Rage融合蛋白、製劑及其使用方法

2023-05-14 23:54:11

專利名稱：：Rage融合蛋白、製劑及其使用方法RAGE融合蛋白、製劑及其使用方法發明領域本發明涉及晚期糖基化終產物受體(RAGE)的調節。更具體而言，本發明描述包含RAGE多肽的融合蛋白、製造這類融合蛋白及這類RAGE融合蛋白的製劑的方法及這類RAGE融合蛋白用於治療基於RAGE的病症的用途。背景蛋白質或脂質與醛糖的溫育導致蛋白質上非酶促糖基化及氨基氧化，從而形成安瑪多立(amadori)加合物。加合物隨時間經歷額外重排、合物。促進AGE形成的因素包括延遲的蛋白質周轉(例如在澱粉狀蛋白病中)、具有高賴氨酸含量的巨分子的累積及高血糖水平(例如在糖尿病中)(Hori等人，/.A/oAC力e瓜270:25752—761，(1995))。AGE涉及於大量病症中，包括與糖尿病及正常老化相關的併發症。AGE顯示特異性且飽和結合單核細胞、巨噬細胞、微脈管系統的內皮細胞、平滑肌細胞、間質細胞及神經元上的細胞表面受體。晚期糖基化終產物受體(RAGE)為分子的免疫球蛋白超基因家族的一員。RAGE的細胞外(N末端)結構域包括三個免疫球蛋白型區域一個V(可變)型結構域，繼而兩個C型(恆定)結構域(Neeper等人，/.A'o/,C力e瓜，267:14998—15004(1992);Schmidt等人，"rc.0w;W.,96#194(1997))。單個跨膜結構域及短的高電荷胞質尾緊隨胞外域。可通過RAGE的蛋白質水解或通過分子生物學方法來分離N末端胞外域以產生包含V及C結構域的可溶性RAGE(sRAGE)。RAGE表達於多種細胞類型(包括白細胞、神經元、小膠質細胞及血管內皮)上(例如Hori等人，/."/oA270:25752-761(1995))。在老化組織(Schleicher等人，/.，99(3):12457-468(1997))及糖尿病性視網膜、維管結構及腎中(Schmidt等人，#"謡艦，1:1002-1004(1995))還發現RAGE水平增加。除AGE外，其它化合物可結合且調控RAGE。RAGE結合多個功能及結構上不同的配體，包括澱粉狀蛋白卩(AP)、血清澱粉狀蛋白A(SAA)、晚期糖基化終產物(AGE)、S100(鈣粒蛋白家族的促炎成員)、羧甲基賴氨酸(CML)、兩性蛋白及CDllb/CD18(Bucciarelli等人，Ce//Z/屍e5W'.，59:1117-128(2002);Chavakis等人，#/cro6es//Lfe".，6:1219-1225(2004);Kokkola等人，Scs/^/./.T/zz邁Mo/,，61:1-9(2005);Schmidt等人，/.//7re".，108:949-955(2001);Rocken等人，j瓜/.戶"力o/.，162:1213-1220(2003))。顯示配體(如AGE、S100/鉤粒蛋白、P-澱粉狀蛋白、CML(N^-羧甲基賴氨酸)及兩性蛋白)與RAGE的結合改變多種基因的表達。接著，這些相互作用可引發信號傳導機制，包括p38活化、p21ras、MAP激酶、Erkl-2磷酸化及炎症信號轉導的轉錄介體NF-kB的活化(Yeh等人，50:1495-1504(2001))。例如在多種細胞類型中，RAGE與其配體之間的相互作用可產生氧化應激，其進而導致自由基敏感轉錄因子NF-kB的活化及NF-kb調節的基因(如細胞因子IL-1P及TNF-a)活化。此外，RAGE表達經由NF-KB上調且顯示在炎症或氧化應激位點處增加的表達(Tanaka等人，/,5/0/.C力e邁.，275:25781-25790(2000))。因此，可通過配體結合引發的正向反饋循環推動上升且通常有害的螺旋。RAGE在不同組織及器官中的活化可導致大量病理生理結果。RAGE涉及各種病症，包括急性及慢性炎症(Hofmann等人，Ce7/97:889-901(1999))、糖尿病晚期併發症的發展(如增加的血管通透性)(Wautier等人，/./扁仏，97:238-243(1995))、腎病(Tei1let等人，/.j瓜5Vc,iYe/力ro/.，11:1488—1497(2000))、動務1a更化(Vlassara等人，r力e屍/力/7/、力5^c/"y/^。"^7#，J/m.，28:419-426(1996))及浮見網膜病(Hammes等人，"/a6"o/og/s，42:603-607(1999))。RAGE還涉及阿茲海默氏病(Alzheimer'sdisease)(Yan等人，艇"re，382:685-691(1996))及肺瘤侵襲與轉移(Taguchi等人，yVW"re，405:354-357(2000))。儘管RAGE廣泛表達及其在多種不同疾病模型中的明顯多效作用，但RAGE對正常發育而言似乎並非必要。例如，RAGE敲除小鼠無明顯異常表型，這表明雖然當慢性刺激時RAGE可在疾病病理中起作用，但RAGE的抑制似乎未促進任何不需要的急性表型(Liliensiek等人，/.//^eW.，113:1641—50(2004))。拮抗生理配體與RAGE的結合可下調由過量濃度的AGE及其它RAGE配體引起的病理生理變化。通過減少內源性配體與RAGE的結合可減少與RAGE介導的病症相關的症狀。可溶性RAGE(sRAGE)能有效拮抗RAGE配體與RAGE結合。然而，sRAGE在活體內施用時半衰期可能太短而不適於治療一或多種病症。因此，需要研製拮抗AGE及其它生理配體結合RAGE受體的化合物，其中該化合物具有所期望的藥代動力學概況。概述本發明的實施方案包含RAGE融合蛋白及使用這類蛋白的方法。本發明可以各種方式具體化。本發明的實施方案可包含一種RAGE融合蛋白，其包含連接於第二非RAGE多肽的RAGE多肽。在一實施方案中，RAGE融合蛋白包含RAGE配體結合位點。RAGE融合蛋白可進一步包含RAGE多肽。在某些實施方案中，RAGE融合蛋白包含如SEQIDNO:56或SEQIDNO:57中所述的胺基酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90°/。、95°/。、96%、97%、98°/。或99%—致的序列。例如，在某些實施方案中，與SEQIDNO:56或SEQIDNO:57至少90%—致的序列包含無C末端賴氨酸的SEQIDNO:56或SEQIDNO:57序列。本發明還包含一種製備RAGE融合蛋白的方法。在一實施方案中，該方法包含將RAGE多肽連接於第二非RAGE多肽。在一實施方案中，RAGE多肽包含RAGE配體結合位點。該方法可包含將RAGE多肽直接連接於包含免疫球蛋白的CH2結構域或CH2結構域的部分的多肽。在某些實施方案中，RAGE融合蛋白包含如SEQIDNO:56或SEQIDNO:57中所述的胺基酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90°/。、95°/。、96%、97%、98°/。或99°/。一致的序列。例如，在某些實施方案中，與SEQIDNO:56或SEQIDNO:57至少90%—致的序列包含無C末端賴氨酸的SEQIDNO:56或SEQIDNO:57序列。在其它實施方案中，本發明可包含用於治療受試者中RAGE介導的病症的方法及組合物。該方法可包含將本發明的RAGE融合蛋白施用給受試者。該組合物可包含藥學上可接受的載體中的本發明的RAGE融合蛋白。在其它實施方案中，本發明還提供包含凍幹保護劑、RAGE融合蛋白與緩衝劑的凍幹混合物的製劑。例如，在某些實施方案中，本發明可包含穩定重構製劑，其包含至少50mg/mL的量的RAGE融合蛋白及稀釋劑，其中重構製劑由RAGE融合蛋白與凍幹保護劑的凍幹混合物製備。本發明的實施方案還可包含製造的物品。在某些實施方案中，製造的物品可包含保存包含凍幹RAGE融合蛋白的製劑的容器。製造的物品還可包含用於以稀釋劑重構凍幹製劑的說明。在其它實施方案中，本發明還可包含製備RAGE融合蛋白的穩定重構製劑的方法。在某些實施方案中，該方法可包含在稀釋劑中重構RAGE融合蛋白與凍幹保護劑的凍幹混合物使得重構製劑中RAGE融合蛋白濃度至少為50mg/mL。例如，在一實施方案中，該方法可包含凍幹包含RAGE融合蛋白與凍幹保護量的凍幹保護劑的混合物且在稀釋劑中重構凍幹混合物的步驟。存在可與本發明的特定實施方案相關的各種優勢。在一實施方案中，當施用給受試者時，本發明的RAGE融合蛋白可為代謝穩定的。本發明的RAGE融合蛋白還可顯示結合RAGE配體的高親和力。在某些實施方案中，本發明的RAGE融合蛋白以高納摩爾至低微摩爾範圍的親和力結合RAGE配體。本發明的RAGE融合蛋白可通過以高親和力結合生理RAGE配體而用於抑制內源性配體與RAGE結合，從而提供一種改善RAGE介導的疾病的方式。本發明的RAGE融合蛋白還可以蛋白質或核酸形式提供。在一實例實施方案中，RAGE融合蛋白可全身施用且保留在維管結構中以有效治療部分由RAGE介導的血管疾病。在另一實例實施方案中，RAGE融合蛋白可局部施用以治療其中RAGE配體促進疾病病理的疾病。可選擇地，可通過使用適當栽體(如病毒或棵露DNA)將編碼RAGE融合蛋白的核酸構建體傳遞至位點，其中短暫局部表達可局部抑制RAGE配體與受體之間的相互作用。因此，施用藥物本質上可為短暫的(例如在施用RAGE融合蛋白的情況下)或更持久(例如在以重組DNA形式施用RAGE融合蛋白的情況下)。存在將於下文描述的本發明的額外特徵。應了解本發明的應用不限於以下申請專利範圍、實施方式及附圖所說明的細節。本發明允許其它實施方案且以各種方式實施或進行。詳述除非說明相反，否則以下說明書中所說明的數字參數為近似值，其可視本發明尋求獲得的所期望的性質而變。絲毫不試圖使等價原則的應用限於申請專利範圍的範疇，各數字參數應至少根據所報導的有效數字的數及通過應用一般四捨五入技術來解釋。雖然本發明廣泛範圍所陳述的數字範圍及參數為近似值，但儘可能精確報導特定實施例中說明的數值。然而，任何數值必定先天含有源自在其各自測試測量中發現的標準差的某些誤差。此外，應了解本文公開的所有範圍涵蓋其所包含的任何及所有子範圍。例如，應認為所述範圍"l至IO"包括在最小值1與最大值10之間(及包括最小值1及最大值IO)的任何及所有子範圍；還即以最小值1或1以上(例如1至6.l)開始且以10或10以下(例如5.5至10)結束的所有子範圍。此外，任何稱為"併入本文"的參考文獻均理解為全文併入。進一步注意除非清楚及明確限於一個指示物，否則如本說明書中所用的單數形式"一"及"該"包括複數指示物。除非上下文另外明確說明，否則術語"或"與術語"和/或"可交換使用。術語"部分"及"片段"還可交換使用地指代多肽、核酸或其它分子構建體的部分。"多肽"及"蛋白質"在本文可交換用以描述可包含部分或全長蛋白的蛋白分子。如本
技術領域：
中已知，"蛋白質"、"肽"、"多肽"及"寡肽"為胺基酸(通常L-胺基酸)鏈，其oc碳經由肽鍵連接，該肽鍵通過一胺基酸的a碳的羧基與另一胺基酸的a碳的氨基之間的縮合反應而形成。組成蛋白質的胺基酸通常依次計數，以氨基末端殘基開始且朝蛋白質的羧基末端殘基方向增加。如本文所用的，術語"上遊"指對第二殘基而言為N末端的殘基(其中分子為蛋白質)或對第二殘基而言為5"其中分子為核酸)。如本文所用的，術語"下遊"指對第二殘基而言為C末端的殘基(其中分子為蛋白質)或對第二殘基而言為3'(其中分子為核酸)。除非另外定義，否則本文所用的所有科技術語具有與本領域一般技術人員通常理解的含義相同的含義。對本
技術領域：
的定義及術語而言，實施者尤其針對CurrentProtocolsinMolecularBiology(例如參見Ausubel，F.M.等人，i^orf戶rc^cco/s//#o/ecw/<2r第4版，第2章，JohnWiley&Sons,N.Y.)。胺基酸殘基的縮寫為本
技術領域：
中用於指代20個普通L-胺基酸之一的標準3字母和/或1字母密碼。"核酸"為多聚核苷酸，如脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。該術語用於包括單鏈核酸、雙鏈核酸及從核普酸或核苷酸類似物製成的RNA及DNA。術語"栽體"指可用於將第二核酸分子轉運至細胞中的核酸分子。在一實施方案中，載體允許插入載體中的DNA序列複製。載體可包含啟動子以增強核酸分子在至少某些宿主細胞中的表達。栽體可自主複製(在染色體外)或可整合至宿主細胞染色體內。在一實施方案中，載體可包含能夠產生來源於插入栽體中的至少一部分核酸序列的蛋白質的表達載體。如本領域中已知，用於核酸序列彼此雜交的條件可描述為從低嚴格度至高嚴格度範圍。一般而言，高嚴格度雜交條件指在低鹽緩衝劑中於高溫下洗滌雜交物。雜交可通過在65X:下使用本
技術領域：
中標準的雜交溶液(如0.5MNaHP04、7%十二烷基硫酸鈉(SDS))且在0.25MNaHP04、3.5%SDS中洗滌接著在室溫至68°C範圍的溫度下(視探針長度而定)在0.1xSSC/0.1%SDS中洗滌來過濾結合的DNA。例如，高嚴格度洗滌包括在6xSSC/0.05%焦磷酸鈉中對14個鹼基寡核苷酸探針而言於37'C下洗滌或對17個鹼基寡核苷酸探針而言於48X:下洗滌或對20個鹼基寡核苦酸探針而言於55'C下洗滌或對25個鹼基寡核苷酸探針而言於60'C下洗滌或對長約250個核苷酸的核苷酸探針而言於65。C下洗塗。核酸探針可通過用(例如)[Y-"P]ATP末端標記或通過隨機引物標記來併入放射性標記的核苷酸(如[cc-32P]dCTP)從而用放射性核苷酸標記。可選擇地，可通過併入生物素標記或焚光素標記的核苷酸來標記探針，且使用鏈黴抗生物素或抗螢光素抗體檢測探針。如本文所用的"小有機分子"為分子量小於2，000道耳頓(Dalton)的含有至少一個碳原子的分子。術語"融合蛋白"指具有來源於兩個或兩個以上蛋白質的胺基酸序列的蛋白質或多肽。融合蛋白還可包括在來源於獨立蛋白質的胺基酸部分之間的胺基酸連接區。如本文所用的"非RAGE多肽"為非來自RAGE或其片段的任何多肽。這類非RAGE多肽包括免疫球蛋白肽、二聚體多肽、穩定多肽、兩親性肽或包含為靶向或純化蛋白質提供"標記"的胺基酸序列的多肽。如本文所用的"免疫球蛋白肽"可包含免疫球蛋白重鏈或其部分。在一實施方案中，重鏈部分可為Fc片段或其部分。如本文所用的Fc片段包含單聚體或二聚體形式的重鏈鉸鏈多肽及免疫球蛋白的重鏈的"2及"3結構域。或Ch1及Fc片段可用作免疫球蛋白多肽。重鏈(或其部分)可來源於任一已知重鏈同種型IgG(y)、IgM(ja)、IgD(5)、IgE(e)或IgA(ot)。此外，重鏈(或其部分)可來源於任一已知重鏈亞型IgGl(yl)、IgG2(y2)、IgG3(y3)、IgG4(y4)、IgAl(al)、IgA2(ct2)或這些同種型或亞型改變生物活性的突變。可改變的生物活性的實例包括如(例如)通過修飾鉸鏈區減少同種型結合某些Fc受體的能力。術語"一致性"或"一致性％"指兩個胺基酸序列或兩個核酸序列之間的序列一致性。一致性％可通過比對兩序列來測定且指在比較序列共有位置處一致殘基(即，胺基酸或核苷酸)的數量。可使用本
技術領域：
中的算法標準(例如Smith及Waterman,1981，J/7/7/.他".2:482;Needleman及W廳ch，1970，/.脂.腸/.48:443;Pearson及Lipman，1988，/Voc,Ais〃.Sc/.，USA,85:2444)或通過作為BLAST及FASTA公開可得的這些算法的計算機化版本(WisconsinGeneticsSoftwarePackageRelease7.0，GeneticsComputerGroup,575ScienceDrive,Madison,WI)來進4亍序歹'J比對及比較。可將自NationalInstitutesofHealth,BethesdaMD購得的ENTREZ用於序列比較。在一實施方案中，可使用間隙權重為1的GCG來測定兩序列的一致性％使得如同其為兩序列之間的單個胺基酸錯配來衡量各胺基酸間隙。如本文所用的術語"保守殘基"指在具有相同結構和/或功能的多個蛋白質中相同的胺基酸。保守殘基區域對蛋白質結構或功能而言可能是重要的。因此，在三維蛋白質中所鑑別的連續保守殘基對蛋白質結構或功能而言可能是重要的。為找到保守殘基或3D結構的保守區列。口々"5、5"'-如本文所用的術語"同系物"意指具有與野生型胺基酸序列一定程度同源性或一致性的多肽。同源性比較可通過眼睛或更通常在易得的序列比較程序幫助下進行。這些市售電腦程式可計算兩個或兩個以上序列之間的同源性°/。(例如Wilbur,W.J,及Lipman，D.J.,1983，Ais〃.Sc/.USA,80:726-730)。例如，可採用的同源序列包括在替代實施方案中彼此至少70%—致、75%—致、85%—致、90%—致、95%—致、96%—致、97%—致、98%—致或99%—致的胺基酸序列。如本文所用的術語與其至少90°/。一致包括與指定序列的一致性從90%至99.99%的範圍的序列且包括所有在其間的範圍。因此，術語與其至少90%—致包括與指定序列91%、91.5%、92%、92.5%、93%、93.5%、94%、94.5%、95%、95.5%、96°/。、96.5°/。、97°/"97.5%、98%、98.5%、99%、99.5%—致的序列。類似地，術語"至少70%—致"包括從70%至99.99%—致的範圍的序列，及其間的所有範圍。一致性°/。測定通過使用本文所述的算法來測定。如本文所用的多肽或蛋白質"域"(domain)或"結構域"(domain)包含沿包含獨立單元的多肽或蛋白質的區域。域可根據結構、序列和/或生物活性來定義。在一實施方案中，多肽域可包含以實質上與蛋白質的其佘部分無關的方式摺疊的蛋白質區域。可使用域資料庫(例如(但不限於)PFAM、PR0D0M、PR0SITE、BL0CKS、PRINTS、SBASE、ISRECPR0FILES、SAMRT及PROCLASS)來鑑定域。如本文所用的"免疫球蛋白域"為與免疫球蛋白的結構域結構上同源或一致的胺基酸序列。免疫球蛋白域的胺基酸序列長度可為任何長度。在一實施方案中，免疫球蛋白域可少於250個胺基酸。在一實例實施方案中，免疫球蛋白域可長為約80-150個胺基酸。例如，IgG的可變區及CH1、Ch2及CH3區各為免疫球蛋白域。在另一實例中，IgM的可變區、CJ、CH2、Ch3及Ch4區各為免疫球蛋白域。如本文所用的"RAGE免疫球蛋白域"為與免疫球蛋白的結構域結構上同源或一致的來自RAGE蛋白的胺基酸序列。例如，RAGE免疫球蛋白域可包含RAGEV結構域、RAGE類Ig的Cl型1結構域("C1結構域")或RAGE類Ig的C2型2結構域("C2結構域")。如本文所用的"域間連接子"包含將兩個結構域接合在一起的多肽。Fc鉸鏈區為IgG中域間連接子的實例。如本文所用的"直接連接"鑑別在兩個不同群組(例如核酸序列、多肽、多肽域)之間的共價連接，在所連接的兩個群組之間無任何插入原子。如本文所用的"配體結合域"指負責結合配體的蛋白質域。術語配體結合域包括配體結合域或其部分的同系物。為此，只要配體結合域的結合特異性保留，則基於殘基的極性、電荷、溶解性、疏水性或親水性的相似性可在配體結合位點上進行慎重胺基酸取代。如本文所用的"配體結合位點"包含直接與配體相互作用的蛋白質中的殘基或涉及配體定位使其與直接與配體相互作用的那些殘基緊密鄰近的殘基。配體結合點中殘基的相互作用可通過模型或結構中殘基與配體的空間接近性定義。術語配體結合位點包括配體結合位點的同系物或其部分。為此，只要配體結合位點的結合特異性保留，則基於殘基的極性、電荷、溶解性、疏水性或親水性的相似性可在配體結合位點上進行慎重胺基酸取代。配體結合位點可存在於蛋白質或多肽的一個或多個配體結合域中。如本文所用的術語"相互作用"指配體或化合物或其部分或片段與所關注第二分子的部分之間的接近性情況。相互作用可為非共價的，例如作為氫鍵、範德瓦爾斯引力(vanderWaals)相互作用或靜電或疏水性相互作用的結果，或其可為共價的。如本文所用的"配體"指與配體結合位點相互作用的分子或化合物或實體，包括基質或其類似物或部分。如本文所述的術語"配體"可指結合所關注蛋白質的化合物。配體可為激動劑、拮抗劑或調節劑。或者配體可不具有生物效應。或者配體可阻斷其它配體的結合，從而抑制生物效應。配體可包括(但不限於)小分子抑制劑。這些小分子可包括肽、肽模擬物、有機化合物等等。配體還可包括多肽和/或蛋白質。如本文所用的"調節劑化合物"指變化或改變所關注分子生物活性的分子。調節劑化合物可增加或減少所關注分子的活性或改變其物理或化學特徵或其功能或免疫特性。對RAGE而言，調節劑化合物可增加或減少RAGE或其部分的活性或改變其特徵或其功能或免疫特性。調節劑化合物可包括天然和/或化學合成或人造肽、經修飾的肽(例如磷酸肽)、抗體、碳水化合物、單醣、寡醣、多醣、糖脂、雜環化合物、核苷或核苷酸或其部分及有機或無機小分子。調節劑化合物可為內源性生理化合物或其可為天然或合成化合物。或者調節劑化合物可為有機小分子。術語"調節劑化合物"還包括經化學修飾的配體或化合物且包括異構體及外消旋形式。"激動劑"包含一種化合物，其結合受體以形成引起對所涉及的受體特異的藥理反應的複合物。"拮抗劑"包含一種化合物，其結合激動劑或受體以形成不產生實質藥理反應且可抑制由激動劑引起的生物反應的複合物。因此，RAGE激動劑可結合RAGE且刺激RAGE介導的細胞過程，且RAGE拮抗劑可抑制RAGE介導的過程使其不受RAGE激動劑刺激。例如在一實施方案中，由RAGE激動劑刺激的細胞過程包含TNF-ct基因轉錄活化。術語"肽模擬物"指在分子之間的相互作用中用作肽的取代物的結構(Morgan等人，1989，JiM.We;or〃C力e瓜，24:243-252)。肽模擬物可包括可含有或不含有胺基酸和/或肽鍵但保留肽或激動劑或拮抗劑的結構及功能特徵的合成結構。肽模擬物還包括類肽、寡類肽(Simon等人，1972，Ais〃.」ca《ScA，M」，89:9367)及含有表示所有可能的對應於肽或本發明的激動劑或拮抗劑的胺基酸序列的指定長度的肽的肽文庫。術語"治療"指改良疾病或病症的症狀且可包含治癒病症、實質上防止病症發作或改良受試者的病況。如本文所用的術語"治療"指針對患者所罹患的既定病症的整個治療範圍，包括減輕來源於該病症的一種症狀或大部分症狀、治癒特定病症或防止病症發作。如本文所用的術語"ECs。"定義為導致50°/。所測量生物效應的藥劑濃度。例如，具有可測量生物效應的治療劑的ECs。可包含藥劑顯示50%生物效應的值。如本文所用的術語"IC5。"定義為導致50%抑制所測量效應的藥劑濃度。例如，RAGE結合拮抗劑的ICs。可包含拮抗劑將配體結合RAGE的配體結合位點減少50%的值。如本文所用的"有效量"意指在受試者體內有效產生所需效應的藥劑的量。術語"治療有效量"表示引起所尋求的動物或人類的治療效應的藥物或醫藥劑的量。包含有效量的實際劑量可視施用途徑、受試者體型及健康、所治療的病症等等而定。如本文所用的術語"藥學上可接受的載體"可指如(例如)對為治療RAGE介導的病症或疾病而施用的治療組合物而言適用於人類或動物受試者的化合物及組合物。本文所用的術語"藥物組合物"表示可作為含有常規無毒栽體、稀釋劑、佐劑、媒劑等等的單位劑量製劑形式(例如)經口、非經腸、局部、通過吸入噴霧、經鼻內或經直腸施用給哺乳動物宿主的組合物。如本文所用的術語"非經腸"包括皮下注射、靜脈內、肌肉內、腦池內注射或輸液^支術。如本文所用的"排斥反應"指組織上的免疫或炎症反應，其導致細胞、組織或器官破壞或導致細胞、組織或器官損傷。排斥的細胞、組織或器官可來源於具有排斥反應的相同受試者或可從不同受試者移植至顯示排斥反應的受試者體內。如本文所用的術語"細胞"指各包含獨立生活系統的哺乳動物生活系統的結構及功能單元。如本
