生物合成靛藍的方法

2023-05-25 05:40:56

專利名稱：生物合成靛藍的方法
技術領域：
本發明涉及一種生物合成靛藍的方法。
背景技術：
靛藍(indigo)是人類所知最古老的染料之一，其作為織物染料的應用至少可追溯到公元前2500年(Sandberg G，1989，Indigo TextilesTechnique andHistory，LondonA C Black)。古埃及木乃伊穿著的一些服裝和我國馬王堆出土的藍色麻織物等都是由靛藍所染成的(吳祺，2001，化學通報，8527-529)，我國瑤族的一支其生產靛藍而得名「藍靛瑤」[鞏繼賢，李輝芹，2002，北京紡織，23(5)25-27]。靛藍也是最重要的染料，需求量佔全部染料總量的10％。據田利明[2006，精細與專用化工，14(7)24-]報導，我國2005年出口的靛藍量為23785.1噸。
靛藍不僅被廣泛應用於印染業上，也廣泛應用於醫藥業和食品工業。在傳統醫學中，中醫、印度醫和南美醫等都利用產靛藍植物的葉和/或根來治療諸多的疾病，從子宮癌、胃痛、癲癇和其它神經系統病(特別是「憂鬱症」)、氣管炎、大出血到脾、肺和腎失調等。產靛藍植物的葉和/或根還被用於治療感冒、心臟和泌尿系統不調、少年白髮和脫髮等(http://www.plantcultures.org/plants/indigo_traditional_medicine.html)。在印度的一些地區，產靛藍植物被用於治療狂犬病，由此得名「狗咬木」(thedog-bite shrub)。在現代醫學中，產靛藍植物葉、莖和/或根的醇提取物用於保護肝臟免受象四氯化碳等化學劑的傷害、降低血壓和抗病毒等。產靛藍植物葉的提取物含有類魚藤酮，具有殺滅蚊子幼蟲的作用(http://www.plantcultures.org/plants/indigo_traditional_medicine.html)。在食品工業中，靛藍以其磺酸鈉鹽或其鋁化的形式等用作食用色素，我國稱之為「亮藍」(GB7655.1-1996)和亮藍鋁澱(GB7655.2-1996)，在美國等以其磺酸鈉鹽形式為主(FDC Blue No.2，USA)，被稱之為「indigotine」(「靛藍素」)。此外，靛藍磺酸鈉鹽還作為硝酸鹽和氯酸鹽的有色指示劑用於腎功能檢測和奶檢測。
靛藍的生產，直到18世紀後期，一直主要靠產靛藍植物中提取。人們將這些產靛藍植物統稱為「藍草」，其中重要的有菘藍(Isatis indigotica，＝Indigoferasumatrgna)、歐洲菘藍(Isatis tinctoria)、蓼藍(Polygonum tinctorum)、馬藍(Strobilanthes cusia，＝Baphicanthus cusia，Goldfusia cusia，Ruelliaindigotica)、木藍(槐藍，Indigofera tinctorum)、野青樹(Indigoferasuffruticosa)和納塔爾木藍(Indigofera arrecta)等。人們將藍草放入發酵池中，加水浸泡發酵，發酵時間充足後撈出殘渣，加入生石灰充分攪拌直至手捧液體查看時有絲狀靛藍沉澱出現即可，如此就得到了靛藍。我國瑤族的一支藍靛瑤，他們在種植靛藍、製作靛藍和應用靛藍染色方面有著獨特的技術。這一傳統技術，獨特傳統處方的靛藍染色工藝及設備列入了《中華人民共和國禁止出口、限制出口的技術目錄》，自2002年1月1日起禁止出口。
儘管傳統的靛藍生產方法被應用了幾千年，但是其生產效率低、所生產的靛藍的純度不高，同時又受到藍草莖葉貯藏條件和貯藏期的限制，不能滿足人們的需要，特別是不能滿足19世紀中頁紡織工業革命帶來的印染業的需要，儘管當時印度尤其是孟加拉一帶開闢了數十萬英畝的良田以種植靛藍植物(吳祺，2001，化學通報，8527-529)。因此，當1883年德國化學家拜爾(Adolf V.Baeyer)鑑定了靛藍的結構式並且發明、由德國BASF公司生產的化學合成靛藍於1897年問世後，因其原料充足、生產簡便、純度高、易貯運、使用方便等而迅速普及，使得具有幾千年歷史的植物靛藍黯然失色，在很短的時間內，幾乎完全將植物靛藍趕出了市場。本20世紀60年代之後，天然靛藍終於銷聲匿跡，退出了歷史舞臺。現在，幾乎所有的靛藍產品都是化學合成的。
化學合成靛藍的主要方法是以苯胺為原料，先與氯乙酸合成苯胺基乙酸，再用氨基鈉與其共熔氧化得到二氫吲哚，進一步氧化，生產吲哚酚，最後縮合成靛藍(顧毓剛等，2001，上海化工，1612-14)。這類方法合成靛藍的原料充足、生產簡便、合成的靛藍純度高、穩定性好，易貯運和使用方便。但是在化學合成過程中，使用的苯胺和鄰苯二甲酸能導致人體急性和慢性中毒，對呼吸道和中樞神經及肝臟均有一定損害，甚至能誘導產生癌症；在縮合過程中產生的鐵鹽廢水pH＝4.5左右，COD高達3-3.5萬mg/L，含鹽量為13％。此外，還有大量的漂洗廢水，它含有大量的氯化鐵、硫酸鐵、硫酸鈉、氯化鈉、苯胺和硝基苯等有毒物質等(顧毓剛等，2001，上海化工，1612-14)。這些有毒物質不僅對化學合成生產者的身體健康造成危害，而且對環境造成嚴重的汙染。進入上世紀80年代後，隨著社會現代化程度的日益提高，環境保護和勞動保護意識的增強和逐漸普及，人們認識到了化學合成靛藍對人體和環境的一系列嚴重危害，開始探求不會產生有毒副產品的靛藍生產方法。
