轉穀氨醯胺酶的製備方法

2023-05-25 12:34:31 1

專利名稱：轉穀氨醯胺酶的製備方法
技術領域：
本發明涉及新型的轉穀氨醯胺酶的製備方法，具體而言，涉及將變性狀態的轉穀氨醯胺酶重摺疊成具有酶活性、與天然狀態的酶基本上具有同等活性的轉穀氨醯胺酶的製備方法。通過該方法可以將變性的微生物轉穀氨醯胺酶重摺疊成具有酶活性的天然狀態的酶，可以將用基因重組技術生產的無活性酶蛋白質變換成大量且廉價的高活性的酶，能廣泛應用於食品加工領域。
背景技術：
轉穀氨醯胺酶可應用於果凍等膠狀食品、酸奶、奶酪、或膠狀化妝品等的製備和肉食的改造等，還可廣泛應用於除此之外的領域，是工業上極其有用的酶。
轉穀氨醯胺酶(EC 2.3.2.13；TGase)是催化蛋白質或多肽鏈的穀氨醯胺殘基的γ-羧基醯胺基與一級胺基間的乙醯基轉移反應的酶，其中，將從微生物(茂原鏈輪絲菌(Streptoverticilliummobraense)的變種)培養上清中發現的轉穀氨醯胺酶稱之為微生物來源的轉穀氨醯胺酶(MTG)。
MTG是由331個胺基酸構成的分子量為38000的單聚體蛋白質(生物化學雜誌，268，11565-11572，1993)。為了大量生產該酶，就力求使上述微生物的培養條件最適化(Agricaltural BiologicalChemistry，53，2613-，1989)，但該微生物不能廣泛應用於以往蛋白質的工業生產，生產量和生產耗費等方面也存在許多問題。另外，該酶雖可在菌體外以活性狀態分泌，但由於它分子內具有4處通過脫醯胺反應而容易進行化學修飾的序列，在進行分泌生產的過程中培養液中進行了化學修飾，回收的培養上清中蓄積了活性很低的酶。為了解決這些問題，對應用大腸桿菌等微生物的基因重組MTG的生產法進行了各種探索(Bioscience and Bioindustry，52，554-561，1994)。
若讓該酶的序列在大腸桿菌的菌體表達，其表達量甚微，但通過與可高表達的T7基因10來源的序列片段融合可成功地高表達融合蛋白質。但是，將該融合蛋白限制性分解而得到的具有原本序列的酶的活性，是天然狀態下轉穀氨醯胺酶的1/5，這提示了用該方法得到的酶的高級結構的不完全性(Bioscience，Biotechnology，andBiochemistry，61，830-835，1997)。此外，從融合蛋白中僅切出該酶的序列，就有必要通過消化酶或化學手段進行限制性分解，問題是不僅製備方法複雜，而且生產耗費高。
要解決以上問題，就有必要獲得用微生物直接高表達該酶序列的技術，獲得將回收的變性狀態的酶完全再形成高級結構、恢復酶活性的技術(再摺疊技術)。先前，本申請人在大腸桿菌菌體內表達MTG時，將使用的密碼子變成宿主大腸桿菌用的，通過大幅度增加質粒的拷貝數而成功地實現目前為止尚不可能的在菌體內高表達該酶序列，並將該內容申請了專利(特願平10-181951號，平成10年6月29日申請，特開平11-075876號(平成11年3月23日公開)，以下將該發明稱為「以前的發明」)。
在這種狀況下，努力開發優良的重摺疊方法。
發明的課題、目的可是，對於蛋白質的重摺疊技術來講，預測檢測目標蛋白質的天然狀態的適宜條件是不可能的，有必要用實際的目標蛋白質進行各自操作條件的試驗性探索(Advances in Protein Chemistry，50，1-59，1997)。根據以前的發明(上述本申請人申請的專利)，可從大量變性狀態的該酶入手，在這裡初次探討該酶重摺疊技術。
本發明的目的是為了建立該酶的廉價的工業製備方法，開發由基因重組微生物生產的變性狀態下獲得的該酶的重摺疊方法，提供基本上與天然狀態的轉穀氨醯胺酶具有同等酶活性(即轉穀氨醯胺酶活性)的轉穀氨醯胺酶的製備方法。發明的公開以解決上述課題為本發明的目的，本發明者們進行了深入研究，結果發現變性狀態下的轉穀氨醯胺酶至少要經過包含下述工序(a)和(b)的工序才能有效的製備出具有酶活性的轉穀氨醯胺酶(a)將該變性狀態的酶形成中間結構的工序，所述的中間結構是形成在水性溶劑中、酸性條件下具有酶活性的結構的中間結構；以及(b)將已經形成上述結構形成的中間結構的酶形成高級結構的工序，所述的高級結構是在水性溶劑中、pH值中性範圍內具有酶活性的高級結構。
也就是說，本發明為至少包括上述步驟(a)和(b)，特別是包括重摺疊步驟的轉穀氨醯胺酶的製備方法。
(a)中得到的具有中間結構的酶，象(a)中處理過程那樣得到的酶雖具有轉穀氨醯胺酶活性，但與天然存在的酶相比其活性基本上很低，例如酶活性不到20U/ml。
再者，本發明包括下述內容。
1.上述工序(a)的方法中，當該酶分子內的半胱氨酸殘基的巰基為游離形式，形成在水性溶劑中、酸性條件下有酶活性的結構的中間結構時，在酸性條件下將該酶稀釋。
2個半胱氨酸殘基部分結合形成二聚體時，優選還原的的巰基為游離形式的。
2.上述方法，其中工序(b)中，水性溶劑包括形成具有酶活性的高級結構的促進劑。
工序(b)中包含調整到中性範圍的階段，此時可使用促進高級結構的目的物形成的促進劑，特別優選在升高pH值之前添加使用。此時，作為促進劑，優選低分子量化合物，例如氯化鉀、氯化鍶等無機鹽，醋酸鈉、丙酸鈉等有機鹽，胺基酸鹽，聚乙二醇等，DMSO、DMF等有機溶劑。
3.上述方法，其中在工序(b)之後，包含工序(c)-即會合該酶中無活性的酶，分離該凝積物的工序。
4.上述方法，其中在工序(a)中該酶溶解在水性溶劑中，工序(b)中該中性範圍是將工序(a)中獲得的酶溶液的pH值升高到中性範圍。
5.上述方法，其中在工序(a)中，將該變性狀態的酶的酸性溶液在酸性條件下稀釋時，在低溫下進行，優選在15℃以下進行稀釋，稀釋的蛋白質濃度不到10mg/ml。
稀釋倍數為5倍以上，優選10倍以上，更優選50～400倍，可分幾個階段進行稀釋。當使用下述變性劑進行稀釋時，稀釋前和稀釋後以尿素代表變性劑的濃度時，稀釋成4～10M，優選稀釋成0.01～0.5M。
工序(a)優選在低溫下進行，特別是稀釋時優選在低溫下進行。例如，在15℃以下，優選在3-10℃的溫度下進行。
6.上述方法，其中在工序(a)中的水性溶劑包含蛋白質變性劑。
優選初始物質的轉穀氨醯胺酶在水性溶劑中有良好的溶解性，可使用蛋白質變性劑作為溶解輔助劑。這種情況下的蛋白質變性劑包括尿素，鹽酸胍，硫氰酸鹽等。使用的濃度就是普通蛋白質變性時使用的濃度，也可根據變性劑的種類選用，如使用尿素作為變性劑時，使用濃度為4-10M。