技術領域：
中已知，細胞包括核、細胞質、胞內細胞器及封閉細胞且使細胞獨立於其它細胞的細胞壁。如本文所用的術語"組織"指具有類似結構及功能或共同起作用以執行特定功能的細胞聚集體。組織可包括類似細胞與圍繞細胞的胞間物質的集合。組織包括(但不限於)肌肉組織、神經組織及骨骼。如本文所用的"器官"指專用於某些特定功能的動物體內完全分化的結構及功能單元。器官可包含執行特定功能或功能群的組織群。器官包括(但不限於)心臟、肺、腦、眼睛、胃、脾、胰臟、腎、肝、腸、皮膚、子宮、膀胱及骨骼。"穩定"製劑為儲存時其中RAGE融合蛋白基本上保留其物理及化學穩定性及生物活性的製劑。測量蛋白穩定性的各種分析技術在本
技術領域：
中可得且評論於PeptideandProteinDrugDelivery,247-301:VincentLeeEd.，MarcelDekker，Inc.,NewYork,N.Y.，Pubs.(1991)及Jones,A.Adv.DrugDeliveryRev.10:29-90(1993)中。可在選定溫度下測量穩定性，歷時選定時間。為快速篩選，可將製劑保持在40。C下歷時1周至1個月，在此時間下測量穩定性。例如，凍幹及儲存後的聚集程度可用作RAGE融合蛋白穩定性的指示物(參見本文實施例)。例如，"穩定"製劑可為其中少於約10%及優選少於約5%的RAGE融合蛋白以聚集體形式存在於製劑中的製劑。在其它實施方案中，可測定在凍幹製劑凍幹及儲存後聚集體形成的增加。例如，"穩定''凍幹製劑可為當凍幹製劑在40°C下溫育至少一周時其中凍幹製劑中聚集體增加少於約5%或少於約3%的製劑。在其它實施方案中，可使用生物活性試驗(如本文所述的結合試驗)測量RAGE融合蛋白製劑的穩定性。"重構"製劑為通過將凍幹的RAGE融合蛋白製劑溶於稀釋劑中使得RAGE融合蛋白分散和/或溶於重構製劑中製得的製劑。重構製劑可適於施用給(例如非經腸施用)待以融合蛋白治療的患者且在本發明的某些實施方案中可為適於皮下施用的製劑。"等滲"意指所關注製劑具有約240至約340mOsm/kg的滲透壓。在一實施方案中，等滲製劑為具有與人類血液(285-310mOsm/kg)基本相同滲透壓的製劑。可使用蒸氣壓或凝固點下降型滲壓計來測量等滲性。"凍幹保護劑"為當與RAGE融合蛋白組合時在凍幹及隨後儲存時顯著預防或減少蛋白的化學和/或物理不穩定性的分子。例示性凍幹保護劑包括糖(如蔗糖或海藻糖)、多元醇(如糖醇，例如赤藻糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇及甘露糖醇)或其組合。在一實施方案中，凍幹保護劑可包含糖。在另一實施方案中，凍幹保護劑可包含非還原性糖。在另一實施方案中，凍幹保護劑可包含如蔗糖的非還原性糖。可將凍幹保護劑以"凍千保護量"添加至預凍幹的製劑中，"凍幹保護量"意指蛋白在凍幹保護量的凍幹保護劑存在下凍幹後，RAGE融合蛋白在凍幹及儲存時基本上保留其物理及化學穩定性及生物活性。用於本文凍幹製劑的"稀釋劑"為藥學上可接受(對施用給人類而言安全且無毒)且適用於製備重構製劑的稀釋劑。例示性稀釋劑包括無菌水、用於注射的抑菌水(BWFI)、pH緩衝溶液(例如磷酸鹽緩沖生理食鹽水)、無菌生理鹽7K溶液、林格氏溶液(Ringedssolution)或右旋糖溶液。在一實施方案中，稀釋劑提供適於注射的重構製劑。在另一實施方案中，在稀釋劑提供適於注射的重構製劑的情況下，稀釋劑可包含用於注射的水(WFI)。重構製劑的"防腐劑"為可添加至稀釋劑或重構製劑中以基本上減少重構製劑中細菌作用的化合物。在一實施方案中，防腐劑的量可以適於促進多用途重構製劑產生的量添加。有效防腐劑的實例包括十八烷基二甲基苄基氯化銨、六甲氯銨、氯化苯曱烴銨(其中烷基為長鏈化合物的烷基千基二甲基氯化銨的混合物)及苄索氯銨(benzethoniumchloride)。其它類型防腐劑包括芳醇，如酚、丁基及千基醇、對羥基笨甲酸烯丙酯(如對羥基苯甲酸甲酯或丙酯)、兒茶酚、間苯二酚、環己醇、3-戊醇及間曱酚。凍千製劑的"膨化劑"為將塊狀物添加至凍幹混合物中且促進凍幹餅塊的物理結構(例如促進基本上均勻的保留開孔結構的凍幹餅塊的產生)的化合物。例示性膨化劑包括(但不限於)甘露糖醇、甘氨酸及山梨糖醇(Xorbital)。RAGE融合蛋白本發明的實施方案包含RAGE融合蛋白、製備這類融合蛋白的方法及使用這類融合蛋白的方法。本發明可以各種方式具體化。例如，本發明的實施方案提供包含連接於第二非RAGE多肽的RAGE多肽的RAGE融合蛋白。在一實施方案中，RAGE融合蛋白可包含RAGE配體結合位點。在一實施方案中，配體結合位點包含RAGE融合蛋白的大部分N末端結構域。RAGE配體結合位點可包含RAGE的V結構域或其部分。在一實施方案中，RAGE配體結合位點包含SEQIDNO:9或與其至少90°/。一致的序列或SEQIDNO:IO或與其至少90%—致的序列或SEQIDNO:47或與其至少90%—致的序列(圖1)。在一實施方案中，RAGE多肽可連接於包含免疫球蛋白域或免疫球蛋白域的部分(例如其片段)的多肽。在一實施方案中，包含免疫球蛋白域的多肽包含人類IgG的CH2或CH3結構域中至少一個的至少一部分。在某些實施方案中，RAGE融合蛋白包含如SEQIDNO:56或SEQIDNO:57中所述的胺基酸序列或與其至少70°/。、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99°/。一致的序列。例如，在某些實施方案中，與SEQIDNO:56或SEQIDNO:57至少90%—致的序列包含無C末端賴氨酸的SEQIDNO:56或SEQIDNO:57的序列。RAGE蛋白或多肽可包含全長人類RAGE蛋白(例如SEQIDNO:1)或人類RAGE的片段。如本文所用的RAGE多肽片段為至少5個胺基酸長，可超過30個胺基酸長，但少於全長胺基酸序列。在本發明的融合蛋白、組合物及方法的替代實施方案中，RAGE多肽可包含與人類RAGE或其片段至少約70%、75%、80%、85%、90°/。、95%、96%、97%、98%或99%—致的序列。例如，在一實施方案中，RAGE多肽可包含人類RAGE或其片段，其中甘氨酸而非甲硫氨酸作為第一殘基(例如參見Neeper等人，(1992))。或者人類RAGE可包含移除信號序列的全長RAGE(例如SEQIDNO:2或SEQIDNO:3)(圖1A及IB)或該胺基酸序列的部分。本發明的RAGE融合蛋白還可包含sRAGE(例如SEQIDNO:4)、與sRAGE至少90°/。一致的多肽或sRAGE的片段。如本文所用的sRAGE為不包括跨膜區或胞質尾的RAGE蛋白(Park等人，vVaf"re,4:1025-1031(1998))。例如，RAGE多肽可包含人類sRAGE或其片段，其中甘氨酸而非甲硫氨酸作為第一殘基(例如參見Neeper等人，(1992))。或者RAGE多肽可包含移除信號序列的人類sRAGE(例如參見圖1中SEQIDNO:5或SEQIDNO:6或SEQIDNO:45)或該胺基酸序列的部分。在其它實施方案中，RAGE蛋白可包含RAGEV結構域(例如參見圖1中SEQIDNO:7、SEQIDNO:8或SEQIDNO:46)(Neeper等人，(1992);Schmidt等人(1997))。或者可使用與RAGEV結構域或其片段至少90%—致的序列。或者RAGE蛋白可包含RAGEV結構域片段(例如圖1中SEQIDNO:9、SEQIDNO:10或SEQIDNO:47)。在一實施方案中，RAGE蛋白可包含配體結合位點。在一實施方案中，配體結合位點可包含SEQIDNO:9或與其至少90%—致的序列或SEQIDNO:10或與其至少90°/。一致的序列或SEQIDNO:47或與其至少90%—致的序列。在另一實施方案中，RAGE片段為合成肽。在另一實施方案中，配體結合位點可包含SEQIDNO.1的胺基酸23-53(圖1)。在另一實施方案中，配體結合位點可包含SEQIDNO:1的胺基酸24-52。在另一實施方案中，配體結合位點可包含SEQIDNO:1的胺基酸31-52。在另一實施方案中，配體結合位點可包含SEQIDNO:l的胺基酸31-116。在另一實施方案中，配體結合位點可包含SEQIDNO:l的胺基酸19-52。例如，配體結合位點可包含RAGEV結構域或其部分，如RAGE配體結合域(例如SEQIDNO:1的胺基酸1-118、23-118、24-118、31-118、1-116、23-116、24-116、31-116、1-54、23-54、24-54、31-54、1-53、23-53、24-53或31-53或其片段)。或可使用功能性結合RAGE配體的多肽片段。或可使用與RAGEV結構域或其片段(例如如上所述)至少70%、75%、80°/。、85%、90%、95°/。、97%、98°/。或99%—致的序列。此外，如本
技術領域：
中已知，在其中融合蛋白的N末端為穀氨醯胺的實施方案中，如(例如)在移除包含SEQIDNO:1的殘基1-23的信號序列(例如多肽的Q24包含胺基酸24-118或SEQIDNO:l)後，穀氨醯胺可環化以形成焦穀氨酸(pE)。因此，用於本發明的RAGE融合蛋白中的RAGE多肽可包含全長RAGE的片段。如本
技術領域：
中已知，RAGE包含三個類免疫球蛋白多肽域、V結構域及CI及C2結構域，各通過域間連接子彼此連接。全長RAGE還包括跨膜多肽及C2結構域的胞質尾下遊(C末端)，且連接於C2結構域。在一實施方案中，RAGE多肽不包括任何信號序列殘基。RAGE信號序列可包含全長RAGE的殘基1-22或殘基1-23。此外如本
技術領域：
中已知，在其中融合蛋白的N末端為穀氨醯胺(例如信號序列包含殘基l-23)的實施方案中，N末端穀氨醯胺(Q24)可環化以形成焦穀氨酸(pE)。這類分子的實例構建體為具有如SEQIDN0:45、46、47、48、49、50及51(圖1)中所述的胺基酸序列的多肽以及具有如SEQIDN0:56及57(圖4)中所述的胺基酸序列的RAGE融合蛋白。如本
技術領域：
中公認，當在某些重組系統中表達時，本發明的RAGE融合蛋白的Ch3區可經由翻譯後修飾使C末端胺基酸切除(例如參見Li等人，"/o戶roce^//^/.，4:23-30(2005))。在一實施方案中，所切除的C末端胺基酸為賴氨酸(K)。因此，在替代實施方案中，本發明的RAGE融合蛋白可包含具有如SEQIDN0:32-37、56及57中所述的胺基酸序列而無C末端賴氨酸(K)的多肽。因此，在各種實施方案中，RAGE多肽可包含人類RAGE的胺基酸23-116(SEQIDNO:7)或與其至少90%—致的序列或人類RAGE的胺基酸24-116(SEQIDNO:8)或與其至少90%—致的序列或其中Q24環化以形成pE的人類RAGE的胺基酸24-116(SEQIDNO:46)或與其至少90%—致的序列，對應於RAGE的V結構域。或者RAGE多肽可包含人類RAGE的胺基酸124-221(SEQIDNO:11)或與其至少90%—致的序列，對應於RAGE的C1結構域。在另一實施方案中，RAGE多肽可包含人類RAGE的胺基酸227-317(SEQIDNO:12)或與其至少90%—致的序列，對應於RAGE的C2結構域。或者RAGE多肽可包含人類RAGE的胺基酸23-123(SEQIDNO:13)或與其至少90%—致的序列或人類RAGE的胺基酸24-123(SEQIDNO:14)或與其至少90%—致的序列，對應於RAGE的V結構域及下遊域間連接子。或者，RAGE多肽可包含其中Q24環化以形成pE的人類RAGE的胺基酸24-123(SEQIDNO:48)或與其至少90°/。一致的序列。或者RAGE多肽可包含人類RAGE的胺基酸23-226(SEQIDNO:17)或與其至少90%—致的序列或人類RAGE的胺基酸24-226(SEQIDNO:18)或與其至少90%—致的序列，對應於V結構域、CI結構域及連接這兩個結構域的域間連接子。或者RAGE多肽可包含其中Q24環化以形成pE的人類RAGE的胺基酸24-226(SEQIDNO:50)或與其至少90%—致的序列。或者，RAGE多肽可包含人類RAGE的胺基酸23-339(SEQIDNO:5)或與其至少90%—致的序列或人類RAGE的24-339(SEQIDNO:6)或與其至少90°/。一致的序列，對應於sRAGE(即編碼V、C1及C2結構域及域間連接子)。或者，RAGE多肽可包含其中Q24環化以形成pE的人類RAGE的胺基酸24-339(SEQIDNO:45)或與其至少90%—致的序列。或可使用這些序列的每一個的片段。這些多肽的胺基酸序列參見圖1。RAGE融合蛋白可包括並非來源於RAGE或其片段的數種類型的肽。RAGE融合蛋白的第二多肽可包含來源於免疫球蛋白的多肽。在一實施方案中，免疫球蛋白多肽可包含免疫球蛋白重鏈或其部分(即片段)。例如，重鏈片段可包含來源於免疫球蛋白的Fc片段的多肽，其中Fc片段包含單體形式的重鏈鉸鏈多肽及免疫球蛋白重鏈的CH2及CH3結構域。重鏈(或其部分)可來源於任一已知重鏈同種型IgG(y)、IgMi)、IgD(5)、IgE(e)或IgA(oc)。此外，重鏈(或其部分)可來源於任一已知重鏈亞型IgGl(yl)、IgG2(Y2)、IgG3(y3)、IgG4(y4)、IgAl(ctl)、IgA2(ct2)或這些同種型或亞型的改變生物活性的突變。第二多肽可包含人類IgGl的CH2及Ch3結構域或這些結構域的任一個或兩個的部分。作為實例實施方案，包含人類IgGl的Ch2及Ch3結枸域或其部分的多肽可包含SEQIDNO:40(圖l)或其部分。在一實施方案中，包含人類IgGl的CH2及CH3結構域或其部分的多肽可包含SEQIDNO:38或其片段。免疫球蛋白肽可通過核酸序列SEQIDNO:39或SEQIDNO:41(圖1)編碼。SEQIDNO:38或SEQIDNO:40中的免疫球蛋白序列還可通過SEQIDNO:52或SEQIDNO:53(圖l)編碼，其中在序列的C末端編碼脯氨酸(CCG至CCC)及甘氨酸(GGT至GGG)的密碼子的沉默鹼基變化移除末端密碼子附近的隱含RNA剪接位點(即SEQIDNO:39的核苷酸622-627經修飾產生SEQIDNO:52或SEQIDNO:41的核苷酸652-657經修飾產生SEQIDNO:53)。免疫球蛋白鏈的Fc部分的鉸鏈區在活體內可為促炎性的。因此在一實施方案中，本發明的RAGE融合蛋白包含來源於RAGE的域間連接子而非來源於免疫球蛋白的域間鉸鏈多肽。因此在某些實施方案中，RAGE融合蛋白可包含直接連接於包含免疫球蛋白的C2結構域或免疫球蛋白的C2結構域的片段或部分的多肽的RAGE多肽。在一實施方案中，CH2結構域或其片段包含SEQIDNO:42(圖1)。在一實施方案中，SEQIDNO:42的片段包含其中前十個胺基酸包含至少一部分所移除的Fc鉸鏈區的SEQIDNO:42。在一實施方案中，RAGE多肽可包含配體結合位點。RAGE配體結合位點可包含RAGE的V結構域或其部分。在一實施方案中，RAGE配體結合位點包含SEQIDNO:9或與其至少90%—致的序列或SEQIDNO:IO或與其至少90°/。一致的序列或SEQIDNO:47或與其至少90%—致的序列。用於本發明的RAGE融合蛋白中的RAGE多肽可包含RAGE免疫球蛋白域。另外或可選擇地，RAGE的片段可包含域間連接子。或者，RAGE多肽可包含連接至上遊(即更接近N末端)或下遊(即更接近C末端)域間連接子的RAGE免疫球蛋白域。在另一實施方案中，RAGE多肽可包含兩個(或兩個以上)RAGE免疫球蛋白域，各通過域間連接子彼此連接。RAGE多肽可進一步包含通過一或多個域間連接子彼此連接且具有連接至N末端RAGE免疫球蛋白域和/或C末端免疫球蛋白域的末端域間連接子的多個RAGE免疫球蛋白域。RAGE免疫球蛋白域與域間連接子的額外組合在本發明的範圍內。在一實施方案中，RAGE多肽包含連接於RAGE免疫球蛋白域的RAGE域間連接子，使得RAGE免疫球蛋白域的C末端胺基酸連接於域間連接子的N末端胺基酸，且RAGE域間連接子的C末端胺基酸直接連接於包含免疫球蛋白的CH2結構域或其片段的多肽的N末端胺基酸。包含免疫球蛋白的CH2結構域的多肽可包含人類IgGl的CH2及CH3結構域或這些結構域的任一個或兩個的部分。作為實例實施方案，包含人類IgGl的CH2及CH3結構域或其部分的多肽可包含SEQIDNO:40或其部分。在一實施方案中，包含人類IgGl的Ch2及Ch3結枸域或其部分的多肽可包含SEQIDNO:38或其片段。或人類IgGl可包含其中移除末端賴氨酸(K)的SEQIDNO:38或SEQIDNO:40。如上文所述，本發明的RAGE融合蛋白可包含單個或多個來自RAGE的結構域。而且，包含連接於RAGE多肽域的域間連接子的RAGE多肽可包含全長RAGE蛋白的片段。例如，RAGE多肽可包含人類RAGE的胺基酸23-136(SEQIDNO:15)或與其至少90。/。一致的序列或人類RAGE的胺基酸24-136(SEQIDNO:16)或與其至少90%—致的序列或其中Q24環化以形成pE的人類RAGE的胺基酸24-136(SEQIDNO:49)或與其至少90%—致的序列，對應於RAGE的V結構域及下遊域間連接子。或者，RAGE多肽可包含人類RAGE的胺基酸23-251(SEQIDNO:19)或與其至少90%—致的序列或人類RAGE的胺基酸24-251(SEQIDNO:20)或與其至少90%—致的序列或其中Q24環化以形成pE的人類RAGE的胺基酸24-251(SEQIDNO:51)或與其至少90%—致的序列，對應於V結構域、CI結構域、連接這兩個結構域的域間連接子及CI下遊的第二域間連接子。例如，在一實施方案中，RAGE融合蛋白可包含兩個來源於RAGE蛋白的免疫球蛋白域及兩個來源於人類Fc多肽的免疫球蛋白域。RAGE融合蛋白可包含連接於第二RAGE免疫球蛋白域及第二RAGE域間連接子的第一RAGE免疫球蛋白域及第一RAGE域間連接子，以便第一域間連接子的N末端胺基酸連接於第一RAGE免疫球蛋白域的C末端胺基酸，第二RAGE免疫球蛋白域的N末端胺基酸連接於第一域間連接子的C末端胺基酸，第二域間連接子的N末端胺基酸連接於第二RAGE免疫球蛋白域的C末端胺基酸，且RAGE第二域間連接子的C末端胺基酸直接連接於CH2免疫球蛋白域的N末端胺基酸。在替代實施方案中，四域RAGE融合蛋白通過SEQIDNO:30或SEQIDNO:54編碼(圖2)。在一實施方案中，四域RAGE融合蛋白可包含SEQIDNO:32(圖4)。在替代實施方案中，四域RAGE融合蛋白包含SEQIDNO:33、SEQIDNO:34或SEQIDNO:56(圖4)。可選擇地，三域RAGE融合蛋白可包含一個來源於RAGE的免疫球蛋白域及兩個來源於人類Fc多肽的免疫球蛋白域。例如，RAGE融合蛋白可包含經由RAGE域間連接子連接於CH2免疫球蛋白域或CH2免疫31球蛋白域的部分的N末端胺基酸的單個RAGE免疫球蛋白域。在替代實施方案中，三域RAGE融合蛋白通過SEQIDNO:31或SEQIDNO:55編碼(圖3)。在一實施方案中，三域RAGE融合蛋白可包含SEQIDNO:35(圖5)。在替代實施方案中，三域RAGE融合蛋白可包含SEQIDNO:36、SEQIDNO:37或SEQIDNO:57(圖5)。RAGE域間連接子片段可包含天然為RAGE免疫球蛋白域的下遊且因此連接至RAGE免疫球蛋白域的肽序列。例如，對RAGEV結構域而言，域間連接子可包含天然為來自V結構域下遊的胺基酸序列。在一實施方案中，連接子可包含SEQIDNO:21,對應於全長RAGE的胺基酸117-123。或者連接子可包含具有天然RAGE序列的額外部分的肽。例如，可使用包含SEQIDNO:21的上遊及下遊的數個胺基酸(例如1-3、1-5或1-10或1-15個胺基酸)的域間連接子。因此在一實施方案中，域間連接子包含SEQIDNO:23，SEQIDNO:23包含全長RAGE的胺基酸117-136。或者可使用自連接子的任一末端刪除(例如)l、2或3個胺基酸的SEQIDNO:21的片段。在替代實施方案中，連接子可包含與SEQIDNO:21或SEQIDNO:23至少70%、75%、80°/。、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%—致的肽。對RAGECI結構域而言，連接子可包含天然為CI結構域下遊的肽序列。在一實施方案中，連接子可包含SEQIDNO:22，對應於全長RAGE的胺基酸222-251。或者連接子可包含具有天然RAGE序列的額外部分的肽。例如，可使用包含SEQIDNO:22的上遊及下遊的數個胺基酸(例如1-3個、1-5個或1-10個或1-15個胺基酸)的域間連接子。或者，可使用自連接子的任一末端刪除(例如)1-3個、1-5個或1-10個或1-15個胺基酸的SEQIDNO:22的片段。例如，在一實施方案中，RAGE域間連接子可包含SEQIDNO:24，對應於胺基酸222-226。在替代實施方案中，連接子可包含與SEQIDNO:22或SEQIDNO:24至少70%、75%、80%、85%、90°/。、95%、96°/。、97%、98%或99%—致的肽。或者域間連接子可包含SEQIDNO:44,對應於RAGE胺基酸318-342。在替代實施方案中，連接子可包含與SEQIDNO:44至少70%、75°/。、80°/。、85%、90%、95%、96°/。、97%、98%或99°/。一致的肽。此外，本領域技術人員認識到在編碼序列中改變、添加或刪除單個胺基酸或小百分比的胺基酸(通常少於約5%，更通常少於約1%)的個別取代、刪除或添加為保守修飾變化，其中這類改變導致化學上類似的胺基酸取代胺基酸。提供功能上類似的胺基酸的保守取代在本
技術領域：
中熟知。以下實例組各含有彼此保守取代的胺基酸1)丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T);2)天冬氨酸(D)、穀氨酸(E);3)天冬醯胺(N)、穀氨醯胺(Q);4)精胺酸(R)、賴氨酸(K);5)異亮氨酸(1)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V);及6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。保守取代為其中取代胺基酸(天然產生或經修飾)在結構上與被取代的胺基酸相關(即具有與被取代的胺基酸相同大小及電學性質)的取代。因此，取代胺基酸在側鏈中具有與原胺基酸相同或類似的官能團。"保守取代"還指利用與被取代的胺基酸相同但側鏈中官能團經適合保護基團保護的取代胺基酸。如本
技術領域：
