使用例如那些處於近紅外或紅外光譜區域之內的低能光子70時，照明以及隨後的諸表面下特性的檢出就容易得多。還要注意到，從該診斷試劑發出的光可以被待觀察的該組織或者其他光密介質高度地吸收和散射。然而，為了滿意地檢測所發出的光，僅需將這種光的一小部分送往一個檢測器。所發出的光的散射範圍越大，就意味著越需要使用各種巧妙的方法，才能從散射光以及其他光學的或儀器的噪聲源中將被激發的試劑所發射的光區分出來。後一種考慮將成為下文的論題。
圖5概略地表示高能和低能光在吸收和穿透深度特性方面的重大差別。當紫外光或可見光74，例如波長為400nm的光，照射到人體組織之上時，在其最外層82，例如表皮和真皮，大部分光能將被立即吸收78和散射80。由於在這種組織76的諸細胞中的某些分子(例如在細胞核中組成遺傳物質的那些)的激發可能導致吸收78，並且在產生吸收78的部位上的諸細胞中，可能引起多種附帶的光化學變化。這些附帶的光化學變化可能含有不可逆的基因損傷並且誘發癌。因此，對於使用紫外光或可見光74(例如通常用於診斷試劑的線性激發的那些)來說，光學穿透深度較淺，並且誘發附帶損傷的可能性較高。與此相對比，近紅外或紅外光84，例如波長為800nm的光，在組織76中所經受的吸收和散射80就小得多。其總的穿透深度將更深，並且對諸細胞的附帶的損傷範圍實質上將縮小。因此，若在雙光子激發過程中使用長波長激發光來代替較高能量的單光子激發，則有可能使用相對地無損傷的具有高穿透深度的諸波長，對存在於深部組織中的特定診斷試劑進行光激活。
而且，在使用近紅外光的條件下，與固有的無損傷性質和高的穿透深度相結合，示於圖2的非線性激發的顯著特性具有附加的含意。例如，圖6針對存在於一塊皮下腫瘤90之中的成像試劑，對單光子激發86以及雙光子同時近紅外激發88所期望的穿透深度和空間定位特性進行比較。單光子激發86產生一個基本上沿著整個光路延伸並且沒有顯著的特異性的激發區域92。要注意的是，由於吸收和散射，使得單光子激發86的效率將沿著該光路發生變化，在靠近光輻射的引入點處為最高94，並且沿著該光路迅速地降下來96。還要注意到，誘發附帶的光損傷的可能性也具有這種相同的趨勢。因此，單光子激發產生一個延伸的激發區域92，它不能被有效地限制在一個有限的體積之內，特別是在深層組織中。同樣地，在所有的周圍組織98中，都可能出現明顯的附帶損傷，特別是在表層組織100中。若該單光子激發86被聚焦，則在其焦點102處，激發區域92將有所增強。然而，要注意的是，若用於單光子激發86的紫外光或可見光在到達該腫瘤90之前已被明顯地吸收或散射，則這個激發區域92甚至無法延伸到該腫瘤90(所在的位置)。與此相對比，使用近紅外雙光子同時激發88將產生一個被精確地限定的遠方激發區域104，作為這種激發方法的內在的非線性特性的一個結果，上述激發區域104基本上被定位於焦點106處。而且，由於對近紅外光的吸收有所降低，其對周圍組織98，特別是對表層組織100的附帶損傷被減到最小。並且作為對近紅外光的低吸收和低散射的綜合結果，跟那些使用紫外光或可見光諸波長的情況相比，有可能有效地探測到更深的深部位置。
各種典型的診斷成像試劑的線性和非線性激發的實例一種在溶液中的診斷試劑的線性激發示於圖7。在這個實例中，波長為442nm的雷射輻射被用來激發染料分子FITC在甲醇中的稀溶液。從一個連續波氦-鎘雷射器發出的雷射束通過一個20倍的顯微物鏡被聚焦到裝有該染料溶液的一個透明小容器上，並且在該染料中激起一個漫射的、延長的發光圖形。這個實例清楚地表明，沿著整個光路出現發光，並且由於散射雷射對該染料的激發而環繞著原始激發路徑出現了一個漫射的光暈。與此相對比，圖8表示使用雙光子同時激發的一種診斷試劑的高度定位的遠程光激活。在這個實例中，波長為730nm的雷射輻射被用來激發染料分子香豆素480在甲醇中的稀溶液。具體地說，以78MHz的脈衝重複頻率、在一個直徑約為1mm的光束中，發出波長為730nm、光脈衝(寬度)短於200fs的連續序列的鎖模鈦蘭寶石雷射器的近紅外輸出，通過相同的20倍顯微物鏡被聚焦到一個裝有該染料溶液的透明小容器上。圖8清楚地表明，來自該染料分子的螢光響應被限制在該近紅外光束的焦點處。由於雙光子激發以及瞬時雷射功率之間的平方關係，使得沿著該激發路徑在焦點之前和之後的諸位置上的激發變為可忽略不計。同樣，雖然在這張照片上，環繞該發光區域可以看到由於照相底片的過分曝光導致少許偽跡，但是仍然觀察不到光暈的存在。
圖9說明存在於一種光密介質中的一種診斷試劑的高度定位的遠程光激活。這裡展示一張照片，表示均勻地分布於含有一塊瓊脂糖凝膠的組織模型之中的染料分子香豆素480的雙光子激發螢光。以78MHz的脈衝重複頻率、在一個直徑約為1mm的光束中，發出波長為730nm、光脈衝(寬度)短於200fs的連續序列的鎖模鈦蘭寶石雷射器的近紅外輸出，用一個擴散光束的望遠鏡將其擴散，以便產生一個直徑約為50mm的準直光束。然後使用一塊100mm焦距、50mm直徑的雙凸單玻璃透鏡，將這個已擴散的光束聚焦到該凝膠塊上。然後，該凝膠塊被這樣定位，使得這個100mm焦距的透鏡的焦點落在深入該塊內部40mm的一個位置上。圖9清楚地表明，只有在該近紅外光束的焦點處才激發出來自香豆素480的螢光響應。由於介於雙光子激發以及瞬時雷射功率之間的平方關係，使得沿著該激發路徑在焦點之前和之後的諸位置上的激發變為可忽略不計。因此，在焦點區域以外，可能出現的激發或導致損傷的附帶的光激活很小，甚至沒有。同樣，由於該近紅外激發光在該凝膠中僅受到微弱的散射，使得在該凝膠塊內部很深的穿透深度上，仍能保持清晰的焦點。要注意的是，該焦點的清晰度取決於高斯光學特性；因此，通過改變用於光束擴散以及其後的重新聚焦的光學參數，就能很容易地調整共焦區域的長度。
如圖10所示，若將一個等效的激發過程施加於一個加有標記的腫瘤樣本，則也能得到類似的結果。這裡展示一張照片，表示均勻地分布於一塊小鼠癌變組織中的染料分子香豆素480的雙光子激發螢光。如圖9所示，圖中說明了一個被嚴格地定位的激活部位，即使該樣本具有極端高的光學密度。
用於診斷成像試劑的雙光子激發的激發源雙光子同時激發的截面積相當小，典型地它比一次等效的單光子激發過程大約小10萬倍，這就意味著典型地應當使用各種特定的光學激發源，以便有效地激發各種診斷試劑。通過增加瞬時入射功率並保持適度的平均功率水平，就能使用能提供高的峰值功率的光源，以便從實質上改善這種低效率的影響。事實上，準連續波鎖模雷射器，例如鎖模鈦蘭寶石雷射器，對於激發在光密樣本(例如生物組織)中的分子診斷試劑來說是很理想的。具體地說，這樣的雷射器能提供超過10kW的近紅外峰值功率，但其形式為非常高的重複頻率(＞25MHz的脈衝重複頻率)，超短(≈200fs的脈衝寬度)，低能量(每個脈衝≈1nJ)的脈衝系列；將平均雷射功率(約為10mW到2W量級)分割為高頻的超短脈衝系列產生一束激發光束，它對於激發雙光子螢光是極其有效的，但對各種生物材料基本上是無害的。鎖模的或其他高重複頻率的雷射器的準連續輸出跟各種調製方法也是高度兼容的，特別是在調製頻率大大地低於該雷射器的脈衝重複頻率的情況下，因為在後繼的解調過程中，該光源的脈衝性質可以被忽略。
鎖模鈦蘭寶石雷射器的一個特例大約從690nm到1080nm的波長範圍內連續可調，這很好地符合於對生物樣本而言的一個最小散射與吸收的區域。在這個波長範圍內的雙光子吸收也符合於這樣一個重要的單光子吸收區域，對許多可能的診斷成像試劑來說，是從345nm到540nm；儘管雙光子的選擇規則有時跟單光子的選擇規則很不一樣，但對單光子過程的強烈吸收可能預示著在波長為單光子波長的兩倍處，會出現顯著的雙光子吸收。