產生較少或者不產生有毒副產品的方法之一是由微生物生物合成靛藍。早在1928年人們就觀察到假單胞菌(Pseudomonas indoloxidaes)能夠氧化吲哚合成靛藍，1956年觀察到真菌Schisophyllum commune能夠在有葡萄糖和胺鹽的培養基上直接合成靛藍，但其機制在當時還不清楚。1983年，Ensley等發現，來源於從土壤細臭腐菌假單胞菌(Pseudomonas putida)的一種可傳遞質粒的DNA片段穩定轉化的大腸桿菌後，轉化子能夠在有吲哚或色氨酸的條件下合成靛藍(Ensley等，1983，Science，222167-169)。Ensley等推測，作為培養基添加劑加入的或由色氨酸的酶促代謝而產生的吲哚，被假單胞菌DNA編碼的多組分雙加氧酶---NDO轉化成順一吲哚-2，3-二氫二醇和3一羥基吲哚(吲哚酚)。所產生的3一羥基吲哚在接觸空氣後被氧化成靛藍(Ensley等，1982，J Bacteriol，149948-954)。1986年，Mermod等(1986，Bio/Technology，4321-)報導，假單胞菌菌株Pseudomonas putidamt-2中含有能夠降解甲苯-二甲苯或甲苯其它衍生物的酶的基因，這種基因位於TOL質粒上。二甲苯氧化酶的釋放產生脫氫和單加氧化作用，使吲哚直接在C3發生羥化形成吲哚酚，後者再經過空氣氧化，自動二聚化形成靛藍。上述2項工作揭示，含有雙加氧酶或單加氧酶基因的細菌能夠分別以色氨酸(或吲哚)和芳香族化合物為原料合成靛藍，從而開創了利用基因工程微生物生產靛藍的先河。此後，有諸多的關於利用不同的單加氧酶和雙加氧酶基因重組微生物生產靛藍的報導和專利。報導的單加氧酶類主要有苯乙烯(styrene)單加氧酶(Kevin E et al，1997，Appl EnvironMicrob，63(11)4287-4291)、2-羥二苯-3-單加氧酶(Meyer A et al，2002，J BiolChem，227(37)34161-34167)和二苯並噻吩(dibenzothiophene，DBT)單加氧酶(Furuya T et al，2004，Biochem Biophys Res Commune，313570-575)等；雙加氧酶類主要有萘(naphthalene)雙加氧酶[NDO；Grund A and Gunsalus IC，1983，J Bacteriol，156(1)89-94；Gibson DT et al，1995，J Bacteriol，2615-2621；Bushan B et al，2000，Lett Appl Microb，315-9；Berry A et al，2002，J IndustMicrol biotechnol，28127-133；Kim JY et al，2003，Let Appl Microb，36343-348]、甲苯(Toluene)雙加氧酶(Stephens GM et al，1989，FEMS Microb Lett，57295-300；Kim JY et al，2003，Let Appl Microb，36343-348)、苯(benzene)雙加氧酶(Tan HM et al，1990，FEMS Microb Lett，72259-264)和其它雙加氧酶(Itoh K et al，1999，JSDC，115234-235；Alemayehu D et al，2004，FEMSMicrob Lett，239285-293；Royo JL et al，2005，J Biotechnol，116113-124)。此外，還有多酚氧化酶類(Doukyu N et al，2003，Appl Microb Biotechnol，60720-725；Kim JY et al，2005，Leet Appl Microb，41163-168)和環單或雙加氧酶類(Harper JB et al，2003，Tetrahedron Lett，445815-5818；PinyakongO et al，2004，FEMS Microb Lett，238297-305)。我國科技工作者孫國萍等[1995，微生物學報，35(3)161-165]也克隆並且表達了2-萘酸加氧酶基因；吳雲等[1989，遺傳學報，16(4)318-324]將萘質粒(含有NDO基因)導入大腸桿菌後獲得能夠合成靛藍的轉化子；李暉和吳雲(1989，食品與發酵工業，24(2)7-10)還將萘質粒導入能夠產生與類胡蘿蔔素的分枝桿菌(Mycobacterium sp)菌株Cr-1-2-39和節桿菌(Arthrobacter sp)菌株2-3中，獲得同時產生類胡蘿蔔素和靛藍的轉化菌株。
