利用大小分離技術分析核酸分子的方法和組合物的製作方法

2023-05-25 16:43:31 4

專利名稱：利用大小分離技術分析核酸分子的方法和組合物的製作方法
技術領域：
本發明總地涉及分析核酸分子的方法和組合物，特別是涉及可在各種核酸反應中利用的標記物，其中需要按大小分離核酸分子。
檢測和分析核酸分子是生物學中最重要的技術之一。這些技術是分子生物學的核心並在其他生物學領域中的作用迅速擴展。
總地說來，一類分析核酸反應的技術涉及按長度分離核酸分子。例如，一項廣泛使用的技術，即聚合酶鏈反應(PCR)(參見美國專利No.4,683,195、4,683,202和4,800,159)已變成鑑定存在於樣品中的序列和為進一步操作合成DNA分子的廣泛應用的技術。
簡單地說，在PCR中，利用以幾何和線性方式合成新DNA鏈的酶促反應擴增DNA序列。擴增後，必須檢測並鑑定DNA序列。因為是非特異性擴增(否則擾亂分析)或須純化，所以須在檢測前分離PCR反應產物。基於產物的大小(即長度)分離時可得到最有用的信息。給出核酸分子的最高分率的方法是電泳分離。在該方法中，對適當的凝膠加載各個PCR反應物並經受電壓。可被處理的樣品數目受凝膠中孔數的限制。在大多數凝膠裝置上，可在單一凝膠中分離大約10至64個樣品。因此，處理大數目的樣品是很麻煩和消耗材料的。
為了獲得數據，必須將電泳分離與某些檢測系統聯合起來。常用和幾乎唯一的核酸檢測系統是利用嵌入染料或放射活性標記，在較少情況下用非放射活性標記。嵌入染料如溴乙錠使用較簡單。在電泳期間使染料包含在凝膠基質中，或者在電泳之後將凝膠浸漬在含染料溶液中。某些情況下染料可直接顯示，但在更多情況下，特別是對溴乙錠來說，則用光(如紫外光)激發出產生螢光。儘管這種標記看來容易使用，但染料有很大的缺點。首先，染料不敏感，而且須使用大量核酸分子才能顯示產物。其次，染料是可引起突變或致癌的。
比染料更敏感的檢測技術是使用放射活性(或非放射活性)標記。一般在PCR反應中包括放射標記的核苷酸或放射標記的引物。分離後，以放射自顯影法「顯示」放射標記。雖然更敏感，但檢測中有膠片限制的問題，例如相關性喪失和非線性。可用磷影像分析來檢測標記來克服這些限制。然而，放射標記有安全要求，增加資源利用和必需專門化設備及人員訓練。為此，使用非放射活性標記已越來越普通。在這樣的系統中，核苷酸含有標記，如螢光團、生物素或洋地黃毒苷，其可用與生色底物有反應性的酶標記的抗體或其他分子(如配體對的另一成員)檢測。如上所述，這些系統並沒有上述安全性問題，但使用不穩定的成分並可產生非特異性反應，導致高的本底(即低信-噪比)。
本發明提供可用於多種核酸反應的新的組合物及方法，並進一步提供其他相關優點。
簡單地說，本發明提供可應用於多種配體對反應的組合物及方法，其中要求基於大小分離感興趣的分子，如核酸分子。在本文提供的公開內容的基礎上可提高的代表性方法的例子包括，PCR、差異展示法、RNA指紋法、PCR-SSCP、寡聚物連接檢測法、核酸酶消化法(如基於外切和內切核酸酶的檢測法)及雙脫氧指紋法。可在很廣泛的領域裡利用本文公開的方法，例如用於臨床或研究的診斷、多態性測定及遺傳圖譜的建立。
在本發明的一個方面，提供了鑑定核酸分子的方法，該方法包括以下步驟(a)從一個或多個選擇的核酸分子產生標記的核酸分子，其中標記是與特定的核酸片段相互關聯的；並且是可用非螢光光譜法或電位測定法檢測的；(b)按大小分離標記的片段；(c)從標記片段上裂解標記；以及(d)用非螢光光譜法和電位測定法檢測標記，從而鑑定核酸分子。
在本發明的相關方面內，提供了檢測選定的核酸分子的方法，其包括以下步驟(a)在足以使標記的核酸探針與互補的所選靶核酸序列雜交的條件下使標記的核酸探針與標記的核酸分子結合足夠長時間，其中標記的核酸探針是可用非螢光光譜法或電位測定法檢測的；(b)改變雜交的標記探針、未雜交的探針或靶分子，或探針靶雜交體的大小；(c)按大小分離標記的探針；(d)從標記的探針上切掉標記；以及(e)用非螢光光譜法或電位測定法檢測標記，從而確定檢測選擇的核酸分子。
在本發明的另一個方面內，提供了對選擇的生物體進行基因型鑑定(genotyping)的方法，其包括以下步驟(a)從選擇的靶分子中產生標記的核酸分子，其中標記是與特定片段相互關聯的並可用非螢光光譜法或電位測定法檢測；(b)按序列長度分離標記的分子；(c)從標記的分子上裂解標記；以及(d)用非螢光光譜法或電位測定法檢測標記，從而確定所說生物體的基因型。
在另一個方面，本發明提供了對選擇的生物體進行基因型鑑定的方法，其包括以下步驟(a)在足以使標記分子與靶分子雜交的條件和時間下使標記的核酸分子與選擇的靶分子結合，其中標記是與特定的片段相互關聯並且可用非螢光光譜法或電位測定法檢測的；(b)按序列的長度分離標記的片段；(c)從標記的片段上裂解標記；以及(d)用非螢光光譜法或電位測定法檢測標記，從而確定生物體的基因型。
從本發明的上下文中應理解到，「生物學樣品」不僅包括得自活生物體(例如哺乳動物、魚、細菌、寄生蟲、病毒、真菌等)或環境(如空氣、水或固體樣品)的樣品，而且包括可人工或合成產生的生物學材料(例如噬菌體文庫、有機分子文庫、基因組克隆的集合體、cDNA克隆、RNA克隆等)。生物學樣品的代表性例子包括生物學液體(如血液、血清、腦脊液、尿液)、生物細胞(如幹細胞、B或T細胞、肝細胞、成纖維細胞等)，以及生物組織。最後，可進行基因型鑑定的生物體的代表性例子包括基本上任何單細胞或多細胞生物體，如溫血動物、哺乳動物或脊椎動物(如人、黑猩猩、恆河猴、馬、牛、豬、羊、狗、貓、大鼠和小鼠以及它們的細胞)、細菌、寄生蟲、病毒、真菌及植物。
在上述方法的各個實施方案中，可通過連接、裂解或延伸(如PCR)反應產生本發明的核酸探針和/或分子。在其他相關方面，可用非3′標記的寡核苷酸引物(例如5′標記的寡核苷酸引物)或二脫氧核苷酸終止子標記核酸探針或分子。
在本發明的其他實施方案中，可在給定的反應內同時利用4、5、10、15、 20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、250、300、350、400、450或多於500個不同的和獨特標記的分子。其中各個標記對於選擇的核酸分子或片段或探針都是特有的，並可分別鑑定的。
在本發明的再一個實施方案中，可用螢光法、質譜法、紅外光譜法、紫外光譜法或恆電勢電流測定法(如利用庫侖檢測器或電流檢測器)檢測標記。適當的光譜檢測技術的例子包括飛行時間質譜法、四極質譜法、磁扇形場質譜、電扇形場質譜法。這些技術的特定實例包括離子俘獲質譜法、電噴射離子化質譜法、離子噴射質譜法、液體電離質譜法、大氣壓流電離質譜法、電子電離質譜法、快原子轟擊電離質譜法、MALDI質譜法、光電離飛行時間質譜法、雷射小滴質譜法、MALDI-TOF質譜法、APCI質譜法、納米噴射質譜法、霧化噴射電離質譜法、化學電離質譜法、共振電離質譜法、次級電離質譜法和熱噴射質譜法。
本發明的其他實施方案中，可利用區別分子大小(真正的線性大小或三維結構大小)的方法將靶分子、雜交的標記探針、未雜交的探針或靶分子、探針靶雜交體，或標記的核酸探針或分子與其他分子分離開。這些方法的代表性例子包括凝膠電泳、毛細管電泳、微通道電泳、HPLC、大小排阻層析、過濾、聚丙烯醯胺凝膠電泳、液相層析、反向大小排阻層析、離子交換層析、反向液相層析、脈衝場電泳、倒轉電場電泳、透析和螢光活化的液體小滴分選。另外，也可將靶分子、雜交的標記探針、未雜交的探針或靶分子、探針靶雜交體，或標記的核酸探針或分子結合到固相載體(例如孔心纖維(Amicon Corporation,Danvers,Mass.)、小珠(Polysciences,Warrington,Pa.)、磁性小珠(Robbin Scientific,MaintainView,Calif.)、平板、平皿和燒瓶(Corning Glass Works,Corning,NY)、篩網(Becton,Dickinson,Mountain View,Calif.)、屏和固體纖維(參見Edelman等人的美國專利No.3,843,324；Kurode等人，美國專利No.4,416,777)、膜(Millipore Corp.,Bedford,Mass.)及浸量尺)上。在本發明的某些實例中，如果第一或第二個成員，或暴露的核酸被結合到固載體上，則本文公開的發明可進一步包括洗滌未結合材料的固相載體的步驟。
在其他實施方案中，可用化學、氧化、還原、酸敏感性、鹼敏感性、酶促、電化學、熱及光敏感性方法裂解標記的核酸分子或探針。在其他實施方案中，可以連續的方式，例如在可實現自動化的單一裝置上完成分離、裂解和檢測步驟。
在本發明的某些實施方案中，可用選自下列一組中的方法改變雜交的標記探針、未雜交的探針或靶分子，或探針靶雜交體的大小聚合酶延伸、連接、核酸外切酶消化、核酸內切酶消化、限制性酶消化、位點特異性重組酶消化、連接、錯配特異性核酸酶消化、甲基化性核酸酶消化、將探針共價連接到靶分子上以及雜交。
本文公開的方法和組合物可有多方面的應用，例如包括鑑定PCR擴增子、RNA指紋法、差異展示、單鏈構型多態性檢測、二脫氧指紋法、限制性酶譜和限制性片段長度多態性、DNA指紋法、基因型鑑定、突變檢測、寡核苷酸連接檢測、序列特異性擴增，用於診斷、法醫、身份鑑定、發育生物學、生物學、分子醫學、毒理學、動物育種。
參見下列詳細描述和附圖，本發明的這些及其他方面將變得明顯。此外，下面列出的更詳細地描述某些方法步驟或物質(例如質粒等)的各種參考文獻被全文列入本文作為參考。


圖1顯示合成可化學裂解的質譜檢測標記物的五氟苯基酯(以釋放出帶羧基醯胺末端的標記)的流程。
圖2顯示合成可化學裂解的質譜檢測標記物的五氟苯基酯(以釋放帶羧酸末端之標記)的流程。
圖3-6和8顯示合成一組36個光化學可裂解之質譜標記的四氟苯基酯的流程。
圖7顯示合成一組36個末端為胺的光化學可裂解之質譜標記物的流程。
圖9顯示從相應的一組36個光化學可裂解之質譜標記酸的四氟苯基酯製得的36個光化學可裂解的質譜標記的寡核苷酸的合成反應步驟。
圖10顯示從一組36個末端為胺的光化學可裂解之質譜標記物製得的36個光化學可裂解的質譜標記寡核苷酸的合成反應流程。
圖11舉例顯示用質譜法同時檢測多個標記。
圖12顯示單獨α-氰基基體的質譜圖。
圖13顯示模式構建的標記的核酸片段。
如上面提到的，本發明提供分析核酸分子的方法和組合物，其中需要按大小分離核酸分子。本方法允許同時檢測包括核酸和片段、蛋白質、肽等在內的感興趣的分子。簡單地說，本發明的一個方面提供其中感興趣的分子或其前體通過不穩定鍵與標記物連接的化合物。因此，本發明的化合物可用下列結構通式表示T-L-X其中T是標記部分，L是作為或含有不穩定鍵的接頭部分，X是感興趣的分子(MOI)部分或可供以使MOI結合到T-L上的功能團部分(Lh)。因此本發明的化合物可由下列更特異的通式代表T-L-MOI和T-L-Lh出於如下詳細描述的原因，可特意使幾組T-L-MOI經受使不穩定鍵斷裂的條件，而從化合物的其餘部分上釋放出標記部分。然後用一種或多種分析技術鑑定標記部分的特徵，從而提供有關標記部分結構的直接信息以及(更重要的)相應的MOI鑑定的間接信息。
作為本發明有代表性的其中L為直接鍵的化合物的一個簡單實例，可參見下列結構(ⅰ)
在結構(ⅰ)中，T是連接到羰基基團上的合氮多環芳族殘基，X是MOI(更具體地講為以胺基團為末端的核酸片段)，並且L是形成醯胺基團的鍵。相對於T中的鍵來說，如本領域所知，醯胺鍵是不穩定的，醯胺鍵可受到不影響標記部分內鍵的酸或鹼性條件的化學裂解(斷裂)。因此，可按下示方式釋放出標記部分(即含有T的裂解產物)
然而，接頭L可能不只是如上實例中所示的直接鍵，在此可參見本發明的另一個具有下示構(ⅱ)的代表性化合物
已知具有鄰位硝基苄胺殘基(見結構(ⅱ)內加方框的部分)是光解不穩定的，在這些化合物暴露於特定波長的光化幅射時將引起苄胺鍵的選擇性裂解(參見結構(ⅱ)中標有加重線的鍵)。因此，結構(ⅱ)具有與結構(ⅰ)相同的T和MOI基團，但接頭基團含有多個原子和鍵，其中有一特殊的不穩定鍵。因此如下所示，結構(ⅱ)的光解可從化合物的其餘部分釋放出標記部分(含T部分)。
因此本發明提供這樣的化合物，即在其遇有適當的裂解條件後經受裂解反應，從而從化合物的餘留部分釋放出標記部分。可用標記部分、MOI(或其前體，Ln)以及將兩個基團連接在一起的不穩定鍵來描述本發明的化合物。或者，可用形成化合物的各個組分來描述本發明的化合物。因此可將本發明的化合物描述為如下所述的標記反應物、接頭反應物和MOI反應物。
標記反應物由化學柄(Th)和可變部分(Tvc)組成，因而標記反應物可視為具有下列通式結構Tvc-Th為了舉例說明這一通式，可參見結構(ⅲ)，其顯示可用於製備結構(ⅱ)化合物的標記反應物。如下所示，具有結構(ⅲ)的標記反應物含有標記可變部分和標記柄
在結構(ⅲ)中，標記柄(-C(=O)-A)簡單地提供一個使標記反應物與接頭反應物反應形成T-L部分的通路。結構(ⅲ)中的基團「A」表示羧基基團處於化學活性狀態，所以其很容易與其他柄偶聯。例如「A」可以是羥基或五氟苯氧基和許多其它基團。如下文詳述的，本發明提供很多可與標記可變部分結合的可能的標記柄。因此標記可變部分是式T-L-X中「T」的一部分，並且也將是從裂解L的反應所形成的標記部分的一部分。
也如下文詳細討論的，因為在按照本發明製備各組化合物中，期望每組的成員有獨特的可變部分，所以如此命名標記可變部分，從而得以用分析技術將個個成員彼此區分開。作為一個例子，結構(ⅲ)的標記可變部分可以是可根據紫外或質譜區分開的下列一組中的成員
同樣，接頭反應物可用其側翼連接有接頭不穩定組分的化學柄(至少需要兩個，每個都稱為Lh)來描述，其中接頭不穩定組分由要求的不穩定部分(L2)和可能存在的不穩定部分(L1和L3)組成，此時可能存在的不穩定部分可有效地用於將L2與柄Lh分開，並且必要的不穩定部分則用於在接頭不穩定組分內提供不穩定鍵。因此，接頭反應物可視為具有下列通式Lh-L1-L2-L3-Lh可就結構(ⅳ)來舉例說明用於描述接頭反應物的通式，結構(ⅳ)也是從結構(ⅱ)的化合物得出的
如在結構(ⅳ)中示例的那樣，原子可以起到一種以上的功能作用。因此在結構(ⅳ)中，苄基氮在允許接頭反應物通過醯胺形成反應連接到標記反應物上的過程中發揮化學柄的功能，並且在繼後還可作為不穩定部分L2的必要結構部分，其中苄基碳-氮鍵對光裂解是特別敏感的。結構(ⅳ)也說明接頭反應物雖沒有L1基團，但可能有L3基團(此處為亞甲基)。同樣，接頭反應是可以有L1基團但沒有L3基團，或者可以有L1和L3基團，或者可以沒有L1也沒有L3基團。在結構(ⅳ)中，存在靠近羰基基團的基團「P」，表明羰基基團是受到保護不參予反應的。給定這一構型，標記反應物(ⅲ)的活化的羰基基團即可徹底地與接頭反應物(ⅳ)的胺基團反應，以形醯胺鍵並得到式T-L-Lh的化合物。
MOI反應物是感興趣分子的適當反應活性形式。其中感興趣的分子是核酸片段，適當的MOI反應物是通過其5′羥基基團結合到磷酸二酯基團上，然後結合到以氨基基團終止的亞烷基鏈上的核酸片段。然後該氨基基團與結構(ⅳ)的羰基基團反應(當然是在使羰基去保護之後，並且最好是在繼後活化羰基基團以有利於與胺基團反應之後)，從而使MOI連接到接頭上。
當以時間先後次序考慮時，本發明可看作是用標記反應物(具有化學標記柄和標記可變部分)、接頭反應物(具有兩個化學接頭柄、要求的不穩定部分及0-2個可能存在的不穩定部分)以及MOI反應物(具有感興趣的分子組分和感興趣分子的化學柄)形成T-L-MOI。因此，為了形成T-L-MOI，首先使標記反應物和接頭反應物一起反應以提供T-L-Lh，然後使MOI反應物與T-L-Lh反應以提供T-L-MOI，或者(較不優選)首先使接頭反應物和MOI反應物一起反應以提供Lh-L-MOI，然後使Lh-L-MOI與標記反應物反應以提供T-L-MOI。為方便起見，從可用於形成這類化合物的標記反應物、接頭反應物及MOI反應物的角度來描述式T-L-MOI的化合物。當然，也可用其他(通常是更麻煩的)方法來製備式T-L-MOI的同樣化合物，並落入本發明T-L-MOI化合物的範圍之內。
在任何情況下，本發明都使T-L-MOI化合物在經受裂解條件時從化合物其餘部分中釋放出標記部分。標記部分將至少包括標記可變部分，並且典型地還包括來自標記柄的某些或所有原子，來自被用於將標記反應物連接到接頭反應物上的接頭柄的某些或所有原子，任選的不穩定部分L1(如果該基團存在於T-L-MOI中時)，並將可能含有取決於L2之精確結構和裂解化學性質的必要不穩定部分L2的某些部分。為方便起見，標記部分可稱為含T部分，因為T一般將構成標記部分的主要部分(按質量計)。
在給出關於本發明一個方面的導論後，下文將詳細描述T、L和X各組分。這一描述是以某些術語的下述定義開始的，這些定義將在下文中用於描述T、L和X。
本文所用的術語「核酸片段」是指與選擇的核酸分子互補的(即互補於其全部或部分)，並可衍生於天然或合成或重組產生的分子，包括非天然存在的分子，有時可以是雙鏈或單鏈形式的；並包括寡核苷酸(如DNA或RNA)、引物、核酸類似物(如PNA)、藉助聚合酶以5′至3′方向延伸的寡核苷酸、化學或酶促裂解的核酸、以二脫氧終止子終止的或在3′或5′末端帶帽以防止在5′或3′末端聚合的核酸，以及這些形式的組合。核酸片段與選擇的靶核酸分子互補一般是指在整個片段長度上表現有至少約70％特異鹼基配對。核酸片段較好表現有至少約80％特異性鹼基配對；最好至少約90％。確定百分錯配(從而百分特異鹼基配對)的方法是本領域已知的，並且是基於參照全鹼基配對時作為Tm函數的百分錯配。
本文所使用的術語「烷基」，無論單獨或聯合的，均指含有1-10，較好1-6個，最好1-4個碳原子的飽和直鏈或支鏈烴殘基。這類殘基的例子包括但不只限於甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基、己基、癸基等。術語「亞烷基」是指飽和的含有1-10個，較好1-6個，最好1-4個碳原子的直鏈或支鏈烴二基。這樣的殘基的例子包括但不只限於亞甲基、亞乙基(-CH2-CH2-)、亞丙基等。
術語「鏈烯基」(單獨或結合的)是指在總共2-10個，較好2-6個，最好2-4個碳原子鏈中至少有1個碳-碳雙鏈的直鏈或支鏈烴基。這樣的基團的例子包括但不只限於乙烯基、E和Z-丙烯基、異丙烯基、E-和Z-丁烯基、E-和Z-異丁烯基、E-和Z-戊烯基、癸烯基等。術語「亞鏈烯基」是指在總共2-10個，較好2-6個，最好2-4個碳原子鏈中至少有1個碳-碳雙鍵的直鏈或支鏈烴雙基。這樣的雙基的例子包括但不只限於次甲基(=CH2)，亞乙烯基(-CH=C-)、亞丙烯基(-CH2-CH=CH-)等。
術語「炔基」，無論單獨或組合使用，均指在總共2-10個，較好2-6個，最好2-4個碳原子鏈中至少有1個碳-碳三鍵的直鏈或支鏈烴殘基。這樣的殘基的例子包括但不只限於乙炔基、丙炔基(炔丙基)、丁炔基、己炔基、癸炔基等。術語「亞炔基」單獨或聯合使用均指總共有2-10個，較好2-6個，最好2-4個碳原子的鏈中至少有1個碳一碳三鍵的直鏈或分支鏈烴雙基。這樣的雙基的例子包括但不只限於亞乙炔基(-C≡C-)、亞丙炔基(-CH2-C≡C-)等。
術語「環烷基」(單獨或組合的)是指含3至8個，較好3至6個碳原子的飽和的環形的碳原子排列。這樣的環烷基殘基的例子包括但不只限於環丙基、環丁基、環戊基、環己基等。術語「環亞烷基」是指環烷基的雙基形式。
術語「芳基」是指(整個由碳和氫組成)選自苯基、萘基、茚基、2,3二氫化茚基、薁基、芴基和蒽基的碳環芳香基團；或選自呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、2-吡唑啉基、吡唑烷基、異噁唑基、異噻唑基、1,2,3-噁二唑基、1,2,3-三唑基、1,3,4-噻二唑基、噠嗪基、嘧啶基、吡嗪基、1,3,5-三嗪基、1,3,5三噻烷基、中氮茚基、吲哚基、異吲哚基、3H-吲哚基、二氫吲哚基、苯並[b]呋喃基、2,3-二氫苯並呋喃基、苯並[b]噻吩基、1H-吲唑基、苯並咪唑基、苯並噻唑基、嘌呤基、4H-喹嗪基、喹啉基、異喹啉基、噌啉基、2,3-二氮雜萘基、喹唑啉基、喹喔啉基、1,8-二氮雜萘基、喋啶基、咔唑基、吖啶基、吩嗪基、吩噻嗪基和吩噁嗪基的雜環芳香基團。
本申請中限定的「芳基」基團可獨自含有1至4個取代基，其獨立地選自氫、滷素、羥基、氨基、硝基、三氟甲基、三氟甲氧基、烷基、鏈烯基、炔基、氰基、羧基、烷氧羰基、1,2-二氧亞乙基、烷氧基、鏈烯氧基或炔氧基、烷基氨基、鏈烯基氨基、炔基氨基、脂族或芳族醯基、烷氧羰基氨基、烷基磺醯氨基、嗎啉代羰基氨基、硫代嗎啉代羰基氨基、N-烷基胍基、芳烷氨基磺醯基；芳烷氧基烷基；N-芳烷氧基脲；N-羥基脲；N-鏈烯基脲；N,N-(烴基，羥基)脲；雜環基；硫代芳氧基取代的芳基；N,N-(芳基、烷基)肼基；Ar′取代的磺醯基雜環基；芳烷基取代的雜環基；環烷基和環烯基取代的雜環基；環烷基縮合的芳基；芳氧基取代的烷基；雜環基氨基；脂族或芳族醯基氨基羰基；脂族或芳族醯基取代的鏈烯基；Ar′取代的氨基羰基氧基；Ar′,Ar′-二取代的芳基；脂族或芳族醯基取代的醯基；環烷基羰基烷基；環烷基取代的氨基；芳氧基羰基烷基；二氨基磷酸或酯。
「Ar」是具有1至3個取代基的如上文定義的碳環或雜環芳基，所述取代取選自氫、滷素、羥基、氨基、硝基、三氟甲基、三氟甲氧基、烷基、鏈烯基、炔基、1,2-二氧亞甲基、1,2-二氧亞乙基、烷氧基、鏈烯氧基、炔氧基、烷氨基、鏈烯基氨基或炔基氨基、烷基羰氧基、脂族或芳族醯基、烷基羰基氨基、烷氧基羰基氨基、烷基磺醯氨基、N-烷基或N,N-二烷基脲。
術語「烷氧基」單獨或聯合均指烷基醚殘基，其中術語「烷基」定義同上。適當的烷基醚殘基的例子包括但不只限於甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基等。
術語「鏈烯氧基」單獨或聯合均指式鏈烯基-O-的殘基，其中術語「鏈烯基」定義同上，但條件是該殘基不是烯醇醚。適當的鏈烯氧基殘基的例子包括但不只限於烯丙氧基、E-和Z-3-甲基-2-丙烯氧基等。
術語「炔氧基」單獨或合用均指式炔基-O-的殘基，其中術語「炔基」定義同上，但條件是該殘基不是炔醇醚。適當的炔氧基殘基的例子包括但不只限於炔丙氧基、2-丁炔氧基等。
術語「硫代烷氧基」是指式烷基-S-的硫醚殘基，其中烷基定義同上。
術語「烷基氨基」單獨或聯合使用均指單一或二烷基取代的氨基殘基(即式烷基-NH-或(烷基)2-N-的殘基)，其中術語「烷基」定義同上。適當的烷基氨基殘基的例子包括但不只限於甲氨基、乙氨基、丙氨基、異丙氨基、叔丁氨基、N,N-二乙氨基等。
術語「鏈烯氨基」單獨或聯合均使用均指式鏈烯基-NH-或(鏈烯基)2N-的殘基，其中術語「鏈烯基」定義同上，但條件是該殘基不是烯胺。這樣的鏈烯基氨基殘基的例子是烯丙氨基殘基。
術語「炔氨基」單獨或聯合使用均指式炔基-NH-或(炔基)2N-的殘基，其中術語「炔基」定義同上，但條件是該殘基不是炔胺。這樣的炔氨基殘基的例子是炔丙氨基殘基。
術語「醯胺」是指-N(R1)-C(=O)-或-C(=O)-N(R1)-，其中R1定義為包括氫及其他基團。術語「取代的醯胺」是指其中R1不是氫的狀態，而術語「未取代的胺」是指其中R1是氫的狀態。
術語「芳氧基」單獨或聯合使用均指式芳基-O-的殘基，其中芳基定義同前。芳氧基殘基的例子包括但不只限於苯氧基、萘氧基、吡啶氧基等。
術語「芳氨基」單獨或聯合使用均指式芳基-NH-的殘基，其中芳基的定義同上所述。芳氨基的例子包括但不只限於苯氨基(苯胺基)、萘氨基、2-,3-和4-吡啶氨基等。
術語「芳基縮合的環烷基」單獨或聯合使用均指與芳基殘基分享兩個相鄰原子的環烷基殘基，其中術語「環烷基」和「芳基」定義同上。芳基縮合的環烷基殘基的例子是與苯縮合的環丁基殘基。
