酶促原位製備基於過酸的可移除抗微生物塗料組合物及其使用方法

2023-05-25 09:30:26 2

專利名稱：酶促原位製備基於過酸的可移除抗微生物塗料組合物及其使用方法
技術領域：
本發明涉及控制微生物的方法，所述方法包括用可移除的抗微生物成膜組合物塗覆表面，所述組合物包含原位酶促生成的過氧酸，以及施用所述組合物的方法。
背景技術：
化學消毒劑目前用于越來越多的行業以確保食品安全並遵從更嚴格的健康和安全法規。用於去汙、消毒和滅菌的組合物必須具有優異的殺菌功效、作用迅速、無腐蝕性並且微量起效。理想的組合物必須具有殺滅微生物的多個機制，因此提供抗廣譜微生物的功效並減少導致耐抗殺菌劑的微生物進化的可能性。包含過氧化物尤其是過氧化氫(HP)和過乙酸(也稱為過氧乙酸，PAA)的組合物已證明是非常有效的抗微生物劑。多種此類製劑已通過了必須的測試並且成為註冊產品如消毒劑、殺菌劑和殺芽孢劑。許多這些過氧化物/過氧酸組合物為溶液，它們可用於處理水溶液、表面和物體。一些組合物經批准用於接觸食品表面並用於一些食品的消毒。一些組合物也註冊為用於蒸汽相處理的消毒劑或殺菌劑。已描述了清潔、滅菌、和/或消毒硬質表面、肉產品、活植物組織和醫療設備以杜絕有害微生物生長的方法(美國專利6，545，047 ；美國專利6，183，807;美國專利 6，518，307 ；美國專利申請公布20030026846 ；和美國專利5，683，724)。也已報導過酸在製備用於衣物洗滌劑應用的漂白組合物中是有用的(美國3，974，082 ；美國專利5，296, 161 ； 和美國專利5，364，554)。製備過酸的方法有若干個。例如W02006/076334描述了包含過氧化物和過酸水溶液的殺微生物和去汙組合物；美國專利5，130，124描述了具有過氧化氫的含水抗微生物成膜組合物；W01996/022687描述了包含過氧化氫的氧化成膜組合物。酶催化劑也可用於促進過酸的生成。共有的共同未決的美國專利公開申請2008/0176299A1描述了酶促生產過酸的方法，其全文以引用方式併入本文。也已描述了用於過酸的酶促生產的酶如酯酶(美國專利3，974，082)、蛋白酶(美國專利5，364，554)、酯酶和脂肪酶(美國專利5，296，161)。儘管有如上所述的過酸製備方法，存在原位酶促生成基於過酸的、易於移除的、均一化的抗微生物塗料組合物的需要，所述組合物在施用到表面後提供短期和長期(或殘餘的)的抗微生物功效。

發明內容
本發明通過提供方法和組合物解決了上述問題，所述組合物是抗微生物的，並且也通過在目標表面上形成抗微生物塗層提供長期的抗微生物效應。在一個方面，本發明涉及提供在位點處控制微生物的方法，所述方法包括以下步驟a)通過組合組分形成組合物，所述組分包含i)成膜的水溶性或水分散性試劑；ii)惰性溶劑；iii)羧酸酯底物；iv)過氧源；ν)酶催化劑，所述酶催化劑具有過水解酶活性從而形成至少一種過氧酸以提供至少第一抗微生物劑；和vi)流變改性劑；b)將所述組合物施用到所述位點；c)允許所述組合物乾燥從而在所述位點上形成塗層。本發明的另一方面涉及提供控制位點處微生物的方法，所述方法包括以下步驟(a)提供包含惰性溶劑和成膜試劑的第一預混組分；(b)提供包含具有過水解酶活性的酶催化劑、羧酸酯底物和過氧源的第二預混組分；(c)將所述第一預混組分和所述第二預混組分混合以獲得包含具有過氧酸的第一抗微生物劑的液體塗料組合物；(d)將所述塗料組合物施用到所述位點；並且(e)允許所述塗料組合物乾燥從而在所述位點上形成塗層。本發明的另一方面涉及包含組分的抗微生物組合物，所述組分包括a)成膜的水溶性或水分散性試劑；b)惰性溶劑；c)羧酸酯底物；d)過氧源；e)具有過水解酶活性的酶催化劑；和f)流變改性劑其中，在組合所述組分時形成過氧酸。生物序列簡述下面的序列遵循37C. F. R. § 1. 821-1. 825( 「對包含核苷酸序列和/或胺基酸序列公開內容的專利申請的要求-序列規則」(Requirements for Patent Applications Containing Nuceotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures-the Sequence Rules))，並且符合世界智慧財產權組織(World Intellectual Property Organization)(WIPO)ST. 25 標準(1998)以及 European Patent Convention (EPC)和 Patent Cooperation Treaty (PCT)的序列表要求(規則5. 2和49. 5 (a-bis)以及行政指令 (Administrative Instructions)的208節和附錄C)。用於核苷酸和胺基酸序列數據的符號和格式遵循在37C. F. R. § 1. 822中所列出的規定。SEQ ID NO :1 是枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) ATCC31954 先鋒黴素 C 脫乙
醯酶的胺基酸序列。SEQ ID NO :2是枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)亞種枯草芽孢桿菌菌株168 (GenBank Accession#NP_388200)先鋒黴素c脫乙醯酶的胺基酸序列。SEQ ID NO :3 是枯草芽孢桿菌(Bacillus subti 1 is) ATCC6633 (GenBank Accession#YP_077621. 1)先鋒黴素c脫乙醯酶的胺基酸序列。SEQ ID NO :4 是地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)ATCC14580 (GenBank Accession#YP_077621. 1)先鋒黴素c脫乙醯酶的胺基酸序列。SEQ ID NO 5 Mi M 々、W I^1 ^f M (Bacilluspumilis) (GenBank Accession#CAB76451. 2)乙醯木聚糖酯酶的胺基酸序列。SEQ ID NO :6 是熱纖梭菌(Clostridium thermocellum) ATCC27405 (GenBank Accession#ZP_00504991)乙醯木聚糖酯酶的胺基酸序列。SEQ ID NO :7 是 β 不勒斯棲熱袍菌(Thermotoga neapoIitana)GenBank Accession#AAB70869. 1)乙醯木聚糖酯酶的胺基酸序列。SEQ ID NO 8 ^ 海 ffiIfi M (Thermotoga maritima)MSB8 (GenBank Accession#NP_227893. 1)乙醯木聚糖酯酶的胺基酸序列。SEQ ID NO :9 是熱厭氧桿菌屬(Thermoanaerobacterium sp. ) (GenBank Accession#AAB68821. 1)乙醯木聚糖酯酶的胺基酸序列。SEQ ID NO :10 是芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)NRRL B14911 (GenBank Accession#ZP_01168674)先鋒黴素c脫乙醯酶的胺基酸序列。SEQ ID NO 11 是耐鹽嗜鹼芽孢桿菌(Bacillus halodurans) C-125 (GenBank Accession#NP_244192)乙醯木聚糖酯酶的胺基酸序列。SEQ ID NO 12是克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii)KSM-K16先鋒黴素c脫乙
醯酶的胺基酸序列。SEQ ID NO 13 ^1 /^ , (Thermoanaerobacterium saccharolyticum)乙酉先木聚糖酯酶的胺基酸序列。SEQ ID N0:14是萊廷格熱袍菌(Thermotoga lettingae)乙醯木聚糖酯酶的氮基酸序列。SEQ ID NO 15是Thermotoga petrophilia棲熱袍菌乙醯木聚糖酯酶的胺基酸序列。SEQ ID N0:16是棲熱袍菌屬(Thermotoga sp.)RQ2 「a」乙醯木聚糖酯酶的胺基酸序列。SEQ ID NO 17是棲熱袍菌屬(Thermotoga sp.)RQ2 「b」乙醯木聚糖酯酶的氨基
酸序列。SEQ ID NO 18是實施例1中使用的引物f27405的核苷酸序列。SEQ ID NO 19是實施例1中使用的引物r27405的核苷酸序列。SEQ ID NO 20是由用於製備實施例1中使用的質粒pSW196的SEQ ID NO 18和 19擴增的核酸產物的核酸序列。SEQ ID NO 21是存在於CE-7糖酯酶中的4個保守基序的鄰接胺基酸序列。SEQ ID NO 22 是實施例 8 中使用的正向引物[TAACTGCAGTMGGAGGAAT AGGACATGGC CTTCTTCGAT TTACCCACTC]的核苷酸序列。SEQ ID NO 23 是實施例 8 中使用的反向引物[TGATCTAGATTAGCCTTTCT CMATAGTTTTTTCAAGA]的核苷酸序列。SEQ ID NO 24是由用於製備質粒pSW207的SEQ ID NO 22和23擴增的核酸產物的核酸序列。SEQ ID NO 25 是實施例 8 中使用的正向引物[TAAGMTTCTMGGAATAGG ACATGGCGTT TCTTCGACCT GCCTCTG]的核苷酸序列。SEQ ID NO :26 是實施例 8 中使用的反向引物[AAACTGCAGTTAGCCCTTCT CMACAGTTT CTTCAG]的核苷酸序列。SEQ ID NO 27是由用於製備實施例8中使用的質粒的SEQ ID NO 25禾口 26擴增的核酸產物的核酸序列。SEQ ID NO 28是實施例9中使用的正向引物Tma_ C277Sf [GGACAACATCTCACCTCCTTCTA]的核苷酸序列。SEQ ID NO :29是實施例9中使用的正向反向引物Tma_ C227Sr [TAGAAGGAGGTGAGATGTTGTCC]的核苷酸序列。SEQ ID NO :30是實施例9中使用的質粒pSW2^的T. maritima (海棲熱袍菌)乙醯木聚糖酯酶的密碼子優化序列。發明詳述除非另行指出，所有百分數、份數、比率等均按重量計。商標以大寫體標示。此外， 當數量、濃度或其他數值或參數以範圍、優選範圍或優選上限數值和優選下限數值的列表形式給出時，此類公開將具有相同的效應，因為如果在指定範圍內的每個單獨數值-以及在公開範圍內獲取自任意兩個單獨數值的組合的任何範圍-已被具體描述，甚至假如所述單獨數值不是本文唯一或單獨公開的。除非另行指出，凡在本文中給出某一數值範圍之處， 該範圍均旨在包含其端點，以及位於該範圍內的所有整數和分數。除非明確說明，當定義一個範圍時，不旨在將本發明的範圍限定於所列舉的具體數值。為清楚起見，本文使用的術語應理解為如本文所述，或如本發明的領域中的普通技術人員所理解的那樣。此外，本文所使用的某些術語的解釋提供如下「過酸」是其中酸性-OH基已被-OOH基取代的羧酸。如本文所用，「過酸」與過氧酸(peroxyacid)、過氧酸(peroxy acid)、過羧酸(percarboxylic acid)禾口過氧性酸 (peroxoic acid)同義。過酸包括過乙酸，這一點通常是已知的。如本文所用，術語「過乙酸」或「PAA」與過氧乙酸、乙過氧酸(ethan印eroxoic acid)和CAS登記號79_21_0的所有其他同義詞同義。「甘油三乙酸酯」與三乙酸甘油；三乙酸甘油酯；甘油三醋酸酯，1，2，3-三乙醯氧基丙烷、1，2，3_丙三醇三乙酸酯以及CAS登記號102-76-1的所有其他同義詞同義。「過氧源」是指可被釋放到溶液中的任何過氧化物化合物或包含過氧化氫的化合物。「剪切速率」是指流動物質中的速度梯度並以秒的倒數(S—1)的SI單位進行測量。「剪切致稀特性」或「假塑性特性」是指隨著剪切速率提高顯示出粘度降低的流體。「易於移除的」是指在施用所述液體塗料組合物到受關注的表面後易於移除形成的塗層，但不至於被無意的物理接觸移除。「非揮發性的」是指其蒸汽壓在25°C低於1000帕斯卡的化合物。
