用於誘導人類多能幹細胞的方法和組合物的製作方法

2023-05-17 06:37:21

專利名稱：用於誘導人類多能幹細胞的方法和組合物的製作方法
技術領域：
本發明大體上涉及用於誘導人類多能幹細胞(human pluripotent stem cells)的方法和組合物(composition)
背景技術：
胚胎幹細胞(E S)是多能細胞，它能夠在細胞培養中增殖和向表現出多能性質的多種細胞系限制性細胞(lineage-restricted cell)群體分化(Odorico et al. , StemCells 19:193-204(2001))。由於這些特徵，包括人類胚胎幹細胞的胚胎幹細胞能夠成為非常特定的細胞類型，該細胞類型表現出多種功能。通常人類胚胎幹細胞是高度成分均一，具有自我複製能力和分化成人體中的任意功能細胞的能力。在合適的條件下，自我複製能夠導致長期增殖能力，具有在細胞培養中無限擴增的潛力。另外，如果人類胚胎幹細胞以無向的方式(undirected fashion)分化,用於表達用於多數不同組織類型標誌的細胞的異質性群體(heterogeneous population)被獲得(W0 01/51616;和 Shamblott et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:113(2001))。這些特徵使得人類胚胎幹細胞獨特、均一，用於製備具有治療功效的細胞的起源群體。人類胚胎幹細胞能夠被用於製備多種用於科學和商業研究用途的分化細胞類型。目前，許多類型的分化人類細胞不易獲得且在體外培養中不能大量的擴增。然而，人類胚胎幹細胞在培養中能夠無限地擴增，且能夠分化成許多(即使不是全部)人體的分化細胞類型。這樣以來，誘導人類胚胎幹細胞分化成任何數量的人體的特定細胞類型的培養技術正在被開發。用於科學和商業研究的許多分化人類細胞可被大量地供應的可能性已經被人類胚胎幹細胞的可用性開啟。從事人類胚胎幹細胞的一個困難是不使用動物產品或產品，如血清，開發用於人類胚胎幹細胞的標準培養的條件，動物產品或產品，如血清趨向於批次到批次不同。這樣以來，本領域希望人類胚胎幹細胞培養的培養條件儘可能界定。為了實現那個想法，一組培養條件最近被描述即允許在界定的條件下長期培養未分化的人類胚胎幹細胞。Ludwig et al. , Nat. Methods 3:637-646 (2006),整體納入文本作為參考。Ludwig等描述了一種培養基，本文該培養基被稱為TeSR 培養基，其用於培養人類胚胎幹細胞，該培養基的每種成分被充分公開和表徵。因此，TeSR 是一種用於人類胚胎幹細胞培養的被充分界定且足夠的培養基。TeSR 已經被證明在用於新鮮人類胚胎幹細胞系的衍生中的使用也有效，新鮮人類胚胎幹細胞系的衍生甚至比未分化的人類胚胎幹細胞培養更有挑戰性限制。當生長在細胞與其它細胞或它們環境中的物理結構(physical structures)直接接觸的環境中時，人類胚胎幹細胞優先地保持未分化。在其它細胞環境中，人類胚胎幹細胞開始分化且不能無限增殖。在克隆一種胚胎幹細胞培養的過程中，這是有意義的。本文使用的「克隆」意思是從起始培養啟動一種胚胎幹細胞培養的方法，理想地，從單個胚胎幹細胞或至少從極少數個胚胎幹細胞。允許未分化的胚胎幹細胞的克隆培養的培養條件也許是在常規的胚胎幹細胞培養和增殖中要求的所有條件中的最基本條件。儘管在有效地培養胚胎幹細胞中取得了進展，這些方法的幾個重大缺點仍然存在。例如，通過M E F調節的培養基(MEF-conditioned medium)或基質膠(matrigelmatrix)，暴露於動物病原體仍然是一種可能。在人類治療中使用人類胚胎幹細胞的主要障礙是最初描述的繁殖人類胚胎幹細胞的方法，該方法涉及在非人類起源的一層飼養細胞(feeder cells)上，且在非人類起源的營養血清的存在下培養人類胚胎幹細胞。最近，廣泛研究改進用於人類胚胎幹細胞的培養體系已經集中在在無血清/無飼料的條件下種植胚胎幹細胞的能力上。例如，為了保證一種用於人類胚胎幹細胞的生長的無飼料的環境，包括血清替代物(S R)，轉化生長因子.beta. l(TGF-.beta. I), LIF, bFGF和基質纖連蛋 白(fibronectin matrix)的培養基的替代體系也已經被嘗試(Amit et al (2004), Biol.Reprod. 70(3) :837-45)。評價在人類飼料或無飼料基質上衍生和繁殖未分化的人類胚胎幹細胞的方法在繼續。

發明內容
本發明提供了一種用於重新編程細胞進入多能幹細胞樣(a pluripotent stemcell like) (PSCL)細胞或無性系(clone)的方法和組合物，用於本發明的方法的一種培養基、PSCL細胞或無性系和使用所述PSCL細胞或無性系治療或減輕紊亂(disorder)的一種方法。在一方面，本發明提供了一種細胞培養基組合物，所述組合物包括纖維調節素(FMOD)或它的衍生物或片段，其中所述組合物對重新編程細胞以便形成多能幹細胞樣(PSCL)無性系是有效的，其中所述PSCL克隆，在免疫螢光染色中，由針對人類0ct4A、Sox2、Nanog、SSEA4、TRA-1-60 (S)或 TRA-1-181 的抗體識別。在一些實施例中，所述FMOD是FMOD蛋白質或肽。所述細胞培養基組合物可以具有不同濃度的FMOD蛋白質或肽。在一些實施例中，所述組合物具有濃度從約200nM到約800nM的FMOD。在上述組合物中，所述細胞可以為任意哺乳動物的細胞。在一些實施例中，所述細胞是人類細胞、小鼠細胞(mouse cell)或大鼠細胞(rat cell)。人類細胞的例子包括,例如，BJ、MRC-5 和 NHDF。在另一方面，本發明提供了一種重新編程哺乳動物細胞進入PSCL細胞或無性系的方法。在一些實施例中，所述方法包括用細胞培養基處理哺乳動物細胞從一天到一個月的一段時間，和有規律地更換所述細胞培養基直至多能幹細胞樣(PSCL)無性系形成；其中所述培養基包括纖維調節素(fibiOmodulin) (FMOD)或它的衍生物或片段，其中所述組合物對重新編程所述細胞以便形成PSCL無性系是有效的，和