細胞色素P450基因經過重組後導入大腸桿菌也能氧化吲哚生成靛藍。ElizabethMJ等於1999年報導[Biochem Biophys Res Commune，265(2)469-472]，他們將人類細胞色素P450基因重組後導入大腸桿菌，轉化子能夠將外加到培養基中的吲哚轉化成靛藍。隨後，他們闡明是由於重組人類細胞色素P450酶對外加吲哚的氧化作用導致靛藍的形成(Elizabeth MJ et al，2000，Biochem，39(45)13817-13824)。Katsunori N等(2001，Arch Biochem Biophys，395(1)25-31)從隨機突變人類細胞色素P450 2A6基因中篩選出能夠將吲哚轉化成靛藍的基因。Li QS等報導(2000，J Chem Euro，61531-1536)，通過定向突變巨型桿菌(Bacillus megaterium)作為脂肪酸羥化酶的細胞色素P450 BM-3，使之轉變成能夠催化吲哚羥化的酶，即能夠氧化吲哚形成吲哚酚從而形成靛藍的酶。我國科技工作者李紅梅等、陸燕等進一步定向突變了細胞色素P450 BM-3，獲得了能夠更高效率地將吲哚轉化成靛藍的突變體(李紅梅等，2005，生物化學與生物物理進展，32(7)1-6；2006，生物加工過程，24(2)7-10；陸燕等，2006，自然科學進展，16(8)1047-1050)。
綜上所述，傳統的從靛藍植物(或產靛藍植物)中直接提取靛藍的方法因其生產效率低、所生產的靛藍的純度不高同時又受到藍草莖葉貯藏條件和貯藏期的限制等早已經退出歷史舞臺；化學合成靛藍方法因其合成過程中所用的有毒物質和產生的廢水廢料不僅對化學合成生產者的身體健康造成危害並且對環境造成嚴重的汙染而無法滿足現代人們對健康和環保的要求；通過基因工程改良的微生物生物合成靛藍則需要專門的設備和裝置並且涉及轉基因而難以消除公眾對轉基因生物安全性的憂慮。

發明內容
本發明的目的是提供一種在常溫下不使用有毒物質、不產生有毒副產品和廢水的體外生物合成靛藍的方法。
本發明所提供的生物合成靛藍的方法，是利用活體植物的器官和/或組織的體外分泌物、和/或活體植物的器官和/或組織的細胞破碎物的體外分泌物作為催化劑，在體外以吲哚為底物合成靛藍。
所述的體外分泌物均能將吲哚氧化成吲哚酚。
所述植物器官和/或組織及其細胞破碎物可來自於任何一種或多種植物，包括(產)靛藍植物和非(產)靛藍植物。
所述(產)靛藍植物是指在自然狀態下或者人工改良後能夠自身合成靛藍及其衍生物的植物，包括但不限於菘藍、歐洲菘藍、蓼藍、馬藍、木藍(槐藍)、納塔爾木藍和野青樹等。
所述的非(產)靛藍植物是指在自然狀態下或者人工改良後自身不能夠合成靛藍及其衍生物的植物，包括但不限於被子植物和裸子植物、單子葉植物和雙子葉植物、草本植物、藤本植物和木本植物、常綠植物和落葉植物、園林園藝植物和農作物及牧草植物、一年生植物和多年生植物、陸生植物以及有性和無性繁殖植物。在非(產)靛藍的雙子葉植物中，優選為藜目莧科莧屬和雞冠花屬植物；傘形目傘形科植物；十字花目十字花科植物，特別是芸苔屬和蘿蔔屬植物；茄目茄科植物，特別是菸草、矮牽牛、茄子、番茄和曼陀羅；葫蘆目葫蘆科植物，特別是西瓜、甜瓜和黃瓜等；豆目豆科植物，特別是黃豆(大豆)、綠豆、豌豆、豇豆和紫藤等；忍冬科忍冬屬植物；在非(產)靛藍的單子葉植物中，優選為禾本目禾本科植物，特別是水稻、小麥、玉米、穀子、稗子和高梁等。
所述植物的器官可為種子和/或根和/或莖和/或葉；優選器官為種子和/或葉。該種子在自然或在人工條件下能夠吸水發芽；根和葉選自正常生長和發育植株的生活根、莖和葉。
所述種子的體外分泌物是通過種子的發芽培養得到的，根、莖和葉的體外分泌物是通過將根、莖和葉切成小區段或片段後的保溼培養得到的。
所述活體植物的器官和/或組織的細胞破碎物的體外分泌物是通過將活體植物的器官和/或組織的細胞破碎物進行保溼培養得到的。
所述植物種子的體外分泌物是植物種子發芽過程中分泌到體外的分泌物；該體外分泌物按照如下方法獲得將植物種子置於能夠吸水、保水且能夠吸附靛藍並且所吸附的靛藍容易被洗脫的培養襯質上進行發芽，收集所述培養襯質，得到所述植物種子發芽過程中產生的體外分泌物；所述植物根、莖和葉的體外分泌物是這些器官及其細胞破碎物在離體培養過程中分泌到體外的分泌物；該體外分泌物按照如下方法獲得將根、莖和葉切成小片段或者搗碎，置於能夠吸水、保水且能夠吸附靛藍並且所吸附的靛藍容易被洗脫的培養襯質上保溼1-5天，收集所述培養襯質，得到所述植物根、莖和葉及其細胞破碎物的體外分泌物。
植物種子發芽所需的外界條件是本領域技術人員公知的，如充足的水分，適宜的溫度，足夠的氧氣，有些種子還需要光暗條件。供種子發芽用的水可為自然水、自來水、蒸餾水或去離子水，優選為蒸餾水，經濟的為自然水或自來水。如在常溫或室溫下，在有吸水紙(如，濾紙)或類似襯質上使種子吸水發芽。
植物根和莖的保溼培養是將其切成長0.3-2cm的片段，放置在吸水紙(如，濾紙)或類似襯質上在室溫下使其保溼；植物葉的離體培養是將其切成長0.3-2cm和寬0.1-0.5cm的條段，或者切成直徑為0.1-1.5cm的圓盤(常稱為「葉盤」)，放置在吸水紙(如，濾紙)或類似襯質上在室溫下使其保溼。供根、莖和/或葉片段保溼用的水可為自然水、自來水、蒸餾水或去離子水，優選為蒸餾水，經濟的為自然水或自來水。
將植物的活體根段和/或莖段和/或葉段置於能夠吸水、保水且能夠吸附靛藍並且所吸附的靛藍容易被洗脫的培養襯質上保活的方法是本領域技術人員公知的，如充足的水分，適宜的溫度，足夠的氧氣，有些還需要光暗條件。
所述的種子發芽襯質、根段與葉段(葉盤)等培養襯質是指墊在種子、根段與葉段(葉盤)等之下作支撐而對種子、根段與葉段(葉盤)等培養物沒有毒性的物質，其具有一定的吸水和保水性能，又能夠吸附靛藍並且所吸附的靛藍很容易被洗脫。優選為吸水紙，更優選為濾紙。
所述活體植物的器官和/或組織的體外分泌物、和/或活體植物的器官和/或組織的細胞破碎物的體外分泌與吲哚按照如下方法混合將吲哚溶液加到所述培養襯質上。