「惰性溶劑或水性溶劑」是指有利於施用所述塗料組合物到所述位點的水或任何其他溶劑。水性溶劑也可用於清洗被塗覆的表面以按需移除塗層。「成膜試劑」或「水溶性或水分散性塗層劑」在本文中可互換使用，它們是指形成膜並被用於向受關注的表面提供保護性塗層的塗劑。這些塗劑或是水溶性的，或是水分散性的。這些塗劑進一步詳述於下文中。「金屬螯合劑」或「多價螯合劑」是指結合金屬或含金屬的雜質並阻止它們對過氧化氫或過氧酸的分解催化的製劑。「流變改性劑」或「流變劑」是指提高粘度和/或提供剪切致稀特性給組合物，並引起含水處理劑或塗料組合物粘附到受關注的表面的化合物。「重量％ 」是指相對於溶液或分散體總重量的重量百分比。「液體塗料組合物」是指包含至少一種水溶性成膜試劑、惰性溶劑、羧酸酯底物、過氧源、以及具有過水解酶活性的酶催化劑的組合物，其中製備至少一種過氧酸。如本文所用，「抗微生物劑」或「抗微生物特性」是指製劑殺滅微生物、阻止或預防微生物汙染(例如形成屏障)、或抑制或阻止微生物生長、捕集微生物以滅殺、阻止生物膜形成或除去/移除生物膜的能力。如本文所用，「抗微生物劑」是指具有抗微生物特性的化合物或物質。「微生物」旨在包括由系統發育範圍的細菌和古生菌、以及單細胞(例如酵母)和絲狀(例如黴菌)真菌、單細胞和絲狀藻類、單細胞和多細胞寄生生物、病毒、朊病毒和類病毒組成的任何生物。如本文所用，「生物殺滅劑」是指通常廣譜的化學試劑，它滅活或破壞微生物。將表現出滅活或破壞微生物能力的化學試劑稱為具有「生物殺滅」活性。「生物膜」是指包被在自身生長的聚合物基體內並附著到活的或惰性的表面微生物結構化群落。「乾燥」是指存在於製劑中的惰性溶劑或任何其他液體通過蒸發而被除去的過程。「消毒劑」是指提供抗微生物活性的一種製劑。根據官方的消毒劑測試，消毒劑是在測試條件下在10分鐘內殺死99. 9%的特定測試微生物的化學製品。(Germicidal and Detergent Sanitizing Action of Disinfectants, Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists,第 960. 09 段及適用章節，第 15 版， 1990 (EPA Guideline 91-2)) 「一個酶活性單位」或「一個活性單位」或「U」定義為，在指定溫度每分鐘產生1微摩爾過酸產物所需的過水解酶活性的量。將「半衰期」或「 τ 」定義為PAA濃度已下降到其最大值一半時的時間。 「酶催化劑，，和「過水解酶催化劑，，互換使用並且是指包含具有過水解活性的酶的催化劑，即，表現出催化過氧化物源和底物之間的反應以形成過酸的能力的酶，並且所述酶可為完整微生物細胞、透化的微生物的一個或多個細胞、微生物細胞提取物的一種或多種細胞組分、部分純化的酶、或純化酶的形式。「乙醯木聚糖酯酶」是指酶(Ε. C. 3. 1. 1. 72 ；ΑΧΕ)，其催化乙醯化木聚糖和其他乙醯化糖類的脫乙醯作用，並且也具有顯著的過水解活性適於由羧酸酯來製備過羧酸。「基因」是指能夠表達特定蛋白質的核酸分子，其包括編碼序列前的調控序列(5'非編碼序列)和編碼序列後的調控序列(3'非編碼序列)。「分離的核酸片段」和「分離的核酸分子」可互換使用，並且是指單鏈或雙鏈的，任選含有合成的、非天然的或改變了的核苷酸鹼基的RNA或DNA聚合物。DNA聚合物形式的分離型核酸分子可由cDNA、基因組DNA或合成DNA的一個或多個片段構成。「表達」是指源於本發明的核酸分子的有義(mRNA)或反義RNA的轉錄和穩定積聚。 表達也可指將mRNA翻譯成多肽。「轉化」是指將核酸分子轉入宿主生物的基因組中，使得基因穩定遺傳。在本發明中，宿主細胞的基因組包括染色體和染色體外(如質粒)基因。含有轉化核酸分子的宿主生物被稱為「轉基因」或「重組」或「轉化」生物。「ATCC」是指美國典型培養物保藏中心。位於Virginia，USA的微生物保藏中心。「第一抗微生物劑」是指根據本發明的方法在塗料組合物中原位生成的抗微生物齊U。在一個優選的實施方案中，第一抗微生物劑為過氧酸。「第二抗微生物劑」是指除了存在於塗料組合物中的過氧酸之外的附加抗微生物齊U。根據本方法，這種製劑不是原位生成的。在一個優選的實施方案中，第二抗微生物劑為季銨化合物。「RGQ」是指在SEQ ID NO :1位118-120的胺基酸殘基的高度保守基序，所述序列是CE-7酶家族的特徵。「GXSQG」是指在SEQ ID NO 1位179-183的胺基酸殘基的高度保守基序，所述序列是CE-7酶家族的特徵。「HE」是指在SEQ ID NO 1位四8_四9的胺基酸殘基的高度保守基序，所述序列是 CE-7酶家族的特徵。「LXD」是指在SEQ ID NO 1位沈7力69的胺基酸殘基的高度保守基序，所述序列是CE-7酶家族的特徵。「基本上類似於」是指核酸分子其中一個或多個核苷酸鹼基上的改變導致增加、取代、或缺失一個或多個胺基酸，但不影響DNA序列編碼蛋白的功能特性(即，過水解活性)。「特徵基序」、「CE-7特徵基序」和「標籤基序」是指具有定義活性如過水解酶活性的酶家族共有的保守結構。在一個方面，本發明為包括使用過水解酶與過氧源和羧酸酯的組合以形成過氧酸的方法。過水解酶是催化過氧源(例如過氧化氫)與選擇的底物的反應以形成過酸的酶。 如上文所述，具有過水解酶活性的酶包括但不限於脂肪酶、酯酶、蛋白酶、非血紅素滷代過氧化物酶和CE-7族的糖酯酶如乙醯木聚糖酯酶或先鋒黴素C脫乙醯酶。這些酶的過水解活性的應用已在共有的美國專利公開申請2009/0005590A1、美國專利公開申請2008/0176299A1和美國專利公開申請2007/042924A1和美國專利公開申請 61/102，520中進行了描述，其全文均以引用方式併入本文。在結構上屬於CE-7酯酶家族的某些酶(例如頭孢菌素C脫乙醯酶(CAH)和乙醯木聚糖酯酶(AXE)表現出用於將羧酸酯(在過氧的無機來源例如過氧化氫、過碳酸鈉、過硼酸鈉存在下)轉化成濃度足以用作消毒劑和/或漂白劑的過酸的顯著過氧化水解活性。該體系通過在不需要高濃度過氧的情況下製備高濃度的過酸來達到高效率(例如，如共有的美國專利申請公布2008/0176299A1所述的那樣)。
過水解酶催化劑可用作完整微生物細胞、透化的微生物細胞、微生物細胞提取物的一種或多種細胞組分、部分純化的酶、或純化酶。酶催化劑還可為化學改性的(例如通過聚乙二醇化或通過與交聯試劑反應來改性)。還可使用本領域技術人員熟知的方法將過水解酶催化劑固定到可溶性或不溶性載體。CE-7家族的糖酯酶CE-7家族成員，先鋒黴素C脫乙醯酶(E.C.3. 1. 1. 41 ；系統命名先鋒黴素 C乙醯水解酶；CAH)和乙醯木聚糖酯酶(E.C. 3.1.1.72)存在於植物、真菌(如頂頭 ？包黴(Cephalosporidium acremonium))、酵母(如圓紅冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)、粘紅酵母(Rhodotorula glutinis))和細菌(如熱厭氧桿菌屬 (Thermoanaerobacterium sp. )、Norcardia Iactamdurans> VX & ^f M M W W ^ ) 員)中(Politino 等人，Appl. Environ. Microbiol,63 :4807-4811,1997) ；Sakai 等人， J. Ferment. Bioeng. 85 :53-57,1998) ；Lorenz, W.禾口 Wiegel, J. , J. Bacteriol. , 179 5436-5441，1997) ；Cardoza 等人，Appl. Microbiol. Biotechnol.，54:406-412,2000)； Mitshushima 等人，同上，Abbott, B.和 Fukuda，D.，Appl. Microbiol. 30 :413-419,1975)； Vincent 等人，J. Mol. Biol.，330 :593-606,2003, Takami 等人，NAR, 28 :4317-4331,2000)； Rey 等人』 Genome Biol. ,5 article 77,2004) ；Degrassi 等人』 Microbiology. , 146 1585-1591，2000)；美國專利公開6，645，233 ；美國專利公開5，281，525 ；美國專利公開 5，338，676 ；和WO 99/03984。與SEQ ID NO 1具有顯著同源性的CE-7家族成員的不完全列表在SEQ ID NO 1-18中提供。作為(Vincent等人，同上)CE_7家族成員的糖酯酶，先鋒黴素C脫乙醯酶 (E. C. 3. 1. 1. 41)和乙醯木聚糖酯酶(E. C. 3. 1. 1. 72)水解在乙醯化聚合木聚糖、乙醯化木糖、乙醯化葡萄糖和乙醯化纖維素上的乙醯基。因此，乙醯化糖類可為用於使用本發明的方法(即在過氧源的存在下)產生過羧酸的合適底物。乙醯化糖類的實例包括但不限於乙醯化葡萄糖(例如葡萄糖五乙酸酯)、乙醯化甘露糖、乙醯化木糖(例如木糖四乙酸酯)和乙醯化纖維素。一些酶如那些適用於本發明方法的酶具有標記基序，所述基序可用於限定和/或鑑定結構上相關的酶家族，所述酶對限定的底物家族具有相似的酶活性。特徵基序可為單個鄰接胺基酸序列或不連續的保守基序的集合，它們一起形成特徵基序。通常，保守基序以胺基酸序列表示。如本文所述，本發明的過水解酶屬於CE-7家族的糖酯酶。該酶家族能通過如下所述存在的標記基序進行限定。CE-7家族成員是與眾不同的，因為它們通常表現出對乙醯化低聚木糖和先鋒黴素 C的酯水解活性，表明CE-7家族提供對小範圍底物具有多功能脫乙醯酶活性的單獨一類蛋白(Vincent等人，同上)。VinCent等人描述了該家族成員之間的結構相似性並限定了 CE-7 家族(SEQ ID NO 21)的標記序列基序特徵。利用CLUSTALW與參考序列SEQ ID N0:1進行比對的CE-7特徵基序具有若干個高度保守的基序，所述基序是該家族的特徵基序，其包括 SEQ ID NO 1 的殘基 118-120 (RGQ)、SEQ ID NO 1 的殘基 179-183 (GXSQG)、SEQ ID NO 1的殘基^8499(HE)和SEQ ID NO 1的殘基沈7力69 (LXD)。胺基酸序列的多重比對可使用Higgins和Sharp，CABI0S，5 :151-153(1989)的Clustal比對方法進行，默認參數(空位罰分=10，空位長度罰分=10)。使用Clustal方法的成對比對的默認參數通常為KTUPLE1，空位罰分=3，窗口 = 5，DIAGONALS SAVED = 5。過水解酶的胺基酸序列與本文報導的序列有至少50%，優選地至少60%，更優選地至少70 %，甚至更優選地至少80 %，甚至更優選地至少90 %，甚至更優選地至少95 %，最優選地至少99%的相似性，其中所得酶保留本發明的功能特性(即過水解活性)，它們適用於本發明的方法。術語「基本上類似於」也可指具有過水解活性的酶，該酶由在嚴格條件下與本文報導的胺基酸序列的核酸分子(例如SEQ ID NO :1-17和30)雜交的核酸分子編碼。 因此，應當理解，本發明不僅僅涵蓋特定的示例性序列。在本文示例的過水解酶之間對整體百分比同一性的比較表明，與SEQ ID N0:1具有少至33%同一性的酶(但保留了特徵基序)表現出顯著的過水解酶活性，並且在結構上歸為CE-7糖酯酶。在一個實施方案中，用於該方法的其中一個過水解酶催化劑包括具有CE-7特徵基序的酶，該基序利用CLUSTALW與參考序列SEQ ID NO=I進行比對所述標記基序包含i)在SEQ ID NO 1的胺基酸位置118-120的RGQ基序；ii)在SEQ ID NO 1的胺基酸位置179-183的GXSQG基序；和iii)在SEQ ID NO 1的胺基酸位置四8_四9的HE基序；其中所述酶也與SEQ ID NO 1具有至少30%的胺基酸同一性。在另一個實施方案中，該特徵基序還包含第四保守基序，其被定義為當用 CLUSTALff比對參考序列SEQ ID NO=I時在第267-269胺基酸殘基位置的LXD基序。在另一個實施方案中，過水解酶催化劑包括具有選自SEQ ID NO :1_17和30的過水解酶活性的酶，或基本上類似的具有過水解酶活性的酶，所述酶通過取代、刪除或添加一個或多個胺基酸到所述胺基酸序列來得到。在另一個實施方案中，具有過水解酶活性的基本上類似的酶與選自SEQ ID NO 1-17和30的一個或多個胺基酸序列具有至少90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%， 97%，98%，或 99%的同一性。在另一個實施方案中，過水解酶催化劑包含與如SEQ ID NO 1定義的鄰接特徵基序具有至少30%，優選至少36%的胺基酸同一性的酶，其中上述標記基序(例如RGQ、GXSQG 和HE，以及任選LXD)被保留。在另一個實施方案中，本發明方法的過水解酶體系與附加的酶聯合使用，附加的酶包括但不限於蛋白酶、澱粉酶等。