7.轉穀氨醯胺酶的製備方法，它是通過將變性狀態下的轉穀氨醯胺酶在酸性條件下溶解到水性溶劑中，其後，將該酶溶液調整到中性範圍時，生產出具有酶活性狀態的酶。此時，優選的處理條件等可利用前面記載的。
8.上述方法，其中在工序(a)中得到的形成所述結構的中間結構，在近紫外區的CD譜與天然狀態的相比有30-70％的分子橢圓率。
9.將變性狀態下的轉穀氨醯胺酶酸性條件下溶解到水性溶劑中，可得到具有以下性質(d)-(g)的蛋白質。
(d)用異羥肟酸法進行轉穀氨醯胺酶活性測定，具有15-25U/mg的比活性；(e)SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳法中，分子量為36000-40000；(f)近紫外區的CD譜與天然狀態的相比有30-70％的分子橢圓率；(g)用His-Mes pH6.1的緩衝液系統進行非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳時，與天然狀態的相比遷移率慢。
上述SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳法中，優選具有與天然狀態同等的大約38000的分子量。
轉穀氨醯胺酶活性測定中所應用的異羥肟酸法，可按眾知的方法(例如，參照文獻Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry，61，830-835，1997)進行。
下面是本發明的適宜例子。
下面工序包含工序A和B，由變性狀態的轉穀氨醯胺酶(MTG)，通過重摺疊方法，製備具有酶活性的天然狀態的轉穀氨醯胺酶(A)將含有活性殘基半胱氨酸殘基(Cys)的巰基游離(free)，來自變性、可溶化了的微生物的轉穀氨醯胺酶溶液的pH值調整到酸性範圍，優選用含有少量變性劑的酸性緩衝液，優選稀釋50-400倍，得到具有形成天然狀態結構的過程中形成的中間結構(狀態)的酶；(B)向含有上述具有中間結構(狀態)的酶溶液中直接添加鹼性溶液，或者在添加促進結構形成的低分子量化合物後添加鹼性溶液，使其pH值上升到中性範圍，6-7左右，促進該酶高級結構的形成，或者在形成高級結構的基礎上，必要時會合未形成該結構的無活性級分，作為凝集物進行分離的過程。
實施方案下面對本發明的實施方案進行詳細說明。尤其是從含有培養重組大腸桿菌而得到的變性狀態的酶的培養物開始，作為適宜例，具體地以進行重摺疊的情況為中心進行說明，但本發明並不限定於此。
本發明使用的初始物質-被處理物是變性狀態的轉穀氨醯胺酶，優選象來自微生物的變性轉穀氨醯胺酶(MTG)那樣沒有高級結構、基本上不顯示酶活性的轉穀氨醯胺酶，再者具有最終能發揮轉穀氨醯胺酶活性序列的酶也包含在本發明的初始物質之內。
更詳細地講，天然狀態的轉穀氨醯胺酶的序列是從N端的天門冬醯胺殘基(序號1)開始到C端的脯氨酸殘基(序號331)為止的331個胺基酸構成的，不用說這樣的蛋白質也包含在本發明的初始物質之內。另外，其它具有從第2個到第331個胺基酸殘基，由330個胺基酸(缺失第1個門冬醯胺殘基)構成的蛋白質，或者N端和/或C端側結合了一個或多個胺基酸殘基的蛋白質，基本上不顯示轉穀氨醯胺酶活性，但通過高級結構的形成後具有了活性或有這種可能的蛋白質也包含在內。這種蛋白質的胺基酸序列內缺失、置換和/或添加或插入了一個或多個胺基酸，通過本發明的方法，可具有轉穀氨醯胺酶活性或有這種可能性，具有這種序列的蛋白質也包含在本發明的初始物質之內。
本發明使用的初始物質的代表性例子包括，培養插入了微生物來源的轉穀氨醯胺酶基因的微生物，例如重組的大腸桿菌，而得到的含變性酶的培養物(以前的發明上述本申請人的在先申請作為後面實施例中的參考製造例)。這裡，改變微生物來源的轉穀氨醯胺酶基因的一部分，使其表達的胺基酸序列的一部分中，有一處或多處發生缺失/或置換(一個或多個胺基酸殘基)，和/或添加、插入一個或多個胺基酸，使之最終發揮轉穀氨醯胺酶活性，若具有這樣序列的可作為本發明的初始物質使用。
應用大腸桿菌作為生產宿主時，微生物來源的轉穀氨醯胺酶起初在菌體中以不溶性顆粒蓄積，所以該顆粒可作為本發明的初始物質。這種情況下，優選在水性溶劑中使按常規方法回收的微生物來源的轉穀氨醯胺酶的不溶性顆粒可溶化。此時，將之懸浮到1mM乙二胺四乙酸(EDTA)後，可應用尿素、鹽酸胍等蛋白質變性劑溶化它。其它的用於可溶化的變性劑包括硫氰酸鹽等。
尿素濃度和鹽酸胍濃度按一般蛋白質變性所必要的濃度使用，分別為7-10M、4-7M左右。微生物來源的轉穀氨醯胺酶的濃度無特別限制，但優選儘可能的高濃度，例如10-100mg/ml左右。
該水溶液中，在見到如二聚體這樣的二硫鍵結合進行還原時，優選添加還原劑。此時可向水溶液中添加還原劑，如20mM的二硫蘇糖醇(DTT)，將pH值調整到7.5以後，37℃攪拌大約2小時，使其溶化。
接著，向這樣得到的微生物來源的轉穀氨醯胺酶可溶化液中添加適量的鹽酸等酸，將其pH值調整到2-7，優選3-5，更優選3.5-4.5，用包含相同濃度變性劑和還原劑的同一緩衝液或相同pH值的緩衝液稀釋，將濃度調整為10-100mg/ml，優選20-80mg/ml。處理溫度優選低溫0-15℃，優選在3-10℃左右進行處理。
將上面得到的溶液稀釋到預先冷卻到3-10℃的5-50mM的醋酸鈉緩衝液中，優選15-25mM，pH3-5，優選pH3.5-4.5，將蛋白質濃度調整為0.2-4mg/ml，尿素濃度為0.01-0.5M，這樣能引導變性酶轉向形成所述結構的中間結構(狀態)。調整溶劑環境，在酸性條件下稀釋，起初以速度效果觀察的中間狀態，不是平衡容易地從天然狀態引導出的狀態(參照後述的實施例11-16)。
變性酶的稀釋可分階段進行，總體的稀釋倍數優選50-400倍左右，使用變性劑時，變性劑的濃度用尿素代表時，將濃度為4-10M左右的酶稀釋到0.01-0.5M左右。
在上述酸性條件下進行稀釋時，適於重摺疊的獲得上述結構形成的中間結構(中間狀態)時間長，例如保持在0.5小時以上，優選1小時以上，更優選保持1.5小時以上。
如此形成的中間結構(中間狀態)與後面實施例11-16中所示的天然結構(狀態)的不同，通過選擇本發明優選的稀釋條件，可有效獲得「天然狀態」的轉穀氨醯胺酶。