中已知，胺基酸可自其天然結構通過酶促或非酶促反應機制來進行化學修飾。例如，在一實施方案中，N末端穀氨酸或穀氨醯胺可在失去水時環化形成焦穀氨酸(pyroE或pE)(Chelius等人，J/za/.C力e/z，78:2370—2376(2006)及Burstein等人，戶roc.^"'o/a7Sc/.，73:2604-2608(1976))。可選擇地，可通過編碼蛋白質中經由翻譯後加工變成N末端的位置處的穀氨酸的核酸序列(例如在SEQIDNO:1的殘基24為穀氨酸而非穀氨醯胺的情況下)潛在評估具有N末端焦穀氨酸的融合蛋白。產生RAGE融合蛋白的方法
技術領域：
：本發明還包含一種製備RAGE融合蛋白的方法。因此在一實施方案中，本發明包含一種製備RAGE融合蛋白的方法，該方法包含將連接於33第二非RAGE多肽的RAGE多肽共價連接的步驟，其中RAGE多肽包含RAGE配體結合位點。例如，經連接的RAGE多肽及第二非RAGE多肽可通過重組DNA構建體編碼。該方法可進一步包含將DNA構建體併入表達載體的步驟。該方法還可包含將表達栽體插入宿主細胞中的步驟。例如，本發明的實施方案提供包含連接於第二非RAGE多肽的RAGE多肽的RAGE融合蛋白。在一實施方案中，RAGE融合蛋白可包含RAGE配體結合位點。在一實施方案中，配體結合位點包含RAGE融合蛋白的大部分N末端結構域。RAGE配體結合位點可包含RAGE的V結構域或其部分。在一實施方案中，RAGE配體結合位點包含SEQIDNO:9或與其至少90°/。一致的序列或SEQIDNO:10或與其至少90°/。一致的序列或SEQIDNO:47或與其至少90%—致的序列。在一實施方案中，RAGE多肽可連接於包含免疫球蛋白域或免疫球蛋白域的部分(例如其片段)的多肽。在一實施方案中，包含免疫球蛋白域的多肽包含人類IgG的CH2或CH3結構域中至少一個的至少一部分。因此，本發明的實施方案可包含編碼本發明的RAGE融合蛋白的經分離DNA分子。在某些實施方案中，該DNA分子編碼包含如SEQIDNO:56或SEQIDNO:57中所述的胺基酸序列或與其至少70%、75%、80°/。、85%、90°/。、95%、96°/。、97%、98°/。或99%—致的序列的RAGE融合蛋白。例如，在某些實施方案中，與SEQIDNO:56或SEQIDNO:57至少90%—致的序列包含無C末端賴氨酸的SEQIDNO:56或SEQIDNO:57的序列。因此在某些實施方案中，本發明可包含具有如SEQIDNO:54或SEQIDNO:55中所述的序列或與其至少90%—致的序列的DNA分子。RAGE融合蛋白可經重組DNA4支術進行工程改造。例如，在一實施方案中，本發明可包含經分離的核酸序列，該核酸序列包含編碼連接於第二非RAGE多肽的RAGE多肽的多核苷酸序列、與其互補或與其具有顯著一致性。在一實施方案中，RAGE多肽可包含RAGE配體結合位佔,、、、oRAGE蛋白或多肽可包含全長人類RAGE(例如SEQIDNO:l)或人類RAGE的片段。在一實施方案中，RAGE多肽不包括任何信號序列殘基。RAGE信號序列可包含全長RAGE(SEQIDNO:l)的殘基l-22或殘基1-23。在替代實施方案中，RAGE多肽可包含與人類RAGE至少70°/。、75%、80%、85%、90%、95°/。、96%、97%、98%或99%—致的序列或其片段。例如，在一實施方案中，RAGE多肽可包含人類RAGE或其片段，其中甘氨酸而非甲硫氨酸作為第一殘基(例如參見Neeper等人，(1992))。或者，人類RAGE可包含移除信號序列的全長RAGE(例如SEQIDNO:2或SEQIDNO:3)(圖1A及IB)或該胺基酸序列的部分。本發明的RAGE融合蛋白還可包含sRAGE(例如SEQIDNO:4)、與sRAGE至少90%—致的多肽或sRAGE的片段。例如，RAGE多肽可包含人類sRAGE或其片段，其中甘氨酸而非曱硫氨酸作為第一殘基(例如參見Neeper等人,(1992))。或者人類RAGE可包含移除信號序列的sRAGE(例如參見圖1中SEQIDNO:5、SEQIDNO:6或SEQIDNO:45)或該胺基酸序列的部分。在其它實施方案中，RAGE蛋白可包含V結構域(例如參見圖1中SEQIDNO:7、SEQIDNO:8或SEQIDNO:46)。或者，可使用與V結構域或其片段至少90%—致的序列。或者，RAGE蛋白可包含RAGE片段，該RAGE片段包含V結構域的部分(例如參見圖1中SEQIDNO:9、SEQIDNO:10或SEQIDNO:47)。在一實施方案中，配體結合位點可包含SEQIDNO:9或與其至少90%—致的序列或SEQIDNO:10或與其至少90%—致的序列或SEQIDNO:47或與其至少90%—致的序列。在另一實施方案中，RAGE片段為合成肽。在一實施方案中，核酸序列包含SEQIDNO:25以編碼人類RAGE的胺基酸1-118或其片段。例如，包含SEQIDNO:25的核苷酸1-348的序列可用於編碼人類RAGE的胺基酸1-116。或者，核酸可包含SEQIDNO:26以編碼人類RAGE的胺基酸l-123。或者，核酸可包含SEQIDNO:27以編碼人類RAGE的胺基酸1-136。或者，核酸可包含SEQIDNO:28以編碼人類RAGE的胺基酸1-230。或者，核酸可包含SEQIDNO:29以編碼人類RAGE的胺基酸1-251。或這些核酸序列的片段可用於編碼RAGE多肽片段。RAGE融合蛋白可包括並非來源於RAGE或其片段的數種類型的肽。RAGE融合蛋白的第二多肽可包含來源於免疫球蛋白的多肽。重鏈(或其部分)可來源於任一已知重鏈同種型IgG(y)、IgM(M)、IgD(5)、IgE(s)或IgA(a)。此外，重鏈(或其部分)可來源於任一已知的重鏈亞型IgGl(yl)、IgG2(y2)、IgG3(y3)、IgG4(y4)、IgAl(al)、IgA2(cc2)或這些同種型或亞型的改變生物活性的突變。第二多肽可包含人類IgGl的(:2及(:3結構域或這些結構域中的任一個或兩個的部分。作為實例實施方案，包含人類IgGl的&2及"3結構域或其部分的多肽可包含SEQIDN0:38或SEQIDNO:40。在一實施方案中，包含人類IgGl的CH2及CH3結構域或其部分的多肽可包含SEQIDNO:38或其片段。免疫球蛋白肽可通過核酸序列SEQIDNO:39或SEQIDNO:41編碼。在替代實施方案中，SEQIDNO:38或SEQIDNO:40中的免疫球蛋白序列還可分別通過SEQIDNO:52或SEQIDNO:53編碼。免疫球蛋白鏈的Fc部分的鉸鏈區在活體內可能是促炎性的。因此，本發明的RAGE融合蛋白可包含來源於RAGE的域間連接子而非來源於免疫球蛋白的域間鉸鏈多肽。因此在一實施方案中，本發明包含一種製備RAGE融合蛋白的方法，該方法包含將RAGE多肽共價連接於包含免疫球蛋白的CH2結構域或免疫球蛋白的CH2結構域的部分的多肽的步驟。在一實施方案中，RAGE融合蛋白可包含RAGE配體結合位點。RAGE配體結合位點可包含RAGE的V結構域或其部分。在一實施方案中，RAGE配體結合位點包含SEQIDNO:9或與其至少90%—致的序列或SEQIDNO:IO或與其至少90。/。一致的序列或SEQIDNO:47或與其至少90%—致的序列。在一實施方案中，RAGE融合蛋白可由重組DNA構建體編碼。該方法可包含將DNA構建體併入表達載體的步驟。該方法還可包含將表達栽體轉染至宿主細胞中。因此，本發明的實施方案還包含編碼DNA分子的表達載體，該DNA分子編碼本發明的RAGE融合蛋白。在某些實施方案中，DNA分子編碼包含如SEQIDNO:56或SEQIDNO:57中所述的胺基酸序列或與其至少70%、75%、80%、85°/。、90%、95%、96%、97%、98%或99°/。一致的序列的RAGE融合蛋白。例如，在某些實施方案中，與SEQIDNO:56或SEQIDNO:57至少90°/。一致的序列包含無C末端賴氨酸的SEQIDNO:56或SEQIDNO:57的序列。本發明的其它實施方案還包含經編碼DNA分子(編碼本發明的RAGE融合蛋白)的表達栽體轉染的細胞。在某些實施方案中，DNA分子編碼包含如SEQIDNO:56或SEQIDNO:57中所述的胺基酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96°/。、97%、98%或99%—致的序列的RAGE融合蛋白。例如，在某些實施方案中，與SEQIDNO:56或SEQIDNO:57至少90%—致的序列包含無C末端賴氨酸的SEQIDNO:56或SEQIDNO:57的序列。例如，在一實施方案中，本發明包含編碼直接連接於包含免疫球蛋白的CH2結構域的多肽的RAGE多肽或其片段的核酸。在一實施方案中，CH2結構域或其片段包含SEQIDNO:42。在一實施方案中，SEQIDNO:42的片段包含移除前十個胺基酸的SEQIDNO:42。第二多肽可包含人類IgGl的(:2及"3結構域。作為實例實施方案，包含人類IgGl的CH2及CH3結構域的多肽可包含SEQIDNO:38或SEQIDNO:40。在一實施方案中，包含人類IgGl的(:2及"3結構域或其部分的多肽可包含SEQIDNO:38或其片段。免疫球蛋白肽可通過核酸序列SEQIDNO:39或SEQIDNO:41編碼。SEQIDNO:38或SEQIDNO:40中的免疫球蛋白序列還可通過SEQIDNO:52或SEQIDNO:53編碼，其中在序列的C末端編碼脯氨酸(CCG至CCC)及甘氨酸(GGT至GGG)的密碼子的沉默鹼基變化移除末端密碼子附近的隱含RNA剪接位點(即SEQIDNO:39的核苷酸622-627經修飾產生SEQIDNO:52或SEQIDNO:41的核普酸652-657經修飾產生SEQIDNO:53)。在一實施方案中，RAGE多肽可包含連接於RAGE免疫球蛋白域的RAGE域間連接子，以便RAGE免疫球蛋白域的C末端胺基酸連接於域間連接子的N末端胺基酸，且RAGE域間連接子的C末端胺基酸直接連接於包含免疫球蛋白的CH2結構域或其片段的多肽的N末端胺基酸。包含免疫球蛋白的CH2結構域或其部分的多肽可包含一多肽，該多肽包含人類IgGl的CH2及Ch3結構域或這些結構域兩個或任一個的部分。作為實例實施方案，包含人類IgGl的Ch2及Ch3結枸域或其部分的多肽可包含SEQIDNO:38或SEQIDNO:40。在一實施方案中，包含人類IgGl的CH2及CH3結構域或其部分的多肽可包含SEQIDNO:38或其片段。在某些實施方案中，包含人類IgGl的CH2及CJ結構域或其部分的多肽可包含移除C末端賴氨酸(K)的SEQIDNO:38或SEQIDNO:40。本發明的RAGE融合蛋白可包含單個或多個來自RAGE的結構域。包含連接於RAGE免疫球蛋白域的域間連接子的RAGE多肽還可包含全長RAGE蛋白的片段。例如，在一實施方案中，RAGE融合蛋白可包含兩個來源於RAGE蛋白的免疫球蛋白域及兩個來源於人類Fc多肽的免疫球蛋白域。RAGE融合蛋白可包含連接於第二RAGE免疫球蛋白域及第二RAGE域間連接子的第一RAGE免疫球蛋白域及第一域間連接子，以便第一域間連接子的N末端胺基酸連接於第一RAGE免疫球蛋白域的C末端胺基酸，第二RAGE免疫球蛋白域的N末端胺基酸連接第一域間連接子的C末端胺基酸，第二域間連接子的N末端胺基酸連接於RAGE第二免疫球蛋白域的C末端胺基酸，且RAGE第二域間連接子的C末端胺基酸直接連接於包含CH2免疫球蛋白域或其片段的多肽的N末端胺基酸。例如，RAGE多肽可包含人類RAGE的胺基酸23-251(SEQIDNO:19)或與其至少90。/。一致的序列或人類RAGE的胺基酸24-251(SEQIDNO:20)或與其至少90°/。一致的序列，或其中Q24環化以形成pE的人類RAGE的胺基酸24-251(SEQIDNO:51)或與其至少90%—致的序列，對應於V結構域、CI結構域、連接這兩個結構域的域間連接子及CI下遊的第二域間連接子。在一實施方案中，包含SEQIDNO:30或其片段的核酸構建體可編碼四域RAGE融合蛋白(圖2A)。在另一實施方案中，包含SEQIDNO:54(圖2B)的核酸構建體可編碼四域RAGE融合蛋白，其中加入在序列的C末端編碼脯氨酸(CCG至CCC)及甘氨酸(GGT至GGG)38的密碼子的沉默鹼基變化以移除末端密碼子附近的隱含RNA剪接位點(即SEQIDNO:30的核苷酸1375-1380經修飾產生SEQIDNO:54)。可選擇地，三域RAGE融合蛋白可包含一個來源於RAGE的免疫球蛋白域及兩個來源於人類Fc多肽的免疫球蛋白域。例如，RAGE融合段的多肽的N末端胺基酸的單個RAGE免疫球蛋白域。例如，RAGE多肽可包含人類RAGE的胺基酸23-136(SEQIDNO:15)或與其至少90%一致的序列或人類RAGE的胺基酸24-136(SEQIDNO:16)或與其至少90%—致的序列，或其中Q24環化以形成pE的人類RAGE的胺基酸24-136(SEQIDNO:49)或與其至少90%—致的序列，對應於RAGE的V結構域及下遊域間連接子(圖1)。在一實施方案中，包含SEQIDNO:31或其片段的核酸構建體可編碼三域RAGE融合蛋白(圖3A)。在另一實施方案中，包含SEQIDNO:55的核酸構建體可編碼三域RAGE融合蛋白，其中在序列的C末端編碼脯氨酸(CCG至CCC)及甘氨酸(GGT至GGG)的密碼子的沉默鹼基變化移除末端密碼子附近的fe含RNA剪接位點(即SEQIDNO:31的核苦酸1030-1035經修飾產生SEQIDNO:55)(圖3B)。RAGE域間連接子片段可包含天然為RAGE免疫球蛋白域的下遊且因此連接至RAGE免疫球蛋白域的肽序列。例如，對RAGEV結構域而言，域間連接子可包含天然為V結構域下遊的胺基酸序列。在一實施方案中，連接子可包含SEQIDNO:21，對應於全長RAGE的胺基酸117-123。或者連接子可包含具有天然RAGE序列的額外部分的肽。例如，可使用包含SEQIDNO:21的上遊及下遊的數個胺基酸(例如1-3個、1-5個或1-10個或1-15個胺基酸)的域間連接子。因此在一實施方案中，域間連接子包含SEQIDNO:23，SEQIDNO:23包含全長RAGE的胺基酸117-136。或者，可使用自連接子任一末端刪除(例如)1、2或3個胺基酸的SEQIDNO:21的片段。在替代實施方案中，連接子可包含與SEQIDNO:21或SEQIDNO:23至少70%、75°/。、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98°/。或99°/。一致的序列。對RAGECl結構域而言，連接子可包含天然為CI結構域下遊的肽序列。在一實施方案中，連接子可包含SEQIDNO:22，對應於全長RAGE的胺基酸222-251。或者，連接子可包含具有天然RAGE序列的額外部分的肽。例如，可〗吏用包含SEQIDNO:22上遊及下遊的數個胺基酸(l-3個、1-5個或1-IO個或1-15個胺基酸)的連接子。或者，可使用自連接子的任一末端刪除(例如)1-3個、1-5個或1-10個或1-15個胺基酸的SEQIDNO:22的片段。例如，在一實施方案中，RAGE域間連接子可包含SEQIDNO:24，對應於胺基酸222-226。在替代實施方案中，連接子可包含與SEQIDNO:22或SEQIDNO:24至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98°/。或99°/。一致的序列。或者域間連接子可包含SEQIDNO:44，對應於RAGE胺基酸318-342。在替代實施方案中，連接子可包含與SEQIDNO:44至少70%、75%、80%、85%、90%、95°/"96%、97%、98°/。或99%—致的序列。該方法可進一步包含將DM構建體併入表達栽體的步驟。因此在一實施方案中，本發明包含編碼RAGE融合蛋白的表達載體，該RAGE融合蛋白包含直接連接於包含免疫球蛋白的CH2結構域或免疫球蛋白的CH2結構域的部分的多肽的RAGE多肽。在一實施方案中，RAGE多肽包含具有連接至RAGE免疫球蛋白域的RAGE域間連接子的構建體(如本文所述的那些構建體)，以便RAGE免疫球蛋白域的C末端胺基酸連接於域間連接子的N末端胺基酸，且RAGE域間連接子的C末端胺基酸直接連接於包含免疫球蛋白的CH2結構域或其部分的多肽的N末端胺基酸。例如，用於轉染細胞的表達栽體可包含核酸序列SEQIDNO:30或其片段、SEQIDNO:54或其片段、SEQIDNO:31或其片段或SEQIDNO:55或其片段。該方法可進一步包含用本發明的表達載體轉染細胞的步驟。因此在一實施方案中，本發明包含用表達本發明的RAGE融合蛋白的表達栽體轉染的細胞，以便細胞表達包含直接連接於包含免疫球蛋白的CH2結構域或免疫球蛋白的CH2結構域的部分的多肽的RAGE多肽的RAGE融合蛋白。在一實施方案中，RAGE多肽包含具有連接於RAGE免疫球蛋白域的RAGE域間連接子的構建體(如本文所述的那些構建體)，以便RAGE免疫球蛋白域的C末端胺基酸連接於域間連接子的N末端胺基酸且RAGE域間連接子的C末端胺基酸直接連接於包含免疫球蛋白的CH2結構域或其部分的多肽的N末端胺基酸。例如，表達載體可包含核酸序列SEQIDNO:30或其片段、SEQIDNO:54或其片段、SEQIDNO:31或其片段或SEQIDNO:55或其片段。例如，可通過使不同長度的人類RAGEcDNA序列與人類IgGlFc(yl)3'cDNA序列融合來構建質粒以表達RAGE-IgG融合蛋白。可通過使用標準重組技術將表達盒序列插入表達載體，如pcDNA3.1表達栽體(Invitrogen，CA)。該方法還可包含將表達載體轉染至宿主細胞中。RAGE融合蛋白可在哺乳動物表達系統中表達，包括其中通過使用病毒(如反轉錄病毒或腺病毒)將表達構建體導入哺乳動物細胞中的系統。可用作用於表達的宿主的哺乳動物細胞系在本
技術領域：
中是熟知的且包括多種可購自AmericanTypeCultureCollection(ATCC)的永生化細胞系。這些細胞系尤其包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NSO、SP2細胞、海拉細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎細胞(COS)、人肝癌細胞(例如HepG2)、A549細胞及大量其它細胞系。可經由測定哪些細胞系具有高表達水平的RAGE融合蛋白來選擇細胞系。其它可使用的細胞係為昆蟲細胞系，如Sf9細胞。植物宿主細胞包括(例如)菸草屬、擬南芥屬、浮萍、玉米、小麥、馬鈴薯等。細菌宿主細胞包括大腸桿菌(E.coli)及鏈黴菌(Streptomyces)種。酵母宿主細胞包括裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae)及曱醇酵母(Pichiapastoris)。當編碼RAGE融合蛋白基因的重組表達載體導入哺乳動物宿主細胞時，通過培養宿主細胞持續足以使RAGE融合蛋白在宿主細胞中表達或RAGE融合蛋白分泌入宿主細胞生長所在的培養基的時間來產生RAGE融合蛋白。可通過使用標準蛋白純化方法從培養基中重新獲得RAGE融合蛋白。編碼RAGE融合蛋白的核酸分子及包含這些核酸子的表達載體可41用於轉染適合的哺乳動物、植物、細菌或酵母宿主細胞。可通過用於將多核苷酸導入宿主細胞的任何已知方法進行轉化。用於將異種多核糖介導的轉染磷酸鈣沉澱:聚凝胺介導的轉染、原:生質體融合、電穿孔、多核苷酸在脂質體中的封裝及DNA直接顯微注射入細胞核。此外，可通過病毒載體將核酸分子導入哺乳動物細胞內。轉化植物細胞的方法在本
技術領域：
中是熟知的，包括(例如)農桿菌介導的轉化、基因槍轉化、直接注射、電穿孔及病毒轉化。轉化細菌及酵母細胞的方法在本
技術領域：
中也是熟知的。還可使用DNA基因槍技術將表達載體遞送至表達系統中，其中質粒沉澱至微觀粒子(優選為金)上，且將粒子推動至目標細胞或表達系統中。DNA基因槍技術在本
技術領域：
中是熟知的且設備(例如"基因槍")可市售購得以將孩i粒子遞送至細胞(例如HeliosGeneGun,Bio-RadLabs"Hercules,CA)及皮膚(PMEDDevice,PowderMedLtd.，Oxford,UK)中。可使用大量已知技術增強RAGE融合蛋白自產生細胞系的表達。例如，在某些條件下穀氨醯胺合成酶基因表達系統(GS系統)及編碼血漿的抗新黴素系統為增強表達的通用方法。由不同細胞系表達的RAGE融合蛋白可具有彼此不同的糖基化模式。然而，與RAGE融合蛋白的糖基化無關，所有由本文所提供的核酸分子編碼或包含本文所提供的胺基酸序列的RAGE融合蛋白為本發明的部分。在一實施方案中，重組表達載體可轉染至中國倉鼠卵巢細胞(CHO)中且最優化表達。在替代實施方案中，細胞可產生0.1至20克/升或0.5至10克/升或約l至2克/升。如本
技術領域：