所述反應溫度為室溫，可為10-37℃。
所述底物吲哚可為化學合成或生物合成的吲哚，優選為價格低廉但不含對種子有毒物質的吲哚。所述吲哚可溶解於氯仿或者N，N-二甲基甲醯胺等溶劑中。
本發明利用活體植物器官和/或組織，和/或其細胞破碎物的體外分泌物作為催化劑，在常溫下將吲哚氧化成吲哚酚(3-羥基吲哚)，吲哚酚在空氣氧的作用下聚合生成靛藍。
本發明的方法不涉及轉基因、不需要任何專門的設備和裝置，不使用任何有毒物質、不產生任何有毒副產品，任何具有勞動能力的人都可以實施。本發明的方法完全排除了化學合成靛藍中所使用的有毒物質和產生的有害有毒副產品和廢水，排除了對勞動者健康的不利影響和對環境的汙染。本發明的方法所用的種子來源廣泛，貯運方便容易，成本低，既可以直接利用糧食作物(如小麥、玉米、水稻和穀子等)的種子和蔬菜等作物的種子，也可以利用一些作物的副產品，如西瓜、甜瓜和番茄等的種子；種子在作為「催化劑」使用後，仍然可以作為蔬菜(如黃豆芽、綠豆芽、蘿蔔苗、菘藍苗)食用、作為工業原料使用(如麥芽、玉米芽等)或作為飼料使用(可食用植物)。本發明所用的植物材料來源廣泛而且價格低廉，合成靛藍的效率高、所合成的靛藍的純度高，幾乎不需要純化。本發明的方法是一種簡單、方便、經濟、高效和環保的綠色生產靛藍的方法。


圖1為(產)靛藍植物菘藍發芽種子催化吲哚形成靛藍照片。
圖2為非(產)靛藍單子葉植物發芽種子催化吲哚形成靛藍照片。
圖3為非(產)靛藍雙子葉植物發芽種子催化吲哚形成靛藍照片。
圖4為非(產)靛藍雙子葉植物的種子在發芽過程中催化吲哚形成靛藍照片。
圖5為非(產)靛藍雙子葉植物紅莧菜的種子發芽的濾紙吸附物催化吲哚形成靛藍照片。
圖6為雙子葉植物(紅莧菜)的根催化吲哚形成靛藍照片。
圖7為雙子葉草本植物(紅莧菜)的葉催化吲哚形成靛藍照片。
圖8為雙子葉藤本植物金銀花(常綠)和紫藤(落葉)的葉切碎後催化吲哚形成靛藍照片。
圖9為雙子葉木本植物大葉黃楊(常綠)和美國紅櫨(落葉)的葉催化吲哚形成靛藍照片。
圖10為以氯仿為溶劑洗脫吸附在濾紙上的紅莧菜種子發芽催化合成的靛藍與靛藍標樣及靛玉紅標樣的吸收光譜比較。
圖11為以N，N-二甲基甲醯胺(DMF)為溶劑洗脫吸附在濾紙上的紅莧菜種子發芽的分泌物催化合成的靛藍與靛藍標樣的吸收光譜比較。
圖12為用甲醇清洗後再用DMF溶劑洗脫吸附在濾紙上的紅莧菜種子發芽的分泌物催化合成的靛藍與靛藍標樣以及甲醇洗脫物的吸收光譜比較。
圖13A為以氯仿為溶劑洗脫吸附在濾紙上的紅莧菜種子發芽的分泌物催化合成的靛藍與靛藍標樣和靛玉紅標樣氯仿溶液的薄層層析圖，展開劑是苯∶氯仿∶丙酮(5∶4∶1)。
圖13B為以氯仿為溶劑洗脫吸附在濾紙上的紅莧菜種子發芽的分泌物催化合成的靛藍與靛藍標樣和靛玉紅標樣氯仿溶液的薄層層析圖，展開劑是氯仿∶乙醇(9∶1)。
具體實施例方式
本發明利用數十種植物之一的器官和/或組織，在常溫下在體外將吲哚氧化形成靛藍。
按照本發明的方法，在能夠保水的容器底部鋪放1-3層充分吸水的濾紙(或類似物)，將(產)靛藍植物或非(產)靛藍植物的成熟種子或具有發芽能力的種子置於濾紙(或類似物)上，在常溫或者室溫下保溼使種子在暗處或自然條件發芽。在種子發芽過程中或待85％以上的種子發芽後，除去或不除去發芽種子，在該吸水紙(濾紙)或類似襯質上加入溶解於氯仿或N，N-二甲基甲醯胺(DMF)等溶劑的吲哚，在常溫或者室溫下放置24-72小時，當濾紙(或類似物)變成藍色時，將其取出，剪切成小塊後置於氯仿或N，N-二甲基甲醯胺中在常溫或室溫下漂洗，待靛藍完全洗脫時(濾紙或類似物不再呈藍色)，取出濾紙或類似物。
按照本發明的方法，在能夠保水的容器底部鋪放1-3層充分吸水的濾紙(或類似物)，將(產)靛藍植物或非(產)靛藍植物的活體根段、莖段和葉段(葉盤)等置於濾紙(或類似物)上，在常溫或者室溫下保溼使根段、莖段和葉段(葉盤)等保活。也可以將(產)靛藍植物或非(產)靛藍植物的活體葉等搗碎，置於濾紙(或類似物)上，在常溫或者室溫下保溼。經過1-3天後，除去或不除去培養物，在該吸水紙(濾紙)或類似襯質上加入溶解於氯仿或N，N-二甲基甲醯胺等溶劑的吲哚，在常溫或者室溫下放置12-72小時，當濾紙(或類似物)變成藍色時，將其取出，剪切成小塊後，置於氯仿或N，N-二甲基甲醯胺中在常溫或室溫下漂洗，待靛藍完全洗脫時(濾紙或類似物不再呈藍色)，取出濾紙或類似物。
溶解於氯仿或N，N-二甲基甲醯胺中的靛藍可按照常規方法(如，加熱循環蒸餾)析出，回收氯仿或N，N-二甲基甲醯胺，重複循環使用。為了鑑定合成的靛藍，可以在其析出前直接取氯仿或N，N-二甲基甲醯胺洗脫的靛藍液，以氯仿或N，N-二甲基甲醯胺作為負對照，以靛藍標準樣作為正對照，用紫外-可見光分光光度計進行掃描，比較吸收光譜和最大吸收峰波長。也可以以氯仿或N，N-二甲基甲醯胺等靛藍溶劑作為負對照，以靛藍標樣作為正對照進行薄層層析，比較斑點的顏色和遷移率。
下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規方法。
下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質量百分含量。
下述實施例中的室溫是指10-37℃。