實際上，預期多種酶將用於本發明，包括但不限於微生物細胞壁降解和糖蛋白降解酶、溶菌酶、半纖維素酶、過氧化物酶、蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角質酶、果膠酶、角蛋白酶、異構還原酶、氧化酶、酚氧化酶、月旨氧合酶、木素酶、支鏈澱粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、麥拉寧酶、13-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明質酸酶、軟骨素酶、漆酶、內葡聚糖酶、PNGase、澱粉酶等，以及或它們的混合物。在一些實施方案中，酶穩定劑用於本發明的方法。預期通過酶的組合使用，將同時減少該方法中所需的化學製品的量。雖然在一個優選的實施方案中，已將結構上相關的糖類家族酯酶家族CE-7的成員的過水解活性用於本方法，獲取自任何來源的任何過水解酶也可用於本方法，所述過水解酶在過氧化氫的存在下主要將酯底物轉化成過酸。此外，一些水解酶可用於現有方法。就此目的，合適的水解酶包括(1)屬於肽基-肽水解酶類的蛋白酶(例如胃蛋白酶、胃蛋白酶B、凝乳酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶A、 胰凝乳蛋白酶B、彈性蛋白酶、腸激酶、組織蛋白酶C、木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、無花果蛋白酶、凝血酶、纖溶酶、腎素、枯草桿菌蛋白酶、麴黴肽酶A、膠原酶、梭狀芽胞桿菌肽酶B、 激肽釋放酶、胃亞蛋白酶、組織蛋白酶D、菠蘿蛋白酶、角蛋白酶、胰凝乳蛋白酶C、胃蛋白酶 C、麴黴肽酶B、尿激酶、羧肽酶A和B、以及氨基肽酶)；( 甲酸酯水解酶，包括羧基酯酶、月旨肪酶、果膠酯酶和葉綠素酶；以及C3)具有高過水解與水解比率的酶。在它們中尤其有效的是使用本發明方法的過水解酶初級、次級、三級、和/或四級結構特徵的脂肪酶，以及表現出高過水解與水解比率的酯酶，以及蛋白工程化的酯酶、角質酶和脂肪酶。合適的酶促反應混合物「合適的酶促反應混合物」、「適於原位生產過酸的組分」、「合適的反應組分」、以及 「合適的含水反應混合物」在本文中互換使用，並且指其中反應物和酶催化劑發生接觸的材料和溶液。本文提供了合適的含水反應混合物的組分，並且本領域技術人員應當理解適於本發明方法的組分變化範圍。在一個實施方案中，合適的酶促反應混合物在反應組分組合後原位生產過酸。像這樣的，可提供反應組分作為其中一種或多種反應組分保持分離直至使用的多組分體系。 用於使多種活性組分組合的體系的設計是本領域已知的，並且一般將取決於各反應組分的物理形式。例如，多活性流體(液-液)體系通常使用多室分配瓶或兩相體系(美國專利申請公開2005/0139608 ；美國專利5，398，846 ；美國專利5，624，634 ；美國專利6，391，840 ； EP專利0807156B1 ；美國專利申請公開2005/0008526 ；和PCT公開WO 00/11713A1)，例如在其中所需漂白劑在使反應性流體混合後產生的某些漂白應用中發現的。用於生成過酸的多組分體系的其他形式可包括但不限於設計用於一種或多種固體組分或固體-液體組分組合的那些，例如粉末(如多種可商購獲得的漂白組合物，美國專利公開5，116，575)、多層片劑(美國專利6，210，639)、具有多個隔室的水溶性包(美國專利6，995，125)和在添加水後反應的固體凝聚物(美國專利6，319，888)。在另一方面，用於組合反應組分的合適系統使用雙噴嘴瓶，如美國專利公開申請公布2005/014427所公開的那樣。適用於本發明方法的供選擇裝置為如EP專利0715899B1 所公開的雙隔室觸發-活化流體分配器。在另一方面，用於混合合適反應組分的合適體系可為具有將反應組分分開的膜的容器，其中在使用前通過機械力使膜破裂時，混合反應組分。在另一方面，適用的裝置可為袋內袋。在另一方面，如本發明方法所述用於組合或混合適用酶反應混合物的裝置包括系統、裝置、容器、套件、多件包裝、袋、分配器和本領域技術人員已知的用於使反應組分在使用前保持分離的施用裝置。在另一方面，酶過水解產物組合物可包含提供所需功能的附加組分。這些附加組分包括但不限於緩衝劑、洗滌劑助劑、增稠劑、乳化劑、表面活性劑、潤溼劑、腐蝕抑制劑 (如苯並三唑)、酶穩定劑和過氧化物穩定劑(如金屬離子螯合劑)。許多附加組分為洗滌劑工業中熟知的(參見例如美國專利公開5，932，532;以引用方式併入本文)。乳化劑的實例包括但不限於聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮。增稠劑的實例包括但不限於LAP0NITE RD、 玉米澱粉、PVP、CARB0WAX 、CARB0P0L 、CABOSIL 、聚山梨酸酯20、聚乙烯醇(PVA)和卵磷月旨。緩衝體系的實例包括但不限於磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉；氨基磺酸/三乙醇胺；檸檬酸/三乙醇胺；酒石酸/三乙醇胺；琥珀酸/三乙醇胺；乙酸/三乙醇胺；和碳酸氫鈉/碳酸鈉。表面活性劑的實例包括但不限於a)非離子表面活性劑如環氧乙烷或環氧丙烷的嵌段共聚物、乙氧基化的或丙氧基化的直鏈和支鏈伯醇和仲醇、以及脂族氧化膦，b)陽離子表面活性劑如季銨化合物、尤其是具有結合氮原子、附加地結合三個C1-C2烷基的C8-C20烷基的季銨化合物，c)陰離子表面活性劑如烷烴羧酸(例如C8-C20脂肪酸)、膦酸烷基酯、烷基磺酸鹽(例如十二烷基磺酸鈉「SDS」)或直鏈或支鏈的烷基苯磺酸鹽、烯基磺酸鹽，和d) 兩性和兩性離子表面活性劑如氨基羧酸、氨基二羧酸、烷基甜菜鹼、以及它們的混合物。附加組分可包括芳香劑、染料、過氧化氫穩定劑(例如金屬螯合劑如1-羥基亞乙基-1，1- 二膦酸(DEQUEST 2010，Solutia Inc. , St. Louis, Mo.和乙二胺四乙酸(EDTA))、TURPINAL SL、DEQUEST 0520, DEQUEST 0531、酶活性穩定劑(例如聚乙二醇(PEG))、以及洗滌劑助劑。在另一方面，可在接觸需消毒的表面或無生命物體前預混酶促過水解產物以生成期望濃度的過氧羧酸。在另一方面，可預混酶促過水解產物以生成期望濃度的過氧羧酸並可任選地用水或主要由水組成的溶液稀釋以製備具有期望較低濃度過酸的混合物。在另一方面，不在接觸需消毒的表面或無生命物體前預混酶促過水解產物以生成期望濃度的過氧羧酸，而是相反地，使生成期望濃度的過羧酸的反應混合物組分接觸需消毒的表面或無生命物體，生成期望濃度的過氧羧酸。在一些實施方案中，反應混合物的組分在所述位點組合或混合。在一些實施方案中，將反應組分遞送或施用到所述位點並隨後混合或組合以生成期望的過氧酸。含水反應混合物中催化劑的濃度取決於催化劑的特定催化活性，對該濃度進行選擇以獲得所需的反應速率。過水解反應中催化劑的濃度通常在每毫升總反應體積中具有 0. OOOlmg至10mg，優選0. 0005mg至2. Omg的範圍。還可使用本領域技術人員熟知的方法將催化劑固定在可溶性或不溶性載體上；參見例如Immobilization of Enzymes and Cells ； Gordon F. Bickerstaff, Editor ；Humana Press，Totowa，N. J.，USA，1997。使用固定化催化劑允許在後續反應中進行回收和重複使用。酶催化劑可為完整的微生物細胞、透化的微生物細胞、微生物細胞提取物、部分純化的酶或純化的酶、以及它們的混合物的形式。在一個方面，通過組合羧酸酯的化學過水解和酶促過水解生成的過酸濃度足以提供有效濃度的過酸用於在期望PH進行期望的施用。在另一方面，本發明的方法提供酶和酶底物的組合以生產期望有效濃度的過酸，其中在不加入酶的情況下，製備的過酸濃度顯著更低。雖然在一些情況下通過無機過氧化物與酶底物的直接化學反應可存在基本的酶底物的化學過水解，但生成的過酸濃度可能不足以在期望的應用中提供有效的過酸濃度，並且加入合適的過水解酶催化劑到反應混合物中顯著提高總過酸濃度。通過至少一種羧酸酯的過水解生成的過酸(例如過乙酸)的濃度為在過水解反應開始10分鐘內，優選地在5分鐘內，以及最優選地在1分鐘內達到至少約2ppm，優選地至少 20ppm，優選地至少lOOppm，更優選地至少200ppm過酸，更優選地至少300ppm，更優選地至少500ppm，更優選地至少700ppm，更優選地至少約IOOOppm過酸，最優選地至少約2000ppm 過酸。在另一方面，在開始過水解反應後一小時內，更優選地在30分鐘內，最優選地在5分鐘內通過過水解催化劑生成的過酸濃度為至少約3000ppm，優選地至少5000ppm，更優選地 8000ppm，最優選地至少lOOOOppm。在一個方面，製備期望的濃度過酸所需的反應時間不超過約兩小時，優選地不超過約30分鐘，更優選地不超過約10分鐘，甚至更優選地不超過約 5分鐘，最優選地在約1分鐘或更短的時間內。在其他方面，在將所述反應組分結合後約1 分鐘至約168小時內，或約1分鐘至約48小時內，或約1分鐘至8小時內，或1分鐘至2小時內或其中的任何此類時間間隔內，將被一定濃度的微生物種群汙染的硬質表面或無生命物體與根據本文所述的方法形成的過酸接觸。對反應溫度進行選擇，以控制反應速率和酶催化劑活性的穩定性。反應溫度可在正好在高於反應混合物凝固點(大約0°c )至約75°C的範圍內，優選地在約5°C至約55°C 的範圍內。包含過酸的最終反應混合物的pH為約5至約9. 5，優選地約6至約8，更優選地約 6. 5至約7. 5。在另一個實施方案中，反應混合物的pH為酸性(pH < 7)。在反應期間或反應完成後反應混合物的PH可任選地通過加入合適緩衝液進行控制，包括但不限於磷酸鹽、 焦磷酸鹽、碳酸氫鹽、乙酸鹽、或檸檬酸鹽。使用緩衝劑時，其濃度通常為0. ImM至1.0M，優選 ImM 至 300mM，最優選 IOmM 至 100mM。在本發明的一個實施方案中，預混至少一些組分。預混是指混合塗料混合物的一種或多種單獨組分，但不是混合所有成膜組合物的期望組分。在最終施用或在特定位點使用前必須將塗料組合物的附加組分加到預混組分中。在另一個實施方案中，必須根據本發明的方法將兩種預混組分混合以形成期望的塗料組合物。本發明的塗料組合物的組分可被包含在多隔室圍堵體系中，該體系本文也稱為多隔室體系。多隔室體系是指在使用前使多隔室體系塗料體系的兩種或更多種反應組分保持分離的裝置。在一個方面，多隔室體系包括至少兩個隔室並可包含用於組合液體形式的反應化合物的多室分配瓶或雙相體系。在另一方面，粉末、多層片劑、或具有多個隔室的水不溶性小包可用於固體形式的化合物或固液形式的組合。在另一方面，用於在使用前使反應組分保持分離的任何種類的系統、裝置、容器、包裝、袋、套件、多件包裝、分配器、或用於使反應組分在使用前保持分離的施用裝置可根據本發明的方法使用。在施用後能夠用水溶液除去本發明的塗料。用於移除塗料的有效的水溶液為包含 60至100重量％的水、溶解或分散組分的剩餘組分的任何溶液。溶解或分散的組分包括但不限於溶劑如醇類、增溶劑、表面活性劑、鹽類、螯合劑、酸和鹼。本發明的抗微生物塗料為耐用塗料。在本發明的上下文中耐用性為施用的抗微生物塗層的特性或特徵，所述塗層在乾燥後在典型的使用條件下保留在表面上直至其被有意地開始移除或允許移除。使用條件是在塗層保留在目標表面上的本發明施用位點期間的普遍環境條件，並且可包括無意接觸水的情況。施用到目標表面的抗微生物塗層優選地可為連續的或基本上連續的。在本發明的上下文中連續的或基本上連續的指覆蓋目標表面的塗層無空隙、中斷、未覆蓋區域、或無意間留下暴露表面區域的塗層缺陷。本發明的塗層優選地為均勻的或基本上均勻的。在本發明的上下文中均勻的或基本上均勻的是指塗層在整個塗覆表面僅有小的厚度變化，在整個塗覆表面的塗層厚度的標準偏差在塗層厚度0-40 %的範圍內。不均勻的或基本上不均勻的塗層將不提供施加塗層的整個表面上均勻的抗微生物和移除特性，並且通常不均勻的塗層外觀對很多應用來說被認為是不美觀的。假塑性指數或剪切稀化指數(STI)提供對所述組合物可能表現出的松垂和滴落的抗性指示。在較低剪切速率下記錄的值除以在較高剪切速率下的值以得到STI。一般來講，塗覆材料的STI越高，其對松垂和滴落的抗性將越高。在該公開中將剪切稀化指數定義為在第一剪切速率和第二剪切速率下測得的粘度的比率，其中所述第二剪切速率的值是所述第一剪切速率的值得10倍。作為另外一種選擇，如果S—1中的剪切速率是已知的，也能夠通過用轉式粘度計在第一 rpm和第二 rpm測量粘度計算剪切稀化指數，其中所述第二 rpm 的值是所述第一 rpm的值的10倍。在實例中不受使用的特定第一剪切速率和第二剪切速率或用於計算STI的特定第一 rpm值和第二 rpm值的約束，將剪切稀化指數計算成在Irpm 和IOrpm測得的粘度比率。本發明的抗微生物塗層可用作消毒劑。如本文所定義，消毒劑是化學製品或化學製品混合物，其可為或(i)接觸食品的消毒劑，如果其目的在於控制表面上實際地或潛在地接觸食品的微生物，或(ii)不接觸食品的消毒劑，如果所述表面不旨在接觸食品。如本文所定義，接觸食品的消毒劑在測試方法條件下在30秒內殺死至少99. 