其中所述PSCL無性系，在免疫螢光染色中，由針對人類0ct4A、Sox2、Nanog、SSEA4、TRA-1-60 (S)或 TRA-1-181 的抗體識別。在一些實施例中，所述FMOD是FMOD蛋白質或肽。在上述方法中，所述細胞培養基組合物可以具有不同濃度的FMOD蛋白質或肽。在一些實施例中，所述組合物具有濃度從約200nM到約800nM的FM0D。在上述方法中，所述細胞可以為任意哺乳動物的細胞。在一些實施例中，所述細胞是人類細胞、小鼠細胞或大鼠細胞。人類細胞的例子包括，例如，BJ、MRC-5、NHDF、角化細胞、黑色素細胞、外周血細胞(例如，CD34+)、臍帶血細胞或甚至某些幹細胞(例如，脂肪源性幹細胞(adipose-derived stem cells)、血管周圍幹細胞或神經幹細胞)。
在本發明的進一步方面，它提供了一種多能幹細胞樣(PSCL)細胞或無性系，其由一種方法產生，所述方法包括用細胞培養基處理哺乳動物細胞從一天到一個月的一段時間，和有規律地更換細胞培養基直至多能幹細胞樣(PSCL)無性系形成；其中所述培養基包括纖維調節素(FMOD)或它的衍生物或片段，其中所述組合物對重新編程細胞以便形成PSCL無性系是有效的，和其中，所述PSCL無性系，在免疫螢光染色中，由針對人類0ct4A、Sox2、Nanog、SSEA4、TRA-1-60 (S)或 TRA-1-181 的抗體識別。在一些實施例中，所述FMOD是FMOD蛋白質或肽。在上述方法中，所述細胞培養基組合物可以具有不同濃度的FMOD蛋白質或肽。在一些實施例中，所述組合物具有FMOD濃度從約200nM到約800nM。在上述方法中，細胞可以為任意哺乳動物的細胞。在一些實施例中，細胞是人類細胞、小鼠細胞或大鼠細胞。人類細胞的例子包括，例如，BJ、MRC-5、NHDF、角化細胞、黑色素細胞、外周血細胞(例如CD34+)、臍帶血細胞或甚至某些幹細胞(例如，脂肪源性幹細胞、血管周圍幹細胞或神經幹細胞)。所述PSCL細胞或無性系能夠被用於治療或減輕任意紊亂，這些紊亂能夠被多能或全能幹細胞治療或減輕。通常，所述方法包括給予哺乳動物受試者(例如，人類或動物)本文公開的PSCL細胞或無性系。在一些實施例中，所述紊亂可以是神經組織退化的紊亂(neurodegenerative disorder)。在一些實施例中，所述紊亂可以是中樞神經系統(CNS)疾病、心血管病、血液病、克羅恩病(Crohn』 s disease)、骨疾病、肌病或軟骨疾病。在一些實施例中，所述紊亂可以是視網膜疾病。在一些實施例中，所述紊亂可以是對組織的創傷和損害。這樣的組織的例子可以是皮膚、肌肉、軟骨、筋、末梢神經、脊髓、血管或骨頭。在一些實施例中，所述紊亂可以是骨骼疾病。在一些實施例中，所述紊亂可以是器官疾病。在另一方面,本發明提供了一種包括本文公開的培養基的上清(supernatant),所述上清的實施例在上文和下文中都被描述。所述上清對治療或減輕紊亂是有效的，就像本文公開的PSCL細胞或無性系。在一些實施例中，本發明提供一種包括本文公開的上清的組合物。所述組合物可以是藥物或化妝組合物，所述組合物可以被給予哺乳動物受試者以便治療或減輕本文公開的紊亂。


圖Ia和圖Ib顯示的是暴露於FMOD之後，大鼠-2成纖維細胞形成具有胚胎幹細胞(ES)形貌的無性系。圖2a_2c顯示的是對人類新生兒包皮皮膚成纖維細胞(human newborn foreskindermal fibroblast) BJ 細胞測試結果。圖3a和圖3b顯示的是對人類胎兒肺成纖維細胞(human fetal lungfibroblast) MRC-5細胞測試結果。圖4顯示的是對人類新生兒包皮皮膚成纖維細胞BJ細胞測試結果。圖5顯示的是用針對人類iPS細胞的核心轉錄調控因子(key transcriptionalregulators) (NANOG、0CT4S0X2)的抗體和在所有人類多能細胞(SSEA4、TRA-1-60和TRA-1-81)的細胞表面上被表達的抗原，BJ-FiPS細胞進一步通過免疫螢光染色被識別。標 尺200 μ m.圖6顯示的是BJ-FiPS細胞進一步被RT-PCR識別。未處理的BJ細胞被用作對照。用於iPS表徵(S0X2、0CT4、NAN0G和hTERT)、外胚層標記(KRT-18和巢蛋白(NESTIN))、內胚層標記(AFP和GATA-4)，中胚層標誌(FLT-1、BMP-4和血管內皮鈣粘蛋白(VE-Cadherin))的引物被用做針對β_肌動蛋白的對照引物。圖7 顯不的是使用 AggreWell 800 協議表達(AggreWe11 800protocolexpression), BJ-FiPS在懸浮培養中形成胚胎體(EBs)。圖8a_8c顯示的是經過14天懸浮培養後，免疫染色顯示BJ-FiPS EBs用iPS標記(a)和外胚層(b)及中胚層標記(C)表達。圖9顯示的是BJ-FiPS細胞在體外分化成造骨細胞。圖10顯示的是NHDF-FiPS細胞在體外分化成造骨細胞。圖11顯示的是在SCID-小鼠睪丸中FiPS細胞分化成骨組織。圖12顯示的是FiPS細胞被轉移入脂肪生成培養基(adipogenesis medium)(Lonza)中 21 天。圖13a和圖13b顯示的是對BJ-FiPS細胞的測試結果。圖14a和圖14b顯示的是對BJ-FiPS EBS細胞的試驗結果。圖15a和圖15b顯示的是對在飼養細胞上BJ-FiPS細胞生長的試驗結果。