術語「烷基羰基氨基」單獨或聯合使用均指式烷基-CONH的殘基，其中術語「烷基」定義同上。
術語「烷氧基羰基氨基」單獨或聯合使用均指式烷基-OCONH-的殘基，其中術語「烷基」定義同上。
術語「烷基磺醯氨基」單獨或聯合使用均指式烷基-SO2NH-的殘基，其中術語「烷基」定義同上。
術語「芳磺醯氨基」單獨或聯合使用均指式芳基-SO2-NH-的殘基，其中術語「芳基」的定義同上所述。
術語「N-烷基脲」單獨或聯合使用均指式烷基-NH-CO-NH-的殘基，其中術語「烷基」定義如上。
術語「N-芳基脲」單獨或聯合使用均指式芳基-NH-CO-NH-的殘基，其中術語「芳基」定義同上。
術語「滷素」單獨或結合使用是指氟、氯、溴和碘。
術語「烴殘基」是指只需要一個氫原子就可以成為獨立的穩定分子的碳和氫的排布。因此，烴殘基在一個碳原子上有一個開放化合價位點，通過該位點烴殘基可結合到其他原子上。烴基的例子有烷基、鏈烯基、炔基、環烷基等。
術語「烴雙基」是指只需要兩個氫原子就可以成為獨立的穩定分子的碳和氫的排布。因此，烴雙殘基在一個或兩個碳原子上有兩個開放化合價位點，通過該位點烴殘基可結合到其他原子上。烴雙基的例子有亞烷基、亞鏈烯基、亞炔基、亞環烷基等。
術語「烴基」是指具有單一價位點整個由碳和氫組成的任何穩定排布，藉助價位點其結合到另一個部分上，因此包括烷基、鏈烯基、炔基、環烷基、環鏈烯基、芳基(沒有雜原子摻入芳環中)、芳烷基、烷芳基等。烴殘基也稱為烴基。
術語「亞烴基」是指具有兩個價位點整個由碳和氫組成的任何穩定的排布，藉助價位點使之結合到其他部分上的，因此該術語包括亞烷基、亞鏈烯基、亞炔基、亞環烷基、亞環鏈烯基、亞芳基(沒有雜原子摻入到亞芳環中)、芳基亞烷基、烷基亞芳基等。烴雙基也稱為亞烴基。
術語「烴基-O-亞烴基」是指結合到氧原子上的烴基基團，其中氧原子同樣也在兩個使亞烴基基團結合到其他部分上的價位點之一處結合到亞烴基基團上。術語「烴基-S-亞烴基」、「烴基-NH-亞烴基」和「烴基-醯胺-亞烴基」具有等同的含義，只所說的氧分別代之以硫、-NH-或醯胺基團。
術語「N-(烴基)亞烴基」是指其中兩個價位點之一結合到氮原子上，並且氮原子同時結合到氫和烴基基團上的亞烴基基團。術語「N,N-二(烴基)亞烴基」是指其中兩個價位點之一結合到氮原子上，並且氮原子同時結合到兩個烴基基團上的亞烴基基團。
術語「烴醯基-亞烴基」是指通過醯基(-C(=O)-)基團結合到亞烴基基團的兩個價位點之一上的烴基基團。
術語「雜環烴基」和「雜環基」是指包括碳原子和多達4個的選自氧、氮、磷和硫和原子(稱為雜原子)的穩定的環形排布。環排布可以是3-7個原子的單環形式的，或者是8-11個原子的雙環形式的。環可以是飽和或未飽和的(包括芳香環)，並且可以是或不是苯縮合的。環中的氮和硫原子可以是任何氧化形式的，包括季銨化形式的氮。雜環烴基可以在任何內環碳或雜原子處連接從而產生穩定的結構。優選的雜環烴基包括含有1或2個氮雜原子的5-7元單環雜環。
取代的雜環烴基是指上文限定的雜環烴基，其中至少其一個環原子結合到伸出環的指定的取代基上。
就烴基和亞烴基基團而言，術語「任何其中一個或多個氫被相等數目的氟取代的前述基團的衍生物」是指含有碳、氫和氟子，但不含其他原子的分子。
術語「活化的酯」是含有可很容易被親核試劑如胺、醇或硫醇親核試劑取代的「離去基團」的酯。這樣的離去基團是已知的，並包括而不限於N-羥基琥珀醯亞胺、N-羥基苯並三唑、滷素(滷離子)、包括四氟苯氧基在內的烷氧基、硫代烷氧基等。術語「被保護的酯」是指被蔽避的或以其它方法致無反應性的酯基(如參見Greene，「有機合成中的保護基團」)。
考慮到上述定義，本領域技術人員可很容易地理解本申請全文中所使用的其他化學術語。這些術語可以單獨使用或以其任何組合方式使用。殘基的優選的或更優選的鏈長度適用於所有這些組合。A．標記的核酸片段的產生如上文提到的，本發明的一個方面提供用於DNA測序的一般方案，其允許在每個泳道中使用16個以上的標記；進行連續檢測，可以檢測標記並且如基於螢光的常規測序一樣，在按大小分離時讀出序列。該方案可適用於基於標記分子的大小分離的任何DNA技術。以下更詳細地討論用於本發明的適當標記和接頭，以及測定核酸序列的方法。
1．標記本文使用的術語「標記」一般是指用於專門鑑定「感興趣的分子」的化學部分，特別是指標記可變部分以及標記反應物、標記組分和標記部分的可能與之緊密結合的部分。
可用於本發明的標記具有以下幾個特性1)其能夠與所有其他標記分開。與其他化學部分的這種區別可能是基於標記的色譜行為(特別是在裂解反應之後)、其光譜或電勢性質或其某些組合。可用於區分標記的光譜方法包括質譜(MS)、紅外(IR)、紫外(UV)及螢光，其中優選的是MS、IR和UV，並且MS是最優選的光譜法。電勢電流法是優選的電勢檢測法。
2)當以10-22至10-6摩爾存在時即可檢測標記。
3)標記具有化學柄，通過該柄其可連接到MOI上，藉以專門地鑑定之。連接可以是直接連到MOI上，或通過「接頭」基團連接到MOI上。
4)標記對於所有其經受的操作，包括與MOI連接或與之裂解開，以及對其所連接的MOI的任何操作都是化學上穩定的。
5)標記對於其所連接的MOI上進行的操作無明顯幹擾。例如，如果標記是連接到寡核苷酸上，標記必須是對涉及寡核苷酸的任何雜交或酶促反應(例如PCR測序反應)都沒有明顯幹擾的。同樣，如果標記是連接到抗體上，則它必須對該抗體的抗原識別沒有明顯的幹擾。
欲用某些光譜或電勢測定法檢測的標記部分應具有提高該方法之檢測敏感性和特異性的性質。典型地，標記部分將具有那些性質，因為這些性質已被設計到標記可變部分中，其一般將構成標記部分的主要部分。在下面的討論中，使用「標記」一詞一般是指標記部分(即含有標記可變部分的裂解產物)，但也可以為是指標記可變部分本身，因為其為負責提供標記部分中特異可檢測性質的那部分。在式T-L-X的化合物中，「T」部分將含有標記可變部分。標記可變部分已被設計成可用例如質譜法鑑定的成分，這樣T-L-X的「T」部分便可稱為Tms。同樣，含有T的T-L-X的裂解則可稱為含Tms的部分。可用下述質譜和電勢測定法鑑定含Tms部分的性質。
a．MS標記的特徵當標記可用質譜法分析時(即為MS可讀的標記，本文也稱之為MS標記或「含Tms部分」)，標記的基本特徵是其能夠被離子化。因此在設計MS可讀標記中，於其中摻入可在MS中的離子化條件下攜帶正電荷或負電荷的化學功能團是一個優選要素。這一特徵是提供改善的離子形成效率以及檢測的更大總體靈敏度，特別是在電噴射離子化過程中。支持離子化電荷的化學功能團可來自Tms或L或這兩者。例如Sunner,J.等人(Anal.Chem,60:1300-1307(1988))描述了可提高質譜法檢測分析物的相對靈敏度的因素。
有利於攜帶負電荷的優選的功能團是有機酸，如酚式羥基、羧酸、膦酸、磷酸、三唑、磺醯脲、全氟醇和磺酸。
有利於在離子化條件下帶正電荷的優選的功能團是脂族或芳香胺。賦予MS標記以提高的可檢測性的胺功能團包括季銨類(即具有4個鍵，每個都連到碳原子上的胺，參見Aebersold，美國專利No.5,240,859)和叔胺(即有各自連到碳原子上的3個鍵的胺，其包括例如存在於吡啶中的C=N-C基團，參見Hess等人，Anal.Biochem,224:373,1995；Bures等人，Anal.Biochem.224:364,1995)。特別優選的是位阻季胺。叔胺和季銨可以是烷基或芳基胺。含Tms部分必須帶有至少一個可離子化基團，但也可具有一個以上的可離子化基團。優選的電荷狀態是每個標記都是單一離子化的。因此，最好是每個含Tms部分(及每個標記可變部分)都只含有單一的位阻胺或有機酸基團。
可形成含Tms部分之一部分的適當的胺殘基包括下示基團
用質譜法鑑定標記較好是基於其分子質量對電荷的比例(m/z)。MS標記的優選分子質量範圍是從大約100至2000道爾頓，含Tms部分較好有至少約250道爾頓的質量，更好至少約300道爾頓，最好至少約350道爾頓。質譜法一般難於區分具有低於約200-250道爾頓之母離子的殘片(取決於精密設備)，因此本發明的含Tms部分最好有大於上述範圍的質量。
如上面解釋的，含Tms部分可含有存在於標記可變部分中的原子以外的原子，並確實不存在可Tms本身中的原子。因此，Tms本身的質量可小於約250道爾頓，只要含Tms部分具有至少約250道爾頓的質量即可。因此，Tms的質量範圍可為15(即甲基)至約10,000道爾頓，較好是100至大約5,000道爾頓，最好是大約200至大約1,000道爾頓。
當標記摻入有一種以上具明顯豐度之同位素的原子時，用質譜法分辨這些標記就比較困難。因此，欲進行質譜鑑定的優選T基團(Tms基團)含有碳，氫和氟中至少一種，以及可能有的選自氧、氮、硫、磷和碘的原子。雖然Tms中可存在其他原子，但它們的存在有時會使質譜數據更難以分析。Tms基團中除氫和/或氟外，最好只有碳、氮和氧原子。
氟在Tms基團中是可能有的甚至優選的原子。與氫相比，當然氟要重得多。因此，氟而不是氫原子的存在使Tms基團有更高的質量，從而使T上SM基團達到並超過如上文所述的預期的大於250道爾頓的質量。此外，用氟取代氫可使含Tms部分有更大的揮發性，並且當使用質譜法作為檢測方法時分析物有更大的揮發性可提高檢測的靈敏度。
Tms的分子式落入C1-500N0-100O0-100S0-10P0-10HαFβIδ的範圍之內，式中α、β和δ的總和足以飽和C、N、O、S和P原子的未飽和價。C1-500N0-100O0-100S0-10P0-10HαFβIδ是指Tms含有至少一個，並可含有從1至500任何數目的碳原子，此外還可任意地含有多至100個氮原子(「N0-」是Tms不需含有任何氮原子)、多至100個氧原子，以及多至10個硫原子和多至10個磷原子。符號α、β和δ代表Tms中氫、氟和碘原子的數目，這些數目中的任何兩個都可能是0，並且這些數目的總和等於C、N、O、S和P原子的總的未飽和的價數。Tms優選具有落入C1-50N0-10O0-10HαFβ範圍內的分子式，其中α和β的總和分別等於存在於該部分中的氫和氟原子的數目。
b．IR標記的特徵有機化學基團的IR檢測有兩種基本形式隨機掃描IR和吸收IR。隨機掃描IR光譜和吸收IR光譜是互補的光譜法。一般說來，喇曼激發取決於鍵極性改變，而IR吸收則取決於鍵偶極性改變。弱IR吸收線變成強喇曼線，且反之亦然。波數是IR光譜的特徵性單位。IR標記有3個不同應用的光譜區在12500至4000cm-1處的近IR,4000至600cm-1處的中IR,600至30cm-1處的遠IR。為了本文所述的以化合物作為鑑定MOI、探針或引物的標記的應用，應優選中紅外光譜區。例如，羧酸、羧酸酯和醯胺、碳酸烷基和芳基酯、氨基甲酸酯和酮應檢測羰基伸縮(1850至1750cm-1)。N-H彎曲(1750至160cm-1)將用於鑑定胺、銨離子和醯胺。在1400至1250cm-1，檢測R-OH彎曲以及醯胺中的C-N伸縮。在900至690cm-1檢測芳族取代方式(ArNH2的C-H彎曲，N-H彎曲)。飽和的C-H、烯烴、芳環、雙和三鍵、酯、縮醛、縮酮、銨鹽、N-O化合物和肟、硝基、N-氧化物和硝酸酯、偶氮、腙、苯醌、羧酸、醯胺，以及內醯胺都具有振動紅外相關性數據(參見Pretsch et al.,有機化合物結構測定的光譜數據，Springer-Verlag,New York,1989)。優選的化合物應包括在2230至2210cm-1表現出很強的伸縮振動的芳族腈。其他有用類型的化合物是具有在2140和2100cm-1之間產生尖銳吸收帶之強伸縮振動的芳族炔。第三種類型的化合物是在2160至2120cm-1區表現有強吸收帶的芳族疊氮化物。硫氰酸酯是在2275至2263cm-1有強吸收的有代表性的化合物。
c．UV標記的特徵Scott在其著作(天然產物紫外光譜的解析,Permagon Press,NewYork,1962)中給出了有機發色團類型和它們各自的紫外可見光特徵的彙編。發色團是負責特定光吸收的原子或原子群或電子群。對共軛系統中的π至π*最大吸收存在經驗規則(參見Pretsch等，有機化合物結構測定的光譜數據，p.B65和B70,Springer-Verlag,New York,1989)。優選的化合物(用共軛系統)應具有n至π*和π至π*轉換。這樣的化合物的例子是酸性紫T、吖啶橙、吖啶黃G、亮蘭G、剛果紅、結晶紫、孔雀綠草酸鹽、間胺黃、亞甲藍、甲基橙、甲基紫B、萘酚綠B、油藍N、油紅O、4-苯偶氮酚、藏紅、溶劑綠3和蘇丹橙G，所有這些化合物都是可以市場上得到的(Aldrich,Milwaukee,WD。例如Jane,I.等，J.Chrom.323:191-225(1985)中列出了其他一些適用的化合物。
d．螢光標記的特徵螢光探針大多直接根據吸收度和螢光發射波長及強度鑑定和定量分析。發射光譜(螢光和磷光)比吸收光譜更加敏感，並得以更特異的檢測。其他光物理學特徵如受激狀態半壽期和螢光各向異性則使用不那麼廣泛。通常最有用的強度參數是吸收的摩爾消光係數(ε)和螢光的量子產率(QY)。在單一被長處ε的值是特定的(通常是探針吸收最大值)，而QY則是通過整個螢光光譜分布圖的總光電發射的度量。螢光激發(通過吸收)通常使用窄的光學帶寬(＜20nm)，而螢光檢測帶寬的可變度大得多，其最大靈敏度範圍從全譜帶到最大解析度的窄譜帶(～20nm)。每種探針分子的螢光強度是與δ和QY的乘積成正比的。在同前有實際應用重要性的螢光團中，這些參數的範圍是δ約為10,000至100,000cm-1M-1,QY為0.1至1.0。可用作螢光標記的化合物是螢光素、若丹明、λ藍470、λ綠、λ紅664、λ紅665、吖啶橙和碘化Propidium，這些化合物均可從Lambda Fluorescence Co.(Pleasant Gap.PA)購得。螢光化合物例如尼羅紅、德克薩斯紅、麗絲胺TM、BODIPYTM則可從MolecularProbe(Eugene,OR)購得。
e．電勢標記的特徵電化學檢測(ECD)的原理是基於在某些外加電壓下化合物氧化或還原，供出或接受電子而產生可被檢測的電流。當某些化合物經受電位差時，分子在工作電極表面經受到分子重排，丟失(氧化)或獲得(還原)電子，這樣的化合物可以說是電活性的並經受電化學反應。在HPLC洗脫液通過電極流動時，EC檢測器在電極表面施加電壓。從柱上洗脫的電活性化合物供出電子(氧化)或獲得電子(還原)同時產生電流峰。重要的是，所產生的電流量取決於分析物的濃度和所施加的電壓，每種化合物均具有其開始氧化或還原所需特異性電壓。目前最通用的電化學檢測器是電流檢測器，其中電勢保持恆定並在其後檢測由電化學反應產生的電流。這種類型的光譜測定法目前稱為「恆電位電流測法」。市售安培計可得自ESA，Inc.，Chelmford，MA。
當檢測效率為100％時，特異化檢測器稱為「庫侖檢測器」。就選擇性和靈敏度來說，庫侖檢測器具有許多實踐優點，從而使此類檢測器特別適用於一個陣列中。在庫侖檢測器中，對於給定的分析物濃度，將信號電流作為對工作電極外加電勢(電壓)的函數作圖。所得到的S形曲線圖稱為電流-電壓曲線或流體動力電壓電流圖(HDV)。HDV允許最好地選擇對工作電極施加的電勢，以使所觀察到的信息達到最大。ECD的主要優點是其固有的靈敏度，檢測的電流水平在亞非摩爾(10-15摩爾)範圍。
包括許多生物化學品、藥物及殺蟲劑在內的大量化學物質及化合物都是有電化學活性的。即使它們的半波電勢(最大信號半數值時的電勢)只有30-60mV的差異，仍可有效地分辨層析共洗脫的化合物。
最近發展的庫侖傳感器當在基於液相層析的分離中用作檢測器時，可選擇性地鑑定和分辨共洗脫化合物。因此這些陣列化的檢測器還可補加在檢測器本身中完成的另一組分離。目前的儀器具有原則上只受獲得數據的速率限制的16個波道。可在EC陣列上分辨的化合物的數目是受層析限制的(即受板數限制)。然而，如果層析共洗脫的兩種或多種化合物的半波電位差為30-60mV，則該陣列即能夠區分之。化合物成為電化學活性化合物的能力有賴於其具有EC活性基團(即-OH、-O、-N、-S)。
已使用庫侖檢測器成功地檢測的化合物包括5-羥基色胺、3-甲氧基-4-羥苯基乙二醇、尿黑酸、多巴胺、變腎上腺素、3-羥犬尿氨酸、乙醯米諾芬(acetominophen)、3-羥色醇、5-羥吲哚基乙酸、苯酚、鄰甲酚、焦培酚、2-硝基苯酚、4-硝基苯酚、2,4-二硝基苯酚、4,6-二硝基甲酚、3-甲基-2-硝基苯酚、2,4-二氯苯酚、2,6-二氯苯酚、2,4,5-三氯苯酚、4-氯-3-甲基苯酚、5-甲基苯酚、4-甲基-2-硝基苯酚、2-羥苯胺、4-羥苯胺、1,2-苯二胺、苯並兒茶素、巴特隆、chlortholuron、敵草隆、isoproturon、利谷隆、methohromuron、麥多隆、綠谷隆、monuron、蛋氨酸、色氨酸、酪氨酸、4-氨基苯甲酸、4-羥苯甲酸、4-羥香豆酸、7-甲氧基香豆素、5,7,4′-三羥黃酮、黃岑苷元、咖啡酸、兒茶素、矢車菊苷、綠原酸、大豆黃素、野麻根素、洋蕪荽黃素、表兒茶素沒食子酸鹽、表加蘭兒茶素、表加藍兒茶素沒食子酸鹽、丁子香酚、半齒澤蘭素、阿魏酸、非瑟酮、高良姜精、沒食子酸、桅子寧、染料木黃酮、龍膽酸、桔皮苷、鳶尾配基、莰非醇、無色花青素、藤黃菌素、楝子素、桑色素、楊梅黃酮、柚皮苷、柚皮素-7-芸香糖苷、花葵素、甲基花青素、根皮素、紅車軸草異丙酮、原兒茶酸、鼠李黃素、槲皮素、櫻花素、黃芩配基、莨菪亭、丁香醛、丁香酸、柑桔黃酮、troxerutin、傘形酮、香草酸、1,3-二甲基四氫異喹啉、6-羥多巴胺、r-豬毛菜醇、N-甲基-豬毛菜醇、四氫異喹啉、阿米替林、阿林嗎啡、辣椒辣素、氯氮、氯丙嗪、道諾紅菌素、地昔帕明、多塞平、氟西汀、氟西泮(氟安定)、米帕明、異丙基腎上腺素、甲氧明、嗎啡、嗎啡-3-葡糖苷酸、去甲替林、奧沙西泮(去甲羥安定)、苯福林(去氧腎上腺素)、曲米帕明、抗壞血酸、N-乙醯-5-羥色胺、3,4-二羥苄胺、3,4-二羥扁桃酸(DOMA)、3,4-二羥苯乙酸(DOPAC)、3,4-二羥苯丙氨酸(L-DOPA)、3,4-二羥苯基乙二醇(DHPG)、3-羥基氨茴酸、2-羥基苯乙酸(2HPAC)、4-羥苯甲酸(4HBAC)、5-羥吲哚-3-乙酸(5HIAA)、3-羥犬尿氨酸、3-羥偏桃酸、3-羥-4-甲氧基苯乙胺、4-羥苯乙酸(4HPAC)、4-羥苯基乳酸(4HPLA)、5-羥色氨酸(5HTP)、5-羥色醇(5HTOL)、5-羥色胺(5HT)、5-羥色胺硫酸鹽、3-甲氧基-4-羥苯基乙二醇(MHPG)、5-甲氧基色胺、5-甲氧基色氨酸、5-甲氧基色醇、3-甲氧基酪胺(3MT)、3-甲氧基酪氨酸(3-OM-DOPA)、5-甲基半胱氨酸、3-甲基鳥嘌呤、蟾毒色胺、多巴胺、多巴胺-3-葡糖苷酸、巴多胺-3-硫酸酯、多巴胺-4-硫酸酯、腎上腺素、麻黃寧、葉酸、穀胱苷肽(還原態)、鳥嘌呤、鳥苷、尿黑酸(HGA)、高香草酸(HVA)、高香草醇(HVOL)、高藜蘆酸、硫酸hva、次黃嘌呤、吲哚、吲哚-3-乙酸、吲哚-3-乳酸、犬尿氨酸、褪黑素、變腎上腺素、N-甲基色胺、N-甲基酪胺、N,N-二甲基色胺、N,N-二甲基酪胺、去甲腎上腺腎、去甲變腎上腺素、章魚胺、吡哆醛、磷酸吡哆醛、吡哆胺、脫氧腎上腺素、色醇、色胺、酪胺、尿酸、香草扁桃酸(vma)、黃嘌呤及黃苷。其他化合物如可參見Jane,I.等,J.Chrom.323:191-225(1985)和Musch,G.等，J.Chrom.348:99-110(1985)。可用本領域已知的方法將這些化合物摻入到式T-L-X的化合物中。例如，具有羧酸基團的化合物可與胺、羥基等反應以形成醯胺、酯及T和L間的其他鍵合。
除上述性質外，無論打算使用什麼檢測方法，標記都最好具有模式化學結構。這將有助於使用組合化學技術構建大數目的結構上相關的標記。例如，希望Tms有幾種性質。期望當以質譜法檢測含Tms部分時，其含有支持單一離子化帶電狀態的功能團(更簡單地稱為「質譜靈敏度增強」基團，或簡稱為MSSE)。另外，希望以其作為含Tms部分的家族中的一個成員，該家族的每個成員都有不同的質量/電荷比例，而在質譜檢測中又有差不多同樣的靈敏度。因此，希望該家族的成員有同樣的MSSE。為了得以產生化合物的家族，已發現可通模式合成路線方便地產生標記反應物，因而可將標記成分本身看作是含有模式的。
對於Tms基團的結構，一個優選的模式是Tms具有下列通式T2-(J-T3)n-其中T2是從碳和一個或多個氫、氟、碘、氧、氮、硫和磷形成的具有15至500道爾頓的質量範圍的有機殘基；T3是從碳和一個或多個氫、氟、碘、氧、氮、硫和磷形成的具有50至1000道爾頓的質量範圍的有機殘基；J是直接鍵，或諸如醯胺、酯、胺、硫醚、醚、硫代酯、二硫化物、硫代醚、脲、硫脲、氨基甲酸酯、硫代氨基甲酸酯、西夫鹼、還原態西夫鹼、亞胺、肟、腙、磷酸酯、膦酸酯、磷醯胺、膦醯胺、磺酸酯、氨磺醯或碳-碳鍵的功能團；n是1至50的整數，這樣當n大於1時，每個T3和J都是獨立選擇的。
模式結構T2-(J-T3)n-提供了進入T-L-X化合物家族的方便途徑，其中家族的每個成員都有不同的T基團。例如，當T是Tms，並且每個家族成員都期望有同樣的MSSE時，T3基團之一即可提供這種MSSE結構。為了就Tms的質量而言提供家族成員間的可變性，家族成員間的T2基團可以是變化的。例如，一個家族成員可以有T2=甲基，而另一個有T2=乙基，再一個則有T2=丙基等。
為了提供質量的大跳躍，可以設計T3基團以向T-L-X上加入相當大的(如1百至幾百個)質量單位。這樣的T3基團可稱為分子量範圍調整基團(「WRA」)。如果用一組具有超出限制範圍的質量的T2基團工作，WRA是相當有用的。可使用單一組T2基團，僅僅通過在Tms中摻入一個或多個WRAT3基團來產生有寬質量範圍的Tms基團。因此，舉一個簡單的例子，如果一組T2基團為Tms提供250-340道爾頓的質量範圍，加入例如作為T3基團的100個道爾頓的WRA，則使用同一組T2基團，就可提供350-440道爾頓的質量範圍。同樣，加入兩個100道爾頓MWA基團(各自作為T3基團)便提供接近450-540道爾頓的質量範圍，可繼續這種WRA基團的遞增加入，以為Tms基團提供很大的質量範圍。優選的式T2-(J-T3)n-L-X的化合物具有通式RVWC-(RWRA)W-RMSSE-L-X，其中VWC是「T2」基團，WRA和MSSE中的每一個都是「T3」基團。圖13中舉例說明了這一結構，並代表了製備Tms的一種模式方法。
在通式T2-(J-T3-)n-中，T2和T3較好是選自烴基、烴基-O-亞烴基、烴基-S-亞烴基、烴基-NH-亞烴基、烴基-醯胺-亞烴基、N-(烴基)亞烴基、N,N-二(烴基)亞烴基、烴基醯基-亞烴基、雜環基烴基，其中雜原子選自氧、氮、硫和磷，取代的雜環基烴基，其中雜原子選自氧、氮、硫和磷，且取代基選自烴基、烴基-O-亞烴基、烴基-NH-亞烴基、烴基-S-亞烴基、N-(烴基)亞烴基、N,N-二(烴基)亞烴基以及烴基醯基-亞烴基。此外，T2和/或T3可以是前面列出的潛在T2/T3基團中任何一個的衍生物，即一個或多個氫原子被氟原子取代。