中已知，可通過突變，如(例如)通過用包含所關注突變的引物進行核酸模板的PCR擴增來修飾這類核酸構建體。以這種方式，可設計包含對RAGE配體的親和力不同的多肽。在一實施方案中，突變序列可與起始DNA90%或90%以上一致。因此，變異體可包括在嚴格條件(即相當於比l摩爾鹽中DM雙鏈體的解鏈溫度(TM)低約20°C至27。C)下雜交的核苷酸序列。可通過將表達栽體轉染至適當宿主中來表達編碼序列。例如，重組載體可穩定轉染至中國倉鼠卵巢(CH0)細胞中且選擇及克隆表達RAGE融合蛋白的細胞。在一實施方案中，針對質粒編碼的新黴素抗性，通過應用抗生素G418來選擇表達重組構建體的細胞。可選擇單獨克隆且可擴增如通過蛋白質印跡分析細胞上清液所檢測的表達高水平重組蛋白的克隆，且通過使用蛋白A柱的親和層析法來純化基因產物。編碼本發明的RAGE融合蛋白的重組核酸的樣品實施方案展示於圖2及3中。例如，如上文所述，通過重組DNA構建體而產生的RAGE融合蛋白可包含連接於第二非RAGE多肽的RAGE多肽。RAGE融合蛋白可包含兩個來源於RAGE蛋白的結構域及兩個來源於免疫球蛋白的結構域。編碼具有此類結構的RAGE融合蛋白TTP-4000(TT4)的實例核酸構建體展示於圖2中(SEQIDNO:30及SEQIDNO:54)。如SEQIDNO:30及SEQIDNO:54所示，編碼序列1-753(以粗體突出)編碼RAGEN末端蛋白序列，而序列754-1386編碼無鉸鏈的IgGFc蛋白序列。當來源於SEQIDNO:30或SEQIDNO:54或與其至少90%—致的序列時，RAGE融合蛋白可包含SEQIDNO:32的四域胺基酸序列或移除信號序列的多肽(例如參見圖4中SEQIDNO:33、SEQIDNO:34或SEQIDNO:56)。在SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34或SEQIDNO:56中，RAGE胺基酸序列以粗體突出。免疫球蛋白序列為無鉸鏈區的IgG的Ch2及Ch3免疫球蛋白域。圖6展示在RAGE及IgG中發現的多肽域的比較(圖6A)及RAGE融合蛋白TTP-3000及TTP-4000的域結構。如圖6B所示，全長TTP-4000RAGE融合蛋白的前251個胺基酸含有包含胺基酸1-22/23的信號序列、包含胺基酸23/24-116的V免疫球蛋白域(包括配體結合位點)、包含胺基酸117至123的域間連接子、包含胺基酸124-221的第二免疫球蛋白域(Cl)及包含胺基酸222-251的下遊域間連接子作為RAGE多肽序列。在一實施方案中，RAGE融合蛋白可無需包含第二RAGE免疫球蛋白域。例如，RAGE融合蛋白可包含一個來源於RAGE的免疫球蛋白域及兩個來源於人類Fc多肽的免疫球蛋白域。編碼此類RAGE融合蛋白的實例核酸構建體展示於圖3中(SEQIDNO:31及SEQIDNO:55)。如SEQIDNO:31及SEQIDNO:55所示，來自核普酸1-408的編碼序列(以粗體突出)編碼RAGEN末端蛋白序列，而來自409-1041的序列編碼IgGlFc(yl)蛋白序列。當來源於SEQIDNO:31或SEQIDNO:55或與其至少90°/。一致的序列時，RAGE融合蛋白可包含SEQIDNO:35的三域胺基酸序列或移除信號序列的多肽(例如參見圖5中SEQIDNO:36、SEQIDNO:37或SEQIDNO:57)。在圖5中SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37或SEQIDNO:57中，RAGE胺基酸序列以粗體突出。如圖6B所示，全長TTP-3000RAGE融合蛋白的前136個胺基酸含有包含胺基酸1-22/23的信號序列、包含胺基酸23/24-116的V免疫球蛋白域(包括配體結合位點)及包含胺基酸117至136的域間連接子作為RAGE多肽序列。序列137至346包括先鉸鏈區的IgG的Ch2及Ch3免疫球蛋白域。本發明的RAGE融合蛋白可包含比不包含第二多肽的RAGE多肽改良的體內穩定性。RAGE融合蛋白可經進一步修飾以增加穩定性、功效、效能及生物可用性。因此，可通過翻譯後加工或通過化學修飾來修飾本發明的RAGE融合蛋白。例如，可合成製備RAGE融合蛋白以包括L-、D-或非天然胺基酸、ct雙取代胺基酸或N-烷基胺基酸。此外，可通過乙醯化、醯基化、ADP-核糖基化、醯胺化、脂質(如磷脂醯肌醇)連接、二硫鍵形成等等來修飾蛋白質。此外，可添加聚乙二醇以增加RAGE融合蛋白的生物穩定性。RAGE拮抗劑與RAGE融合蛋白的結合本發明的RAGE融合蛋白可包含許多應用。例如，本發明的RAGE融合蛋白可用於結合試驗中以鑑別RAGE配體(如RAGE激動劑、拮抗劑或調節劑)。例如，在一實施方案中，本發明提供一種檢測RAGE調節劑的方法，該方法包含(a)提供包含連接於第二非RAGE多肽的RAGE多肽的RAGE融合蛋白，其中RAGE多肽包含配體結合位點；(b)將所關注化合物及已知的對RAGE具有結合親和力的配體與RAGE融合蛋白混合；及(c)測量在所關注化合物存在下已知的RAGE配體與RAGE融合蛋白的結合。在一實施方案中，配體結合位點包含RAGE融合蛋白的大部分N末端結構域。RAGE融合蛋白還可提供用於檢測RAGE調節劑的試劑盒。例如，在一實施方案中，本發明的試劑盒可包含(a)已知對RAGE具有結合親和力的化合物作為陽性對照；(b)包含連接於第二非RAGE多肽的RAGE多肽的RAGE融合蛋白，其中RAGE多肽包含RAGE配體結合位點；及(c)使用說明。在一實施方案中，配體結合位點包含RAGE融合蛋白的大部分N末端結構域。例如，RAGE融合蛋白可用於結合試驗中以鑑別潛在的RAGE配體。在該結合試驗的一個實例實施方案中，可將已知的RAGE配體以每孔約5微克的濃度塗布至固體基質(例如Maxisorb板)上，其中各孔含有約IOO微升UL)的總體積。可在4。C下將所述板溫育隔夜以允許配體吸收或結合基質。或者可使用較高溫度(例如室溫)下較短溫育時間。在允許配體結合基質的時期後，可吸乾試驗孔且可添加封閉緩衝劑(例如50mM咪唑緩衝劑中的1%BSA，pH7.2)以封閉非特異性結合。例如，可在室溫下將封閉緩沖劑添加至板中歷時1小時。接著可將板吸乾和/或用洗滌緩衝劑洗滌。在一實施方案中，包含20mM咪唑、150mMNaCl、0.05%Tween-20、5mMCaCh及5mMMgCl2的緩衝劑(pH7.2)可用作洗滌緩衝劑。接著以漸增的稀釋度將RAGE融合蛋白添加至試驗孔中。接著可使RAGE融合蛋白與固定化的配體在試驗孔中溫育以便結合可達到平衡。在一實施方案中，使RAGE融合蛋白與固定化的配體在37。C下溫育約l小時。在替代實施方案中，可使用較低溫度下較長溫育時間。在溫育RAGE融合蛋白及固定化的配體後，可洗滌板以移除任何未結合的RAGE融合蛋白。結合固定化的配體的RAGE融合蛋白可以多種方式檢測。在一實施方案中，使用ELISA檢測。因此在一實施方案中，可將含有單克隆小鼠抗人類IgGl、生物素化的山羊抗小鼠IgG及抗生物素蛋白連接的鹼性磷酸酶的免疫檢測複合物添加至固定在試驗孔中的RAGE融合蛋白。可使免疫檢測複合物結合已固定的RAGE融合蛋白以便RAGE融合蛋白與免疫檢測複合物之間的結合達到平衡。例如，可在室溫下使複合物結合RAGE融合蛋白歷時1小時。在此時，可通過用洗滌緩衝劑洗滌試驗孔來移除任何未結合的複合物。可通過添加鹼性磷酸酶底物對硝基苯磷酸脂(PNPP)及測量PNPP轉變成對硝基苯酚(PNP)使得405mii處吸光率增加來檢測結合的複合物。在一實施方案中，RAGE配體以納摩爾(nM)或微摩爾(iaM)的親和力結合RAGE融合蛋白。說明RAGE配體結合本發明的RAGE融合蛋白的實驗展示於圖7中。製備分別具有1.082mg/mL及370jag/mL的初始濃度的TTP-3000(TT3)及TTP-4000(TT4)溶液。如圖7所示，在不同稀釋度下RAGE融合蛋白TTP-300Q及TTP-400G能夠結合固定化的RAGE配體澱粉狀蛋白P(A0)(購自Biosource的澱粉狀蛋白P(1-40))、S100b(S100)及兩性蛋白(Ampho)，導致吸光率增加。在配體不存在下(即僅以BSA塗布)，吸光率未增加。本發明的結合試驗可用於定量結合RAGE的配體。在替代實施方案中，RAGE配體可以從0.1至1000納摩爾(nM)或從1nM至500nM或從10nM至80nM範圍的結合親和力結合本發明的RAGE融合蛋白。本發明的RAGE融合蛋白還可用以鑑別能結合RAGE的化合物。如圖8及9分別所示，可評估RAGE配體與固定化的澱粉狀蛋白P竟爭結合TTP-4000(TT4)或TTP-3000(TT3)RAGE融合蛋白的能力。因此可見在10jaM最終試驗濃度(FAC)下的RAGE配體可置換在起始TTP-4000溶液(圖8)或TTP-3000(圖9)的1:3、1:10、1:30及1:100濃度下RAGE融合蛋白與澱粉狀蛋白13的結合。細胞效應物的調控本發明的RAGE融合蛋白的實施方案可用於調控RAGE介導的生物反應。例如，可設計RAGE融合蛋白以調控RAGE誘導的基因表達增加。因此在一實施方案中，本發明的RAGE融合蛋白可用於調控生物酶的功能。例如，RAGE與其配體之間的相互作用可產生氧化應激及NF-KB和NF-kB調節的基因(如細胞因子IL-1P、TNF-ct等等)的活化。此外，已顯示若干其它調節途徑(如涉及p21ras、MAP激酶、ERK1及ERn的那些途徑)通過AGE和其它配體與RAGE的結合而活化。本發明的RAGE融合蛋白調控細胞效應物TNF-oc的表達的用途展示於圖10中。THP-1骨髓細胞可在補充有10°/。FBS的RPMI-1640培養基中培養且可通過用S100b刺激RAGE來誘導分泌TNF-a。當該刺激在RAGE融合蛋白存在下發生時，可抑制通過S100b結合RAGE對TNF-ct的誘導。因此如圖IO所示，添加10TTP-3000(TT3)或TTP-4000(TT4)RAGE融合蛋白將使TNF-a的S100b誘導減少約50%至75%。RAGE融合蛋白TTP-400Q在阻斷S100b誘導TNF-a方面至少與sRAGE—樣有效(圖10)。通過僅添加IgG至S100b刺激的細胞的實驗展示TTP-4000及TTP-3000的RAGE序列的抑制特異性。將IgG及S100b添加至試驗顯示與添加單獨S100b相同的TNF-cc水平。在另一基於細胞的試驗中，評估TTP-4000防止RAGE配體HMGBl與RAGE及其它HMGBl受體相互作用的能力。不^f象結合RAGE的抗RAGE抗體，為防止RAGE配體與RAGE相互作用，TTP-4000可通過結合RAGE配體來阻斷RAGE配體與RAGE的相互作用。已報導HMGBl為RAGE及Toll樣受體2及4的配體(Park等人，/C力e瓜，2004;279(9):7370-7)。所有這三個受體(RAGE、Tol1樣受體2及Tol1樣受體4)均表達於THP-1細胞上(Parker等人，//邊/z7"/20/.，2004，172(8):4977-86)。在該實驗中，在TTP4000或抗RAGE抗體存在或不存在下通過HMGBl(50mg/mL)刺激THP-1細胞以產生TNF-a。在用於試驗的條件下，HMGBl應為TNF-a的唯一誘導物質。圖11中的結果證實抗RAGE抗體及RAGE融合蛋白TTP-4000阻斷HMGBl與在THP-1細胞上表達的RAGE相互作用，且TTP-4000比抗RAGE抗體更大程度地抑制HMGBl誘導的TNF-a產生。因此，數據表明通過抑制HMGBl與Toll樣受體247和4以及存在於THP-1細胞上的RAGE相互作用，TTP-4000比抗RAGE抗體更大程度地抑制HMGB1活性。RAGE融合蛋白的生理特徵雖然sRAGE在調節RAGE介導的疾病中具有治療益處，但基於sRAGE在血漿中相對短的半衰期，人類sRAGE作為卓越治療劑存在限制。例如，雖然在正常及糖尿病大鼠中齧齒動物sRAGE具有約20小時的半衰期，但當通過保留免疫活性sRAGE來評估時人類sRAGE具有少於2小時的半衰期(Renard等人，/.戶力ar鵬co/.^77.77er.，290:1458-1466(1999))。為產生具有與sRAGE相似的結合特徵但具有更穩定的藥代動力學概況的RAGE治療劑，可使用包含連接至一個或多個人類免疫球蛋白域的RAGE配體結合位點的RAGE融合蛋白。如本
技術領域：
中已知，免疫球蛋白域可包括免疫球蛋白重鏈的Fc部分。免疫球蛋白Fc部分可賦予RAGE融合蛋白若干特徵。例如，Fc融合蛋白可增加這類融合蛋白的血清半衰期，通常從數小時至數天。藥代動力學穩定性的增加一般為Fc片段的CH2與CH3區之間的連接子與FcRn受體相互作用的結果(Wines等人，/.//zm;mo厶，164:5313-5318(2000))。雖然包含免疫球蛋白Fc多肽的融合蛋白可提供增加的穩定性的優點，但當導入宿主時免疫球蛋白融合蛋白可引起炎症反應。炎症反應在很大程度上可歸因於融合蛋白的免疫球蛋白的Fc部分。若目標在需要消除的有病細胞類型(例如癌細胞、引起自身免疫疾病的大量淋巴細胞)上表達，則促炎反應可為所要特徵。因為大部分可溶性蛋白不激活免疫球蛋白，所以若目標為可溶性蛋白，則促炎反應可為中性特徵。然而，若目標在其破壞導致不當副作用的細胞類型上表達，則促炎反應可為負性特徵。因為炎症的多種介體可對周圍組織有害和/或可能引起全身影響，所以若在融合蛋白結合組織目標的位點處建立炎症級聯反應，則促炎反應可為負性特徵。免疫球蛋白Fc片段上主要促炎位點位於CH1與CH2之間的鉸鏈區。該鉸鏈區與各種白細胞上的FcRl-3相互作用且引發這些細胞侵襲目標(Wines等人，/,/羅"o人，164:5313-5318(2000))。作為RAGE介導的疾病的治療劑，RAGE融合蛋白可能無需產生炎症反應。因此，本發明的RAGE融合蛋白的實施方案可包含如下RAGE融合蛋白，其包含連接於免疫球蛋白域的RAGE多肽，其中來自免疫球蛋白的Fc鉸鏈區被移除且被RAGE多肽置換。以此方式，RAGE融合蛋白與炎症細胞上Fc受體之間的相互作用可最小化。然而，保持MGE融合蛋白的各種免疫球蛋白域之間的適當堆棧(stacking)及其它三維結構相互作用可為重要的。因此，本發明的RAGE融合蛋白的實施方案可取代生物學惰性但結構上類似的分離RAGE的V及Cl結構域的RAGE域間連接子或分離RAGE的Cl及C2結構域的連接子，代替免疫球蛋白重鏈的正常鉸鏈區。因此，RAGE融合蛋白的RAGE多肽可包含在RAGE免疫球蛋白域的下遊天然發現的域間連接子序列以形成RAGE免疫球蛋白域/連接子片段。以此方式，由RAGE或免疫球蛋白促成的免疫球蛋白域之間的三維相互作用可被保持。在一實施方案中，本發明的RAGE融合蛋白可包含與sRAGE相比實質增加的藥代動力學穩定性。例如，圖12展示當RAGE融合蛋白TTP-4000使其配體飽和後，其可保持超過300小時的半衰期。這可與sRAGE在人類血漿中僅幾小時的半衰期形成對比。因此在一實施方案中，本發明的RAGE融合蛋白可用於拮抗生理配體結合RAGE，作為治療RAGE介導的疾病而不產生不可接受量的炎症的方式。本發明的RAGE融合蛋白可展示與IgG相比產生促炎反應的實質減少。例如，如圖13中所示，在檢測人類IgG刺激TNF-a釋放的條件下，RAGE融合蛋白TTP-4000不刺激TNF-ct從細胞釋放。用RAGE融合蛋白治療疾病本發明還可包含治療人類受試者中RAGE介導的病症的方法。在一實施方案中，該方法包含將含有RAGE多肽(其包含連接於第二非RAGE多肽的RAGE配體結合位點)的RAGE融合蛋白施用給受試者。在某些實施方案中，RAGE製劑包含凍幹的RAGE融合蛋白。在某些實施方案中，本發明可包含治療受試者中RAGE介導的病症的方法，該方法包含將治療有效量的包含RAGE融合蛋白、凍幹保護劑及緩衝劑的重構製劑施用給受試者。本文所述的RAGE融合蛋白的任何實施方案可在本發明的治療組合物及製劑中用於治療疾病。因此，RAGE融合蛋白可包含來源於連接於免疫球蛋白多肽的RAGE配體結合位點的序列。RAGE融合蛋白的實施方案可包含直接連接於包含免疫球蛋白的CH2結構域或免疫球蛋白的CH2結構域的部分的多肽的RAGE多肽。在某些實施方案中，RAGE多肽可包含連接於RAGE免疫球蛋白域的RAGE域間連接子，以便RAGE免疫球蛋白域的C末端胺基酸連接於域間連接子的N末端胺基酸且RAGE域間連接子的C末端胺基酸直接連接於包含免疫球蛋白的CK2結構域或其部分的多肽的N末端胺基酸。例如，融合蛋白的某些實施方案可包含連接於第二RAGE免疫球蛋白域及第二RAGE域間連接子的第一RAGE免疫球蛋白域及第一RAGE域間連接子，以便第一域間連接子的N末端胺基酸連接於第一RAGE免疫球蛋白域的C末端胺基酸，第二RAGE免疫球蛋白域的N末端胺基酸連接於第一域間連接子的C末端胺基酸，第二域間連接子的N末端胺基酸連接於第二RAGE免疫球蛋白域的C末端胺基酸，且RAGE第二域間連接子的C末端胺基酸直接連接於Ch2免疫球蛋白域或免疫球蛋白的CH2結構域的部分的N末端胺基酸。在該多域融合蛋白的替代實施方案中，RAGE多肽可包含如SEQIDNO:10中所述的胺基酸序列或與其至少90°/。一致的序列，或如SEQIDNO:47中所述的胺基酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95°/。、96%、97°/。、98%或99°/。一致的序列。在其它替代實施方案中，RAGE融合蛋白可包含如SEQIDNO:32、33、34、35、36、37、56或57中至少一個所述的胺基酸序列或與其至少70%、75°/。、80%、85%、90%、95°/。、96%、97%、98%或99%—致的序列。例如，在某些實施方案中，與SEQIDNO:32、33、34、56、35、36、37或57至少90%—致的序列包含無C末端賴氨酸的SEQIDNO:32、33、34、56、35、36、37或57的多肽。或如本文所述的其它實施方案可構成用於本發明的製劑中的RAGE融合蛋白。多種凍幹保護劑可用於凍幹的RAGE融合蛋白製劑中。在某些實施方案中，凍幹保護劑可包含非還原性糖。例如，非還原性糖可包含蔗糖、甘露糖醇或海藻糖。多種緩沖劑還可用於凍幹的MGE融合蛋白製劑中。在某些實施方案中，緩衝劑可包含組氨酸。凍幹的RAGE融合蛋白可包含額外組份。在某些實施方案中，RAGE融合蛋白製劑可進一步包含表面活性劑、螯合劑或膨化劑的至少一種。在一實施方案中，重構RAGE融合蛋白製劑包含約40-100mg/mLRAGE融合蛋白(其包含如SEQIDNO:32、33、34、56、35、36、37或57中所述的序列)、約2mM至約50mM組氨酸、約60mM至約65mM蔗糖、約0.001%至約0.05%Tween80及約6.0至6.5的pH值。例如，在某些實施方案中，重構RAGE融合蛋白製劑包含約40-50mg/mLRAGE融合蛋白(其包含如SEQIDNO:32、33、34、56、35、36、37或57中所述的序列)、約10mM組氨酸、約65mM蔗糖、約0.01%Tween80及在約6.0的pH值下。或者若需要，則其它濃度的RAGE融合蛋白可用於治療RAGE介導的病症的製劑中。RAGE融合蛋白製劑可包含經調配用於臨床中或用作處方藥的穩定治療劑。例如，在某些實施方案中，RAGE融合蛋白製劑可展示在40。C下一周後少於10%或少於5%或少於3%分解。RAGE融合蛋白製劑在稀釋劑中重構時也可為穩定的。在某些實施方案中，少於約10%、5%、4%、3%、2%或1°/。的RAGE融合蛋白以聚集體形式存在於RAGE融合蛋白製劑中。重構RAGE融合蛋白製劑可適於通過各種途徑且如治療RAGE介導的相關病症所需來施用。施用本發明的RAGE融合蛋白可利用腹膜內(IP)注射。可選擇地，RAGE融合蛋白可經口、經鼻內或作為氣霧劑施用。在另一實施方案中，給藥是靜脈內(IV)的。RAGE融合蛋白還可皮下注射。在另一實施方案中，RAGE融合蛋白的給藥是動脈內的。在另一實施方案中，給藥是舌下的。給藥還可利用緩釋膠囊。在另一實施方案中，給藥可經直腸，如通過栓劑等等。例如，當需要自我施用時，51皮下施用可適用於治療慢性病症。如本文詳述，RAGE已涉及多種疾病病況的發病機理，且發現本發明的RAGE融合蛋白有效改善這類疾病病況。因此，本發明的RAGE融合蛋白製劑可用以治療多種RAGE介導的病症。在某些實施方案中，本發明的重構RAGE融合蛋白製劑可用以治療糖尿病的症狀或糖尿病晚期併發症的症狀。例如，糖尿病或糖尿病晚期併發症的症狀包含糖尿病性腎病、糖尿病性視網膜病、糖尿病性足部潰瘍、心血管併發症或糖尿病性神經病變的至少一種。在其它實施方案中，本發明的重構RAGE融合蛋白製劑可用以治療澱粉狀蛋白病、阿茲海默氏病、癌症、腎衰竭或與自身免疫相關的炎症、炎性腸病、類風溼性關節炎、牛皮褲、多發性硬化症、缺氧、中風、心臟病發作、失血性休克、膿毒病、器官移植或傷口癒合不良的至少一種。或者，重構RAGE融合蛋白製劑可用以治療骨質疏鬆症。例如，在某些實施方案中，施用本發明的RAGE融合蛋白製劑增加受試者骨密度或減緩受試者骨密度降低的速率。在某些實施方案中，使用本發明的RAGE融合蛋白製劑治療的自身免疫可包含皮膚細胞、胰腺細胞、神經細胞、肌肉細胞、內皮細胞、心臟細胞、肝細胞、腎細胞、心臟、骨髓細胞、骨、血細胞、動ii^細胞、靜脈細胞、軟骨細胞、甲狀腺細胞或幹細胞的至少一種的排斥反應。或者，重構RAGE融合蛋白製劑可用以治療腎衰竭。在某些實施方案中，重構RAGE融合蛋白製劑可用於治療與器官、組織或多個細胞的至少一種從第一位點移植至第二位點相關的炎症和/或排斥反應。第一及第二位點可在不同受試者中或在同一受試者體內。可使用本發明的RAGE融合蛋白製劑改良多種不同細胞類型的移植。例如，所移植的細胞、組織或器官可包含胰腺、皮膚、肝、腎、心臟、骨髓、血液、骨、肌肉、動脈、靜脈、軟骨、甲狀腺、神經系統的細胞、組織或器官或幹細胞。本文揭示了使用本發明的RAGE融合蛋白治療這類疾病及病症的實例。例如，已使用多種動物模型證實作為治療劑調控RAGE的化合物的用途。這些模型的實例如下(a)sRAGE在糖尿病及正常大鼠中在動脈損傷後再狹窄的大鼠模型中通過經由RAGE抑制內皮、平滑肌及巨噬細胞活化來抑制新血管內膜形成(Zhou等人，C/rc"7a〃o/107:2238-2243(2003));(b)使用sRAGE或抗RAGE抗體對RAGE/配體相互作用的抑制，減少全身澱粉狀蛋白病小鼠模型中澱粉狀蛋白斑形成(Yan等人，#ed.，6:643-651(2000))。伴隨澱粉狀蛋白斑減少的是炎性細胞因子(白細胞介素-6(IL-6)及巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF))減少以及NF-kB在所治療的動物中活化減少；(c)在AD小鼠模型中RAGE轉基因小鼠(RAGE過度表達者及RAGE顯性陰性表達者)展示斑形成及認知功能障礙(Arancio等人，^#^/.,23:4096-4105(2004));(d)用sRAGE治療糖尿病大鼠將降低血管通透性(Bonnardel-Phu等人，飾6"es，48:2052-2058(1999));(e)用sRAGE治療減少脫脂裁脂蛋白E敲除的糖尿病小鼠體內動脈粥樣硬化損害且預防db/db小鼠體內糖尿病性腎病的功能及形態指標(Hudson等人，Jrc力.刃/oc力e瓜，419:80—88(2003));且(f)sRAGE減弱膠原蛋白誘導關節炎的小鼠模型(Hofmann等人，Ge/2"/邁/77Mo/.，3:123-135(2002))、實驗性過敏性腦脊髓炎的小鼠模型(Yan等人，9:28-293(2003))及炎性腸病的小鼠模型(Hofmann等人，Ce/入97:889-901(1999))中炎症的嚴重程度。因此在一實施方案中，本發明的RAGE融合蛋白可用於治療糖尿病和/或源自由RAGE介導的糖尿病的併發症的症狀。在替代實施方案中，糖尿病或糖尿病晚期併發症的症狀可包含糖尿病性腎病、糖尿病性視網膜病、糖尿病性足部潰瘍、糖尿病的心血管併發症或糖尿病性神經病變。RAGE最初鑑別為其表達與糖尿病病理相關的分子的受體，其自身對糖尿病併發症的病理生理學而言是必要的。已顯示體內抑制RAGE與其配體的相互作用治療糖尿病併發症及炎症的多個模型(Hudson等人，Jrc力."/oc力e邁.^/o;/j^.,419:80-88(2003))。例如，在糖尿病小鼠體內用抗RAGE抗體治療2個月使腎功能正常且減少異常腎組織病理(Flyvbjerg等人，飾6"es53:166-172(2004))。此外，用結合RAGE配體且抑制RAGE/配體相互作用的可溶形式的RAGE(sRAGE)治療減少脫脂載脂蛋白E敲除的糖尿病小鼠體內動脈粥樣硬化損害且減弱db/db小鼠體內糖尿病性腎病的功能及形態病理(Bucciarelli等人，C/rc"""'o2106:2827—2835(2002))。還顯示最終導致晚期糖基化終產物(AGE)形成的巨分子的非酶促糖基化在炎症位點、腎衰竭中、高血糖症及與全身或局部氧化應激相關的其它病況存在下被增強(Dyer等人，J."/",//^e^.，91:2463-2469(1993);Reddy等人，，34:10872-10878(1995);Dyer等人，/,脅/.C力e瓜，266:11654-11660(1991);Degenhardt等人，Ce〃扁/.，44:1139-1145(1998))。如患有透析相關的澱粉狀蛋白病的患者體內發現的AGE-fi2微球蛋白構成的關節澱粉狀蛋白中(Miyata等人，/.67//.//re〃.，92:1243-1252(1993);Miyata等人，/.C7/".J歸".，98:1088-1094(1996))或一般如患有糖尿病的患者的維管結構及組織中所例示的(Schmidt等人，7VW"re#^/.，1:1002-1004(1995))，AGE在維管結構中的累積可集中出現。AGE隨時間在患有糖尿病的患者體內的進行性累積表明在AGE沉積的位點內源性清除機制不能有效起作用。