具體實施例方式在一方面，本發明提供一種用於重新編程哺乳動物細胞進入多能幹細胞樣(PSCL)細胞的方法。該方法一般包括用培養基處理哺乳動物細胞足夠長的一段時間，導致哺乳動物細胞被重新編程進入細胞或無性系，所述細胞或無性系表現出或具有多能幹細胞的一個或多個特徵或性質。在一些實施例中，所述培養基包括纖維調節素(FMOD)蛋白質或肽，或它的衍生物或片段。在一些實施例中，所述培養基可以包括濃度從約InM到約1000 μ M的FMOD蛋白質或肽，例如，從約InM到約IOnM,從約InM到約20ηΜ,從約InM到約50ηΜ,從約InM到約IOOnM,從約InM到約200ηΜ，從約InM到約500ηΜ，從約InM到約ΙΟΟΟηΜ，從約InM到約2 μ M，從約InM到約5 μ M，從約InM到約10 μ Μ,從約InM到約20 μ Μ,從約InM到約50 μ Μ,從約InM到約100 μ Μ,從約InM到約200 μ M或從約InM到約500 μ Μ。在一些實施例中，所述培養基可以包括濃度從約IOnM到約1000 μ M的FMOD蛋白質或肽，例如，從約IOnM到約20ηΜ，從約IOnM到約50ηΜ，從約IOnM到約ΙΟΟηΜ，從約IOnM到約200nM,從約IOnM到約500nM,從約IOnM到約IOOOnM,從約IOnM到約2 μ M,從約IOnM到約5 μ Μ，從約IOnM到約10 μ Μ,從約IOnM到約20 μ Μ,從約IOnM到約50 μ Μ,從約IOnM到約100 μ Μ,從約IOnM到約200 μ M或從約IOnM到約500 μ M0在一些實施例中，所述培養基可以包括濃度從約20ηΜ到約1000 μ M的FMOD蛋白質或肽，例如，從約20ηΜ到約50ηΜ，從約20ηΜ到約ΙΟΟηΜ，從約20nM到約200nM，從約20nM到約500nM，從約20nM到約ΙΟΟΟηΜ，從約20nM到約2 μ M，從約20ηΜ到約5 μ Μ，從約20ηΜ至Ij約10 μ Μ,從約20ηΜ到約20 μ Μ,從約20ηΜ到約50 μ Μ,從約20ηΜ到約100 μ Μ,從約20ηΜ 到約200 μ M或從約20ηΜ到約500 μ Μ。在一些實施例中，所述培養基可以包括濃度從約50ηΜ到約1000 μ M的FMOD蛋白質或肽，例如，從約50ηΜ到約ΙΟΟηΜ，從約50nM到約200nM，從約50nM到約500nM，從約50nM到約ΙΟΟΟηΜ，從約50nM到約2 μ M，從約50ηΜ到約5 μ Μ，從約50ηΜ到約10 μ Μ,從約50ηΜ到約20 μ Μ,從約50ηΜ到約50 μ Μ,從約50ηΜ到約100 μ Μ,從約50ηΜ到約200 μ M或從約50ηΜ 到約 500 μ Mo在一些實施例中，培養基可以包括濃度從約IOOnM到約1000 μ M的FMOD蛋白質或肽，例如，從約IOOnM到約200ηΜ，從約IOOnM到約500ηΜ，從約IOOnM到約ΙΟΟΟηΜ，從約IOOnM到約2 μ M，從約IOOnM到約5 μ Μ,從約IOOnM到約10 μ Μ,從約IOOnM到約20 μ Μ,從約IOOnM到約50 μ Μ,從約IOOnM到約100 μ Μ,從約IOOnM到約200 μ M或從約IOOnM到約500 μ Μ。在一些實施例中，所述培養基可以包括濃度從約200ηΜ到約1000 μ M的FMOD蛋白質或肽，例如，從約200ηΜ到約500ηΜ，從約200ηΜ到約ΙΟΟΟηΜ，從約200nM到約2 μ M，從約200ηΜ到約5 μ Μ，從約200ηΜ到約10 μ Μ,從約200ηΜ到約20 μ Μ,從約200ηΜ到約50 μ Μ,從約200ηΜ到約100 μ Μ,從約200ηΜ到約200 μ Μ,或從約200ηΜ到約500 μ Μ。在一些實施例中，所述培養基可以包括濃度從約500ηΜ到約1000 μ M的FMOD蛋白質或肽，例如，從約500ηΜ到約IOOOnM,從約500ηΜ到約2 μ Μ,從約500ηΜ到約5 μ Μ,從約500ηΜ到約10 μ Μ,從約500ηΜ到約20 μ Μ,從約500ηΜ到約50 μ Μ,從約500ηΜ到約100 μ Μ,從約500ηΜ到約200 μ M或從約500ηΜ到約500 μ Μ。在一些實施例中，所述培養基可以包括濃度從約IOOOnM到約1000 μ M的FMOD蛋白質或肽，例如，從約IOOOnM到約2 μ Μ，從約IOOOnM到約5 μ Μ，從約IOOOnM到約10 μ Μ，從約IOOOnM到約20 μ Μ,從約IOOOnM到約50 μ Μ,從約IOOOnM到約100 μ Μ,從約IOOOnM到約200 μ M 或從約 IOOOnM 到約 500 μ M0在一些實施例中，所述培養基可以包括濃度從約2 μ M到約1000 μ M的FMOD蛋白質或肽，例如，從約2 μ M到約5 μ Μ，從約2 μ M到約10 μ Μ，從約2 μ M到約20 μ Μ，從約2 μ M到約50 μ Μ,從約2 μ M到約100 μ Μ,從約2 μ M到約200 μ M或從約2 μ M到約500 μ Μ。在一些實施例中，所述培養基可以包括濃度從約5 μ M到約1000 μ M的FMOD蛋白質或肽，例如，從約5 μ M到約10 μ Μ，從約5 μ M到約20 μ Μ，從約5 μ M到約50 μ Μ，從約5 μ M到約100 μ Μ,從約5 μ M到約200 μ M或從約5 μ M到約500 μ Μ。在一些實施例中，所述培養基可以包括濃度從約10 μ M到約1000 μ M的FMOD蛋白質或肽，例如，從約10 μ M到約20 μ Μ，從約10 μ M到約50 μ Μ，從約10 μ M到約100 μ Μ，從約10 μ M到約200 μ M或從約10 μ M到約500 μ Μ。