實施例1、(產)靛藍植物種子的體外分泌物常溫下催化合成靛藍一、合成靛藍1、吲哚溶液的配製稱取0.06g吲哚固體粉末(北京化學試劑公司產品，分析純)，溶於1ml的氯仿或N，N-二甲基甲醯胺中，相應形成0.5mmol/ml的吲哚氯仿溶液或吲哚N，N-二甲基甲醯胺溶液，裝入1.5ml離心管或棕色指形管中，室溫存放，備用。
2、種子的發芽在培養皿(直徑9cm)中放入3層濾紙，加約4ml左右蒸餾水使濾紙充分吸溼，以濾紙表面看不到流動的水為度。將(產)靛藍植物菘藍的種子均勻地鋪在培養皿濾紙上，蓋蓋。每次做5個培養皿。將含有種子的培養皿置於暗處在室溫或常溫下培養。1-2天後，85％以上的種子發芽。
3、底物---吲哚的加入和靛藍的合成當種子芽的下胚軸長到2cm左右時(發芽後1-2天)，隨機在第一個培養皿中滴加10μl吲哚溶液(溶劑為氯仿)以合成靛藍，第二個培養皿中滴加10μl吲哚溶液(溶劑為N，N-二甲基甲醯胺(DMF))以合成靛藍，在第三個培養皿中加10μl的氯仿作為溶劑對照，在第四個培養皿中加10μl的N，N-二甲基甲醯胺(DMF)作為溶劑對照，第五個培養皿加蒸餾水以作為空白對照。處理後，將培養皿在暗處於(室溫)下放置1-3天，觀察培養皿中濾紙顏色的變化。結果表明在加入底物吲哚(溶於氯仿或N，N-二甲基甲醯胺---DMF)的培養皿中，濾紙均呈藍色或有藍色斑塊(圖1中A)，而不加吲哚溶液的所有培養皿中，濾紙的顏色沒有任何變化(圖1中B)。圖1中A為加入吲哚溶液(以氯仿作為溶劑)的培養皿，圖1中B為加入10μl氯仿的培養皿。
實施例2、非(產)靛藍單子葉植物種子的體外分泌物常溫下催化合成靛藍吲哚溶液的配製同實施例1。
在培養皿(直徑9cm)中放入3層濾紙，加約4ml左右蒸餾水使濾紙充分吸溼，以濾紙表面看不到流動的水為度。將非(產)靛藍單子葉植物小麥(品種「揚麥158」和「農大170」)、水稻(品種「越富」)和玉米等(見表1)的種子分別均勻地鋪在培養皿濾紙上，蓋蓋。每次每種植物種子做5個培養皿。將含有種子的培養皿置於暗處在25℃下培養。1-2天後，90％以上的種子發芽。
當種子芽的下胚軸長到約2cm左右時(發芽後1-2天)，與實施例1一樣，隨機在第一個培養皿中滴加20μl吲哚溶液(溶劑為氯仿)以合成靛藍，第二個培養皿中滴加20μl吲哚溶液(溶劑為N，N-二甲基甲醯胺(DMF))以合成靛藍，在第三個培養皿中加20μl的氯仿作為溶劑對照，在第四個培養皿中加20μl的N，N-二甲基甲醯胺(DMF)作為溶劑對照，第五個培養皿加蒸餾水以作為空白對照。處理後，將培養皿在暗處於室溫下放置1-3天，然後觀察培養皿中濾紙顏色的變化。結果表明在加入不論是氯仿還是N，N-二甲基甲醯胺(DMF)作為溶劑的吲哚溶液的培養皿中，濾紙均呈藍色或有藍色斑塊(表1，圖2中A)，而不加吲哚溶液的所有培養皿中，濾紙的顏色沒有任何變化(表1，圖2中B)。圖2中A為加入底物吲哚溶液(以N，N-二甲基甲醯胺作為溶劑)的培養皿，圖2中B為加入20μl溶劑N，N-二甲基甲醯胺的培養皿。圖2中A和B中的三個培養皿從左至右依次為水稻、小麥和玉米。
表1、非(產)靛藍單子葉植物種子發芽體外常溫氧化吲哚生成靛藍(襯質濾紙的藍色反應)

實施例3、非(產)靛藍雙子葉植物種子的體外分泌物常溫下催化合成靛藍吲哚溶液的配製同實施例1。
在培養皿(直徑9cm)中放入3層濾紙，加約4ml左右蒸餾水使濾紙充分吸溼，以濾紙表面看不到流動的水為度。將非(產)靛藍雙子葉植物大豆(黃豆)、綠豆、豇豆、莧菜、油菜、大白菜、白蘿蔔、胡蘿蔔、芹菜、茄子、菸草和雞冠花等(見表2)的種子分別均勻地鋪在培養皿濾紙上，蓋蓋。每次每種植物種子5個培養皿。將含有種子的培養皿置於暗處在室溫下培養。
含有種子的培養皿置於暗處在室溫下培養1-2天後，90％以上的種子發芽。當種子芽的下胚軸長到約2cm左右時(發芽後2天)，與實施例1一樣，隨機在第一個培養皿中滴加50μl吲哚溶液(溶劑為氯仿)以合成靛藍，第二個培養皿中滴加50μl吲哚溶液(溶劑為N，N-二甲基甲醯胺(DMF))以合成靛藍，在第三個培養皿中加50μl的氯仿作為溶劑對照，在第四個培養皿中加50μl的N，N-二甲基甲醯胺(DMF)作為溶劑對照，第五個培養皿加蒸餾水以作為空白對照。處理後，將培養皿在暗處於室溫下放置1-3天，然後觀察培養皿中濾紙顏色的變化。結果表明在加入不論是氯仿還是N，N-二甲基甲醯胺(DMF)作為溶劑的吲哚溶液的培養皿中，濾紙均呈藍色或有藍色斑塊(表2，圖3中A)，而不加吲哚溶液的所有培養皿中，濾紙的顏色沒有任何變化(表2，圖3中B)。圖3中A為加入底物吲哚溶液(以N，N-二甲基甲醯胺作為溶劑)的培養皿，圖3中B為加入50μlN，N-二甲基甲醯胺的培養皿。圖3中A和B中的六個培養皿從左至右依次為紅莧菜、油菜、蘿蔔、西瓜、大豆和綠豆。
表2、非(產)靛藍雙子葉植物種子發芽體外常溫氧化吲哚生成靛藍(襯質濾紙的藍色反應)


實施例4、非(產)靛藍雙子葉植物種子的體外分泌物常溫下催化合成靛藍——種子發芽過程中加入吲哚吲哚標準品溶液配製方法與種子發芽方法同實施例3。