很明顯，除了鎖模鈦蘭寶石雷射器以外，各種其他的光源也可用於激發診斷成像試劑。尤其重要的是二極體雷射器，Nd:YAG和Nd:YLF雷射器，以及光參數振蕩器、放大器和發生器。脈衝二極體雷射器以其極端高的運行效率提供了誘人的性能，並可用於多種近紅外波長。鎖模的Nd:YAG和Nd:YLF雷射器分別在1064以及1047或1053nm的波長上，提供一種用以產生近紅外激發光的有效的、可靠的裝置。鎖模的光參數振蕩器、放大器和發生器能產生覆蓋著從大約500nm到大於3000nm的波長帶的光輻射；波長從1000nm到1800nm的可用性提供了一種實用裝置，它使用處于格外低的組織散射和吸收的波長帶內的光來激發諸診斷試劑，並且對於激活各種近紅外診斷試劑(即，那些具有超過500nm波長的單光子吸收帶)是特別有用的。同樣，其他各種脈衝的或鎖模的雷射器也都具有實用性，包括氬離子雷射器；氪離子雷射器；氦-氖雷射器；氦-鎘雷射器；紅寶石雷射器；Nd:YAP，Nd:YVO4，Nd:Glass以及Nd:CrGsGG雷射器；再生放大雷射器；Cr:LiSF雷射器；Er:YAG雷射器；F-中心雷射器；Ho:YAF與Ho:YLF雷射器；以及銅蒸氣雷射器。也可以使用各種連續波雷射器，但與使用脈衝雷射器時所獲得的效率相比，前者的效率是很低的。
來自診斷成像試劑的雙光子激發發光的檢測來自一種雙光子激發診斷成像試劑的涉及該發光原點的空間信息由該激發焦點進行編碼，並且可能與該激發焦點相關。這跟單光子激發成像方法包括那些基於光子遷移的方法在內相比是完全相反的，在單光子激發成像方法中，應當從沿著整個激發路徑產生的發光中，以及從散射的激發光所產生的發光中，小心地分離出該診斷成像信號。因此，對於從雙光子激發診斷試劑發出的光來說，沒有必要直接地和無散射地被檢測或成像。事實上，僅需以這樣一種方式來收集和檢測這種已發射的光的一部分，使得該收集和檢測過程不致於使介於檢測信號和發光原點之間的相關性發生畸變。
為了了解介於信號檢測以及雙光子激發發光原點之間的關係的重要性，考慮緊接著發光瞬間之後，所發出的光遇到什麼情形是有用的。當在一個光密樣本(例如生物組織)中成像時，來自雙光子激發診斷成像試劑的光將以一種基本上各向同性的方式發射出去。所發出的光的某些部分將直接地行進到安裝在遠離發光點處的一個檢測裝置那裡，與此同時，作為在發光和檢測之間出現的一個或多個散射事件的一個結果，某些其他部分將沿著一條迂迴的路逕行進到該檢測裝置。如果打算在一塊生物樣本中深度為10cm處成像，對於一個無散射的，或者彈道的已發射的光子來說，其渡越時間(這就是說，從發光瞬間算起到從該樣本的一個表面退出為止的總的渡越時間)將約為0.3ns；對於一個高度地散射的已發射的光子來說，這個渡越時間可以高達3-10ns。因此，為了得到在本例中的最高效率，人們希望在一段足以俘獲多數或全部的彈道的和高度散射的諸光子的時間內，對所有的已發出的光進行積分。這就意味著對於深度在10cm以內的成像來說，一個大約10ns的積分周期將是適當的，若通過移動或掃描該激發焦點相對於該樣本的位置來產生一幅圖像，則前面的分析意味著該激發點不應當以短於每10ns一次的頻度被移動。事實上，對掃描過程和機制的實際限制，結合涉及最小延遲時間以及附加的諸調製方法的可能應用的信噪比論點，要求使用超過1μs的延遲(dwell)時間來進行掃描。這樣一來，對於使用超過1μs的延遲時間以及1MHz以下的可能的調製頻率的基於亮度的成像來說，只要該檢測器被這樣放置，使得它能收集到該彈道的和散射的發光的一個重要的部分，那末它被定位於何處都沒有什麼差別(選擇檢測器相對於發光原點的位置，由此確定由於光學延遲所引入的時間長度，由於相對於其他測量參數來說，其渡越時間是很短的，所以對該檢測信號跟它的原點互相關聯的能力沒有什麼影響)。相應地，很明顯，該檢測器應該這樣來定位，使得它包括一種用該激發光束從外面照明(epi-illumination)的配置，或者它可能從外部被定位於該激發光束。要注意的是，該從外面照明的配置(或者其他各種可能的共線性激發與檢測配置)在檢測表面的或近表面的諸目標時，能將可能的視差損失減到最小，但這樣一種配置更容易受到來自彈性散射光或反射的激發光的幹擾。在外部檢測配置中，通過主動地對該檢測系統進行定向，使之與該激發點保持對準，通過使用多個檢測器的組合，其中每一個檢測器都個別地進行優化，以便從該樣本內部的不同區域收集所發出的光，或者通過將該檢測系統定位於離樣本足夠遠的地方，使得視差損失為最小，通過採取以上這些措施，可以使視差損失減到最小。
關於對來自雙光子激發診斷成像試劑的發光的檢測的討論已經集中到基於亮度的諸方法這一點上來，其中，通過將被檢測到的發光亮度跟一個樣本中的多個激發點中的激發位置互相關聯，就能建立一幅圖像。然而，基於亮度的諸方法並不總是最佳的，因為它們容易受到多種複雜化因素的影響，包括●由於樣本中的異質性使得激發光的散射與吸收發生變化-異質性，例如定位於該激發源以及預期的激發點之間的不正常的光學密度，可能轉化為在該預期的激發點上的有效激發水平中的不可預測的差異。通過沿著在不同程度上受到這種異質性的影響的若干激發路徑來獲得數據，隨後從所得到的多個數據集中進行反卷積濾波，可以改善由這種現象引起的各種偽跡，但對某些樣本來說，這將是困難的或者是不可能的。
●由於樣本中的異質性使得激發光的散射與吸收發生變化-異質性，例如定位於該發光點以及該檢測系統之間的不正常的光學密度，可能轉化為對從該激發點發出的光的收集效率的不可預測的差異。通過沿著在不同程度上受到這種異質性的影響的若干收集路徑來獲得數據，隨後從所得到的多個數據集中進行反卷積濾波，可以改善由這種現象引起的各種偽跡，但對某些樣本來說，這將是困難的或者是不可能的。
●由於跟形式或功能不直接相關的診斷成像試劑在濃度或局部環境方面的變化-在基於亮度的成像系統中，假設在整個樣本中發光水平的變化跟該樣本中的結構上的或生理學上的組織相關。然而，若該成像試劑在整個樣本內沒有被適當地分布，或者若其他諸因素，例如在該樣本內的局部環境中的異質性，以一種不能跟形式或功能相關的方式影響該成像試劑的發光，則從該樣本中獲得有意義的數據就變得更為困難。通過使用或通過設計不易受這些因素影響的成像試劑，可以改善由這種現象引起的各種偽跡，但對某些樣本來說，這將是困難的或者是不可能的。
一種不易受到樣本的光學異質性的影響的檢測方案可能是基於對激發態壽命的變化進行測量，而不是基於對發光亮度進行測量。激發態壽命是一種分子試劑的激發狀態及其最接近的環境的一種內在屬性，並且幸運地，壽命的精確測量的激發水平和收集效率除最粗大的變化之外不受其它影響。一種用於測量激發態壽命的簡便裝置使用相位光度計方法，以便將介於一個受調製的激發源以及所得到的發光信號之間的相位移跟壽命互相關聯。具體地說，前面關於光子渡越時間的討論意味著相位光度計方法適用於在光密介質中成像，尤其適用於壽命超過1-10ns的各種試劑。因此，若所用的診斷成像試劑具有跟該樣本內部的形式或功能相關的發光壽命，例如在一種結構內部存在氧或一種成像試劑的濃度時，會使該成像試劑的螢光淬滅，則基於壽命變化而不是基於發光亮度的成像就成為實際可行的。這樣一種基於壽命的方法對於雷射掃描顯微術以及對於延長的目標(例如一個病人的腫瘤)的遠程成像，都具有同等的適用性。