這類累積AGE具有通過多種機制改變細胞性質的能力。雖然RAGE在正常組織及維管結構、在其中受體的配體累積的環境中低水平表達，但已顯示RAGE上調(Li等人，/.倫/.C力e瓜，272:16498-16506(1997);Li等人，/.C力e瓜，273:30870—30878(1998);Tanaka等人，/.C力e瓜，275:25781-25790(2000))。RAGE表達在糖尿病維管結構中的內皮、平滑肌細胞及浸潤單核吞噬細胞中增加。細胞培養的研究也已證實AGE-RAGE相互作用引起對血管動態平衡中重要的細胞性質的改變。在圖14中說明RAGE融合蛋白在治療糖尿病相關病理中的用途。在再狹窄的糖尿病大鼠模型中評估RAGE融合蛋白TTP-4000,涉及測量血管損傷後平滑肌增殖及內膜擴增。如圖14中說明，TTP-4000治療可以劑量反應方式顯著減少與糖尿病相關的再狹窄中內膜/介質(I/M)比率(圖14A、表l)。TTP-4000治療還可以劑量反應方式顯著減少與再狹窄相關的血管平滑肌細胞增殖(圖14B)。表1tableseeoriginaldocumentpage55*P<0.05;**對高劑量及低劑量而言，均使用每隻動物3mg的負荷劑量。在其它實施方案中，本發明的RAGE融合蛋白還可用以治療或逆轉澱粉狀蛋白病及阿茲海默氏病。RAGE為澱粉狀蛋白P(AP)以及其它促澱粉狀變蛋白(amyloidogenicprotein)(包括SAA及支鏈澱粉)的受體(Yan等人，#a/^re，382:685-691(1996);Yan等人，/Yoc.#a〃.JcaA^S^，94:5296-5301(1997);Yan等人，，6:643-651(2000);So謹等人，M/猜"，80:1101-1110(2000))。還在人類老年斑周圍組織中發現RAGE配體(包括AGE、SlOOb及Ap蛋白)(Luth等人，Cere6.Cor^15:211-220(2005);Petzold等人，細r飾/.，336:167-170(2003);Sasaki等人，to/"虹，12:256-262(2001;Yan等人，We"or.腸ro/齡謹ci.，12:167-173(1998))。已顯示RAGE與P片狀纖維物質的結合與亞基(澱粉狀蛋白P肽、支鏈澱粉、血清澱粉狀蛋白A、朊病毒衍生的肽)的組成無關(Yan等人，l""re，382:685-691(1996);Yan等人,M歸.，6:643-651(2000))。此外，已顯示澱粉狀蛋白沉積導致RAGE表達增加。例如，在患有阿茲海默氏病(AD)的患者腦中，神經元及神經膠質中RAGE表達增加(Yan等人，^^"re382:685-691(1996))。與RAGE配體表達同時發生，RAGE在患有AD的個體海馬區的星形膠質細胞及小膠質細胞中上調但在未患AD的個體中不上調(Lue等人，^r/,，171:29-45(2001))。這些發現表明表達RAGE的細胞經由在老年斑附近的RAGE/RAGE配體相互作用被活化。體外Ap介導的小膠質細胞活化還可用抗RAGE的配體結合域的抗體阻斷(Yan等人，/Voc.jYs〃.//cs麼，^S^，94:5296-5301(1997))。還證實RAGE可用作原纖維組裝的焦點(Deane等人，〃".艦9:907-913(2003))。身澱粉狀蛋白病小鼠模型中澱粉狀蛋白斑形成(Yan等人，#ed，6:643-651(2000))。過表達人類RAGE及人類澱粉狀前體蛋白(APP)的雙轉基因小鼠(在神經元中具有Swedish突變及Loadon突變(突變體hAPP))比其單個突變體hAPP轉基因對應小鼠更早發生學習障礙及神經病理異常。相比之下，歸因於在相同突變體hAPP背景下表達顯性陰性形式RAGE的神經元，具有減小的AP信號轉導能力的雙轉基因小鼠顯示比其單個APP轉基因對應小鼠延遲的神經病理及學習異常發作(Arancio等人，23:4096-4105(2004))。此外，已顯示RAGE-澱粉狀蛋白相互作用的抑制減少細胞RAGE的表達及細胞應激標記(以及NF-kB活化)且減少澱粉狀蛋白沉積(Yan等人，6:643-651(2000))，這表明RAGE-澱粉狀蛋白相互作用在富含澱粉狀蛋白(甚至在早期)的環境中對擾動細胞性質以及澱粉狀蛋白沉積的作用。因此，本發明的RAGE融合蛋白還可用以治療減少澱粉狀蛋白病且減少澱粉狀蛋白斑及與阿茲海默氏病(AD)相關的認知功能障礙。如上文所述，已顯示sRAGE減少AD動物模型中腦中澱粉狀蛋白斑形成及隨後炎症標記的增加。圖15A及15B顯示患有AD且經TTP-4000或小鼠sRAGE治療3個月的小鼠比接受媒劑或人類IgG陰性對照(IgGl)的動物澱粉狀蛋白|3(A0)斑更少且認知功能障礙更輕。類似於sRAGE，TTP-4000也可減少與AD相關的炎症細胞因子IL-1及TNF-oc(數據未展示)。本發明的RAGE融合蛋白還可用於治療動脈粥樣硬化及其它心血管病症。因此，已顯示缺血性心臟病在糖尿病患者中尤其高發(Robertson等人，Ls6，18:538-551(1968);Ka腸l等人，/.j瓜J;^oc，241:2035-2038(1979);Kannel等人，"/a6.Care:2:120-126(1979))。此外，研究表明糖尿病患者中動脈粥樣硬化比未罹患糖尿病的患者中動脈粥樣硬化更快且更廣泛(例如參見Wa11er等人，」瓜/.#ed，69:498-506(1980);Crall等人，J邁./.#ed64:221-230(1978);Hamby等人，C力eW，2:251-257(1976);及Pyorala等人，//a6.，3:463-524(1978))。雖然在糖尿病背景下加速動脈粥樣硬化的原因是多方面的，但已顯示AGE減少可減少斑形成。例如，本發明的RAGE融合蛋白還可用於治療中風。當在中風的疾病相關動物模型中將TTP-4000與sRAGE相比時，發現TTP-4000提供顯著更大的梗塞體積減小。在該模型中，將小鼠的中部頸動脈結紮且接著再灌注以形成梗塞。為評估RAGE融合蛋白治療或預防中風的功效，在即將再灌注前用sRAGE或TTP-4000或對照免疫球蛋白治療小鼠。如表2中可見，在這些動物中在限制梗塞面積方面，TTP-4000比sRAGE有效，表明TTP-4000由於其在血漿中更佳的半衰期而能夠比sRAGE保持更大保護。表2tableseeoriginaldocumentpage57IgG同型對照4%(300ug)*p<0.OOl顯著；**與生理鹽水相比在另一實施方案中，本發明的RAGE融合蛋白可用於治療癌症。在一實施方案中，使用本發明的RAGE融合蛋白治療的癌症包含表達RAGE的癌細胞。例如，可用本發明的RAGE融合蛋白治療的癌症包括某些肺癌、某些神經膠質瘤、某些乳頭狀瘤等等。兩性蛋白為高遷移率I族非組蛋白染色體DNA結合蛋白(Rauvala等人，/,C力e邁.，262:16625-16635(1987);Parkikinen等人，/.A/o厶Oe邁.268:19726-19738(1993)),已顯示其與RAGE相互作用。已顯示兩性蛋白促進神經突外生長以及用作纖維蛋白溶解系統中組裝蛋白酶複合物的表面(已知促進細胞遷移)。此外，在原發性腫瘤模型(C6神經膠質瘤)、Lewis肺癌轉移模型(Taguchi等人，iVa^re405:354-360(2000))及表達v-Ha-rss轉基因的小鼠中自發出現的乳頭狀瘤(Leder等人，屍藩.JcaA5W.，87:9178-9182(1990))中觀察到阻斷RAGE的局部腫瘤生長抑制作用。在另一實施方案中，本發明的RAGE融合蛋白可用於治療炎症。在替代實施方案中，本發明的MGE融合蛋白可用於治療與炎性腸病相關的炎症、與類風溼性關節炎相關的炎症、與牛皮癬相關的炎症、與多發性硬化症相關的炎症、與缺氧相關的炎症、與中風相關的炎症、與心臟病發作相關的炎症、與出血性休克相關的炎症、與膿毒相關的炎症、與器官移植相關的炎症、與傷口癒合不良相關的炎症或與自身(例如自身免疫)或非自身(例如移植)細胞、組織或器官的排斥反應相關的炎症。例如，進行溶栓治療後，如粒細胞的炎症細胞浸潤缺血組織且產生可摧毀比缺氧殺死的細胞更多的細胞的氧自由基。用抗體或其它蛋白拮抗劑抑制嗜中性粒細胞上使嗜中性粒細胞能浸潤組織的受體展示對反應的改善。因為RAGE為該嗜中性粒細胞受體的配體，所以含有RAGE片段的RAGE融合蛋白可充當誘餅且防止嗜中性粒細胞運動至再灌注位點且因此防止組織進一步破壞。RAGE預防炎症的作用可通過經由RAGE抑制內皮、平滑肌細胞增殖及巨噬細胞活化的研究說明，該研究展示糖尿病及正常大鼠的動脈損傷後再狹窄大鼠模型中sRAGE抑制新血管內膜擴增(Zhou等人，6V環/"/叫107:2238-2243(2003))。此外，sRAGE抑制包括遲髮型超敏反應、實驗性自身免疫性腦炎及炎性腸病的炎症模型(Hofman等人，Ce7/,97:889-901(1999))。在一實施方案中，本發明的RAGE融合蛋白可用於治療基於自身免疫的病症。例如，在一實施方案中，本發明的RAGE融合蛋白可用於治療腎衰竭。因此，本發明的RAGE融合蛋白可用於治療全身性狼瘡性腎炎或炎性狼瘡性腎炎。例如，已顯示S100/鈣粒蛋白包含緊密相關的鉤結合多肽家族，其特徵為由連接肽連接的兩個EF手區(Schafer等人，77AS;21:134-140(1996);Zimmer等人，Ars//Wes.5"".，37:417-429(1995);Rammes等人，/.腸/.C力e瓜，272:9496-9502(1997);Lugering等人，/,67/".i/p^".，25:659-664(1995))。雖然其缺乏信號肽，但長期以來已知如在嚢腫性纖維化及類風溼性關節炎中尤其在慢性免疫/炎症反應的位點處S100/鉤粒蛋白可進入細胞外空間。RAGE為S100/鈞粒蛋白家族的多個成員的受體，介導它們對如淋巴細胞及單核吞噬細胞的細胞的促炎作用。對遲髮型超敏反應、IL-10敲除小鼠的結腸炎、膠原蛋白誘導的關節炎及實驗性自身免疫性腦炎模型的研究也表明RAGE-配體相互作用(假定與S100/4丐粒蛋白)在炎症級聯反應中具有最接近作用。I型糖尿病為可通過用本發明的RAGE融合蛋白治療來預防或改善的自身免疫病症。例如，已顯示sRAGE可使脾細胞從非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠轉移至患有嚴重複合型免疫缺陷症的NOD小鼠(廳-scid小鼠)。雖然NOD-scid小鼠未自發顯示糖尿病，但其需要能夠破壞胰島細胞的免疫細胞存在以便接著誘導糖尿病。與未經sRAGE治療的NOD-scid接受小鼠相比，發現經sRAGE治療的NOD-scid接受小鼠顯示由從糖尿病(NOD)小鼠轉移的脾細胞誘導的糖尿病發作減少(美國專利公開2002/0122799)。如US2002/0122799中所述，該模型中使用sRAGE的實驗結果與如其中可發生未來免疫療法及胰島移植的臨床環境的人類疾病相關。因此在一實施方案中，本發明的RAGE融合蛋白可用於治療與器官、組織或多個細胞的至少一種從第一位點移植至第二位點相關的炎症。第一及第二位點可在不同受試者或相同受試者體內。在替代實施方案中，所移植的細胞、組織或器官可包含胰腺、皮膚、肝、腎、心臟、肺、骨髓、血液、骨、肌肉、內皮細胞、動脈、靜脈、軟骨、甲狀腺、神經系統的細胞或幹細胞。例如，施用本發明的RAGE融合蛋白可用於促進胰島細胞從第一非糖尿病受試者至第二糖尿病受試者的移植。在另一實施方案中，本發明可提供一種通過將治療有效量的本發明的RAGE融合蛋白施用給受試者來治療骨質疏7^症的方法(Zhou等人，/.fx;,，203:1067-1080(2006))。在一實施方案中，治療骨質疏鬆症的方法可進一步包含增加受試者骨密度或減少受試者骨密度下降速率的步驟。因此在各種所選實施方案中，本發明可提供一種通過將治療有效量的本發明的RAGE融合蛋白施用給受試者來抑制受試者體內AGE與RAGE相互作用的方法。使用本發明的RAGE融合蛋白治療的受試者可為動物。在一實施方案中，受試者為人類。受試者可惟患與AGE相關的疾病，如糖尿病、糖尿病併發症(如腎病、神經病變、視網膜病、足部潰瘍、澱粉狀蛋白病或腎衰竭)及炎症。或者，受試者可為患有阿茲海默氏病的個體。在一替代實施方案中，受試者可為患有癌症的個體。在其它實施方案中，受試者可罹患系統性紅斑狼瘡或炎性狼瘡性腎炎。其它疾病可由RAGE介導且因此可使用本發明的RAGE融合蛋白進行治療。因此，在本發明的其它替代實施方案中，RAGE融合蛋白可用於治療人類或動物受試者的克羅恩氏病(Crohn'sdisease)、關節炎、血管炎、腎病、視網膜病及神經病變。在其它實施方案中，包含自身免疫炎應(例如自身排斥反應)及非自身免疫反應(例如非自身排斥反應)的炎症可通過RAGE介導且因此可使用本發明的RAGE融合蛋白治療。治療有效量可包含能夠預防受試者體內RAGE與AGE或其它類型的內源性RAGE配體相互作用的量。因此，該量視所治療的受試者而變。化合物施用可為每小時、每天、每周、每月、每年施用或為單一事件。在各種替代實施方案中，RAGE融合蛋白的有效量的範圍可從每千克體重約1ng至每千克體重約100mg或從每千克體重約10Mg至每千克體重約50mg或從每千克體重約100yg至每千克體重約20mg變化。實際有效量可通過劑量/反應試驗使用本
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中的標準方法來測定(Johnson等人，"/a6<^e&42:1179，(1993))。因此如本領域技術人員已知，有效量可視化合物的生物可用性、生物活性及生物降解性而定。組合物本發明可包含一種組合物，其包含與藥學上可接受的載體混合的本發明的RAGE融合蛋白。RAGE融合蛋白可包含連接於第二非RAGE多肽的RAGE多肽。在一實施方案中，RAGE融合蛋白可包含RAGE配體結合位點。在一實施方案中，配體結合位點包含RAGE融合蛋白的大部分N末端結構域。RAGE配體結合位點可包含RAGE的V結構域或其部分。在一實施方案中，RAGE配體結合位點包含SEQIDNO:9或與其至少90%—致的序列或SEQIDNO:10或與其至少90%—致的序列或SEQIDNO:47或與其至少90%—致的序列。在一實施方案中，RAGE多肽可連接於包含免疫球蛋白域或免疫球蛋白域的部分(例如其片段)的多肽。在一實施方案中，包含免疫球蛋白域的多肽包含人類IgG的CH2或CH3結構域中至少一個的至少一部分。在某些實施方案中，RAGE融合蛋白包含如SEQIDNO:56或SEQIDNO:57中所述的胺基酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98°/。或99%—致的序列。例如，在某些實施方案中，與SEQIDNO:56或SEQIDNO:57至少90°/。一致的序列包含無C末端賴氨酸的SEQIDNO:56或SEQIDNO:57的序列。RAGE蛋白或多肽可包含全長人類RAGE(例如SEQIDNO:l)或人類RAGE的片段。在一實施方案中，RAGE多肽不包括任何信號序列殘基。RAGE信號序列可包含全長RAGE(SEQIDNO:1)的殘基l-22或殘基1-23。在替代實施方案中，RAGE多肽可包含與人類RAGE或其片段至少70°/。、75%、80%、85%、90%、95°/。、96°/。、97%、98°/。或99%—致的序列。例如，在一實施方案中，RAGE多肽可包含人類RAGE或其片段，其中甘氨酸而非甲硫氨酸作為第一殘基(例如參見Neeper等人，(1992))。或者，人類RAGE可包含移除信號序列的全長RAGE(例如SEQIDNO:2或SEQIDNO:3)(圖1A及IB)或該胺基酸序列的一部分。本發明的RAGE融合蛋白還可包含sRAGE(例如SEQIDNO:4)、與sRAGE至少90%—致的多肽或sRAGE的片段。例如，RAGE多肽可包含人類sRAGE或其片段，其中甘氨酸而非曱硫氨酸作為第一殘基(例如參見Neeper等人，(1992))。或者，人類RAGE可包含移除信號序列的sRAGE(例如參見圖1中的SEQIDNO:5、SEQIDNO:6或SEQIDNO:45)或該胺基酸序列的部分。在其它實施方案中，RAGE蛋白可包含V結構域(例如參見圖1中的SEQIDNO:7、SEQIDNO:8或SEQIDNO:46)。或者，可使用與V結構域或其片段至少90%—致的序列。或者RAGE蛋白可包含RAGE片段，該RAGE片段包含V結構域的部分(例如參見圖1中的SEQIDNO:9、SEQIDNO:10或SEQIDNO:47)。在一實施方案中，配體結合位點可包含SEQIDNO:9或與其至少90%—致的序列，或SEQIDNO:10或與其至少90%—致的序列，或SEQIDNO:47或與其至少90%—致的序列。在另一實施方案中，RAGE片段為合成肽。例如，RAGE多肽可包含人類RAGE的胺基酸23-116(SEQIDNO:7)或與其至少90°/。一致的序列或人類RAGE的胺基酸24-116(SEQIDNO:8)或與其至少90%—致的序列，或其中Q24環化以形成pE的人類RAGE的胺基酸24-116(SEQIDNO:46)，或與其至少90%—致的序列，對應於RAGE的V結構域。或者，RAGE多肽可包含人類RAGE的胺基酸124-221(SEQIDNO:11)或與其至少90%—致的序列，對應於RAGE的Cl結構域。在另一實施方案中，RAGE多肽可包含人類RAGE的胺基酸227-317(SEQIDNO:12)或與其至少90%—致的序列，對應於RAGE的C2結構域。或者，RAGE多肽可包含人類RAGE的胺基酸23-123(SEQIDNO:13)或與其至少90。/。一致的序列，或人類RAGE的胺基酸24-123(SEQIDNO:14)或與其至少90%—致的序列，對應於RAGE的V結構域及下遊域間連接子。或者，RAGE多肽可包含其中Q24環化以形成pE的人類RAGE的胺基酸24-123(SEQIDNO:48)或與其至少90%—致的序列。或者，RAGE多肽可包含人類RAGE的胺基酸23-226(SEQIDNO:17)或與其至少90%—致的序列，或人類RAGE的胺基酸24-226(SEQIDNO:18)或與其至少90°/。一致的序列，對應於V結構域、CI結構域及連接這兩個結構域的域間連接子。或者，RAGE多肽可包含其中Q24環化以形成pE的人類RAGE的胺基酸24-226(SEQIDNO:50)或與其至少90%一致的序列。或者，RAGE多肽可包含人類RAGE的胺基酸23-339(SEQIDNO:5)或與其至少90%—致的序列，或人類RAGE的24-339(SEQIDNO:6)或與其至少90%—致的序列，對應於sRAGE(即編碼V、CI及C2結構域及域間連接子)。或者，RAGE多肽可包含其中Q24環化以形成pE的人類RAGE的胺基酸24-339(SEQIDNO:45)或與其至少90°/。一致的序列。或者，可使用這些序列的每一個的片段。在另一實施方案中，配體結合位點可包含SEQIDNO:1的胺基酸22-51。在另一實施方案中，配體結合位點可包含SEQIDNO:1的胺基酸23-51。在另一實施方案中，配體結合位點可包含SEQIDNO:1的胺基酸31-51。在另一實施方案中，配體結合位點可包含SEQIDNO:l的胺基酸31-116。例如，配體結合位點可包含RAGEV結構域或其部分，如RAGE配體結合域(例如SEQIDNO:l的胺基酸1-118、23-118、24-118、31-118、1-116、23-116、24-116、31-116、1-54、23-54、24-54、31-54、1-53、23-53、24—53或31-53或其片段)(圖1)。或可使用功能性結合RAGE配體的多肽片段。或者，可使用與RAGEV結構域或其片段(例如如上文所述)至少70%、75°/。、80°/。、85%、90%、95%、97%、98%或99%—致的序列。此外如本