中間狀態的形成可用逆相高效液相(HPLC)和高效凝膠過濾色譜進行檢測，如分別用Vydac 214TP54(4.6φ×250mm，SEPARATIONSGROUP)和Superdex-75 HR 10/30(10φ×300mm，ァマシャム·ファルマシァ·バィオラク)進行檢測，通過比較微生物來源的轉穀氨醯胺酶的峰面積可進行確認。用文獻(Bioscience，Biotechnology，andBiochemistry，61，830-835，1997)記載的方法測定出的中間狀態的酶活性低，如比活性為10-20U/mg左右，比天然狀態的酶活性(約300U/mg)大大下降。具有這樣酶活性的組分或級分包含在本發明(a)工序中得到的具有「形成所述結構的中間結構」的酶中。因此，在具有這樣低酶活性的MTG生產階段(不包含其採集過程)，結束本發明的(a)工序。
應用凝膠過濾色譜和透析可取代上述稀釋法，形成中間(狀態)，但與稀釋法相比，酶蛋白質的回收率和酶活性(比活性)降低，所以，不優選這些方法。若得到上述低酶活性產物，可進行(b)工序，尤其沒必要分離本發明(a)工序中的酶。
接著，在(b)工序中，將如上得到的含有形成中間狀態的酶溶液的pH值處理成中性範圍。此時，將酶溶液維持在低溫下，例如維持在15℃以下，優選維持在3-10℃，升高其pH值到中性範圍。調整成中性範圍的方法優選向其中添加鹼性溶液，將pH值升高到5.8-8.5，優選6-7，離心除去產生的沉澱，回收含結構形成結束了的微生物來源的轉穀氨醯胺酶的上清。因此，會合該方法完成上述結構形成中得到的無活性酶，作為凝集物可容易地分離，所以極為有利。在獲得具有上述目標酶活性的結構形成階段(不包含其採集過程)，結束本發明的(b)工序。
上清的酶活性為30U/mg，與天然狀態的同等高，各種HPLC的洗脫峰形圖，分光學性質，及熱穩定性與天然狀態的微生物來源的轉穀氨醯胺酶完全或基本一致。由以上可知，從變性蛋白質完成向天然狀態酶的重摺疊。此外，酶的分離、純化方法，可利用已知的轉穀氨醯胺酶之外其它酶的分離、純化方法，容易地進行。
在升高中間狀態的pH值時，預先向其中添加低分子量化合物作為促進劑，由此可促進從中間狀態向天然狀態的結構形成。比如，0.01-10mM氯化鈣(CaCl2)等2價金屬鹽，形成結構轉移的核心促進局部結構形成，促進中間狀態向天然狀態轉移。除氯化鈣以外，可應用氯化鍶等無機鹽。0.1-2M的醋酸鈉和丙酸鈉等有機鹽，0.1-2M的精氨酸鹽酸鹽等胺基酸鹽，10-40％的二甲基亞碸(DMSO)和二甲基甲醯胺等有機溶劑，1-10％的聚乙二醇等多元醇和1-50mM的CHAPS等表面活性劑，可通過改變緩衝液的性質而抑制向天然狀態結構轉移的過程中產生的酶會合聚集，提高該酶蛋白質的回收率。
如此得到的轉穀氨醯胺酶純度極高，將之分離純化無特殊困難，應用慣用的或已知的方法進行酶(轉穀氨醯胺酶)的分離純化很容易進行。
本發明中如此得到的轉穀氨醯胺酶與天然狀態的基本上具有同等活性，且純度極高，所以沒必要再進行純化，可直接在食品等各種領域與天然狀態的轉穀氨醯胺酶同樣使用。
附圖簡述

圖1示MTG表達質粒pTRPMTG-01的構建圖。
圖2示MTG表達質粒pTRPMTG-02的構建圖。
圖3表示MTG表達的SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳的展開圖。
1.MTG(4μg)2.pUC19/JM109的菌體破碎總級分(陰性對照)3.pUCTRPMTG-02/JM109的菌體破碎總級分4.第3泳道的離心上清部分5.第3泳道的離心沉澱部分圖4示質粒pUCN216D的構建圖。
圖5示MTG表達質粒pTRPMTG(+)D2的構建圖。
圖6表示缺失相當於精氨酸殘基GAT的圖。
圖7表示N末端的胺基酸為絲氨酸的圖。
圖8表示天然狀態的轉穀氨醯胺酶(天然型)與從基因重組MTG獲得的酶(基因重組型)的逆相HPLC圖。
1.基因重組型；2.天然型天然型、基因重組型轉穀氨醯胺酶分別以8μg以下的條件進行逆相HPLC。柱Vydac 214TP5410洗脫液A 0.1％TFA(三氟醋酸)B 0.1％TFA，80％乙腈洗脫程序1ml/min時間(分)A(％)B(％)0 703020 505025 0 10028 0 100圖9表示天然狀態的(天然型)與從基因重組MTG獲得的(基因重組型)轉穀氨醯胺酶的CD譜。
用AVIV型號62ADS(HART SCIENTIFIC)和1mm電池，20℃測定實施例1中4個待檢樣品的CD譜。圖中待檢樣品的序號1-4如下。待檢樣品序號轉答氨醯胺酶緩衝液pH值轉答氨醯胺酶1 天然型4.0 3.22mg/ml2 然型 5.8 3.203 基因高組型 0 1.814 基因高組型5.8 1.69圖10表示實施例12中得到的基因重組型轉穀氨醯胺酶的天然型及其結構形成過程中中間結構(狀態)的CD(圓二色性)譜。
1.稀釋後0-10分；2.稀釋後10-60分；3.稀釋後60-160分；4.稀釋後170-270分；5.純化基因重組型轉穀氨醯胺酶。
圖11表示實施例12中得到的基因重組型轉穀氨醯胺酶的天然型及其結構形成過程中中間狀態的CD譜。
1.純化基因重組型轉穀氨醯胺酶；2.將純化基因重組型轉穀氨醯胺酶調整到pH4.2，0.16M的尿素中；3.由變性狀態稀釋後，經過26小時。
圖12表示對實施例13中得到的基因重組型轉穀氨醯胺酶的天然型及其結構形成過程中中間結構(狀態)進行凝膠過濾分析的色譜圖。
圖13表示對實施例16中得到的基因重組型轉穀氨醯胺酶的天然型及其結構形成過程中中間狀態進行非變性PAGE的結果圖。
1.純化基因重組型轉穀氨醯胺酶；2.由變性狀態稀釋後，經過26小時；3.將純化基因重組型轉穀氨醯胺酶調整到pH4.2，0.16M的尿素中；4.與3相同。
最佳實施狀態以下通過製備例和實施例對本發明進行具體說明。
(初始物質的製備)將編碼微生物來源的轉穀氨醯胺酶的DNA導入大腸桿菌中，用2×YT培養基培養大腸桿菌，微生物來源的轉穀氨醯胺酶以不溶性顆粒蓄積在細菌體內，將之作為初始物質使用均如下製備。其詳細內容記載於本申請者以前的發明特願平10-181951號、平成10年6月29日申請，特開平11-075876號公報(平成11年3月23日)(說明書等)中，本說明書中引入其說明書中的內容作為參考。