用於轉換亮度或基於相位的發光數據的適當的收集器件包括，但不局限於，光電倍增管，微通道平板器件，光電二極體，雪崩光電二極體，電荷耦合器件和電荷耦合器件陣列，電荷注入器件和電荷注入器件陣列，以及照相膠捲。
用於從診斷成像試劑中恢復雙光子激發發光的隆噪方法-調製與二次諧波檢測雙光子激發過程所固有的低效率可以轉化為散射的、不吸收的激發光對雙光子激發螢光發射的一個非常高的比率。而且，歸因於這個非常高的激發水平的其他可能的線性幹擾的重要性包括以下因素該試劑或者存在於待觀察樣品內的其他種類的單光子激發螢光，拉曼散射，以及其他現象，此外還有消除從環境光以及其他光學的或電子的噪聲源中各種幹擾的需求，所有這些都表明，一種受調製的激發方法，結合該檢測器信號的適當的解調將提供對幹擾的最佳鑑別，並改進對分析信號的恢復。事實上，若採用合適的調製和解調方法，包括在該雷射器的脈衝重複頻率上進行解調，則由Denk等人(見美國專利第5,034,613號)所報導的來自背景噪聲的幹擾可能被大大地免除；使用這樣的方法將顯著地改進他們的顯微鏡的信噪比(SNR)性能。一般來說，對實際上的採用一種或多種方法的任何測量來說，調製可以改進檢測性能(1)抑制連續背景噪聲或噪聲源-在Denk的雙光子雷射掃描顯微鏡的實例中，使用一種諸如鎖定放大器(LIA)或者一種外差式解調器的裝置，對激發源進行調製，並在其後對該檢測器信號進行解調，將對檢測系統產生限制，使其響應於與該調製頻率緊密相關的一個頻帶。通過控制該解調過程的相位靈敏度，將對那些不聯繫於或緊密地匹配於該調製模式的諸信號產生附加的鑑別力。因此，通過適當選擇調製頻率以及解調相位，來自諸如處於特定頻率上的室內燈光或電子噪聲，例如來自附近的電動機，的噪聲源的幹擾，將受到強有力的抑制。這個方案對於延長的諸目標(例如一個病人體內的腫瘤)的遠成成像，也是同等地有效的。
(2)抑制寬帶或「粉紅色噪聲」源-該測量環境，以及用於任何測量的電子設備和其他裝置，將寬帶噪聲，有時被稱為粉紅色噪聲，加入到任何測量。通過使用限制帶寬的檢測方法，就能大大地減少這種內部噪聲的影響。具體地說，對一次給定的光學測量來說，被觀測的信號電壓VSIGNAL被聯繫於由光子跟一個檢測器交互作用而產生的一個檢測器輸入電流iINPUT乘以輸入阻抗ZINPUT以及該檢測系統的增益G，根據下列公式VSIGNAL=iINPUT·ZINPUT·G,(1)而被觀測的噪聲電壓VNOISE，可以近似地表示為該噪聲電流iNOISE，該輸入阻抗，該檢測系統的電子的或光學的帶寬B的平方根，以及該增益的乘積，根據下列公式VNOISE=iNOISE·ZINPUT·B1/2·G. (2)由此，可以從這兩個電壓的比值(VSIGNAL/VNOISE)來估計信噪比(SNR)。當一個典型的光學檢測器，例如一個光電倍增管(PMT)，被用來檢測一個未調製的螢光信號時，這個檢測器將產生一個確定的信號電平，此外還有一個噪聲電流。對一個示例性的PMT來說，例如型號為Hamamatsu R928這一種(7.4×105A/W輻射陽極靈敏度)，一個10pW水平的光輸入將產生7.4μA的iSIGNAL。若這個信號電流在一個具有一個100的增益，一個50Ω的輸入阻抗，一個5 nV/√Hz的輸入噪聲電平，以及一個1MHz的帶寬的低噪聲放大器中被轉換為電壓，則將產生下列諸信號VSIGNAL=7.4μA·50Ω100=37mV；VNOISE=5nV/√Hz·(107Hz)1/2·100=1.6mV.
要注意的是，已經用公式2所示的噪聲電流和阻抗來代替歐姆定律，或V=i*R。因此，對這個寬帶的實例來說，SNR=23。若這個激發能量受到調製，例如採用1MHz的正弦波並具有一個100％的調製深度，則該VSIGNAL的數值將降低到18.5mV(假設通過周期的衰減或其他基於損耗的調製方法來引入這種調製，導致平均功率的總損耗為50％，而峰值激發功率不變)。但若該檢測系統採用具有1kHz帶寬的在1MHz頻率上的限制帶寬解調方法，則該粉紅色噪聲的減小比信號快很多VNOISE=5nV/√Hz·(103Hz)1/2·100=16μV，並且總的信噪比(SNR)增加到大約1200。因此，當使用多種調製方式時，雖然損失了某些信號強度，但是在信噪比方面總的增加用來補償這個損失已顯得綽綽有餘。還有，若在該檢測器的響應中存在任何線性幹擾，例如來自漏到該檢測器的環境光，則該寬帶檢測方案將把這個當作一個附加的噪聲源加以檢測，而該受調製的、限制帶寬的方案將抑制這種幹擾。假設環境漏光在PMT上產生1μA的背景信號，它轉化為5mV的背景信號。對於未調製的情形來說，來自這個背景的光學散彈噪聲B，等於被檢測到的總光子的平方根，並且SNR≈S/(S+B)1/2；這產生一個約為5.7的SNR估計值。值得注意的是，這個信噪比數值對於受調製的情況基本上是不變的。這個分析對於雷射掃描顯微術以及對於延長的諸目標(例如一個病人體內的腫瘤)的遠程成像，都是同等地有用的。
(3)在調製頻率上抑制線性幹擾-作為雙光子激發過程所固有的低效率的一個結果，散射的、不吸收的激發光對雙光子激發螢光發射的比值通常很高。這包括在該調製頻率上的線性幹擾，它們來自彈性的和非彈性的散射，也來自單光子激發螢光。在用頻譜方法將雙光子發光從這些光學背景現象中區分出來的努力中，光學過濾器(濾色鏡)被頻繁地使用。不幸的是，單純地使用頻譜方法，要消除這些幹擾是格外困難的，甚至是不可能的。作為一種忽略這些殘留的幹擾源的變通方案，一種用於恢復純粹雙光子信號的常用方案，利用在幾種激發功率水平上該檢測信號對激發功率水平的回歸，使得可以用數學方法從各種線性幹擾中抽取該二次的雙光子激發螢光分量；這裡利用了一個總螢光響應If的模型，它由下式給出If=αIL+βI2L(3)式中，IL為瞬時激發亮度，α為針對各種線性效應的一個比例常數，β為針對雙光子激發螢光的一個比例常數。這種基於回歸的方法適於在實驗室使用，在那裡每單位時間所需進行測量的次數是很少的，但例如在多點掃描光學成像的情況下，它就顯得很費時、複雜和不實用，因此總的數據採集時間應當減到最小。通過使用時間抑制方法，例如二次諧波檢測，它不需要在幾種功率水平上進行多次測量，這樣就能得到更快的結果。Freeman等人(R.G.Freeman,D.L.Gililand以及F.E.Lytle，「正弦調製的雙光子激發螢光的二次諧波檢測」，分析化學，62(1990)2216-2219)講授了用於化學樣本分析的二次諧波檢測方法，其中，該激發源的正弦調製被用來產生一個僅跟雙光子激發螢光有關的、頻率為調製頻率兩倍的信號。一個參考於該調製頻率的鎖定放大器被用來在該調製頻率的二次諧波上恢復該純粹的雙光子信號。該二次諧波螢光信號僅佔所產生的全部雙光子螢光的大約12％，改進了的對線性幹擾的抑制用來補償絕對信號電平的損失是綽綽有餘的，這將導致總的信噪比的增加。因此，作為它在抑制散射(信號)方面的內在效率以及它的高的數據帶寬潛力的一個結果，這種二次諧波檢測方法在用於雷射掃描顯微術和用於延長的目標(例如一個病人體內的腫瘤)的遠程成像時是很理想的。這些優點意味著，一個使用二次諧波檢測方法的成像系統可以在每一點上以最小的延遲時間，並且在每一點上針對每一次測量使用最大激發功率來獲得純粹的雙光子激發發光信號。