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中已知，在其中融合蛋白的N末端為穀氨醯胺的實施方案中，如(例如)在移除包含SEQIDNO:1的殘基1-23的信號序列(例如多肽的Q24包含胺基酸24-118或SEQIDNO:l)後，穀氨醯胺可環化以形成焦穀氨酸(pE)。RAGE融合蛋白可包括非來源於RAGE或其片段的數種類型的肽。RAGE融合蛋白的第二多肽可包含來源於免疫球蛋白的多肽。重鏈(或其部分)可來源於任何已知重鏈同種型IgG(y)、IgMU)、IgD(S)、IgE(s)或IgA(cc)。此外，重鏈(或其部分)可來源於任何已知重鏈亞型IgGl(yl)、IgG2(y2)、IgG3(y3)、IgG4(y4)、IgAl(al)、IgA2(a2)或這些同種型或亞型的改變生物活性的突變。第二多肽可包含人類IgGl的CH2及CH3結構域或這些結構域的任一個或兩個的部分。作為實例實施方案，包含人類IgGl的(:2及"3結構域或其部分的多肽可包含SEQIDNO:40或其部分。在一實施方案中，包含人類IgGl的CH2及CH3結構域或其部分的多肽可包含SEQIDNO:38或其部分。例如，包含人類IgGl的CH2及Ch3結構域或其部分的多肽可包含移除末端賴氨酸(K)的SEQIDNO:38或SEQIDNO:40。免疫球蛋白肽可由核酸序列SEQIDNO:39或SEQIDNO:41編碼。SEQIDNO:38或SEQIDNO:40中的免疫球蛋白序列還可分別通過SEQIDNO:52或SEQIDNO:53編碼。免疫球蛋白鏈的Fc部分在體內可為促炎性的。因此在一實施方案中，本發明的RAGE融合蛋白包含來源於RAGE的域間連接子而非來源於免疫球蛋白的域間鉸鏈多肽。因此在一實施方案中，RAGE融合蛋白可進一步包含直接連接於包含免疫球蛋白的CH2結構域或其片段的多肽的RAGE多肽。在一實施方案中，CH2結構域或其片段包含SEQIDNO:42。在一實施方案中，SEQIDNO:42的片段包含移除前十個胺基酸的SEQIDNO:42。在一實施方案中，RAGE多肽包含連接於RAGE免疫球蛋白域的RAGE域間連接子，以便RAGE免疫球蛋白域的C末端胺基酸連接於域間連接免疫球蛋白的CH2結構域或其片段的多肽的N末端胺基酸。包含免疫球蛋白的CH2結構域或其部分的多肽可包含人類IgGl的CH2及CJ結構域或這些結構域的兩個或任一個的部分。作為實例實施方案，包含人類IgGl的CH2及CH3結構域或其部分的多肽可包含SEQIDNO:40或其部分。在一實施方案中，包含人類IgGl的CH2及CH3結構域或其部分的多肽可包含SEQIDNO:38或其部分。例如，包含人類IgGl的CH2及Ch3結構域或其部分的多肽可包含移除末端賴氨酸(K)的SEQIDNO:38或SEQIDNO:40。本發明的RAGE融合蛋白可包含單個或多個來自RAGE的結構域。包含連接於RAGE免疫球蛋白域的域間連接子的RAGE多肽可包含全長RAGE蛋白的片段。例如，在一實施方案中，RAGE融合蛋白可包含兩個來源於RAGE蛋白的免疫球蛋白域及兩個來源於人類Fc多肽的免疫球蛋白域。RAGE融合蛋白可包含連接於第二RAGE免疫球蛋白域及第二RAGE域間連接子的第一RAGE免疫球蛋白域及第一域間連接子，以便第一域間連接子的N末端胺基酸連接於第一RAGE免疫球蛋白域的C末端胺基酸，第二RAGE免疫球蛋白域的N末端胺基酸連接於第一域間連接子的C末端胺基酸，第二域間連接子的N末端胺基酸連接於RAGE第二免疫球蛋白域的C末端胺基酸，且RAGE第二域間連接子的C末端胺基酸直接連接於包含CH2免疫球蛋白域或其片段的多肽的N末端胺基酸。例如，RAGE多肽可包含人類RAGE的胺基酸23-251(SEQIDNO:19)或與其至少90%—致的序列或人類RAGE的胺基酸24-251(SEQIDNO:20)或與其至少90%—致的序列，或其中Q24環化以形成PE的人類RAGE的胺基酸24-251或與其至少90%—致的序列(SEQIDNO:51)，對應於V結構域、CI結構域、連接這兩個結構域的域間連接子及CI下遊的第二域間連接子。在一實施方案中，包含SEQIDNO:30或其片段的核酸構建體可編碼四域RAGE融合蛋白。在另一實施方案中，包含SEQIDNO:54的核酸構建體可編碼四域RAGE融合蛋白，其中加入在序列的C末端編碼脯氨酸(CCG至CCC)及甘氨酸(GGT至GGG)的密碼子的沉默鹼基變化以移除末端密碼子附近的隱含RM剪接位點(即SEQIDNO:30的核苷酸1375-1380經修飾產生SEQIDNO:54)。可選擇地，三域RAGE融合蛋白可包含一個來源於RAGE的免疫球蛋白域及兩個來源於人類Fc多肽的免疫球蛋白域。例如，RAGE融合蛋白可包含經由RAGE域間連接子連接於包含CH2免疫球蛋白域或其片段的多肽的N末端胺基酸的單個RAGE免疫球蛋白域。例如，RAGE多肽可包舍人類RAGE的胺基酸23-136(SEQIDNO:15)或與其至少90%一致的序列，或人類RAGE的胺基酸24-136(SEQIDNO:16)或與其至少90%—致的序列，或其中Q24環化以形成pE的人類RAGE的胺基酸24-136或與其至少90%—致的序列(SEQIDNO:49)，對應於RAGE的V結構域及下遊域間連接子。在一實施方案中，包含SEQIDNO:31或其片段的核酸構建體可編碼三域RAGE融合蛋白。在另一實施方案中，包含SEQIDNO:55的核酸構建體可編碼三域RAGE融合蛋白，其中加入在序列的C末端編碼脯氨酸(CCG至CCC)及甘氨酸(GGT至GGG)的密碼子的沉默鹼基變化以移除末端密碼子附近的隱含RNA剪接位點(即SEQIDNO:31的核苷酸1030-1035經修飾產生SEQIDNO:55)。RAGE域間連接子片段可包含天然為RAGE免疫球蛋白域的下遊且因此連接至RAGE免疫球蛋白域的肽序列。例如，對RAGEV結構域而言，域間連接子可包含天然為V結構域下遊的胺基酸序列。在一實施方案中，連接子可包含SEQIDNO:21,對應於全長RAGE的胺基酸117-123。或者，連接子可包含具有天然RAGE序列的額外部分的肽。例如，可使用包含SEQIDNO:21的上遊及下遊的數個胺基酸(例如l-3個、1-5個或1-10個或1-15個胺基酸)的域間連接子。因此在一實施方案中，域間連接子包含SEQIDNO:23,SEQIDNO:23包含全長RAGE的胺基酸117-136。或者，可使用自連接子的任一末端刪除(例如)l、2或3個胺基酸的SEQIDNO:21片段。在替代實施方案中，連接子可包含與SEQIDNO:21或SEQIDNO:23至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97°/。、98°/。或99%—致的序列。對RAGBCI結構域而言，連接子可包含其為CI結構域的天然下遊的肽序列。在一實施方案中，連接子可包含SEQIDNO:22，對應於全長RAGE的胺基酸222-251。或者，連接子可包含具有天然RAGE序列的額外部分的肽。例如，可使用包含SEQIDNO:22的上遊及下遊的數個胺基酸(l-3個、1-5個或1-10個或1-15個胺基酸)的連接子。或者，可使用自連接子的任一末端刪除(例如)1-3個、1-5個或1-10個或1-15個胺基酸的SEQIDNO:22片段。例如，在一實施方案中，RAGE域間連接子可包含SEQIDNO:24，對應於胺基酸222-226。在替代實施方案中，連接子可包含與SEQIDNO:22或SEQIDNO:24至少70%、75°/。、80°/。、85%、90%、95°/。、96%、97%、98%或99%—致的序列。或者域間連接子可包含SEQIDNO:44，對應於RAGE胺基酸318-342。在替代實施方案中，連接子可包含與SEQIDNO:44至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%—致的序列。藥學上可接受的載體可包含本
技術領域：
中已知的標準的藥學上可接受的載體的任一種。在一實施方案中，藥學栽體可為液體且RAGE融合蛋白或核酸構建體可呈溶液形式。在另一實施方案中，藥學上可接受的栽體可為粉末、凍乾粉末或片劑形式的固體。或藥學載體可為凝膠、栓劑或乳骨。在替代實施方案中，載體可包含脂質體、微囊、聚合物封裝的細胞或病毒。因此，術語藥學上可接受的栽體涵蓋(但不限於)標準的藥學上接受的載體的任一種，如水、醇類、磷酸鹽緩衝生理鹽水溶液、糖類(例如蔗糖或甘露糖醇)、油類或乳液(如油/水乳液或甘油三酯乳液)、各種類型的潤溼劑、片劑、包衣片劑及膠嚢。在某些實施方案中，RAGE融合蛋白可以中性形式(包括兩性離子形式)或以帶正電或負電的物質形式存在。在某些實施方案中，RAGE融合蛋白可與平衡離子複合以形成藥學上可接受的鹽。術語"藥學上可接受的鹽"指包含一或多種RAGE融合蛋白及一或多種平衡離子的複合物，其中平衡離子來源於藥學上可接受的無機及有機酸及鹼。藥學上可接受的無機鹼包括金屬離子。更優選的金屬離子包括(但不限於)適當鹼金屬鹽、鹼土金屬鹽及其它生理可接受的金屬離子。衍生自無機鹼的鹽包括鋁、銨、鈣、鈷、鎳、鉬、釩、錳、鉻、硒、錫、銅、鐵、亞鐵、鋰、鎂、錳鹽、亞錳、鉀、銣、鈉及鋅且為其常用化合價。藥學上可接受的本發明的RAGE融合蛋白的酸加成鹽可從下列酸製備，包括(但不限於)甲酸、乙酸、乙醯氨基苯曱酸、脂肪酸、抗壞血酸、硼酸、丙酸、苯曱酸、樟腦酸、碳酸、環拉酸、脫氫膽酸、丙二酸、依地酸(edeticacid)、乙基石危酸、芬地拃酸(fendizoicacid)、偏磷酸、丁二酸、乙醇酸、葡糖酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、鞣酸、檸檬酸、硝酸、抗壞血酸、葡糖醛酸、順丁烯二酸、葉酸、反丁烯二酸、丙酸、丙酮酸、天冬胺酸、穀氨酸、苯甲酸、鹽酸、氬溴酸、氫碘酸、賴氨酸、異檸檬酸、三氟乙酸、雙羥萘酸、丙酸、鄰氨基苯甲酸、曱磺酸(mesylicacid)、乳清酸、草酸、草乙酸、油酸、硬脂酸、水楊酸、氨基水楊酸、矽酸鹽、對羥基苯甲酸、菸鹼酸、苯乙酸、扁桃酸、雙羥萘酸、磺酸、甲磺酸、磷酸、膦酸、乙磺酸、乙二磺酸、銨、苯磺酸、泛酸、萘磺酸、曱苯磺酸、2-羥基乙烷磺酸、對氨基苯磺酸、硫酸、硝酸、亞硝酸、疏酸單甲酯、環己基氨基磺酸、(3-羥基丁酸、甘氨酸、雙甘胺肽、穀氨酸、二甲紳酸鹽、二氨基己酸、樟腦磺酸、葡糖酸、硫氰酸、酮戊二酸、5-磷酸吡哆醛、氯代苯氧基乙酸、十一酸、N-乙醯基-L-天冬胺酸、半乳糖二酸及半乳糖醛酸。藥學上可接受的有機鹼包括三甲胺、二乙胺、N，『-二節基乙二胺、氯代普魯卡因(chloroprocaine)、膽鹼、二爺胺、二乙醇胺、乙二胺、葡曱胺(N-甲基葡糖胺)、普魯卡因(procaine)、環胺、季銨陽離子、精胺酸、甜菜鹼、咖啡因、克立咪唑(clemizole)、2-乙胺基乙醇、2-二乙胺基乙醇、2-二曱胺基乙醇、乙二胺、丁胺、乙醇胺、乙二胺、N-乙基嗎啉、N-乙基哌啶、乙基葡糖胺、葡萄糖胺、葡糖胺、組氨酸、哈胺(Hydrabamine)、咪喳、異丙胺、甲基葡糖胺、嗎啉、派-秦、p比啶、吡哆辛、釹、哌啶、多元胺樹脂、普魯卡因、喋呤、可可鹼、三乙胺、三丙胺、三乙醇胺、氨丁三醇、甲胺、牛磺酸、膽酸鹽、6-氨基-2-甲基-2-庚醇、2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇、2-氨基-2-甲基-l-丙醇、脂肪族單及二羧酸、經苯基取代的鏈烷酸、羥基鏈烷酸、芳族酸、脂肪族及芳族磺酸、鍶、曲辛(tricine)、肼、苯基環己胺、2-(N-嗎啉基)乙磺酸、雙(2-羥乙基)氨基-三(羥甲基)甲烷、^(2-乙醯氨基)-2-氨基乙磺酸、1，4-哌嗪二乙磺酸、3-嗎啉基-2-羥基丙磺酸、1，3-雙[三(幾甲基)甲氨基]丙烷、4-嗎啉丙磺酸、4-(2-羥乙基)哌嗪-l-乙磺酸、2-[(2-羥基-1，1-雙(輕甲基)乙基)氨基]乙磺酸、N，N-雙(2-幾乙基)-2-氨基乙磺酸、4-(N-嗎啉基)丁磺酸、3-OV，^雙[2-羥乙基]氨基)-2-羥基丙磺酸、2-羥基-3-[三(羥甲基)甲氨基]-l-丙磺酸、4-(2-幾乙基)哌溱-l-(2-羥基丙磺酸)、哌嗪-l，4-雙(2-羥基丙烷磺酸)二水合物、4-(2-羥乙基)-l-哌溱丙烷磺酸、《^雙(2-羥乙基)甘氨酸、N-(2-羥乙基)哌嗪-『-(4-丁磺酸)、N-[三(羥甲基)甲基]-3-氨基丙磺酸、N-三(羥甲基)甲基-4-氨基丁磺酸、N-(l，1-二甲基-2-羥乙基)-3-氨基-2-幾基丙磺酸、2-(環己氨基)乙磺酸、3-(環己氨基)-2-羥基-l-丙磺酸、3-(環己氨基)-1-丙磺酸、^(2-乙醯氨基)亞胺二乙酸、4-(環己氨基)-1-丁磺酸、^[三(羥甲基)甲基]甘氨酸、2-氨基-2-(羥甲基)-l，3-丙二醇及氨基丁三醇。可利用各種途徑施用本發明的RAGE融合蛋白。因此，可利用腹膜內(IP)注射來施用本發明的RAGE融合蛋白。可選擇地，RAGE融合蛋白可經口、經鼻內或作為氣霧劑施用。在另一實施方案中，給藥為靜脈內(IV)給藥。RAGE融合蛋白還可皮下注射。在另一實施方案中，RAGE融合蛋白給藥為動脈內給藥。在另一實施方案中，給藥為舌下給藥。給藥還可利用緩釋膠嚢。例如，當需要自我給藥時，皮下給藥可適用於治療慢性病症。在本發明的另一方面中，本發明的RAGE融合蛋白可用於與任何其它已知治療劑的輔助治療或組合治療。以下為可與本發明的RAGE融合蛋白調節劑組合使用的佐劑及額外治療劑的非詳盡列表。抗癌劑的藥理分類1.烷基化藥劑環磷醯胺、亞硝基脲、卡鉑(carboplatin)、順賴(cisplatin)、丙卡巴肼(procarbazine)2.抗生素博來黴素(Bleomycin)、柔紅黴素(Daunorubicin)、多柔比星(Doxorubicin)3.抗代謝劑氨甲喋呤(Methotrexate)、阿糖胞苷(Cytarabine)、氟尿嘧咬(Fluorouraci1)、硫峻噪呤(Azathioprine)、6-巰嘌呤(6-Mercaptopurine)及細胞毒素癌症化療劑4.植物鹼長春鹼(Vinblastine)、長春新鹼(Vincristine)、依託泊苷(Etoposide)、紫杉醇(Paclitaxel),5.激素他莫昔芬(Tamoxifen)、乙酸奧曲肽(Octreotideacetate)、非那雄胺(Finasteride)、氟他胺(Flutamide)6.生物反應修飾劑幹擾素(Interferon)、白細胞介素治療類風溼性關節炎的藥理分類1.止痛劑阿司匹林(Aspirin)2.NSAID(非類固醇消炎藥)布洛芬(Ib叩rofen)、萘普生(Naproxen)、雙氯芬酸(Diclofenac)3.DMARD(改善疾病的抗風溼藥)氨甲喋呤(Methotrexate)、金製劑、幾氣唾(hydroxychloroquine)、杉卩氣碌p比梵(sulfasalazine)4.生物反應修飾劑、DMARD:依那西普(Etanercept)、英夫利昔單抗(Infliximab)，糖皮質激素，如倍氯米*>(beclomethasone)、曱潑尼龍(methylprednisolone)、倍他米松(betamethasone)、潑尼松(prednisone)、地塞米松(dexamethasone)及氫化可的松(hydrocortisone)治療糖尿病的藥理分類1.磺醯脲類甲苯碌丁脲(Tolbutamide)、妥拉磺脲(Tolazamide)、格列本脲(Glyburide)、格列吡-泰(Glipizide)2.雙胍類二甲雙胍(Metformin)3.混雜口月l藥劑阿卡波糖(Acarbose)、曲格列酮(Troglitazone)4.胰島素治療阿茲海默氏病的藥理分類1.膽鹼酯酶抑制劑他克林(Tacrine)、多奈哌齊(Donepezi1)2.安定藥氟哌啶醇(Haloperidol)、硫利達漆(Thioridazine)3.抗抑鬱劑地昔帕明(Desipramine)、氟西汀(Fluoxetine)、曲唾酉同(Trazodone)、帕羅西S丁(Paroxetine)4.抗痙攣劑卡馬西平(Carbamazepine)、丙戊酸(Valproicacid)在一實施方案中，本發明的組合物可包含治療有效量的RAGE融合蛋白以及單個或多個額外治療劑。除上文所述的藥劑外，以下治療劑可與本發明的RAGE融合蛋白組合4吏用免疫抑制劑，如環孢素(cyclosporin)、他克莫司(tacrolimus)、雷巾白黴素(rapamycin)及其它FK-506型免疫抑制劑。因此在一實施方案中，本發明提供一種治療RAGE介導的疾病的方法，該方法包含將治療有效量的RAGE融合蛋白與選自下列的治療劑組合施用給有需要的受試者烷基化藥劑、抗代謝劑、植物鹼、抗生素、激素、生物反應修飾劑、止痛劑、NSAID、DMARD、生物反應修飾劑(例如糖皮質激素)、磺醯脲類、雙胍類、胰島素、膽鹼酯酶抑制劑、安定藥、抗抑鬱劑、抗痙攣劑及免疫抑制劑，如環孢素、他克莫司、雷帕黴素及其它FK-506型免疫抑制劑。在另一實施方案中，本發明提供如上所述的本發明的藥物組合物，其進一步包含一或多種選自下列的治療劑烷基化藥劑、抗代謝劑、植物鹼、抗生素、激素、生物反應修飾劑、止痛劑、NSAID、DMARD、生物反應^f'務飾劑(例如糖皮質激素)、磺醯脲類、雙胍類、胰島素、膽鹼酯酶抑制劑、安定藥、抗抑鬱劑、抗痙攣劑及免疫抑制劑，如環孢素、他克莫司、雷帕黴素及其它FK-506型免疫抑制劑。凍幹製劑在其它實施方案中，本發明還提供包含RAGE融合蛋白的製劑。製劑的實施方案可包含凍幹保護劑、RAGE融合蛋白及緩衝劑的凍幹混合物。多種凍千保護劑可用於本發明的凍幹RAGE融合蛋白製劑中。在某些實施方案中，凍幹保護劑可包含非還原性糖。例如，非還原性糖可包含蔗糖、甘露糖醇或海藻糖。多種緩衝劑還可用於凍幹RAGE融合蛋白製劑中。在某些實施方案中，緩衝劑可包含組氨酸。凍幹RAGE融合蛋白可包含額外組份。在某些實施方案中，RAGE融合蛋白製劑可進一步包含表面活性劑、螯合劑或膨化劑的至少一種。在一實施方案中，重構RAGE融合蛋白製劑包含約40-100mg/mLRAGE融合蛋白(其包含如SEQIDNO:32、33、34、56、35、36、37或57中所述的序列)、約2mM至約50mM組氨酸、約60mM至約65mM蔗糖、約0.001%至約0.05%Tween80及約6.0至6.5的pH值。例如，在某些實施方案中，重構RAGE融合蛋白製劑可包含約40-50mg/mLRAGE融合蛋白(其包含如SEQIDNO:32、33、34、56、35、36、37或57中所述的序列)、約10mM組氨酸、約65mM蔗糖、約0.01%Tween80及約6.0的pH值。或者，其它濃度RAGE融合蛋白可如本文進一步所述使用。在一實施方案中，本發明包含一種重構製劑，其包含在稀釋劑中重構的凍幹RAGE融合蛋白，其中重構製劑中的MGE融合蛋白濃度在約lmg/mL至約400mg/mL的範圍內。或者可如本文所述使用其它濃度的RAGE融合蛋白。在其它實施方案中，本發明還可包含製備RAGE融合蛋白的穩定重構製劑的方法。重構製劑可包含適於直接使用(例如直接施用給受試者)或可進一步稀釋和/或與遞送劑混合的濃度。在某些實施方案中，該方法可包含在稀釋劑中重構RAGE融合蛋白與凍幹保護劑的凍幹混合物以便RAGE融合蛋白在重構製劑中的濃度在約1mg/mL至約400mg/mL的範圍內。或者可如本文所述使用如本文所述的其它濃度。多種凍幹保護劑可用於本發明的重構RAGE融合蛋白製劑中。在某些實施方案中，凍幹保護劑可包含非還原性糖。例如，非還原性糖可包含蔗糖、甘露糖醇或海藻糖。多種緩衝劑還可用於凍幹RAGE融合蛋白製劑中。在某些實施方案中，緩衝劑可包含組氨酸。重構RAGE融合蛋白製劑可包含額外組份。在某些實施方案中，RAGE融合蛋白製劑可進一步包含表面活性劑、螯合劑或膨化劑的至少一種。在一實施方案中，重構RAGE融合蛋白製劑包含約40-100mg/mLRAGE融合蛋白(其包含如SEQIDNO:32、33、34、56、35、36、37或57中所述的序列)、約2mM至約50mM組氨酸、約60mM至約65mM蔗糖、約0.001%至約0.05%TVeen80及約6.0至6.5的pH值。例如，在某些實施方案中，重構RAGE融合蛋白製劑可包含約40-50mg/mLRAGE融合蛋白(其包含如SEQIDNO:32、33、34、56、35、36、37或57中所述的序列)、約10fflM組氨酸、約65mM蔗糖、約0.01%Tween80及約6.0的pH值下。多種適於藥物的稀釋劑可用以重構凍幹RAGE融合蛋白。在一實施方案中，凍幹RAGE融合蛋白無菌。在一實施方案中，稀釋劑也無菌。在一實施方案中，稀釋劑可包含用於注射的水(WFI)。在某些實施方案中，所添加的稀釋劑的量還基於RAGE融合蛋白的治療劑量及藥代動力學概況以及所施用的製劑及載體的生物兼容性。在一實施方案中，重構製劑為等滲的。RAGE融合蛋白製劑可包含經調配用於臨床中或用作處方藥的穩定治療劑。例如，在某些實施方案中，重構RAGE融合蛋白製劑可展示在4(TC下一周後少於10%或少於5%或少於3%分解。RAGE融合蛋白製劑在稀釋劑中重構後還可為穩定的。在某些實施方案中，少於約10°/。或約5%或約4%或約3%或約2%或約1%的RAGE融合蛋白以聚集體形式存在於RAGE融合蛋白製劑中。重構RAGE融合蛋白製劑可適於通過各種途徑且如治療RAGE介導的相關病症所需來施用。在某些實施方案中，重構RAGE融合蛋白製劑適於將製劑以靜脈內、腹膜內或皮下中的至少一種施用給受試者。例如，在某些實施方案中，本發明可包含一種穩定重構製劑，其包含以至少10mg/mL或至少20mg/mL或至少50mg/mL的濃度的RAGE融合蛋白及稀釋劑，其中重構製劑從RAGE融合蛋白與凍幹保護劑的凍幹混合物製備。在替代實施方案中，重構製劑中RAGE融合蛋白濃度可為至少100mg/mL或至少200mg/mL或至少400mg/mL。在替代實施方案中，重構製劑中RAGE融合蛋白濃度為在約0.5mg/mL至約400mg/mL或約1mg/mL至約200mg/mL或約40mg/mL至約400mg/mL、約40至100mg/mL或約40-50mg/mL的範圍內的量。製劑還可包含緩衝劑。在其它實施方案中，本發明可包含包括RAGE融合蛋白的製品。例如，在某些實施方案中，製品可包含保存凍幹RAGE融合蛋白的容器及用於以稀釋劑重構凍幹製劑的說明。在某些實施方案中，製品可包含保存包含凍幹保護劑、RAGE融合蛋白與緩衝劑的凍幹混合物的製劑的容器。製品還可包含用於以稀釋劑重構凍幹製劑的說明。多種凍幹保護劑可用於本發明的製品中。在某些實施方案中，凍幹保護劑可包含非還原性糖。例如，非還原性糖可包含蔗糖、甘露糖醇或海藻糖。多種緩衝劑還可用於凍幹RAGE融合蛋白製劑中。在某些實施方案中，緩衝劑可包含組氨酸。本發明的製品的RAGE融合蛋白製劑可包含額外組份。在某些實施方案中，凍幹RAGE融合蛋白製劑可進一步包含表面活性劑、螯合劑或膨化劑的至少一種。在本發明的製品的一個實施方案中，在根據所提供的說明重構後，RAGE融合蛋白製劑包含約40-100mg/mLRAGE融合蛋白(其包含如SEQIDNO:32、33、34、56、35、36、37或57中所述的序列)、約2mM至約50mM組氨酸、約60mM至約65mM蔑糖、約0.001%至約0.05%Tween80及約6.0至6.5的pH值。例如，在某些實施方案中，重構RAGE融合蛋白製劑可包含約40-50mg/mLRAGE融合蛋白(其包含如SEQIDNO:32、33、34、56、35、36、37或57中所述的序列)、約10mM組氨酸、約65mM蔑糖、約0.01%Tween80及約6.0的pH值。或者可如本文所述使用其它濃度的RAGE融合蛋白。可提供多種適於藥物的稀釋劑以重構凍幹RAGE融合蛋白。在一實施方案中，凍幹製劑無菌。可選擇地或額外地，稀釋劑可無菌。在一實施方案中，稀釋劑可包含用於注射的水(WFI)。因此，製品可進一步包含保存用於重組凍幹製劑的稀釋劑的第二容器，其中稀釋劑為用於注射的水(WFI)。在一實施方案中，重構製劑為等滲的。在某些實施方案中，所添加的稀釋劑的量還基於RAGE融合蛋白的治療劑量及藥代動力學概況以及所施用的製劑與載體的生物兼容性。在替代實施方案中，說明用於重構凍幹製劑以使其具有如本文所述的濃度。例如，在某些實施方案中，說明用於重構凍幹製劑以便重構製劑中RAGE融合蛋白濃度在約40mg/mL至約100mg/mL的範圍內。如製品所提供的RAGE融合蛋白製劑可包含經調配用於臨床中或用作處方藥的穩定治療劑。例如，在某些實施方案中，當根據所提供的說明重構時，RAGE融合蛋白可展示在40C下一周後少於10%或少於5%或少於3%分解。在稀釋劑中重構後，RAGE融合蛋白製劑還可為穩定的。在某些實施方案中，少於約10%或約5%或約4%或約3%或約2%或約1%的RAGE融合蛋白以聚集體形式存在於RAGE融合蛋白製劑中。在某些實施方案中，當根據所提供的說明重構時，重構RAGE融合蛋白製劑還可適於通過各種途徑及如治療RAGE介導的所關注病症需要來施用。在某些實施方案中，重構RAGE融合蛋白製劑適於將製劑以靜脈內、腹膜內或皮下中的至少一種施用給受試者。在製劑、製品及製造包含RAGE融合蛋白的製劑的方法的某些實施方案中，重構製劑中RAGE融合蛋白濃度可為至少10mg/mL或至少20mg/mL或至少50mg/mL。在替代實施方案中，重構製劑中RAGE融合蛋白濃度可為至少100mg/mL或200mg/mL或400mg/mL。例如，在替代實施方案中，重構製劑中RAGE融合蛋白濃度為至少約0.5至400mg/mL或約1至200mg/mL、40至400mg/mL、50至400mg/mL、40至100mg/mL、50至100mg/mL或約40-50mg/mL。例如，在一實施方案中，RAGE融合蛋白作為製劑施用，該製劑呈具有約5.O至約6.5範圍的pH值且包含約lmg/mL至約200tng/ml的RAGE融合蛋白、約1毫摩爾至約100毫摩爾的組氨酸緩衝劑、約0.01mg/mL至約10mg/mL的聚山梨醇酯80、約100毫摩爾至約400毫摩爾的海藻糖及約0.01毫摩爾至約1.Q毫摩爾的乙二胺四乙酸二鈉二水合物的無菌水溶液形式。本文所述的任一實施方案可用作本發明製劑中的RAGE融合蛋白。因此，對凍幹製劑、重構凍幹製劑或製備凍幹製劑或重構凍幹製劑的方法或包含本發明的凍幹製劑或重構凍幹製劑的製品的每一者而言，RAGE融合蛋白可包含來源於連接於免疫球蛋白多肽的RAGE配體結合位點的序列。因此如本文所述，RAGE融合蛋白的實施方案可包含直接連接於包含免疫球蛋白的CH2結構域或免疫球蛋白的CH2結構域的部分的多肽的RAGE多肽。