還就通式T2-(J-T3)n-來說，優選的T3具有式-G(R2)-，其中G是具有單一R2取代基的C1-6亞烷基鏈。因此，如果G是亞乙基(-CH2-CH2-)，則兩個亞乙基碳中的任一個可具有R2取代基，並且R2選自烷基、鏈烯基、炔基、環烷基、芳基縮合的環烷基、環烯基、芳基、芳烷基、芳基取代的鏈烯基或炔基、環烷基取代的烷基、環烯基取代的環烷基、聯芳基、烷氧基、鏈烯氧基、炔氧基、芳烷氧基、芳基取代的鏈烯氧基或炔氧基、烷氨基、鏈烯氨基或炔氨基、芳基取代的烷氨基、芳基取代的鏈烯氨基或炔基氨基、芳氧基、芳氨基、N-烷基脲取代的烷基、N-芳基脲取代的烷基、烷基羰基氨基取代的烷基、氨基羰基取代的烷基、雜環基、雜環基取代的烷基、雜環基取代的氨基、羧烷基取代的芳烷基、氧代碳環縮合的芳基和雜環基烷基；環烯基、芳基取代的烷基和芳烷基、羥基取代的烷基、烷氧基取代的烷基、芳烷氧基取代的烷基、烷氧基取代的烷基、芳烷氧基取代的烷基、氨基取代的烷基、(芳基取代的烷氧基羰基氨基)取代的烷基、硫羥取代的烷基、烷基磺醯取代的烷基、(羥基取代的烷硫基)取代的烷基、硫代烷氧基取代的烷基、烴基醯基氨基取代的烷基、雜環醯基氨基取代的烷基、烴基取代的雜環基醯基氨基取代的烷基、烷基磺醯氨基取代的烷基、芳基磺醯氨基取代的烷基、嗎啉代烷基、硫代嗎啉代烷基、嗎啉代羰基取代的烷基、硫代嗎啉代羰基取代的烷基、(N-(烷基、鏈烯基或炔基)-或N,N-[二烷基、二鏈烯基、二炔基或(烷基、鏈烯基)-氨基]羰基取代的烷基、雜環基氨基羰基、雜環基亞烷基氨基羰基、雜環基氨基羰基取代的烷基、雜環基亞烷基氨基羰基取代的烷基、N,N-[二烷基]亞烷基氨基羰基、N,N-[二烷基]亞烷基羰基取代的烷基、烷基取代的雜環基羰基、烷基取代的雜環基羰基-烷基、羧基取代的烷基、二烷基氨基取代的醯基氨基烷基，以及選自精氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、S-甲基半胱氨酸、蛋氨酸和其相應的亞碸和碸衍生物、甘氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、別異亮氨酸、叔亮氨酸、正亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、脯氨酸、丙氨酸、鳥氨酸、組氨酸、穀氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、天冬氨酸、β-氰基丙氨酸及別蘇氨酸的胺基酸側鏈；炔基和雜環基羰基、氨基羰基、醯氨基、一或二烷基氨基羰基、一或二芳基氨基羰基、烷基芳基氨基羰基、二芳基氨基羰基、一或二醯基氨基羰基、芳族或脂族醯基、被選自氨基、羧基、羥基、巰基、一或二烷基氨基、一或二芳基氨基、烷基芳基氨基、二醯基氨基、一或二芳基氨基、烷氧基、鏈烯氧基、芳氧基、硫代烷氧基、硫代鏈烯氧基、硫代炔氧基、硫代芳氧基和雜環基任意取代的烷基。優選的式T2-(J-T3-)n-L-X的化合物具有下示結構
其中G是(CH2)1-6，其中由單一「G」代表的CH2基團中一個並且只有一個上的氫原子被-(CH2)c-醯胺-T4所取代，T2和T4是式C1-25N0 -9HαFβ的有機殘基，其中α和β的總和足以飽和C、N和O原子可能未飽和的價；醯胺是
R1是氫或C1-10烷基；C是0至4的整數，n是1至50的整數，其中當n大於1時，G、c、醯胺、R1和T4是獨立地選擇的。
在另一個優選實施方案中，式T2-(J-T3-)n-L-X的化合物具有下示結構
其中T5是式C1-25N0-9O0-9HαFβ的有機殘基，其中α和β的和足以飽和C、N和C原子的可能未飽和的價；T5包括叔或季胺或有機酸；m是0-49的整數，且T2、T4、R1、L和X是如前定義的基團。
另一個具有式T2-(J-T3-)n-L-X的優選化合物則有以下具體結構
其中T5是式C1-25N0-9O0-9HαFβ的有機殘基，其中α和β的總和足以飽和C、N和O原子的可能未飽和的價；T5包括叔或季胺或有機酸；m是0-49的整數，且T2、T4、c、R1、「醯胺」、L和X已在前面給出了定義。
在上面的具有T5基團的結構中，-醯胺-T5較好是使有機酸與從「G」延伸的游離氨基基因反應而方便地製得的下列基團之一
當上述化合物具有T5基團，並且「G」基團具有游離羧基基團(或其反應性等同物)時，則優選的-醯胺-T5基團是如下所示的，可使適當的有機胺與從「G」基團延伸的游離羧基基團反應而方便地製得的基團
在本發明的三個優選實施方案中，T-L-MOI具有下示結構
或者
或者
其中T2和T4是式C1-25N0-9O0-9S0-3P0-3HαFβIδ的有機殘基，其中α、β和δ的總和足以飽和C、N、O、S和P原子可能未飽和的價；G是(CH2)1-6，其中由每個G代表的CH2基團上的一個並且只有一個氫被-(CH2)c-醯胺-T4取代；醯胺是
R1是氫或C1-10烷基；c是從0至4的整數；「C2-C10」代表具有2至10個碳原子的亞烴基基團，「ODN-3′-OH」代表有末端3′羥基基團的核酸片段(即在核酸片段的3′末端以外的位置連接到(C1-C10))；n是從1至50的整數，這樣當n大於1時，獨立地選擇G、c、醯胺、R1和T4。最好沒有三個雜原子結合到同一個碳原子上。
在上面列出的含有T2-C(=0)-N(R1)-基團的結構中，該基團可由式HN(R1)-的胺與選自下面例子中的有機酸反應而生成，下面所列出的只是某些實例，但並沒有無遺漏地列出所有可能的有機酸。所說有機酸的例子包括甲酸、乙酸、丙酸、丙炔酸、氟乙酸、2-丁炔酸、環丙烷羧酸、丁酸、甲氧乙酸、二氟己酸、4-戊炔酸、環丁烷羧酸、3,3-二甲基丙烯酸、戊酸、N,N-二甲基甘氨酸、N-甲醯-Gly-OH、乙氧基乙酸、(甲硫基)乙酸、吡咯-2-羰酸、3-糠酸、異噁唑-5-羧酸、反式-3-己烯酸、三氟乙酸、己酸、Ac-Gly-OH、2-羥-2-甲基丁酸、苯甲酸、煙酸、2-吡嗪羧酸、1-甲基-2-吡咯羧酸、2-環戊烯-1-乙酸、環戊烷乙酸、(S)-(-)-2-吡咯烷酮-5-羧酸、N-甲基-L-脯氨酸、庚酸、Ac-b-Ala-OH、2-乙基-2-羥丁酸、2-(2-甲氧基乙氧基)乙酸、對甲苯甲酸、6-甲基煙酸、5-甲基-2-吡嗪羧酸、2,5-二甲基吡咯-3-羧酸、4-氟苯甲酸、3,5-二甲基異噁唑-4-羧酸、3-環戊基丙酸、辛酸、N,N-二甲基琥珀氨酸、苯基丙炔酸、肉桂酸、4-乙基苯甲酸、對甲氧基苯甲酸、1,2,5-三甲基吡咯-3-羧酸、3-氟-4-甲基苯甲酸、Ac-DL-炔丙基甘氨酸、3-(三氟甲基)丁酸、1-哌啶丙酸、N-乙醯脯氨酸、3,5-二氟苯甲酸、Ac-L-Va-OH、吲哚-2-羧酸、2-苯並呋喃羧酸、苯並三唑-5-羧酸、4-正丙基苯甲酸、3-二甲基氨基苯甲酸、4-乙氧基苯甲酸、4-(甲硫基)苯甲酸、N-(2-糠醯)甘氨酸、2-(甲硫基)煙酸、3-氟-4-甲氧基苯甲酸、Tfa-Gly-OH、2-萘甲酸、喹哪啶酸、Ac-L-Ile-OH、3-甲基吲哚烯-2-羧酸、2-喹喔啉羧酸、1-甲基吲哚-2-羧酸、2,3,6-三氟苯甲酸、N-甲醯-L-Met-OH、2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酸、4-正丁基苯甲酸、N-苯甲醯甘氨酸、5-氟吲哚-2-羧酸、4-正丙氧基苯甲酸、4-乙醯-3,5-二甲基-2-吡咯羧酸、3,5-二甲氧基苯甲酸、2,6-二甲氧基煙酸、環己烷戊酸、2-萘基乙酸、4-(1H-吡咯-1-基)苯甲酸、吲哚-3-丙酸、間三氟甲基苯甲酸、5-甲氧基吲哚-2-羧酸、4-戊基苯甲酸、Bz-b-Ala-OH、4二乙基氨基苯甲酸、4-正丁氧基苯甲酸、3-甲基-5-CF3-異噁唑-4-羧酸、(3,4-二甲氧基苯基)乙酸、4-聯苯基羧酸、新戊醯-Pro-OH、辛醯基-Gly-OH、(2-萘氧基)乙酸、吲哚-3-丁酸、4-(三氟甲基)苯基乙酸、5-甲氧基吲哚-3-乙酸、4-(三氟甲氧基)苯甲酸、Ac-L-Phe-OH、4戊氧基苯甲酸、Z-Gly-OH、4-羧基-N-(呋喃-2-基甲基)吡咯烷-2-酮、3,4-二甲氧基苯甲酸、2,4-二甲基-5-CO2Et-吡咯-3-羧酸、N-(2-氟苯基)琥珀醯胺酸、3,4,5-三甲氧基苯甲酸、N-苯基鄰氨基苯甲酸、3-苯氧基苯甲酸、壬醯-Gly-OH、2-苯氧基吡啶-3-羧酸、2,5-二甲基-1-苯基吡咯-3-羧酸、反式-4-(三氟甲基)肉桂酸、5-(甲基-2-苯基噁唑-4-基)乙酸、4-(2-環己烯氧基)苯甲酸、5-甲氧基-2-甲基吲哚-3-乙酸、反式-4-可塔寧羧酸、Bz-5-氨基戊酸、4-己氧基苯甲酸、N-(3-甲氧基苯基)琥珀醯胺酸、Z-Sar-OH、4-(3,4-二甲氧基苯基)丁酸、Ac-O-氟-DL-Phe-OH、N-(4-氟苯基)戊醯胺酸、4′-乙基-4-聯苯基羧酸、1,2,3,4-四氫吖啶羧酸、3-苯氧基苯基乙酸、N-(2,4-二氟苯基)琥珀醯胺酸、N-癸醯基-Gly-OH、(+)-6-甲氧基-a-甲基-2-萘乙酸、3-(三氟甲氧基)肉桂酸、N-甲醯-DL-Trp-OH,(R)-(+)-a-甲氧基-a-(三氟甲基)苯乙酸、Bz-DL-Leu-OH、4-(三氟甲氧基)苯氧基乙酸、4-庚氧基苯甲酸、2,3,4-三甲氧基肉桂酸、2,6-二甲氧基苯甲醯基-Gly-OH、3-(3,4,5-三甲氧基苯基)丙酸、2,3,4,5,6-五氟苯氧基乙酸、N-(2,4-二氟苯基)戊醯胺酸、N-十一醯基-Gly-OH、2-(4-氟苯甲醯基)苯甲酸、5-三氟甲氧基吲哚-2-羧酸、N-(2,4-二氟苯基)二甘醇氨酸、Ac-L-Trp-OH、Tfa-L-苯基甘氨酸-OH、3-碘代苯甲酸、3-(4-正戊基苯甲醯基)丙酸、2-苯基-4-喹啉羧酸、4-辛氧基苯甲酸、Bz-L-Met-OH、3,4,5-三乙氧基苯甲酸、N-月桂醯-Gly-OH、3,5-雙(三氟甲基)苯甲酸、Ac-5-甲基-DL-Trp-OH、2-碘苯基乙酸、3-碘-4-甲基苯甲酸、3-(4-正己基苯甲醯基)丙酸、N-己醯-L-Phe-OH、4-壬氧基苯甲酸、4＇-(三氟甲基)-2-聯苯基羧酸、Bz-L-Phe-OH、N-三癸醯基-Gly-OH、3,5-雙(三氟甲基)苯基乙酸、3-(4-正庚基苯甲醯基)丙酸、N-庚醯-L-Phe-OH、4-癸氧基苯甲酸、N-(α,α,α-三氟-間甲苯基)鄰氨基苯甲酸、2-[3-(三氟甲基)苯胺基]鹽酸、4-(2-羥基六氟異丙基)苯甲酸、N-肉豆蔻醯-Gly-OH、3-(4-正辛基苯甲醯基)丙酸、N-辛醯基-L-Phe-OH、4-十-烷氧基苯甲酸、3-(3,4,5-三甲氧基苯基)丙醯-Gly-OH、8-碘代萘酸、N-十五醯-Gly-OH、4-十二烷氧基苯甲酸、N-棕櫚醯-Gly-OH和N-硬脂醯-Gly-OH。可從下列公司購得這些有機酸Aclvanced Chem Tech,Louisville,KY；Bachem BioscienceInc.,Torrance,CA；Caliochem-Novabiochem Corp.,San Diego,CA；Farchan Laboratories Inc.,Gainesville FL；Lancaster Synthesis,Windham NH；以及MayBridge Chemical Company(c/o Ryan Scientific),Columbia,SC。這些公司的產品目錄中使用上述識別這些酸的縮寫字。
f．作為製備標記的手段的組合化學技術組合化學是導致生產大的化學文庫的一類合成策略(例如參見PCT申請公開號WO94/08051)。可使用這些組合文庫作為鑑定感興趣分子(MOI)的標記。組合化學可定義為一組彼此有不同結構的不同「結構單元」的系統的和重複的共價連接，藉以產生一大組互異的分子。結構單元可以採取天然產生和合成的許多形式，例如可以是親核試劑、親電子試劑、二烯類、烷化劑或醯化劑、二胺、核苷酸、胺基酸、糖、脂、有機單體、合成纖維及其組合。用於連接結構單元的化學反應包括烷基化、醯化、氧化、還原、水解、取代、消除、加成、環化、縮合等。該方法可產生化合物文庫，如寡聚合的、非寡核合的或其組合。如果是寡聚合的，化合物可以是分支的，不分支的或環化的。可用組合化學方法製備的寡聚結構的例子包括寡肽、寡核苷酸、寡糖、聚脂質、聚酯、聚醯胺、聚氨酯、聚脲、聚醚、聚(磷衍生物)，例如磷酸酯、膦酸酯、磷醯胺、膦醯胺、亞磷酸酯、phorsphinamide等，以及聚(硫衍生物)，如碸、磺酸酯、亞硫酸酯、氨磺醯、亞磺醯胺等。
一個通用類型的寡聚物組合文庫是肽組合文庫。當前肽化學和分子生物學的技術創新已使人們能夠製備並使用由數千萬到數億個不同的肽序列組成的文庫。可將這樣的文庫分成三大類。一類文庫包括化學合成可溶性非載體結合的肽文庫(如參見Houghten等，自然354:84,1991)。第二類包括化學合成呈現在塑料針、樹脂球或棉布上的與支持物結合的肽文庫(Geysen等,Mol.Immunol.23:709,1986；Lam等，自然354:82,1991；Eichler和Houghten，生物化學(Biochemistry)32:11035,1993)。在前兩類中，結構單元一般是L-胺基酸、D-胺基酸、非天然胺基酸或其某些混合物或組合。第三類是使用分子生物學方法在絲狀噬菌體或質粒表面上製備肽或蛋白質(Scott和Craig,Curr.Opinion Biotech.5:40,1994)。可溶性的非載體組和的肽文庫似乎適合於包括用作標記在內的許多應用。可以用例如全甲基化步驟擴展肽文庫中可利用的化學多樣性(Ostresh等，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 91:11138,1994)。
可以製得肽組合文庫的大量變體，例如其中可修飾肽骨架，和/或用模擬基團取代醯胺鍵。可以使用的醯胺模擬基團包括脲、氨基甲酸酯(尿烷)及羰基亞甲基等。重新構建骨架，以從每個胺基酸的醯胺氮而不是α碳發出側鏈，從而得到稱為類肽的化合物文庫(Simon等，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 89:9367,1992)。
另一個常見類型的寡聚物組和文庫是寡核苷酸組合文庫，其中結構單元是某種形式的天然存在的或非天然的核苷酸或多糖衍生物，包括其中各種有機和無機基團可取代磷酸酯鍵，並且氮和硫可取代醚鍵中的氧(Schneider等，生物化學34:9599,1995；Freier等，J.Med.Chem.38:344,1995；Frank，生物技術雜誌(J.Biotechnology)41:259,1995；Schneider等，已公開的PCT WO942052,Ecker等，核酸研究(NucleicAcids Res.)21:1853,1993)。
最近已描述了組和生產非寡聚的小分子化合物集群的方法(DeWitt等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:690,1993；Bunin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:4708,1994)。適於製成小分子文庫的結構包括各種有機分子，例如雜環、芳族、無環、脂族化合物、類固醇、抗生素、酶抑制劑、配體、激素、藥物、生物鹼、阿片樣物質、萜類、卟啉、毒素、催化劑以及其組合。
g．組合合成標記的特異性方法以下概述製備和使用不同組的含胺MS標記的兩種方法。在兩種方法中，利用固相合成可使人們得以用組合化學的技術同時平行地合成很大數目的標記的接頭。在第一種方法中，最後從寡核苷酸上裂解掉標記後得以釋放出羧醯胺。在第二種方法中，切掉標記後產生羧酸。用於這些方法中的化學成分和連接元件的縮寫符號如下R =樹脂FMOC =芴基甲氧基羰基保護基團All=烯丙基保護基團CO2H =羧酸基團CONH2=羧醯胺基團NH2=氨基基團OH=羥基基團CONH =醯胺鍵COO =酯鏈NH2-Rink-CO2H=4-[(α-氨基)-2,4-二甲氧基苄基]-苯氧基苯丁酸(Rink接頭)OH-1MeO-CO2H =(4-羥甲基)苯氧基丁酸OH-2MeO-CO2H =(4-羥甲基)-3-甲氧基)苯氧基乙酸NH2-A-COOH =側鏈中有脂族或芳族胺功能團的胺基酸X1…Xn-COOH=具獨特分子量的一組n個不同的羧酸oligo1…oligo(n) =一組n個寡核苷酸HBTU =O-苯並三唑-1-基-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸鹽方法1中各步驟的順序如下OH-2MeO-CONH-R↓FMOC-NH-Rink-CO2H；偶聯(如HBTU)FMOC-NH-Rink-COO-2MeO-CONH-R↓哌啶(除去FMOC)NH2-Rink-COO-2MeO-CONH-R↓FMOC-NH-A-COOH；偶聯(例如HBTU)FMOC-NH-A-CONH-Rink-COO-2MeO-CONH-R↓哌啶(除去FMOC)NH2-A-CONH-Rink-COO-2MeO-CONH-R↓分為n等份↓↓↓↓偶聯到n種不同的酸X1……Xn-COOH上X1……Xn-CONH-A-CONH-Rink-COO-2MeO-CONH-R↓↓↓↓↓用1％TFA從樹脂上切下標記的接頭X1……Xn-CONH-A-CONH-Rink-COOH↓↓↓↓↓偶聯到n個寡聚體上(oligo1…oligo(n))(例如通過Pfp酯)X1……Xn-CONH-A-CONH-Rink-CONH-oligo1…oligo(n)↓合併標記的寡聚體↓完成測序反應↓從測序反應中分離不同長度的片段(例如通過HPLC或CE)↓用25％-100％TFA從接頭上切下標記X1……Xn-CONH-A-CONH↓用質譜分析方法2中各步驟的順序如下OH-1MeO-CO2-All↓FMOC-NH-A-CO2H；偶聯(例如，HBTU)FMOC-NH-A-COO-1MeO-CO2-All↓鈀(除去烯丙基)FMOC-NH-A-COO-1MeO-CO2H↓OH-2MeO-CONH-R；偶聯(例如，HBTU)FMOC-NH-A-COO-1MeO-COO-2MeO-CONH-R↓哌啶(除去FMOC)NH2-A-COO-1MeO-COO-2MeO-CONH-R↓分成n個等份↓↓↓↓↓偶聯到n個不同的酸X1……Xn-CO2H上X1……Xn-CONH-A-COO-1MeO-COO-2MeO-CONH-R↓↓↓↓↓用1％TFA從樹脂上切掉標記的接頭X1……Xn-CONH-A-COO-1MeO-CO2H↓↓↓↓↓偶聯到n個寡聚體上(oligo1…oligo(n))(例如，通過Pfp酯)X1……Xn-CONH-A-COO-1MeO-CONH-oligo1…olgo(n)↓合併標記的寡聚體↓完成測序反應↓從測序反應中分離不同長度的片段(例如通過HPLC或CE)↓用25-100％TFA從接頭上切掉標記X1……Xn-CONH-A-CO2H↓用質譜法分析2．接頭本文中所說的「接頭」成分(或L)是指用於通過共價化學鍵將「標記」(或T)接合到「感興趣分子」(或MOI)上的直接共價鍵或有機化學基團。此外，直接鍵本身或接頭成分內的一個或多個鍵可在允許從T-L-X化合物的其餘部分(包括MOI成分)中釋放出(或者說是裂解掉)T的條件下裂解。存在於T內的標記可變部分應是對裂解條件穩定的。最好儘快完成裂解，例如在幾分鐘內，特別是在15秒鐘或更短時間內。
一般來說，使用接頭使每一大組標記連接到一相似的大組MOI上。典型的是將單個標記-接頭組合連接到各個MOI上(得到各種各樣的T-L-MOI)，但在某些情況下，可在每個MOI上連接一個以上的標記-接頭組合(得到各種(T-L)n-MOI)。在本發明的另一個實施方案中，通過接頭上的多個獨立的位點將兩個或多個標記結合到單一接頭上，然後將此多標記-接頭組合連接到單個MOI上(得到各種(T)n-L-MOI)。
在對這組標記的MOI進行了各種操作後，使用特異的化學和/或物理條件裂解接頭中的一個或多個共價鍵，結果從MOI上釋出標記。該可裂解的鍵可以是或不是某些當標記、接頭和MOI連接在一起時所形成的同樣鍵。接頭的設計將在很大程度上決定完成裂解所需的條件。因此，可根據它們特別敏感的裂解條件來指稱接頭。當接頭對光不穩定時(即傾向於通過與光化照射接觸而裂解)，則接頭可稱為Lhv。同樣，可用Lacid、Lbase、L[O]、Lenz、Lelc、LΔ和Lss來命名分別對酸、鹼、化學氧化、化學還原、酶的催化活性(更簡單地說是對「酶」)、電化學氧化或還原、升高的溫度(「熱」)及硫醇交換特別敏感的接頭。
某些類型的接頭對每一類型的裂解條件不穩定，而其他一些接頭則對幾種類型的裂解不穩定。此外，在能夠結合多個標記的接頭(得到(T)n-L-MOI型結構)中，各個標記結合位點可以是對不同的裂解條件不穩定的。例如，在其上結合有兩個標記的接頭中，其中一個標記可以是只對鹼不穩定，另一個則只對光解作用不穩定。
可用於本發明的一種接頭具有幾個特徵1)接頭具有化學柄(Lh)，通過該柄使接頭連接到MOI上。
2)接頭具有第二個分立的化學柄(Lh)，通過該柄使標記連接到接頭上。如果多個標記連接到單一接頭上((T)n-L-MOI型結構)，則對每個標記存在一個分立的柄。
3)除了允許裂解，以使含T的部分從包括MOI在內的化合物其餘部分上釋放下來的條件外，接頭對其所經受的所有操作都是穩定的。因此，接頭在標記連接到接頭上、接頭連接到MOI上，以及在對MOI進行的使標記和接頭(T-L)與之連接的任何操作期間都是穩定的。
4)接頭在T-L連接到MOI上時並不明顯地幹擾對MOI進行的操作。如果T-L連接到寡核苷酸上，T-L一定不能對寡核苷酸所參於的任何雜交和酶促反進(如PCR)造成以確切幹擾。同樣，如果T-L連接到抗體上，則其一定不能對該抗體的抗原識別有明顯的幹擾。
5)使用對標記的可檢測性沒有不利影響的物理或化學方法，以高度控制的方法將標記從化合物上裂解下來。
對於任何給定的接頭，最好是接頭能夠連接到寬範圍的各種MOI上，而且各種標記可以連接到接頭上。這樣的靈活性是有利的，因為這樣可使T-L連接物的文庫一旦製備之後，即可與幾種不同的MOI一起使用。
如上文解釋的，一種優選的接頭具有下列通式Lh-L1-L2-L3-Lh其中每個Lh都是一個能用於將接頭連接到標記反應物上和感興趣的分子反應物上的反應活性柄。L2是接頭的基本部分，因為L2賦予接頭以不穩定性。L1和L3是可任意存在的基團，其可有效地用於使L2與柄Lh分離開。
L1(按照定義，其比L3更接近於T)可用於使T與必要的不穩定部分L2分離開。如果裂解反應產生可使含T部分的結構發生隨機改變的特殊反應性基團(如游離基)時，則這種分離可能是有用的。當裂解位點進一步與含T部分分離開時，在此裂解位點形成的反應性基團就不太可能破壞含T部分的結構。另外，因為L1中的原子一般存在與含T部分，這些L1原子可賦予含T部分以有利的性質。例如，當含T部分是含Tms部分時，希望作為含Tms部分之結構的一部分(例如作為MSSE)存在位阻胺，該位阻胺可能存在於L1不穩定部分中。
在其他例子中，接頭成分中可能只存在L1和/或L3，這是因為接頭的供應商選擇出售具這種L1和/或L3基團形式的接頭。在這些情況下，使用具有L1和/或L3基團的接頭，即使對摻入它們的化合物沒有帶來任何特殊的性能優點，但也沒有什麼損害(只要這些基因並不抑制裂解反應即可)。因此，本發明允許在接頭成分中存在L1和/或L3基團。
L1和/或L3基團可以是直接鍵(在這種情況下，實際不存在該基團)、亞烴基基團(例如亞烷基、亞芳基、亞環烷基等)、-O-亞烴基(例如-O-CH2-、O-CH2CH(CH3)4-等)或亞烴基-(O-亞烴基)w-，其中w是1到10的整數(例如-CH2-O-Ar-,-CH2-(O-CH2CH2)4-等)。
隨著固相合成的出現，已發表了大量關於對特異性反應條件不穩定的接頭的文章。在典型的固相合成中，固相載體通過不穩定的接頭結合反應性位點，並且在反應性位點產生待合成的分子。當該分子被完全合成之後，使固相載體-接頭-分子構建體受從固相載體上放出所說的分子的裂解條件。已發展的用於這一目的(或可能用於這一目的)的不穩定性接頭也可很容易於用作本發明的接頭反應物。
Lloyd-Williams,P等人(「會聚性固相肽合成」)，四面體報告(Tetrahedron Report)No.347,49(48):11065-11133(1993))深入地討論了對光化性照射(即光解)、酸、鹼及其他裂解條件不穩定的接頭。有關敏感性接頭的其他信息來源易於得到。
如上文所討論的，不同的接頭設計將賦予在不同的特異性物理或化學條件下的可裂解性。用於裂解各種不同設計的接頭的條件包括酸、鹼、氧化、還原、氟化物、巰基交換、光解及酶促條件。
