針對腦膜炎的防衛素的用途的製作方法

2023-05-14 16:36:31

專利名稱：針對腦膜炎的防衛素的用途的製作方法
針對腦膜炎的防衛素的用途
對序列表的引用
本申請包含計算機可讀形式的序列表。該計算機可讀形式通過提述併入本文。
發明背景發明領域
本發明涉及以防衛素多肽治療腦膜炎。
背景
腦膜炎是覆蓋中樞神經系統的保護性膜(合稱腦膜)的炎症。腦膜炎可對一些 原因(最重要的是細菌和病毒)反應而發生。由於發炎鄰近腦和脊髓，腦膜炎為一種潛在 嚴重的病症。嚴重神經損害或甚至死亡的可能性使得迅速醫療關注和評價成為必需。細 菌性腦膜炎通常以抗生素治療且需要密切觀察。多種微生物可引起細菌性腦膜炎，而肺炎 鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)( 「月市炎球菌(pneumococcus)，，)禾口腦膜炎奈瑟氏菌 (Neisseria meningitidis)(「腦膜炎球菌(meningococcus) 」)是在無免疫缺陷的患者中最 常見的病原體。細菌性腦膜炎對全球健康而言是嚴重的威脅，其是每年全世界估計171000 例死亡的原因。
肺炎鏈球菌在幼兒中造成侵入性細菌性感染的原因的流行生物。在患有肺炎球菌 腦膜炎的兒童中死亡率為患腦膜炎球菌性腦膜炎中的至少兩倍高且倖存者後遺症的發生 率最高。最近的研究報導了來自大部分歐洲國家在年齡小於5歲的兒童中肺炎球菌腦膜炎 的發生率的數據。整體而言，最低發生率被報導在芬蘭(0. 3/100000)而最高發生率被報導 在法國(12.0/100000)。青黴素抗性肺炎球菌常常為多重抗性，因此對治療造成嚴重的問 題。對大環內酯類(macrolides)的抗性也為普遍的，且在地中海地區特別高。
本發明的一個目標在於提供能夠穿過血腦屏障的多肽，以及使用這些多肽治療腦 膜炎的方法。發明內容
我們現已發現合成的防衛素顯示針對肺炎球菌腦膜炎的優異的活性，且可用於治 療細菌性腦膜炎。
在第一方面，本發明提供具有抗微生物活性的多肽在製備用於治療(therapeutic treatment)腦膜炎的藥物的用途，所述多肽包含與SEQ ID NO 1的胺基酸序列具有至少 90%同一性的胺基酸序列。
在第二方面，本發明提供具有抗微生物活性的多肽，其用於治療腦膜炎，所述包含 與SEQ ID NO 1的胺基酸序列具有至少90%同一性的胺基酸序列。
在另一方面，本發明提供治療腦膜炎的方法，其包括將有效量的(例如抗腦膜炎 有效量的)具有抗微生物活性的多肽施用於需要所述治療的受試者，所述多肽包含與SEQ ID NO 1的胺基酸序列具有至少90%同一性的胺基酸序列。
在一個實施方案中，該多肽為防衛素多肽，優選β-防衛素多肽。在另一個實施方案中，該多肽能夠穿過血腦屏障。
根據本發明的腦膜炎可為細菌性腦膜炎，優選肺炎球菌腦膜炎，例如由鏈球菌屬 (Streptococcus)，優選肺炎鏈球菌引起的腦膜炎。在一個優選的實施方案中，腦膜炎由青 黴素抗性肺炎鏈球菌引起。
根據本發明使用的多肽或根據本發明用於治療腦膜炎的多肽以下稱為「(根據) 本發明的多肽」。
本發明的詳細描述
定義
抗微生物活性術語「抗微生物活性」於本文定義為一種能夠殺死微生物細胞或抑 制微生物細胞生長的活性。在本發明的上下文中，術語「抗微生物的」系意欲意指有殺細菌 的和/或抑制細菌的和/或殺真菌的和/或抑制真菌的效果和/或殺病毒的效果，其中術 語「殺細菌的」應被理解為能夠殺死細菌細胞。術語「抑制細菌的」應被理解為能夠抑制細 菌的生長，即抑制生長的細菌細胞。術語「殺真菌的」應被理解為能夠殺死真菌細胞。術語 「抑制真菌的」應被理解為能夠抑制真菌生長，即抑制生長的真菌細胞。術語「殺病毒的」應 被理解為能夠使病毒失活。術語「微生物細胞」代表細菌或真菌細胞(包括酵母)。
在本發明的上下文中，術語「抑制微生物細胞的生長」意欲指細胞處於非生長狀 態，即它們不能繁殖。
在一個優選的實施方案中，術語「抗微生物活性」系定義為殺細菌的和/或抑制細 菌的活性。更優選地，「抗微生物活性」定義為針對鏈球菌屬(優選肺炎鏈球菌)的殺細菌 的和/或抑制細菌的活性。
就本發明而言，抗微生物活性可根據由Lehrer等，Journal of Immunological methods, Vol. 137 (2) pp. 167-174(1991)所述的方法測定。或者，抗微生物活性可根據來自 CLSI (臨床和實驗室標準學會(Clinical and Laboratory Standards Institute)；之前 稱為國家臨床與實驗室標準委員會(National Committee of Clinical and Laboratory Standards))的 NCCLS 指南測定。
將具有抗微生物活性的多肽以濃度為500 μ g/ml ；優選濃度為250 μ g/ml ；更優選 濃度為100 μ g/ml ；甚至更優選濃度為50 μ g/ml ；最優選濃度為25 μ g/ml ；且特別是濃度 為10 μ g/ml的具有抗微生物活性的多肽在相關微生物生長底物中於37°C溫育8小時後 (優選4小時後，更優選2小時後，最優選1小時後，且特別是30分鐘後)可將肺炎鏈球菌 (ATCC 49619)的活細胞數目減少至1/100。