不管是基於發光亮度的測量，還是基於激發態壽命的測量來獲得數據，前面所列舉的在雙光子激發診斷成像中使用調製方法的優點都同樣地得到很好的應用。事實上，採用相位光度計方法進行壽命測量是最現成和最靈敏的，這個方法基於對介於一個調製波形以及該檢測信號之間的相位移的測定。因此，很明顯，各種調製方法，包括那些基於二次諧波檢測的方法，在雙光子激發螢光的有效檢測中具有重要的用途，在這裡它們被用來消除來自環境的和儀器的噪聲源的幹擾，以及來自在被觀察的樣本內部所出現的散射和其他現象的幹擾。對於諸如人體組織這樣的光密介質來說，散射的、不吸收的激發光對雙光子激發螢光發射的極端高的比值使得這種方法的應用成為不可缺少的。因此，對於臨床的影像應用或者對於雙光子雷射掃描顯微術來說，使用這裡所描述的各種調製方法通常是有利的。
在雙光子激發成像中的對照試劑-內源的和外源的諸試劑前面的討論已經表明，可以使用非線性的雙光子激發來實現存在於光密介質中的可用光學方法激發的分子試劑在特異性和穿透深度方面的重大改進，還表明，通過在各自的激發和檢測過程中使用各種編碼和解碼方法可以改進檢測性能。當使用雙光子方法時，可能的激發的特別好的空間定位可以被用來顯著地改進在該激發點處的對比度。一旦實現了這種局部化的激發，就可以用多種檢測裝置來檢測由此發出的分析光。若這個激發點相對於待觀察的樣品發生移動，例如通過掃描該焦點相對於該樣品的位置，或者通過掃描該樣品相對於該焦點的位置，則藉助於在激發點位置以及由此產生的光發射之間建立相關，就能產生該樣品的一個二維或三維圖像。然而，在這個圖像中，有用的對比度也依賴於用於發光的該分子試劑或諸試劑在濃度或局部環境方面的差異的存在。這些試劑對該樣品而言可以是內源性的或外源性的，並且最後基於在它們的局部化的發光特性中的對比度來成像，上述局部化的發光特性可以跟該樣品內部在結構上或功能上的異質性相關。因此，重要的是，在非線性診斷成像中還要仔細地考慮這些對照試劑的作用。
各種內源性的生色試劑可用於診斷成像，特別是用於患病組織的診斷成像。由於介於患病的和未患病的諸組織之間，在高等動物中介於各種內部的基礎結構以及各種器官之間，或者介於健康或亞健康組織的不同範圍之間的結構上或生理學上的差異，使得各種天然生色試劑，例如芳香族胺基酸、蛋白質、核酸、細胞能量交換補給物(例如三磷酸腺苷)、酶、激素或者其他試劑的濃度或局部環境，能夠以一種對探測結構上或功能上的異質性有用的方式發生改變。因此，可以用雙光子激發方法無損傷地探測到異質性的這些內源性的指示劑。
不幸的是，在許多情況下，用這樣的試劑可能得到的特異性不適於獲得有意義的診斷圖像，因此必須將各種外源性的試劑加入到該樣品中去。傳統的各種外源性試劑在給藥之後半選擇性地分配到一件樣品的特定組織、器官或其他諸結構單元中去。這些試劑的給藥路線典型地是局部的敷用或者經由系統的給藥。在理想條件下，這些試劑將分配到、或聚集於感興趣的結構之上或之中，或者可以優先地排除在這些結構之外。這種聚集可能是直接在表面結構上孤立地局部敷用(某種試劑)的結果，或者是導致將該試劑分配到該結構之中的該結構在物理或化學諸特性上的內在差異的結果。由此，介於高濃度區域和低濃度區域之間的對比可以被用來作為探測結構上或生理學上的異質性的一個基礎。另一方面，外源性試劑可以瀰漫於整個樣品之中；若它們的發光特性，例如顏色變換、淬滅、或者壽命，對生理學上的異質性敏感的話，則該對照試劑的這些參數可以被用來作為成像對比的基礎。
由於一種分子試劑的發光特性取決於該激發態及其環境的基本特性，所以，負責使該試劑達到激發態的這種機制對該激發態的發光特性沒有顯著的影響。因此，在單光子激發條件下工作得很好的一種分子診斷或對照試劑，可以被期待在雙光子激發條件下也展現出類似的表現。一般來說，對單光子激發有用的任何對比試劑都可以用於雙光子激發，在這裡，對激發部位的強化控制將用於改進圖像的解析度。適當的對比試劑包括許多用作生物染料或著色劑、以及那些用於光能療法(PDT)的分子試劑。標準的PDT試劑具有組織特異性，一般來說，它們基於該試劑和該組織(例如一種癌變損傷)的綜合化學與物理特性。這些試劑是光能的有效吸收劑，並且在許多情況下是發光的。例如，●補骨脂素及其衍生物(包括5-甲氧基補骨脂素〔或5-MOP〕；8-甲氧基補骨脂素〔8-MOP〕；4,5』,8-三甲基補骨脂素〔TMP〕；4』-氨甲基-4,5』,8三甲基補骨脂素〔AMT〕；4』-羥甲基-4,5』,8三甲基補骨脂素〔HMT〕；5-氯甲基-8-甲氧基補骨脂素，當歸根素(異補骨脂素)；5-甲基當歸根素〔5-MIP〕；以及3-乙氧基醯基基補骨脂素)；●各種卟啉以及血卟啉衍生物(包括血卟啉衍生物〔HPD〕；PhotofrinⅡ；苯並卟啉衍生物〔BPD〕；原卟啉Ⅸ〔PpⅨ〕；染料血卟啉醚〔DHE〕；多血卟啉酯類〔PHE〕；原卟啉的13,17-N,N,N-二甲基乙基乙醇胺酯〔PHl008〕；四(3-羥苯基)-卟啉〔3-THPP〕；四苯基卟啉單磺酸鹽〔TPPS1〕；四苯基卟啉二磺酸鹽〔TPPS2a〕；二血卟啉醚；meso-苯基卟啉；以及meso-四(4N-甲基吡啶基)卟啉〔T4MPyP〕，還有各種四氮雜卟啉(包括八(4-叔丁基苯基)四吡嗪紫菜嗪〔OPTP〕；四(4-叔丁基)酞菁〔t4-PcH2〕；以及四(4-叔丁基)酞菁鎂〔t4-PcMg〕；●各種酞菁衍生物(包括氯化鋁酞花青磺化的酞菁〔CASPc〕；氯化鋁酞花青酞菁四硫酸鹽〔AlPcTS〕；單，二，三和四磺化的鋁酞菁〔包括AlSPc,AlS2Pc,AlS3Pc和AlS4Pc〕；矽酞菁〔SiPcⅣ〕；鋅(Ⅱ)酞菁〔ZnPc〕；雙(二異丁基十八烷基甲矽烷氧基)矽2,3-萘酞菁〔isoBOSINC〕；以及鍺(Ⅳ)-八丁氧基酞菁；●各種若丹明衍生物(包括若丹明101〔Rh-101〕；若丹明110〔Rh-110〕；若丹明123〔Rh-123〕；若丹明19〔Rh-19〕；若丹明560〔Rh-560〕；若丹明575〔Rh-575〕；若丹明590〔Rh-590〕；若丹明610〔Rh-610〕；若丹明640〔Rh-640〕；若丹明6G〔Rh-6G〕；若丹明700〔Rh-700〕；若丹明800〔Rh-800〕；若丹明B〔Rh-B〕；磺基若丹明640或101；以及磺基若丹明B)；●各種香豆素衍生物(包括香豆素1,2,4,6,6H,7,30,47,102,106,,120,151,152,152A,153,311,307,314,334,337,343,440,450,456,460,461,466,478,480,481,485,490,500,503,504,510,515,519,521,522,523,535,540,540A,548)；●各種苯並吩噁嗪衍生物(包括5-乙氨基-9-二乙氨基苯並[a]吩噁嗪鎓鹽〔EtNBA〕；5-乙氨基-9-二乙氨基苯並[a]吩噻嗪鎓鹽〔EtNBS〕；以及5-乙氨基-9-二乙氨基苯並[a]吩硒嗪鎓鹽〔EtNBSe〕)；●氯丙嗪及其衍生物；●各種葉綠素以及細菌葉綠素衍生物(包括細菌二氫卟酚a〔BCA〕)；●各種金屬-配基絡合物，例如二氯化三(2,2』-雙吡啶)釕(Ⅱ)(RuBPY)；●脫鎂葉綠甲酯-酸a〔Pheo a〕；部花青540〔MC 540〕；維生素D；5-氨基-乙醯丙酸〔ALA〕；photosan；二氫卟酚e6，二氫卟酚e6亞乙基二醯胺，以及單-L-天冬氨醯基二氫卟酚e6；脫鎂葉綠甲酯-酸-a〔Ph-a〕；吩噁嗪尼羅藍衍生物(包括各種吩噁嗪染料)；●各種電荷轉移和輻射轉移試劑，例如芪，芪衍生物以及4-(N-(2-羥乙基)-N-甲基)-氨基苯基)-4』-(6-羥基己基磺醯基)芪(APSS)；以及●許多其他光活性試劑。