因為MTG在菌體內以不溶性顆粒的形式蓄積，所以包含在如下菌體破碎液的離心沉澱部分中，在以後的實施例中，將該離心沉澱部分作為顆粒應用。該顆粒不顯示轉穀氨醯胺酶活性。大腸桿菌中MTG的大量表達1MTG表達質粒pTRPMTG-01的構建考慮到大腸桿菌和酵母密碼子的使用頻度，已經全部合成了MTG基因(參照特開平5-199883號公報)。但是，該基因序列沒有在大腸桿菌中表達最適宜的元件。也就是說，存在的30個精氨酸殘基的密碼子均是單一的密碼子AGA。於是，首先，再合成最適於在大腸桿菌中表達的從MTG N末端開始的200個鹼基。
轉錄MTG基因的啟動子應用trp啟動子，它在培養基中缺乏色氨酸時容易誘導轉錄。高表達マグィ轉穀氨醯胺酶(TG)基因的質粒pTTG2-22(參照特開平6-225775號公報)使用trp啟動子，マグィTG基因上遊的序列按異種蛋白在大腸桿菌中高表達的要求設計。
質粒質粒pTRPMTG-01的構建是如圖1所示的那樣在マグィTG表達質粒pTTG2-22(參照特開平6-225775號公報)的trp啟動子下遊，從ClaI/HpaI部位到BgIII部分置換成合成DNA基因的ClaI/HpaI片段和pGEM15BTG(參照特開平6-30771)的HpaI/BamHI片段(小)。
合成DNA基因的ClaI/HpaI片段，是從pTTG2-22的trp啟動子下遊ClaI部位開始到翻譯起始密碼子結束的序列和具有MTG基因從N末端開始的216個鹼基的基因序列。關於MTG結構基因部分，要參考大腸桿菌的密碼子使用頻度，使之最適於在大腸桿菌中表達，這樣來確定鹼基序列。但為了去除mRNA形成高級結構的能力，所以將編碼N末端部分區域中的縮合密碼子的3個字母變換成富含腺嘌呤、尿嘧啶，儘可能不要聯用相同的鹼基。
合成DNA基因的ClaI/HpaI片段，設計成N末端有EcoRI、HindIII位點。設計的基因其+鏈和-鏈間相互重疊的大約40-50個鹼基，合成12條相當於各個序列的DNA(序列表中序號2-13)。將該合成的DNA的5』端磷酸化，與配對的合成的DNA退火後，連接。然後進行聚丙烯醯胺凝膠電泳，切出大的目的DNA，重組到pUC19的EcoRI/HindIII部位。驗證鹼基序列，將正確的命名為pUCN216。從該pUCN216中切出ClaI/HpaI片段(小)，用於構建pTRPMTG-01。
(2MTG表達質粒pTRPMTG-02的構建由於保持有pTRPMTG-01的大腸桿菌JM109不能高表達MTG，所以將MTG基因N末端改變了的部分以外的部分(777個鹼基)也改變用於大腸桿菌。由於一次合成777個鹼基較難，所以參考大腸桿菌的密碼子使用頻度確定鹼基序列後，每次200個鹼基分4批(B1，2，3，4)合成。設計每批的末端保持EcoRI、HindIII。設計的基因，其+鏈和-鏈間相互重疊的大約40-50個鹼基，每批合成10條相當於各序列的DNA，共合成40條(序列表中序號14-53)。將該合成的DNA的5』端磷酸化，與配對的合成的DNA退火後，連接。然後進行聚丙烯醯胺凝膠電泳，切出大的目的DNA，重組到pUC19的EcoRI/HindIII部位。驗證鹼基序列，將正確的分別命名為pUCB1，B2，B3，B4。然後如圖2那樣連接B1和B2，B3和B4，製作pUCB3-4。再由pTRPMTG-01、pUCN216、pUCB1-2、pUCB3-4構建pTRPMTG-02。存在於pTRPMTG-02上包含高表達MTG基因的鹼基序列示於序列表序列號1中。
3MTG表達質粒pTRPMTG-02(+)、(-)的構建由於保持有pTRPMTG-02的大腸桿菌JM109不能高表達MTG，所以將質粒多拷貝化。將包含pTRPMTG-02 trp啟動子的Eco0109I片段(小)平端化後，重組到多拷貝質粒pUC19的HincII部位，構建與lacZ的啟動子和trp啟動子的同一體(pUCTRPMTG-02(+))逆向的質粒(pUCTRPMTG-02(-))。
4MTG的表達用含有150μg/ml氨苄西林的3ml 2×YT培養基中培養pUCTRPMTG-02(+)、pUC19轉化的大腸桿菌JM109，37℃振蕩培養10小時(預培養)。向該培養液0.5ml中添加50ml含有150μg/ml氨苄西林的2×YT培養基，37℃振蕩培養20小時。
從培養液中收集菌體，超聲波破碎。該菌體破碎液的總組分、離心上清部分、離心沉澱部分在SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳中的展開結果如圖3所示。可以確證，pUCTRPMTG-02(+)/JM109的菌體破碎液的總組分、離心沉澱部分中與MTG的分子量相同的蛋白質高表達。另外，通過Wester blotting可以驗證，該蛋白質與小鼠抗MTG抗體反應。該蛋白質的表達量為500-600mg/L。生產培養基中即便不加入3-β-吲哚丙烯酸也能看到顯著高表達。
再者，用小鼠抗MTG抗體進行Wester blotting時，在離心上清部分中一點也沒看到MTG表達，由此可以明白表達的MTG幾乎全部形成不溶性蛋白質包含體。
5表達MTG的N末端胺基酸分析對表達MTG的蛋白質包含體N末端胺基酸殘基進行分析，N末端序列約60％為甲硫氨酸殘基，40％為甲醯甲硫氨酸殘基。要除去相當於起始密碼子的(甲醯)甲硫氨酸殘基，需進行以下操作。
6MTG的N末端門冬醯胺殘基的缺失以含有MTG N末端216個鹼基的pUCN216為模板進行PCR，使相當於門冬醯胺殘基的鹼基序列缺失掉。pUCN216是包含MTG N末端ClaI-HpaI片段的大約216個bp克隆到pUC19的EcoRI/HindIII部位的質粒。pF01(序列表序列號54)、pR01(序列表序列號55)是持有載體中序列的引物，pDELD(序列表序列號56)是缺失了相當於Asp殘基的鹼基序列，pHd01(序列表序列號57)是將C變成G，產生HindIII位點。pF01、pDELD是正義引物，pR01、pHd01是反義引物。
首先，pF01和pHd01，pDELD和pR01組對，分別對pUCN216進行PCR，94℃30秒、55℃1分、72℃2分的條件下進行35個循環。用酚/氯仿抽提各PCR產物，然後用乙醇沉澱，溶解到100μl水中。
從各PCR產物中取1μl混合，94℃熱變性10分鐘，然後以pF01和pHd01引物對進行PCR，94℃30秒、55℃1分、72℃2分的條件下進行35個循環。