在某些實施方案中，RAGE多肽可包含連接於RAGE免疫球蛋白域的RAGE域間連接子，以便RAGE免疫球蛋白域的C末端胺基酸連接於域間連接子的N末端胺基酸，且RAGE域間連接子的C末端胺基酸直接連接於包含免疫球蛋白的CH2結構域或其部分的多肽的N末端胺基酸。例如，融合蛋白的某些實施方案可包含連接於第二RAGE免疫球蛋白域及第二RAGE域間連接子的第一RAGE免疫球蛋白域及第一RAGE域間連接子，以便第一域間連接子的N末端胺基酸連接於第一RAGE免疫球蛋白域的C末端胺基酸，第二RAGE免疫球蛋白域的N末端胺基酸連接於第一域間連接子的C末端胺基酸，第二域間連接子的N末端胺基酸連接於第二RAGE免疫球蛋白域的C末端胺基酸，且RAGE第二域間連接子的C末端胺基酸直接連接於CH2免疫球蛋白域或免疫球蛋白的CH2結構域的部分的N末端胺基酸。例如，在RAGE融合蛋白的替代實施方案中，RAGE多肽可包含如SEQIDNO:10中所述的胺基酸序列或與其至少90%—致的序列，或如SEQIDNO:47中所述的胺基酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96°/。、97°/。、98%或99。/。一致的序列。在其它替代實施方案中，RAGE融合蛋白可包含如SEQIDNO:32、33、34、35、36、37、56或57的至少一個中所述的胺基酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99°/。一致的序列。例如，在某些實施方案中，與SEQIDNO:32、33、34、56、35、36、37或57至少90%—致的序列包含無C末端賴氨酸的SEQIDNO:32、33、34、56、35、36、37或57多肽。凍幹製劑的製備在另一實施方案中，本發明提供預凍幹製劑、凍幹製劑、重構製劑及其製備方法。在製備如上文所述的所關注RAGE融合蛋白後，可產生"預凍幹製劑"。可考慮所要劑量體積、給藥模式等來確定存在於預凍幹製劑中的RAGE融合蛋白的量。在一實施方案中，預凍幹製劑中融合蛋白的量可超過1mg/mL。在某些實施方案中，預凍幹製劑中融合蛋白的量還可少於約5mg/ml、10mgM、50mg/mL、100mg/mL或200mg/mL。在另一實施方案中，預凍幹製劑可為在約4-8的pH值下的pH緩衝溶液。在另一實施方案中，預凍幹製劑可為在約5-7的pH值下的pH緩沖溶液。在另一實施方案中，預凍千製劑可為在少於6.7的pH值下的pH緩衝溶液。在另一實施方案中，預凍幹製劑可為在約6.0的pH值下的pH緩衝溶液。例示性緩衝劑包括組氨酸、磷酸鹽、Tris、杼檬酸鹽、琥珀酸鹽及如本文所述的其它有機酸。緩衝劑濃度視(例如)緩衝劑及製劑(例如重構製劑)的所要等滲性而定可為約1mM至約100mM，或少於約50mM，或約2mM至約50mM，或少於約15mM，或約3mM至約15mM。在一實施方案中，緩衝劑為組氨酸。凍幹保護劑可添加至預凍千製劑中。在一實施方案中，凍幹保護劑包含糖。在另一實施方案中，凍幹保護劑包含非還原性糖。在另一實施方案中，凍幹保護劑包含非還原性糖蔗糖。或者，非還原性糖可包含甘露糖醇。或者，非還原性糖可包含海藻糖。預凍幹製劑中凍千保護劑的量一般使重構後所得製劑等滲。然而，高滲性重構製劑也可適於(例如)以製劑形式用於外周腸胃外給藥。此外，凍幹保護劑的量不應過低使得在凍幹後出現不可接受量的蛋白降解和/或聚集。在替代實施方案中，不可接受量的聚集可為20%、或10%、或5%、或5%以上的RAGE融合蛋白以聚集體形式存在於製劑中。預凍幹製劑中凍幹保護劑濃度的例示性範圍可少於約400mM。在另一實施方案中，預凍幹製劑中凍幹保護劑濃度的範圍可少於約100mM。因此，在替代實施方案中，預凍幹製劑中凍幹保護劑濃度的範圍可為約0.5mM至400mM或約2mM至200mM或約30mM至約150mM或約60mM至65niM。在某些實施方案中，凍幹保護劑還以使重構製劑等滲的量添加。針對各RAGE融合蛋白及凍幹保護劑組合選擇預凍幹製劑中RAGE融合蛋白與凍幹保護劑的比率。在具有高RAGE融合蛋白濃度(例如大於或等於約50mg/mL)的等滲重構製劑的實施方案中，凍幹保護劑與RAGE融合蛋白的摩爾比可為約50摩爾至約1500摩爾凍幹保護劑比1摩爾RAGE融合蛋白。在另一實施方案中，凍幹保護劑與RAGE融合蛋白的摩爾比可為約150摩爾至約IOOO摩爾凍幹保護劑比l摩爾融合蛋白。在另一實施方案中，凍幹保護劑與RAGE融合蛋白的摩爾比可為約150摩爾至約300摩爾凍幹保護劑比1摩爾RAGE融合蛋白。例如，在凍幹保護劑為非還原性糖(如蔗糖、海藻糖或甘露糖醇)的情況下，這些範圍可為適合的。在本發明的另一實施方案中，表面活性劑可添加至預凍幹製劑中。可選擇地或另外，表面活性劑可添加至凍幹製劑和/或重構製劑中。例示性表面活性劑包括非離子表面活性劑，如聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20或80)(Tween2(P或Tween80)、泊洛沙姆(poloxamer)(例如泊洛沙姆188)。所添加的表面活性劑的量使得其減少重構蛋白的聚集且最小化重構後^:粒形成。例如，表面活性劑可以約0.001%至0.5%的量存在於預凍幹製劑中。例如，在其中表面活性劑包含聚山梨醇酯80的實施方案中，表面活性劑可以約0.005°/。至0.05%或約0.008%至0.012%或約0.01。/。的量存在於預凍幹製劑中。可選擇地，表面活性劑可存在於製劑中以致包含O.001mg/mL至約100mg/mL或約0.01mg/mL至約IOmg/mL範圍的最終濃度。在本發明的某些實施方案中，凍幹保護劑(如蔗糖或組氨酸)與膨化劑(例如甘露糖醇或甘氨酸)的混合物可用於預凍幹製劑的製備中。膨化劑可允許均勻凍幹餅塊(其中無過多凹穴等)產生。其它藥學上可接受的載體、賦形劑或穩定劑(如Remington'sPharmaceuticalSciences第16版，Osol，A.Ed.(1980)中描述的那些栽體、或重構製劑)中，只要它們不負面影響製劑的所要特徵。可接受的載體、賦形劑或穩定劑在所用劑量及濃度下對接受者而言為無毒的且包括額外緩衝劑、防腐劑、助溶劑、抗氧化劑(包括抗壞血酸及甲硫氨酸)、螯合劑(如EDTA)、金屬複合物(例如Zn-蛋白複合物)、生物可降解聚合物(如聚酯)和/或形成鹽的平衡離子(如鈉)。本發明的RAGE融合蛋白製劑還可含有如所治療的特定適應症所需的額外蛋白質。可選擇額外蛋白質使得各蛋白質具有不負面影響彼此或RAGE融合蛋白的互補活性。這類蛋白質適合於以有效達成所期望目的的量存在於組合物中。對體內施用而言，本發明的RAGE融合蛋白製劑可為無菌的。這可通過在凍幹及重構之前或之後經由無菌過濾膜過濾來達成。將RAGE融合蛋白、凍幹保護劑及其它任選組份共同混合後可凍幹製劑。許多不同凍幹機可用於該目的，如Hull50TM(Hull，USA)或GT20(Leybold-Heraeus，Germany)凍幹機。通過冷凍製劑且隨後在條件下，產物溫度在製劑低共溶點或坍塌溫度以下。通常，在適合壓力(通常在約50mTorr至250mTorr範圍內)下初步乾燥的板層溫度在約-5(TC至25。C範圍內(只要產物在初步乾燥期間保持冷凍)。在一實施方案中，壓力為約100mTorr且樣品可在約-30。C與25。C之間凍幹。製劑、保存樣品的容器(例如玻璃瓶)的大小及類型及液體體積可指示乾燥所要時間，該時間可在數小時至數天(例如40-60小時)範圍內。冷凍乾燥條件可視製劑及小瓶大小而變化。在某些情況下，可能需要在進行蛋白重構的容器中凍幹蛋白製劑以避免轉移步驟。在這種情況下，容器可為(例如)2、3、5、10、20、50、IOO或250cc小瓶。在一實施方案中，容器為適於製備體積小於或等於100niL的重構製劑的任何容器。作為一般建議，凍幹將導致水分含量少於約5%的凍幹製劑。在一實施方案中，凍幹製劑的水分含量少於約3%。在另一實施方案中，凍幹製劑的水分含量少於約1%。凍幹製劑的重構在所要階段，通常在將RAGE融合蛋白施用給患者或受試者時，用稀釋劑重構凍幹製劑以便重構製劑中RAGE融合蛋白濃度大於約10mg/mL或大於20mg/ml或大於50mg/mL或約30-50mg/mL或約50mg/mL。在替代實施方案中，重構製劑中RAGE融合蛋白濃度可為至少100mg/mL或200mg/mL或400mg/mL。例如，在替代實施方案中，重構製劑中RAGE融合蛋白濃度可在約1mg/mL至約600mg/mL，或約1mg/mL至約500mg/mL，或約1mg/mL至約400mg/mL，或約1mg/mL至約200mg/mL,或約10mg/mL至約400mg/mL，或約10mg/mL至約200mg/mL,或約40mg/mL'至約400mg/mL，或約40mg/mL至約200mg/mL，或約50mg/mL至約400mg/mL，或約50mg/mL至約200mg/mL的範圍內。在其它實施方案中，重構製劑中RAGE融合蛋白濃度可為約40mg/mL至約100mg/mL，或約50mg/mL至約100mg/mL,或約40mg/mL至約50mg/mL。在需要皮下遞送重構製劑的情況下，認為重構製劑中這類RAGE融合蛋白濃度尤其有用。然而，對其他給藥途徑(如靜脈內施用)而言，可能需要重構製劑中較低蛋白濃度(例如重構製劑中RAGE融合蛋白約5-50mg/ml或約10-40mg/ml)。因此在某些實施方案中，重構製劑中融合蛋白濃度可等於或小於預凍幹製劑中融合蛋白濃度的2倍。在某些實施方案中，重構製劑中融合蛋白濃度顯著高於預凍幹製劑中融合蛋白濃度。例如，在某些實施方案中，重構製劑中融合蛋白濃度可為預凍幹製劑的融合蛋白濃度的約2-40倍或2-10倍或3-8倍。在一實施方案中，重構製劑中RAGE融合蛋白濃度可為預凍幹製劑中RAGE融合蛋白濃度的約3-6倍。在預凍幹製劑中RAGE融合蛋白濃度為約15mg/mL的另一實施方案中，重構製劑中RAGE融合蛋白濃度大於或等於約50mg/mL(例如大至少3倍或至少4倍)。由於體積限制(小於或等於1.5mL)及劑量需要(大於或等於100mg)，所以對皮下給藥而言高蛋白濃度遞送常為有利的或所需的。然而，因為在高濃度下蛋白質在加工期間可能具有聚集的趨勢且難以操作(例如抽吸)及無菌過濾，所以在製造過程中可能難以達到蛋白濃度(大於或等於50mg/mL)。可選擇地，凍幹過程可提供一種使蛋白濃縮的方法。例如，RAGE融合蛋白可填充至一定體積(Vf)小瓶中且接著凍幹。接著用比初始體積小的體積(Vr)(例如Vr-O.25Vf)的水或防腐劑(例如BWFI)重構凍幹RAGE融合蛋白，導致重構溶液中更高RAGE融合蛋白濃度。此過程還導致緩沖劑及賦形劑濃縮。皮下給藥需要溶液等滲。雖然需要時可使用其它溫度，但重構一般發生在約25。C的溫度下以確保完全水合。重構所需時間可視(例如)稀釋劑類型、賦形劑及蛋白質的量而定。例示性稀釋劑包括無菌水、用於注射的抑菌水(BWFI)、pH緩衝溶液(例如磷酸鹽緩沖生理鹽水)、無菌生理鹽水溶液、林格氏溶液或葡萄糖溶液。在一實施方案中，稀釋劑提供適於注射的重構製劑。在另一實施方案中，在稀釋劑提供適於注射的重構製劑的情況下，稀釋劑包含用於注射的水(WFI)。稀釋劑任選地含有防腐劑。可通過評估與蛋白質兼容的不同防腐劑濃度及防腐劑功效測試來確定所用防腐劑的量。在替代實施方案中，在每50mL容器中重構製劑可具有少於8，000個、或少於6，000個、或少於4,000個、或少於2，000個、或少於1，000個、或少於600個、或少於400個、或少於200個、或少於100個、或少於50個大小等於或大於10jam的微粒。在其它實施方案中，在每50mL容器中重構製劑可具有少於8,000個、或少於6，000個、或少於4，000個、或少於2，000個、或少於1，000個、或少於600個、或少於400個、或少於200個、或少於100個、或少於50個大小等於或大於25jim的孩吏粒。重構製劑的施用根據已知方法(如以大丸劑靜脈內施用或通過經一段時間連續輸液、通過肌肉內、腹膜內、腦脊髓內、皮下、關節內、滑膜內、鞘內、經口、局部或吸入途徑)可將重構製劑施用給需要用RAGE融合蛋白治療的哺乳動物(如人類)。在實施方案中，重構製劑可通過皮下(即在皮膚下)給藥來施用給哺乳動物。為此，可使用注射器注射重構製劑。然而，施用重構製劑的其它裝置可購得，如注射裝置(例如Inject-easeTM及GenjectTM裝置)、注射筆(如GenPen)、無針裝置(例如Medi化"0^及BioJector)及皮下貼片遞送系統。RAGE融合蛋白的適當劑量或治療有效量視(例如)待治療的病況、病況的嚴重程度及過程、RAGE融合蛋白為預防目的還是治療目的施用、先前療法、患者臨床病史及對RAGE融合蛋白的反應及主治醫師的判斷而定。RAGE融合蛋白可一次或經一系列治療施用給受試者(例如患者)或可自診斷起的任何時間施用給患者。RAGE融合蛋白可作為唯一治療或與其它適於治療所論述的病況的藥物或療法結合施用。在一實施方案中，無論(例如)通過一或多種單獨給藥，約0.1-20mg/kg的劑量為施用給受試者的最初候選劑量。如上所述，其它給藥方案可能是有用的。製品在本發明的另一實施方案中，提供含有本發明的凍幹製劑且提供其重構和/或用途的說明的製品。製品可包含一容器。適合容器包括(例如)瓶、小瓶(例如兩室小瓶)、注射器(如兩室注射器)及試管。容器可由如玻璃或塑料的多種材料形成。容器可保存凍幹製劑。在某些實施方案中，可存在粘貼於容器或與容器相關聯的標籤。標籤可指示重構和/或用途的說明。例如，在某些實施方案中，標籤可指示將凍幹製劑重構成如上所述的蛋白質濃度。標籤可進一步說明製劑適於或旨在皮下給藥。'保存製劑的容器可為多用途小瓶，其允許重複施用(例如2-6次或2-10次或2-50次施用)重構製劑。製品可進一步包含第二容器，該第二容器包含適合稀釋劑(例如WFI)。將稀釋劑與凍幹製劑混合後，重構製劑中最終RAGE融合蛋白濃度一般為至少10mg/mL。在一實施方案中，重構製劑中最終RAGE融合蛋白濃度為至少約20mg/mL。在另一實施方案中，重構製劑中最終RAGE融合蛋白濃度為至少約50mg/mL。在替代實施方案中，重構製劑中RAGE融合蛋白濃度可為至少100mg/mL、或200mg/mL或400mg/mL。在其它實施方案中，重構製劑中最終RAGE融合蛋白濃度介於約1-400mg/mL、或1-200mg/mL、或l-100mg/mL、或10-400mgM、或10-200mg/mL、或10-100mg/mL、或40-400mgM、或40-200mg/mL、或40-100mgM、或50-400mg/mL、或50-200mg/mL、或50-100mg/mL或40mg/mL至50mg/mL之間。從商業及使用者觀點，製品可進一步包括其它所要物質，包括其它緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針、注射器及具有用途說明的藥品說明書。實施例在以下實施例中進一步說明本發明所涵蓋的本發明概念的特徵及優點。實施例1A:RAGE融合蛋白的產生構建兩個質粒以表達RAGE-IgG融合蛋白。通過連接來自人類RAGE的不同長度的5'cDNA序列與來自人類IgGFc(yD的相同3'cDNA序列構建兩個質粒。接著將這些表達序列(即連接產物)插入pcDNA3.1表達載體(Invitrogen，CA)中。編碼RAGE融合蛋白編碼區的核酸序列展示於圖2及3中。對TTP-4000RAGE融合蛋白而言，1至753的核酸序列(以粗體突出)編碼RAGEN-末端蛋白序列，而754至1386的核酸序列編碼無鉸鏈的IgGFc蛋白序列(圖2)。對TTP-3000而言，1至408的核酸序列(以粗體突出)編碼RAGEN-末端蛋白序列，而409至1041的核酸序列編碼無鉸鏈的IgGFc蛋白序列(圖3)。為產生RAGE融合蛋白，將包含SEQIDNO:30或SEQIDNO:31的核酸序列的表達載體穩定轉染至CHO細胞中。針對由質粒賦予的新黴素抗性來選擇及克隆陽性轉化林。擴增如通過上清液的蛋白質印跡分析法所檢測的高產克隆且通過使用蛋白A柱的親和層析法來純化基因產物。最優化表達使得細胞產生約1.3g/1水平的重組TTP-4000。實施例IB:四域RAGE融合蛋白的替代產生構建一質粒以表達RAGE-IgG融合蛋白。通過連接來自人類RAGE的5'cDNA序列與來自無Fc鉸鏈區的人類IgGFc(yl)的3'cDNA序列構建該質粒。用PCR擴增cDNA。此外，在5'末端，PCR引物添加來自克隆的EcoRI限制酶位點及Kozak共有(consensus)翻譯起始序列。在3'末端，PCR引物在末端密碼子的緊鄰後方添加XhoI限制位點。在3'末端，PCR引物還包括移除末端密碼子附近的免疫球蛋白部分所隱含的RNA剪接位點的兩個沉默鹼基改變。編碼脯氨酸(依據SEQIDNO:32中蛋白序列編號，為殘基459)的密碼子自CCG變成CCC，且編碼甘氨酸(依據SEQIDNO:32中蛋白序列編號，為殘基460)的密碼子自GGT變成GGG。用EcoRI及XhoI消化PCR片段且接著將其插入經MfeI消化(以形成具有EcoRI的兼容末端)及經XhoI消化的逆轉錄病毒載體質粒(pCNS-newMCS-WPRE(newori)，購自Gala,Inc.)中。可對克隆質粒的插入部分及克隆連接處測序以確保克隆期間無突變發生。為產生RAGE-IgG融合蛋白，將包含核酸序列SEQIDNO:54的表達載體穩定轉染至CHO細胞中。由轉染細胞表達的分離RAGE融合蛋白TTP-4000的序列通過各種特徵研究證實為SEQIDNO:34或SEQIDNO:56,或SEQIDNO:34及SEQIDNO:56兩者。因此，切除由SEQIDNO:32的前23個胺基酸編碼的信號序列且N末端殘基為穀氨醯胺(Q)或焦穀氨酸(pE)或其混合物。特徵研究還展示N2及N288(基於SEQIDNO:34或SEQIDNO:56的編號)處的糖基化位點且展示當在該重組系統中表達時RAGE融合蛋白的CH3區可經由翻譯後修飾來切除其C末端殘基。實施例1C:三域RAGE融合蛋白的替代產生以上述針對TTP-4000的方式可構建質粒以表達三域RAGE-IgG融合蛋白(例如，一個RAGE域及兩個IgG域)，如TTP-3000。通過連接來自人類RAGE的編碼人類RAGE的胺基酸1-136的cDNA序列與無Fc鉸鏈區的來自人類IgGFc(yl)的3'cDNA序列來構建質粒。PCR可用於擴增cDNA。在5'末端，PCR引物可添加用於克隆的限制位點(例如，如TTP-4000所用的EcoRI限制酶位點)及Kozak共有翻譯起始序列。在3'末端，PCR引物還可緊在末端密碼子之後添加限制位點(例如Xhol限制位點)。如若需要，則PCR引物還可包括沉默鹼基變化以移除任何隱含RNA剪接位點，如位於如實施例1B中所述的免疫球蛋白CH2結構域的3'末端處的隱含RNA剪接位點。為移除這些隱含剪接位點，編碼SEQIDNO:35的脯氨酸344(即基於SEQIDNO:31中DM序列編號的殘基1030-1032)的密碼子可自CCG變成CCC，且編碼SEQIDNO:35的甘氨酸345(基於SEQIDNO:31中DNA序列編號的殘基1033-1035)的密碼子可自GGT變成GGG。接著可用適當限制酶(例如EcoRI及XhoI)消化PCR片段且將其插入逆轉錄病毒載體質粒pCNS-newMCS-WPRE(newori;購自Gala,Inc.)中。可用MfeI消化載體以形成與EcoRI兼容的末端，且還用XhoI消化。可對克隆質粒的插入部分及克隆連接處測序以確保克隆期間無突變發生。如實施例IA及IB中所述，為產生RAGE-IgG融合蛋白，可將包含核酸序列SEQIDNO:55(即包含移除隱含剪切位點的DNA序列變化)的表達載體穩定轉染至CH0細胞中。由轉染細胞表達的分離RAGE融合蛋白TTP-3000的序列可為SEQIDNO:36、SEQIDNO:37或SEQIDNO:57或SEQIDNO:36、SEQIDNO:37和/或SEQIDNO:57的組合。因此，由SEQIDNO:35的醯胺(Q)或焦穀氨酸(pE)或其混合物。糖基化可發生在N2及N174(基於SEQIDNO:37或SEQIDNO:57的編號)位點和/或其它可能存在的糖基化位點處。當在該重組系統中表達時RAGE融合蛋白的CH3區可經由翻譯後修飾來切除其C末端殘基。實施例2:測試RAGE-IgGl融合蛋白活性的方法A.體外配體結合將已知RAGE配體以每孔5;微克的濃度塗布於Maxisorb板的表面上。將板在4X:下溫育隔夜。配體溫育後，吸乾板且室溫下將1%BSA於50mM咪唑緩沖劑中的封閉緩沖劑(pH7.2)添加至板中歷時1小時。接著吸乾板和/或用洗滌緩沖劑(20mM咪唑、150mMNaCl、0.05%Tween-20、5mMCaCl2及5mMMgCl2，pH7.2)洗滌。製備起始濃度為1.082mg/mL的TTP-3000(TT3)溶液及起始濃度為370|ag/mL的TTP-4000(TT4)溶液。以起始樣品的遞增稀釋度添加RAGE融合蛋白。在37。C下使RAGE融合蛋白與固定化的配體溫育一'卜時，接著洗滌板且分析RAGE融合蛋白的結合。通過添加含有單克隆小鼠抗人類IgGl(以1:11，000稀釋成21ng/100nL的最終試驗濃度(FAC))、生物素化的山羊抗小鼠IgG(以1:500稀釋成500ng/pL的FAC)及抗生物素蛋白連接的鹼性磷酸酶的免疫檢測複合物來檢測結合。室溫下用固定的RAGE融合蛋白溫育複合物1小時，接著洗滌板且添加鹼性磷酸酶底物對硝基苯基磷酸酯(PNPP)。通過測量PNPP至對硝基苯酚(PNP)的轉化(在405nm下分光光度測量)來定量複合物與固定的RAGE融合蛋白的結合。如圖7所說明，RAGE融合蛋白TTP-4000(TT4)及TTP-3000(TT3)與已知RAGE配體澱粉狀蛋白P(Ap)、S100b(S100)及兩性蛋白(Ampho)特異性相互作用。在配體不存在下(即單獨BSA塗布(BSA或BSA+洗滌劑))，可歸因於免疫檢測複合物的非特異性結合的吸光率水平未增加。在澱粉狀蛋白P用作標記配體時，可能需要在試驗前預溫育澱粉狀蛋白P。預溫育可使澱粉狀蛋白P自身聚集成摺疊片狀形式，因為澱粉狀蛋白P可優選地以摺疊片狀形式結合RAGE。RAGE融合蛋白TTP-4000及TTP-3000與RAGE配體之間的特異性相互作用的額外證椐可例示於展示RAGE配體能夠與結合RAGE融合蛋白的已知RAGE配體有效竟爭的研究中。在這些研究中，澱粉狀蛋白P(Ap)固定於Maxisorb板上且如上文所述添加RAGE融合蛋白。此外，將RAGE配體與RAGE融合蛋白同時添加至某些孔中。發現在TTP-4000以123jag/mL存在的情況下(l:3稀釋，圖8)，RAGE配體可將TTP-4000(TT4)的結合阻斷約25°/。至30%。當TTP-4000的起始溶液以係數10或30(1:10或1:30)稀釋時，RAGE融合蛋白與固定的配體的結合完全糹皮RAGE配體抑制。類似地，在TTP-3000以360yg/mL存在的情況下(1:3稀釋，圖9),RAGE配體將TTP-3000(TT3)的結合阻斷約50%。當TTP-3000的起始溶液以係數10(1:IO)稀釋時，RAGE融合蛋白與固定的配體的結合完全被RAGE配體抑制。因此，RAGE融合蛋白與RAGE配體結合的特異性是劑量依賴性的。還如圖8及9中所示，在RAGE融合蛋白不存在下(即僅使用免疫檢測複合物("單獨的複合物"))基本上未檢測到結合。