具有抗微生物活性的多肽當以500 μ g/ml的濃度加入；優選當以250 μ g/ml的濃 度加入；更優選當以100 μ g/ml的濃度加入；甚至更優選當以50 μ g/ml的濃度加入；最優 選當以10 μ g/ml的濃度加入；以及特別是當以5 μ g/ml的濃度加入時，在相關微生物生長 底物中於37°C也可將肺炎鏈球菌(ATCC 49619)的長出(outgrowth)抑制8小時。
本發明的多肽具有至少20 %，優選至少40 %，更優選至少50 %，更優選至少60 %， 更優選至少70 %，更優選至少80 %，甚至更優選至少90 %，最優選至少95 %，且甚至最優選 至少100%的由SEQ ID NO 1的胺基酸序列組成的多肽的抗微生物活性。
防衛素(Defensin)術語「防衛素」用於本文意指本領域的技術人員所識別為屬 於抗微生物肽的防衛素類的多肽。為確定一種多肽是否為根據本發明的防衛素，其胺基酸序列優選通過使用可自由得到的HMMER軟體包，與PFAM資料庫的隱藏馬爾科夫模型譜 (hidden markov model profile) (HMM 譜(HMM profile))比較(參見實施例 1)。
PFAM防衛素家族包括防衛素1或「哺乳類防衛素」(登錄號PF00323)、防衛素2或 「節肢動物防衛素」(登錄號PF01097)、防衛素β或「β防衛素」(登錄號PF00711)、防衛 素_propep或「防衛素前肽」(登錄號PF00879)與γ-硫堇(gamma-thionin)或「 γ -硫堇 家族」(登錄號PF00304)。
防衛素可屬於α -防衛素類、β -防衛素類、θ -防衛素類、昆蟲或節肢動物防衛素 類、或植物防衛素類。
在一個實施方案中，根據本發明的防衛素的胺基酸序列包含4、5、6、7、或8個半胱 氨酸殘基，優選4、5、或6個半胱氨酸殘基、更優選4或6個半胱氨酸殘基、且最優選6個半 胱氨酸殘基。
防衛素也可為享有任何防衛素類的特性特徵的合成防衛素。
這樣的防衛素的實例包括(但不限於)α-防衛素ΗΝΡ-1(人中性粒細胞 肽)、ΗΝΡ-2 與 ΗΝΡ-3 ； β -防衛素-12、Drosomycin, Heliomicin, γ 1-嘌呤硫堇 (Yl-purothionin)、昆蟲防衛素 Α、和 PCT 申請 WO 99/53053,WO 02/06324,WO 02/085934、 WO 03/044049, WO 2006/050737 和 WO 2006/053565 中所公開的防衛素。
分離的多肽術語「分離的變體」或「分離的多肽」用於本文指自來源分離的變體 或多肽。在一方面，該變體或多肽為至少純的，優選至少系5%純的，更優選至少10% 純的，更優選至少20 %純的，更優選至少40 %純的，更優選至少60 %純的，甚至更優選至少 80 %純的，且最優選至少90 %純的，如通過SDS-PAGE所測定的。
基本上純的多肽術語「基本上純的多肽」於本文代表一種多肽製備物，其含有以 重量計至多10 %，優選至多8 %，更優選至多6 %，更優選至多5 %，更優選至多4 %，更優選 至多3 %，甚至更優選至多2 %，最優選至多1 %，且甚至最優選至多0. 5 %的與其天然或重 組結合的其它多肽材料。因此，優選地，基本上純的多肽按該製備物中存在的總多肽材料的 重量計為至少92 %純的，優選至少94 %純的，更優選至少95 %純的，更優選至少96 %純的， 更優選至少96%純的，更優選至少97%純的，更優選至少98%純的，甚至更優選至少99% 純的，最優選至少99. 5%純的，且甚至最優選100%純的。本發明的多肽優選處於基本上純 的形式。這可以通過以公知的重組方法或以經典的純化方法製備該多肽來完成。
同一性兩個胺基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的相關性通過參數「同一性」 描述。
就本發明而言，兩個胺基酸序列之間的同一性程度使用如於EMBOSS包(EMBOSS 歐洲分子生物開放軟體組(The European Molecular Biology Open Software Suite)， Rice 等，2000，Trends in Genetics 16 :276-277 ;http://emboss, org)的 Needle 程序， 優選3. 0. 0或更晚版本中所執行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970， J. Mol. Biol. 48 :443-453)來確定。所使用的任選參數為缺口開放罰分(gap open penalty) 為10，缺口延伸罰分為0. 5，和EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版本)取代矩陣。使用標記 為「最長同一性」的Needle的輸出(使用-nobrief選項獲得)作為百分比同一性並計算 如下
(相同的殘基X100)/(比對的長度-比對中缺口的總數)