用酚/氯仿抽提第二次PCR產物，乙醇沉澱後，用HindIII、EcoRI處理，獲得pUC19的亞克隆pUCN216D(圖4)。驗證所得pUCN216D的序列，是目的產物。
7門冬醯胺殘基缺失質粒的構建將pUCN216D的EcoRI/PpaI片段(小)與pUCB1-2(MTG基因的HpaI/BglII片段亞克隆到pUC19的Ec0RI/HindIII部位的質粒〕的Eco0109I/HpaI片段(大)結合，構成pUCNB1-2D。再將pUCNB1-2D的ClaI/BglII片段(小)與MTG高表達質粒pUCTRPMTG-02(+)DClaI/BglII片段(大)結合，形成門冬醯胺殘基缺失的MTG表達質粒pUCTRPMTG(+)D2(圖5)。結果如圖6所示，得到包含缺失相當於門冬醯胺殘基GAT的MTG基因的質粒。
8缺失門冬醯胺殘基的MTG的表達用含有150μg/ml氨苄西林的3ml 2×YT培養基中培養pUCTRPMTG(+)D2轉化的大腸桿菌JM109，37℃振蕩培養10小時(預培養)。向該培養液0.5ml中添加50ml含有150μg/ml氨苄西林的2×YT培養基，37℃振蕩培養20小時。將菌體超聲波破碎後，取其破碎液的上清部分和沉澱部分，從SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳後考馬斯亮蘭染色和用小鼠抗MTG抗體進行Western blotting的結果來看，在超聲波破碎後的沉澱部分，即不溶性部分中可檢測到缺失門冬醯胺殘基的MTG蛋白質。這提示缺失門冬醯胺殘基的MTG蛋白質以蛋白質包含體的形式蓄積在菌體內。
對該蛋白質包含體的N末端胺基酸序列進行分析，如圖7所示，N末端的序列大約90％為絲氨酸。
比較5和8中得到的表達MTG的N末端胺基酸序列結果，由表1可以看出，通過使MTG的N末端缺失門冬醯胺殘基，可有效除去表達MTG的N末端附加的起始密碼子甲硫氨酸。
表1

N.D.未檢測(實施例1)用象前面所講初始物質製備例中那樣製備的顆粒(上述離心沉澱部分)來製備顆粒懸浮液(1mMEDTA)，添加終濃度為8M的尿素，再添加20mM DTT之後，用20mM磷酸緩衝液調整pH值到7.5，37℃攪拌2小時，進行抽提，作為變性酶液。用前述的逆相HPLC測定該變性酶液的含量後，分成小分，-80℃凍存，直到以後實驗中應用。
向該變性酶溶液(酶濃度約50mg/ml)中滴入濃鹽酸，調整pH為4.0。用含8M尿素和20mM二硫蘇糖醇(DTT)的20mM醋酸鈉，pH4.0將之稀釋，將變性酶溶液的濃度調整為40mg/ml。將0.25ml注入到50ml預先5℃冷卻的稀釋用緩衝液(含2mM DTT的20mM醋酸鈉，pH4.0)中，攪拌使之均勻。此時，反應條件為變性酶濃度0.2mg/ml，尿素濃度0.04M。按文獻(Bioscience，Biotechnology，andBiochemistry，61，830-835，1997)中記載的方法求出反應溶液中的酶活性(比活性)為19.4U/mg。5℃繼續攪拌30分鐘，然後滴入4M氫氧化鈉使pH值增加到6.0，離心，得到上清。所得酶活性上升到pH值上升前的1.5倍，達到29.0U/mg，幾乎與微生物來源的天然狀態轉穀氨醯胺酶一致。從變性酶開始的蛋白質回收率為53.6％。
維持以上的重摺疊反應條件，將實驗的規模提高10倍，用500緩衝液稀釋，pH值上升到6.0以後，離心，得到上清。該酶的比活性為33.7U/mg，從變性酶液開始的蛋白質回收率為41.9％。將所得酶液通過陽離子交換色譜，應用(1)逆相HPLC(參照圖8)，(2)CD譜(參照圖9)，和(3)示差掃描熱量計(DSC)，比較所得純化酶的性狀與微生物來源的天然狀態轉穀氨醯胺酶的性狀，可以看到二者基本上沒差異。
(實施例2)向與實施例1同樣製備的變性酶溶液中滴入濃鹽酸，調整pH為4.0。用含8M尿素和20mM二硫蘇糖醇(DTT)的20mM醋酸鈉，pH4.0將之稀釋，將變性酶溶液的濃度調整為0.2mg/ml。將6ml該變性酶溶液過用含2mM DTT的20mM醋酸鈉，pH4.0緩衝液平衡過的Sephadex-G25M柱(1.6φ×15cm，Pharmacia)，用相同的緩衝液展開。以280nm波長的UV吸收為指標回收級分。層析在室溫進行。將回收級分於5℃冷卻30分鐘以上，向其中滴入4M氫氧化鈉使pH值增加到6.0，離心，得到上清。該酶的比活性為23.4U/mg，從變性酶液開始的蛋白質回收率為39.8％，酶的比活性、蛋白質回收率比實施例1中得到的有所降低。
(實施例3)向與實施例1同樣製備的變性酶溶液中滴入濃鹽酸，調整pH為4.0。用含8M尿素和20mM二硫蘇糖醇(DTT)的20mM醋酸鈉，pH4.0將之稀釋，將變性酶溶液的濃度調整為0.2mg/ml。將1ml該變性酶溶液裝入透析袋(Spectra/Por membrance，Nol；Spectrum MedicalInduatries，Inc.)，在1000ml緩衝液(含2mM DTT的20mM醋酸鈉，pH4.0)中5℃透析過夜。向所得透析內液中滴入4M氫氧化鈉使pH值增加到6.0，離心，得到上清。該酶的比活性為31.1U/mg，從變性酶液開始的蛋白質回收率為42.6％，比實施例1中得到的有所降低。
(實施例4)向與實施例1同樣製備的變性酶溶液中滴入濃鹽酸，調整pH為6.0。用含8M尿素和20mM二硫蘇糖醇(DTT)的20mM醋酸鈉，pH6.0將之稀釋，將變性酶溶液的濃度調整為40mg/ml。將0.25ml注入到50ml預先5℃冷卻的稀釋用緩衝液(含2mM DTT的20mM醋酸鈉，pH6.0)中，攪拌使之均勻。此時，反應條件為變性酶濃度0.2mg/ml，尿素濃度0.04M。5℃繼續攪拌30分鐘，離心得到上清。上清中一點也沒檢測到蛋白質，會合聚集用於重摺疊的變性酶。
再向與實施例1同樣製備的變性酶溶液中滴入4M氫氧化鈉使pH值增加到9.0。用含8M尿素和20mM二硫蘇糖醇(DTT)的20mM醋酸鈉，pH9.0將之稀釋，將變性酶溶液的濃度調整為40mg/ml。將0.25ml注入到50ml預先5℃冷卻的稀釋用緩衝液(含2mMDTT的20mM醋酸鈉，pH9.0)中，攪拌使之均勻。此時，蛋白質回收率為18.9％，檢測不到酶活性。繼續滴入濃鹽酸，將pH降到6.0，離心得到上清。上清中一點也沒檢測到蛋白質，會合聚集用於重摺疊的變性酶。
以上結果與實施例1的有效性均提示進行稀釋操作時pH值必需保持酸性條件。