在一些實施例中，所述培養基可以包括濃度從約20 μ M到約1000 μ M的FMOD蛋白質或肽，例如，從約20 μ M到約50 μ Μ，從約20 μ M到約100 μ Μ，從約20 μ M到約200 μ M或從約20 μ M到約500 μ Mo在一些實施例中，所述培養基可以包括濃度從約50 μ M到約1000 μ M的FMOD蛋白質或肽，例如，從約50 μ M到約100 μ Μ，從約50 μ M到約200 μ M或從約50 μ M到約500 μ Mo在一些實施例中，所述培養基可以包括濃度從約100 μ M到約1000 μ M的FMOD蛋白質或肽，例如，從約100 μ M到約200 μ M或從約100 μ M到約500 μ Mo 在一些實施例中，培養基可以包括濃度從約500 μ M到約1000 μ M的FMOD蛋白質或肽。除了所述FMOD蛋白質或肽或它的衍生物或片段，所述培養基可以是在本領域普遍使用的任意細胞培養基。例如，培養基通常包括鹽水。細胞培養基的一個例子包括，例如，鹽水、pH為7. 4的PBS、DMEM培養基或成纖維細胞鹼性培養基(FBM，Lonza)。在一些實施例中，所述培養基可以包括額外的成分或試劑，例如，轉化生長因子(TGF)-i3。在培養基中FMOD蛋白質或肽的濃度的例子可以是，例如，約ΙΟηΜ，約20nM，約50nM,約 ΙΟΟηΜ，約 200nM (例如 220nM)，約 500nM，約 ΙΟΟΟηΜ，約 2 μ M，約 5 μ M，約 10 μ Μ,約20 μ Μ,約 50 μ Μ,約 100 μ Μ,約 200 μ M 或約 500 μ Mo本文所使用的術語「足夠時間」意思是足夠長的一段時間由本文公開的培養基重新編程哺乳動物細胞。在一些實施例中，術語「足夠時間」範圍從數小時到約180天，例如，從8小時到約12小時，從約8小時到約24小時，從約8小時到約2天，從約8小時到約7天，從約8小時到約14天，從約8小時到約21天，從約8小時到約30天，從約8小時到約45天，從約8小時到約60天，從約8小時到約90天，從約8小時到約120天，從約8小時到約150天或從約8小時到約180天。在一些實施例中，術語「足夠時間」範圍從I天到約180天，例如，從約I天到約2天，從約I天到約7天，從約I天到約14天，從約I天到約21天，從約I天到約30天，從約I天到約45天，從約I天到約60天，從約I天到約90天，從約I天到約120天，從約I天到約150天，或從約I天到約180天。在一些實施例中，術語「足夠時間」範圍從2天到約180天，例如，從約2天到約7天，從約2天到約14天，從約2天到約21天，從約2天到約30天，從約2天到約45天，從約2天到約60天，從約2天到約90天，從約2天到約120天，從約2天到約150天，或從約2天到約180天。在一些實施例中，術語「足夠時間」範圍從7天到約180天，例如，從約7天到約14天，從約7天到約21天，從約7天到約30天，從約7天到約45天，從約7天到約60天，從約7天到約90天，從約7天到約120天，從約7天到約150天，或從約7天到約180天。在一些實施例中，術語「足夠時間」範圍從14天到約180天，例如，從約14天到約21天，從約14天到約30天，從約14天到約45天，從約14天到約60天，從約14天到約90天，從約14天到約120天，從約14天到約150天，或從約14天到約180天。在一些實施例中，術語「足夠時間」範圍從21天到約180天，例如，從約21天到約30天，從約21天到約45天，從約21天到約60天，從約21天到約90天，從約21天到約120天，從約21天到約150天，或從約21天到約180天。在一些實施例中，術語「足夠時間」範圍從30天到約180天，例如，從約30天到約45天，從約30天到約60天，從約30天到約90天，從約30天到約120天，從約30天到約150天，或從約30天到約180天。在一些實施例中，術語「足夠時間」範圍從45天到約180天，例如，從約45天到約60天，從約45天到約90天，從約45天到約120天,從約45天到約150天,或從約45天到約180天。
在一些實施例中，術語「足夠時間」範圍從60天到約180天，例如，從約60天到約90天，從約60天到約120天，從約60天到約150天，或從約60天到約180天。在一些實施例中，術語「足夠時間」範圍從90天到約180天，例如，從約90天到約120天，從約90天到約150天，或從約90天到約180天。在一些實施例中，術語「足夠時間」範圍從120天到約180天，例如，從約12天到約150天，或從約60天到約180天。在一些實施例中，本文提供的方法進一步包括有規律地用新鮮培養基更換培養基。術語「有規律地」意思是每小時一次、每兩小時一次、一天四次、一天兩次、每天一次、每兩天一次、每兩周一次，每周一次、每兩個月一次、或每月一次更換培養基。本發明的另一方面，它提供了一種本文公開的PSCL細胞或無性系的上清。所述上清包括本發明的培養基和生長因子(growth factors)和/或由本文提供的PSCL細胞或無性系分泌的轉錄因子(transcriptional factors)。本文公開的上清對治療或減輕紊亂是有效的，就像本文公開的PSCL細胞或無性系。在一些實施例中，上清能形成一種組合物(可選擇地和載體)。所述組合物可以被應用到哺乳動物受試者用於治療或減輕紊亂。在一些實施例中，所述組合物可以是化妝組合物或藥用組合物。多能幹細胞樣細胞或無性系本文所使用的術語PSCL細胞或無性系意思是細胞，該細胞不是多能細胞但至少具有PSC特徵之一。本文公開的PSCL細胞或無性系有能力在組織的生理環境中分化成想要得到的組織細胞。PSC的特徵或屬性在本領域是眾所周知的，PSC的一些特徵被描述如下。PSC的公認的特徵包括它的在適當的條件下分化成不同組織細胞的能力。PSC的其它屬性包括，例如，表達轉錄調控因子，例如Oct-4、Sox2或Nanog或抗原，例如SSEA-4、TRA-1-60或TRA-1-81和高效表達鹼性磷酸酶(ALP)。在一些實施例中，本文公開的PSCL細胞或無性系具有多能幹細胞的所有屬性。在這些實施例中，所述PSCL細胞或克隆據推測是所述PSC。