滿足上文列出的接頭一般標準的可裂解的接頭是本領域技術人員已知的，並包括Pierce(Rockford,IL)提供的目錄中的那些。例子包括· 雙(琥珀醯亞氨基琥珀酸)乙二醇酯(EGS)，為可被羥胺裂解(1M,37℃,3-6小時)的胺反應性交聯劑；· 酒石酸二琥珀醯亞氨酯(DST)和磺基-DST，其為可被0.015M過碘酸鈉裂解的胺反應性交聯劑；· 雙[2-(琥珀醯亞氨氧基羰基氧基)乙基]碸(BSOCOES)和磺基-BSOCOES，其為可被鹼(pH11.6)裂解的胺反應性交聯劑；· 1,4-二-[3′-(2′-吡啶二硫基(丙醯胺基)丁烷(DPDPB)，可經硫羥交換或還原作用裂解的吡啶二硫醇交聯劑；· N-[4-(對疊氮基水楊醯胺基)-丁基]-3＇-(2＇-吡啶二硫基)丙醯胺(APDP)，為可經硫羥交換或還原裂解的吡啶二硫醇交聯劑；· 雙-[β-4-(疊氮基水楊醯胺基)乙基]-二硫化物，為可經硫羥交換或還原作用裂解的光反應性交聯劑；· N-琥珀醯亞氨基-(4-疊氮苯基)-1,3′-二硫基丙酸酯(SADP)，可經硫羥交換或還原反應裂解的光反應性交聯劑；· 硫代琥珀醯亞氨基-2-(7-疊氮基-4-甲基香豆素-3乙醯胺)乙基-1,3′-二硫丙酸酯(SAED)，可經硫羥交換或還原反應裂解的光反應性交聯劑；· 磺基琥珀醯亞氨基-2-(間疊氮基-鄰硝基苯甲醯氨基)-乙基-1,3′-二硫丙酸酯(SAND)，可經硫羥交換或還原反應裂解的光反應性交聯劑。
可裂解接頭的其他例子和可用於釋放標記的裂解條件如下所述。可被氟化物或在酸性條件下裂解的甲矽烷基連接基團。可被光源裂解(光解)的3-,4-,5-，或6-取代的-2-硝基苄氧基或2-,3-,5-，或6-取代的-4-硝基苄氧基連接基團。可被Ce(NH4)2(NO3)6裂解(氧化)的3-,4-,5-或6-取代的-2-烷氧基苯氧基或2-,3-,5-，或6-取代的-4-烷氧基苯氧基連接基團。可被氫氧化物(鹼)、酸或LiAIH4(還原)裂解的NCO2(尿烷)接頭。可被O3、OsO4/IO4-或KMnO4(氧化)裂解的3-戊烯基、2-丁烯基或1-丁烯基連接基團。可被O2、Br2、MeOH或酸裂解的2-[3-,4-，或5-取代的-呋喃基]氧基連接基團。
裂解其他不穩定連接基團的條件包括可用酸裂解叔烷氧基連接基團；可用H3O+裂解的甲基(二烷基)甲氧基或4-取代的-2-烷基-1,3-二氧戊環-2-基連接基團；可用氟化物或酸裂解的2-甲矽烷基乙氧基連接基團；可在鹼性條件下裂解的2-(X)-乙氧基(其中X=酮、酯、醯胺、氰基、NO2、硫醚、亞碸、碸)連接基團；可用酸或在還原條件下裂解的2-,3-,4-,5-，或6-取代的苄氧基連接基團；可用(Ph3P)3RhCl(H)裂解的2-丁烯氧基連接基團；可用Li、Mg或BuLi裂解的3-,4-,5-或6-取代的-2-溴苯氧基連接基團；可用Hg2+裂解的甲基硫代甲氧基連接基團；可用Zn或Mg裂解的2-(X)-乙氧基(其中X=滷素)連接基團；可經氧化(例如用Pb(OAc)4)裂解的2-羥基乙氧基連接基團。
優選的接頭是被酸或光解作用裂解的接頭。在已為固相肽合成而發展的酸敏感性接頭中，有幾種可用於將標記連接到MOI上。在Lloyd-Williams等人的綜述(四面體49:11065-11133,1993)描述了其中的某些接頭。一類有用的接頭是基於對烷氧基苄基醇，其中兩種接頭4-羥基甲基苯氧基乙酸和4-(4-羥甲基-3-甲氧基苯氧基)丁酸可購自Advanced ChemTech(Louisville,KY)。這兩個接頭可通過連接到苄醇上的酯鍵連接到標記上，並且通過連到羧酸上的醯胺鍵連接到含胺MOI上。用不同濃度的三氟乙酸從MOI裂解掉由這些分子連接的標記。裂解這些接頭導致標記上的羧酸的釋放。酸裂解通過相關接頭如2,4-二甲氧基-4＇-(羧甲氧基)-二苯甲基胺(可以FMOC保護的形式購自AdvancedChem Tech公司)連接的標記，導致被釋出的標記上的羧醯胺的釋放。
已為固相肽合成而發展的大部分光敏感性接頭也可用於本申請(參見Lloyd-Williams的綜述)。這些接頭通常是基於2-硝基苄酯或2-硝基苄醯胺。最近文獻中報導過的光敏感接頭的兩個例子是4-(4-(1-Fmoc-氨基)乙基)-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)丁酸(Holmes和Jones,J.Org.Chem.60:2318-2319,1995)和3-(Fmoc-氨基)-3-(2-硝基苯基)丙酸(Brown等，Molecular Diversity 1:4-12,1995)。兩接頭均可通過羧酸連接到MOI的胺上。通過在標記上的羧酸和接頭上的胺之間形成醯胺而使標記接到接頭上。通常用350nm波長的紫外光以本領域已知的強度和時間完成對光敏感接頭的裂解。裂解接頭導致標記上伯醯胺的釋放。光可裂解的接頭的例子包括硝基苯基甘氨酸酯，內-和外-2-苯並降冰片烷基氯和甲磺酸，以及3-氨基-3(2-硝基苯基)丙酸。酶促裂解的例子包括可裂解酯鍵的酯酶、裂解磷酸二酯鍵的核酸酶、裂解肽鍵的蛋白酶等。
優選的接頭成分具有如下所示的鄰硝基苄基結構
其中位置a、b、c、d或e上的一個碳原子被-L3-X取代，L1(其較好是直接鍵)在上述結構中存在於N(R1)的左邊。這樣的接頭成分對選擇性光誘導的對標有「a的碳和N(R1)之間的鍵裂解是敏感的。R1對裂解反應並不重要，但最好選自氫和烴基。本發明指出上述結構中-N(R1)-可被-O-替換。另外，在上示結構中，位置b、c、d或e中的一個或多個位置可被烷基、烷氧基、氟、氯、羥基、羥酸酯或醯胺取代，其中這些取代基在各種情形中被獨立地選擇。
另一個帶有化學柄Lh的優選接頭成分具有下示結構
其中位置b、c、d或e中的一個或多個位置由氫、烷基、烷氧基、氟、氯、羥基羧酸酯或醯胺取代，R1是氫或烴基，且R2是-OH或保護或活化羧酸以利於與另一個部分偶聯的基團。氟碳和氫氟碳基團是活化羧酸以利與另一個部分偶聯的優選基團。
3．感興趣的分子(MOI)MOI的例子包括核酸或核酸類似物(如PNA)、核酸的片段(即核酸片段)、合成的核酸或片段、寡核苷酸(如DNA或RNA)、蛋白質、肽、抗體或抗體片段、受體、受體配基、配體對的成員、細胞因子、激素、寡糖、合成的有機分子、藥物及其組合。
優選的MOI包括核酸片段。優選的核酸片段是與存在於用來鹼基測序的載體中的序列互補的引物序列。核酸片段較好是在片段的3′末端以外，並且最好是在片段的5′末端直接或間接連接到標記上。可以從商業來源(例如Promega,Madison,WI)買到或基於基因資料庫(例如Dib等，自然380:152-154,1996和GEPH Genotype Database,http://www,cephb.fr)製得。
本文使用的術語MOI包括MOI的衍生物，其含有使MOI連接到T-L-Lh上的功能團。例如，在5′末端有磷酸二酯並且該磷酸二酯也結合到亞烷基胺上的核酸片段即是MOI。美國專利4,762,779中描述了這樣一種MOI。作了內部修飾的核酸片段也是MOI。對核酸片段的內部修飾的一個例子是將已經過修飾的鹼基(例如A、G、C、T、U)加到反應性功能基團上。可從例如Glen Research,Herndon,VA購得這種經過內部修飾的核酸片段。對核酸片段進行內部修飾的另一個例子是使用無鹼基亞磷酸醯胺合成修飾的磷酸二酯，將後者放在核酸片段的糖和磷酸基團之間。該無鹼基亞磷酸醯胺含有一反應性基團，所說的基團允許含有該亞磷酸醯胺衍生部分的核酸片段連接到另一個部分如T-L-Lh化合物上。例如可從Clonetech Laboratories,Inc.,Palo Alto,CA購得這樣的無鹼基亞磷酸醯胺。
4．化學柄(Lh)化學柄是作為第一分子的一部分存在的同穩定而具反應性的原子排布，該柄可進行與作為第二分子的一部分存在的互補化學柄的化學反應，從而形成兩分子間的共價結合。例如，化學柄可以是羥基基團，而互補化學柄則可以是羧酸基團(或其活化的衍生物，例如氫氟芳基酯)，經反應後這兩個柄之間形成將兩分子連接在一起的共價鍵(特別是酯基團)。
化學柄可用於許許多多共價鍵形成反應中，通過這些反應使標記連接到接頭上，並使接頭連接到MOI上。這樣的反應包括烷基化(例如形成醚，硫醚)、醯化(如形成酯、醯胺、氨基甲酸酯、脲、硫脲)、磷酸化(如形成磷酸酯、膦酸酯、磷醯胺、膦醯胺)、磺醯化(如形成磺酸酯、氨磺醯)、縮合(如形成亞胺、肟、腙)、甲矽烷基化、二硫化物形成，以及經光解作用生成反應性中間體(如氮烯或碳烯)。一般說來，適於將標記連接到接頭上的柄和鍵形成反應也適於使接頭接到MOI上，反之亦然。在某些情況下，MOI可能預先進行修飾的衍生作用，以提供連接接頭所需的柄。
一種類型的特別適用於將接頭連接到MOI上的鍵是二硫鍵。其形成需要在接頭上存在巰基基團(「柄」)，並且在MOI上存在另一個巰基基團。然後中度氧化條件即足以使兩個巰基結合成二硫化物。也可使用過量的適當二硫化物交換試劑例如二硫化吡啶來誘導二硫鍵形式。因為二硫化物的形成是很容易逆轉的，所以必要時可使用二硫鍵作為釋放標記的可裂解鍵。一般可在相似的溫和條件下，使用過量的適當巰基交換劑如二硫蘇糖醇來完成反應。
為使標記(或連有接頭的標記)連接到寡核苷酸上，特別有利的是形成醯胺鍵。可用亞磷醯胺酯例如6-單甲氧基三苯甲基己基氰乙基-N,N-二異丙基亞磷醯胺酯(可購於Glenn Research,Sterling,VA)很容易的將伯脂族胺柄導入到合成的寡核苷酸上。與被導入的伯胺相比，見於天然核苷酸中的胺例如腺苷和鳥苷實際上是無反應性的。反應性的這種差異構成與被導入的伯胺而不是核苷胺選擇性地形成醯胺及相關結合基團(如脲、硫脲、氨磺醯)之能力的基礎。
如在分子探針供貨目錄(Molecular Probes catalog)(Eugene,OR)中所列出的，胺反應性功能基團的部分細目包括活化的羧酸酯、異氰酸酯、異硫氰酸酯、磺醯滷和二氯三氮烯。活性酯是對胺修飾的極好試劑，因為所形成的醯胺產物是很穩定的。另外，這些試劑與脂族胺有很好的反應性，而與寡核苷酸的核苷酸胺則是低反應性的。活性酯的例子包括N-羥基琥珀醯亞胺酯、五氟苯基酯、四氟苯基酯及對硝基苯基酯。因為活性酯可由實際上任何含有羧酸的分子製得，所以它們是很有用的。Bodansky(肽化學的原理(第二版)，Springer Verlag,London,1993)列出了製造活性酯的方法。
5．接頭連接一般使用單一類型的接頭將特定組或家族的標記連接到特定組或家族的MOI上。在本發明的優選實施方案中，可按一種統一的方法創造所有的各種T-L-MOI結構。如果一組T-L-MOI結構的數目多，這樣做是特別有利的，因為它得以使用組合化學或其他平行的加工技術製備這一組結構。以相似的方式，使用單一類型的接頭可以利用某種統一的方法裂解所有的各種T-L-MOI結構。另外，這對於一大組T-L-MOI結構是有利的，因為這樣可以按平行的重複的和/或自動化的方式處理該組結構。
但也有本發明的其他實施方案，其中使用兩種或多種類型的接頭將不同亞組的標記連接到相應亞組的MOI上。在這種情況下，可使用選擇性裂解條件獨立地裂解各個接頭，而不裂解存在於其他亞組MOI上的接頭。
有許多共價鍵形成反應適於將標記連接到接頭上，並將接頭連接到MOI上。這樣的反應包括烷基化(例如形成醚，硫醚)、醯化(如形成酯、醯胺、氨基甲酸酯、脲、硫脲)、磷酸化(如形成磷酸酯、膦酸酯、磷醯胺、膦醯胺)、磺醯化(如形成磺酸酯、氨磺醯)、縮合(如形成亞胺、肟、腙)、甲矽烷基化、二硫化物形成，以及經光解作用生成反應性中間體(如氮烯或碳烯)。一般說來，適於將標記連接到接頭上的柄和鍵形成反應也適於使接頭接到MOI上，反之亦然。在某些情況下，MOI可能預先進行修飾或衍生作用，以提供連接接頭所需的柄。
一種類型的特別適用於將接頭連接到MOI上的鍵是二硫鍵。其形成需要在接頭上存在巰基基團(「柄」)，並且在MOI上存在另一個巰基基團。然後中度氧化條件即足以使兩個巰基結合成二硫化物。也可使用過量的適當二硫化物交換試劑例如二硫化吡啶來誘導二硫鍵形式。因為二硫化物形成是很容易逆轉的，所以必要時可使用二硫鍵作為釋放標記的可裂解鍵。一般可在相似的溫和條件下，使用過量的適當巰基交換劑如二硫蘇糖醇來完成反應。
為使標記連接到寡核苷酸上，特別有利的是形成醯胺鍵。可用亞磷醯胺酯例如6-單甲氧基三苯甲基己基氰乙基-N,N-二異丙基亞磷醯胺酯(可購於Glenn Research,Sterling,VA)很容易的將伯脂族胺柄導入到合成的寡核苷酸上。與被導入的伯胺相比，見於天然核苷酸中的胺例如腺苷和鳥苷實際上是無反應性的。反應性的這種差異構成與被導入的伯胺而不是核苷胺選擇性地形成醯胺及相關結合基團(如脲、硫脲、氨磺醯)之能力的基礎。
如在分子探針供貨目錄(Molecular Probes catalog)(Eugene,OR)中所列出的，胺反應性功能基團的部分細目包括活化的羧酸酯、異氰酸酯、異硫氰酸酯、磺醯滷和二氯三氮烯。活性酯是對胺修飾的極好試劑，因為所形成的醯胺產物是很穩定的。另外，這些試劑與脂族胺有很好的反應性，而與寡核苷酸的核苷酸胺則是低反應性的。活性酯的例子包括N-羥基琥珀醯亞胺酯、五氟苯基酯、四氟苯基酯及對硝基苯基酯。因為活性酯可由實際上任何含有羧酸的分子製得，所以它們是很有用的。Bodansky(肽化學的原理(第二版)，Springer Verlag,London,1993)列出了製造活性酯的方法。
有許多可作為接頭的商品交聯劑(如參見Pierce Cross-linkers,Pierce Chemical Co.,Rockford,IL)。其中同雙官能胺反應性交聯劑的例子是同雙官能亞氨酸酯和N-羥基琥珀醯亞氨(NHS)酯。還存在具有兩個或多個不同反應性基團的異雙官能交聯劑，其允許進行系列反應。亞氨酸酯在鹼性pH條件下與胺迅速反應。當NHS酯與伯或仲胺反應時產生穩定的產物。馬來醯亞胺、烷基滷和芳基滷、α-滷醯基和吡啶二硫化物是巰基反應性的。在pH6.5-7.5範圍內馬來醯亞胺是對巰基(硫氫基)基團特異的，並在鹼性pH可變成胺反應性的。在生理條件下硫醚鍵是穩定的。α-滷乙醯基交聯劑含有碘乙醯基團並且是對巰基有反應性的。咪唑可與碘乙醯基團反應，但反應非常緩慢。吡啶二硫化物與巰基基團反應形成二硫鍵。碳二亞胺將羧基化合物偶聯到醯肼的伯胺上以形成醯基-肼鍵。芳基疊氮化物是在接觸紫外或可見光之前呈化學惰性的光親和試劑。當這樣的化合物在250-460nm光解時，形成反應性芳基氮烯。反應性芳基氮是烯相對非特異的。乙二醛對精氨酸的胍基部分有反應性。
在本發明的一個典型實施方案中，首先使標記結合到接頭上，然後再使標記和接頭的組合體結合到MOI上，以產生結構T-L-MOI。或者，可首先使接頭結合到MOI，然後再使接頭和MOI的組合體結合到標記上。一個例子是其中MOI為DNA引物或寡核苷酸。在這種情況下，典型的是首先使標記與接頭結合，然後再使T-L結合到DNA引物或寡核苷酸上，所得組合體即可用於測序反應。
一種有用的形式是其中使標記通過化學敏感性接頭可逆性地連接到MOI(如寡核苷酸或DNA測序引物)上。接頭的一種優選設計使接頭接觸到揮發性有機酸例如三氟乙酸(TFA)時被裂解。特別是TFA適於與包括電噴射法在內的大多數MS離子化方法配合使用。
如下文詳細描述的，本發明提供基因型鑑定的方法。可用於基因型鑑定的組合物包括有下示通式的多個化合物Tms-L-MOI其中Tms是可用質譜法檢測的有機基團，包含碳，氫和氟中至少一種，並可包括選自氧、氮、硫、磷和碘的原子。該式中，L是允許從化合物的其餘部分裂解出含Tms部分的有機基團，其中含Tms部分包括當化合物經受質譜分析時支持單一離子化帶電狀態的功能團，並選自於叔胺、季胺和有機酸。式中，MOI是核酸片段，其中L在MOI之3′末端以外的位置連接到MOI上。在該組合物中，至少兩個化合物具有同樣的Tms，但這些分子的MOI基團具有不同的核酸長度。
另一種用於基團分型方法的組合物包括多個有下示通式的化合物Tms-L-MOI其Tms是可用質譜法檢測的有機基團，包含碳，氫和氟的至少一種，並可包括選自氧、氮、硫、磷和碘的原子。該式中，L是允許從化合物的其餘部分裂解出含Tms部分的有機基團，其中含Tms部分包括當化合物經受質譜分析時支持單一離子化帶電狀態的功能團，並選自於叔胺、季胺和有機酸。該式中，MOI是核酸片段，其中L在MOI之3′末端以外的位置連接到MOI上。該組合物中，至少兩個化合物具有同樣的Tms，但那些化合物在柱層析中具有不同的洗脫時間。
可用於基因型鑑定的另一種組合物包括多個有下列通式的化合物Tms-L-MOI其中Tms是可用質譜法檢測的有機基團，包含碳，氫和氟的至少一種，並可包括選自氧、氮、硫、磷和碘的原子。該式中，L是允許從化合物的其餘部分裂解出含Tms部分的有機基團，其中含Tms部分包括當化合物經受質譜分析時支持單一離子化帶電狀態的功能團，並選自於叔胺、季胺和有機酸。該式中，MOI是核酸片段，其中L在MOI之3′末端以外的位置連接到MOI上。該組合物中，沒有兩個化合物具有同樣MOI核苷酸長度且有同樣的Tms。
在上述組合物中，多個是是大於2，最好是大於4。另外，MOI中的核酸片段具有與載體的一部分互補的序列，其中片段能夠引導多核苷酸合成。多個化合物中成員的Tms基團最好至少差2amu，並可至少差4amu。
本發明還提供包括多組化合物的組合物，每組化合物都有下列通式Tms-L-MOI其中Tms是可用質譜法檢測的有機基團，包含碳，氫和氟的至少一種，並可包括選自氧、氮、硫、磷和碘的原子。該式中，L是允許從化合物的其餘部分裂解出含Tms部分的有機基團，其中含Tms部分包括當化合物經受質譜分析時支持單一離子化帶電狀態的功能團，並選自於叔胺、季胺和有機酸。該式中，MOI是核酸片段，其中L在MOI之3′末端以外的位置連接到MOI上。在該組合物中，第一組化合物中的成員具有完全相同的Tms基因，但具有不同的MOI基團，即MOI中有不同數目的核苷酸；並且第一組內至少有10個成員，其中各組間Tms基團至少相差2amu。多組較好是至少3組，且最好是至少5組。
本發明還提供包括多組化合物的組合物，每組化合物都下列通式Tms-L-MOI其中Tms是可用質譜法檢測的有機基團，包含碳，氫和氟的至少一種，並可包括選自氧、氮、硫、磷和碘的原子。該式中，L是允許從化合物的其餘部分裂解出含Tms部分的有機基團，其中含Tms部分包括當化合物經受質譜分析時支持單一離子化帶電狀態的功能團，並選自於叔胺、季胺和有機酸。該式中，MOI是核酸片段，其中L在MOI之3′末端以外的位置連接到MOI上。在該組合物中，一組內的化合物具有同樣的洗脫時間，但有不同的Tms基團。
此外，本發明提供了用於基因型鑑定的試劑盒。試劑盒包括多個擴增引物對，其中至少一個引物有下列通式Tms-L-MOI其中Tms是可用質譜法檢測的有機基團，包含碳，氫和氟的至少一種，並可包括選自氧、氮、硫、磷和碘的原子。該式中，L是允許從化合物的其餘部分裂解出含Tms部分的有機基團，其中含Tms部分包括當化合物經受質譜分析時支持單一離子化帶電狀態的功能團，並選自於叔胺、季胺和有機酸。該式中，MOI是核酸片段，其中L在MOI之3′末端以外的位置連接到MOI上。並且每個引物對都與不同的位點結合。在試劑盒中，所說的多個是至少3個，且最好至少5個。
如上所述，本發明提供了測定核酸分子序列的組合物及方法。簡單地說，這樣的方法總地包括以下步驟(a)產生標記的核酸片段，其互補於從核酸分子之第一末端到第二末端的選擇的核酸分子(如標記的片段)，其中標記是與特定的或選擇的核苷酸相互關聯的，並可用許多檢測方法的任一種檢測，(b)按序列長度分離標記的片段，(c)從標記的片段上裂解標記，以及(d)檢測標記，並從而確定核酸分子的序列。下面更詳地討論各個方面。B．診斷方法1．引言如上文指出的，本發明還提供各種可利用上述標記和/或接頭以代替傳統標記(如放射活性或酶標記)的方法，藉以在給定的方法中提高特異性、靈敏度、或可同時分析的樣品數目。可提高上述性質的有代表性的方法包括RNA擴增(參見Lizardi等，生物技術(Bio/Technology)6:1197-1202,1988；Kramer等，自然(Nature)339:401-402,1989；Lomeli等，臨床化學(Clinical Chem.)35(9):1826-1831,1989；美國專利No.4,786,600)，及利用LCR或聚合酶鏈反應(「PCR」)的DNA擴增(參見美國專利No.4,683,195、4,683,202和4,800,159)。
在本發明的一個方面，提供了鑑定核酸分子或片段(或檢測選擇的核酸分子或片段的存在)的方法，其包括以下步驟(a)從一個或多個選擇的核酸分子產生標記的核酸分子，其中標記是與特定的核酸片段相互關聯的；並且是可用非螢光光譜法或電位測定法檢測的；(b)按大小分離標記的片段；(c)從標記的片段上裂解標記；以及(d)用非螢光光譜法和電位測定法檢測標記，從而鑑定核酸分子。
在本發明的相關方面，提供了檢測選擇的核酸分子的方法，其包括以下步驟(a)在足以使標記的核酸探針與互補的所選靶核酸序列雜交的條件下使標記的核酸探針與靶核酸分子結合足夠長時間，其中標記的核酸探針是可用非螢光光譜法或電位測定法檢測的；(b)改變雜交的標記探針、未雜交的探針或靶分子、或探針靶雜交體的大小；(c)按大小分離標記的探針；(d)從標記的探針上切掉標記；以及(e)用非螢光光譜法和電位測定法檢測標記，從而確定選擇的核酸分子。下面更詳細地討論這些和其他相關技術。
2．PCR
PCR可在數小時內數億次地擴增任何來源(病毒、細菌、植物或人)的所需DNA序列。因為PCR反應是高度特異的、易於實現自動化，並且能夠擴增極小量的樣品，所以是特別有價值的。為此，PCR已對臨床醫學、遺傳性疾病的診斷、法醫科學及進化生物學產生了巨大影響。
簡單地說，PCR是一種基於專門化聚合酶的方法，該酶可在含有4種DNA鹼基和靶序列側翼的2個DNA片段(引物，各大約20鹼基長)的混合物中合成給定的DNA鏈的互補鏈。加熱混合物以分離合有靶序列之雙DNA各鏈，然後冷卻以使(1)引物找到並結合到分離的鏈上的其互補序列，並且(2)聚合酶將引物延伸成新的互補鏈。重複加熱和冷卻循環以成指數倍增靶DNA，因為每次新的雙鏈分離就變成兩個進一步合成新鏈的模板。在1小時中，20次PCR循環可將靶序列擴增一百萬倍。
在本發明一個實施方案中，提供了利用PCR技術鑑定例如生物學樣品中的核酸分子，或檢測選擇的核酸分子的方法。簡單地說，這些方法包括在PCR期間產生一系列標記的核酸片段，並按大小分離所得片段的步驟。可利用本文描述的任何技術完成大小分離步驟，其中包括凝膠電泳(如聚丙烯醯胺凝膠電泳)或更好是HPLC。然後從分離的片段上裂解掉標記，並用各種檢測技術檢測之。本文已描述了這類技術的例子，其中包括質譜、紅外光譜、恆電勢電流測定或紫外光譜等。3．RNA指紋法和差別顯示法當模板是RNA時，指紋法中的第一個步驟是逆轉錄。Liang和Pardee(科學(Science)257:967,1992)首先描述了一種RNA指紋方法，其中使用基於Oligo(dT)但在5′末端有兩個鹼基「錨」的逆轉錄引物(如Oligo5′-(dT11)CA-3′)。引導主要發生在poly(A)尾的5′末端，並且主要在截至到5′-UpG-poly(rA)-3′的序列中，選擇性地接近1/12的聚脈苷酸化RNA。逆轉錄並變性之後，在所得第一條cDNA鏈上進行隨意引導。現在可使用PCR產生產物的指紋結構，其最好地匹配引物並且衍生於mRNA和聚腺苷酸化異源RNA的3′末端。該方案已被稱為「差異展示」(differential display)。
或者，也可在反轉錄的第一個步驟中使用隨機引物，選擇那些在與引物的3′末端有6-8鹼基匹配的RNA內部區域。在此之後用相同或不同的任意引物隨機引導所得到的第一條cDNA鏈，並進行PCR。這種特殊方案適用於RNA中任何位置，包括開放讀框(Welsh等，核酸研究(Nuc.Acids.Res.)20:4965,1992)。另外，其可使用在未聚腺苷酸化的RNA上，例如許多細菌RNA上。這種由任意引物PCR得到的RNA指紋法的變化形式稱為RAP-PCR。