(實施例5)向與實施例1同樣製備的變性酶溶液中滴入濃鹽酸，調整pH為4.0。用含8M尿素和20mM二硫蘇糖醇(DTT)的20mM醋酸鈉，pH4.0將之稀釋，將變性酶溶液的濃度調整為40mg/ml。將0.25ml注入到50ml預先5℃冷卻的稀釋用緩衝液(含2mM DTT的20mM醋酸鈉，pH4.0)中，攪拌使之均勻。5℃繼續攪拌30分鐘，再注入0.25ml pH4.0的變性酶溶液(40mg/ml)，稀釋之。這樣的操作重複2次，共分4次稀釋，結果最終的反應條件為變性酶濃度0.78mg/ml，尿素濃度0.16M。5℃繼續攪拌30分鐘，滴入4M氫氧化鈉使pH值增加到6.0，離心得到上清。所得酶的比活性為32.8U/mg，從變性酶液開始的蛋白質回收率為59.0％。稀釋操作不分次進行，將1ml變性酶溶液(pH4.0，40mg/ml)一次進行稀釋時，所得上清的比活性相同(32.8U/mg)，但蛋白質回收率比分4次稀釋時降低3％，得到56％。
(實施例6)向與實施例1同樣製備的變性酶溶液中滴入濃鹽酸，調整pH為4.0。用含8M尿素和20mM二硫蘇糖醇(DTT)的20mM醋酸鈉，pH4.0將之稀釋，將變性酶溶液的濃度調整為40mg/ml。將0.25ml注入到50ml預先5℃冷卻的稀釋用緩衝液(含2mMDTT的20mM醋酸鈉，pH4.0)中，攪拌使之均勻。5℃繼續攪拌30分鐘，向其中添加1mM CaCl2，再5℃攪拌30分鐘。此時，反應條件為變性酶濃度0.2mg/ml，尿素濃度0.04M，CaCl21mM。然後，滴入4M氫氧化鈉使pH值增加到6.0，離心得到上清。所得酶的比活性為30.0U/mg，從變性酶液開始的蛋白質回收率為60.1％。以不添加CaCl2時同時進行的重摺疊作為對照，所得酶的比活性為31.7U/mg，從變性酶液開始的蛋白質回收率為51.3％，相差大約9％，由此確證在pH值增加到6.0以前添加CaCl2的效果。另一方面，預先向稀釋用緩衝液中添加1mM CaCl2時，比活性為25.3U/mg，蛋白質回收率為53.2％，與pH值上升前添加相比有些降低。
(實施例7)向與實施例1同樣製備的變性酶溶液中滴入濃鹽酸，調整pH為4.0。用含8M尿素和20mM二硫蘇糖醇(DTT)的20mM醋酸鈉，pH4.0將之稀釋，將變性酶溶液的濃度調整為40mg/ml.將0.25ml注入到50ml預先5℃冷卻的稀釋用緩衝液(含2mMDTT的20mM醋酸鈉，pH4.0)中，攪拌使之均勻。5℃繼續攪拌30分鐘，向其中添加0.1mM StCl2，再5℃攪拌30分鐘。此時，反應條件為變性酶濃度0.2mg/ml，尿素濃度0.04M，StCl20.1mM。然後，滴入4M氫氧化鈉使pH值增加到6.0，離心得到上清。所得酶的比活性為27.3U/mg，從變性酶液開始的蛋白質回收率為84.5％。比實施例1的蛋白回收率(53.6％)有大幅度上升。
(實施例8)向與實施例1同樣製備的變性酶溶液中滴入濃鹽酸，調整pH為4.0。用含8M尿素和20mM二硫蘇糖醇(DTT)的20mM醋酸鈉，pH4.0將之稀釋，將變性酶溶液的濃度調整為40mg/ml。將0.25ml注入到50ml預先5℃冷卻的稀釋用緩衝液(含2mM DTT的20mM醋酸鈉，pH4.0)中，攪拌使之均勻。5℃繼續攪拌30分鐘，向其中添加10mM表面活性劑CHAPS(3-[(3-膽胺異丙基)二甲基-氨基]-2-羥基-1-丙磺酸)，再5℃攪拌30分鐘。此時，反應條件為變性酶濃度0.2mg/ml，尿素濃度0.04M，CHAPS 10mM。然後，滴入4M氫氧化鈉使pH值增加到6.0，離心得到上清。所得酶的比活性為29.3U/mg，從變性酶液開始的蛋白質回收率為93.0％。比實施例1的蛋白回收率(53.6％)有大幅度上升。
(實施例9)向與實施例1同樣製備的變性酶溶液中滴入濃鹽酸，調整pH為4.0。用含8M尿素和20mM二硫蘇糖醇(DTT)的20mM醋酸鈉，pH4.0將之稀釋，將變性酶溶液的濃度調整為40mg/ml。將0.2ml注入到10ml預先5℃冷卻的稀釋用緩衝液(含2mMDTT的20mM醋酸鈉，pH4.0)中，攪拌使之均勻。5℃邊攪拌邊在30秒、5分、及0.5、1.0、1.5、2.0、3.0及17小時後分別取樣，滴入4M氫氧化鈉使pH值轉換到6.0，離心取上清。所得上清中酶的比活性及從變性酶溶液開始到獲得上清的蛋白質回收率與取樣時間間的關係如表2所示。結果，稀釋後直接轉換pH值的比活性低，隨著取樣時間的延長，pH值轉換後上清中的比活性增高，1.5小時以上時可達30U/mg。由於經pH4.0的稀釋所形成的中間結構(狀態)獲得適於重摺疊的結構狀態，所以更優選1.5小時以上的時間。
表2

(實施例10)向與實施例1同樣製備的變性酶溶液中滴入濃鹽酸，調整pH為4.0。用含8M尿素和20mM二硫蘇糖醇(DTT)的20mM醋酸鈉，pH4.0將之稀釋，將變性酶溶液的濃度調整為40mg/ml。將0.2ml注入到10ml預先5℃冷卻的各種pH值的稀釋用緩衝液(含2mMDTT的20mM醋酸鈉，pH3.5、3.8、4.0、4.2、4.5、5.0、5.5)中，攪拌使之均勻。5℃繼續攪拌2小時，然後滴入4M氫氧化鈉使pH值轉換到6.0，離心取上清。所得上清中酶的比活性及從變性酶溶液開始到獲得上清的蛋白質回收率與稀釋時的pH間的關係如表3所示。結果，pH4.0和4.2時比活性和蛋白質回收率最高。
表3

(實施例11)向與實施例1同樣製備的變性酶溶液中滴入濃鹽酸，調整pH為4.0。用含8M尿素和20mM二硫蘇糖醇(DTT)的20mM醋酸鈉，pH4.0將之稀釋，將變性酶溶液的濃度調整為40mg/ml。將147ml注入到7350ml預先5℃冷卻的稀釋用緩衝液(含2mM DTT的20mM醋酸鈉，pH4.1)中，攪拌使之均勻。5℃繼續攪拌2小時，然後滴入4M氫氧化鈉使pH值轉換到6.0，傾析並離心取上清。所得上清中酶的比活性為30.7U/mg，從變性酶溶液開始到獲得上清的蛋白質回收率為66.5％。通過超濾(截斷分子量10kDa)將該上清濃縮為750ml，用平衡陽離子交換色譜的緩衝液(20mM醋酸鈉，pH5.8)稀釋10倍。然後，過經同一緩衝液充分平衡過的陽離子交換柱(CM SepharoseFF，11.3φ×10cm，ァマシャム·ファルマシァ·バィオテク社制)。用同一緩衝液再平衡後，以280nm波長的UV吸收為指標，用0-0.3M的NaCl線性濃度梯度進行洗脫，回收蛋白質級分(500ml)。層析在室溫進行。通過該操作可除去菌體來源的非目標性雜質物。