在一些實施例中，本文公開的PSCL細胞或克隆具有多能幹細胞的屬性中的一個或多個即使不是全部。在這些實施例中，本文公開的所述PSCL細胞或無性系並不等同於PSC。這些轉錄調控因子或抗原，在例如免疫螢光染色中，可以容易地由針對這些調控因子或抗原的抗體識別。本文所使用的術語PSC也包括多能幹細胞。使用的方法所述PSCL細胞或無性系可以被用於醫藥，就像用於治療或減輕哺乳動物(例如，人類或動物)中的紊亂的PSC。通常，該方法包括給予具有紊亂的受試者PSCL細胞或無性系以便治療或減輕紊亂。使用多能幹細胞治療紊亂的方法在本領域中已被廣泛建立和熟知，因為它將很類似於用於胚胎幹細胞的協議(protocols)(參見,例如Sun, et al.，CellCycle 9:5, 880-885 (2010))。儘管還沒有被認可的產品，但是有許多潛在的應用如移植、基因修復和用於多種基因性疾病的細胞取代治療(參見，例如Gunaseelie』et al. , Curr MedChem. ;17 (8):759-766(2010))。紊亂可以為任意紊亂，這些紊亂能夠通過多能幹細胞被治療或減輕。在一些實施例中，紊亂可以為退化性疾病，例如神經組織退化的紊亂或心臟退化性疾病。 在一些實施例中，所述紊亂可以是中樞神經系統(CNS)疾病，心血管病、血液病、克羅恩病、骨疾病、肌病、脫髮、癌症、不孕症或軟骨疾病，例如腺苷脫氨酶嚴重複合型免疫缺乏症(adenosine deaminase deficiency-related severe combinedimmunodeficiency) (ADA-SCID)> 舒-戴二氏綜合症(Shwachman-Bodian-Diamondsyndrome) (SBDS), III 型戈謝(Gaucher)病(⑶)、假肥大型肌營養不良症(Duchenne)(DMD)和貝克(Becher)型肌肉萎縮症(BMD)、帕金森(Parkinson)病(PD)、亨廷頓(Huntington)病(HD)、青少年糖尿病(juvenile-onset)、l型糖尿病(JDM)、唐氏(Down)綜合症(DS)/三體性21、萊施-奈恩(Lesch-Nyhan)綜合症的攜帶狀態、阿茲海默症或缺血性心臟病(參見例如，Gunaseelie, et al. , Curr Med Chem. ; 17 (8) : 759 - 766 (2010))。在一些實施例中，所述紊亂可以為視網膜疾病。在一些實施例中，所述紊亂可以是對組織的創傷和損害。這樣的組織的例子可以是皮膚、肌肉、軟骨、筋、末梢神經、脊髓、血管或骨頭。創傷的例子可以是由身體衝擊遭受的創傷或由醫學中的手術造成的創傷，例如在治療癌症中組織的除去等。在一些實施例中，所述紊亂可以是骨骼紊亂。在一些實施例中，所述紊亂可以是器官疾病。實施例下面的例子闡述，而不是限制本發明。對暴露於蛋白質試劑之後iPS細胞的誘發和它的肽衍生物(例子1-15)的研究SE體細胞的直接重新編程提供了一種產生患者-或疾病-特定多能幹細胞(patient-or disease-specific pluripotent stem cells)的可倉泛。最近，由 Yamanaka和同事的開創性工作確認了核心轉錄因子，當過表達時，核心轉錄因子能夠重新編程體細胞到多能性狀態(Takahashi，K. & Yamanaka, S. Cell 126,663-676(2006))。通過所述因子0CT4、S0X2、KLF4和c-MYC或針對因子的不同的一組(a different set of forfactors) (0CT4、S0X2、NANOG和LIN-28)的異位表達重新編程小鼠和人類的體細胞到被誘導的多能幹(iPS)細胞現在是可能的(Okita, K. , et al. , Nature 448, 313-317 (2007) ; Takahashi, K. , et al. , Nat Protoc 2, 3081-3089 (2007) ;Maherali, N. , et al. CellStem Cell I, 55-70 (2007) ;ffernig, M. , et al. , Nature 448，318-324 (2007) ; Yu, J.，etal.，Science 318，1917-1920(2007);Park, I. H.，et al.，Nature451, 141-146(2008);和 Lowry，W. E.，et al. , Proc Natl Acad Sci U S A 105,2883-2888(2008)。人類iPS細胞在基因表達中很類似於胚胎幹細胞(ES)，具有多能性和後生狀態(印igeneticstates)，並對再生醫藥和在體外疾病建模具有較大的潛力。然而，將小瓶轉基因(vialtransgenes)整合到體細胞基因組，尤其是致癌基因，例如c-MYC和KLF，限制了 iPS細胞的實用。確實，在嵌合子小鼠中，C-Myc逆轉錄酶病毒的再活化促進來源於iPS細胞的腫瘤的形成(Okita, K. , et al. , Nature 448, 313-317 (2007);和 Nakagawa, Μ·，et al. , NatBiotechnol 26, 101-106 (2008)) 0通過優化重新編程方法，用一些取代一些轉錄因子的小分子化學物質重新編程小鼠和人類的體細胞現在是可能的。(Nakagawa, M.，et al.，NatBiotechnol 26, 101-106 (2008);Lowry, ff. E. &Plath, K. , Nat Biotechnol 26,1246-1248 (2008);Huangfu, D. , et al. , Nat Biotechnol 26,1269-1275 (2008);Huangfu, D. , et al. , Nat Biotechnol 26,795-797 (2008);和 Maherali，N.