分別將含有紅莧菜(品系農大紅)、大白菜和曼陀羅等種子的培養皿置於暗處在20℃培養24小時後，可以看見有些種子開始萌芽。此時，隨機在第一個培養皿中滴加50μl吲哚溶液(溶劑為氯仿)以合成靛藍，第二個培養皿中滴加50μl吲哚溶液(溶劑為DMF)以合成靛藍，在第三個培養皿中加50μl的氯仿作為溶劑對照，在第四個培養皿中加50μl的DMF作為溶劑對照，第五個培養皿加蒸餾水以作為空白對照。處理後，將培養皿在暗處於室溫下放置1-3天，然後觀察培養皿中濾紙顏色的變化。結果表明在加入底物吲哚溶液(以氯仿或DMF作為溶劑)的培養皿中，濾紙均呈藍色或有藍色斑塊(圖4中A)，而不加吲哚溶液的所有培養皿中，濾紙的顏色沒有任何變化(圖4中B)。圖4中A為加入吲哚溶液(以氯仿作為溶劑)的培養皿，圖4中B為加入50μl氯仿的培養皿。圖4中A和B中的三個培養皿從左至右依次為大白菜、曼陀羅和紅莧菜。
實施例5、非(產)靛藍雙子葉植物種子的體外分泌物常溫下催化合成靛藍——將種子芽苗移走後加入吲哚吲哚標準品溶液配製方法與種子發芽方法同實施例3。
含有紅莧菜(品系農大紅)種子的培養皿置於暗處在室溫下培養1-2天後，90％以上的種子發芽。當種子芽的下胚軸長到約2cm左右時(發芽後1-2天)，將芽苗取出，留下濾紙。然後，隨機在第一個培養皿中滴加30μl吲哚溶液(以氯仿為溶劑)以合成靛藍，第二個培養皿中滴加30μl吲哚溶液(以DMF為溶劑)以合成靛藍，在第三個培養皿中加30μl的氯仿作為溶劑對照，在第四個培養皿中加30μl的DMF作為溶劑對照，第五個培養皿加蒸餾水以作為空白對照。處理後，將培養皿在暗處於室溫下放置1-3天，然後觀察培養皿中濾紙顏色的變化。結果表明，無論以氯仿還是以DMF為吲哚的溶劑，在加入底物吲哚溶液的培養皿中，濾紙均呈藍色或有藍色斑塊(圖5中A)，而不加吲哚溶液的所有培養皿中，濾紙的顏色沒有任何變化(圖5中B)。圖5中A為加入吲哚溶液(以DMF作為溶劑)的培養皿，圖5中B為加入50μlDMF的培養皿。
實施例6、雙子葉植物的根的體外分泌物常溫下催化合成靛藍吲哚標準品溶液配製方法同實施例3。
取紅莧菜(品系農大紅)等田間苗或室內室溫或常溫下種子芽苗的根(田間苗的根用自來水洗淨，用吸水紙吸乾表面的水)，在培養皿中充分吸溼的2-3層濾紙上切成長0.5-0.8cm的片段，培養皿加蓋後於暗處在室溫或常溫下培養1-2天。然後，隨機在第一個培養皿中滴加50μl吲哚溶液(溶劑為氯仿)以合成靛藍，第二個培養皿中滴加50μl吲哚溶液(溶劑為DMF)以合成靛藍，在第三個培養皿中加50μl的氯仿作為溶劑對照，在第四個培養皿中加50μl的DMF作為溶劑對照，第五個培養皿加蒸餾水以作為空白對照。處理後，將培養皿在暗處於室溫下放置1-3天，然後觀察培養皿中濾紙顏色的變化。結果表明田間苗的根或種子芽苗的根在加入吲哚溶液(不論以氯仿還是以DMF作為溶劑)的培養皿中，濾紙均呈藍色或有藍色斑塊(圖6)，而不加吲哚溶液的所有培養皿中，濾紙的顏色沒有任何變化。圖6示田間苗的根催化合成的靛藍。
實施例7、雙子葉植物的葉片的體外分泌物常溫下催化合成靛藍吲哚標準品溶液配製方法同實施例3。
取紅莧菜(品系農大紅)田間苗或無菌苗(試管苗)的伸展葉。田間苗的葉用自來水洗淨，用吸水紙吸乾表面的水。
將葉切成長0.3-1.5cm、寬0.2-0.5cm的長條，或者用打孔器切成直徑為0.3-0.5cm的圓盤，將其放置培養皿中充分吸溼的2-3層濾紙上，培養皿加蓋後於暗處在室溫或常溫下培養1-2天。然後，隨機在第一個培養皿中滴加50μl吲哚溶液(溶劑為氯仿)以合成靛藍，第二個培養皿中滴加50μl吲哚溶液(溶劑為DMF)以合成靛藍，在第三個培養皿中加50μl的氯仿作為溶劑對照，在第四個培養皿中加50μl的DMF)作為溶劑對照，第五個培養皿加蒸餾水以作為空白對照。處理後，將培養皿在暗處於室溫下放置1-3天，然後觀察培養皿中濾紙顏色的變化。結果表明在加入不論是氯仿還是DMF作為溶劑的吲哚溶液的培養皿中，濾紙均呈藍色或有藍色斑塊(圖7)，而不加吲哚溶液的所有培養皿中，濾紙的顏色沒有任何變化。圖7是田間苗的葉催化合成的靛藍。
實施例8、雙子葉藤本植物的葉片細胞破碎物常溫下催化合成靛藍吲哚標準品溶液配製方法同實施例3。
分別取常綠藤本植物金銀花(忍冬)和落葉藤本植物紫藤田間苗伸展葉，用自來水洗淨，再用蒸餾水清洗2-3次，用吸水紙吸乾表面的水。葉片清洗完後，迅速搗碎，放在培養皿中充分吸溼的2-3層濾紙上，培養皿加蓋後於暗處在室溫或常溫下培養1-2天。然後，隨機在第一個培養皿中滴加50μl吲哚溶液(溶劑為氯仿)以合成靛藍，第二個培養皿中滴加50μl吲哚溶液(溶劑為DMF)以合成靛藍，在第三個培養皿中加50μl的氯仿作為溶劑對照，在第四個培養皿中加50μl的DMF作為溶劑對照，第五個培養皿加蒸餾水以作為空白對照。處理後，將培養皿在暗處於室溫下放置1-3天，然後觀察培養皿中濾紙顏色的變化。結果顯示在加入底物吲哚溶液(以氯仿或DMF作為溶劑)的培養皿中，濾紙均呈藍色或有藍色斑塊(圖8)，而不加吲哚溶液的所有培養皿中，濾紙的顏色沒有任何變化。圖8為雙子葉木質藤本植物的葉片細胞破碎物催化合成的靛藍。圖中，A為金銀花(忍冬)，B為紫藤。
實施例9、雙子葉木本植物的葉片常溫下催化合成靛藍吲哚標準品溶液配製方法同實施例3。