將回收級分的半量(250ml)過凝膠過濾柱(SepharoseG-25M，14φ×15cm，ァマシャム·ファルマシァ·バィオテク社制)，該柱用含2mM DTT的20mM醋酸鈉緩衝液，pH6.0平衡過，用同一緩衝液展開。以280nm波長的UV吸收為指標，回收蛋白質級分(380ml)。層析在室溫進行。所得蛋白質級分的比活性為29.4U/mg(約0.75g)。將該級分調整為1.2mg/ml，分成小份，-80℃凍存。以後，將該保存的樣品稱為「純化基因重組型轉穀氨醯胺酶」。
另一方面，將上述陽離子交換色譜中殘餘的另一半回收級分(250ml)過上述用含2mM DTT的10mM醋酸鈉緩衝液，pH6.0平衡過的凝膠過濾柱，用同一緩衝液展開。以280nm波長的UV吸收為指標，回收蛋白質級分(380ml)。層析在室溫進行。用前述的超濾將所得蛋白質級分的總量濃縮到122ml。將醋酸銨的濃度調整為50mM，-80℃冷凍，進行冷凍乾燥，得到大約0.75g乾粉。以後，將該乾粉稱為「純化基因重組型轉穀氨醯胺酶乾粉」。
(實施例12)應用實施例11中得到的純化基因重組型轉穀氨醯胺酶乾粉，研究結構形成的中間結構(狀態)的物理化學性質。將該乾粉溶解到1mMEDTA水溶液中，添加尿素、DTT和磷酸鈉，使其終濃度分別為8M、20mM和20mM，調pH為7.5。將之37℃孵育2小時，向其中滴入濃鹽酸，調pH為4.0。用含8M尿素和20mM DTT的20mM磷酸鈉，pH4.0稀釋之，將變性酶濃度調整為40mg/ml。分成小份，-80℃凍存，備用。將該變性酶液融解後，向0.2ml中注入10ml稀釋用緩衝液(含2mMDTT的20mM醋酸鈉，pH4.0〕，攪拌均勻。其後，隨時間變化測定其近UV光譜。測定時使用JascoJ-715spetropolarimeter，比色杯在近UV區選用1cm通道，在遠UV區選用0.1cm的通道。測定在室溫進行，波長掃描率為10nm/min。所得數據變換成每1摩爾胺基酸的CD(圓二色性)。圖10是近UV的CD(圓二色性)譜。0-10min是1次掃描的數據，10-60min是5次掃描的平均數據，60-160min和170-270min是10次掃描的平均數據。由該結果可以看出，直接稀釋後幾乎沒有高級結構形成，其後緩慢進行結構形成。60-160min和170-270min幾乎顯示同一波譜，這表明在近UV-CD觀察到的高級結構形成延續到160min才結束。稀釋後即使經過26小時(h)，在60-160min所形成的結構一點也沒變化。
同時向實施例11中得到的純化基因重組型轉穀氨醯胺酶中添加尿素和磷酸鈉，最終調整為含0.16M尿素和2mM DTT的20mM醋酸鈉、pH4.2，靜置24小時，使之在同一緩衝液中形成充分穩定的結構後，同樣測定CD譜，與天然狀態的比較。結果如圖11所示。即便在0.16M尿素，pH4.2中，該酶也沒失去天然結構(狀態)。另一方面，從變性狀態通過稀釋而形成的結構狀態(稀釋後26小時)與同一緩衝液中該酶的結構狀態(天然狀態)有明顯差異，這表明變性→稀釋操作(重摺疊)中形成的結構狀態是與天然狀態不同的「中間狀態」，但稀釋後狀態慢慢產生變化。
由以上可以看出，近紫外區尤其是260-290nm的CD譜中，中間狀態相對於天然狀態的分子橢圓率為30-70％。
(實施例13)向與實施例12同樣製備的變性酶溶液中滴入濃鹽酸，調整pH為4.0。用含8M尿素和20mM二硫蘇糖醇(DTT)的20mM磷酸鈉，pH4.0將之稀釋，將變性酶溶液的濃度調整為40mg/ml。將該溶液0.2ml注入到10ml稀釋用緩衝液(含2mMDTT的20mM醋酸鈉，pH4.0)中，攪拌使之均勻。為了研究稀釋後結構狀態的變化過程，用Superdex 75 HR10/30進行凝膠過濾分析。緩衝液用包含0.02％Tween 20的0.1M硫酸鈉，pH4.0，流速0.8ml/min。隨時間變化(2、10、30、60、100、160、260分及1日)分析稀釋後的樣品100μg。直接稀釋後(2分)，檢測到比天然結構(狀態)下該酶的峰洗脫時間早4分鐘出現的峰，與稀釋後的時間經過一起，洗脫時間發生變化，這表明結構狀態(大分子狀態)在稀釋後繼續變化。
另一方面，將在實施例11中獲得的純化基因重組型轉穀氨醯胺酶在含0.16M尿素和2mM DTT的20mM醋酸鈉、pH4.0中透析24小時，在稀釋用緩衝液中形成充分穩定的結構後進行同樣地分析(參照圖12)。峰的洗脫時間與天然狀態的無變化，該酶在0.16M尿素pH4.0的條件下沒有喪失天然狀態。通過稀釋形成的結構在經過足夠的時間後，其峰的洗脫時間與天然狀態的一致，但峰形依然有明顯的差異。這表明通過稀釋形成的中間狀態隨時間的變化其構造狀態也發生變化，最終沒達到與天然狀態同樣的結構，保留在結構形成中的中間狀態。
(實施例14)向與實施例12同樣製備的變性酶溶液中滴入濃鹽酸，調整pH為4.0。用含8M尿素和20mM二硫蘇糖醇(DTT)的20mM磷酸鈉，pH4.0將之稀釋，將變性酶溶液的濃度調整為15mg/ml。將該溶液0.2ml注入到10ml稀釋用緩衝液(含2mM DTT的20mM醋酸鈉，pH4.0)中，攪拌使之均勻。測定該溶液在280nm處激發的Trp螢光的λmax隨時間的變化(30秒及0.5、1、1.5和2小時)。從剛稀釋後(30秒)開始，觀察λmax轉藍(351.5→344nm)隨時間的變化，顯示結構慢慢緊湊化(結構形成進行)的過程。稀釋後即便經過足夠的時間，λmax與天然狀態的(340.0nm)也不一致，這表明通過稀釋而形成的結構狀態與天然狀態有明顯的差異。
另一方面，將在實施例11中獲得的純化基因重組型轉穀氨醯胺酶在含0.16M尿素和2mMDTT的20mM醋酸鈉、pH4.0中透析24小時，在稀釋用緩衝液中形成充分穩定的結構後，同樣進行Trp螢光的λmax測定時，λmax與天然狀態的沒有變化，這表明該酶在0.16M尿素pH4.0的條件下能夠維持天然結構(狀態)(參照表4)。這些結果表明，通過稀釋形成的中間狀態隨時間的變化其構造狀態也發生變化，最終沒達到與天然狀態同樣的結構，保留在結構形成中的中間狀態。
表4