就本發明而言，兩個脫氧核糖核苷酸序列之間的同一性程度使用如於EMBOSS包 (EMBOSS 歐洲分子生物開放軟體組(The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice 等，2000，如上；http://emboss, org)的 Needle 程序，優選 3. 0. 0 或更晚版本 中所執行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，如上)測定。所使用的任 選參數為缺口開放罰分10，缺口延伸罰分0. 5，和EDNAFULL (NCBI NUC4. 4的EMBOSS版本) 取代矩陣。使用標記為「最長同一性」的Needle的輸出(使用-nobrief選項獲得)作為 百分比同一性並計算如下
(相同的脫氧核糖核苷酸X100)/(比對的長度-比對中缺口的總數)。
等位變體術語「等位變體」在本文中表示佔據相同染色體基因座的基因的任何兩 種或兩種以上可選形式。等位變異通過突變天然地發生，並且可導致種群內的多態性。基因 突變可以是沉默的(在編碼的多肽中無變化)或可以編碼具有改變的胺基酸序列的多肽。 多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。
修飾術語「修飾」在本文的意思是，對由SEQ ID NO 1的胺基酸序列組成的多肽 或其同源序列的任何化學修飾，以及對編碼所述多肽的DNA的遺傳操作。所述修飾可以是 一個或多個(數個)胺基酸的取代、缺失和/或插入，以及一個或多個(數個)胺基酸側鏈 的置換；或在胺基酸序列中使用具有相似特徵的非天然胺基酸。特別地，修飾可為醯胺化， 例如C-端的醯胺化。
具有抗微生物活性的多肽
在第一方面，本發明涉及具有與SEQ ID NO :1( S卩，成熟多肽)有至少80%，優選 至少85%，更優選至少90%，最優選至少95%，且特別地至少97%同一性程度的胺基酸序 列的分離的多肽，其具有抗微生物活性(以下稱「同源多肽」)。在一個優選的方面，同源多 肽具有與SEQ ID NO :1的胺基酸序列相差至多六個胺基酸，優選至多五個胺基酸，更優選至 多四個胺基酸，甚至更優選至多三個胺基酸，最優選至多兩個胺基酸，且特別地是一個氨基 酸的胺基酸序列。
本發明的多肽優選包含SEQ ID NO=I的胺基酸序列或其等位變體。在一個優選的 方面，多肽包含SEQ ID NO :1的胺基酸序列。在另一個優選的方面，多肽由SEQ ID N0:1的 胺基酸序列或其等位變體組成。在另一個優選的方面，多肽由SEQ ID NO :1的胺基酸序列 組成。
優選地，胺基酸改變對性質是較不重要的(of a minor nature)，即保守的胺基酸 取代或插入，其不顯著影響蛋白質的摺疊和/或活性；單缺失；小的氨基-或羧基-末端 延伸；多至大約20-25個殘基的小接頭肽；或通過改變淨電荷或其它功能來促進純化的小 延伸，如多組氨酸標籤(poly histidine tag)、抗原表位(antigenic印itope)或結合域 (binding domain)。
保守取代的實例是在以下組之內鹼性胺基酸組(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、 酸性胺基酸組(穀氨酸和天冬氨酸)、極性胺基酸組(穀氨醯胺和天冬醯胺)、疏水性氨 基酸組(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族胺基酸組(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小 胺基酸組(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變比活性(specific activity)的胺基酸取代是本領域已知的，並且由例如H. Neuratt^PR. L. Hill, 1979，於The Proteins, Academic Press, New York 中描述。最普遍發生的交換是 Ala/^er、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser,Ala/Gly,Ala/Thr,Ser/Asn,Ala/Val、Ser/Gly,Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/ Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu 禾口 Asp/Gly。
除了 20個基本胺基酸，非基本胺基酸(如4-羥脯氨酸、6-N-甲基賴氨酸、2_氨基 異丁酸、異纈氨酸和α-甲基絲氨酸)可以取代野生型多肽的胺基酸殘基。有限數量的非 保守胺基酸、不由遺傳密碼編碼的胺基酸和非天然胺基酸可以取代胺基酸殘基。「非天然氨 基酸」在蛋白質合成後已經過修飾，和/或在它們的側鏈具有不同於基本胺基酸的化學結 構。非天然胺基酸能夠以化學方法合成，並且優選是商業上能夠獲得的，包括六氫吡啶羧酸 (pipecolic acid)、噻唑燒羧酸(thiazolidine carboxylic acid)、脫氫脯氨酸、3-和4-甲 基脯氨酸，和3，3- 二甲基脯氨酸。