一般來說，這些試劑將積累在或接近於一個敷用點或者半選擇性地處於一個特定的組織之中，這是由於該組織在物理和化學特性方面的差異，從而導致該PDT試劑分配到該組織之中；一旦積累起來，這樣的試劑將容易受到雙光子激發，並且它們的發光和其他的發射特性可以用於採集圖像數據。也可以使用其他能吸收光並且隨後能將能量轉移到一種或多種其他試劑的光活性試劑，這些試劑可以單獨使用，也可以跟一種或多種反應性試劑配合使用，後者能夠接受被轉移過來的能量，並將它轉換為一種輻射的發光。
在雙光子激發成像中的生物性對照試劑在理想條件下，標準的對照試劑基於對特定組織的化學的或者物理的親和力導出目標特異性。這樣一來，對照試劑將分配到或聚集於感興趣的組織之上或之中。不幸的是，這種目標特異性通常是不完全的。事實上，人們希望建立一種改進的方法，用以增加在尋找試劑目標時的特異性。一種在特異性方面獲得這樣的改進的方法是基於利用在結構、功能或者疾病方面的特定的生物學的特徵。例如，通過將反義寡核苷酸試劑結合到一個或多個光活性部分，例如FITC，就可以產生新的生物性對照試劑，它們僅能選擇性地標記含有互補的遺傳密碼的特定細胞(例如癌細胞)。而且，通過改變用於該生物性探測器的寡聚密碼，就能很容易地將這個基本方案推廣應用到多種基於遺傳的疾病或者其他紊亂症狀。使用雙光子激發使得這個強有力的方案在應用中，將起源於生物的探測器的生物特異性跟雙光子同時光激活過程所固有的高度的空間定位能力結合起來。因此，使用針對一種特定的器官、組織或損傷具有特異性的各種試劑，在基因水平上獲得非常高的對比度、非常高的解析度的圖像將成為可能。
一種用於起源於生物性探測器的最佳設計利用具有隨著生物性試劑以及該目標部位之間的複合而變化的發光特性的一個或多個光活性部分。具體地說，基於複合的發光波長或壽命的變化可以被用來增加該一般方法的靈敏度，因為這樣的變化有助於增加介於含有複合試劑的區域以及含有未複合試劑的區域之間的對比度。一個例子是，一種基於一個光活性部分的生物性試劑，在複合發生之前它一直是淬滅的，基於其上的發光將變為不淬滅的。另一個例子是，一種基於一個添加的光活性部分的試劑，例如補骨脂素，它被束縛到一個反義基因序列之中；當在該反義序列以及它的目標序列之間發生複合時，由於添加了光活性部分，使得該光活性部分在發光特性上出現顏色偏移。
從前面的討論中很清楚地看出，基於其他的生物特異方法(例如免疫學方法)，而不是單純地基於基因方法的導向方法，也被本發明的範圍所涵蓋。具體地說，基於各種抗原-抗體方法(在這裡，一個抗體探測器被結合到一個光活性組)的試劑特異性，為疾病和感染的診斷提供了一種強有力的新方法。在試劑導向的過程中用於獲得生物特異性的附加方法包括，但不局限於，使用配基、半抗原、碳水化合物、脂類、蛋白質受體或者各種複合試劑、螯合劑、以及膠囊載體，例如脂質體、fullerenes、冠醚，以及環糊精。
本發明的第一個示例性實施例因此，本發明的一個特定的優選實施例就是使用波長約為通常的單光子光激活所需波長兩倍的近紅外光源輸出，對存在於一個樣品中的內源性或外源性診斷成像試劑進行雙光子同時光激活。這個優選的實施例示於圖11。近紅外光源108產生一束近紅外輻射光束110，它由一系列的快速的高峰值功率的近紅外輻射脈衝組成。例如，標準的市售鎖模鈦蘭寶石雷射器就能夠輸出寬度＜200fs、脈衝能量約為20nJ、脈衝重複頻率超過75MHz的鎖模脈衝；這個光源產生一束準連續光束，它具有相當低的平均功率(僅為幾個瓦特)和高的峰值功率(為100kW量級)，其波長可以在大約690-1080nm的近紅外波長帶內連續地調諧。由該近紅外光源108發出的脈衝序列構成了一束近紅外輻射光束110，使用標準的光學裝置，例如反射的或折射的光學裝置112，就能容易地使之聚焦。隨後，已聚焦的近紅外光束114就被投射到一個待成像的樣品116之上。由於僅出現於焦點處的高的瞬時輻射水平，使得該診斷成像試劑的雙光子同時光激活基本上將被限制在該聚焦光束114的共焦區域118之內。被該樣品116所散射的激發光120將不具有為顯著地激發處於該共焦區域118以外的區域中的任何診斷成像試劑所需的足夠的瞬時輻射水平。位於該共焦區域118中的診斷成像試劑分子所發出的光122將以一種基本上各向同性的方式從該共焦區域118射出。所發出的光124中的一部分被一個檢測裝置126(例如一個被安裝在該樣品116內側或外側一個位置上的光電倍增管)所俘獲。這個檢測裝置126配有一個波長選擇裝置128，例如一個光學帶通濾波器，該濾波器用來以這樣一種方式對該發射光124的被俘獲部分進行預處理該選擇裝置128拒斥彈性的散射光中的大部分，但允許符合於該診斷試劑的原理特性所規定的波長或諸波長的光的大部分得以通過。由此，從該檢測裝置126發出的信號130被一個處理器裝置132所俘獲，其主要用途就是將來自診斷成像試劑的發光響應作為該共焦區域118的位置的一個函數加以記錄。通過在該樣品116的整個體積內對該共焦區域118的位置進行掃描，並通過將該處理器裝置132的內容作為該共焦區域118的位置的一個函數來觀察，就能獲得該樣品116的一個完整的圖像。這個圖像可以被用來識別感興趣的區域134，例如皮下腫瘤或者其他患病區域。
本發明的第二個示例性的實施例作為對這個優選實施例的一種變通方案，可以將一個調製裝置納入到圖11所示的一般的實施例之中；這樣的調製裝置可以被用來改進該成像系統總的性能，例如改進對環境的或儀器的噪聲源的抑制，在二次諧波上恢復純粹的雙光子激發發光，或者使用相位光度計方案使發光的檢測易於進行。具體地說，圖12表示一個調製裝置136，例如一個電-光或聲-光調製器，一個斬波器，或者其他裝置，它被這樣定位，使得它能跟由該近紅外光源108所發出的近紅外輻射光束110交互作用，該調製裝置可以被用來按照一種調製模式對該近紅外輻射光束110進行編碼，而該調製模式則被寄存在向該調製裝置136提供一個驅動信號140的調製器驅動器138的輸出端處。隨後，正如前面針對圖11所描述的那樣，將由此產生的近紅外輻射142的調製光束投射到樣品上。由此產生的該雙光子激發發光144將以一種基本上各向同性的方式從該共焦區域118射出。然而，跟前面針對圖11所描述的類似的發光122相對照，這個發光144將展現出一種調製現象，它基本上同步於該被調製的近紅外輻射光束142的調製，而該光束142又依次地同步於由該調製器驅動器138所發出的驅動信號140。已調製的發射光146中的一部分被一個檢測裝置126(例如一個被安裝在該樣品116內側或外側一個位置上的光電倍增管)所俘獲。這個檢測裝置126配有一個波長選擇裝置128，例如一個光學帶通過濾器，該濾波器用來以這樣一種方式對該已調製的發射光146的被俘獲部分進行處理使得該選擇裝置128拒斥彈性的散射光中的大部分，但允許符合於該診斷試劑的原理特性所規定的波長或諸波長的光的大部分得以通過。由此，從該檢測裝置126發出的已調製信號148被一個處理器裝置150所俘獲。該處理器裝置150服務於兩個主要用途，其一是用由該調製器驅動器138發出的解調參考輸出信號152去解調由該檢測裝置126所發出的已調製信號148，其二是將已解調的來自該診斷成像試劑的發光響應作為該共焦區域118的位置的一個函數加以記錄。因此，通過在該樣品116的整個體積內對該共焦區域118的位置進行掃描，並通過將該處理器裝置150的內容作為該共焦區域118的位置的一個函數來觀察，就能獲得該樣品116的一個完整的圖像。這個圖像可以被用來識別感興趣的區域134，例如皮下腫瘤或者其他患病區域。