如果對已經受了不同的實驗處理或有不同發育歷史的細胞、組織或其他生物材料的樣品進行RNA的任意引物PCR指紋分析，可檢測樣品間基因表達的差異。對於每個反應，假設發生同樣數目的有效PCR倍增事件，並且cDNA產物初始濃度的差異都作為最終指紋強度的比率而保留。在凝膠上的單一泳道內的帶強度之間沒有有意義的聯繫，強度是匹配和長度的函數。但每種上樣的RNA保持各泳道間的比例，從而得以檢測差異表達的RNA。即使在循環的次數足以使PCR反應達到飽和時，仍保持樣品間起始材料的比例。這是因為達到飽和所需的倍增數幾乎完全受構成大部分指紋的恆定產物的控制。在這方面，PCR指紋法不同於單一產物的常規PCR，在常規方法中，除非在擴增的指數期取產物樣品，否則不能保持樣品間的起始材料比例。
在本發明的一個實施方案中，提供了利用RNA指紋技術檢定例如生物樣品中的核酸分子，或檢測選擇的核酸分子的方法。簡單地說，這些方法一般包括產生一系列標記的核酸片段的步驟。經PCR或相似的擴增程序產生片段，然後按大小分離之。大小分離步驟例如可以是本文所描述的任何技術，例如包括凝膠電泳(如聚丙烯醯胺凝膠電泳)或優選的HPLC。然後從分離的片段上裂解掉標記，並用相應的檢測技術檢測標記。適用技術的代表性例子包括質譜、紅外光譜、恆電勢電流測定法或紫外光譜法。任何給定的核酸片段的相對量並不重要，但當參照對照樣品時帶的大小是可提供信息的。
4．基於螢光的PCR單鏈構象多態性(PCR-SSCP)除RFLP方法外，還有幾種方法可用於分析鹼基替代多態性。Orita等人已設計了一種基於變性DNA中構象差異分析這些多態性的方法。簡單地說，使用限制性酶消化或PCR產生相對小的DNA片段，然後變性並在非變性聚丙烯醯胺凝上電泳分辨之。鹼基替代導致的單鏈DNA片段中構象差異是根據電泳遷移率檢測的。鏈內鹼基配對產生高度序列特異性的並且電泳遷移率不同的單鏈構象。然而，在使用常規SSCP進行的不同研究中檢測率範圍從35％到近100％，同時最高檢測率常常需要幾種不同的條件。原則上，也可用該方法分析基於短的插入式缺失的多態性。該方法是鑑定DNA中點突變和缺失的最強有力的工具之一(SSCP-PCR,Dean等，細胞(Cell)61:863,1990)。
在本發明的一個實施方案中，提供利用PCR-SSP的技術檢測例如生物學樣品中選擇的核酸分子或鑑定核酸分子的方法。簡單地說，這些方法一般包括產生一系列標記的核酸片段的步驟。然後按大小分離經PCR產生的片段。大小分離步驟最好是非變性的，並且在分離方法處理之前變性處理核酸片段。例用可用凝膠電泳法(如聚丙烯凝膠電泳)或HPLC法完成大小分離步驟。然後從分離的片段上裂解掉標記並用相應的檢測技術(如質譜法、紅外光譜法、恆電勢電位測定法或紫外光譜法)檢測標記。
5．雙脫氧指紋法(ddF)已描述過另一種方法(ddF,Sarkar等，基因組(Genomics)13:441,1992)，當以回顧或前展方式試驗時，用於檢測人IX因子基因中的100％單個鹼基改變。當分析患B型肝炎病人的基因組DNA時，檢測到全部84個不同的序列改變。
簡單地說，當將標記用於基因型鑑定或其他目的時，可以使用的另一種方法是雙脫氧指紋化。該方法利用Sanger測序反應中的二脫氧終止子。該方法的原理如下將待測序的靶核酸放在具有雙脫氧終止子的反應中，該終止子互補於靶核酸中已知發生了突變的鹼基。例如，如果突變導致A→G的改變，反應應在C雙脫氧終止子反應中完成。使用PCR引物定位和擴增感興趣的靶序列。如果推測的靶序列含有A→G改變，則由於在擴增的序列中摻入雙脫氧終止子而改變序列群體的大小。在標記的這一特定應用中，將產生一個在突變情況下具有可推測大小的片段。可將標記連接到PCR引物的5′末端上並提供標示樣品類型和雙脫氧終止子類型的「圖譜」。發生PCR擴增反應，例如可用HPLC或PAGE方法按大小分離所得到的片段。在分離步驟結束時，將DNA片段收集在一個時序參考框中，裂解標記，由於摻入給定的雙脫氧終止子而產生早熟鏈，故可根據鏈長度來確定有無突變。
應特別提到的是，ddf導致雙脫氧終止區段的獲得或丟失，和/或獲得或一個終子區段或產物的遷移率變動。因此，在該方法中是在高本底的其他分子量片段中搜索一個片段遷移率的變動。一個優點是預知與設定的突變相聯繫的片段長度。
在本發明的一個實施方案中，提供利用PCR-SSP技術鑑定例如生物學樣品中核酸分子或檢測選擇的核酸分子的方法。簡單地說，這些方法一般包括產生一系列標記的核酸片段的步驟。然後按大小分離片段。大小分離步驟最好是非變性的，並且在分離方法處理之前變性處理核酸片段。例用可用凝膠電泳法(如聚丙烯凝膠電泳)或優選的HPLC法完成大小分離步驟。然後從分離的片段上裂解掉標記並用相應的檢測技術(如質譜法、紅外光譜法、恆電勢電位測定法或紫外光譜法)檢測標記。
6．限制性圖譜和RFLP限制性核酸內切酶識別短的DNA序列和在那些特異性位點切割DNA片段。某些限制性酶(rare-cutter)的切割位點很稀少，從而產生小數目的很大片段(幾千至百萬bp)。大多數酶很頻繁地切割DNA，從而產生大量小的片段(小於一百至大於一千bp)。有4鹼基識別位點的限制性酶將產生平均256鹼基長的片段，6鹼基識別位點將產生4000鹼基長的片段，8鹼基識別位點將產生64,000鹼基長的片段。因為已鑑定了數百種不同的限制性酶，故可將DNA切割成許多不同的小片段。
已建立了許多分析DNA多態性的技術。最廣泛使用的方法有限制性片段長度多態性(RFLP)方法、聯合限制性酶消化、凝膠電泳、膜轉印跡和與克隆DNA探針雜交等。根據印跡上標記片段長度的變化檢測多態性。可使用PFLP方法來分析當序列改變落入限制性酶切點內時鹼基替代，或者通過選擇在重複單元以外切割的限制酶分析小衛星/VNTR。瓊脂糖凝膠通常不能提供區分相差單一重複單元的小衛星/VNTR等位基因所需的分率率，但許多小衛星/VNTR是可變的，故仍可得到有高度信息價值的標誌。
本發明的一個實施方案中，提供利用限制性圖譜技術或RFLP鑑定例如生物學樣品中的核酸分子，或檢測選擇的核酸分子的方法。簡單地說，這些方法一般包括產生一系列標記的核酸片段的步驟，其中所產生的片段用限制性酶消化。通過進行標記探針與經過消化的靶核酸的雜交步驟產生標記片段。雜交步驟可在限制性核酸酶消化之前或之後進行。然後按大小分離所得到的消化的核酸片段。例用可用凝膠電泳法(如聚丙烯凝膠電泳)或優選的HPLC法完成大小分離步驟。然後從分離的片段上裂解掉標記並用相應的檢測技術(如質譜法、紅外光譜法、恆電勢電位測定法或紫外光譜法)檢測標記。
7．DNA指紋法DNA指紋法包括展示來自特定DNA樣品中的一組DNA片段。目前已有多種DNA指紋技術(Jeffries等，自然314:67,1985；Welsh和McClelland，核酸研究19:861,1991)，其中大多數是使用RCR產生片段。選用何種指紋技術要決決於應用目的，例如DNA分型、DNA標記作圖及研究例如原核生物、植物、動物、人等生物體。在過去的幾年裡已發展了許多適合這些需要的指紋方法，包括隨機擴增的多態性DNA(RAPD)、DNA擴增指紋(DAF)和任意引物PCR(AP-PCR)。這些方法都是基於用任意選擇的PCR引物擴增隨機基因組DNA片段。可在沒有序列知識的情況下產生任何DNA的DNA片段圖形。所產生的圖形取決於PCR引物的序列和模板DNA的性質。在低退火溫度下完成PCR，以使引物退火到DNA的多個基因座上。當引物結合位點是在允許擴增的距離範圍內時產生DNA片段。原則上，單個引物即足以產生帶型圖。
已描述了一種稱為AFLP的DNA指紋新技術(Vos等，核酸研究23:4407,1995)。AFLP技術是基於用PCR擴增法檢測基因組限制性片段，並可用於檢測任何來源的或複合來源的DNA。簡單地說，使用有限的通用引物對在沒有先前的序列知識的情況下產生指紋。可經選擇特定的引物組來「協調」在單一反應中檢測的片段數目。AFLP技術是堅定可靠的，因為其中引物退火使用了嚴格的反應條件PFLP技術的可靠性是與PCR技術的效率相結合的。
在本發明的一個實施方案中，提供了利用DNA指紋技術鑑定例如生物學樣品中的核酸分子，或檢測選擇的核酸分子的方法。簡單地說，這些方法一般包括產生一系列標記的核酸片段，然後按大小分離片段的步驟。例用可用凝膠電泳法(如聚丙烯凝膠電泳)或HPLC法完成大小分離步驟。然後從分離的片段上裂解掉標記，並用相應的檢測技術(如質譜法、紅外光譜法、恆電勢電位測定法或紫外光譜法)檢測標記。
8．可裂解的標記應用於基因型鑑定和多態性檢測a．引言雖然有少數已知的人DNA多態性是基於非重複序列的插入、缺失或其他重排，但絕大多數還是基於單個鹼基取代或串聯重複序列數目的改變。鹼基取代在人基因組中是很常見的，平均每200-500bp出現一次。串聯重複序列的長度變化在基因組中也是常見的，數千個鹼基中至少有數十個散在的多態位點(稱為基因座)。串聯重複多態性的重複區長度範圍為(dA)n(dT)n序列中的1bp至α-衛星DNA中的至少170bp。串聯重複多態性可分為兩大類，其由小衛星/可變數目的串聯重複(VNTR)(典型的重複長度為數十個鹼基對並有數十至數千總重複單位)及微衛星(重複長度最多6bp且最大總長度約為70bp)組成。迄今所鑑定的大多數微衛星多態性是基於(dC-dA)n或(dG-dT)n二核苷酸重複序列的。微衛星多態性的分析包括以聚合酶鏈反應(PCR)擴增含有重複段的小DNA片段，然後在變性聚丙烯醯胺凝膠上電泳分離擴增的DNA。PCR引物互補於側接於重複段的獨特序列。按傳統使用聚丙烯醯胺凝膠，而不是瓊脂糖凝膠分離微衛星，因為等位基因間的大小常常只差一個重複段。
因此，在本發明的一個方面提供了對選擇的生物體進行基因型鑑定的方法，其包括以下步驟(1)從選擇的靶分子產生標記的核酸分子，其中標記是與特定的片段相互關聯的，並且是可用非螢光光譜法或電位測定法檢測的，(b)按序列長度分離標記的分子，(c)從標記的分子上裂解標記，以及(d)用非螢光光譜法或電位測定法檢測標記，從而確定生物體的基因型。
在另一個方面，提供了對選擇的生物體進行基因型鑑定的方法，其包括以下步驟(a)在足以使標記分子與靶分子雜交的條件和時間下使標記的核酸分子與選擇的靶分子結合，其中標記是與特定的片段相互關聯並且可用非螢光光譜法或電位測定法檢測的；(b)按序列的長度分離標記的片段；(c)從標記的片段上裂解標記；以及(d)用非螢光光譜法或電位測定法檢測標記，從而確定生物體的基因型。
b．可裂解標記應用於基因型鑑定PCR方法鑑定限制性片段長度多態性(PFLP)結合了凝膠電泳和檢測與特定PCR引物相關的標記。一般說來，一個PCR引物將具有一個特異的標記。因此標記將代表一組PCR引物並進而代表預定的DNA片段長度。根據凝膠中或凝膠洗脫物中標記的片段長度的變化測定多態性。聚丙烯醯胺凝膠電泳通常將提供區分相差單個重複單位的小衛星/VNTR等位基因所需的解析度。分析微衛星多態性涉及聚合酶鏈反應(PCR)擴增含有重複片段的DNA小片段，然後在變性聚丙烯醯胺凝膠上電泳分離擴增的DNA，或然後以HPLC法分離DNA片段。擴增的DNA將用在引物5′末端有可裂解標記的引物標記。經鏈延伸後引物被摻入到新合成的鏈中。PCR引物互補於側接於重複段片段的獨特序列。也可以如上述微衛星一樣多地擴增小衛星/VNTR多態性。
對許多類型DNA序列多態性的描述已提供了了解人類基因組結構的根本性基礎(Botstein等,Am.J.Human Genetics 32:p314,1980；Donis-Keller，細胞51:319,1987；Weissenbach等，自然359:794)。使用這些DNA多態性促進了廣泛構架連鎖圖的構建，並已為由連鎖定位疾病基因提供了實際可行為手段。微衛星二核苷酸標記正顯示為鑑定已證明含有突變並在某些情況下引起疾病的人類基因的有力工具。基因組二核苷酸重複是高多態性的(Weber,1990,基因組分析,Vol.1,pp.159-181,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Weber和Wong,1993,Hum.Mol.Genetics,2,p1123)並可具有多達24個等位基因。可使用與二核苷酸重複段周圍的獨特區域互補的引物以PCR法擴增微衛星二核苷酸重複。擴增後，合併幾個擴增的基因座(多重化)，然後按大小分離。將擴增的微衛星片段應用於大小分離步驟，然後鑑定大小並進而鑑定等位基因的方法即所謂的基因型鑑定。已報導了將允許高度多重複合的染色體特異性標記用於全基因掃描以進行連鎖分析(Davies等，1994,自然371,p130)。
可在與微衛星有關的基因型鑑定中使用標記來發揮作用。簡單地說，構建攜帶標記的PCR引物並用於小心選擇的PCR反應，以擴增二、三或四核苷酸重複序列。然後用HPLC或PAGE等方法按大小分離擴增產物。以時序方式收集DNA片段，從各個DNA片段上裂解掉標記並根據與大小分離步驟中的內部標準品的比較來推測長度。參考擴增產物的大小進行等位基因鑑定。
藉助可裂解標記進行基因型鑑定，有可能將多個樣品合併到單一分離步驟上。實現這一目的有兩種通用方法。用於高通過量篩選的第一種通用方法是檢測一大群個體中的單一多態性。在該方法中使用單一或重疊組的PCR引物，並且每個擴增反應用一種類型的DNA樣品進行。可在分步驟中合併的樣品數目與每種檢測技術可產生的可裂解標記的數目(即用於質譜儀的400-600個標記)成正比。因此可同時鑑定一大群個體中的1個至幾個多態性。第二種方法是使用可對單一DNA樣品鑑定許多多態性(例如鑑定個體的基因型)的多組PCR引物。在該方法中，將PCR引物合併在產生不同長度的PCR產物的單一擴增反應中。每個引物對或重疊的引物組均由一特異的可裂解標記編碼，這就意味著每個PCR片段將由一特異性標記編碼。基於單一分離步驟進行反應(見下文)。可在分步驟中合併的樣品數目與每種檢測技術可產生的可裂解標記的數目(即用於質譜儀的400-600個標記)成正比。
c．突變的酶檢測法和標記的應用在該特定應用或方法中，經酶促裂解給定核酸雙鏈中錯配的鹼基對來檢測異源雙鏈中的錯配。使用一組特異性引物以PCR方法擴增待檢查是否存在突變的DNA序列，變性處理擴增的產物，與變性的參考片段混合併雜交，從而導致異源雙鏈的形成。然後用如果存在錯配時可識別並裂解雙鏈的酶處理異源雙鏈。這樣的酶可以是核酸酶S1、綠豆核酸酶、「解離酶」、T4核酸內切酶Ⅳ等。基本上可使用任何一種在體外識別錯配並裂解所產生之錯配的酶。用適當的酶處理，例如用HPLC或PAGE方法按大小分離DNA雙鏈。按時序收集DNA片段。裂解並檢測標記。根據片段的遷移率相對於野生型參考片段所出現的偏移檢測突變的存在。
d．標記應用於寡核苷酸連接檢測法(OLA)最初由Landegren等人(Landergren等，科學241:487,1988)描述的寡核苷酸連接檢測法是一種鑑定(已知)很大而複雜的基因組中的序列的有用技術。OLA反應的原理是基於當兩個診斷寡核苷酸在特定的DNA靶上彼此相鄰而雜交時，連接酶共價連接它們的能力。如果在探針接合處的序列不是完美鹼基配對時，探針將不被連接酶連接。當位於「上遊」探針的3′端時，熱穩定性連接酶區分潛在的單個鹼基配對差異的能力為分辨單個鹼基配對提供了機會(Barony,PNAS USA 88:189,1991)。在標記的應用中，標記應附著於被連接到擴增產物上的探針上。完成OLA後，基於大小分離各片段，裂解標記並以質譜法檢測之。
e．序列特異性擴增可使用有互補於突變體或正常寡核苷酸序列之3′末端的PCR引物選擇性地擴增一個或其他等位基因(Newton等，核酸研究，17,p2503；1989，基因組，5,p535；Okayama等，1989,J.Lab.Clin.Med.,114,p105；Sommer等,1989,Mayo Clin.Proc.,64,1361；Wu等,PNAS USA,86,p2757)。在經PAGE擴增後通常可顯現出PCR產物，但序列特異性擴增的原則可被應用於固相程式。
f．標記在某些基於擴增的檢測法方面的潛在應用病毒的基因型鑑定標記的一個潛在應用是通過與標記的探針雜交對病毒進行基因型鑑定或病毒鑑定。例如，F+RNA大腸桿菌噬菌體可能是腸內病毒汙染之指示劑的有用候選物。以核酸雜交方法進行基因型鑑定是可代替血清分型的可靠、快速、簡便而又便宜的方法(Kafatos等，核酸研究7:1541,1979)。擴增技術和核酸雜交技術已被成功地就用於分類各種微生物，其中包括大腸桿菌(Feng，分子細胞探針(Mol.Cell Probes)7:151,1993)、輪狀病毒(Sethabutr等，J.Med.Virol.37:192,1992)、C型肝炎病毒(Stuyver等，J.Gen.Virol.74:1093,1993)和單純皰疹病毒(Matsumoto等，J.Virol.Methods 40:119,1992)。
腫瘤中突變分析的預後應用已描述了各種實驗性哺乳動物和人惡性病變中的基因改變，並代表了在腫瘤發生中所觀察到的先後發生的形態學改變的形態學基礎(Vogelstein等，NEJM 319:525,1988)。近年來，隨著分子生物學技術的進展，已對某些染色體上的等位基因丟失或腫瘤抑制基因的突變以及幾種癌基因(例如c-myc、c-jun和ras家族)作了大量研究。先前的工作(Finkelstein等，Arch.Surg.128:526,1993)已鑑定了K-ras癌基因中特定類型的點突變與結腸癌診斷的階段之間的相互關係。結果提示突變分析可提供有關腫瘤侵佔性的重要信息，包括轉移的模式和擴散。最近已證明了對三期結腸癌所作TP53和K-ras-2突變分析的預後價值(Pricolo等，Am.J.Surg.171:41,1996)。因此可以明顯看出，對腫瘤和癌前細胞的基因型鑑定，以及特異性突變檢測在人類腫瘤的治療中將變得越來越重要。C．DNA片段的分離需要分析的樣品常常是在複雜基質中的許多成分的混合物。對於含有未知成分的樣品，必須將各成分彼此分離開，從而可用其他分析方法鑑定每種個別成份。在恆定條件下混合物中各成份的分離性質是恆定的，一旦檢定後即可利用這些分離性質去鑑定和定量每種成份。這樣的方法在層析和電泳分析性分離中是很典型的。
1．高效液相層析(HPLC)高效液相層析(HPLC)是分離溶解於溶液中之化合物的層析分離技術。HPLC裝置由流動相儲存器、泵、注樣器、分離柱和檢測器組成。向柱內注射等分的樣品混合物以分離化合物。混合物中不同成份由於它們在流動液相和固定相之間的分配行為不同，而以不同的速率通過柱。
最近，已顯示在帶有化學結合的烷基鏈的非多孔PS/DVB顆粒上進行IP-RO-HLPC在分析雙和單鏈核酸中可替代毛細管電泳，提供迅速分離和相似程度的解析度(Huber等，1993,Anal.Biochem.,212,p351；Huber等，1993，核酸研究，21,p1061；Huber等,1993,生物技術(Biotechniques),16,p898)。與離子交換層析相反，其並不總是以鏈長度的函數保留雙鏈DNA(因為AT鹼基對與帶正電荷的固定相相互作用比GC鹼基對更強)，IP-RP-HPLC能夠嚴格地依據大小進行分離。
已發展了使用乙酸三乙銨作為離子配對試劑的方法，可藉助高效液相層析法在烷基化非多孔2.3μM聚(苯乙烯-二乙烯基苯)顆粒上成功地分離磷酸二酯寡核苷酸(Oefner等,1994,And.Biochem,223,p39)。所描述的技術允許分離大小範圍為50到200核苷酸的長度上只差4至8個鹼基對的PCR產物。
2．電泳電泳是基於離子(或如本文所述的DNA)在電場中遷移率的分離技術。帶負電荷的DNA遷移向正電極，而帶正電荷的離子則向負電極泳動。為安全起見，一個電極通常是接地的，另一個則正或負向偏置的。帶電的離子或DNA依賴它們的總電荷、大小和形狀不同而有不同的遷移率，並因此可被分離開。電極裝置由高電壓能源、電極、緩衝液和緩衝液的載體如聚丙烯醯胺凝膠，或毛細管組成。開口毛細管用於許多類型的樣品，其他凝膠載體則通常用於蛋白質混合物或DNA片段等生物學樣品。
3．毛細管電泳(CE)毛細管電泳(CE)正在以其各種表現形式(游離溶液、等速電泳、等電聚焦、聚丙烯醯胺凝膠、膠束電動「層析」)發展為一種以高解析度迅速分離很小樣品體積的複雜混合物的方法。與MS的固有靈敏度和選擇性結合，CE-MS是生物分析的潛在高效率技術。在本文公開的新的應用中，將這兩種方法相對接將產生其速率超過目前的測序方法幾個數量級的優越DNA測序方法。
CE和電噴射離子化(ESI)流速之間的一致性，以及兩者都因(而且主要是用於)溶液中的離子種類而得以簡化這一事實提供了極具吸引力的組合基礎。已描述了毛細管在區帶電泳(CZE)和毛細管等速電泳與建立在ESI基礎上的四極質譜儀的組合(Olivares等，Anal.Chem.59:1230,1987；Smith等，Anal.Chem.60:436,1988；Loo等，Anal.Chem.179:404,1989；Edmonds等，J.Chroma.474:21,1989；Loo等，J.MicrocolumnSep.1:223,1989；Lee等，J.Chromatog.458:313,1988；Smith等，J.Chromatog.480:211,1989；Grese等，J.Am.Chem.Soc.111:2835,1989)。小肽很容易以高敏感性(飛摩爾)經受CZE分析。
DNA片段的最有力的分離方法是聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)，通常是板凝膠格式。但當前技術的主要限制是完成對測序反應中產生的DNA片段的凝膠電泳需要相當長的時間。使用毛細管電泳(其利用超薄凝膠)可實現數量級增加。在游離溶液中，當加入鹼時所有DNA均以同樣遷移率遷移到第一點的值，從而導致質量和電荷的補償。在聚丙烯醯胺凝膠中，DNA片段作為長度的函數篩分並遷移，並且該方法現已被應用於CE。用交聯聚丙烯醯胺現已達到每米有很大的塔板數(每米107塔板，Cohen等,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 85:9660,1988)。如所描述的這樣CE柱也應用於DNA測序。在標準測序儀中，CE的方法原理上比板凝膠電泳快25倍。例如，每小時可讀出300個鹼基。板凝膠電泳中分離速度受到可在不產生過多熱產生情況下施加給凝膠的電場大小限制。因此，所達到的CE速度越大使用的電場強度越高(CE中的300V/cm對板凝膠電泳中的10V/cm)。毛細管方法降低了電流量並因而降低了電能和熱量生成。
Smith等人(Smith等，核酸研究18:4417,1990)已提出平行使用多個毛細管以增加通過量。同樣Mathies和Huang(Mathies和Huang，自然359:167,1992)已引入了在平行陣列的毛細管上完成分離並證明有高測序通過量的毛細管電泳(Huang等，Anal.Chem.64:967,1992；Huang等，Anal.Chem.64:2149,1992)。毛細管電泳的主要缺點是可裝在毛細管上的樣品數量有限。在毛細管電泳開始時，分離前濃縮大量樣品可增加負載能力，而檢測水可降低幾個數量級。在CE中最通用的預濃縮方法是樣品堆積。最近已詳述了樣品堆積(Chien和Burgi,Anal.Chem.64:489A,1992)。樣品堆積依賴於樣品緩衝液和毛細管緩衝液之間的基質差異(pH，離子強度)，這樣通過樣品帶的電場就比毛細管區域中的電場大。在樣品堆積中，導入在低濃度緩衝液中的大體積樣品在毛細管柱的頂部預濃縮。毛細管內充入同樣成分但有較高濃度的緩衝液。當樣品離子達到毛細管緩衝液和較低的電場時，它們就堆積到濃縮帶中。樣品堆積增加可檢測性1-3個數量級。