能夠根據本領域已知的方法，例如定位誘變或丙氨酸分區誘變法(Cunningham 和Wells，1989，Science M4 :1081-1085)來鑑定親本多肽中的必需胺基酸。在後一技術 中，將單一丙氨酸突變引入到分子中的每個殘基，並且測試所得突變分子的生物活性(即， 抗微生物活性)以鑑定對於所述分子的活性關鍵的胺基酸殘基。同樣參見Hilton等， 1996，J.Biol. Chem. 271 =4699-47080生物相互作用也能夠通過結構的物理分析而測定， 如通過以下這些技術如核磁共振、晶體學、電子衍射或光親和標記，連同推定的接觸位點 胺基酸的突變來測定。參見例如de Vos等，1992，Science 255 :306-312 ;Smith等，1992， J. Mol. Biol. 224 :899-904 ；Wlodaver 等，1992，FEBS Lett. 309 :59_64。必需胺基酸的身份 (identity)也能夠從與多肽的同一性分析來推斷，所述多肽與根據本發明的多肽相關。
能夠使用已知的誘變、重組和/或改組(shuffling)方法，然後是有關的篩選方 法，例如那些由 Reidhaar-Olson 禾Π Sauer, 1988，Science 241 :53-57 ；Bowie 禾Π Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 :2152-2156 ；WO 95/17413;或 WO 95/22625 公開的那 些方法來進行並測試單個或多個胺基酸取代。能夠使用的其它方法包括易錯PCR、噬菌 體展示(例如，Lowman 等，1991，Biochem. 30 :10832-10837 ；美國專利 No. 5，223，409 ；WO 92/06204)和區域定向的誘變(Derbyshire 等，1986，Gene 46 :145 ；Ner 等，1988，DNA 7 127)。
誘變/改組方法能夠與高通量、自動化的篩選方法組合以檢測由宿主細胞表達的 克隆的、誘變的多肽的活性。能夠從宿主細胞回收編碼活性多肽的誘變的DNA分子，並且使 用本領域內標準方法快速測序。這些方法允許快速測定感興趣的多肽中單個胺基酸殘基的 重要性，並且能夠應用於未知結構的多肽。
在一個優選的實施方案中，本發明的多肽為防衛素多肽，優選防衛素多肽。
N-端延伸
本發明的多肽的N-端延伸可適當地由1至50個胺基酸，優選2-20個胺基酸，尤 其是3-15個胺基酸組成。在一個實施方案中，N-端肽延伸不包含Arg(R)。在另一個實施 方案中，N-端延伸包含kex2或kex2_樣切割位點，如在下文進一步定義的。在一個優選的 實施方案中，N-端延伸為肽，其包含至少兩個Glu (E)和/或Asp (D)胺基酸殘基，如包含以 下序列之一的N-端延伸EAE、EE、DE和DD。
Kex2 位點
Kex2位點(參見，例如，Methods in Enzymology Vol 185，D. Goeddel編，Academic Press Inc. (1990), San Diego, CA, "Gene Expression Technology，，)禾口 kex2_ 樣位點為在一些蛋白質的前肽編碼區和成熟區之間存在的二元的(dibasic)識別位點(即，切割位點)ο
插入kex2位點或kex2_樣位點已在某些情況中顯示改進於前肽切割位置的正確 內肽酶加工，導致蛋白質分泌水平增加。
在本發明的上下文中，插入kex2或kex2_樣位點導致在N-端延伸中某個位置處 獲得切割的可能性，造成抗微生物的多肽與SEQ ID NO :1中所示的成熟多肽相比得到延長。
融合的多肽
本發明的多肽也包括融合的多肽或可切割的融合多肽，其中另一個多肽被融合於 本發明的多肽或其片段的N-端或C-端。通過將編碼另一個多肽的核苷酸序列(或其部 分)融合於本發明的核苷酸序列(或其部分)來產生融合的多肽。產生融合多肽的技術是 本領域已知的，並包括連接編碼多肽的編碼序列以使它們在閱讀框中，並且使融合的多肽 的表達在相同啟動子和終止子的控制下。
方法和用途
本發明涉及本發明的多肽用於治療腦膜炎之用途。因此，本發明的多肽可用作為 抗微生物的獸用或人用治療劑或預防劑。因此，本發明的防衛素變體可用於製備供治療腦 膜炎之用的獸用或人用治療劑或預防劑。
本發明的多肽可以足以殺死鏈球菌屬菌種(如肺炎鏈球菌)或抑制鏈球菌屬菌種 (如肺炎鏈球菌)生長的量使用。
本發明的多肽的配製物被施用於患有(suffering from)或易感染(predisposed to)腦膜炎(如細菌性腦膜炎，例如肺炎球菌腦膜炎)的宿主。在一個實施方案中，腦膜炎 由青黴素抗性肺炎鏈球菌感染引起。
施用可為局部的或全身的(systematic)。一般而言，本發明的抗微生物多肽的劑 量會足以通過至少1 log，且可為2個以上log的致死而將微生物群體減少。本發明的多肽 系以減少微生物群體同時最小化任何副作用的劑量施用。期望的是獲得組合物並在醫師的 指導下使用以用於體內用途。