本發明的第三個示例性的實施例作為對這個優選實施例的第二個變通方案，可以用一束未經聚焦的近紅外輻射光束去照射一個樣品的表面特徵以便提供一種用於檢測的直接成像裝置。這示於圖13。具體地說，使用一個近紅外光源的輸出，例如鎖模鈦蘭寶石雷射器，使用波長約為通常單光子光激活所需波長的兩倍的光，可以對位於或靠近一個樣品表面的內源性或外源性診斷成像試劑進行雙光子同時光激活。該近紅外光源108產生一束由一系列快速的高峰值功率近紅外輻射脈衝組成的近紅外輻射光束110。用一個調製裝置136對這個光束進行調製，該調製裝置被這樣定位，使得它能跟由該近紅外光源108所發出的近紅外輻射光束110交互作用。該調製裝置136可以被用來按照一種調製模式對該近紅外輻射光束110進行編碼，而該調製模式則被寄存在向該調製裝置136提供一個驅動信號140的調製器驅動器138的輸出端處。隨後，使用標準的光學裝置，例如反射的或折射的光學裝置154，對由此產生的該已調製的近紅外輻射光束142進行去聚焦，以便產生一束髮散的激發光束156，它被投射到待成像的一件樣品116之上。位於或靠近該樣品116的表面的診斷成像試劑的雙光子同時光激活產生已調製的雙光子激發發光144，它具有這樣一種調製方式，即它基本上同步於該被調製的近紅外輻射光束142的調製，而該光束142又依次地同步於由該調製器驅動器138所發出的驅動信號140。已調製的發射光146中的一部分被一個圖像檢測裝置158(例如一個被安裝在該樣品116外側一個位置上的電荷耦合器件陣列)所俘獲。這個圖像檢測裝置158配有一個波長選擇裝置128，例如一個光學帶通過濾器，該濾波器用來以這樣一種方式對該已調製的發射光146的被俘獲部分進行處理使得該選擇裝置128拒斥彈性的散射光中的大部分，但允許符合於該診斷試劑的原理特性所規定的波長或諸波長的光的大部分得以通過。從該圖像檢測裝置158發出的已調製信號160被一個處理器裝置162所俘獲。該處理器裝置162服務於兩個主要用途，其一是用由該調製器驅動器138發出的解調參考輸出信號152去解調由該圖像檢測裝置158所發出的已調製信號160，其二是將已解調的來自該診斷成像試劑的發光響應作為發光位置的一個函數加以記錄。因此，這個變通的實施例基於跨越該樣品116的被照射表面的雙光子激發發光中的空間差異，就能實現表面特徵164(例如皮膚癌損傷)的直接視頻圖形成像。
應當這樣理解，以上所描述的諸要素中的每一個，或者兩個或者更多個加在一起，也可以在不同於上述諸類型的其他結構或應用類型中，找到有用的用途。
本發明作為一種用以改進分子診斷成像試劑的光激活的選擇性的一般方法而加以實施，對此已經作了圖解和說明，但不打算將它局限於所示的諸細節之內，因為人們應當懂得，專業人士在不以任何方式背離本發明的精神實質的前提下，可以對所說明的本方法的形式以及細節及其運作作出各種省略、修改、替代以及改變。例如，在第三個示例性的實施例中，為了生成一個更簡單的成像裝置，可以省略有關調製與解調的諸細節，雖然這種示例性的修改會導致在成像性能方面的整體降低。
用不著進一步的分析，上文已經如此充分地揭示了本發明的要點，使得他人，通過運用現有知識，就能現成地將它用於各種用途，並且從現有技術的觀點來看，不致於遺漏那些清楚地構成本發明的一般或特殊方面的重要特徵的特點。
在所附的權利要求書中，陳述了那些新的並且希望受到專利保護的各項權利要求。
權利要求
1．一種用於對植物或動物組織的一個特定體積進行成像的方法，其中該植物或動物組織含有至少一種光活性分子試劑，該方法包括下列諸步驟(a)用足以激勵包含於該植物或動物組織的該特定體積之中的光活性分子試劑進入雙光子同時激發狀態的光來處理該植物或動物組織的該特定體積；(b)對包含於該植物或動物組織的該特定體積之中的至少一種光活性分子試劑進行光激活，由此產生至少一種已被光激活的分子試劑，其中該至少一種已被光激活的分子試劑發射能量；(c)檢測由該至少一種已被光激活的分子試劑發射的能量；(d)產生一個已檢測的能量信號，它是該植物或動物組織的該特定體積的特徵所在。
2．如權利要求1所述方法，其中該足以激勵至少一種光活性分子試劑進入雙光子同時激發狀態的光是雷射。
3．如權利要求1所述方法，其中該足以激勵光活性分子試劑進入雙光子同時激發狀態的光是一束聚焦光束。
4．如權利要求4所述方法，其中該聚焦光束是聚焦的雷射束。
5．如權利要求1所述方法，還包括用至少一種光活性分子試劑來處理該植物或動物組織的第一步驟，其中，該植物或動物組織的該特定體積保留該至少一種光活性分子試劑中的至少一部分。
6．如權利要求5所述方法，其中該至少一種光活性分子試劑是從由下列各種光活性分子試劑組成的小組中選出的，它們是補骨脂素，5-甲氧基補骨脂素〔5-MOP〕,8-甲氧基補骨脂素〔8-MOP〕,4,5』,8-三甲基補骨脂素〔TMP〕,4』-氨甲基-4,5』,8-三甲基補骨脂素〔AMT〕,5-氯甲基-8-甲氧基補骨脂素〔HMT〕，當歸根素(異補骨脂素)，5-甲基當歸根素〔5-MIP〕,3-羧基補骨脂素，卟啉，血卟啉衍生物〔HPD〕,PhotofrinⅡ，苯並卟啉衍生物〔BPD〕，原卟啉Ⅸ〔PpⅨ〕，染料血卟啉醚〔DHE〕，多血卟啉酯類〔PHE〕，原卟啉的13,17-N,N,N-二甲基乙基乙醇胺酯〔PH1008〕，四(3-羥苯基)-卟啉〔3-THPP〕，四苯基卟啉單磺酸鹽〔TPPS1〕，四苯基卟啉二磺酸鹽〔TPPS2a〕，二血卟啉醚，meso-四苯基卟啉，meso-四(4N-甲基吡啶)卟啉〔T4MPyP〕，八(4-叔丁基苯基)四吡嗪紫菜嗪〔OPTP〕，四(4-叔丁基)酞菁〔t4-PcH2〕，四(4-叔丁基)酞菁鎂〔t4-PcMg〕，氯化鋁酞花青磺化的酞菁〔CASPc〕，氯化鋁酞花青酞菁四硫酸鹽〔AlPcTS〕，單磺化的鋁酞菁〔AlSPc〕，二磺化的鋁酞菁〔AlS2Pc〕，三磺化的鋁酞菁〔AlS3Pc〕，四磺化的鋁酞菁〔AlS4Pc〕，矽酞菁〔SiPcⅣ〕，鋅(Ⅱ)酞菁〔ZnPc〕，雙(二異丁基十八烷基甲矽烷氧基)矽2,3-萘酞菁(naphthalocyanine)〔isoBOSINC〕，鍺Ⅳ八丁氧基酞菁〔GePc〕，若丹明101〔Rh-101〕，若丹明110〔Rh-110〕，若丹明123〔Rh-123〕，若丹明19〔Rh-19〕，若丹明560〔Rh-560〕，若丹明575〔Rh-575〕，若丹明590〔Rh-590〕，若丹明610〔Rh-610〕，若丹明640〔Rh-640〕，若丹明6G〔Rh-6G〕，若丹明700〔Rh-700〕，若丹明800〔Rh-800〕，若丹明B〔Rh-B〕，磺基若丹明101(sulforhodamine 101)，磺基若丹明640，磺基若丹明B，香豆素1，香豆素2，香豆素4，香豆素6，香豆素6H，香豆素7，香豆素30，香豆素47，香豆素102，香豆素106，香豆素120，香豆素151，香豆素152，香豆素152A，香豆素153，香豆素311，香豆素307，香豆素314，香豆素334，香豆素337，香豆素343，香豆素440，香豆素450，香豆素456，香豆素460，香豆素461，香豆素466，香豆素478，香豆素480，香豆素481，香豆素485，香豆素490，香豆素500，香豆素503，香豆素504，香豆素510，香豆素515，香豆素519，香豆素521，香豆素522，香豆素523，香豆素535，香豆素540，香豆素540A，香豆素548,5-乙氨基-9-二乙氨基苯並[a]吩噁嗪鎓鹽〔EtNBA〕,5-乙氨基-9-二乙氨基苯並[a]吩噻嗪鎓鹽〔EtNBS〕,5-乙氨基-9-二乙氨基苯並[a]吩硒嗪鎓鹽〔EtNBSe〕，氯丙嗪，氯丙嗪衍生物，葉綠素衍生物，細菌葉綠素衍生物，金屬-配基絡合物，三氯化二(2,2』-雙吡啶)釕(Ⅱ)(RuBPY)，二氯化三(2,2』-雙吡啶)銠(Ⅱ)(RhBPY)，二氯化三(2,2』-雙吡啶)鉑(Ⅱ)(PtBPY)，脫鎂葉綠甲酯-酸a，部花青540，維生素D,5-氨基-乙醯丙酸，photosan，二氫卟酚e6，二氫卟酚e6亞乙基二醯胺，單-L-天冬氨醯基二氫卟酚e6，吩噁嗪尼羅藍衍生物，芪，芪衍生物，4-(N-(2-羥乙基)-N-甲基)-氨基苯基)-4』-(6-羥基己基磺醯基)芪(APSS)，以及標準的生物染料和著色劑。