，et al., Cell Stem Cell3，340-345 (2008))。然而，至少一些轉錄因子，例如0CT4，不得不被整合(Nakagawa, Μ.，etal. , Nat Biotechnol26, 101-106(2008);Lowry, ff. E. & Plath, Κ. , Nat Biotechnol 26,1246-1248 (2008);Huangfu,D.,et al. , Nat Biotechnol 26，1269-1275(2008);Huan gfu,D.,et al. , Nat Biotechnol 26,795-797(2008);和 Maherali, N.，et al. , CellStem Cell 3，340-345 (2008))。因此，針對iPS的應用，安全問題仍然存在。另外，轉基因過程藉助大量的確認和表徵iPS每個方法的選擇(Takahashi, K. &Yamanaka, S. , Cell126，663-676 (2006);Lowry, ff. E. &Plath, Κ.，Nat Biotechnol 26，1246-1248(2008);Huangfu, D. , et al.，Nat Biotechnol 26, 1269-1275(2008);Huangfu, D. , et al. , NatBiotechnol26,795-797(2008);Maherali,N. ,et al., Cell Stem Cell 3, 340-345 (2008);和Takahashi, K. , et al. ,Cell 131,861-872(2007)),轉基因過程是非常耗時間的。對臨床實踐，產生iPS的新方法是更安全和更有效，該方法在下面的例子中被建立。纖維調節素(FMOD)是小分子富含亮氨酸的間質蛋白多糖(member of smallleucine rich proteoglycan) (SLRP)中的成員之一。FMOD是具有表達特徵的細胞溶質分泌蛋白(cytosolic secreted protein),其主要被限制在結締組織和富含膠原蛋白的組織，如軟骨、骨頭、筋和皮膚(Heinrich, W.，et al. , FEBS Lett 16，63-67 (1971);和Heinegard, D. , et al. , Pathol Immunopathol Res 1988;7(1-2):27-317，27-31(1988))。纖維調節素被涉及到原纖維形成、細胞粘著和細胞因子活性調節(cytokine activitymodulation)中(Hildebrand, A.，et al. , Biochem J 302，527-534 (1994);Zheng, Ζ·，etal. , Wound Repair and Regeneration 16，A28-A28(2008);Zheng, Z.，et al. , J Am CollSurgeons 211，S127-S127 (2010);和 Zheng, Z.，et al. , Journal of InvestigativeDermatology 131，769-778 (2011))。先前的研究已經表明FMOD可以既與轉化生長因子(TGF)-P亞型又和膠原蛋白結合以便調節信號傳導和細胞外基質的分布(Hildebrand,A.,et al. , Biochem J 302，527-534(1994);Zheng,Z.，et al. , WoundRepair and Regeneration 16,A28-A28 (2008);Zheng, Z. , et al. , J Am Coll Surgeons211,S127-S127(2010);Hedbom, E. & Heinegard, D. , J Biol Chem 1989Apr25;264(12):6898-905264, 6898-6905(1989);和 Kalamajski, S. & Oldberg, A. , Journal of BiologicalChemistry 282，26740-26745(2007))。最近，FMOD被發現是對多能幹細胞的合適環境(niche environment)的關鍵成分(Bi, Y. , et al. , Nat Med 13,1219-1227(2007))。有趣的是，我們發現暴露於 FMOD 之後，大鼠成纖維細胞細胞系大鼠-2形成了具有胚胎幹細胞形貌的無性系(實施例1，圖1)，這表明FMOD有誘導iPS細胞的潛力。實施例I在這個實施例中，暴露於FMOD之後，大鼠-2成纖維細胞形成了具有胚胎幹細胞(ES)形貌的無性系。圖Ia顯示的是未經過FMOD處理的大鼠-2，圖Ib大鼠-2被暴露於200nM FMOD 一周的結果。實施例2-3在例子2-3中，三種人類細胞包括人類新生兒包皮皮膚成纖維細胞BJ細胞(ATCC, CRL-2522)、人類胎兒肺成纖維細胞MRC-5細胞(ATCC，CCL-171)和正常人類成人皮·膚成纖維細胞NHDF細胞(Lonza Group Ltd.)被用於核實這種現象。暴露於FMOD三到四周之後，這三種細胞都能形成了 ES樣的無性系(圖2-3)。圖2a_2c顯示的是人類新生兒包皮皮膚成纖維細胞BJ細胞(a)被播種在24孔板中，且在轉移到飼養細胞上之前用200nM FMOD w/o血清處理三周(用6000拉德(rads)的Y輻照處理小鼠胚胎成纖維細胞，GlobalStem)的實驗結果。每天更換培養基，ES樣無性系用針對iPS表徵的鹼性磷酸酶(AP)染色(c)被觀察(b)。每20，000起始被播種的BJ細胞，形成6-8個無性系。標尺200 μ m。