預濃縮的另一種方法是在對分析物進行游離區帶CE分離之前應用等速電泳(ITP)。ITP是允許在毛細管上裝入微升體積樣品的電泳技術。該技術依賴於在分別比分析物有較高和較低遷移率的兩種緩衝液(前導和收尾電解質)之間插入樣品。該技術本來就是一種濃縮技術，其中分析物濃縮在以同樣速度遷移的區帶中。該技術目前不象上述的堆積方法那麼通用，這是因為它需幾次選擇前導和收尾電解質，並且在分離進行期間只能分離陽離子或陰離子分析物。
DNA測序方法的要點是顯著地選擇性電泳分離DNA或寡核苷酸片段。該方法有顯著的選擇性是因為每個片段都只根據核苷酸的差異被分辨出來。已實現分離多達1000個片段(1000bp)。用可裂解的標記進行測序的其他優點如下所述。當在利用可裂解的標記以聚丙烯醯胺凝膠電泳法分離DNA片段時，不需要使用板凝膠格式。因為合併大量的樣品(4到2000個)，所以不必象使用現有的染料-引物或染料-終止方法(即AB1373測序儀)那樣平行地分離樣品。因為沒有理由進行平行電泳，也就沒有理由使用板凝膠。因此，可在電泳分離方法中利用管凝膠格式。Grossman(Grrossman等,Genet.Anal.Tech.Appl.9:9,1992)已證明，當使用管凝膠格式代替板凝膠格式時可得到相當大的優點。這是由於與板凝膠相比，在管格式中散失Joule熱的能力更大。從而導致電泳速度更快(快50％)，而對高分子量DNA片段(大於1000nt)有更高的解析度。在基因組測序中讀出長序列是很關鍵的。因此，在測序中使用可裂解標記，還具有允許使用者利用最有效和敏感並具有最高解析度的DNA分離方法的優點。
4．微裝配式裝置毛細管電泳(CE)是DNA測序、法醫分析、PCR產物分析及限制性片段大小分離的高效率方法。因為毛細管凝膠可施加高得多的勢場，所以CE遠比傳統的板PAGE快得多。但CE具有每個凝膠只能處理一個樣品的缺點。本方法結合了CE的更快的分離速度和平行分離多份樣品的能力。使用微裝置式裝置的基本原理是通過使泳道大小微型化至約100微米，從而能增加電泳中的信息密度。電子工業常規使用微裝配技術製造有小於1微米特徵的電路板。目前毛細管排列的密度限於毛細管的外徑。通道的微裝配產生高密度的排列。微裝配也允許進行用玻璃纖維不可能實現的物理裝配，並使通道直接連接到電路片的其他裝置上。以前很少在微電路片上構建過用於分離技術的裝置。已在矽晶片上裝配了氣相層析儀(Terry等，IEEE Trans.Electron Device,ED-26:1880,1979)和液相層析儀(Manz等，Sens.Actuators B1:249,1990)，但這些裝置未被廣泛使用。幾個研究小組報導了在微裝配裝置上分離螢光染料和胺基酸(Manz等，J.Chromatography 593:253,1992；Effenhauser等，Anal.Chem,65:2637,1993)。最近Woolley和Mathies(Woolley和Mathies,Proc.Natl.Acad.Sci.91:11348,1994)已證明，可用光刻蝕法和化學刻蝕法在玻璃基質上製造大量的分離通道。通道內充入羥乙基纖維素(HEC)分離基質。已顯示可在短短兩分鐘內分離DNA限制性片段。
D．標記的裂解如上文所討論的，不同的接頭設計可在不同的特異性物理或化學條件下提供可裂解性(「敏感性」)。用於裂解各種接頭設計的條件包括酸、鹼、氧化、還原、氟化物、琉基交換、光解及酶促條件。
可滿足上文列出的接頭的一般性標準的可裂解接頭是本領域技術人員已知的，並包括見於Pierce(Rockord，IL)的商品目錄中的那些接頭。例子包括· 雙(琥珀醯亞氨基琥珀酸)乙二醇酯(EGS)，為可被羥胺裂解(1M,37℃,3-6小時)的胺反應性交聯劑；· 酒石酸二琥珀醯亞氨酯(DST)和磺基-DST，其為可被0.015M過碘酸鈉裂解的胺反應性交聯劑；· 雙[2-(琥珀醯亞氨氧基羰基氧基)乙基]碸(BSOCOES)和磺基
-BSOCOES，其為可被鹼(pH11.6)裂解的胺反應性交聯劑；· 1,4-二-[3′-(2′-吡啶二硫基(丙醯胺基)丁烷(DPDPB)，可經硫羥交換或還原作用裂解的吡啶二硫醇交聯劑；· N-[4-(對疊氮基水楊醯胺基)-丁基]-3′-(2′-吡啶二硫基)丙醯胺(APDP)，為可經硫羥交換或還原裂解的吡啶二硫醇交聯劑；· 雙-[β-4-(疊氮基水楊醯胺基)乙基]-二硫化物，為可經硫羥交換或還原作用裂解的光反應性交聯劑；· N-琥珀醯亞氨基-(4-疊氮苯基)-1,3′-二硫基丙酸酯(SADP)，可經硫羥交換或還原反應裂解的光反應性交聯劑；· 硫代琥珀醯亞氨基-2-(7-疊氮基-4-甲基香豆素-3乙醯胺)乙基-1,3′-二硫丙酸酯(SAED)，可經硫羥交換或還原反應裂解的光反應性交聯劑；· 磺基琥珀醯亞氨基-2-(間疊氮基-鄰硝基苯甲醯氨基)-乙基-1,3′-二硫丙酸酯(SAND)，可經硫羥交換或還原反應裂解的光反應性交聯劑。
可裂解接頭的其他例子和可用於釋放標記的裂解條件如下所述。可被氟化物或在酸性條件下裂解的甲矽烷基連接基團。可被光源裂解(光解)的3-,4-,5-，或6-取代的-2-硝基苄氧基或2-,3-,5-，或6-取代的-4-硝基苄氧基連接基團。可被Ce(NH4)2(NO3)6裂解(氧化)的3-,4-,5-或6-取代的-2-烷氧基苯氧基或2-,3-,5-，或6-取代的-4-烷氧基苯氧基連接基團。可被氫氧化物(鹼)、酸或LiAlH4(還原)裂解的NCO2(尿烷)接頭。可被O3、OsO4/IO4-或KMnO4(氧化)裂解的3-戊烯基、2-丁烯基或1-丁烯基連接基團。可被O2、Br2、MeOH或酸裂解的2-[3-,4-，或5-取代的-呋喃基]氧基連接基團。
裂解其他不穩定連接基團的條件包括可用酸裂解叔烷氧基連接基團；可用H3O+裂解的甲基(二烷基)甲氧基或4-取代的-2-烷基-1,3-二氧戊環-2-基連接基團；可用氟化物或酸裂解的2-甲矽烷基乙氧基連接基團；可在鹼性條件下裂解的2-(X)-乙氧基(其中X=酮、酯、醯胺、氰基、NO2、硫醚、亞碸、碸)連接基團；可用酸或在還原條件下裂解的2-,3-,4-,5-，或6-取代的苄氧基連接基團；可用(Ph3P)3RhCl(H)裂解的2-丁烯氧基連接基團；可用Li、Mg或BuLi裂解的3-,4-,5-或6-取代的-2-溴苯氧基連接基團；可用Hg2+裂解的甲基硫代甲氧基連接基團；可用Zn或Mg裂解的2-(X)-乙氧基(其中X=滷素)連接基團；可經氧化(例如用Pb(OAc)4)裂解的2-羥基乙氧基連接基團。
優選的接頭是被酸或光解作用裂解的接頭。在已為固相肽合成而發展的酸敏感性接頭中，有幾種可用於將標記連接到MOI上。在Lloyd-Williams等人的綜述(四面體49:11065-11133,1993)描述了其中的某些接頭。一類有用的接頭是基於對烷氧基苄基醇，其中兩種接頭4-羥基甲基苯氧基乙酸和4-(4-羥甲基-3-甲氧基苯氧基)丁酸可購自Advanced Chem Tech(Louisville,KY)。這兩個接頭可通過連接到苄醇上的酯鍵連接到標記上，並且通過連到羧酸上的醯胺鍵連接到含胺MOI上。用不同濃度的三氟乙酸從MOI裂解掉由這些分子連接的標記。裂解這些接頭導致標記上的羧酸的釋放。酸裂解通過相關接頭如2,4-二甲氧基-4＇-(羧甲氧基)-二苯甲基胺(可以FMOC保護的形式購自AdvancedChem Tech公司)連接的標記，導致被釋出的標記上的羧醯胺的釋放。
已為固相肽合成而發展的大部分光敏感性接頭也可用於本申請(參見Lloyd-Williams的綜述)。這些接頭通常是基於2-硝基苄酯或2-硝基苄醯胺。最近文獻中報導過的光敏感接頭的兩個例子是4-(4-(1-Fmoc-氨基)乙基)-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)丁酸(Holmes和Jones,J.Org.Chem.60:2318-2319,1995)和3-(Fmoc-氨基)-3-(2-硝基苯基)丙酸(Brown等，Molecular Diversity 1:4-12,1995)。兩接頭均可通過羧酸連接到MOI的胺上。通過在標記上的羧酸和接頭上的胺之間形成醯胺而使標記接到接頭上。通常用350nm波長的紫外光以本領域已知的強度和時間完成對光敏感接頭的裂解。光化學裂解裝置的商品來源是Aura Industries Inc.(Staten Island,NY)和Agrenetics(Wilmington,MA)。裂解接頭導致標記上伯醯胺的釋放。光可裂解的接頭的例子包括硝基苯基甘氨酸酯，內-和外-2-苯並降冰片烷基氯和甲磺酸，以及3-氨基-3(2-硝基苯基)丙酸。酶促裂解的例子包括可裂解酯鍵的酯酶、裂解磷酸二酯鍵的核酸酶、裂解肽鍵的蛋白酶等。E．標記的檢測檢測方法一般依賴於某些類型光譜場中的吸收和發射。當原子或分子吸收光時，進入的能量將量化結構激發到較高能量水平。激發的類型取決於光的波長。電子被紫外或可見光激發到較高軌道，紅外光激發分子振動，並且微波激發旋轉。吸收光譜是作為波長函數的光吸收。原子或分子的光譜依賴於其能量水平結構。吸光光譜可用於鑑定化合物。具體的吸收光譜方法包括原子吸收光譜法(AA)、紅外光譜法(IR)和紫外可見光譜法(UV-Vis)。
被激到高能水平的原子或分子因發出幅射而衰變到較低水平。如果躍遷是在同一自旋狀態間進行該光稱為螢光，如果躍遷發生在不同自旋狀態之間則是磷光。分析物的發射強度與濃度成線性關係(在低濃度下)，並用於定量發光物質。具體的發射光譜方法包括原子發射光譜法(AES)、原子螢光光譜法(AFS)、分子雷射誘導的螢光法(LIF)和X射線螢光法(XRF)。
當電磁幅射通過物質時，大部分幅射以其原來的方向繼續前進，但小部分向其他方向散射。以入射光的同樣波長散射的光稱為雷利散射。在透光固體中由于振動散射的光稱為布裡淵散射。布裡淵散射典型的是從入射光偏移0.1到1個波數。不透明固體中由於分子中振動或光聲子散射的光稱為喇曼散射。喇曼散射光從入射光偏移多達4000個波數。特異性散射光譜方法包括喇曼光譜法。
IR光譜法是檢測被樣品吸光的中紅外光的波長和強度。中紅外光(2.5-50μm,4000-200cm-1)是足以激發分子振動到較高能量水平的光。IR吸收帶的波長是特異類型的化學鍵所特有的，並且IR光譜一般最適於鑑定有機和有機金屬分子。
近紅外吸收光譜(NIR)是檢測被樣品吸收的近紅外光的波長和強度。近紅外光跨越800nm-2.5μm(12,500-4000cm-1)範圍並且是足以激泛音和分子振動組合達到較高能量水平的光。NIR典型地被用於定量檢測有機官能基團，特別是O-H、N-H和C=O。NIR儀的組成和設計相似於UV-VIS吸收光譜儀。光源通常是鎢燈，檢測器通常是PbS固態檢測器。樣品容器可以是玻璃或石英的，並且典型的溶劑是CCl4和CS2。NIR光譜的方便裝置使之適於聯機監測和過程控制。
紫外和可見光吸收光譜是測量由樣品吸收的近紫外和可見光的波長和強度。真空中UV吸收發生在100-100nm(105-50,000cm-1)；石英UV在200-350nm(50,000-28,570cm-1)，可見光在350-800(28,570-12,500cm-1)，並且符合Beer-Lambert-Bouguet定律。紫外和可見光是足以加速外圍電子到較高能量水平的光。UV-Vis光譜通常可應用於溶液中的分子和無機離子或複合物。US-Vis光譜受到光譜寬度特徵的限制。光源通常是氘燈(用於UV檢測)和鎢燈(用於可見光檢測)。用波長分離器如稜鏡或光柵單色儀選擇這些連續光源的波長。經掃描波長分離器得到光譜，並可根據光譜或在單一波長處進行定量檢測。
質譜是利用離子化原子或分子的質量對電荷比例的不同將它們彼此分離開。因此質譜可用於原子或分子的定量，並且還用於確定分子的化學和結構信息。分子具有不同的片段化特徵，從而為鑑定化合物提供結構信息。質譜儀的一般操作如下。造成氣相離子，基於它們的質量對電荷比例在空間或時間上分離離子，並檢測各個質荷比離子的量。質譜儀的離子分離能力是由解析度描述的，其定義為R=m/Am，其中m是離子質量，Δm是質譜中兩個可分辨峰之間的質量差異。例如解析度為1000的質譜儀可分辨開m/z為100.0的離子與m/z為100.1的離子。
一般說來，質譜儀由離子源、質量選擇分析器和離子檢測器組成。磁扇形場、四極和飛行時間設計也需要抽提和加速離子以將離子從來源區域轉移到質量分析器中。下面討論幾種質量分析器設計(磁扇形場質譜、四極質譜或飛行時間質譜)的詳細內容。磁扇形場質譜的單聚焦分析器利用180、90或60度的顆粒束路徑。影響顆粒的各種力分離有不同質量/電荷比例的離子。用雙聚焦分析器，在這種類型的儀器中加入靜電分析器，以分離有不同動能的顆粒。
用於四極質譜的四極質量濾器由平行排列的4個金屬棒組成。施加的電壓影響在4個棒之間中心部分向下飛行之離子的軌跡。對於給定的DC和AC電壓，只有某些質量/電荷比例的離子通過四極濾器，而所有其他的離子則被拋出它們原來的路徑。當改變棒上的電壓時監測通過四級濾器的離子，以得到質譜。
飛行時間質譜利用通過「漂移區」的過渡時間的差異分離不同質量的離子。其以脈衝發射模式運行，所以離子必須在脈衝中產生和/或被提取。發射脈衝的電場將所有離子以qV的動能加速到無場漂移區，其中q是離子電荷，V是施加的電壓。因為離子動能是0.5mV2，所以較輕的離子比較重離子有更高的速度，並較快地到達漂移區末端的檢測器。離子檢測器的輸出作為時間的函數展示在示波器上，以得到質譜。
離子形成過程是質譜分析的起始點。化學電離是一種利用試劑離子與分析物分子(標記)反應以通過質子或氫負離子轉移形成離子的方法。試劑離子是向電子碰撞(EI)離子源內導入過量(相對於標記)甲烷而產生的。電子碰撞產生CH4+和CH3+，它們進一步與甲烷反應形成CH5+和C2H5+。電離標記的另一種方法是通過等離子體和輝光放電。等離子體是有效地激發並電離原子的熱的部分電離的氣體。輝先放電是保持在兩個電極之間的低壓等離子體。電子碰撞電離利用電子束，通常是由鎢絲產生的電子束電離氣相原子或分子。來自電子束的電子撞掉分析物原子或分子的電子以產生離子。電子噴射電離(ESI)利用很細的針和一系列分離器(Skimner)。樣品溶液被噴射到離子源小室中以形成小滴。當排出毛細管時小滴攜帶電荷並且當溶劑蒸發時小滴消失，留下高帶電分析物分子。ESI特別適用於難以蒸發或電離的生物大分子。快速原子轟擊(FAB)利用衝擊固體樣品的中性原子和Xe或Ar的高能束以引起解吸附和電離。其用於難以進入氣相的生物大分子。FAB很少引起片段化並通常給出大的分子離子峰，使之適用於分子量測定。經加速從離子源通過電荷交換室的離子產生原子束。離子在與中性原子碰撞中吸收電子形成高能原子束。雷射電離是一種雷射脈衝剝落樣品表面的材料並產生微等離子體的方法，後者電離某些樣品成分。基質輔助的雷射解吸電離(MACDI)是蒸發和電離大生物分子如蛋白質或DNA片段的LIMS方法。將生物分子分散於固體基質如煙酸上。UV雷射脈衝將攜帶某些大分子的基質以離子化形式剝落到氣相中，以使它們可被提取到質譜儀內。等離子體解吸電離(PD)利用252Cf的衰變，產生兩個以相反方向遷移的碎片。一個碎片衝擊樣品激發出1-10個分析物離子。另一個碎片衝擊檢測器並引發開始採集數據。該電離方法特別適用於大的生物分子。共振電離是其中將一個或多個雷射束調至使氣相原子和分子共振躍遷的頻率，使之以分步方式加速到其離子化電勢以上，以產生離子。次級電離(SIMS)利用離子束例如3He+、16O+或40Ar+聚焦在樣品表面上並使材料濺蝕到氣相中。火花源是一種穿過兩電極發出電流脈衝以電離固體樣品中分析物的方法。
標記在從所連接的分子上裂解之前、期間或之後，可能變成帶電的。基於離子「解吸」的電離方法，從固體或液體表面直接形成或發射離子，得以增加電離方法的應用至非揮發性和熱敏感性化合物。這些方法不要求在電離前中性分子揮發，並且總地大大減少了分子的熱降解。這些方法包括場解吸(Becky，場電離和場解吸質譜的原理，Pergamon,Oxford,1977)、等離子體解吸(Sundqvist和Macfarlane,Mass Spectrom.Rev.)、雷射解吸(Karas和Hillenkange,Anal.Clem.60:2299,1998；Karas等,Angew.Chem.101:805,1989)、快粒子轟擊(如快原子轟擊、FAB和次級離子質譜、SIMS；Barber等,Anal.Chem.54:645A,1982)及熱噴射(TS)電離(Vestal,Mass Spectrom.Rev.2:447,1983)。熱噴射廣泛應用於與液相層析聯機組合。也已顯示連續流動FAB方法(Caprioli等,Anal.Chem.58:2949,1986)有重要的應用潛力。更完全的電離/質譜法組合包括離子捕獲質譜、電噴射電離質譜、離子噴射質譜、液體電離質譜、大氣壓電離質譜、電子電離質譜、亞穩定原子轟擊電離質譜、快原子轟擊電離質譜、MALDI質譜、光化電離飛行時間質譜、雷射小滴質譜、MALDI-TOF質譜、APCI質譜、納米噴射質譜、霧化噴射電離質譜、化學電離質譜、共振電離質譜、次級離子質譜、熱噴射質譜。
這些電離方法適合於非揮發性生物化合物具有交迭實用範圍。電離效率主要取決基質組合物和化合物類型。目前可得到的結果表明，TS分子量上限約為8000道爾頓(Jones和Krolik,質譜快訊，1:67,1987)。因為TS實踐主要是用四極質譜儀，所以在較高質量/電荷比例(m/z)下敏感性一般都不成比例。飛行時間(TOF)質譜儀是可從市場上購得的，並具有m/z範圍只受檢測器效率限制的優點。最近，已引入了另外兩種電離方法。這兩種方法現在稱為基質輔助的雷射解吸(MALDI,Karas和Hilenkamp,Anal.Chem.60:2299,1988；Karas等，Angew.Chem.101:805,1989)和電噴射電離(ESI)。這兩種方法都有很高的電離效率(即很高的[產生的分子離子]/[消耗的分子]比例)。限定技術最終潛力的靈敏度取決於樣品大小、離子的量、流速、檢測效率及實際電離效率。
電噴射質譜是建立在60年代首先提出的理論(Dole等,J.Chem.Phys.49:2240,1968)基礎上的。電噴射電離(ESI)是一種產生用質譜法分析的帶電分子的手段。簡單地說，電噴射電離在強靜電場中由霧化液體產生高帶電小滴。一般在幹浴氣體中於大氣壓下形成高帶電小滴，經中性溶劑蒸發而收縮，直到電荷排斥力克服內聚力，導致「庫侖爆炸」。電離的準確機制尚有爭論並且已有幾個研究小組提出了假設(Blades等，Anal.Chem.63:2109-14,1991；Kebarle等，Anal.Chem.65:A972-86,1993；Fenn,J.Am.Soc.Mass.Spectram.4:524-35,1993)不管離子形成的基本過程如何，ESI總是於溫和條件下從溶液中產生帶電荷分子。
用小量有機分子獲得有用質譜數據的能力有賴於離子的有效產生。ESI的電離效率與分子的正電荷量有關。實驗性改善電離作用通常包括使用酸性條件。改善電離的另一種方法是在可能時使用季胺(參見Aekersold等，蛋白科學(Protein Science)1:494-503,1992；Smith等，Anal.Chem.60:436-41,1988)。
以下進一步詳細描述電噴射電離。電噴射離子的產生需要兩個步驟在接近大氣壓下分散高帶電小滴，然後在誘導蒸發條件下處理。使分析物分子的溶液通過保持在高電勢下的針。在針的尖端，溶液分散到含分析物分子的帶高電荷小滴的氣霧中。小滴迅速地蒸發並通過一個場解吸或殘留蒸發的過程，質子化的蛋白質分子被釋放到氣相中。電噴射一般是通過對來自毛細管的小的液體流(一般為1-10μL/分鐘)施加高電場而產生的。一般在毛細管和位置相距0.2-2cm的反電極之間施加3-6kV的電勢差(其中依據去溶劑化的程度，可通過小孔由MS提取電子、帶電團、甚至帶電小滴樣品)。電場導致電荷在毛細管末端液體表面上積聚；因此液體流速、比電阻和表示張力是小滴形成中的重要因素。高電場導致液體表面的破壞和高帶電液體小滴的形成。根據毛細管偏壓可產生帶正電荷或負電荷小滴。負離子型需要在電子清除劑例如氧的存在以抑制放電。
可將各種液體靜電噴射到真空中，或者可藉助噴霧劑噴射。只使用噴霧電場導致對液體導電率和介電常數的某些實際限制。室溫下以相當於＜10-4M的含水電解質溶液的有用液體流速進行穩定電噴射需要小於10-5歐姆的溶液導電率。發現該模式對ESI-MS是最有用的，適當的液體流速導致液體作為細霧分散。離毛細管的距離非常短，小滴直徑常常相當均勻並且約為1μm。特別重要的是，對於較高液體流速，總電噴射離子電流只稍有增加。有證據表明加熱對於操縱電噴射是有用的。例如，稍微加熱可使含水溶液很容易電噴射，推測是由於降低了粘度和表面張力。熱輔助和氣體霧化輔助電噴射允許使用較高的液體流速，但增加小滴帶電的程度。分子離子的形成需要有影響初始小滴群體蒸發的條件。為此，可在較高壓力下藉助於中度溫度(＜60℃)的幹氣體流，在通過界面運輸期間加熱，並且(特別是在使用離子俘獲法的情況下)經在相對低的壓力下高能碰撞而實現之。
雖然構成ESI之基礎的詳細過程尚不確定，但經ESI產生的很小小滴似乎允許溶液中的幾乎所有各種帶電顆粒在蒸發殘留溶劑後被轉移到氣相中。然後質譜檢測需要離子在去溶劑化後具有可檢測的m/z範圍(四極裝置要求＜4000道爾賴)，並且能以足夠的效率產生和傳輸。已發現很寬範圍的溶劑都適合於ESI-MS，而且電離效率基本上不依賴於分子量，提示其為一種高度無區別的和廣泛適用的電離方法。
電噴射離子「源」在接近大氣壓條件下起作用。電噴射「源」一般是金屬或玻璃毛細管，加上一種相對可反電極電偏離液體溶液的方法。溶液，典型的是含有分析物並常含有其他添加劑如乙酸的水-甲醇混合物，流向毛細管末端。已描述了一種ESI源(Smith等,Anal.Chem.62:885,1990)，其可容納基本上任何溶劑系統。ESL的典型流速為1-10μL/分鐘。對ESI-MS界面的基本要求是儘可能有效地從高壓區向MS加樣並輸送離子。
ESI的效率可以是很高的，從而為本發明有用的極敏感的裝置提供了基礎。對於單一帶電荷的檢測對象來說，目前的裝置性能可提供在檢測器中的總離子電流為2×10-12A或約107計數/秒。在該裝置性能的基礎上，如果分析物完全被電離，濃度低到10-10M或大約10-18mol/秒的單一種帶電粒子將產生可檢測的離子流(大約10個計數/秒)。例如，使用與毛細管區帶電泳的ESI界面，已得到了季銨離子的10-18摩爾檢測下限(Smith等,Anal.Chem.59:1230,1988)。對於分子量為1000的化合物，電荷平均數為1，電荷狀態近似數為1，峰寬度(m/z)為1，並且最大強度強度(離子/秒)是1×1012。
在得到ESI質譜中實際消耗相當少的樣品(Smith等,Anal.Chem.60:1948,1988)。使用扇頁裝置的陣列檢測器(其允許同時檢測光譜的各部分)也可獲得實質性效益。因為目前只檢測由ESI形成的約10-5的所有離子，所以關注限制裝置性能的因素可以為改善靈敏度提供基礎。本領域技術人員可以理解到，本發明包括並容納對電離和檢測方法的改進。
界面最好是放在分離裝置(使用凝膠)和檢測器(例如質譜)之間。界面最好有下列特徵(1)能夠以不連續的時間間隔收集DNA片段，(2)濃縮DNA片段，(3)從電泳緩衝液和介質中除去DNA片段，(4)從DNA片段上切掉標記，(5)將標記與DNA片段分離開，(6)處理DNA片段，(7)將標記放在揮發性溶液中，(8)揮發並電離標記，(9)將標記放置或運送到噴射裝置，由此將標記導入質譜儀。
當DNA片段從凝膠的底部洗脫時，界面也有「收集」DNA片段的能力。凝膠可以包括板凝膠、管狀凝膠、毛細管凝膠等。可用幾種方法收集DNA片段。第一種方法是使用電場，其中DNA片段被收集到電極上或接近電極處。第二種方法是其中使液體流流過凝膠底部以收集DNA片段。可以接合兩種方法的特徵，其中可將DNA收集到流動的液體流中，其後利用電場濃縮。最終結果是從完成分離方法的介質中除去DNA片段。這就是說，可以使用電場將DNA片段從一類溶液「拖拉」到另一類溶液中。