999%的特定測試微生物，所述測試方法如EPA政策DIS/TSS-4 :「Efficacy data requirements-Sanitizing rises for previously cleaned food-contact surfaces，，，United States Environmental Protection Agency, 1979年1月30日所述。如本文所定義，不接觸食品的消毒劑在測試方法條件下在5分鐘內殺死至少99. 9%的特定測試微生物，所述測試方法如2003年4月10 日版並公布於 2003 年 7 月的 ASTM 標準 E 1153-03 」 Standard Test Method for Efficacy of Sanitizers Recommended for Inanimate Non-Food Contact Surfaces，，所述。本發明的塗料組合物能夠表現出殘餘的抗微生物功效，並表現出自我消毒特性。 「殘餘的抗微生物功效」或「自我消毒特性」指如本文所述形成的塗層的特性，其在乾燥後保持抗微生物活性。乾燥塗層的抗微生物活性能夠使用殘餘自我消毒(RSQ測試進行測量。一直以來對具有改善的抗微生物功效和改善的作用速度的抗微生物劑具有長期的需要。對此類製劑的特定需求根據預期應用(例如殺菌劑、消毒劑、滅菌劑、無菌包裝處理等)和可適用的公共健康需求而不同。例如，如Germicidal and Detergent Sanitizing Action of Disinfectants, Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists，第 960. 09 段和可適用的章節，第 15 版，1990 (EPA Guideline 91-2)所提出的那樣，消毒劑應在室溫下Q3_27°C )在30秒內對若干種測試生物提供99. 999%的減少效果(5-對數級的減少)。用於本發明的原位酶促產生的基於過酸的、可移除的抗微生物塗層組合物可用作標準消毒產品(例如稀釋的季銨化合物溶液、過酸泡沫等)的替代或補充，並且可作為保護性塗層用於正在使用的或未使用的設備的日常消毒、以及長期保護(數周或數月)。本公開的原位酶促產生的基於過酸的、可移除的抗微生物塗層組合物提供若干個優點，包括但不限於殺滅獨立生存的或浮遊的微生物和生存在生物膜中的微生物、通過防止生物膜形成並捕獲在塗層中、塗層下或換句話講與塗層接觸的微生物來減少或阻止微生物生長。本文公開的塗料組合物可通過用流變改性劑配製組合物進行改進以塗覆垂直的、傾斜的、複雜幾何形狀的或難以到達的表面。這使得該抗微生物劑能夠被施用於設備上或設備內的表面，而具有傳統的剪切-粘度特徵和在25°C低於約0. 01帕-秒的粘度的常規抗微生物溶液難以施用到所述表面上。水平的和垂直的表面可用無抗微生物劑廢料的薄層保護性塗層覆蓋，因為該塗層通過流變改性劑防止或極大地減少了滴落的發生。通過用合適的流變改性劑配製組合物和一定程度的交聯，可製備具有多種塗覆特性的塗料組合物，所述組合物將在表面光潔度和保護性能以及易移除性方面不同。本發明的塗料組合物提供若干個機制防止微生物或非微生物來源的汙染，例如泥土。例如，當施用液體塗料組合物時，通過塗料製劑中的抗微生物劑將在表面上浮遊的或鬆散附著的細胞殺滅、或減少或阻止其生長。此外，在施用本發明的液體抗微生物塗層組合物後，通過在施用的成膜組合物完全乾燥以提供抗微生物膜之前將抗微生物劑散布到水合生物膜中，表面上受生物膜保護的細胞將被殺死，或其生長可被減少或阻止。就持續的抗微生物活性而言，希望本發明的抗微生物膜為半滲透的。因此形成的抗微生物膜構成抗微生物劑的貯存器，其提供比通常在數秒或數分鐘內滴落的常規消毒漂洗液長得多的接觸時間。當塗層存在於位點上時，長時間保持的活性在多種應用中尤其有益。本發明的成膜抗微生物組合物不會迅速從目標表面上滴落，並且不易於被例如附帶的接觸除去。本發明塗料的膜的柔韌性、粘度、強度和粘附性的變型使得其適應特定的用途，因此在多種情況下提供持續可用的抗微生物保護效果，其中此類持續的活性(殘餘的有益效果)以前是不可用的。在本發明實施中使用的成膜水溶性或水分散性試劑可為下述任何製劑的至少其中一種，所述製劑為耐用的和可移除的。本發明的膜被設計為在相對溫和的條件下可移除的。例如，本發明的膜當用溫度高於15°C，優選地高於30°C的水溶液處理時能被移除。合適的成膜試劑選自但不限於聚乙烯醇、聚乙烯醇共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸、丙烯酸酯共聚物、離子烴聚合物、聚氨酯、多糖、官能化的多糖、米糠萃取物、葡甘露聚糖、瓜耳膠、 阿拉伯樹膠、joharmis樹膠、纖維素、甲基纖維素、乙基纖維素、羥甲基纖維素、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、羧乙基纖維素澱粉、羥基乙基澱粉、黃原膠、角叉菜膠、凝膠多糖、支鏈澱粉、膠質、葡聚糖、脫乙醯殼多糖、甘油、藻酸鈉、與鈣鹽交聯的藻酸鈉、角叉菜膠、環氧乙烷/ 環氧丙烷/環氧乙烷嵌段共聚物、以及它們的組合。本領域的技術人員可根據本發明的方法容易地選擇合適的分子量範圍以提供水溶解度範圍，從而提供易於移除的塗層。聚乙烯醇，有時稱為聚(乙烯基醇)，由聚乙烯乙酯通過水解製成，並且適用於本發明。聚乙烯醇的物理特性受分子量和水解度的控制。最常見的可用的聚乙烯醇等級，按水解度分級為87-89%等級(包含11-13摩爾％的殘餘的乙酸乙烯酯單位)，96%水解等級(包含4摩爾％的殘餘的乙酸乙烯酯單位)，以及「完全水解的」和「超水解」等級，分別為約98%和大於99%水解的。較低水解度的(例如74%和79% )也為可商購獲得的。一些優選的水解度為大於85摩爾％，或大於92摩爾％。本發明的聚乙烯醇組分還可為乙烯醇的共聚物，例如通過使乙酸乙烯酯與少量(至多約15摩爾％ )的其他單體的共聚物水解而獲得的。適當的共聚單體為例如丙烯酸、甲基丙烯酸、馬來酸或富馬酸、衣康酸等的酯。此夕卜，乙酸乙烯酯與烴如α-烯烴(例如乙烯、丙烯或十八烯，等等)、與較高級的乙烯酯如丁酸乙烯酯、2-己酸乙酯、硬脂酸酯、三甲基乙酸酯、或它們的同系物(由Siell Chem. Co.銷售的「vv-10」型乙烯酯)等的共聚作用產生可被水解為適當的聚乙烯醇共聚物的共聚物。 其他合適的共聚用單體為N-取代的丙烯醯胺、乙烯基氟化物、乙酸烯丙酯、烯丙醇等。此外游離的不飽和酸如丙烯酸、甲基丙烯酸、單甲基馬來酸等也可用作共聚用單體。由於有文獻中已知的或可商購獲得的多種等級，本領域的技術人員能夠通過以任何所期望的比例簡單地混合已知的或商品化的等級配製出具有從74%至大於99%範圍內的平均水解度的聚乙烯醇溶液。膜的柔韌性、水敏感度、溶解的容易程度、粘度、膜強度和聚乙烯醇膜的粘附性可通過調整分子量和水解度而不同。在一個實施方案中，用於本發明方法的聚乙烯醇具有約85%至大於99%的水解度。在另一個實施方案中，聚乙烯醇具有約87%至大於89%的水解度。在一個實施方案中，聚乙烯醇的數均分子量(Mn)在約4，000至約200，000，或約 4，000至約150，000，或10,000至約100，000之間的範圍內。在一個實施方案中，聚乙烯醇的分子量在約10，000和130，000之間的範圍內。在另一個實施方案中，可將不同分子量的聚乙烯醇混合以提供期望的特性。在一個實施方案中，聚乙烯醇按重量計以溶液重量的約2%至約30%使用。在一個更加具體的實施方案中，聚乙烯醇按重量計以溶液重量的約2%至約15%使用。在一個更加具體的實施方案中，聚乙烯醇按重量計以溶液重量的約5%至約12%使用。本發明的成膜組合物可包含按重量計約0.25%至約50%的濃度的PVP。適當等級的 PVP 可購自 hternational Specialty Products (Wayne，NJ，USA)。此類等級包括 K-15，具有在約6,000至約15,000範圍內的平均分子量(Mw) ；Κ-30，具有在約40，000至約80，000範圍內的分子量；Κ-60，具有在約Μ0，000至約450，000範圍內的分子量；Κ-90， 具有在約900，000至約1，500，000範圍內的分子量；和Κ-120，具有在約2，000，000至約 3，000, 000範圍內的分子量。PVP的混合物，以及PVP和其他成膜化合物的組合均可使用。 合適的等級在共有的和共同未決的美國專利申請美國專利2007/0275101Α1和美國專利 2008/0026026Α1中進行了描述，它們全文均以引用方式併入本文。通常，與相同濃度的較高分子量的PVP相比，較低分子量的PVP將產生粘性較低的產物。就給定濃度的PVP而言，隨著分子量範圍的提高，粘度也將升高。本發明可使用具有多種分子量範圍中的任何一種的PVP。然而，優選使用具有約15，000至約3，000, OOOg/ mol的分子量分布的PVP。具有這樣的分子量分布的通常產生具有可被容易地調整的粘度並且可被容易地洗掉而無與塗覆的表面相互作用的顯著跡象的成膜組合物。在一個優選的實施方案中，分子量分布在約15，000和約3，000, 000g/mol之間的PVP以按重量計在約 0. 25%和約40%之間的濃度存在。在另一個優選的實施方案中，分子量分布在約30，000和約1，200, 000g/mol之間的PVP以按重量計在約0. 25%和約10%之間的濃度存在。一類被廣泛識別為包括高效消毒劑的分子為有機過氧酸分子。近年來已開展了針對這些化合物的研究，目標至少是為它們提供穩定安全的遞送裝置。在過氧酸中，已受到最密切關注的是過氧乙酸(常稱為過乙酸或PAA)。這種特別的過氧酸很少分離成純化合物， 而是通常為在水和非水介質中的溶液。過氧乙酸常以平衡混合物形式供應，主要包括水、乙酸和過氧化氫，以及許多其他微量組分如穩定劑(W0 2006/076334 ；美國專利5，508，046)。 然而，甚至過氧乙酸的平衡體系本質上是熱力學不穩定的，這是由於過氧乙酸分解成乙酸和氧。如果採取特別措施，可延緩此類分解，但不能完全阻止。使得過氧酸難以使用或貯存的其他特性是它們可迅速猛烈地分解，尤其是低分子量和高純度的過氧酸。為了解決該問題，通常原位生成過氧酸以實現特定的期望功能。此類原位生成具有優點，因為製備的過氧酸量可通過選擇原料的相對組成進行化學計量學控制。此外，由於原位體系的非平衡本質， 可獲得比得自平衡體系的過氧酸更高濃度的過氧酸。也需要以所需速率生成過氧酸速率太慢可導致性能不佳。本發明的方法提供酶和酶底物的組合以生產期望有效濃度的過酸，其中在不加入酶的情況下，製備的過酸濃度顯著更低。雖然在一些情況下通過無機過氧化物與酶底物的直接化學反應可基本上化學過水解酶底物，但生成的過酸濃度可能不足以在期望應用中提供有效的過酸濃度，並且加入合適的過水解酶催化劑到反應混合物中顯著提高總過酸濃度。對過酸本質上缺乏穩定性的一個解決方案是提供一個體系，其中產生或反應形成過酸的反應組分保持分離狀態直到需要時(W02006/016145)。在本文所述的方法中考慮了對該問題的此類解決方案。在本發明中成膜組分與其他組分組合，所述其他組分包括羧酸酯底物、具有過水解酶活性的酶催化劑和過氧源。可將成膜組分和一種或多種以下組分羧酸酯底物、酶催化劑和過氧源一起在組合以形成抗微生物塗層組合物並施用到目標表面之前貯存在一個隔室中，或貯存在分開的隔室中。例如，可將來自羧酸酯底物、酶催化劑和過氧源的成膜組分貯存在分開的隔室中，並恰好在施用到目標表面之前組合，或可將成膜組分與羧酸酯底物一起貯存，但與酶催化劑或過氧源分開直到將它們組合併施用到目標表面時。本發明的方法使用具有過水解酶活性的酶以耐用的、連續的和易於移除的成膜組合物形式原位酶促生成有效濃度的過酸，所述酶來自糖酯酶CE-7家族。如本文所述，編碼所述酶(例如具有分離自那不勒斯棲熱袍菌(Thermotoga neapolitana)的胺基酸序列SEQ ID NO :7、分離自海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)的胺基酸序列SEQ ID NO :8、或基本上類似的胺基酸序列的酶)的基因適於在本發明方法中應用。如上文所公開的那樣，來自不同來源的具有過水解酶活性的其他酶也可用於本文所公開的方法。在一個優選的實施方案中，無機過氧化物源是過氧化氫。本發明不旨在受無機過氧化氫的限制。過氧化氫可使用酶催化劑和合適的底物生成。在本發明方法中使用生成過氧化氫和酸的任何酶以及適用底物。例如，來自乳桿菌(Lactobacillus)菌種的乳酸過氧化物酶可用於本發明方法，所述酶已知從乳酸和氧生產過氧化氫。能夠生成過氧化氫的其他酶(例如葡萄糖氧化酶、醇氧化酶、乙二醇氧化酶、甘油氧化酶、胺基酸氧化酶等)也與酯底物以及本發明方法的過水解酶組合生成過酸。本發明也使用從底物中生成酸、不生成過氧化氫的酶。此類酶的實例包括但不限於蛋白酶。