(實施例15)向與實施例12同樣製備的變性酶溶液中滴入濃鹽酸，調整pH為4.0。用含8M尿素和20mM二硫蘇糖醇(DTT)的20mM磷酸鈉，pH4.0將之稀釋，將變性酶溶液的濃度調整為15mg/ml。將該溶液0.2ml和ANS(8-苯胺萘-1-磺酸，終濃度20μM)注入到10ml稀釋用緩衝液(含2mM DTT的20mM醋酸鈉，pH4.2)中，攪拌使之均勻。其後，在激發波長400nm、螢光波長470nm處測定ANS螢光強度隨時間的變化(1分，0.5、1、1.5、2小時)，結果如表5所示。結果是，從剛稀釋後(1分)開始到2小時，可觀察到隨時間的變化，螢光強度降低(1387→974)，這顯示了蛋白質表面露出的疏水性區域慢慢消失的過程。但是稀釋後即便經過足夠的時間，ANS螢光強度也降不到天然狀態的螢光強度，這表明通過稀釋而形成的結構狀態與天然狀態有明顯的差異。
另一方面，將在實施例11中獲得的純化基因重組型轉穀氨醯胺酶在含0.16M尿素和2mM DTT的20mM醋酸鈉、pH4.0中透析24小時，在稀釋用緩衝液中形成充分穩定的結構後，同樣進行ANS螢光強度測定時，與天然狀態比較螢光強度有若干上升，其變化不大(56→162)，這表明該酶在0.16M尿素pH4.0的條件下能夠維持天然狀態。這些結果表明，通過稀釋形成的中間狀態隨時間的變化其構造狀態也發生變化，最終沒達到與天然狀態同樣的結構，保留在結構形成中的中間狀態。
表5

(實施例16)向與實施例12同樣製備的變性酶溶液中滴入濃鹽酸，調整pH為4.0。用含8M尿素和20mM二硫蘇糖醇(DTT)的20mM磷酸鈉，pH4.0將之稀釋，將變性酶溶液的濃度調整為40mg/ml。將該溶液0.2ml注入到10ml稀釋用緩衝液(含2mM DTT的20mM醋酸鈉，pH4.0)中，攪拌使之均勻，進行非變性PAGE。用市售的NuPAGE Tris-Acetate 7％膠(Novex)，His-Mes pH6.1緩衝液系統進行電泳。結果如圖13所示。稀釋後該酶的遷移率與天然狀態的有明顯差異，這表明通過稀釋而形成的結構狀態與天然狀態有差異。
同時，將在實施例11中獲得的純化基因重組型轉穀氨醯胺酶中添加尿素和醋酸鈉溶液，最終調整為含0.16M尿素和2mMDTT的20mM醋酸鈉、pH4.0，同樣進行非變性PAGE。溶劑變化前後遷移率沒有變化，這表明該酶在0.16M尿素pH4.0的條件下能夠維持天然狀態。
實施例11-16所示的結果顯示(1)水性溶劑中，酸性條件下，用變性劑稀釋而形成的結構狀態是複雜的化合物；(2)其狀態是隨時間變化的；(3)最終保留到與天然結構不同的「中間狀態」。再者，實施例9和10(4)優選適當設定稀釋條件，通過誘導中間狀態，可提高向天然狀態的回收率。
發明效果根據本發明中使用的上述重摺疊方法，可工業化將由基因重組微生物生產的變性狀態的酶與天然狀態的轉穀氨醯胺酶基本上具有同等酶活性，即具有轉穀氨醯胺酶活性的高純度的轉穀氨醯胺酶。且無需特殊純化，可直接與天然狀態的轉穀氨醯胺酶同樣廣泛使用於食品等各種領域。
尤其是，通過在酸性溶液中稀釋，優選將pH保持在一定狀態下進行稀釋處理後調整到中性範圍，製備出具有有效促進從變性狀態的轉穀氨醯胺酶，經過上述結構形成的中間結構，到目的高級結構形成這樣酶活性的酶。
還提供具有形成上述結構的中間結構的中間體。
權利要求
1.具有酶活性的轉穀氨醯胺酶的製備方法，其特徵在於將變性狀態的轉穀氨醯胺酶付諸至少包含下述工序(a)和(b)的工序(a)將該變性狀態的酶形成中間結構的工序，所述的中間結構是形成在水性溶劑中、酸性條件下具有酶活性的結構的中間結構；以及(b)將已經形成可形成上述結構的中間結構的酶形成高級結構的工序，所述的高級結構是在水性溶劑中、pH值中性範圍內具有酶活性的高級結構。
2.權利要求1的方法，其中工序(a)中在該酶分子內半胱氨酸殘基的巰基是游離的，在形成在水性溶劑中，酸性條件下具有酶活性的結構的中間結構時，在溶解狀態下將該酶在酸性條件下稀釋。
3.權利要求1的方法，其中工序(b)中的水性溶劑包含形成具有酶活性的高級結構的促進劑。
4.權利要求1的方法，在工序(b)之後包含工序(c)，即會合該酶中無活性的酶，作為凝集物進行分離的工序。
5.權利要求1的方法，其中工序(a)中，將該酶溶解到水性溶劑中，其中工序(b)中的中性範圍是指將工序(a)中得到的酶溶液的pH值上升到中性範圍。
6.權利要求2的方法，其中工序(a)中將變性狀態的酶的酸性溶液稀釋成酸性時，在15℃以下的低溫下進行稀釋，所稀釋的蛋白質濃度不到10mg/ml。
7.權利要求1的方法，其中工序(a)中的水性溶劑包含蛋白質變性劑。
8.權利要求1的方法，其中形成所述結構的中間結構在近紫外區域的CD譜相對於天然狀態的有30-70％的分子橢圓率。
9.具有酶活性的轉穀氨醯胺酶的製備方法，其特徵在於，將變性狀態的轉穀氨醯胺酶在水性溶劑中酸性條件下溶解，其後將該酶溶液調整到中性範圍，生成具有酶活性的酶。
10.通過將變性狀態的轉穀氨醯胺酶置於水性溶劑中酸性條件下，可得到具有以下(d)-(g)所示特徵的蛋白質(d)用異羥肟酸方法對轉穀氨醯胺酶進行活性測定，它具有15-25U/mg的比活性；(e)SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳法中，分子為36000-40000；(f)近紫外區域的CD譜相對於天然狀態的有30-70％的分子橢圓率；以及(g)用His-Mes、pH6.1的緩衝液系統進行非不變性聚丙烯醯胺凝膠電泳時，其遷移比天然狀態的慢。
全文摘要
通過包括至少下述工序(a)和(b)的工序將變性狀態的轉穀氨醯胺酶製備為具有酶活性的轉穀氨醯胺酶:(a)將該變性狀態的酶形成中間結構的工序,所述的中間結構是形成在水性溶劑中、酸性條件下具有酶活性的結構的中間結構;以及(b)將已經形成上述結構形成的中間結構的酶形成高級結構的工序,所述的高級結構是在水性溶劑中、pH值中性範圍內具有酶活性的高級結構。因此能有效地對基因重組微生物生產的變性狀態的轉穀氨醯胺酶進行重摺疊,使之與天然狀態的轉穀氨醯胺酶基本上具有同等酶活性,即能夠工業性製備具有轉穀氨醯胺酶活性的高純度的轉穀氨醯胺酶。還提供形成上述結構的中間結構的中間體。
文檔編號C12N9/10GK1334867SQ99816257
公開日2002年2月6日 申請日期1999年12月24日 優先權日1998年12月28日
發明者橫山敬一, 小野邦夫, 江島大輔 申請人:味之素株式會社 被以下專利引用 (1),