分別取常綠木本植物大葉黃楊和落葉木本植物美國紅櫨田間苗伸展葉，用自來水洗淨，再用蒸餾水清洗2-3次，用吸水紙吸乾表面的水。葉片清洗完後，將葉切成長0.3-1.5cm、寬0.2-0.5cm的長條，或者用打孔器切成直徑為0.3-0.5cm的圓盤，將其放置培養皿中充分吸溼的2-3層濾紙上，培養皿加蓋後於暗處在室溫或常溫下培養1-2天。然後，隨機在第一個培養皿中滴加50μl吲哚溶液(溶劑為氯仿)以合成靛藍，第二個培養皿中滴加50μl吲哚溶液(溶劑為DMF)以合成靛藍，在第三個培養皿中加50μl的氯仿作為溶劑對照，在第四個培養皿中加50μl的DMF作為溶劑對照，第五個培養皿加蒸餾水以作為空白對照。處理後，將培養皿在暗處於室溫下放置1-3天，然後觀察培養皿中濾紙顏色的變化。結果表明在加入不論是氯仿還是DMF作為溶劑的吲哚溶液的培養皿中，濾紙均呈藍色或有藍色斑塊(圖9)，而不加吲哚溶液的所有培養皿中，濾紙的顏色沒有任何變化。圖中，A為大葉黃楊；B為美國紅櫨。
實施例10、植物催化體外常溫合成靛藍的提取方法1、直接提取分別將實施例1-9中顯藍色或藍色斑塊濾紙室溫自然晾乾後，剪切成碎片，分別置於氯仿溶劑或N，N-二甲基甲醯胺(DMF)中，室溫下放置以洗脫藍色物質，期間白天每隔1小時輕輕搖動3-5分鐘，以在濾紙上看不見藍色為度(一般2-12小時)。此時，溶液變成藍色。當濾紙退去藍色後，將其取出，得到合成靛藍的氯仿溶液或DMF溶液。
方法2、用甲醇漂洗後再提取將實施例1-9中顯藍色或藍色斑塊濾紙室溫自然晾乾後，剪切成大片(6-8份/張)，置於甲醇(北京化學試劑公司產品，分析純)中於室溫下漂洗1-12小時，取出濾紙，室溫下晾乾，然後剪切成碎片，分別置於氯仿溶劑或DMF中，室溫下放置以洗脫藍色物質，期間白天每隔1小時輕輕搖動3-5分鐘，以在濾紙上看不見藍色為度(一般2-12小時)。此時，溶液變成藍色。當濾紙退去藍色後，將其取出，得到合成靛藍的氯仿溶液或DMF溶液。
實施例11、植物催化體外常溫合成靛藍的分光光度計吸光譜鑑定1、標準品靛藍溶液的配製準確稱取靛藍和靛玉紅標準品(中國藥品生物製品檢定所產品)各1mg，分別定溶於50ml的氯仿(北京化學試劑公司產品，分析純)或N，N-二甲基甲醯胺(DMF，北京化學試劑公司產品，分析純)中，相應形成0.02mg/ml的標準靛藍氯仿溶液和靛藍DMF溶液，裝入棕色試劑瓶中，室溫存放，備用。
2、靛藍的分光光度計吸光譜掃描將標準品靛藍溶液(以及標準品靛玉紅溶液)和實施例1-9中所合成按照實施例10中方法1和方法2所提取的靛藍的溶液(以氯仿或DMF為溶劑)用紫外-可見光分光光度計(雙光束紫外可見分光光度計，型號TU-1901，購自北京普析通用儀器有限責任公司)在190-800nm波長範圍內以1nm為單位進行吸光掃描，相應以溶劑氯仿或DMF為空白對照。將掃描的吸光值用微軟Excell軟體作曲線圖，然後比較標準品靛藍溶液和合成靛藍的吸光譜與最大吸光波長(或波峰)。
結果表明實施例1-9中合成的所有靛藍與標準品靛藍的吸光譜與最大波峰完全一致，這也被在紫外光區和可見光區最大吸光值所肯定。由此表明，由植物器官(種子、根和葉片)催化吲哚形成的藍色物質為靛藍。圖10顯示的是以氯仿為溶劑洗脫吸附在濾紙上的紅莧菜種子發芽的分泌物催化合成的靛藍與靛藍標樣及靛玉紅標樣的吸收光譜比較；圖中，1為氯仿提取的靛藍樣品中的吸收光譜，2為靛藍標準樣品的吸收光譜，3為靛玉紅標準樣品的吸收光譜。圖11顯示的是以N，N-二甲基甲醯胺(DMF)為溶劑洗脫吸附在濾紙上的紅莧菜種子發芽的分泌物催化合成的靛藍與靛藍標樣的吸收光譜比較；圖中，4為DMF提取的合成靛藍樣品，5為DMF溶解的靛藍標準樣品。圖12顯示的是用甲醇清洗後再用DMF溶劑洗脫吸附在濾紙上的紅莧菜種子發芽的分泌物催化合成的靛藍與靛藍標樣以及甲醇洗脫物的吸收光譜比較；圖中，6為DMF溶解的靛藍標準樣品，7為甲醇清洗後，DMF提取的靛藍樣品，8為甲醇提取物。表3給出了標準品靛藍與紅莧菜種子發芽的分泌物催化吲哚形成的靛藍在不同溶劑(氯仿或DMF)經過甲醇清洗前後在紫外光區和可見光區的最大吸收峰的波長。
表3、標準品靛藍與紅莧菜種子發芽的分泌物催化吲哚形成的藍色物質的最大吸收峰波長(nm)比較

實施例12、植物催化體外常溫合成靛藍的薄層層析鑑定標準品靛藍溶液和標準品靛玉紅溶液的配製同實施例11。薄層層析所用的矽膠板為「銀龍」牌「薄層色譜矽膠預製板」(煙臺化學工業研究所產品)，尺寸10×2.5×0.25cm；質量標準魯Q/YT257-85，塗層厚度0.2mm±0.03mm，SX＝3；矽膠粉粉度8±2μm。Ph＝6.2-6.8。
在層析板的一端距離邊沿2.5cm處用鉛筆在矽膠板上輕輕劃一條線，然後用毛細管在線上點開三個小孔(直徑大約0.1mm)，分別取標準品靛藍溶液、標準品靛玉紅溶液和的樣品靛藍的溶液(實施例1-9中所合成、按照實施例10中途徑1的方法提取，以氯仿或DMF為溶劑)3-5μl，依次加入3個小圓孔中。將矽膠板置於層析缸中在室溫下進行層析(展開劑深度為1.5cm左右)，直至展開劑上升到距上邊緣1-0.5cm時，將矽膠板取出，沿展開劑所到達的最上邊緣用鉛筆輕輕劃一條直線。計算遷移率Rf＝(半點中心與原始樣點之間的距離)/(溶劑前沿與原始樣點之間的距離)，並照相保存結果。