7．如權利要求5所述方法，其中該至少一種光活性分子試劑是對處於該植物或動物組織的特定體積之中的一種特定組織具有特異性的至少一種生物性光活性分子試劑。
8．如權利要求7所述方法，其中該至少一種生物性光活性分子試劑包括從由下列各種光活性分子試劑組成的小組中選出的一個片段，它們是DNA,RNA，胺基酸，蛋白質，抗體，配基，半抗原，碳水化合物受體或複合試劑，脂類受體或複合試劑，蛋白質受體或複合試劑，螯合劑，以及膠囊載體。
9．如權利要求8所述方法，其中該至少一種生物性光活性分子試劑還包括當受到足以激勵它進入一種雙光子激發狀態的光(的照射)時被光激活的一個片段。
10．如權利要求1所述方法，用足以激勵包含於該植物或動物組織的該特定體積之中的至少一種光活性分子試劑進入雙光子同時激發狀態的光來處理該植物或動物組織的該特定體積的步驟包括下列諸步驟(a1)用一種特定類型的調製(方式)從光源對光進行調製，由此產生一束已調製光；以及(a2)用足以激勵包含於該植物或動物組織的該特定體積之中的至少一種光活性分子試劑進入雙光子同時激發狀態的已調製光來處理該植物或動物組織的該特定體積；還包括下列諸步驟(e)對具有該特定類型的調製(方式)的該已檢測的能量信號進行解調；以及(f)產生一個已解調的能量信號，它是該植物或動物組織的特定體積的特徵所在。
11．如權利要求10所述方法，其中對具有該特定類型的調製(方式)的該已檢測的能量信號進行解調的步驟包括在一個兩倍於該特定類型的調製(方式)的頻率上對已檢測的能量信號進行解調，由此檢出該特定類型的調製(方式)的二次諧波。
12．如權利要求10所述方法，其中作為該植物或動物組織的特定體積的特徵的該已解調的能量信號，代表了存在於該植物或動物組織的特定體積之中的至少一種光激活分子試劑的壽命的變化。
13．一種用於對材料中的一個特定體積進行成像的方法，其中該材料含有至少一種光活性分子試劑，該方法包括下列諸步驟(a)用足以激勵包含於該材料的該特定體積之中的至少一種光活性分子試劑進入雙光子同時激發狀態的光來處理該材料的該特定體積；(b)對處於該材料的該特定體積之中的至少一種光活性分子試劑進行光激活，由此產生至少一種已被光激活的分子試劑，其中該至少一種已被光激活的分子試劑發射能量；(c)檢測由該至少一種已被光激活的分子試劑所發射的能量；以及(d)產生一個已檢測的能量信號，它是該材料的該特定體積的特徵所在。
14．權利要求13中，該材料是從由植物組織和動物組織所組成的小組中選出的。
15．如權利要求13所述方法，其中該足以激勵至少一種光活性分子試劑進入雙光子同時激發狀態的光是雷射。
16．如權利要求13所述方法，其中該足以激勵至少一種光活性分子試劑進入雙光子同時激發狀態的光是一束聚焦光束。
17．如權利要求16所述方法，其中該聚焦光束是聚焦的雷射束。
18．如權利要求13所述方法還包括用至少一種光活性分子試劑來處理該材料的一個第一步驟，其中，該材料的特定體積保留該至少一種光活性分子試劑中的至少一部分。
19．如權利要求18所述方法，其中該至少一種光活性分子試劑是從由下列各種光活性分子試劑組成的小組中選出的，它們是補骨脂素，5-甲氧基補骨脂素〔5-MOP〕,8-甲氧基補骨脂素〔8-MOP〕,4,5』,8-三甲基補骨脂素〔TMP〕,4』-氨甲基-4,5』,8-三甲基補骨脂素〔AMT〕,5-氯甲基-8-甲氧基補骨脂素〔HMT〕，當歸根素(異補骨脂素)，5-甲基當歸根素〔5-MlP〕,3-羧基補骨脂素，卟啉，血卟啉衍生物〔HPD〕,PhotofrinⅡ，苯並卟啉衍生物〔BPD〕，原卟啉Ⅸ〔PpⅨ〕，染料血卟啉醚〔DHE〕，多血卟啉酯類〔PHE〕，原卟啉的13,17-N,N,N-二甲基乙基乙醇胺酯〔PH1008〕，四(3-羥苯基)-卟啉〔3-THPP〕，四苯基卟啉單磺酸鹽〔TPPS1〕，四苯基卟啉二磺酸鹽〔TPPS2a〕，二血卟啉醚，meso-四苯基卟啉，meso-四(4N-甲基吡啶)卟啉〔T4MpyP〕，八(4-叔丁基苯基)四吡嗪紫菜嗪〔OPTP〕，酞菁，四(4-叔丁基)酞菁〔t4-PcH2〕，四(4-叔丁基)酞菁鎂〔t4-PcMg〕，氯化鋁酞花青磺化的酞菁〔CASPc〕，氯化鋁酞花青酞菁四硫酸鹽〔AlPcTS〕，單磺化的鋁酞菁〔AlSPc〕，二磺化的鋁酞菁〔AlS2Pc〕，三磺化的鋁酞菁〔AlS3Pc〕，四磺化的鋁酞菁〔AlS4Pc〕，矽酞菁〔SiPcⅣ〕，鋅(Ⅱ)酞菁〔ZnPc〕，雙(二異丁基十八烷基甲矽烷氧基)矽2,3-萘酞菁(naphthalocyanine)〔isoBOSINC〕，鍺Ⅳ八丁氧基酞菁〔GePc〕，若丹明101〔Rh-101〕，若丹明110〔Rh-110〕，若丹明123〔Rh-123〕，若丹明19〔Rh-19〕，若丹明560〔Rh-560〕，若丹明575〔Rh-575〕，若丹明590〔Rh-590〕，若丹明610〔Rh-610〕，若丹明640〔Rh-640〕，若丹明6G〔Rh-6G〕，若丹明700〔Rh-700〕，若丹明800〔Rh-800〕，若丹明B〔Rh-B〕，磺基若丹明101(sulforhodamine101)，磺基若丹明640，磺基若丹明B，香豆素1，香豆素2，香豆素4，香豆素6，香豆素6H，香豆素7，香豆素30，香豆素47，香豆素102，香豆素106，香豆素120，香豆素151，香豆素152，香豆素152A，香豆素153，香豆素311，香豆素307，香豆素314，香豆素334，香豆素337，香豆素343，香豆素440，香豆素450，香豆素456，香豆素460，香豆素461，香豆素466，香豆素478，香豆素480，香豆素481，香豆素485，香豆素490，香豆素500，香豆素503，香豆素504，香豆素510，香豆素515，香豆素519，香豆素521，香豆素522，香豆素523，香豆素535，香豆素540，香豆素540A，香豆素548,5-乙氨基-9-二乙氨基苯並[a]吩噁嗪鎓鹽〔EtNBA〕,5-乙氨基-9-二乙氨基苯並[a]吩噻嗪鎓鹽〔EtNBS〕,5-乙氨基-9-二乙氨基苯[a]吩硒嗪鎓鹽〔EtNBSe〕，氯丙嗪，氯丙嗪衍生物，葉綠素衍生物，細菌葉綠素衍生物，金屬-配基絡合物，二氯化三(2,2』-雙吡啶)釕(Ⅱ)(RuBPY)，二氯化三(2,2』-雙吡啶)銠(Ⅱ)(RhBPY)，二氯化三(2,2』-雙吡啶)鉑(Ⅱ)(PtBPY)，脫鎂葉綠甲酯-酸a，部花青540，維生素D,5-氨基-乙醯丙酸，photosan，二氫卟酚e6，二氫卟酚e6亞乙基二醯胺，單-L-天冬氨醯基二氫卟酚e6，吩噁嗪尼羅藍衍生物，芪，芪衍生物，4-(N-(2-羥乙基)-N-甲基)-氨基苯基)-4』-(6-羥基己基磺醯基)芪(APSS)，以及標準的生物染料和著色劑。
20．如權利要求18所述方法，其中該至少一種光活性分子試劑是對處於該材料的特體積之中的一種特定物質具有特異性的至少一種生物性光活性分子試劑。