圖3a和圖3b顯示的是人類胎兒肺成纖維細胞MRC-5細胞(a)和人類正常成人皮膚成纖維細胞NHDF細胞(b)被播種在24孔板中，並在轉移到飼養細胞上之前用無血清的200nM FMOD處理四周的實驗結果。每天更換培養基，ES樣無性系被觀察(b)，每50，000起始被播種的BJ細胞，形成4-10個無性系。實施例4為進一步證實，在暴露於FMOD之前，用包括編碼與Nanog促進劑[BJ(Nanog-EGFP)細胞]結合的增強型綠色突光蛋白(enhanced green fluorescent protein) (EGFP)的基因的慢病毒，預轉染BJ細胞。經過三周的FMOD處理之後，BJ(Nanog-EGFP)細胞也形成了具有EGFP表達的ES樣無性系，它表明Nanog基因在這些FMOD誘導的iPS (FiPS)細胞中被強烈地表達，正像由Yamanaka或Thomson因子的異位表達誘導的其它iPS (Takahashi, K. &Yamanaka, S. , Cell 126,663-676(2006);Yu, J. , et al. , Science 318,1917-1920(2007);和 Takahashi, K.，et al. , Cell 131,861-872(2007))。圖4顯示的是在暴露於FMOD之前，用包括編碼與Nanog促進劑[BJ (Nanog-EGFP)細胞]結合的EGFP的基因的慢病毒，預轉染人類新生兒包皮皮膚成纖維細胞BJ細胞的實驗結果。在轉移到飼養細胞上之前，每天更換培養基。ES樣無性系用EGFP表達被觀察。實施例5和6通過免疫螢光染色，用針對人類iPS細胞的核心轉錄調控因子(NAN0G和0CT4S0X2)的抗體和在所有人類多能細胞(SSEA4、TRA-l-60和TRA-1-81)的細胞表面上被表達的抗原，從BJ細胞(BJ-FiPS)誘導出的FiPS細胞進一步被識別(圖5)。RT-PCR靶向人類iPS細胞的關鍵iPS標記也作為第二證據被執行(圖6)。
圖5顯示的是通過免疫螢光染色，用針對人類iPS細胞的核心轉錄調控因子(NAN0G和0CT4S0X2)的抗體和在所有人類多能細胞(SSEA4、TRA-1-60和TRA-1-81)的細胞表面上被表達的抗原，BJ-FiPS細胞進一步被識別。標尺200 μ m。圖6顯示的是BJ-FiPS細胞進一步被RT-PCR識別。未處理的BJ細胞被用作對照。用於iPS表徵(S0X2、0CT4、NANOG和hTERT)、外胚層標記(KRT-18和巢蛋白)、內胚層標記(AFP和GATA-4)，中胚層標記(FLT-1，BMP-4和VE-Cadherin)的引物被用做針對β -肌動蛋白的對照引物。實施例7和8在懸浮培養中，使用AggreWell 800協議(StemCell)，BJ-FiPS形成了胚胎體(EBs)(圖7)。再者，免疫染色顯示了 BJ-FiPS EBs 一貫地表達iPS標記，例如NAN0G、0CT4和S0X2以及外胚層和中胚層標記(圖8)，它表明了 BJ-FiPS細胞的多能性。圖7顯示的是在懸浮培養中，使用AggreWell 800協議表達，BJ-FiPS形成了胚胎·體(EBs) ο 標尺200 μ m。圖8a_8c顯示的是經過14天懸浮培養後，免疫染色顯示了 BJ-FiPS EBs用iPS標記(a)以及和外胚層(b)和中胚層標記(C)表達。實施例9為進一步證明BJ-FiPS細胞的多能性，體外分化試驗被採用。首先，BJ-FiPS細胞被轉移入含有10%胎牛血清(FBS)，50g/ml抗壞血酸，IOmM β -甘油磷酸酯和10_8Μ地塞米松的a-MEM培養基中21天。每隔三天培養基被更換。茜素紅(Alizarin Red S)染色顯示BJ-FiPS細胞能夠分化成造骨細胞(中胚層細胞)(圖9)。圖9顯示的是BJ-FiPS細胞在體外分化成造骨細胞。骨頭結節被茜素紅染色。實施例10-13體外分化中的類似物由從NHDF細胞(NDHF-FiPS)誘導出的FiPS細胞證實(圖10)。再者，當FiPS細胞被注入到SCID-小鼠睪丸中，在體內，該細胞分化成骨組織(圖11)。另外，FiPS細胞能夠分化成脂肪細胞和心肌細胞，兩者都是中胚層細胞(圖12-13)。圖10顯示的是在體外，NHDF-FiPS細胞分化成造骨細胞。骨頭結節被茜素紅染色。圖11顯示的是在SCID-小鼠睪丸中，FiPS細胞分化成骨組織。圖12顯示的是FiPS細胞被轉移入脂肪生成培養基(Lonza)中21天。培養基每隔三天被更換。油紅染色(Oil Red)顯示了 BJ-iPS細胞可以在體外分化成脂肪細胞。圖13a和圖13b顯示的是BJ-FiPS細胞被轉移入DMEM/F12 (I: I)培養基中，四天懸浮培養以便形成EBs，DMEM/F12(l:l)培養基由20%FBS、ImM穀氨酸鹽、O. ImM非必需胺基酸和O. ImM 2-巰基乙醇(EB20培養基)供給。接著，EBs細胞被轉移到明膠塗層板上培養十天以便體外心肌細胞分化。心肌細胞由平滑肌肌動蛋白(SM) (a)的免疫染色、心肌肌鈣蛋白(cTNT)和轉錄因子NKX2. 5(b)表徵。細胞核是用DAPI被計數染色，標尺100 μ m。實施例14-15實施例14和15顯示的是不僅iPS細胞能夠分化成多個中胚層組織，起源於成纖維細胞的FiPS細胞也能分化成外胚層(圖14)和內胚層細胞(圖15)。圖14a和圖14b顯示的是BJ-FiPS EBS在基因敲除(Konckout) DMEM培養基中被懸浮培養8天，基因敲除DMEM培養基由10%基因敲除血清、2mM穀氨酸鹽、10 μ M全反式維甲酸(RA)和IOOnM人類音速克刺蝟(human sonic hedgehog) (Shh)的N-末端活性片段供給。RA每天被重新供給，且每隔兩天整個懸浮培養基被更換。