在另一方面，過氧源可為任何過氧化物化合物並且可選自但不限於以下物質過氧化氫、過硼酸鈉一水合物、過硼酸鈉四水合物、過焦磷酸鈉、過氧化脲、過碳酸鈉、過氧化鈉、以及它們的混合物。在一個實施方案中，合適的底物包括酯，所述酯通過下式表示[XJmR5其中X =式Ii6C(O)O的酯基R6 = Cl至C7直鏈的、支鏈的或環狀的烴基部分，其任選地用羥基或Cl至C4烷氧基取代，其中當R6 = C2至C7時，&任選地包含一個或多個醚鍵；& = Cl至C6直鏈、支鏈或環狀烴基部分，其任選地用羥基取代；其中&中的每個碳原子各自包含不超過一個羥基或不超過一個酯基；其中&任選地包含一個或多個醚鍵；m = 1至&中碳原子數；並且其中所述酯的水中溶解度為25°C下至少5ppm。在另一個實施方案中，合適的底物也包括用下式表示的酯=R1-COO-R2，其中R1 =Cl至C7的直鏈或支鏈烷基，其任選地被羥基或Cl至C4烷氧基取代，並且& = Cl至 ClO的直鏈或支鏈烷基、烯基、炔基、芳基、烷基芳基、烷基雜芳基、雜芳基，-(CH2CH2-O)nH 或-(CH2CH (CH3) -0) nH 並且 η = 1 至 10。在另一個實施方案中，合適的底物也包括用下式表示的甘油酯 R1-COO-CH2-CH(OR3)-CH2-OR4，其中R1 = Cl至C7的直鏈或支鏈烷基，其任選地被羥基或Cl 至C4烷氧基取代，並且民和R4是單獨的H或R1C (0)。在另一個實施方案中，R6為任選地被羥基或Cl至C4烷氧基取代的Cl至C7支鏈的烴基部分，任選地包含一個或多個醚鍵。在一個更優選的實施方案中，&為任選地被羥基取代的C2至C7直鏈的烴基部分，和/或任選地包含一個或多個醚鍵。在另一個實施方案中，合適的底物也包括乙醯化的糖，其選自乙醯化的單糖、二糖和多糖。在一個優選的實施方案中，乙醯化糖類包括乙醯化單糖、二糖和多糖。在另一個實施方案中，乙醯化糖類選自乙醯化木聚糖、乙醯化木聚糖片段、乙醯化木糖(例如木糖四乙酸酯)、乙醯化葡萄糖(例如葡萄糖五乙酸酯)、β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯、 三-鄰-乙醯基-D-半乳醛和三-鄰-乙醯基-D-葡萄烯糖、以及乙醯化纖維素。在一個優選的實施方案中，乙醯化糖類選自β -D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯、三-鄰-乙醯基-D-半乳醛和三-鄰-乙醯基-D-葡萄烯糖，以及乙醯化纖維素。因此，乙醯化糖類可為用於使用本發明的方法(即在過氧源的存在下)產生過羧酸的合適底物。在一個實施方案中，所述底物的實例選自甘油一乙酸酯；甘油二乙酸酯；甘油三乙酸酯；甘油一丙酸酯；甘油二丙酸酯；甘油三丙酸酯；甘油一丁酸酯；甘油二丁酸酯；甘油三丁酸酯；葡萄糖五乙酸酯；木糖四乙酸酯；乙醯化木聚糖；乙醯化木聚糖片段； β -D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸鹽或酯；三-鄰-乙醯基-D-半乳醛；三-鄰-乙醯基-葡萄烯糖；1，2-乙二醇的單酯或二酯、1，2_丙二醇、1，3-丙二醇、1，2-丁二醇、1，3-丁二醇、 2，3- 丁二醇、1，4- 丁二醇、1，2-戊二醇、2，5-戊二醇、1，6-戊二醇、1，2-己二醇、2，5-己二醇、1，6_己二醇；以及它們的混合物。在一個優選的實施方案中，所述底物選自乙酸乙酯、乳酸甲酯、乳酸乙酯、乙醇酸甲酯、乙醇酸乙酯、甲氧基乙酸甲酯、甲氧基乙酸乙酯、3-羥基丁酸甲酯、3-羥基丁酸乙酯、 2-乙醯檸檬酸三乙酯、葡萄糖五乙酸酯、葡糖酸內酯、甘油酯(單甘油酯、二甘油酯和三甘油酯)如甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、甘油一丙酸酯、甘油二丙酸酯(二丙酸甘油基酯)、甘油三丙酸酯(1，2，3_三丙醯基甘油)、甘油一丁酸酯、甘油二丁酸酯(二丁酸甘油基酯)、甘油三丁酸酯(1，2，3-三丁醯基甘油)、乙醯化糖、以及它們的混合物。在另一個優選的方面，羧酸酯底物選自甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、甘油一丙酸酯、甘油二丙酸酯、甘油三丙酸酯、甘油一丁酸酯、甘油二丁酸酯、甘油三丁酸酯、乙酸乙酯和乳酸乙酯。在又一方面，羧酸酯底物選自甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、乙酸乙酯和乳酸乙酯。在一個優選的方面，羧酸酯為選自甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、以及它們的混合物的甘油酯。本發明使用的惰性溶劑包括水或包含至少50重量％水的溶液。附加的溶劑包括一元醇、單官能和多官能醇，優選包含約1至約6個碳原子和1至約6個羥基。實例包括乙醇、異丙醇、正丙醇、1，2-丙二醇、1，2-丁二醇、2-甲基-2，4-戊二醇、甘露糖醇和葡萄糖。 更高級的二醇類、聚乙二醇、多聚氧化物、乙二醇醚和丙二醇醚也是有用的。附加的溶劑包括游離酸和下列鹼金屬鹽磺化的烷基芳基如甲苯、二甲苯、異丙基苯和苯酚或苯酚醚或二苯醚磺化物；烷基和二烷基萘磺化物以及烷氧基化衍生物。對本發明有用的組合物還可包含一種或多種表面活性劑。不受理論的約束，據信表面活性劑將有助於潤溼要塗覆的表面並且將有助於通過膜而平坦覆蓋。據信表面活性劑也有助於當被移除時通過膜起泡，從而輔助移除膜並洗滌受保護的表面。合適的表面活性劑具有優選的約9至約17的親水-親脂平衡(HLB)。合適的表面活性劑包括但不限於兩性表面活性劑如來自iTomah Products的Amphoteric N ；矽酮表面活性劑如得自 BYK Chemie (BYK-Chemie GmbH，Wesel，Germany)的 BYK 348 ；氟化表面活性劑如得自 DuPont (Wilmington，DE，USA)的Zonyl FS300 ；和基於壬基苯酚聚氧乙烯醚的表面活性劑
如得自Dow(Midland，MI，USA) W1Triton N-IOl。其他合適的表面活性劑包括乙氧基化的癸炔二醇如得自 Air Products&Chemicals (Allentown, PA, USA)的 Surfynol 465 ；烷芳基聚醚如得自Dow的Triton CF-IO ；辛基苯氧聚乙氧基乙醇如得自Dow的Triton X-100 ；乙氧基化的醇如得自 Siell (The Hague, the Netherlands)的 Neodol 23-5 或 Neodol 91-8 ；得自 Dow 的 iTergitol 15-S-7 ；得自乂印&11 Company (Northfield, IL,USA) &Meol_4N，28% 的月桂基聚氧乙烯醚硫酸鈉；胺化氧如得自Mepan的Ammonyx LO ；Ε0/Ρ0嵌段共聚物如得自 BASF (Parsippany，NJ，USA)的Pluronic 17R4 ；脫水山梨糖醇衍生物如得自 Uniqema (New Castle,DE,USA)的Tween 20或Tween 60 ；和季銨化合物如苯扎氯銨。其他適當的表面活性劑包括有機金屬-矽氧烷表面活性劑，如得自ktre Chemical Company (Memphis, TN, USA) 的 Silwet L-77 ；得自 DowCorning Silicones (Midland,MI,USA)的 DowCorning Q2_5211 ； ^Hg Siltech Corporation (Toronto, ON, Canada)白勺 Silsurf A008。它對保護性薄膜的柔韌性和完整性可能是重要的，所得膜被塑化。就本發明而言所述膜的塑化已通過摻入合適的增塑劑如聚乙二醇或甘油來完成。適用於本發明的其他增塑劑包括但不限於溶劑、多元醇、平均分子量為200至800g/mol的聚乙二醇和山梨醇。PEG 相對於甘油來說是優選的，因為甘油易於被微生物代謝，潛在地導致微生物生長。加入增塑劑一般也允許膜保留輕微發粘的表面感覺。隨著增塑劑含量提高，所得膜也將表現出提高的粘著性。為了捕集空氣傳播的微粒和垢或其他物質，此類粘著性在低水平下可為期望的。然而，如果增塑劑含量太高，塗層變得過於發粘並且將顯示出對偶然的機械移除如擦拭的低抗性。優選的增塑劑量為成膜試劑重量的約1重量％至約20重量％，更優選地為約5重
量％至約10重量％。本發明可用的組合物也可包含一種或多種流變改性劑用於提高粘度、或增稠並引起含水處理劑或塗料組合物粘附到表面。粘附使該組合物能夠保持與臨時的和駐留的微生物接觸較長時間，增強殺菌功效並防止因為過多的滴落導致的垃圾。流變改性劑可為成膜試劑或與成膜試劑協同作用以形成提供附加保護的屏障。有用的水溶性或水分散性流變改性劑可被分類為無機的或有機的。有機增稠劑可進一步被分為天然的和合成聚合物，後者被進一步分為合成的天然基和合成的石油基。無機增稠劑一般為經過燻蒸或沉澱從而產生具有大的表面對尺寸比率的顆粒的化合物，例如膠態矽酸鎂鋁類(VEEGUM )、膠質粘土(膨潤土)、或二氧化矽(CAB-0-SIL )。有用的天然水凝膠增稠劑主要是蔬菜來源的流出物。例如，黃蓍膠、刺梧桐樹膠和阿拉伯樹膠；和提取物如角叉菜膠、刺槐豆膠、瓜耳膠和果膠；或純培養物發酵產物如黃原膠都潛在地可用於本發明。化學上講，所有這些材料均為複合的陰離子多糖的鹽。有用的合成的天然基增稠劑為纖維質的衍生物，其中在直鏈的脫水葡萄糖聚合物上的游離羥基已被醚化或酯化，從而產生在水中溶解並形成粘稠溶液的一類物質。這類材料包括烷基纖維素和羥基-烷基纖維素，具體地講包括甲基纖維素、羥乙基甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥丁基甲基纖維素、羥乙基纖維素、乙基羥乙基纖維素、羥丙纖維素和羧基甲基纖維素。另一類優選的增稠劑包括聚丙烯酸酯如專有的Acusol增稠劑，(例如Acusol 823, Rohm and Haas，Philadelphia，PA，USA)，和Carbopol增稠劑如Carbopol 934或Carbopol Aqua-30聚合物(B F Goodrich, Cleveland, OH, USA) 0附加的優選基於丙烯酸酯的流變改性劑包括專有的陽離子Mieovis 增稠劑(Ciba，Basel，Switzerland)。聚丙烯酸酯增稠劑可按成膜試劑的重量計以至多3重量％的濃度進行使用。也可使用增稠劑的混合物，其中取決於所使用的增稠劑和所期望的最終產物的粘度，所述混合物的總量可為按重量計至多3重量％。就本專利申請而言，其他可能的增稠劑包括糊精、玉米澱粉和含水矽酸鎂類，例如以商品名 Laponite XLG(Southern Clay Products, Inc.，Gonzales, TX, USA)銷售的矽酸鎂鈉。除了原位生成過氧酸之外，組合物中可存在一種或多種附加的抗微生物劑。對本發明有用的抗微生物劑可為無機劑或有機劑、或它們的混合物。本文所用術語「無機抗微生物劑」是對包含金屬或金屬離子如銀、鋅、銅等並且具有抗微生物特性的無機化合物的統稱。本發明不受對任何特定的抗微生物劑的選擇的限制，並且任何已知的水溶性或水分散性抗微生物劑均可被包括在本發明的組合物中，例如抗微生物劑、防黴劑、防腐敗劑、 消毒劑、消毒殺菌劑、殺菌劑、除藻劑、防汙塞劑、防腐劑、以及上述的組合等等，前提條件是所述抗微生物劑與組合物中的其他組分化學上相容。抗微生物劑的適當類別描述於下文中。可用的抗微生物劑的實例包括氯己定、葡萄糖酸氯己定、戊二醛、哈拉宗、六氯酚、 呋喃西林、迷他芬、硫柳汞、C1-C5-對羥基苯甲酸酯、次氯酸鹽、滷卡班、氯苄酚、酚醛樹脂、 醋酸磺胺米隆、鹽酸氨吖啶、季銨鹽、氯和溴釋放化合物(例如鹼和鹼土次氯酸鹽和次溴酸鹽、異氰尿酸鹽、乙內醯脲的氯化衍生物、磺醯胺、胺等)、過氧化物和過氧酸化合物(例如過乙酸、過辛酸)、質子化的短鏈羧酸、氧氯苯磺酸、美溴沙侖、汞溴紅、雙溴沙侖、甘油月桂酸酯、1-氧-2-巰基吡啶鈉和/或鋅、磷酸三鈉鹽、(十二烷基)(四甲二胺)甘氨酸和/或 (十二烷基)(氨基丙基)甘氨酸等。可用的季銨鹽包括N-Cltl-C24-烷基-N-苄基-季銨鹽，其包含水增溶的陰離子如滷化物，例如氯離子、溴離子和碘離子；硫酸鹽、硫酸二甲酯等以及雜環的亞胺如咪唑啉鹽。季銨鹽也可包括其他非滷化的陰離子如丙酸鹽和糖精等。有用的酚醛樹脂殺菌劑包括苯酚、間甲酚、鄰甲酚、對甲酚、鄰-苯基-苯酚、4-氯-間甲酚、氯二甲苯酚、6-正戊基-間甲酚、間苯二酚、間苯二酚-乙酸酯、對-叔丁基苯酚和鄰苄基-對氯酚。已知對防止黴菌菌落可見生長有效的有用的抗微生物劑包括例如3-碘代-2-炔丙基氨基甲酸丁酯、2-(4-噻唑基)苯並咪唑、對甲苯基二碘甲基碸、四氯間苯二甲腈、2-吡啶硫醇-1-氧化物(包括其鹽)的鋅絡合物以及上述的組合。包含抗微生物劑的塗料組合物提供對各種不同的微生物的防護。 