一旦DNA片段處在適當的溶液(與電噴射和質譜相容的)中，標記即可從DNA片段上裂解下來。然後可利用電場將DNA片段與標記分離開(該標記最好帶有與DNA標記相反的電荷)。然後再使用電場或流動液體將標記導入電噴射裝置內。
根據它們的吸收和螢光發射波長及強度最直接地鑑定並定量螢光標記。
雖然常規螢光分光光度計是適應性極強的，其可提供連續範圍的激發和發射波長(lEX、lS1、lS2)，但例如流式細胞計數儀和雷射掃描顯微鏡等更專業化的裝置則需要可在單一的固定波長激發的探針。在現代裝置中，這通常是氬雷射的488nm光譜線。
每個探針分子的螢光強度都與ε和QY的乘積成正比例。在目前實踐中有重要性的螢光團中，這些參數的範圍為ε大約10000至100,000cm-1M-1,QY為0.1至1.0。當高強度光照將吸收驅向飽和時，限制螢光可檢測性的因素是被激發的螢光團的不可逆性破壞(光漂白)。光漂白的實際影響取決於所用的螢光檢測技術。
本領域技術人員可以看出，裝置(界面)可被安排在分離和檢測步驟之間，以便使大小分離和標記檢測(在時間上)連續進行。這樣就將分離方法和裝置與檢測方法和裝置聯合起來，構成單一裝置。例如，將界面置於分離技術操作和以質譜法或電勢電流測定法進行的檢測之間。
界面的功能主要是從分析物中釋放出(如質譜)標記。有幾種有代表性的界面裝置。界面的設計依據於對可裂解接頭的選擇。就可光裂解的接頭來說，需要能量或光源。對於熱不穩性接頭、鹼敏感性接頭或二硫化物接頭，需在界面內加入試劑。對於熱敏感性接頭，需要能量或熱源。對於酶敏感性接頭(例如特異性蛋白酶)和肽接頭、核酸酶及DNA或RNA接頭、糖基化酶、HRP或磷酸酶及裂解後不穩定的接頭(例如相似於化學發光底物)則需要加入酶。界面的其他特徵包括最小帶加寬，在注入質譜儀內之前將DNA與標記分離開。分離技術包括基於電泳方法的技術和親和技術、按大小保留(透析)技術、過濾等。
也有可能以俘獲電泳法濃縮標記(或核酸-接頭-標記構建體)，然後釋放到與所選用的特定類型的電離方法相匹配的替代試劑流中。界面也能夠將標記(或核酸-接頭-標記構建體)俘獲到微球上，將微球射入小室內之後進行雷射解吸/蒸發。也可能提取到替代緩衝液中(例如從毛細管電泳緩衝液穿過可通透膜進入疏水緩衝液中)。在某些應用中也可能期望將標記間歇性地傳送到質譜儀中，這可能包括界面另外的功能。界面的另一個功能是將標記從多個柱送入對每個柱都有一旋轉時間狹縫的質譜儀中。另外，有可能將標記從單個柱傳送到按時間分開的多個質譜檢測儀中，在數毫秒時間裡收集每組標記，然後送入質譜儀。
下面列出的是可用於本發明的分離和檢測技術設備的代表性銷售商。Hoefer Scientific Instruments(San Francisco,CA)生產用於測序的電泳裝置(Two StepTM,Poker FaceTMⅡ)。Pharmacia Biotech(Piscataway,NJ)生產用於DNA分離和測序的電泳裝置(PhastSystem用於PCR-SSCP分析，MacroPhor System用於DNA測序)。Rerkin Elmer/Applied Biosystems Division(ABI,FosterCity,CA)生產基於螢光素染料的半自動測序儀(ABI373和ABI377)。Analytical Spectral Devices(Boulder,CO)生產UV分光光度計。Hitachi Instruments(日本東京)生產原子吸收光譜儀、螢光光譜儀、LC和GC質譜儀、NMR光譜儀及UV-Vis光譜儀。PreSeptiveBiosystems(Framingham,MA)生產質譜儀(VoyagerTMElite)。Bruker Instruments Inc.(Manning Park,MA)生產FTIR光譜儀(Vector22)、FF喇變光譜儀、飛行時間質譜儀(Reflex IITM)、離子俘獲質譜儀(EsquireTM)和Maldi質譜儀。Analytical Technology Inc.(ATI,Boston,MA)製造毛細管凝膠電泳裝置、UV檢測器和二極體陣列檢測儀。Teledyne Electronic Technologies(Mountain View,CA)製造離子俘獲質譜儀(3DQ DiscoveryTM和3DQ ApogeeTM)。Perkin Elmer/Applied Biosystems Division(Foster city,CA)製造可與電噴射匹配的Sciex質譜儀(三聯四極LC/MS/MS,API 100/300)。Hewlett-Packard(Santa Clara,CA)生產質量選擇性檢測器(HP5972A)、MALDI-TOF質譜儀(HP G2025A)、二極體陣列檢測器、CE裝置、HPLC裝置(HP1090)及UV光譜儀。FinniganCorporation(San Jose,CA)製造質譜儀(磁扇形場(MAT95STM)、四極光譜儀(MAT95SQTM)和四種其他的相關質譜儀)。Rainin(Emevyville,CA)製造HPLC裝置。
本文描述的方法和組合使得可以使用裂解的標記確定樣品類型和核酸鑑定的圖譜。在每個測序方法開始時，為每個特定的(選擇的)引物指定一個特殊的獨特標記。標記指示不同的樣品類型、雙脫氧終止子類型(就Sanger測序反應而言)或優選兩者。具體地說，標記指示引物類型，引物類型又指示載體類型，載體類型又指示樣品身份。標記也可能指示雙脫氧終止子類型(ddTTP、ddCTP、ddGTP、ddATP)，其中參考放有標記引物的雙脫氧核苷酸反應。然後完成測序反應並及時按大小依次分離所得到的片段。
在時間框架中從片段上切下標記並在時間框架內檢測和記錄之。將標記圖譜與時間框架相比較以構成序列。即，在按大小分離之後及時記錄所有標記的鑑定數據並且在數據框架中變成相互關聯的。按大小分離步驟可分離開按一個核苷酸遞增的核酸片段，因此按一個核苷酸的增量分離了相關的標記。由於予知雙脫氧終止子或核苷酸圖譜和樣品類型，很容易以線性方式推斷出序列。
下列實施例是按舉例說明方式，而不是以限制的方法提供的。
除另外指出者外，用於實施例中的化學品均可從Aldrich ChemicalCompany,Milwaukee,WI得到。本文使用具有所指出的含義的下列縮寫詞ANP=3-(Fmoc-氨基)-3-(2-硝基苯基)丙酸NBA=4-(Fmoc-氨基乙基)-3-硝基苯甲酸HATU=O-7-氮雜苯並三唑-1-基-N,N,N』,N』-四甲基脲六氟磷酸鹽DIEA=二異丙基乙胺MCT=一氯三嗪NMN=4-甲基嗎啡啉MNP=N-甲基吡咯烷酮ACT357=ACT357肽合成儀，購目Advanced ChomTech,Inc.LouisvilleKYACT=Advanced Chem Tech,Inc.,Louisvile,KYNovaBiochem=CalBiochem-NovaBiochem International,San diego,CATFA=三氟乙酸Tfa=三氟乙醯iNIP=N-甲基異哌啶甲酸Tfp=四氟苯基DIAEA=2-(二異丙基氨基)乙胺MCT=一氯三氮烯5』-AH-ODN=有5』-氨基己基尾的寡脫氧核苷酸。
實施例實施例1用於可裂解分子鑑定劑測序中的酸敏感性接頭的製備A可化學裂解的質譜標記五氟苯基酯的合成，以釋放帶羧醯胺末端的標記圖1顯示反應流程。步驟A．在ACTA357肽合成儀(ACT)的收集容器中用DMF懸浮TentaGel SAC樹脂(化合物Ⅱ；得自ACT；1當量)。加入溶於DMF的化合物Ⅰ(3當量)、HATU(3當量)和DIEA(7.5當量)並將收集容器振蕩1小時。除去溶劑並用NMP(2X)、MeOH(2X)和DMF(2X)洗樹酯。將Ⅰ偶聯到樹脂上並重複洗滌步驟，得到化合物Ⅲ。步驟B．將樹脂(化合物Ⅲ)與DMF中的25％哌啶混合併振蕩10分鐘。除去溶劑，用NMP(2X)、MeOH(2X)和DMF(2X)洗樹脂，並直接用於步驟C。步驟C．將步驟B的去保護的樹脂懸浮於DMF中並向其中加入DMF中的FMOC保護的在其側鏈中含有胺官能團的胺基酸(化合物Ⅳ，如α-N-FMOC-3-(3-吡啶基)-丙氨酸，可購自Synthetech,Albany,OR；3當量)、HATU(3當量)和DIEA(7.5當量)。將容器振蕩1小時。除去溶劑並用NMP(2X)、MeOH(2X)和DMF(2X)洗樹酯。將Ⅳ偶聯到樹脂上並重複洗滌步驟，以得到化合物Ⅴ。步驟D．按步驟B中所述用哌啶處理樹脂(化合物Ⅴ)以除去FMOC基團。然後用ACT357將收集容器中的去保護的樹脂等分到16個反應容器中。步驟E．將得自步驟D的16等份的去保護樹脂懸浮於DMF中。向各反應容器中加入溶於DMF中的適當的羧酸Ⅵ1-16(R1-16CO2H3,3當量)、HATU(3當量)和DIEA(7.5當量)。將容器振蕩1小時。除去溶劑並用NMP(2X)、MeOH(2X)和DMF(2X)洗各等份的樹脂。將Ⅵ1-16偶聯到各等份的樹脂上並重複洗滌步驟，得到化合物Ⅶ1-16。步驟F．用CH2CI2(3X)洗各等份的樹脂(化合物Ⅶ1-16)。向各反應容器內加入在CH2CH2中的1％TFA並將容器振蕩30分鐘。將溶劑從反應容器過濾到各個試管中。用CH2CI2(2X)和MeOH(2X)洗各等份的樹脂並將濾液合併到各個試管中。真空中蒸發各個試管。得到化合物Ⅷ1-16。步驟G．將每份游離羧酸Ⅷ1-16溶解於DMF中。向各溶液內加入吡啶(1.05當量)，然後再加入三氟乙酸五氟苯酯(1.1當量)。室溫下將混合物攪拌45分鐘。用EtOAc稀釋該溶液，用1M檸檬酸水溶液(3X)和5％NaHCO3水溶液(3X)洗，在Na2SO4上乾燥，過濾並真空蒸發，得到化合物Ⅸ1-16。
B．可化學裂解的質譜標記五氟苯基酯的合成，以釋放帶羧酸末端的標記圖2顯示反應流程。步驟A．將4-(羥甲基)苯氧基丁酸(化合物Ⅰ；1當量)與DIEA(2.1當量)和烯丙基溴(2.1當量)合併在CHCl3中並加熱回流2小時。用EtOAc稀釋混合物，用1N HCl(2X)、pH9.5碳酸鹽緩衝液(2X)及鹽水(1X)洗，在Na2SO4上乾燥，並真空蒸發得到化合物Ⅰ的烯丙酯。步驟B．將步驟A中的化合物Ⅰ的烯丙酯(1.75當量)與FMOC保護的在其側鏈中含有胺官能團的胺基酸(化合物Ⅱ，如α-N-FMOC-3-(3-吡啶基)-丙氨酸，可購自Synthetech,Albany,OR；1當量)、N-甲基嗎啉(2.5當量)和HATU(1.1當量)合併到CH2Cl2中，並室溫攪拌4小時。用CH2Cl2稀釋混合物，用1M檸檬酸水溶液(2X)、水(1X)和5％NaHCl3水溶液(2X)洗，在Na2SO4上乾燥並真空蒸發。經快速層析(CH2Cl2→EtOAc)分離化合物Ⅲ。步驟C．將化合物Ⅲ溶解於CH2Cl2中，加入Pd(PPh3)4(0.07當量)和N-甲基苯胺(2當量)，並將混合物室溫攪拌4小時。用CH2Cl2稀釋混合物，用1M檸檬酸水溶液(2X)和水(1×)洗，在NaSO4上乾燥並真空蒸發。經快速層析(CH2Cl2→EtOAc)分離化合物Ⅳ。步驟D．在ACT357肽合成儀(Advanced ChemTech Inc(ACT)，Louisvile,KY)的收集容器內用DMF懸浮TentaGel S AC樹脂(化合物Ⅴ；1當量)，加入溶於DMF中化合物Ⅳ(3當量)、HATU(3當量)和DIEA(7.5當量)並將收集容器振蕩1小時。除去溶劑並用NMP(2X)、MeOH(2X)和DMF(2X)洗樹脂。將Ⅳ偶聯到樹脂上並重複洗滌步驟，得到化合物Ⅵ。步驟E．將樹酯(化合物Ⅵ)與DMF中的25％哌啶混合併振蕩5分鐘。過濾樹脂，然後與DMF中的25％哌啶混合併振蕩1小時。除去溶劑並用NMP(2X)、MeOH(2X)和DMF(2X)洗樹脂。然後用ACT357將去保護的樹脂從收集容器中等分到16個反應容器中。步驟F．將步驟E的16等份去保護的樹脂懸浮於DMF中。向各反應容器內加入溶於DMF的適當的羧酸Ⅶ1-16(R1-16CO2H；3當量)、HATU(3當量)和DIEA(7.5當量)。將容器振蕩1小時。除去溶劑並用NMP(2X)、MeOH(2X)和DMF(2X)洗各等份樹脂。將Ⅶ1-16偶聯到樹脂上並重複洗滌步驟，得到化合物Ⅷ1-16。步驟G．用CH2Cl2(3X)洗各等份樹脂(化合物Ⅷ1-16)。向各反應容器內加入在CH2Cl2中的1％TFA並將容器振蕩30分鐘。從反應容器中將溶劑過濾到各個試管內。用CH2Cl2(2X)和MeOH(2X)洗各等份的樹脂，並將濾液合併到各個試管內。真空蒸發各個試管，得到化合物Ⅸ1-16。步驟H．將各游離羧酸Ⅸ1-16溶解於DMF中。向各溶液內加入吡啶(1.05當量)，然後再加入三氟乙酸五氟苯酯(1.1當量)．將混合物室溫攪拌45分鐘。用EtOAc稀釋溶液，用1M擰檬酸水溶液(3X)和5％NaHCO3溶液(3X)洗，在Na2SO4上乾燥，過濾並真空蒸發，得到化合物Ⅹ1-16。
實施例2證明T-L-X的光裂解室溫下用近紫外光照射實施例11中製備的T-L-X化合物7分鐘。使用在350mm處有發射峰的Rayonett螢光紫外燈(Southern NewEngland Ultraviolet Co.,Middletown,CT)作為紫外光源。將燈放在離含樣品平皿15cm距離處。SDS凝膠電泳顯示在這些條件下85％以上的混合物被裂解。
實施例3製備螢光標記的引物和證明螢光團的裂解寡核苷酸的合成和純化使用製造商提供的標準亞磷醯胺化學，或H-膦酸酯化學(GlennResearch Sterling,VA)在自動DNA合成儀上製備寡核苷酸(ODN)。適當封閉的dA、dG、dC和T亞磷醯胺是以這些形式從市場上購得的，並且可很容易地將合成的寡核苷轉化成這種適當的形式。使用由製造商提供的標準亞磷醯胺，或H-膦酸酯化學製備寡核苷酸。使用標準方法寡核苷酸。使用12μm 300#Rainin(Emeryville,CA)Dynamax C-84.2×250反相柱以HPLC對帶5′三苯甲基的寡核苷酸進行層析，使用0.1N Et3NH+OAc-(pH7.0)中的15％至55％MeCN梯度洗脫20分鐘。當完成脫三苯甲基化時，進一步用凝膠排阻層析法純化寡核苷酸。在鹼性pH條件下用PRP柱(Alltech,Deerfield,IL)並用PAGE法分析檢查寡核苷酸的質量。
2,4,6-三氯三嗪衍生的寡核苷酸的製備使10至1000μg 5′-末端胺連接的寡核苷酸與過量重結晶的氰尿醯氯在溶於鹼性(最好pH8.3至8.5)緩衝液內的10％N-甲基吡咯烷酮中於19℃至25℃下反應30至120分鐘。終反應混合物由0.15M硼酸鈉(pH8.3)、2mg/ml重結晶的氰尿醯氯和500μg/ml各寡核苷酸組成。在G50Sephedex(Pharmacia,Piscataway,NJ)柱上經排阻層析除去未反應的氰尿醯氯。
然後使經過活化的如上純化的寡核苷酸在室溫下於0.15M硼酸鈉(pH8.3)中與100倍過量的半胱胺反應1小時。在G50 Sephadex柱上經大小排阻層析除去未反應的半胱胺。然後使衍生的ODN與胺反應性螢光顏料反應。將所得到的ODN製備物分成3份，每份各與(a)20倍摩爾過量的德克薩斯紅磺醯氯(Molecular Probes,Eugene,OR)、與(b)20倍摩爾過量的麗斯胺磺醯氯(MolecularProbes,Eugene,OR),(c)20倍摩爾過量的螢光素異硫氰酸酯反應。終反應條件是在0.15M硼酸鈉(pH8.3)中於室溫下反應1小時。在G50Sephadex柱上經大小排阻層析除去未反應的螢光顏料。
為了從寡核苷酸上裂解螢光顏料，將ODN調整到1×10-5摩爾，然後在TF(TF是0.01M Tris,pH7.0,5mM EDTA)中稀釋(12,3倍稀釋)。向100μl體積的ODN中加入25μl 0.01M二硫蘇糖醇(DTT)。一組相同的對照物中不加DDT。將混合物室溫下保溫15分鐘。在黑色微滴定板中檢測螢光。從保溫管中除去溶液(150μl)並放在黑色微滴定板(Dynatek Laboratories,Chantilly,VA)中。使用FluoroskanⅡ螢光計(Flow Laboratories,McLean,VA)直接讀平板，其中使用495nm雷射波長並監測520nm發射波來檢測螢光素，使用591nm激發波長並監測612nm的發射波以檢測德克薩斯紅，並使用570nm激發波長並監測590nm發射波以檢測麗絲胺。螢光團的摩爾數未裂解的裂解的游離的RFU RFU RFU1.0×105M6.4 1200 13453.3×106M2.4 451 4561.1×106M0.9 135 1303.7×107M0.3 44481.2×107M0.1215.3 16.04.1×107M0.144.9 5.11.4×108M0.132.5 2.84.5×109M0.120.8 0.9數據表明，當螢光團從ODN上裂解下來時，相對螢光約增加200倍。
實施例4製備標記的M13序列引物並證明標記的裂解製備2,4,6-三氯三嗪衍生的寡核苷酸1000μg 5′末端胺連接的寡核苷酸(5′-己胺-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′)(Seq.ID No.1)與過量重結晶的氰尿醯氯在10％N-甲基吡咯烷酮鹼性(較好pH8.3至8.5)緩衝液中19至25℃下反應30至120分鐘。終反應條件由0.15M硼酸鈉(pH8.3)、2mg/ml重結晶的氰尿醯氯和500μg/ml每種寡核苷酸構成。在G50 Sephadex柱上經大小排阻層析除去未反應的氰尿醯氯。
然後使活化的純化的寡核苷酸與100倍過量的半胱胺在0.15M硼酸鈉(ph8.3)中室溫反應1小時。在G50 Sephadex柱上經大小排阻層析除去未反應的半胱胺。然後使衍生的ODN與各種醯胺反應。將所得的ODN製品分成12份，每份與(25摩爾過量)下列酸的五氟苯酯反應(1)4-甲氧基苯甲酸，(2)4-氟苯甲酸，(3)甲苯甲酸，(4)苯甲酸，(5)吲哚-3-乙酸，(6)2,6-二氟苯甲酸，(7)煙酸N-氧化物，(8)2-硝基苯甲酸，(9)5-乙醯水楊酸，(10)4-乙氧基苯甲酸，(11)肉桂酸，(12)3-氨基煙酸。反應在0.2M硼酸鈉(pH8.3)中37℃進行2小時。在G50 Sephadex上經凝膠排阻層析純化衍生的ODN。
為了從寡核苷酸上裂解掉標記，將ODN調整到1×10-5摩爾然後在TE(TE是0.01MTris,ph7.0,5mM EDTA)中用50％EtOH(VV)進行稀釋(12,3倍稀釋)。向100μl體積ODN中加入25μl 1M二硫蘇糖醇(DTT)。一組同樣的對照物中則不加DTT。室溫下保溫30分鐘。然後加NaCl至0.1M並加入2體積EtOH以沉澱ODN。以14,000g於4℃下離心15分鐘以除去溶液中的ODN。保留上清液，徹底乾燥。然後將沉澱物溶解於25μl MeOH。以質譜檢測法檢測沉澱物中標記的存在。
用於本研究的質譜儀是外部離子源傅立葉變換質譜儀(FTMS)。使為MALDI分析所製備的樣品沉積到直接探子的尖端並插入到離子源中。當雷射脈衝照射樣品時離子從該源中被抽提出來並通入長的四極離子導槽中，由此將它們聚焦並輸送到位於超導磁鐵中心孔內的FTMS分析儀小室中。
光譜產生如下信息。在下列分子量處強度從25到100相對強度單位變化的峰(1)指示4-甲氧基苯甲酸衍生物的212.1amu，(2)指示4-氟苯甲酸衍生物的200.1amu，(3)指示甲苯酸衍生物的196.1amu，(4)指示苯甲酸衍生物的182.1amu，(5)指示吲哚-3-乙酸衍生物的235.2amu，(6)指示2,6-二氟苯甲酸衍生物的218.1amu，(7)指示煙酸N-氧化物的199.1amu，(8)指示2-硝基苯甲醯胺的227.1amu，(9)指示5-乙醯水楊酸衍生物的179.18amu,(10)指示4-乙氧基苯甲酸衍生物的226.1amu，(11)指示肉桂酸衍生物的209.1amu，(12)指示3-氨基煙酸衍生物的198.1amu。
結果表明分子量(MV)鑑定劑從引物上被裂解下來並可用質譜法檢測。
實施例5一組式R1-36-Lys(ε-1NIP)-ANP-Tfp化合物的製備圖3舉例說明平行合成一組36個T-L-X化合物(X=Lh)，其中Lh是活化的酯(特別四氟苯基酯)，L2是鄰硝基苄胺基團，L3是連接Lh和L2的亞甲基基團，T具有其中賴氨酸的羧酸基團已連接到L2苄胺基團的氮原子上形成醯胺鍵的模式結構，且分子量可變成分R1-36(其中這些R基團相當於如本文定義的T2，並可通過本文所列出的任何一種特異性羧酸被導入)通過賴氨酸的α-氨基基團連接，而質譜靈敏度增強子基團(通過N-個基異哌啶甲酸導入的)則通過賴氨酸的ε-氨基基團結合。
參見圖3步驟A．在ACT357的收集容器內用DMF懸浮NovaSyn HMP樹脂(可購自NovaBiochem；1當量)。加入溶於DMF的化合物Ⅰ(得自ACT的ANP；3當量)、HATU(3當量)和NMM(7.5當量)並將收集容器振蕩1小時。除去溶劑並用NMP(2X)、MeOH(2X)和DMF(2X)洗樹酯。將Ⅰ偶聯到樹脂上並重複洗滌步驟，得到化合物Ⅱ。步驟B．將樹脂(化合物Ⅱ)與DMF中的25％哌啶混合併振蕩5分鐘，過濾樹脂與DMF中的25％哌啶混合併振蕩10分鐘。除去溶劑，用NMP(2X)、MeOH(2X)和DMF(2X)洗樹脂，並直接用於步驟C。步驟C．將步驟B的去保護的樹脂懸浮於DMF中並向其中加入DMF中的FMOC保護的在其側鏈中含有被保護官能團的胺基酸(Fmoc-賴氨酸(Aloc)-OH，購自BeSeptive Biosystems；3當量)、HATU(3當量)和NMM(7.5當量)。將容器振蕩1小時。除去溶劑並用NMP(2X)、MeOH(2X)和DMF(2X)洗樹酯。將Fmoc-Lys(Aloc)-OH偶聯到樹脂上並重複洗滌步驟，以得到化合物Ⅳ。步驟D．用CH2Cl2(2X)洗樹脂(化合物Ⅳ)，然後懸浮在(PPh3)4Pd(0)(0.3當量)和PhSiH3(10當量)在CH2Cl2中的溶液中。將混合物振蕩1小時。除去溶劑並用CH2Cl2(2X)洗樹脂。重複鈀處理步驟。除去溶劑並用CH2Cl2(2X)、溶於DMF中的N,N-二異丙基乙銨二乙基二硫代氨基甲酸酯(2X)、DMF(2X)洗樹酯，得到化合物Ⅴ。步驟E．將步驟D得到的去保護的樹脂與步驟C中所述的N-甲基異哌啶甲酸偶聯，得到化合物Ⅵ。步驟F．用ACT357收集容器中的Fmoc保護的樹脂Ⅵ等分到36個反應容器中，得到化合物Ⅵ1-36。步驟G．按步驟B中所述使樹脂(化合物Ⅵ1-36)與哌啶反應，以除去FMOC基團。步驟H．將步驟G的36等份去保護的樹脂懸浮於DMF中。向各反應容器中加入溶於DMF的適當的羧酸(R1-36CO2H；3當量)、HATU(3當量)和NMM(7.5當量)。將容器振蕩1小時。除去溶劑並用NMP(2X)、MeOH(2X)和DMF(2X)洗各等份的樹酯。將R1-36CO2H偶聯到樹脂上並重複洗滌步驟，以得到化合物Ⅷ1-36。步驟Ⅰ.用CH2Cl2(3X)洗各等份的樹脂(化合物Ⅷ1-36)。向各反應容器內加入90∶5∶5的TFA∶H2O∶CH2Cl2並將容器振蕩120分鐘。將容劑從反應容器過濾到各個試管中。用CH2Cl2(2X)和MeOH(2X)洗等分的樹脂並將濾液合併到各個試管內。在真空中蒸發各個試管，得到化合物Ⅸ1-36。步驟J．將各游離羧酸Ⅸ1-36溶解於DMF。向各溶液內加入吡啶(1.05當量)，然後加入三氟乙酸四氟苯基酯(1.1當量)。室溫下將混合物攪拌45分鐘。用EtOAc稀釋溶液，用5％NaHCO3水溶液(3X)洗，在Na2SO4上乾燥，過濾和真空蒸發，得到化合物Ⅹ1-36。