可採用多種施用方法。多肽配製物可口服給予，或可血管內、肌肉內、皮下、腹膜注 射、通過氣溶膠、眼部(opthalmically)、膀胱內、局部等方式施用。治療配製物的劑量變化 會很大，取決於待施用的特定抗微生物多肽、施用的頻率、施用的方式、藥劑自宿主的清除 等。初始劑量可較大，然後為較小的維持劑量。在許多情況中，口服施用會需要比靜脈內 施用更高的劑量。醯胺鍵，以及氨基與羧基端，可進行修飾以在口服施用時具有較大的穩定 性。例如，羧端可經醯胺化。
配製物
本發明的多肽可併入多種配製物中用於治療施用。更具體地，本發明的多肽可通 過與適合的、醫藥上可接受的載體或稀釋劑組合而配製成藥物組合物，且可配製成固體、半 固體、液體或氣體形式的製備物，如片劑、膠囊、粉末、顆粒(granules)、軟膏(ointment)、 乳霜(cream)、泡沫、溶液、栓劑、注射劑、吸入劑、凝膠、微球、洗劑(lotion)和氣溶膠。 按原樣，多肽的施用可以多種方式實現，其包括口服施用、頰施用、直腸施用、非消化道 (parenteral)施用、腹膜內施用、皮內施用、透皮施用、氣管內施用等。本發明的抗微生物多 肽在施用後可為全身性或可為局部化的。
本發明的多肽可單獨施用、彼此組合施用、或它們可與其它已知化合物(例如，穿 孔素(perforin)、抗炎劑、抗生素等)組合使用。在醫藥劑型中，多肽可以其醫藥上可接受 的鹽的形式施用。以下方法與賦形劑僅為例示性的而非以任何方式限制。
對於口服製備物，多肽可單獨使用或與適合的添加劑組合以製造片劑、粉末、顆 粒或膠囊，例如，與常規的添加劑，如乳糖、甘露醇、玉米澱粉或馬鈴薯澱粉組合；與粘合劑 (binder)，如結晶纖維素、纖維素衍生物、阿拉伯樹膠(acacia)、玉米澱粉或明膠組合；與 崩解劑，如玉米澱粉、馬鈴薯澱粉或羧甲基纖維素鈉組合；與潤滑劑，如滑石或硬脂酸鎂組 合；以及如果需要，與稀釋劑、緩衝劑、溼潤劑、防腐劑和調味劑結合。
多肽可通過將它們溶解、懸浮、或乳化於水性或非水性溶劑(例如植物油或其它 類似的油、合成的脂肪酸甘油酯、高級脂肪酸的酯或丙二醇)中，以及如果需要，與常規的 添加劑(例如增溶劑、等張劑、懸浮劑、乳化劑、穩定劑和防腐劑)結合，而配製成用於注射 的製備物。
多肽可用於氣溶膠配製物中以經由吸入施用。本發明的多肽可配製成加壓的可接 受推進劑中，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等。
此外，多肽可通過與多種基底(base)(例如乳化基底或水溶性基底)混合而制 成栓劑。本發明的多肽可經由栓劑而直腸施用。栓劑可包括媒介物，例如可可脂、碳蠟 (carbowax)和聚乙二醇，其在體溫融化，但在室溫固化。
可提供用於口服或直腸施用的單位劑型，如糖漿、酏劑和懸浮劑，其中每個劑量單 位，例如茶匙量、湯匙量、片劑或栓劑)包含預定量的組合物，所述組合物包含一種或多種 本發明的多肽。類似的，用於注射或靜脈內施用的單位劑型可包含組合物中的本發明的多 肽，而該組合物作為無菌水、一般鹽水或另一個醫藥上可接受的載體中的溶液。
用於持續釋放配製物的移植物是本領域中公知的。移植物以生物可降解的或非生 物可降解的聚合物配製成微球、平板(slab)等。例如，乳酸和/或乙醇酸的聚合物形成可 侵蝕性聚合物，其可良好地被宿主所容忍。包含本發明的抗微生物多肽的移植物置於接近 感染的位點，使得活性劑的局部濃度相對於身體的其餘部分增加。
用於本文，術語「單位劑型」意指物理上地分開的單位，其適合作為用於人和動 物受試者的單元劑量，每個單元包含預定量的本發明的多肽，該量經計算為足夠產生期望 效果的量，所述多肽與醫藥上可接受的稀釋劑、載體或媒介物組合。本發明的單位劑型的 規格取決於所採用的特定多肽和待實現的效果、以及在宿主中與多肽相關的藥效動力學 (pharmacodynamics)0
醫藥上可接受的賦形劑，如媒介物、佐劑、載體或稀釋劑，是公眾容易獲得的。此 外，醫藥上可接受的輔助物質，如PH調整與緩衝劑、張度調節劑(tonicity adjusting agent)、穩定劑、潤溼劑等，是公眾容易獲得的。
用於全身性施用的通常劑量的範圍為0. Ipg至100毫克每公斤受試者重量每次 施用。通常劑量可為每天服用二到六次每次一片，或每天服用一次每次一顆延時-釋放的 (time-release)膠囊或片劑，且包含成比例更高含量的活性成分。延時-釋放效果可通過 在不同PH值溶解的膠囊材料、通過由於滲透壓緩慢釋放的膠囊、或通過任何其它已知的控 制釋放方法而獲得。
本領域的技術人員容易理解的是劑量水平可作為特定多肽、症狀的嚴重性、受試者對副作用的敏感性的函數而變化。一些特定多肽比其它更有潛力。用於給定多肽的優選 劑量可由本領域的技術人員通過多種手段容易地確定。一個優選的手段為測量給定多肽的 生理潛力(physiological potency)。
使用脂質體作為遞送媒介物是一種所關注的方法。脂質體與目標位置的細胞融合 並將內腔的內容物在細胞內遞送。維持脂質體與細胞接觸一段足夠融合的時間，其使用多 種方法以維持接觸，如分離、結合劑等。在本發明的一個方面，脂質體經設計以氣溶膠化用 於肺部施用。脂質體可以介導膜融合的純化蛋白質或肽(如，仙臺病毒或流感病毒等)制 備。脂質可為已知的脂質體形成性脂質的任何有用組合，包括陽離子脂質或兩性離子脂質， 如磷脂醯膽鹼。剩下的脂質通常為中性或酸性脂質，如膽固醇、磷脂醯絲氨酸、磷脂醯甘油寸。