在一個實施方案中，塗料組合物防護革蘭氏陽性菌或革蘭氏陰性菌。塗層抑制或殺滅的革蘭氏陽性菌包括但不限於破傷風梭菌(Clostridium tetani)、產氣莢膜梭菌(C. perfringens)、肉毒梭菌(C. botulinum)、其他梭菌屬(Clostridium)菌種、結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、牛分枝桿菌(M. bovis)、鼠傷寒分枝桿菌(M. typhimurium)、牛分枝桿菌(M. bovis)菌株BCG、BCG亞株、鳥分枝桿菌 (M. avium)、胞內分枝桿菌(M. intracellulare)、非洲分枝桿菌(M. africanum)、堪薩斯分枝桿菌(M. kansasii)、海魚分支桿菌(M. marinum)、潰瘍分枝桿菌(M. ulcerans)、 ^r ^ ff ^ S1J ^n tl M ft (Μ. avium subspecies paratuberculosis) > ^11^ (Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(S. epidermidis)、馬鏈球菌(S.equi)、酉良膿鏈球菌(Str印tococcus pyogenes)、無乳鏈球菌(S. agalactiae)、單核細胞增多性李其J 特菌(Listeria monocytogenes)、依氏李其jf特菌(L. ivanovii)、炭疽桿菌(Bacillus anthracis)、枯草芽孢桿菌(B. subtilis)、星形諾卡菌(Nocardia asteroides)禾口其他諾卡氏菌屬、草綠色鏈球菌(Sti^ptococcus viridans group)、消化球菌屬菌種 (Peptococcus species)、消化鏈球菌屬菌禾中(Peptostreptococcus species)、衣氏放線菌(Actinomyces israelii)禾口其他放線菌屬菌種(Actinomyces species)、疫抱丙酸桿菌(Propionibacterium acnes)禾口腸球菌屬菌禾中(Enterococcus species)。塗層抑制或殺滅的革蘭氏陰性菌包括但不限於銅綠假單胞菌O^eudomonas aeruginosa)、其他假單胞菌屬菌禾中(Pseudomonas species)、彎曲桿菌屬菌禾中(Campylobacter species)、霍舌L 弧菌(Vibrio cholerae)、埃利希氏體屬菌種(Ehrlichia species)、胸膜肺炎放線桿菌 (Actinobacillus pleuropneumoniae) >}§iilfii EiSff^ lif (Pasteurella haemolytica) > Hj 血敗血性巴斯德菌(P.multocida)、其他巴斯德屬菌種(Pasteurella species)、退伍軍人 ^ (Legionella pneumophila)(Legionella species)
菌(Salmonella typhi)、其他沙門氏菌屬菌種(Salmonella species)、志賀氏菌屬菌種 (Shigella species)流產布魯氏菌(Brucella abortus)、其他布魯氏菌菌種(Brucella species)、沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)、鸚鵡熱衣原體(C. psittaci)、伯氏考克斯氏體(Coxiella burnetti)、腦膜炎雙球菌(Neiserria meningitidis)、淋球菌 (N. gonorrhea) ^iJit^Bf ilff^ (Haemophilus influenzae) ^tt^lfBf i&ff^ (H. ducreyi)、 其他嗜血桿菌菌種(Haemophilus species)、鼠疫耶爾森氏桿菌(Yersinia pestis)、小腸結腸炎耶爾森氏菌(Y. enterolitica)、其他耶爾森氏菌屬菌種(Yersinia species)、大腸桿菌(Escherichia coli)、希拉腸球菌(E. hirae)和其他埃希氏菌屬菌種(Escherichia species)、以及其他腸桿菌(Enterobacteriacae)、洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderia c印acia)、類鼻疽伯克霍爾德菌(B. pseudomallei)、土拉熱弗朗西絲菌(Francisella tularensis)> 月危弱擬木幹菌(Bacteroides fragilis)> 核半立梭菌(Fusobacterium nucleatum) ^Ι ^Κ^Μ^ Ψ (Provetella species)、雲力_#|||| ft # (Cowdriaruminantium)、克雷伯氏菌屬菌種(Klebsiella species)禾口變形桿菌屬菌種(Proteus species)。在另一個實施方案中，所述塗層提供對真菌的保護，所述真菌包括但不限於鏈格抱屬(Alternaria alternata)、漂麴黴(Aspergillus niger)、出芽短梗黴(Aureobasidium pullulans)、支孢樣支孢黴(Cladosporium cladosporioides)、澳大利亞德氏黴 (Drechslera australiensis) Λ 7^^1^ (Gliomastix cerealis)、禾g ^ (Monilia grisea)、團青黴(Penicillium commune)、類蓮點黴(Phoma fimeti)、紙皮思黴 (Pithomyces chartarum)禾口人類線狀擔子菌(Scolecobasidium humicola)。痕量雜質尤其是金屬可與過氧化氫和過氧酸反應並引起分解。因此許多過氧化物/過氧酸組合物包括穩定成分，例如鰲合金屬的化合物和包含金屬的雜質材料。優選的螯合劑的實例包括但不限於，亞烷基氨基磷酸或其鹽，它們中的一些以商品名Deepest (Thermphos, Vlissingen, the Netherlands)售賣、1_ 羥基亞乙基 _1，1_ 二膦酸及其鹽，它們中的一些以商品名Turpinal (Thermphos)售賣，和2-膦醯基-1，2，4-丁烷三羧酸或其鹽，其以 Bayhibit 的商品名得自 LANXESS Corporation (Pittsburgh，PA，USA)。另一類適用的化合物是氨基羧酸或其鹽。一個實例為乙二胺四乙酸。此外，其他適用的螯合劑包括吡啶二羧酸、乙烷-1，1，2-三膦酸和亞乙基-1，1- 二膦酸。此外，本領域也熟知的螯合劑為磷酸鹽、多磷酸鹽、焦磷酸鹽和羧酸如檸檬酸或水楊酸。將有足量的穩定劑或多種穩定劑存在以抑制過氧化物/過氧酸的分解。本發明可任選地包括著色劑或染料。對本發明有用的著色劑包括染料和顏料如食品級顏料。對本發明有用的染料既包括水溶性的也包括水不溶性的染料。水溶性染料可被容易地配入到本發明的含水體系中。水不溶性的染料可被包括在可分散於或懸浮於對本發明有用的抗微生物塗層組合物中的油相中。就本發明的目的而言，有用的染料通常為吸收可見光從而導致可發現顏色的顯現的有機化合物。也可使用螢光染料，例如為了通過紫外光使膜顯色。在本發明中典型有用的染料是被批准用於食物、藥物、化妝品和醫療設備的著色齊U。當前使用的著色劑以及它們的狀態如下食品中允許使用的著色劑為(1)經過認證的 FD&C 藍 1 號、FD&C 藍 2 號、FD&C 綠 3 號、FD&C 紅 3 號、FD&C 紅 40 號、FD&C 黃 5 號、FD&C 黃6號、Citrus紅2號和橙(B) (2)免除認證的胭脂樹橙提取物、θ -衍-8'-胡蘿蔔素醛、角黃素、焦糖、Θ-胡蘿蔔素、胡蘿蔔油、胭脂蟲提取物(胭脂紅)、玉米胚乳油、脫水甜菜(甜菜粉末)、幹藻類粗粉、葡萄糖酸亞鐵、果汁、葡萄顏色提取物、葡萄皮提取物、甜辣椒、辣椒油、核黃素、藏紅花、合成氧化鐵、萬壽菊粗粉和提取物、二氧化鈦、部分烘烤的脫脂烹煮棉籽粉、薑黃、薑黃油樹脂、群青藍和蔬菜汁。藥物中允許使用的著色劑(包括食品中允許使用的著色劑)為(1)經過認證的FD&C紅4號、D&C藍4號、D&C藍9號、D&C綠5 號、D&C綠6號、D&C綠8號、D&C橙黃4號、D&C橙黃5號、D&C橙黃10號、D&C橙黃11號、 D&C紅6號、D&C紅7號、D&C紅17號、D&C紅21、D&C紅22號、D&C紅27號、D&C紅沘號、 D&C紅30號、D&C紅31號、D&C紅33號、D&C紅34號、D&C紅36號、D&C紅39號、D&C紫 2號、D&C黃7號、D&C黃8號、D&C黃10號、D&C黃11號和Ext. D&C黃7號。此夕卜，雞油菌素、β胡蘿蔔素、葉綠酸和其他色素是已知的。對於被批准的色素的更加詳細的列表和/ 或討論，參見 D. M. Marmion, Handbook of U. S. Colorants，Foods，Drugs，Cosmetics and Medical Devices,John Wiley&amp ；Sons Inc. , New York(1991)禾口 U. S. Code of Federal Regulations，Title 21，parts 70-82。本發明可任選地包括交聯劑。與成膜組合物一起使用交聯劑的優點包括影響膜的機械特性，例如粘著性和機械強度，以及塗層的溶解度。此外，交聯降低粘著性並阻止垢和微生物物理上附著到聚合物膜，這可為某些應用所期望的。調整交聯度以獲得期望的特性組合。適用於聚乙烯醇及其共聚物的交聯劑包括但不限於醛(例如甲醛、乙二醛、戊二醛)、硼酸、四硼酸鈉、金屬離子(例如鋅、鐵、鋁、鎳、釩、鈷、銅、鋯、鈦、錳離子)、有機金屬化合物(例如有機鈦酸鹽如DuPont 1720『《、有機0(111)絡合物如DuPont Quilon )、矽氧烷(例如四乙氧基矽烷、聚二甲基矽氧烷)、異氰酸鹽(例如封端的、水溶性的或分散型的異氰酸鹽)、環氧化物(例如二縮水甘油醚)、二元羧酸(例如草酸、馬來酸、富馬酸、鄰苯二甲酸)、基於脲的交聯劑(例如SunreZ700)。鉍和三價金屬陽離子(例如!^e (II)、Fe (III)、 Al(III))是優選的，因為當膜乾燥時它們在PVOH聚合物鏈之間形成共價鍵。這允許交聯劑被加入成膜液體中成為『一鍋』混合物。為了在不沉澱其他成分如粒狀流變控制劑的情況下高效地交聯聚合物，必須仔細的選擇合適的濃度。在多數情況下交聯劑將利用標準混合技術與其他成分混合。交聯反應可任選地在存在催化劑的情況下進行，這對本領域的技術人員來說是熟知的。在醛、異氰酸酯、矽氧烷、 二縮水甘油醚和二元羧酸的情況下，可附加地利用加熱和酸催化劑或金屬催化劑。製劑中的交聯劑濃度可為零至上限，上限或通過沉澱開始形成時的製劑穩定性限度確定，或通過高效地移除所得膜時的不穩定性確定。優選的交聯劑濃度很大程度上可取決於交聯劑的類型，並且通常低於聚合物含量的25重量％，更優選地低於聚合物含量的10重量％。除了前述組分之外，本發明的組合物也可包含一種或多種性能強化添加劑，也稱為「性能增強劑」。這些增強劑包括閃鏽抑制劑，其包括用於水基體系的任何數量的有機或無機材料，用於防止接觸該材料的和無遮蔽的金屬生鏽。兩個實例是苯甲酸鈉或苯並三唑。另一種任選的性能強化添加劑包括推薦用於水基體系的一個或多個消泡劑的組合，其用於防止產品在施用期間不期望的泡沫。泡沫太多可破壞產品形成所需的連續膜並導致失效。加入泡沫控制產品也可對混合和加工遮蔽組合物有利，例如得自Ashland Chemical, Inc. Drew Industrial Division(Covington, KY, USA)的 Drewplus L475。附力卩的任選的性能強化添加劑為用於提高塗層製劑的儲存壽命的抗氧化劑。一個實例為丁基化羥基甲苯。此外附加的添加劑包括芳香劑。可附加地加入發泡劑以在施用的塗層中產生氣泡。氣泡可用作遮光劑以有利於施用和/或允許接觸表面較長時間；例如通過阻止從斜面上滴落和/或減少處理某個表面積或體積的塗層製劑的需用量。也可加入施用指示劑。這些指示劑中的一些如上所述，但是包括顏料、染料、螢光染料、PH指示劑或在施用期間產生氣泡。少量(按重量計通常小於)的這些附加材料可被加入，同時對水或其他組分進行適當的調整。應當了解，上述任選組分的任何一種或多種的混合物也可予以使用。