之後，被誘導的EBs被轉移到具有DMEM/F12 (I: I)培養基的多聚-鳥氨酸/纖維蛋白連接素塗層板上，用於神經細胞分化，DMEM/F12 (I: I)培養基由 N2,⑶NF，BDNF, CNTF, B27 和 2%FBS 供給。三天後，BJ-FiPS 分化成神經細胞(外胚層細胞)，該神經細胞通過β III-微管蛋白(a)的免疫染色和穀氨酸鹽受體I (GRIAl) (b)表徵。細胞核是用DAPI被計數染色，標尺100 μ m。圖15a和圖15b顯示的是在RPMI 1640培養基中，暴露於100ng/ml重組活化素A後，飼養細胞上的BJ-FiPS細胞生長向內胚層細胞分化四天，由α-胎蛋白(AFP) (a)的免疫染色表徵，該培養基由2%FBS和2mM穀氨酸鹽供給。之後，在RPMI 1640培養基中，BJ_FiPS培養另外八天,保存於胰腺世系細胞(pancrease lineage cell)的體外分化中，由胰腺/十二指腸同源框I (PDXl) (b)表徵，RPMI 1640培養基由2%FBS和2mM穀氨酸鹽供給，沒有活化素A,。細胞核是用DAPI被計數染色,標尺100 μ mo 因此，FiPS細胞表現出多能性是清晰的。另外，體內試驗表明FiPS細胞將不會誘導腫瘤形成(圖11)。因此，用暴露於FMOD誘導iPS細胞和它的肽衍生物，將是更安全和更好的直接重新編程體細胞的方法。儘管上述發明通過說明和用於理解清晰目的的例子被相當詳細地描述了，應該理解為，對本領域技術人員來說，某些適應性修改是路線優化問題，在不脫離本發明精神，或權利要求的範圍的前提下，可被實施。
權利要求
1.一種細胞培養基組合物，其包括纖維調節素(FMOD)或它的衍生物或片段，其特徵在於，所述組合物對重新編程細胞以便形成多能幹細胞樣(PSCL)無性系是有效的， 其中，所述PSCL無性系，在免疫螢光染色中，由針對人類0ct4A、Sox2、Nanog、SSEA4、TRA-1-60(S)或 TRA-1-181 的抗體識別。
2.根據權利要求I所述的細胞培養基組合物，其特徵在於，所述FMOD是FMOD蛋白質或肽。
3.根據權利要求I所述的細胞培養基組合物，其特徵在於，所述FMOD具有濃度從約.200nM 到約 800nM。
4.根據權利要求I所述的細胞培養基組合物，其特徵在於，所述細胞是人類細胞，小鼠細胞或大鼠細胞。
5.一種方法，其包括 用細胞培養基處理哺乳動物細胞從一天到一個月的一段時間，和 有規律地更換細胞培養基直至多能幹細胞樣(PSCL)無性系形成； 其中，所述培養基包括纖維調節素(FMOD)或它的衍生物或片段， 其中，所述組合物對重新編程細胞以便形成PSCL無性系是有效的，和其中，所述PSCL無性系，在免疫螢光染色中，由針對人類0ct4A、Sox2、Nanog、SSEA4、TRA-1-60(S)或 TRA-1-181 的抗體識別。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述FMOD是FMOD蛋白質或肽。
7.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述FMOD具有濃度從約200nM到約.800nMo
8.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述細胞是人類細胞、小鼠細胞或大鼠細胞。
9.一種多能幹細胞樣(PSCL)無性系，其由一種方法產生，所述方法包括 用細胞培養基處理哺乳動物細胞從一天到一個月的一段時間，和 有規律地更換細胞培養基直至多能幹細胞樣(PSCL)無性系形成； 其中，所述培養基包括纖維調節素(FMOD)或它的衍生物或片段， 其中，所述組合物對重新編程細胞以便形成PSCL克隆是有效的，和其中，所述PSCL無性系，在免疫螢光染色中，由針對人類0ct4A、Sox2、Nanog、SSEA4、TRA-1-60(S)或 TRA-1-181 的抗體識別。
10.根據權利權利要求9所述的PSCL無性系，其特徵在於，所述FMOD是FMOD蛋白質或肽。
11.根據權利權利要求9所述的PSCL無性系，其特徵在於，所述FMOD具有濃度從約.200nM 到約 800nM。
12.根據權利權利要求9所述的PSCL無性系，其特徵在於，所述細胞是人類細胞，小鼠細胞或大鼠細胞。
13.一種治療哺乳動物中的紊亂的方法，其包括給予哺乳動物權利要求9-12任一項所述的多能性幹細胞樣(PSCL)無性系。
14.根據權利要求13所述的方法，其特徵在於，所述哺乳動物是人類。
15.根據權利要求9所述的方法，其特徵在於，所述紊亂是神經組織退化的紊亂。
16.根據權利要求9所述的方法，其特徵在於，所述紊亂是中樞神經系統(CNS)疾病、心血管病、血液病、克羅恩病、骨疾病、肌病或軟骨疾病。
17.根據權利要求9所述的方法，其特徵在於，所述紊亂是視網膜疾病。
18.根據權利要求9所述的方法，其特徵在於，所述紊亂是對組織的創傷和損害。
19.根據權利要求9所述的方法，其特徵在於，所述紊亂是骨骼疾病。
20.根據權利要求9所述的方法，其特徵在於，所述紊亂是器官疾病。
21.根據權利要求9所述的方法，其特徵在於，所述紊亂是對皮膚、肌肉、軟骨、筋、末梢神經、脊髓、血管或骨頭的傷害。
22.—種上清,其包括權利要求1-5任一項所述的培養基。
23.一種組合物，其包括權利要求22所述的上清。
24.根據權利要求23所述的組合物，所述組合物是藥物或化妝組合物。
25.一種治療或減輕紊亂的方法，其包括給予哺乳動物受試者權利要求22所述的上清或權利要求23所述的組合物。
全文摘要
本發明提供了多能性幹細胞樣(PSCL)細胞或無性系、培養基和它的上清和生產和使用多能幹細胞的方法。
文檔編號C07K14/47GK102892879SQ201180023880
公開日2013年1月23日 申請日期2011年5月12日 優先權日2010年5月13日
發明者康·汀, B·嘉·蘇, 中·鄭 申請人:加州大學董事會