為了製備脂質體，可使用Kato等(1991) J. Biol. Chem. 266 :3361所描述的方法。 簡言之，脂質與包含肽的內腔組合物在適合的水性介質(方便地為鹽水介質)中組合，其中 總固體在大約1-10重量百分比的範圍內。在短時間(大約5-60秒)激烈地攪動後，將管 子置於溫水浴(大約25-40°C )並重複此循環大約5-10次。然後對組合物進行聲處理一段 方便的時間(一般大約1-10秒)並可進一步通過漩渦震蕩而攪動。然後通過加入水性介 質擴增體積，一般將體積增加大約1-2倍，然後搖動並冷卻。此方法允許將高分子量分子並 入內腔中。
具有其它活性劑的配製物
為了用於本方法，本發明的抗微生物多肽可與其它醫藥活性劑(特別是其它抗 微生物劑)一起配製。所關注的其它藥劑包括廣大範圍的抗生素，如於技術領域中已 知的。抗生素的類型包括青黴素類，例如青黴素G、青黴素V、甲氧西林(methicillin)、 苯唑西林(oxacillin)、羧苄西林(carbenicillin)、萘夫西林(nafcillin)、氨苄青黴 素等；青黴素類與β -內醯胺酶抑制劑、頭胞菌素的組合，例如頭孢克洛(cefaclor)、頭 孢唑林(cefazolin)、頭孢呋辛(cefuroxime)、拉氧頭孢(moxalactam)等；碳青黴烯類 (carbapenems)；單醯胺菌素類(moncAactams)；氨基糖苷類；四環素類；大環內酯類；林可 黴素類；多粘菌素類；磺胺類；喹諾酮類(quinolones)；氯黴素(cloramphenical)；甲硝唑 (metronidazole)；大觀黴素；甲氧節唆(trimethoprim)；萬古黴素等。
抗黴菌劑(包括多烯類，例如兩性黴素B (amphotericin B)、制黴菌素； 5-flucosyn ；以及唑類，例如咪康唑(miconazol)、酮康唑(ketoconazol)、伊曲康 唑(itraconazol)與氟康唑(f luconazol))也是有用的。抗結核藥物包括異煙胼 (isoniazid)、乙胺丁醇(ethambutol)、鏈黴素和利福平(rifampin)。細胞因子(例如幹擾 素Y、腫瘤壞死因子α、白介素12等)也可包括於本發明的抗微生物多肽的配製物中。
體外合成
本發明的多肽可通過體外合成使用如本技術領域中已知的方便方法製備。多種商 業合成設備(例如Applied Biosystems Inc.，Beckman的自動化合成儀等)是可獲得的。 通過使用合成儀，可以非天然胺基酸(特別是D-同型異構物(或D-型)，例如D-丙氨酸 與D-異亮氨酸、非對映異構物、具有不同長度或官能團的側鏈等)取代天然存在的胺基酸。 製備的特定順序與方式可通過方便性、經濟性、所需純度等確定。
可將化學結合提供給多種肽或蛋白質，其包括方便的用於鍵合的官能團，如用於醯胺或取代的胺(例如還原性胺化)形成的氨基、用於硫醚或雙硫鍵形成的硫醇基、用於醯胺形成的羧基等。
如果需要，可在合成過程中或在表達過程中將多個基團(其允許結合至其它分子 或結合至表面)導入至肽中。因此，可使用半胱氨酸以製造硫醚、使用組氨酸以連結於金屬 離子複合物、使用羧基以形成醯胺或酯、使用氨基以形成醯胺等。
多肽也可根據常規的重組合成方法而分離和純化。可製備表達宿主的裂解物，而 該裂解物使用HPLC、排阻層析、凝膠電泳、親和層析、或其它純化技術純化。一般來說，所使 用的組合物會包含按重量計至少20%的期望產物，更通常按重量計至少大約75%，優選按 重量計至少大約95 %，以及為了治療目的，通常按重量計至少大約99. 5 %，其系相對於與 產物的製備及其純化方法有關的汙染物而言。通常，百分比會基於總蛋白質。
通過以下實施例進一步描述本發明，且所述實施例不應被理解為限制本發明的範 圍。實施例
實施例1
#用來自PFAM資料庫的HMMf件以鑑定防下.素
可在網際網路上在線或在本地於計算機上，使用公知的HMMER可自由得到的軟體 包，使用隱藏馬爾科夫模型譜進行序列分析。目前的版本是HMMER 2.3.2，2003十月。
HMM譜可獲得自公知的PFAM資料庫。目前的版本是PFAM 16. 0,2004 i^一月。對 於所有平臺，HMMER與PFAM兩者皆可得自(例如)美國華盛頓大學聖路易斯分校醫學院 (Washington University in St. Louis(USA), School of Medicine)(http://pfam. wustl. edu 禾口 http://hmmer. wustl. edu)。
若查詢胺基酸序列(或其片段)屬於以下五個PFAM家族之一，則該胺基酸序列是 根據本發明的防衛素
-防衛素或「β防衛素」登錄號PF00711；
-防衛素_prop印或「防衛素前肽」登錄號PF00879；
-防衛素_1或「哺乳動物防衛素」登錄號PF00323；
-防衛素_2或「節肢動物防衛素」登錄號PF01097；
-γ-硫堇或「γ -硫堇家族」登錄號PF00304。