就由纖維基質組成的區域而言，任選的性能增強成分為提供表面效果的製劑。此類表面效果包括免燙性、易燙性、收縮控制、抗皺、耐久定形、水分控制、柔軟性、強度、防滑性、防靜電性、防鉤傷性、防起球性、抗汙性、去汙性、拒垢性、去垢性、拒水性、拒油性、氣味控制、抗微生物性、或防曬性。可通過任何裝置包括傾注將所述膜或塗層施用到目標表面或區域。膜或塗層用於在目標表面上實現連續的和/或均勻的層。常規用於漆料和塗層的塗覆體系可用於塗覆， 例如但不限於刷子、滾筒刷、培克刷、墊子、海綿、梳子、手動泵分配器、壓縮空氣驅動的噴槍、無氣噴槍、電子或靜電霧化器、背包噴塗法設備、氣溶膠噴霧罐、衣物、紙材、羽毛、觸針、 刀子和其他施用工具。如果將浸漬用作施用塗層的方法，不需要特殊的設備。如果將氣溶膠噴霧用於施用，塗料組合物可與氣溶膠推進劑(例如壓縮氣體)混合或塗料組合物可通過阻擋材料如罐內的聚合物袋與推進劑物理上分離；如果塗料組合物和推進劑混合，所述混合物可構成一個或多個液相。就纖維質基底如紡織物和地毯而言，可通過吸盡、泡沫、彈性交咬、交咬、浸軋、溼潤輥、輾鍛、絞絲、絞盤、液體注射、溢流、輥、刷子、滾筒、噴霧、浸漬、浸入等施用所述塗層。 也可通過採用常規缸染法、連續染色法或紡絲流水線應用來施用該塗層。在本公開的一個實施方案中，靜電噴塗器可被用於塗覆所述表面。靜電噴塗器通過高電勢賦予含水塗料組合物能量。該能量起到使含水塗料組合物霧化和使其充電的作用，以產生細小的荷電顆粒噴劑。靜電噴塗器可容易地購自供應商如Tae In Tech Co., South Korea 禾口 Spectrum, Houston, TX, USA。在本發明的另一個實施方案中，無氣噴槍可用於塗覆目標表面。無氣噴槍利用高的流體壓力和特定噴嘴而不是壓縮空氣來輸送和霧化液體。通過流體泵在通常介於3. 5至 45MI^範圍內的壓力下將液體供應至無氣噴槍。當漆料以這樣的壓力離開流體噴嘴時，它將略微展開並霧化為小滴，而沒有霧化空氣的影響。噴出的漆料的高速度將小滴推向目標表面。在無氣噴槍上的流體噴嘴基本上不同於在空氣霧化噴槍上的流體噴嘴。合適噴嘴的選擇決定了遞送多少漆料以及施用的送風模式。無氣噴嘴孔口的大小決定噴出的漆料數量。 無氣流體遞送是高速的，其速度介於700-2000mL/min的範圍內。推薦的噴槍距離為距離目標約30cm，並且取決於噴嘴類型，10至45cm的送風模式是可能的。因此，可基於目標表面的大小和形狀以及需施用的塗層的厚度針對每次施用選擇噴嘴。無氣噴槍產生微小的氣流擾動，這可從「難以到達的區域」排出液體，這種情況將存在於食品加工設備、孵卵所等中。 高流速使得無氣在清潔和消毒時有利，其中抗微生物塗層將被施用到較大表面區域和多個表面上。所施用的和乾燥的膜的厚度將取決於多種因素。這些因素包括成膜試劑的濃度、 流變控制添加劑和/或其他添加劑的濃度、以及施用的溫度和溼度。膜的厚度和膜的均勻度還至少部分地取決於施用設備的參數，例如流體的輸送、噴霧器孔口直徑、空氣壓力或就無氣施用而言的活塞泵壓力和噴霧塗敷器與目標表面的距離。因此，可對液體配方進行調整以產生所期望的膜厚度。對塗料溶液的霧化進行選擇，使得在目標區域上施用一層均勻的薄膜。目標表面(區域)包括潛在地可能被微生物汙染的所有表面，包括通常難以施用消毒劑或殺菌劑的表面(例如難以到達的表面)。目標表面的實例包括存在於食品或飲料行業的設備表面(例如罐、傳送裝置、地面、排放管、冷卻器、冷凍器、冰箱、設備表面、天花板、牆、閥門、皮帶、管道、排放管、管道系統、接頭、裂縫、它們的組合等)；建築表面，包括在建的建築、新居建築和在季節性建築如假期家居之內或之上的表面(例如天花板、牆、木質構架、地面、窗戶、管道系統)、廚房(下水道、排放管、工作檯面、冰箱、切板)、浴室(淋浴器、盥洗室、排放管、管道、管道系統、浴缸)、(尤其用於除黴)、甲板、木質表面、壁板和其他家居表面、浙青木瓦屋頂材料、平臺或石材區域(尤其是藻類處理)；船和船設備表面；垃圾處理、垃圾箱和大型垃圾箱或其他垃圾移除設備和表面；非食品行業的相關管道和排放管； 存在於醫院的表面；或其中提供外科手術、門診病人、或獸醫服務的表面(例如天花板、牆、 地面、管道系統、床、設備、醫院/獸醫院或其他保健設施中的衣著，包括擦拭物、鞋和其他醫院或獸醫院表面)第一反應器或其他緊急服務設備和衣服；鋸木場設備、表面和木質產品；餐館表面；超市、雜貨店、零售和便利店設備和表面；熟食店設備和表面以及食品製備表面；釀酒廠和麵包房表面；浴室表面如下水道、淋浴器、臺面和盥洗室；衣服和鞋；玩具； 學校和體育館設備、天花板、牆、地面、窗戶、管道系統和其他表面；廚房表面如下水道、臺面、設施；木質或複合甲板、水池、熱浴缸和溫泉表面；地毯；紙材；皮革；動物軀體、毛皮和獸皮；牲口棚或家畜廄舍表面，例如家禽、牛、奶牛、山羊、馬和豬；和家禽或蝦的孵卵所。在其中動物居住的建築內的表面，例如鳥籠和畜欄，可用本文所述的抗微生物塗層進行塗覆。 附加的表面也包括食物產品，例如牛肉、禽肉、豬肉、蔬菜、水果、海產品、它們的組合等。適用於本發明的附加區域包括纖維質基底表面並包括纖維、紗線、織物、紡織物、 非織造材料、地毯、皮革、或紙材。纖維質基底由天然纖維如羊毛、棉花、黃麻、劍麻、海草、紙材、椰皮纖維和纖維素、或它們的混合物製成；或由合成纖維如聚醯胺、聚酯、聚烯烴、芳族聚醯胺、聚丙烯酸類以及它們的共混物製成；或由至少一種天然纖維和至少一種合成纖維的共混物製成。「織物」是指由纖維構成的天然或合成織物，或其共混物，所述纖維如棉、人造絲、絲綢、羊毛、聚酯、聚丙烯、聚烯烴、尼龍和芳族聚醯胺(諸如「Ν0ΜΕΧ 」和「KEVLAR 」)。 「織物共混物」是指由兩種或更多種類型的纖維製成的織物。通常這些共混物為至少一種天然纖維與至少一種合成纖維的組合，但也可為兩種或更多種天然纖維的共混物或兩種或更多種合成纖維的共混物。非織造基底包括例如射流噴網非織造材料，如得自Ε. I. du Pont de Nemours and Company (Wilmington，DE，USA)，和層壓的非織造材料如紡粘-熔噴-紡粘非織造材料。表面材料的實例為金屬(例如鋼、不鏽鋼、鉻、鈦、鐵、銅、黃銅、鋁、以及它們的合金)、礦物質(例如混凝土)、天然的或合成的聚合物和塑料(例如聚烯烴，如聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚(甲基)丙烯酸酯、聚丙烯腈、聚丁二烯、聚丙烯腈丁二烯苯乙烯、聚(丙烯腈、丁二烯)、丙烯腈丁二烯；聚酯如聚對苯二甲酸乙二醇酯；和聚醯胺如尼龍)。附加表面包括磚塊、瓷磚、陶瓷、瓷器、玻璃、木質(地板)、聚乙烯樹脂(地板)和油氈。用臨時塗層保護的設備或表面可在保護狀態下使用或不使用。目標表面可為疏水性的或親水性的。塗覆體系也可為一種或多種組分，並且可包括催化劑。一般而言，塗層大約被允許固定或乾燥大於5分鐘以形成膜。然而，該塗層在較短時間內可為抗微生物有效的，例如在 30秒後有效。取決於所期望的用途，塗層可在其乾燥前或乾燥之後的任何時間被除去。乾燥時間將部分地取決於若干因素，包括環境條件如溼度和溫度。乾燥時間還將取決於所施用的塗層的厚度。施用到目標表面上的膜或塗層的厚度影響移除所需的時間和施用到表面上的每單位面積生物殺滅劑的量。較厚的膜增加所述膜需被再施用以保持期望的抗微生物特性時的時間間隔。膜越薄，通過衝洗移除時將越容易和快速。因此通過以下方式施用所述製劑是重要的所述施用產生的薄膜厚度既易於移除塗層又具有長期的抗微生物特性。如上所述，膜或塗層的厚度為約0. 3至約300微米。在一個更具體的實施方案中，膜或塗層的厚度為約0. 5至約100微米。在一個更具體的實施方案中，膜或塗層的厚度為約1. 0至約30微米。本發明涉及當使用者認為合適時可被移除的膜。塗層可容易地除去，並且可通過用水性溶劑或溶液清洗表面而除去。移除時間可根據以下因素確定或(i)產生期望的抗微生物活性的期望最短接觸時間，通常表達為殺滅或滅活初始微生物種群中的微生物量， 或(ii)在開始後續的操作或加工步驟之前對從表面上移除塗層的需求或期望。雖然可在任何時候如乾燥後移除塗層，薄膜厚度、抗微生物劑濃度和特定用途決定合適的移除時間。 例如使用者可能期望處理後的設備在停止工作一段時間後恢復正常工作狀態。例如在吃水果之前需要洗滌。當膜中的生物殺滅劑耗盡時，可移除膜並施用新塗層。例如可定期如每日、每周、或每兩周處理排放管。可在施用所述膜後儘早如30秒後、數小時後、數日後、數周后、數月後、甚至數年後測量抗微生物活性。因此，移除塗層的時間是塗層用途的函數。膜移除可通過溶解或分散所得塗層來完成。這可通過將水性溶液施用於所述塗層上而實現。在一個實施方案中，溶液溫度在約15°C至約100°C的範圍內。在另一個實施方案中，溶液溫度為約30°C至約80°C。所述溶液或水的施用可通過簡單的衝洗或噴灑於表面上而實現。塗層移除也可通過使用加壓洗滌器來完成，其通過附加的機械應力促進移除。塗層移除也可通過用沾水的布料或海綿洗滌來完成。此外，溫和的添加劑可被利用或與所述水性溶液混合，以幫助成膜試劑或水分散劑的溶解或分散，所述溫和的添加劑包括常用的酸或鹼、螯合劑或洗滌劑。作為另外一種選擇，可通過用水和/或其他組分重複洗滌排放管降解例如在排放管中的膜。也可通過將所述膜剝離表面、從表面上擦掉或刷掉、或其他機械移除機構來移除。除了操作者有意地移除之外，移除也包括用自動化系統或機器人系統移除以及無意的移除，例如在管道或排放管內用液體連續地或定期地接觸塗層一段時間後的移除，者連續地或定期地施加機械應力如磨損導致的移除。接觸時間指塗層或塗料組合物提供對接觸或接近所述塗層或塗料組合物的微生物抗微生物特性的時間。取決於對抗微生物劑的具體需要，接觸時間將不同，這如 Germicidal and Detergent Sanitizing Action of Disinfectants, Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists,第960. 09段及適用章節，第15版，1990 (EPA Guideline 91_2)所提出的那樣。例如，如果本公開的預期應用是用作接觸食品表面的消毒劑，那麼所述組合物應在室溫下在30秒內提供對若干種測試微生物的99. 999%的減少(5-對數級的減少)。如果預期應用是用作不接觸食品表面的消毒劑，那麼所述組合物應在室溫下在5分鐘內提供對若干種測試微生物的99. 9%的減少 (3-對數級的減少)。如果其目的在於使用該公開作為消毒劑，那麼所述組合物將在10分鐘內提供99. 9%的減少(3-對數級的減少)。如果預期應用是提供殘餘的抗微生物活性，那麼本發明方法將允許大於10分鐘的接觸微生物的時間。本發明的塗層提供物理屏障。物理屏障本文定義為由本發明的成膜組合物形成的膜。所得膜密封處理的表面防止周圍的汙染，例如垢、脂肪、塵埃、微生物等。這些汙染物將保留在塗層表面上並將在移除塗層時被洗掉。可製備並實施本文所公開並受權利要求書保護的所有組合物及方法而無需按照本公開進行過度實驗。儘管本公開的方法和組合物已依據本發明的各個方面和優選實施方案進行了描述，但對本領域的技術人員顯而易見的是可將變型應用於組合物與方法以及本文所述方法的步驟中或步驟序列中而不脫離本發明的概念、實質和範圍。更具體地講，將顯而易見的是化學相關的某些試劑可取代本文所述的試劑同時實現相同或相似結果。對本領域的技術人員顯而易見的所有此類相似替代品及變型被認為是在如所附權利要求所定義的本發明的實質、範圍及概念內。一般方法重組技術和微牛物牛長實施例中使用的標準重組DNA和分子克隆技術是本領域熟知的並且描述於 Sambrook, J. , Fritsch, E. F.禾口 Maniatis, Τ. , Molecular CloninR :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. ,1989, T. J. Silhavy,M. L. Berman禾口 L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. , 1984,以及 Ausubel, F. Μ.等人，Current Protocols in Molecular BioIory, Greene Publishing Assoc.禾口 Wiley-Interscience, N. Y.，1987。適合細菌培養物維持及生長的材料和方法在領域內也是眾所周知的。適用於下面實施例的技術可存在於以下文獻中Manual of Methods for General Bacteriology, Phillipp Gerhardt,R. G. E. Murray,Ralph N. Costilow,Eugene W. Nester,Willis A. Wood, Noel R. Krieg 禾口 G. Briggs Phillips 編輯，American Society for Microbiology, Washington, DC, USA,1994, 或 Thomas D. Brock in Biotechnology :A Textbook of Industrial Microbiology,第二版，Sinauer Associates, Inc. , Sunderland, MA, USA, 1989。