21．如權利要求20所述方法，其中該至少一種生物性光活性分子試劑包括從由下列各種光活性分子試劑組成的小組中選出的一個片段，它們是DNA,RNA，胺基酸，蛋白質，抗體，配基，半抗原，碳水化合物受體或複合試劑，脂類受體或複合試劑，蛋白質受體或複合試劑，螯合劑，以及膠囊載體。
22．如權利要求21所述方法，其中該至少一種生物性光活性分子試劑還包括當受到足以激勵它進入一種雙光子激發狀態的光(的照射)時被光激活的一個片段。
23．如權利要求13所述方法，其中用足以激勵包含於該材料的該特定體積之中的至少一種光活性分子試劑進入雙光子同時激發狀態的光來處理該材料的該特定體積的步驟包括下列諸步驟(a1)用一種特定類型的調製(方式)從光源對光進行調製，由此產生一束已調製光；以及(a2)用足以激勵包含於該材料的該特定體積之中的至少一種光活性分子試劑進入雙光子同時激發狀態的已調製光來處理該材料的該特定體積；還包括下列諸步驟(e)對具有該特定類型的調製(方式)的該已檢測的能量信號進行解調；以及(f)產生一個已解調的能量信號，它是該材料的特定體積的特徵所在。
24．如權利要求23所述方法，其中對具有該特定類型的調製(方式)的該已檢測的能量信號進行解調的步驟包括在一個兩倍於該特定類型的調製(方式)的頻率上對已檢測的能量信號進行解調，由此檢出該特定類型的調製(方式)的二次諧波。
25．如權利要求23所述方法，其中作為該材料的特定體積的特徵的該已解調的能量信號，代表了存在於該材料的特定體積之中的至少一種光激活分子試劑的壽命的變化。
26．如權利要求1所述成像方法中，該處理步驟包括在一個焦距的範圍內聚焦一束光束，使得該光束的一個焦平面延伸到介於該組織的一個表面以及基本上遠離該組織表面的一個點之間的一個位置上，由此，該處理步驟可以延伸以便穿透該組織的深部。
27．如權利要求26所述成像方法，還包括，當該光束是現存的時，在該組織內部改變該焦距位置，使得所述光激活、檢測、以及產生一個已檢測的能量信號的諸步驟沿著介於該組織表面以及一個基本上定位於該組織表面之外的一個位置之間的諸位置而發生，因此該圖像是三維的。
28．如權利要求27所述方法，其中所述處理步驟包括運行一個雷射器以產生一系列的脈衝輸出，該脈衝系列具有高於大約75MHz的脈衝重複頻率以及一個亞納秒的脈衝寬度。
29．如權利要求28所述方法，包括運行該雷射器以產生近紅外光。
30．如權利要求29所述方法，其中該雷射器產生的脈衝能量約為20nJ。
31．如權利要求29所述方法，其中該光激活步驟包括對至少一種光活性分子試劑進行一次雙光子同時激發。
32．如權利要求31所述方法，其中所述檢測步驟包括檢測那些不按照來自該雷射器的該入射光的一條光路折返的發射光。
33．如權利要求31所述方法，其中所述處理步驟還包括對該雷射束進行調製；並且其中該檢測步驟以及諸產生步驟中被選定的一個包括使用一個波長選擇步驟。
34．如權利要求31所述方法，其中所述處理和光激活諸步驟被這樣安排，以便產生來自該分子試劑並基本上同步於該雷射的調製(頻率)的發射光。
35．用於對含有至少一種光活性分子試劑的植物或動物組織中的一個特定體積進行成像的裝置，該裝置包括一個準直光源，所述光具有一個實質上能穿透該組織的頻率，所述光被這樣調適，使之能激勵包含於該組織之中的該分子試劑進入雙光子同時激發(TPE)狀態；聚焦裝置，用於通過一個從所述組織表面延伸到基本上遠離所述表面的一個深部的一個位置的焦距範圍內對該準直光進行聚焦，所述光源以及聚焦裝置協同工作以激勵該分子試劑的TPE，其中一個焦點或焦平面相對於所述組織是可調的；以及一個位於該組織附近的檢測器，它被這樣定位，以便檢測由該分子試劑所發出的、並且沿著一條與入射到該組織的光的光路不重複的路逕行進的光，所述檢測器被這樣配置，以便產生一個檢測信號，它是該光源曾經聚焦於其上的該特定體積的特徵。
36.如權利要求35所述裝置，其中所述光源產生一系列的脈衝輸出，該脈衝系列具有高於大約75MHz的脈衝重複頻率以及一個亞納秒的脈衝寬度。
37．如權利要求36所述裝置，其中所述光源產生近紅外光。
38．如權利要求37所述裝置，其中所述光源產生的脈衝能量約為20nJ。
39．如權利要求37所述裝置，其中所述光源包括一個雷射器。
40．如權利要求35所述裝置還包括一個被連接到所述檢測器的處理器。
41．如權利要求40所述裝置還包括一個跟所述光源相連接的調製系統，所述處理器被連接到所述調製系統。
42．一種用於醫學診斷成像的方法包括下列諸步驟將一種光活性分子試劑引入到一個組織之中，以對感興趣的該組織具有特異性為標準來選擇所述試劑，所述試劑對雙光子激發(TPE)是敏感的，允許所述試劑在感興趣的特定組織中積累；將光引導到該組織內部感興趣的特定區域，包括基本上位於一塊組織表面下方的區域，所述光按照頻率和能量來選擇，使之能穿透該組織，並且基本上僅在一個共焦區域內激勵TPE；在所述組織內部一個深度範圍內，控制一個共焦區域的位置；在所述組織內部一個深度範圍內，使用TPE對所述試劑進行光激活，由此在該共焦區域內產生已被光激活的諸試劑，其中該已被光激活的分子試劑發射能量；檢測所發射的能量；以及產生一個已檢測的能量信號，它是在該共焦區域內的組織的特徵所在。
43．如權利要求42所述方法，其中所述引導光的步驟包括使用一個工作於短脈衝寬度以及一個高的脈衝重複頻率的脈衝雷射器來產生近紅外光，並將所述雷射聚焦到所述組織內。
44．如權利要求42所述方法，其中所述控制該位置的步驟包括改變該共焦區域相對於待觀察的該組織的位置，或者改變該待觀察的組織相對於一個固定的共焦區域的位置。
45．如權利要求42所述方法，還包括在該光入射到該組織之前對它進行調製，並且在檢測到該發射光之後對它進行解調。
46．用於醫學診斷成像的裝置包括光源裝置，用於將一束受限的光束引導到以及進入到待成像的深部組織之中，所述光按照頻率和能量來選擇，使之能穿透到一塊組織表面的下方，並且基本上僅在一個共焦區域內激勵TPE；用於在待成像的該組織的一個深度範圍內改變該光的一個共焦區域的位置的裝置；以及檢測裝置，它被這樣定位，以便在用雙光子激發方法來激發所述試劑之後，接收和檢測由處於該組織內部的一種已被光激活的分子試劑所發出的各向同性的輻射。
47．如權利要求46所述裝置其中，該光源裝置包括產生一束準直光束的裝置；以及其中，該光源裝置包括聚焦裝置，用於將該準直光束聚焦到定位於該組織表面下方一個點上的一個共焦區域。
48．如權利要求47所述裝置，其中用以產生一束準直光束的裝置包括一個工作於近紅外光譜區域的脈衝雷射器。
全文摘要
一種用於對植物或動物組織的一個特定體積進行成像的方法,其中該植物或動物組織含有至少一種光活性分子試劑。本方法包括下列諸步驟:用足以激勵包含於該植物或動物組織的該特定體積之中的光活性分子試劑進入雙光子同時激發狀態的光來處理該植物或動物組織的該特定體積,對包含於該植物或動物組織的該特定體積之中的至少一種光活性分子試劑進行光激活,由此產生至少一種已被光激活的分子試劑,其中該至少一種已被光激活的分子試劑發射能量,檢測由該至少一種已被光激活的分子試劑所發射的能量,以及產生一個已檢測的能量信號,它是該植物或動物組織的該特定體積的特徵所在。本發明還提供一種對材料的一個特定體積進行成像的方法,其中該材料含有至少一種光活性分子試劑。
文檔編號A61K49/00GK1226147SQ97196813
公開日1999年8月18日 申請日期1997年10月27日 優先權日1996年10月30日
發明者埃利斯·A·瓦赫特, 瓦爾·G·費謝, H·克萊格·迪斯 申請人:福託金公司