當在線使用PFAM資料庫時，或當hmmpfam程序(來自HMMER軟體包)在本地使用 時，若胺基酸序列產生大於0. 1的E-值和大於或等於零的分數，根據本發明，其屬於PFAM家族。
當序列分析使用hmmpfam程序在本地進行時，需要自PFAM資料庫獲得(下載) HMM譜。每個家族存在兩個譜；用於全局搜索的XXX_ls.hmm，以及用於局部搜索的xxx_ fs.hmm( 「XXX」系家族的名稱)。這使以上提及的五個家族共有十個譜。
此十個譜可獨立地使用，或可結合(附加)成單譜(使用文本編輯器-該譜為 ASCII文件)，其可被命名為(例如Wefensin.hmm。然後可使用以下命令行評估查詢氨基 酸序列
hmmpfam-E 0. ldefensin. hmm sequence_file
-其中「Sequence_file」是文件，其具有可由HMMER軟體包識別的任何格式的查詢胺基酸序列。
若分數大於或等於零(0.0)，且E-值大於0. 1，查詢序列是根據本發明之防衛素。
PFAM 資料庫進一步描述於 Bateman 等 Q004) "The Pfam Protein Families Database，，，Nucleic Acids Research, Vol. 32 (Database Issue) pp. D138-D141。
實施例2
研究在腦臘炎i寸蔣中合成的防下.素的CSF穿誘禾Π殺細菌效果
將青黴素抗性血清型9V肺炎鏈球菌的分離物(1395)，其原始分離自患有 腦膜炎的78歲年長女性的CSF，用於腦膜炎模型中。此菌株先前被用於評估使用 Moxifloxacin(莫西沙星)治療腦膜炎的有效性(參見Ostergaard等「Evaluation of moxifloxacin, a new 8-methoxyquinolone, for treatment of meningitis caused by a penicillin-resistant pneumococcus in rabbits，，， Antimicrob Agents Chemother, vol. 42(7)，pp.1706-1712(1998))。
該菌株的毒性通過將細菌通過小鼠腹膜炎模型繼代而增強。使來自取樣的腹膜流 體的細菌在血液瓊脂板上生長，回收並以加入10%甘油的牛肉湯(beef-broth)稀釋與冷 凍在_80°C。
解凍細菌等分試樣並生長在血液瓊脂板上，懸浮在無菌牛肉湯中以達到在MOnm 的3. 5光學密度，並隨後稀釋以獲得最終濃度為1-2 X 106CFU/ml。
用於實驗的合成防衛素為具有SEQ ID NO :1所示的胺基酸序列的多肽。在實施例 中，此合成的防衛素稱為「Meningicin」。Meningicin針對肺炎鏈球菌(1395)的最小抑制 濃度(minimium inhibitory concentration, MIC)測定為 0· 25 μ g/ml。
在功效研究中，將Meningicin在清除腦膜感染中的有效性與頭孢曲松 (Ceftriaxone，其為頻繁用於治療患有青黴素抗性菌株的肺炎球菌腦膜炎的患者的抗生 素)的有效性和不給予治療(「媒介物」)的效果比較。頭孢曲松針對肺炎鏈球菌(1395) 的MIC測定為0. 5μ g/ml。
腦膜炎模型
將重量約2500g的雄性紐西蘭白兔用於實驗中。兔子於實驗1-2周前到達實驗室 (facilities)以允許適應。將它們放在以乾草覆蓋的單獨籠子中並無限制提供食物和水。 實驗室有獸醫專家，且實驗設計由當地的動物法規委員會批准。
為了固定在立體定位頭架(stereotactic frame)中的準備
將兔子稱重並以多美康(dormicum)O. 5ml/kg(咪達唑侖(midazolam) 5mg/ml)皮 下注射(s. c.)和在10分鐘後以hypnorm 0. 35ml/kg (檸檬酸芬太尼(fentanylcitrat) + 氟阿尼酮(fluanison))肌肉注射(i. m.)麻醉。
將兔子的耳朵、頭皮和頸部刮毛並將皮膚消毒。在兔子的前額上製造大小大約km 的切口並將頭皮通過鈍剝離(blunt dissection)暴露。製造界定一個正方形的4個鑽孔 並以直角將4個螺釘擰到表面上O. 5至3轉)。從牙科鑄造材料直接將丙烯酸酯類盔(嵌 有螺絲扣)鑄造在兔子之頭皮上並以流動的水冷卻盔。將兔子放回其籠子中並無限制提供 食物和水以休息8-10小時，直到細菌接種的時間或對未經感染兔子的藥物動力學治療研 究開始。給予丁丙諾啡(buprenorfin)，。. lmg/kg止痛。
細菌接種
在晚上，於10p.m.，在使用Meningicin進行治療實驗的前一天，將兔子以 hypnorm-多美康再麻醉。將兔子之頭部固定在立體定位頭架中並將脊髓套管(spinal canula)導入小腦延髓池(cistema magna)中用於接種1 X IOtFU肺炎球菌。在細菌接種 後，將兔子放回其籠子並使其可取用食物和水另8小時。給予丁丙諾啡(0. lmg/kg)止痛 (注意未感染的兔子不經歷細菌接種程序)。
(setup)