除非另外指明，使用的用於細菌細胞生長和維持的所有試劑、限制性內切酶和材料均得自 Aldrich Chemicals (Milwaukee，WI，USA)、BD Diagnostic Systems (Sparks, MD, USA)、Life Technologies(Rockville,MD,USA)或Sigma Chemical Company(St. Louis,M0, USA)。SDS凝膠電泳SDS凝膠電泳使用本領域熟知的方法進行。硬質表面上的抗微牛物活件的測試方法過酸可具有生物殺滅活性。本領域已知的可適用於本發明的典型備選生物殺滅劑包括例如氯、二氧化氯、氯異氰尿酸鹽、次氯酸鹽、臭氧、胺、氯酚、銅鹽、有機硫化合物和季銨鹽。使用下述的兩種測試方法測量塗料組合物的生物殺滅功效或抗微生物功效。不接觸食品的消毒劑測試為了評估塗料組合物在下述情況下的抗微生物活性 其中在施用所述抗微生物塗層組合物時微生物汙染已在目標表面上存在，使用如ASTM標準 E1153-03 所述的"Standard Test Method for Efficacy of Sanitizers Recommended for Inanimate Non-Food Contact Surfaces」。該測試方法稱為不接觸食品的消毒劑測試或「NFC測試」。殘金自身消毒測試為了評估塗料組合物在下述情況下的抗微生物活性其中微生物汙染接觸已乾燥的塗層，使用下列殘餘自身消毒測試方法。該測試方法稱為殘餘自身消毒測試或「RSS測試」。使用大小為25. 4X25. 4mm的無孔的、預清潔的、不鏽鋼(SS316 型)試塊進行測試。從生物體的初始平板(連續轉移三次但不超過30次轉移)中選擇一個菌落並將其置於IOmL AOAC營養肉湯(氯化鈉2. 5g ；牛肉膏2. 5g ；Anatone 5g ；去離子水500mL)中。在35°C下靜態培養接種後的培養物M小時。在製備測試種菌時，用渦旋攪拌器劇烈攪拌靜態培養物，靜置15分鐘，並將上部三分之二的培養物轉移到無菌管(大約 6mL)中。加入胎牛血清(FBS)的有機垢負載至終濃度為這一測試種菌5重量％的有機垢負載。最終的測試種菌密度為大約lX108CFU/mL。將測試試塊置於70重量％的乙醇中過夜，浸泡在溫和洗滌劑中至少30分鐘，用自來水徹底衝洗並風乾。表面一旦清潔後，所有抓握動作用無菌鑷子完成。試塊噴灑70重量％的乙醇並徹底乾燥。將待測試的塗料組合物的等分試樣(50yL)施用到每個不鏽鋼試塊，用無菌塑料鋪展器均勻鋪展，將其置於無菌塑料培養皿中並在生物安全櫃中風乾過夜。 記錄環境空氣溫度和相對溼度。將未塗布的試塊用作對照表面，其在與用塗料組合物處理的試塊相同的條件下進行處理。通過在所述塗覆試塊表面上斑染0. OlmL的種菌給試塊接種，使用至少30個菌斑。 每個塗料組合物接種至少兩個平行測定試塊。在5分鐘後，將測試試塊無菌轉移到20mL Bacto D/E中和肉湯中。用手劇烈振蕩所述管，在超聲波水浴中以最大功率處理10s，最後在旋轉振蕩器上以250rpm振蕩4分鐘。培養物的細胞密度使用系列稀釋鋪板技術用 Butterfield Phosphate Buffer 稀釋管和 Trypticase Soy Agar (TSA)培養皿計算。計算所有樣品在大約30分鐘內轉移到D/E中和肉湯中的數量。將經處理的和未經處理的試塊平行測定的平均細胞密度(CFU/mL)計算成單獨 CFU測量的幾何平均數。所有對數為基於10的對數。
實施例為演示本發明的優選方面，本文提供了以下實施例。本領域的技術人員應認識到下文實施例中公開的技術代表本發明人發現的在本發明的實施中功能良好的技術，因此可認為其構成實施的優選模式。然而，本領域的技術人員應依據本發明理解的是，在不背離本發明的精神和範圍的情況下，可對所公開的具體實施方案進行許多更改並仍能獲得相同或相似的結果。實施例中使用的縮寫詞在說明書中的以下縮寫詞對應於如下的測量、技術、特性、或化合物單位「SeC」 或「 s」指秒，「min」指分鐘，「h」或「hr」指小時，「mm」指毫米；"μ L」指微升，「mL」指毫升， 「L」指升，「mM」指毫摩爾每升，「M」指摩爾每升，「mmol」指毫摩爾，「。C」指攝氏度；「ppm」指份每一百萬份並且指mg/L (毫克每升)，在以下實施例中，「wt，，指重量，"wt %，，指示按重量計的百分比，「g」指克，「μ g」指微克，「g」指地心引力常數，「HPLC」指高效液相色譜法，「ddH20」指蒸餾並去離子的水，「DI」指去離子的，「dew」指幹細胞重量，「ATCC」或「ATCC 」指美國典型培養物保藏中心(Manassas，VA，USA)，「U」指過水解酶活性單位，「U/mg protein」指每毫克蛋白的過水解酶活性單位，「rpm」指每分鐘轉數，「EDTA」指乙二胺四乙酸，「PAA」指過乙酸，「PEG」指聚乙二醇，「 1 *s」指帕秒；「IPTG」指異丙基-β -D-硫代半乳糖苷；「MPa」 指兆帕斯卡；「NMWC0」指示標稱截留分子量，「LB」指Luria肉湯培養基，「0D」指光密度，"g feed/min」指每分鐘投料克數，「SDS」指十二烷基硫酸鈉，「o_DA」指鄰聯茴香胺，「pNPA」指乙酸對硝基苯酯，「L · cm-1 · mo Γ1」指每摩爾每釐米升，「mg/mL」指毫克每毫升，「kg」指千克，「U/mg」指每毫克單位數，「CFU」指菌落形成單位；「FBS」指胎牛血清；「log CFUlgCFU 數量的常用對數10 ；「CFU/mL」指每毫升CFU ；「NFC」指不接觸食品的消毒劑測試；"RSSl^ 殘餘的自我消毒活性；「SS316」指不鏽鋼316型(ASTM標準)；「TAED」指四乙醯乙二胺。化學品所有化學藥品得自Sigma-Aldrichd Louis，M0，USA)，除非另外指明。Elvanol 51-04(部分水解等級的聚乙烯醇，88%等級)得自DuPont (Wilmington，DE, USA)。平均分子量為 300g/mol (Carbowax PEG-300)的聚乙烯二醇得自 Dow(Midland，MI, USA)。BTC
(S)
885、Onyxide 3300 和 Biosoft: N25-7 得自(Northfield，IL, USA) BTC 885 包
含50重量％的季銨化合物作為抗微生物劑以及50重量％的惰性材料。I he0ViS FRC得自 Ciba (Basel, Switzerland)。Glucopon 215UP 得自 Cognis Corporation (Cincinnati,
OH)。PC 5450NF 得自 Performance Chemicals，LLC (Concord，NH)。四乙醯乙二胺(TAED
⑧
B675)得自 Warwick International Ltd. (Flintshire, UK)。過碳酸鈉(Provox C)得自
OCI Chemical Corp. (Decatur, AL, USA)。Turpinal SL 得自 Thermphos (Vlissingen, the Netherlands)。Silwet L_77 得自 ktre Chemical Company (Memphis，TN，USA)。微生物培養基得自 DIFCO Laboratories (Detroit, MI, USA)、GIBC0/BRL(Gaithersburg, MD, USA)、 TCIAmerica(Portland, OR, USA)、Roche Diagnostics Corporation(Indianapolis, IN, USA)或 Sigma-Aldrich Chemical Company (St. Louis，M0，USA)。Bacto D/E 中和肉湯得自 Difco(Cat. No. 281910，Difco Laboratories, Detroit, MI, USA)。pNPA微板測定法向96孔微板的每四個孔中加入170 μ L磷酸鉀緩衝液(50mM，pH7. 2)和或10 μ L 0. Img的總蛋白/mL細胞裂解液，或10 μ L 0. 02mg的總蛋白/mL噴霧乾燥的酶溶液。覆蓋該微板並將其置於微板閱讀器(Molecular Devices SPECTRAmax 384Plus)中，然後混合若干秒並在30°C平衡10分鐘。然後向該微板的每個孔同時加入20 μ L 30mM pNPA溶液， 該溶液通過混合乙腈中的(緊接著使用前)0. 6mL IOOmM pNPA與1. 4mL 50mM磷酸鉀緩衝液(pH 7.2)來製備。在1分鐘的反應時間裡測量400nm的吸光度變化。在四個孔中分別測量pNPA水解的背景速度(從在存在酶的情況下測得的水解速度中減去)，該測量通過用 10 μ L/孔磷酸鉀緩衝液(50mM，pH7. 2)取代細胞裂解液或含酶溶液來進行。在pH 7.2的 1-cm路徑長度槽中測得的對硝基苯酚的消光係數為10，909L ^nT1 ^olA — pNPA單位的酶活性等同於在一分鐘內催化一微摩爾PNPA水解的蛋白量。測定流變學特件使用 Brookfield Digital Viscometer Model DV-II (Brookfield Engineering
30Laboratories, Middleboro, MA, USA)，用RV系列錠子#6和高玻璃燒杯評估液體抗微生物製劑的流變學特性。將樣品注入玻璃燒杯中以加載樣品。在不同rpm下測量粘度。高效液相餼譜(HPLC)使用HPLC測定反應混合物中的PAA濃度。使用Supelco Discovery C8柱 (15cmX4. Omm, 5 μ m)禾口預柱 Supelco Superguard Discovery C8。注身寸體積為 IOyL0 下表示出用乙腈和去離子水在1. OmL/min和環境溫度下的梯度方法。
權利要求
1.提供在位點處控制微生物的方法，所述方法包括以下步驟a)通過組合組分形成組合物，所述組分包含 i)成膜的水溶性或水分散性試劑； )惰性溶劑；iii)羧酸酯底物；iv)過氧源；ν)酶催化劑，所述酶催化劑具有過水解酶活性從而形成至少一種過氧酸以提供至少第一抗微生物劑；和 vi)流變改性劑；b)將所述組合物施用到所述位點；c)允許所述組合物乾燥從而在所述位點上形成塗層；其中所述組分還包括第二抗微生物劑，其中所述第二抗微生物劑包含季銨化合物。
2.權利要求2的方法，其中所述酶催化劑選自CE-7家族的糖酯酶。
3.權利要求1的方法，其中所述過氧酸在將所述組分組合約5分鐘至約2小時內以至少20ppm的濃度生成。
4.提供在位點處控制微生物的方法，所述方法包括以下步驟(a)提供包含惰性溶劑和成膜試劑的第一預混組分；(b)提供包含具有過水解酶活性的酶催化劑、羧酸酯底物和過氧源的第二預混組分；(c)將所述第一預混組分和所述第二預混組分混合以獲得液體塗料組合物，所述組合物包含具有過氧酸的第一抗微生物劑；(d)將所述塗料組合物施用到所述位點；並且(e)允許所述塗料組合物乾燥從而在所述位點上形成塗層；其中至少一種預混組分還包括第二抗微生物劑，其中所述第二抗微生物劑包含季銨化合物。
5.權利要求4的方法，其中所述第一預混組分和第二預混組分在多隔室體系中提供； 其中所述第一預混組分和第二預混組分在步驟(c)之前保持分離。
6.權利要求4的方法，其中一種預混組分為液體形式，並且一種預混組分為固體形式。
7.權利要求4的方法，其中所述酶催化劑包含CE-7家族的糖酯酶。
8.包含組分的抗微生物組合物，所述組分包含a)成膜的水溶性或水分散性試劑；b)惰性溶劑；c)羧酸酯底物；d)過氧源；e)具有過水解酶活性的酶催化劑；和f)流變改性劑其中，在組合所述組分時形成過氧酸；其中所述組分還包括為包含季銨化合物的抗微生物劑的組分。
9.權利要求8的組合物，其中至少一種或多種所述組分在它們組合形成所述過氧酸之前以多隔室體系形式與所述其他組分分開包裝。
10.權利要求8的組合物，其中所述過氧酸在將所述組分組合約5分鐘至約2小時內以至少20ppm的濃度生成。
11.製品，所述製品在制品的至少一個表面上包含具有抗微生物組合物的塗層，其中所述抗微生物組合物包含a)成膜的水溶性或水分散性試劑；b)惰性溶劑；c)羧酸酯底物；d)過氧源；和e)具有過水解酶活性的酶催化劑；其中，在組合(a)至(e)的組分時形成過氧酸。
12.權利要求11的製品，其中所述製品為用於食品或飲料行業的設備。
全文摘要
本發明公開了原位酶促製備的基於過酸的可移除抗微生物塗料組合物及它們的使用方法，所述方法用於在多個位點控制微生物。
文檔編號A01N25/10GK102480942SQ201080032904
公開日2012年5月30日 申請日期2010年7月27日 優先權日2009年7月27日
發明者C·S·斯託弗, C·W·小埃爾肯布勒赫, C·霍夫曼, L·勒格, M·S·佩恩, R·迪科西莫 申請人:納幕爾杜邦公司