實施例6一組式R1-36-Lys(ε-1NIP)-NBA-Tfp化合物的製備圖4舉例說明平行地合成一組36種T-L-X化合物(X=Lh)，其中Lh是活化的酯(特別四氟苯基酯)，L2是鄰硝基苄胺基團，L3是連接Lh和L2之間的直接鍵，其中Lh直接連接到L2基團的芳環上。T具有其中賴氨酸的羧酸基團已被連接到L2苄胺基團氮原子上形成醯胺鍵的模式結構，且分子量可變的成分R1-36(其中這些R基團相當於如本文定義的T2，並可通過本文所列的任何一種特異性羧酸被導入)是通過賴氨酸的α氨基基團被結合的，而質譜增強子基團(通過N-甲基異哌啶甲酸被導入)則是通過賴氨酸的ε氨基基團結合的。
參見圖4步驟A．按照實施例5的步驟A中所述的方法將NovaSyn HMP樹脂偶聯到化合物Ⅰ(按照Brown等，Molecular Diversity,1,4(1995))的方法製備的NBA)上，得到化合物Ⅱ。步驟B-J．按照實施例5的步驟B-J所述處理樹脂(化合物Ⅱ)，得到化合物Ⅹ1-36。
實施例7一組式1INP-LYs(ε-R1-36)-ANP-Tfp化合物的製備圖5圖解說明平行地合成一組36種T-L-X化合物(X=Lh)，其中Lh是活化的酯(特別四氟苯基酯)，L2是鄰硝基苄胺基團，L3是連接Lh和L2的亞甲基基團，T具有其中賴氨酸的羧酸基團已被連接到L2苄胺基團之氮原子上形成醯胺鍵的模式結構，且分子量可變的成分R1-36(其中這些R基團相當於如本文定義的T2，並可通過本文所列的任何一種特異性羧酸被導入)是通過賴氨酸的α氨基基團結合的，而質譜增強子基團(通過N-甲基異哌啶甲酸被導入)則是通過賴氨酸的ε氨基基團結合的。
參見圖5步驟A-C．同實施例5。步驟D．按實施例5的步驟B中所述用哌啶處理樹脂(化合物Ⅳ)，以除去FMOC基團。步驟E．步驟D中樹脂上保護的α-胺與實施例5步驟C中描述的N-甲基異哌啶甲酸偶聯，得到化合物Ⅴ。步驟F．同實施例5。步驟G．按實施例5步驟D所述用鈀處理樹脂，以除去Aloc基團。步驟H-J．按實施例7中所述的同樣方法製備化合物Ⅹ1-36。
實施例8一組式R1-36-Glu(γ-DIAEA)-ANP-Tfp化合物的製備圖6圖解說明平行合成一組36個T-L-X化合物(X=Lh)，其中Lh是活化的酯(特別四氟苯基酯)，L2是鄰硝基苄胺基團，L3是連接Lh和L2的亞甲基基團，T具有其中穀氨酸的羧酸基團已被連接到L2苄胺基團氮原子上形成醯胺鍵的模式結構，且分子量可變的成分R1-36(其中這些R基團相當於如本文定義的T2，並可通過本文所列的任何一種特異性羧酸被導入)是通過穀氨酸的α氨基基團被結合的，而質譜增強子基團(通過2-(二異丙氨基)乙胺導入的)則是通過穀氨酸的γ-羧酸結合的。參見圖6步驟A-B．同實施例5。步驟C．按實施例5的步驟C中所述的偶聯方法使去保護的樹脂(化合物Ⅲ)偶聯到Fmoc-Glu-(OAl)-OH上，得到化合物Ⅳ。步驟D．用CH2Cl2(2X)洗樹脂(化合物Ⅳ)上的烯丙基酯並與(PPh3)4Pd(0)(0.3當量)和N-甲基苯胺(3當量)在CH2Cl2中的溶液混合。將混合物振蕩1小時。除去溶劑並用CH2Cl2(2X)洗樹脂。重複鈀處理步驟。除去溶劑並用CH2Cl2(2X)、溶於DMF中的N,N-二異丙基乙銨二乙基二硫代氨基甲酸酯(2X)、DMF(2X)洗樹酯，得到化合物Ⅴ。步驟E．將得自步驟D的去保護的樹脂懸浮在DMF中並經混合HATU(3當量)和NMM(7.5當量)而活化。將容器振蕩15分鐘。除去溶劑並用NMP(1X)洗樹脂。將樹脂與2-(二異丙基氨基)乙胺(3當量)和NMM(7.5當量)混合。將容器振蕩1小時。將2-(二異丙基氨基)乙胺偶聯到樹脂上並重複洗滌步驟，得到化合物Ⅵ。步驟F-J．同實施例5。
實施例9一組式R1-36-Lys(ε-1NIP)-ANP-Lys(ε-NH2)-NH2化合物的製備圖7圖解顯示平行地合成一組36種T-L-X化合物(X=Lh)，其中Lh是胺(特別是賴氨酸衍生殘基的ε氨基基團)，L2是鄰硝基苄胺基團，L3是連接Lh和L2的氨甲醯取代的亞烷基氨基醯基亞烷基基團，T具有其中賴氨酸的羧酸基團已被連接到L2苄胺基團氨原子上形成醯胺鍵的模式結構，且分子量可變的成分R1-36(其中這些R基團相當於如本文定義的T2，並可通過本文所列的任何一種特異性羧酸被導入)是通過賴氨酸的α氨基基團結合的，而質譜增強子基團(通過N-甲基異哌啶甲酸被導入)則是通過賴氨酸的ε氨基基團結合的。參見圖7步驟A．將Fmoc-Lys(Boc)-SRAM樹脂(可得自ACT；化合物Ⅰ)與溶於DMF的25％哌啶混合併振蕩5分鐘。過濾樹脂，然後與溶於DMF的25％哌啶混合併振蕩10分鐘。除去溶劑，用NMP(2X)、MeOH(2X)和DMF(2X)洗樹脂，並直接用於步驟B中。步驟B．加入DMF中的樹脂(化合物Ⅱ)、ANP(可購自ACT；3當量)、HATU(3當量)和NMM(7.5當量)並將收集容器振蕩1小時。除去溶劑並用NMP(2X)、MeOH(2X)和DMF(2X)洗樹脂。將Ⅰ偶聯到樹脂上並重複洗滌步驟，得到化合物Ⅲ。步驟C-J．按實施例7步驟B-Ⅰ所述方法處理樹脂(化合物Ⅲ)，得到化合物Ⅹ1-36。
實施例10一組式R1-36-Lys(ε-Tfa)-Lys(ε-IINP)-ANP-Tfp化合物的製備圖8圖解顯示平行地合成一組36個T-L-X化合物(X=Lh)，其中Lh是活化的酯(特別是四氟苯酯)，L2是鄰硝基苄胺基團且L3是連接Lh和L2的亞甲基，T具有其中第一個賴氨酸的羧酸基團已連接到L2苄胺基團氮原子上以形成醯胺鍵的模式結構，質譜靈敏度增強子基團(通過N-甲基異哌啶甲酸導入的)通過第一個賴氨酸的ε-氨基基團結合，第二個賴氨酸分子已通過第一個賴氨酸的α氨基基團被連接到第一個賴氨酸上，分子量調整基團(具有三氟乙醯結構)則是通過第二個賴氨酸的ε氨基基團結合的，並且分子量可變成分R1-36(這些R基團相當於本文定義的T2，並且可通過本文所示出的任何特異性羧酸被導入)通過第二個賴氨酸的α氨基基團被結合。參見圖8步驟A-E．這些步驟與實施例5的步驟A-E完全相同。步驟F．按實施例5中步驟B所述方法用哌啶處理樹脂(化合物Ⅵ)，以除去FMOC基團。步驟G．使用實施例5的步驟C中所述的偶聯方法將去保護的樹脂(化合物Ⅶ)偶聯到Fmoc-Lys(Tfa)-OH上，得到化合物Ⅷ。步驟H-K．按實施例5步驟F-J所述處理樹脂(化合物Ⅷ)，得到化合物Ⅸ1-36。
實施例11一組式R1-36-Lys(ε-1NIP)-ANP-5′-AH-ODN化合物的製備圖9舉例顯示了平行地合成一組36個T-L-X化合物(X=MOI，MOI是核酸片段，ODN)，該組化合物衍生於實施例7的酯(其中X是活化酯的其他T-L-X化合物可使用同樣方法)。MOI通過磷酸二酯-亞烷基胺基團借MOI的5′端連接到T-L上。
參見圖9步驟A．按照Van Ness等，核酸研究，19,3345(1991)中所述的改良的生物素化方法製備化合物Ⅻ1-36。向其中一種5′氨己基寡核苷酸(化合物Ⅺ1-36,1mg)在200mM硼酸鈉(pH8.3,250ml)中的溶液內加入一種四氟苯基酯(得自實施例7的化合物Ⅹ1-36，在250ml NMP中100倍摩爾過量)。在室溫下保溫反應過夜。經Sephadex G50層析從化合物Ⅻ1-36中除去未反應的和水解的四氟苯基酯。
實施例12一組式R1-36-Lys(ε-1NIP)-ANP-Lys(ε-(MCT-5′-AH-ODN))-NH2化合物的製備圖10舉例顯示平行地合成一組衍生於實施例11胺的36種T-L-X化合物(X=MOI,MOI是核酸片段，ODN)(可使用同樣方法製備其X是胺的其他T-L-X化合物)。MOI通過磷酸二酯-亞烷基胺基團借MOI的5′端連接到T-L上。
參見圖10步驟A．按Van Ness等，核酸研究,19,3345(1991)中描述的方法製備5′-[6-(4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-基氨基)己基]寡核苷酸Ⅻ1-36。步驟B．向5′-[6-(4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-基氨基)己基]寡核苷酸(化合物Ⅻ1-36)在100mM硼酸鈉(pH8.3)中的1mg/ml濃度溶液加入100倍摩爾過量的選自R1-36-Lys(ε-iNIP)-ANP-Lys(ε-NH2)NH2的伯胺(實施例11中的化合物Ⅹ1-36)。室溫下將溶液混合過夜。使用H2O作為洗滌溶液(3X)通過300MW截留值的膜(Amicon,Beverly,MA)超濾除去未反應的胺使體積減少到100ml以分離化合物ⅩⅢ1-36。
實施例13演示用質譜法同時檢測多個標記本實施例描述質譜檢測法同時檢測多個化合物(標記)的能力。在該特定實施例中，將31種化合物與基質混合，沉積在固相載體上並乾燥之，然後用雷射解吸。將所得到的離子導入質譜儀中。
等摩量混合下列化合物(購自Aldrich,Milwaukee,WI)以達到0.002M的終濃度(每種化合物)苯甲醯胺(121.14)、煙醯胺(122.13)、吡嗪醯胺(123.12)、3-氨基-4-吡唑羧酸(127.10)、2-噻酚羧醯胺(127.17)、4-氨基苯甲醯胺(135.15)、甲苯醯胺(135.17)、6-甲基煙醯胺(136.15)、3-氨基煙醯胺(137.14)、煙醯胺N-氧化物(138.12)、3-羥吡啶醯胺(138.13)、4-氟苯甲醯胺(139.13)、肉桂醯胺(147.18)、4-甲氧基苯甲醯胺(151.17)、2,6-二氟苯甲醯胺(157.12)、4-氨基-5-咪唑羧醯胺(162.58)、3,4-吡啶二羧醯胺(165.16)、4-乙氧基苯甲醯胺(165.19)、2,3-吡嗪二羧醯胺(166.14)、2-硝基苯甲醯胺(166.14),3-氟-4-甲氧基苯甲酸(170.4)、吲哚-3-乙醯胺(174.2)、5-乙醯水楊醯胺(179.18)、3,5-二甲氧基苯甲醯胺(181.19)、1-萘乙醯胺(185.23)、8-氯-3,5-二氨基-2-吡嗪羧醯胺(187.59)、4-三氟甲基苯甲醯胺(189.00)、5-氨基-5-苯基-4-吡唑-羧醯胺(202.22)、1-甲基-2-苄基-丙二酸酯(207.33)、4-氨基-2,3,5,6-四氟基甲醯胺(208.11)、2,3-萘二羧酸(212.22)。將這些化合物以上述濃度放在DMSO中。然後將1μl材料與α-氰基-4-羥基肉桂酸基質(1∶10,000稀釋之後)混合併沉積到固體不鏽鋼載體上。
然後使用Protein TOF質譜儀(Bruker,Manning Park MA)用雷射照射以使材料解吸，並以線性和反射操作模式檢測所得離子。觀察到下列m/z值(圖11)121.1--苯甲醯胺(121.14)122.1--煙醯胺(122.13)123.1--吡嗪醯胺(123.12)124.1125.2127.3--3-氨基-4-吡唑羧酸(127.10)127.2--2-噻吩羧醯胺(127.17)135.1--4-氨基苯甲醯胺(135.15)135.1--甲苯醯胺(135.17)136.2--6-甲基煙醯胺(136.15)137.1--3-氨基煙醯胺(137.14)138.2--煙醯胺N-氧化物(138.12)138.2--3-羥吡啶醯胺(138.13)139.2--4氟苯甲醯胺(139.13)140.2147.3--肉桂醯胺(147.18)148.2149.24-甲氧基苯甲醯胺(151.17)152.22,6-二氟苯甲醯胺(157.12)158.34-氨基-5-咪唑-羧醯胺(162.58)163.3165.2--3,4-吡啶-二羧醯胺(165.16)165.2--4-乙氧基苯甲醯胺(165.19)166.2--2,3-吡嗪二羧醯胺(166.14)166.2--2-硝基苯甲醯胺(166.14)3-氟-4-甲氧苯甲酸(170.4)171.1172.2173.4吲哚-3-乙醯胺(174.2)178.3179.3--5-乙醯水楊醯胺(179.18)181.2--3,5-二甲氧萘苯甲醯胺(181.19)182.2--
1-萘乙醯胺(185.23)186.2
8-氯-3,5-二氨基-2-吡嗪羧醯胺(187.59)188.2189.2--4-三氟甲基-苯甲醯胺(189.00)190.2191.2192.35-氨基-5-苯基-4-吡啶-羧醯胺(202.22)203.2203.41-甲基-2-苯基-丙二酸酯(207.33)4-氨基-2,3,5,6-四氟苯甲醯胺(208.11)212.2--2,3-萘二羧酸(212.22)219.3221.2228.2234.2237.4241.4數據表明31種化合物中有21種出現在預期質量的範圍中，31化合物中有9種出現在超出預期質量範圍有n+H質量(1個原子質量單位，amu)的範圍中。後一種現象可能是由於化合物內胺的質子化作用。因此31種化合物均可用MALDI質譜法檢測。更重要的是，該實施例證明可用質譜法同時檢測多個標記。
單獨α-氰基基質(圖11)在146.2、164.1、172.1、173.1、189.1、190.1、191.1、192.1、212.1、224.1、228.0、234.3處產生峰。光譜中其他已鑑定的質量是由於所購買的化合物中因沒有進一步純化這些化合物而帶的汙染物。
實施例14微衛星標誌PCR擴增使用下述標準PCR條件擴增微衛星標誌。簡單地說，在含有40ng基因組DNA、各50pmol引物、0.125mM dNTP和1單位Tag聚合酶的總體積50μl反應混合物中完成PCR反應。1X擴增緩衝液含有10mMTris鹼，pH9,50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.1％ Tr．iton X-100和0.01％明膠。使用「熱起始」程序進行反應在96℃5分鐘第一次變性步驟後加入Tag聚合酶。經35次循環完成擴增變性(94℃，40秒)和退火(55℃，30秒)。最後一次退火後以延伸步驟(72℃，2分鐘)終止擴增過程。因為將得到的擴增產物較短(90至350bp長)並且溫度從55℃升高到94℃(以1℃/秒的上升率達到的)的時間間隔足夠長，所以沒有72℃的步驟即可完成DNA延伸。
從上文可以理解到，雖然本文已為舉例說明的目的描述了本發明的特定實施方案，但可在不背離本發明的精神和範圍的前提下作出各種改動。
權利要求
1．鑑定核酸分子的方法，其包括(a)從一個或多個選擇的核酸分子產生標記的核酸分子，其中標記是與特定的核酸片段相互關聯的；並且是可用非螢光光譜法或電位測定法檢測的；(b)按大小分離標記的片段；(c)從標記的片段上裂解標記；以及(d)用非螢光光譜法或電位測定法檢測標記，從而鑑定所述核酸分子。
2．檢測選擇的核酸分子的方法，其(a)在足以使標記的核酸探針與互補的選擇的靶核酸序列雜交的條件下使標記的核酸探針與靶核酸分子結合足夠長時間，其中標記的核酸探針是可用非螢光光譜法或電位測定法檢測的；(b)改變雜交的標記探針的大小、未雜交的探針或靶分子的大小、或探針靶雜交體的大小；(c)按大小分離標記的探針；(d)從標記的探針上切掉標記；以及(e)用非螢光光譜法或電位測定法檢測標記，從而檢測選擇的核酸分子。
3．根據權利要求1或2的方法，其中用質譜法、紅外光譜法、紫外光譜法或恆電勢電流測定法檢測標記。
4．根據權利要求1的方法，其中產生4個以上標記的核酸片段，並且其中各個標記對於選擇的核酸片段都是獨特的。
5．根據權利要求2的方法，其中利用4個以上標記的核酸探針，並且其中各個標記對於選擇的核酸片段都是獨特的。
6．根據權利要求1或2的方法，其中所說的靶核酸分子是經引物延伸得到的。
7．根據權利要求2的方法，其中用選自聚合酶延伸、連接、核酸外切酶消化和核酸內切酶消化的方法改變所說的雜交的標記探針、未雜交的探針或靶分子、或探針靶雜交體的大小。
8．根據權利要求1或2的方法，其中用選自凝膠電泳、毛細管電泳、微通道電泳、HPLC、大小排阻層析和過濾的方法分離標記的分子。
9．根據權利要求1或2的方法，其中用選自氧化、還原、酸敏感性、鹼敏感性、酶促、電化學、熱和光敏感性方法裂解標記的分子。
10．根據權利要求1或3的方法，其中用飛行時間質譜、四極質譜、磁扇形場質譜和電扇形場質譜法檢測標記。
11．根據權利要求10的方法，其中利用選自庫侖檢測器和電流檢測器以恆電勢電流測定法檢測所說的標記。
12．根據權利要求1或2的方法，其中以連續方式完成分離、裂解和檢測的步驟。
13．根據權利要求1或2的方法，其中在單一裝置上以連續方式完成分離、裂解和檢測步驟。
14．根據權利要求13的方法，其中分離、裂解和檢測的步驟是自動化的。
15．根據權利要求1或2的方法，其中所說的標記的分子或探針是從5′標記的核苷酸終止子產生的。
16．根據權利要求1或2的方法，其中所說的標記的分子或探針是從標記的二脫氧核苷酸終止子產生的。
17．對選擇的生物體進行基因型鑑定的方法，其包括(a)從選擇的靶分子中產生標記的核酸分子，其中標記是與特定片段相互關聯並可用非螢光光譜法或電位測定法檢測的；(b)按序列長度分離標記的分子；(c)從標記的分子上裂解標記；以及(d)用非螢光光譜法或電位測定法檢測標記，從而確定所說生物體的基因型。
18．對選擇的生物體進行基因型鑑定的方法，其包括(a)在足以使標記分子與靶分子雜交的條件下使標記的核酸分子與選擇的靶分子結合足夠長時間，其中標記是與特定的片段相互關聯並且可用非螢光光譜法或電位測定法檢測的；(b)按序列的長度分離標記的片段；(c)從標記的片段上裂解標記；以及(d)用非螢光光譜法或電位測定法檢測標記，從而確定生物體的基因型。
19．根據權利要求17或18的方法，其中標記的分子是從選自基因組克隆、cDNA克隆和RNA克隆的克隆集合體中產生的。
20．根據權利要求17或18的方法，其中所說的標記的分子是經聚合酶鏈反應產生的。
21．根據權利要求17或18的方法，其中用質譜法、紅外光譜法、紫外光譜法或恆電勢電流測定法檢測標記。
22．根據權利要求17或18的方法，其中產生4個以上標記的核酸分子，並且其中各個標記對於選擇的核酸片段都是獨特的。
23．根據權利要求17或18的方法，其中所說的靶核酸分子是經引物延伸得到的。
24．根據權利要求17或18的方法，其中用選自凝膠電泳、毛細管電泳、微通道電泳、HPLC、大小排阻層析和過濾的方法分離標記的分子。
25．根據權利要求17或18的方法，其中用選自氧化、還原、酸敏感性、鹼敏感性、酶促、電化學、熱和光敏感性方法裂解標記的分子。
26．根據權利要求17或18的方法，其中用飛行時間質譜、四極質譜、磁扇形場質譜和電扇形場質譜法檢測標記。
27．根據權利要求17或18的方法，其中利用選自庫侖檢測器和電流檢測器以恆電勢電流測定法檢測所說的標記。
28．根據權利要求17或18的方法，其中以連續方式完成分離、裂解和檢測的步驟。
29．根據權利要求17或18的方法，其中在單一裝置上以連續方式完成分離、裂解和檢測步驟。
30．根據權利要求17或18的方法，其中分離、裂解和檢測的步驟是自動化的。
31．根據權利要求17或18的方法，其中所說的標記的分子是從非3′標記的寡核苷酸引物產生的。
32．根據權利要求17或18的方法，其中所說的標記的分子是從標記的二脫氧核苷酸終止子產生的。
33．根據權利要求1、2或17的方法，其中所說的標記的分子是從生物學樣品中得到的。
34．含有下式的多個化合物的組合物Tms-L-MOI其中Tms是可用質譜法檢測的有機基團，包含碳，氫和氟中至少一種，以及選自氧、氮、硫、磷和碘的任選原子；L是允許從化合物的其餘部分裂解掉含Tms部分的有機基團，其中含Tms部分包括當化合物經受質譜分析時支持單一離子化帶電狀態的功能團，並選自叔胺、季胺和有機酸；MOI是核酸片段，其中L在MOI之3′末端以外的位置連接到MOI上，並且其中至少兩個化合物具有同樣的Tms，但這些分子的MOI基團具有不同的核苷酸長度。
35．包含有式多個化合物的組合物Tms-L-MOI其中Tms是可用質譜法檢測的有機基團，包含碳，氫和氟中至少一種，以及選自氧、氮、硫、磷和碘的任選原子；L是允許從化合物的其餘部分裂解掉含Tms部分的有機基團，其中含Tms部分包括當化合物經受質譜分析時支持單一離子化帶電狀態的功能團，並選自叔胺、季胺和有機酸；MOI是核酸片段，其中L在MOI之3′末端以外的位置連接到MOI上，並且其中至少兩個化合物具有同樣的Tms，但那些化合物具有不同的柱層析洗脫時間。
36．包含有下式的多個化合物的組合物Tms-L-MOI其中Tms是可用質譜法檢測的有機基團，包含碳，氫和氟中至少一種，以及選自氧、氮、硫、磷和碘的任選原子；L是允許從化合物的其餘部分裂解掉含Tms部分的有機基團，其中含Tms部分包括當化合物經受質譜分析時支持單一離子化帶電狀態的功能團，並選自叔胺、季胺和有機酸；MOI是核酸片段，其中L在MOI之3′末端以外的位置連接到MOI上，並且其中沒有兩個具有同樣MOI核苷酸長度也具有同樣的Tms的化合物。
37．權利要求34-36中任何一項的組合物，其中多個是大於2個。
38．權利要求34-36中任何一項的組合物，其中多個是大於4個。
39．權利要求34-36中任何一項的組合物，其中核酸片段具有互補於載體之一部分的序列，其中該片段能夠引發多核苷酸合成。
40．權利要求34-36中任何一項的組合物，其中多個化合物之成員的Tms基團相差至少2amu。
41．權利要求34-36中任何一項的組合物，其中多個化合物之成員的Tms基團核差至少4amu。
42．包含多組化合物的組合物，每組化合物均具有下列通式Tms-L-MOI其中Tms是可用質譜法檢測的有機基團，包含碳，氫和氟中至少一種，以及選自氧、氮、硫、磷和碘的任選原子；L是允許從化合物的其餘部分裂解掉含Tms部分的有機基團，其中含Tms部分包括當化合物經受質譜分析時支持單一離子化帶電狀態的功能團，並選自叔胺、季胺和有機酸；MOI是核酸片段，其中L在MOI之3′末端以外的位置連接到MOI上，並且第一組化合物內的成員具有相同的Tms基團，但具有不同的MOI基團，其中MOI中有不同數目的核苷酸，且第一組內至少有10個成員，各組間Tms基團至少相差2amu。
43．根據權利要求42的組合物，其中多組是至少3組。
44．根據權利要求42的組合物，其中多組是至少5組。
45．包含多組化合物的組合物，各組化合物均具有下列通式Tms-L-MOI其中Tms是可用質譜法檢測的有機基團，包含碳，氫和氟中至少一種，以及選自氧、氮、硫、磷和碘的任選原子；L是允許從化合物的其餘部分裂解掉含Tms部分的有機基團，其中含Tms部分包括當化合物經受質譜分析時支持單一離子化帶電狀態的功能團，並選自叔胺、季胺和有機酸；MOI是核酸片段，其中L在MOI之3′末端以外的位置連接到MOI上，並且其中，一組內的化合物具有同樣的洗脫時間，但有不同的Tms基團。
46．包含多個擴增引物對的基因型鑑定試劑盒，其中至少一個引物具有下列通式Tms-L-MOI其中Tms是可用質譜法檢測的有機基團，包含碳，氫和氟中至少一種，以及選自氧、氮、硫、磷和碘的任選原子；L是允許從化合物的其餘部分裂解掉含Tms部分的有機基團，其中含Tms部分包括當化合物經受質譜分析時支持單一離子化帶電狀態的功能團，並選自叔胺、季胺和有機酸；MOI是核酸片段，其中L在MOI之3′末端以外的位置連接到MOI上，並且每個引物對與不同的基因座相結合。
47．根據權利要求46的試劑盒，其中多個是至少3個。
48．根據權利要求46的試劑盒，其中多個是至少5個。
全文摘要
公開了為各種核酸反應而特別設計的標記和接頭,其適合於其中需要按大小分離核酸分子的各種核酸反應。
文檔編號C07B61/00GK1212020SQ97192555
公開日1999年3月24日 申請日期1997年1月23日 優先權日1996年1月23日
發明者J·范尼斯, J·C·特邦, J·J·豪伯特, J·T·默利甘 申請人:拉普吉恩公司