結果顯示，用氯仿溶解靛藍標準品、靛玉紅標準品和洗脫合成的靛藍，當展開劑為苯∶氯仿∶丙酮＝5∶4∶1(體積比)[程力惠，2005，「板藍根中靛玉紅提取方法研究」，亞熱帶植物科學，34(2)46-47]時，在可見光下靛藍標樣和實施例1-9中合成的所有靛藍樣品都呈藍色扁橢圓形斑點，而靛玉紅標樣呈紫紅色扁橢圓形斑點；靛玉紅標樣的遷移率比靛藍標樣和提取靛藍樣品的低得多，而靛藍標樣和提取的靛藍樣品的遷移率相等(靛藍標準樣品Rf＝0.8013，靛玉紅標準樣品Rf＝0.4697，藍色樣品Rf＝0.8013)，見圖13A。在相同的條件下，當展開劑為氯仿∶乙醇＝9∶1(體積比)時，在可見光下靛藍標樣和實施例1-9中合成的所有靛藍樣品都呈藍色長扁橢圓形斑點，而靛玉紅標樣呈紫紅色長扁橢圓形斑點；靛藍標樣和提取的靛藍樣品的遷移率仍然相等，但靛玉紅標樣的遷移率與靛藍標樣和提取靛藍樣品遷移率的差距縮小(靛藍標準樣品Rf＝0.9615，靛玉紅標準樣品Rf＝0.9385，藍色樣品Rf＝0.9615)，見圖13B。圖13A和13B顯示的是以氯仿為溶劑洗脫吸附在濾紙上的紅莧菜種子發芽的分泌物催化合成的靛藍、與以氯仿為溶劑配製的靛藍和靛玉紅標準樣品的薄層層析圖，其中，圖13A中展開劑是苯∶氯仿∶丙酮(5∶4∶1)；圖13B中展開劑是氯仿∶乙醇(9∶1)；圖13A和13B中，從左至右依次為靛藍標準樣品、靛玉紅標準樣品與合成的靛藍。
從圖10-13B可以看出，本發明用植物器官和/或組織在體外在常溫下催化吲哚氧化形成的藍色物質與靛藍標準品的吸收光譜及其最大吸收峰波長完全一致，顏色完全相同，而且層析的遷移率相等。因此，本發明用植物器官和/或組織在體外在常溫下催化吲哚氧化形成的藍色物質的確是靛藍。從薄層層析圖(圖13A和13B)可以看出，無論用經典的展開劑(圖13A)還是用新的展開劑(圖13B)，本發明用植物器官和/或組織在體外在常溫下催化吲哚氧化形成的藍色物質與靛藍標準品一樣，都只有一個藍色的斑點，絕對不含靛玉紅等雜質。證明，本發明用植物器官和/或組織在體外在常溫下催化吲哚氧化形成的靛藍是高度純淨的靛藍。
權利要求
1.一種生物合成靛藍的方法，是利用活體植物的器官和/或組織的體外分泌物、和/或活體植物的器官和/或組織的細胞破碎物的體外分泌物作為催化劑，在體外以吲哚為底物合成靛藍。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的體外分泌物均能將吲哚氧化成吲哚酚。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於所述植物為單子葉植物與雙子葉植物；所述植物優選為陸生種子植物；尤其優選為菘藍、歐洲菘藍、蓼藍、馬藍、木藍、納塔爾木藍、野青樹、金銀花、紫藤、黃楊、紅櫨、菸草、矮牽牛、茄子、番茄、曼陀羅、油菜、大白菜、小白菜、莧菜、蘿蔔、胡蘿蔔、茴香、芹菜、西瓜、甜瓜、黃瓜、黃豆、綠豆、豌豆、豇豆、水稻、小麥、玉米、穀子、稗子和高梁；所述莧菜包括葉用和籽用的莧菜。
4.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於所述植物為菸草、油菜、莧菜、黃豆、綠豆、豌豆、蘿蔔、小麥、玉米、穀子和高梁；所述莧菜為籽用的莧菜。
5.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述植物的器官為種子和/或根和/或莖和/或葉；優選器官為種子和/或葉。
6.根據權利要求1-5中任一所述的方法，其特徵之在於所述植物種子的體外分泌物是植物種子發芽過程中分泌到體外的分泌物；該體外分泌物按照如下方法獲得將植物種子置於能夠吸水、保水且能夠吸附靛藍並且所吸附的靛藍容易被洗脫的培養襯質上進行發芽，收集所述培養襯質，得到所述植物種子發芽過程中產生的體外分泌物；所述植物根、莖和葉的體外分泌物是這些器官及其細胞破碎物在離體培養過程中分泌到體外的分泌物；該體外分泌物按照如下方法獲得將根、莖和葉切成小片段或者搗碎，置於能夠吸水、保水且能夠吸附靛藍並且所吸附的靛藍容易被洗脫的培養襯質上保溼1-5天，收集所述培養襯質，得到所述植物根、莖和葉及其細胞破碎物的體外分泌物。
7.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於所述培養襯質為吸水紙或濾紙。
8.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於所述活體植物的器官和/或組織的體外分泌物、和/或活體植物的器官和/或組織的細胞破碎物的體外分泌與吲哚按照如下方法混合將吲哚溶液加到所述培養襯質上。
9.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述反應溫度為10-37℃，反應時間為1-6天。
10.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於所述吲哚溶液是將吲哚溶解於氯仿或者N，N-二甲基甲醯胺等有機溶劑中，優選溶劑為氯仿或者N，N-二甲基甲醯胺。
全文摘要
本發明公開了一種生物合成靛藍的方法。該方法是利用活體植物的器官和/或組織的體外分泌物、和/或活體植物的器官和/或組織的細胞破碎物的體外分泌物作為催化劑，在體外以吲哚為底物合成靛藍。利用該方法合成靛藍不需要任何特殊的和專門的儀器和設備，操作極其簡單方便，並且不產生任何汙染物。所合成的靛藍很容易用常規方法提取，純度高，幾乎不需要再純化。此外，作為催化劑的植物器官，在完成催化後仍然可以作為食物(可食用植物)或工業原料(非可食用植物)利用。
文檔編號C09B61/00GK1970642SQ20061011448
公開日2007年5月30日 申請日期2006年11月10日 優先權日2006年11月10日
發明者肖興國, 劉建兵, 袁利娟, 高兆建, 韓曉紅 申請人:中國農業大學