於7. 30a. m 將兔子以烏拉坦(urethan) 3. 5ml/kg(丙烯酸二甲酯 50%,1. 75g/kg) 皮下注射再麻醉。將靜脈導管施加於左耳靜脈並緩慢地灌注Mebumal (戊巴比妥)大約 0. 5-lml (戊巴比妥(pentobarbital) 50mg/ml)靜脈注射(i. v.)直到兔子入睡並被深度麻 醉。將三通彎頭(three-way tap)連接至靜脈導管並將包含用於追加麻醉的戊巴比妥和用 於衝洗的等張NaCl與肝素lUI/ml的注射器連接至彎頭。每半小時觀察兔子一次。當需要 追加麻醉時，給予另外0. 2ml的Mebumal (戊巴比妥50mg/ml)。在實驗期間將觀察和麻醉記 錄在實驗室動物部門的方案中和實驗室動物審視書(the book of the Laboratory Animal Inspection)中。
將動脈套管施加於右耳動脈並在整個實驗過程中用於血液取樣。將螺栓緊固至嵌 在丙烯酸酯類盔中的螺扣，並將兔子之頭部固定在立體定位頭架中。在整個實驗過程中使 兔子維持固定。
以脊髓套管穿刺小腦延髓池，緊固至立體定位頭架。在整個實驗過程中使套管維 持正確的位置並用於CSF取樣。
在與所實施實驗有關的時間點，將Iml的血液和0.3ml的CSF從動脈套管/脊 髓針吸出並轉移至EDTA管/Eppendorf管。在最後一次取樣後，終止實驗並以過量的 Mebumal (戊巴比妥200mg/ml)殺死兔子。
iMr
Meningicin的CSF和血漿濃度通過使用HPLC測量。當評估在接種體和樣本中的 細菌濃度時，使用在血液瓊脂板上鋪板成為50 μ 1的點的系列10倍稀釋(需要20 μ 1的測 試材料)以計算CFU/ml。
具體到對藥物動力學研究
在實驗開始10分鐘以靜脈內大量灌注將Meningicin (劑量分別為20、40和80mg/ kg)通過三通彎頭施用。
用於研究Meningicin通過發炎腦膜的穿過的兔子如以上所述感染並等待直到細 菌接種後10小時的靜脈注射Meningicin施用。使用兩隻兔子的組研究Meningicin於3 個不同劑量通過發炎和未發炎腦膜的穿透(對應的CSF和血漿水平)。血液和CSF在施用 Meningicin 後 0、1/4、1/2、1、11/2、2、3、4、5 和 6 小時取樣以測定 Meningicin 濃度(HPLC)。 基於MIC和對於Meningicin所觀察的藥物動力學，建立用於治療試驗的劑量方案。
具體到功效研究
在施用脊髓套管後，將0. 5ml的CSF吸入注射器中。在接種前將0. Iml用於溶解 細菌接種物並將0. 2ml用於之後衝洗注射器和導管。製備接種物的系列10倍稀釋物以確 認感染性劑量。
使用Meningicin或頭孢曲松治療在細菌接種後10_11小時起始。在靜脈內劑量 的抗生素之後0、1、3、5、6和10小時取樣血液和腦脊液。測定抗生素濃度和細菌計數。
藥物動力學的結果
如上所述，將Meningicin以劑量20mg/kg、40mg/kg和80mg/kg施用。測量來自經 感染兔子的血清中Meningicin的濃度並計算「曲線下面積」(AUC血清)。同樣地，測量腦 脊液(CSF)中的Meningicin的濃度並計算「曲線下面積」(AUC CSF)。
Meningicin 劑量(mg/kg)在血清中的峰 農度(ng/l)AUC血 清細/1)在CSF中的峰 濃度AUC CSF (μ8/ )血腦屏障的 Meningicin 穿透
權利要求
1.一種具有抗微生物活性的多肽在製備用於治療腦膜炎的藥物中的用途，所述多肽包 含與SEQ ID NO 1的胺基酸序列具有至少90%同一性的胺基酸序列。
2.一種具有抗微生物活性的多肽，其用於治療腦膜炎，所述多肽包含與SEQ ID NO 1 的胺基酸序列具有至少90%同一性的胺基酸序列。
3.一種治療腦膜炎的方法，其包括向需要治療的受試者施用有效量的，例如抗腦膜炎 有效量的具有抗微生物活性的多肽，所述多肽包含與SEQ ID NO :1的胺基酸序列具有至少 90%同一性的胺基酸序列。
4.權利要求1-3中任一項的用途、多肽或方法，其中所述多肽包含與SEQID N0:1的 胺基酸序列具有至少95%同一性的胺基酸序列，優選其中所述多肽包含SEQ ID N0:1的多 肽或由SEQ ID NO 1的多肽組成。
5.權利要求1-3中任一項的用途、變體或方法，其中所述多肽為防衛素多肽，優選 β-防衛素多肽。
6.權利要求1-3中任一項的用途、變體或方法，其中所述腦膜炎為細菌性腦膜炎。
7.根據權利要求6的用途、變體或方法，其中所述細菌性腦膜炎由鏈球菌屬菌種 (Streptococcus sp)的感染弓I起。
8.根據權利要求6的用途、變體或方法，其中所述細菌性腦膜炎為肺炎球菌腦膜炎。
9.根據權利要求6的用途、變體或方法，其中所述肺炎球菌腦膜炎由青黴素抗性肺炎 鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)的感染弓I起。
全文摘要
本發明涉及以防衛素多肽治療腦膜炎，如細菌性腦膜炎的方法。
文檔編號A61K38/17GK102036678SQ200980117980
公開日2011年4月27日 申請日期2009年3月30日 優先權日2008年4月4日
發明者多思·桑德範, 漢斯-亨裡克·K·霍根豪格 申請人:諾維信阿德寧生物技術公司