B.RAGE融合蛋白在基於細胞的試驗中的作用先前工作展示骨髓THP-1細胞可對RAGE配體應答而分泌TNF-ct。在該試驗中，使用ATCC提供的方法，在補充有10%FBS的RPMI-1640培養基中培養THP-1細胞。在RAGE融合蛋白TTP-3000(TT3)或TTP-4000(TT4)(10jag)、sRAGE(10jug)及人類IgG(10ng)(即作為陰性對照)不存在或存在下，經由用0.1mg/mlSlOOb刺激RAGE來誘導細胞分泌TNF-cc。在將蛋白質添加至細胞培養物24小時後使用市售的4十對TNF—ot的ELISA試劑盒(R&DSystems,Minneapolis,MN)測量由THP-1細胞分泌的TNF-oc的量。圖10中的結果證明RAGE融合蛋白抑制這些細胞中S100b/RAGE誘導的TNF-ct產生。如圖10所示，在添加10jugTTP-3000或TTP-4000RAGE融合蛋白時，SlOOb(O.lmg/mlFAC)誘導的TNF-a分別減少約45%至70°/。。融合蛋白TTP-4000在阻斷SlOOb誘導TNF-a方面至少與sRAGE—才羊有效(圖10)。通過其中僅將IgG添加至SI00b刺激的細胞的實驗展示TTP-4000及TTP-3000RAGE序列的抑制特異性。將IgG及S100b添加至試驗展示與僅添加SlOOb相同的TNF-a含量。通過其中僅將IgG添加至SlOOb刺激的細胞的實驗展示對RAGE融合蛋白的RAGE序列而言TTP-4000及TTP-3000抑制TNF-a誘導的特異性。可見將IgG(即無RAGE序列的人類IgG，以每孔10)ig添加的Sigma人類IgG)及S100b添加至試驗中展示與僅添加S100b相同的TNF-ct含量。在另一基於細胞的試驗中，評估TTP-4000預防RAGE配體HMGB1與RAGE及其它HMGB1受體相互作用的能力。與結合RAGE且預防RAGE配體與RAGE相互作用的抗RAGE抗體不同，TTP-4000可通過與RAGE配體結合來阻斷RAGE配體與RAGE的相互作用。已報導HMGB1為RAGE及Toll樣受體2及4的配體(Park等人，/Wo/，2004;279(9):7370-7)。所有這三個受體(RAGE、Tol1樣受體2及Tol1樣受體4)均表達於THP-1細胞上(Parker等人，//邁邁Mo/.，2004，172(8):4977-86)。在該實驗中，在TTP4000或抗RAGE抗體存在或不存在下通過HMGBl(5Qmg/mL)刺激THP-l細胞產生TNF-cc。在試驗所用的條件下，HMGB1應為TNF-ot的唯一謙導劑。在將蛋白質添加至細胞培養物24小時後使用市售的針對TNF-ot的ELISA試劑盒(R&DSystems,Minneapolis,MN)測量由THP-1細胞分泌的TNF-cc的量。雖然圖11的結果證明抗RAGE抗體及RAGE融合蛋白TTP-400Q阻斷HMGB1與在THP-1細胞上表達的RAGE相互作用，但TTP-4000比抗RAGE抗體更大程度地抑制HMGB1誘導的TNF-oc產生。因此，該數據表明通過抑制HMGB1與Toll樣受體2及4以及存在於THP-1細胞上的RAGE相互作用，TTP-4000比抗RAGE抗體更大程度地抑制HMGB1活性。實施例3:TTP-4000藥代動力學概況為測定與人類sRAGE相比TTP-4000是否具有較好藥代動力學概況，給大鼠及非人類靈長類動物靜脈內(IV)注射TTP-4000(5mg/kg)且接著針對TTP-4000的存在來評估血漿。在這些實驗中，兩隻首次用於實驗的的雄性猴的外周靜脈接受單獨IV單次劑量的TTP_4000(5mg/ml/kg)接著約1.0毫升(ml)生理鹽水衝洗。在給藥前(即在注射TTP-4000前)或在給藥後0.083、0.25、0.5、2、4、8、12、24、48、72、96、120、168、240、288及336小時收集血樣(約1.0mL)至含有肝素鋰的管。收集後，將管置放在溼水上(最長30分鐘)直至在冷凍下(在2至8。C下)以1500xg離心15分鐘。接著冷凍(-70。C士10。C)儲存各個所釆集血漿樣品直至使用ELISA分析在注射後不同時間點的RAGE多肽，如實施例6中所述。圖12中所示的動力學概況表明如通過兩隻動物中oc相相對陡的斜率所證明TTP-40004吏其配體飽和後，TTP-4000保持超過300小時的終末半衰期。該半衰期比人類sRAGE在血漿中的半衰期(一般約2小時)顯著大且為急性及半慢性適應症的單次注射提供機會。圖12中，各曲線表示在相同實驗條件下的不同動物。實施例4:TTP-4000Fc活化進行實驗以測量與人類IgG相比RAGE融合蛋白TTP-4000對Fc受體的活化。通過測量從表達Fc受體的THP-1細胞分泌的TNF-oc來測量Fc受體活化。在這些實驗中，用每孔IOjag的TTP-4000或人類IgG塗布96孔板。Fc刺激導致TNF-a分泌。通過酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測量TNF-a的量。因此在該試驗中，根據ATCC說明將骨髓細胞系THP-l(ATTC#TIB-202)保持在補充有10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中。通常，通過用每孔IOmg的熱聚集(63。C下30min)TTP-4000或人類IgGl預塗布孔，經由Fc受體刺激來誘導每孔40,000-80，000個細胞分泌TNF-cc。根據說明4吏用市售的TNFELISA試劑盒(R&DSystems,Minneapolis,MN#DTAOOC)在從所處理的孔中的24小時細胞培養物收集的上清液中測量由THP-l細胞分泌的TNF-oc的量。結果展示於圖13中，其中可見TTP-4000產生少於每孔2ng的TNF且IgG產生超過每孔40ng的TNF。實施例5:TTP-4000的體內活性在若干人類疾病的體內模型中比較TTP-4000與sRAGE的活性。A.TTP-4000在再狹窄的動物才莫型中在再狹窄的糖尿病大鼠;t莫型中評估RAGE融合蛋白TTP-4000,涉及測量血管損傷後21天平滑肌增殖及內膜擴增。在這些實驗中，使用標準方法在Zucker糖尿病及非糖尿病大鼠體內進行左頸總動脈的球嚢損傷。在損傷前一天將負載劑量(每隻大鼠3mg)的IgG、TTP-4000或磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)經腹膜內施用(IP)。每兩天遞送維持劑量直至損傷後第7天(即在損傷後第1、3、5及7天)。較高維持劑量為一組每隻動物lmg，或較低為第二組每隻動物0.3mg。為測量血管平滑肌細胞(VSMC)增殖，在損傷後第4天及第21天處死動物。為測量細胞增殖，在安樂死前18小時、12小時及2小時^f吏4天的動物接受腹膜內注射50mg/kg的溴代脫氧尿苷(BrDdU)。處死後，採集完整左側頸動脈及右側頸動脈。在包埋前將試樣儲存於Histochoice中歷時至少24小時。使用小鼠抗BrdU單克隆抗體進行VSMC增殖的評估。應用焚光標記的山羊抗小鼠二抗。由兩名對處理方案盲向的觀測者計數每部分BrdU陽性細胞核數。在21天處死剩餘大鼠以進行形態測量分析。由對研究群組盲向的觀測者使用計算機化數位化顯微面積測定軟體Image-ProPlus對由VanGieson染色法染色的頸動脈連續切片(相隔5mm)進行形態測量分析。所有數據均表示為平均值士SD。使用SPSS軟體進行統計分析。使用非配對t檢驗法來比較連續變量。認為P<0.05的值為統計學顯著的。如圖14A及14B中可見，TTP-4000處理以劑量反應方式顯著減少內膜/介質比率及血管平滑肌細胞增殖。在圖14B中，y軸表示BrdU增殖細胞數量。B.AD動物才莫型中的TTP4000進行實驗以評估TTP-4000是否可影響AD小鼠模型中澱粉狀蛋白形成及認知功能障礙。該實驗利用在PDGF-B鏈啟動子控制下表達人類Swedish突變體澱粉狀前體蛋白(APP)的轉基因小鼠。這些小鼠隨時間產生高水平的RAGE配體澱粉狀蛋白P(Ap)。先前，展示sRAGE治療3個月減少該模型中腦中澱粉狀蛋白斑形成及相關的炎症標記增加。通過在血小板衍生生長因子B(PDGF-B)鏈基因啟動子的控制下將計用於該實驗的APP小鼠(雄性)。在C57BL/6背景下產生小鼠且通過MolecularTherapeuticsInc，來發育小鼠。隨意餵養動物且通過兄妹交配來保持。從6個月大時開始，從該構建體產生的小鼠發展澱粉狀蛋白沉積物。動物成長到6個月大且接著供養90天並處死以進行澱粉狀蛋白定量。在6個月大時開始每兩天向APP轉基因小鼠施用[qod(i.p.)]媒劑或TTP4000，歷時90天。在實驗結束時，處死動物且檢查腦中AP斑負荷(即斑數目)。6個月大對照APP組用於測定澱粉狀蛋白沉積物的基線。此外在研究結束時，使動物經受行為(Morris水迷宮(Morriswatermaze))分析。研究者對研究化合物為盲向的。將樣品以每兩天每隻小鼠0.25ml給予小鼠。此外，給予一組小鼠每天200)ig的人類sRAGE。厶澱粉炎'f^-沉積為進行組織學檢查，利用腹膜內注射(IP)戊巴比妥鈉(50mg/kg)來麻醉動物。用4'C磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)接著4%低聚曱醛經心灌注動物。將腦移除且置放於4%低聚曱醛中過夜。以石蠟加工腦且包埋。獲得十個連續30Mm厚經由腦部的切片。在4'C下使切片經受一抗(AP肽抗體)過夜以檢測轉基因動物的腦中澱粉狀蛋白沉積物(Guo等人，/.vVewo;c/.,22:5900-5909(2002))。在Tris緩衝生理鹽水(TBS)中洗滌切片且添加二抗且在室溫下溫育1小時。洗塗後，如VectorABCElite試劑盒(VectorLaboratories)中所指示溫育切片且用二氨基苯甲酸(DAB)染色。在水中停止反應且用二甲苯處理後以蓋玻片覆蓋。用計算機輔助影像分析系統(由裝備有QuickCaptureframegrabbercard的PowerMacintosh計算機、安裝在Olympus顯微鏡及相機支架上的HitachiCCD相機組成)測定各切片中澱粉狀蛋白面積。使用NIH影像分析軟體v.1.55。捕捉影像且測定出十個切片的澱粉狀蛋白的總面積。對處理狀況盲向的單個操作員進行所有測量。對切片的澱粉狀蛋白體積求和且除以切片總數以計算澱粉狀蛋白體積。為進行定量分析，使用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)來測量APP轉基因小鼠的腦中人類總Ap、A0總及APh2水平(BiosourceInternational,Camarillo，CA)。通過鹽酸胍從小鼠腦中提取AP總及A(3h2且如製造商所述定量。該試驗從腦中提取出總肽(均可溶且聚集)。麼"餘^教如下進行Morris水迷宮測試在實驗結束時在Morris水迷宮測試中測試所有小鼠一次。在1.2m戶外水迷宮中訓練小鼠。將池用水填充至30cm深且保持在25。C。將逃跑平臺(1Gcm"置放在水平面下1cm。在試驗期間，自池中移除平臺。在用白色帘子圍繞以隱藏任何迷宮外提示的池中進行提示測試。所有動物均連續三天經歷非空間預先訓練(NSP)。這些試驗為動物進行最終行為測試作準備以測定找到平臺的記憶保留。雖然未記錄這些試驗，但這些試驗僅為了訓練的目的。為進行訓練及認知研究，移除帘子以提供額外迷宮提示(這允許鑑別具有遊泳損傷的動物)。在第1天，將小鼠置於隱藏平臺上歷時20秒(試驗1)，針對試驗2-3，將動物釋放在距離提示平臺或隱藏平臺(試驗4)10cm處的水中且允許其遊至平臺。在試驗第二天，在池中心或各四分部的中心之間隨機移動隱藏平臺。將動物釋放至池中，隨機面對牆壁且允許60秒到達平臺(3個試驗)。在第三個試驗中，對動物進行三個試驗，兩個試驗為隱藏平臺且一個為提示平臺。NSP後兩天，允許動物經受最終行為試驗(Morris水迷宮測試)。針對這些試驗(每隻動物3次)，將平臺置於池之一個四分部中心，且以隨機方式面向牆壁釋放動物。使動物找到平臺或遊泳60秒(潛伏時間，動物找到平臺的時間)。在給藥4-6小時內測試所有動物且由對測試群組盲向的操作員隨才幾選擇以進4亍測試。結果表示為平均值士標準差(SD)。使用t檢驗法分析澱粉狀蛋白與行為研究差異的顯著性。比較6個月大APP對照組與經TTP-4000處理的動物以及9個月大APP媒劑處理組與經TTP-4000處理的動物。認為在0.05以下的差異為顯著的。通過對各組中數據求和且除以對照來確定澱粉狀蛋白及行為的變化°/。(即1i.P./6個月大對照=變化％)。圖15A及15B展示經TTP-4000或小鼠sRAGE處理3個月的小鼠具有比媒劑及陰性對照人類IgGl(IgGl)處理的動物更少的A3斑及更輕的認知功能障礙。該數據表明TTP-4000有效減少轉基因小鼠模型中AD病理。還發現，類似於sRAGE，TTP-4000可減少炎症細胞因子IL-1及TNF-a(數據未展示)。C.TTP-4000在中風動物模型中的功效還在中風的疾病相關動物模型中比較TTP-4000與sRAGE。在該模型中，結紮小鼠的中部頸動脈歷時1小時接著再灌注23小時，在此刻處死小鼠且評估腦中梗塞面積。在即將再灌注前用sRAGE或TTPMOOO或對照免疫球蛋白處理小鼠。在這些實驗中，將媒劑(以每隻小鼠250nl)或TTP測試物(TTP-3000、TTP-4000，以每隻小鼠250pl)注射給雄性C57BL/6。在缺血開始後l小時，經腹膜內注射小鼠。使小鼠經受l小時腦缺血接著24小時再灌注。為誘導缺血，麻醉每隻小鼠且通過外部加溫使體溫保持在36。C至37。C下。經由頸部的中部切口暴露左頸總動脈(CCA)。將顯微外科夾置放在頸內動脈(ICA)的起端周圍。用真絲結紮ECA的遠端且橫切。將6-0真絲鬆散地系在ECA殘端周圍。將尼龍縫線的火焰磨光末端輕輕插入ECA殘端中。在殘端周圍拉緊6-0真絲圏且使尼龍縫線進入且穿過頸內動脈(ICA)，直至其停留在大腦前動脈中，從而閉塞前面交通及大腦中動脈。當尼龍縫線在適當位置歷時1小時後，將動物再次麻醉，記錄直腸溫度且移除縫線和縫合切口。通過腹膜內注射戊巴比妥鈉(50mg/kg)將動物麻醉且接著移除大腦來測定梗塞體積。接著將大腦切成4個經由梗塞區的2mm切片且置於2y。氯化三苯基四氮唑(TTC)中30分鐘。接著將切片置於4%低聚甲醛中過夜。用計算機輔助影像分析系統(由裝備有QuickCaptureframegrabbercard的PowerMacintosh計算機、安裝在相機支架上的HitachiCCD相機組成)測定各切片中梗塞面積。使用NIH影像分析軟體v.1.55。捕捉影像且測定出切片的梗塞總面積。對處理狀況盲向的單個操作員進行所有測量。對切片的梗塞體積求和計算出總梗塞體積。結果表示為平均值土標準差(SD)。使用t檢驗法分析梗塞體積數據差異的顯著性。如由表2中數據所說明，在限制這些動物的梗塞面積方面TTP-4000比sRAGE有效，這表明TTP-4000由於其在血漿中更佳的半衰期而能在這些小鼠體內保持更大保護。實施例6:通過ELISA檢測RAGE融合蛋白最初經由過夜溫育將50|iLRAGE特異性單克隆抗體1HB1011以在IXPBSpH7.3中10jug/ml的濃度塗布於板上。當準備使用時，將板用300nL1X咪唑-Tween洗滌緩衝劑洗滌三次且用1。/。BSA封閉。以100uL最終體積添加樣品(經稀釋)及已知TTP-4000稀釋液的標準稀釋液。將樣品在室溫下溫育1小時。溫育後，將板洗滌3次。添加在具有1%BSA的IXPBS中的山羊抗人類IgGl1(SigmaA3312)AP結合物且在室溫下溫育1小時。將板洗滌3次。顏色用對硝基苯基磷酸酯來說明。實施例7:RAGE配體結合RAGE融合蛋白的定量圖16展示TTP-4000與各種已知的固定的RAGE配體的飽和結合曲線。配體固定於微量滴定板上且在從0漸增至360nM的RAGE融合蛋白存在下溫育。使用結合特異性針對融合嵌合體的IgG部分的鹼性磷酸酶的多克隆抗體來檢測RAGE融合蛋白-配體相互作用。使用GraphpadPrizm軟體計算相對Kd且與已建立的RAGE-RAGE配體值的文獻值匹配。HMGlB-兩性蛋白，CML-羧甲基賴氨酸，A^-澱粉狀蛋白P1-40。實施例8:使用RAGE融合蛋白防止同種異體移植排斥反應可預期RAGE阻滯阻斷同種異體移植排斥反應。如通過被移植動物血糖水平保持低於目標濃度的時間長度所測量，這些實驗探究使用本發明的RAGE融合蛋白阻滯配體-RAGE相互作用是否削弱從健康供體移植至糖尿病動物的胰島細胞的排斥反應。如本文所論述，發現將RAGE融合蛋白(例如TTP-4000)施用給已接受胰島細胞移植物的糖尿病動物顯著延遲高血糖症的復發及因此移植的胰島細胞在兩個移植(同種異體及同源)動物模型中的排斥反應。A.小鼠中同種異體胰島移植第一組實驗測試RAGE融合蛋白(TTP-4000)的施用是否調節糖尿病C57BL/6J(B6)小鼠模型中移植的胰島細胞的同種異體排斥反應及糖尿病的復發。糖尿病動物模型通過以200mg/kg單次靜脈內注射鏈脲佐菌素(STZ)(SigmaChemicalCo.，St.Louis,MO)使C57BL/6J(6-8周大)(B6)小鼠患糖尿病。將BALB/cJ(6-8周大)(BALB)小鼠用作胰島移植的供體，因此提供用於胰島移植的同種異體錯配。胰島分離用鹽酸氯胺酮/鹽酸甲苯噻喚(xylazineHC1)溶液(Sigma，St.LouisMO)麻醉小鼠(BALB/c)。管內注射3ml含有1.5mg/ml膠原酶P(RocheDiagnostics,Branchburg,NJ)的冷漢克斯平衡鹽溶液(HBSS，Gibco，GrandIslandNY)後，經外科手術獲得胰腺且在37C下消化20min。用HBSS洗滌胰島且通過^f吏用具有四個不同密度(26%、23%、20°/。及11%)的聚蔗糖400(Cellgro，HerndonVA)的間斷梯度離心來純化。收集在20%與23°/。層的界面處的組織片段，洗滌且再懸浮於HBSS中。在倒置顯微鏡下手選無連接腺泡、血管及管道組織的單獨胰島，產生用於移植的高純度胰島。胰島移植在診斷出糖尿病2天內鏈脲佐菌素誘導的糖尿病C57BL/6(B6)小鼠接受胰島移植物。將BALB/cJ(6-8周大)(BALB)小鼠用作供體以進行同種異體胰島移植。為了移植，用灌輸裝置從供體小鼠揀取500-600個新分離的胰島(即約550個胰島等價物)且將其移植至受體右腎的包膜下(subcapular)空間。用測試化合物治療胰島移植的同時施用測試化合物；給藥視對照動物進展而定持續約60天。根據以下方案(表3)用0.25ml磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)、PBS中的TTP-4000或PBS中的IgG注射小鼠。95表3施用測試化合物和/或媒劑tableseeoriginaldocumentpage96胰島移植物功能的監測胰島移植後前2周每天連續測量血糖，接著此後每兩天測量來監測胰島移植物功能。糖尿病的逆轉定義為兩次連續測量的血糖水平少於200mg/dl。當兩次連續測量的血糖超過250mg/dl時確定移才直物損失。結果展示於表4中。表4tableseeoriginaldocumentpage96tableseeoriginaldocumentpage97*表4中的值反映如通過增加的血糖水平的復發所定義的各動物的移植物損失的天數。施用TTP-4000對BALB/c胰島在B6小鼠體內的同種異體移植排斥反應的影響如圖17中Kaplan-Meier累積存活曲線所示。可見與未經處理(對照)或經媒劑(PBS)或(人類IgGl)處理的動物對比，在檢測到用TTP-4000(組1及3)處理的動物移植物衰竭前時間增加。使用多種統計學分析(Mantel-CoxLogrank、Breslow-Gehan-Wilcoxon、Tarone-Ware、Peto-Peto-Wilcoxin及Harrington-Fleming)，對照與TTP-4000(組1及3)之間的差異顯著(表5)。表5tableseeoriginaldocumentpage97*自由度B.作為自身免疫疾病模型的NOD小鼠體內胰島移植第二批實驗測試施用RAGE融合蛋白(即TTP-400G或TTP-3000)是否調控NOD小鼠(使用同源NOD移植模型)體內糖尿病復發過程。糖尿病動物模型自發性自身免疫非肥胖糖尿病小鼠(膽/LtJ)(12-25周大)用作胰島細胞的受體，而年幼糖尿病前期N0D/LtJ小鼠(6-7周大)用作同源胰島移植的供體。如上文部分A(同種異體胰島移植)中所述分離用於移植的胰島。胰島移植糖尿病N0D/LtJ小鼠在診斷出糖尿病2天內接受胰島移植物。用灌輸裝置從供體小鼠揀取500-600個新分離的胰島(約550個胰島等價物)且將其移植至右腎的包膜下空間。用測試化合物治療在胰島移植同時施用測試化合物且持續約8周。根據以下方案(表6)用0.25mlPBS、PBS中TTP-4000或PBS中TTP-3000注射小鼠。表6tableseeoriginaldocumentpage98胰島移植物功能的監測胰島移植後通過在前2周每天連續測量血糖，隨後每兩天測量來監測胰島移植物功能。糖尿病的逆轉定義為兩次連續測量的血糖少於200mg/dl。當兩次連續測量的血糖超過25Qmg/dl時測定移植物損失%。結果展示於表7中。表7TTP-4000及TTP-3000對NOD小鼠體內同源胰島移植物的糖尿病復發的影響*TTP-4000TTP-3000對照300|agLD+100(jgqodip300mg+100HgQodip(組1)(組2)3544233846254042264341223634224532244430213820222124平均值39.87538.4285722.727273SD3.7583246.320791,8488326n8711*數值反映如通過增加的血糖水平的復發所定義的各動物移植物損失的天數。施用TTP-4000對糖尿病NOD小鼠體內同源移植胰島排斥反應的影響如圖18中Kaplan-Meier累積存活曲線所示。如表7的數據所示，與未經處理(對照)的動物相比，在檢測到用TTP-4000(組l)及TTP-3000(組2)處理的動物的移植物衰竭前時間增加。圖18展示在檢測到用TTP-4000(組l)處理的動物及未經處理的動物的移植物衰竭前時間的增加。使用多種統計學分析(Mantel-CoxLogrank、Breslow-Gehan-Wilcoxon、Tarone-Ware、Peto-Peto-Wilcoxin及Harrington-Fleming)，對照與TTP-4000(組1)以及對照與TTP-3000(組2)之間的差異顯著(表8)。99表8tableseeoriginaldocumentpage100*自由度實施例9-RAGE融合蛋白凍幹製劑在使用RAGE融合蛋白TTP-4000研製凍幹製劑中，最初通過測量凍千及重構後蛋白穩定性來篩選凍幹保護劑及緩衝劑。各製劑中凍幹蛋白還經受加速穩定性研究以測定蛋白在其保存期的潛在穩定性。在最初篩選研究中，設計實驗以評估可提供被調配為冷凍塊體的TTP-4000的適當溶解性及穩定性且提供具有約50mg/ml或50mg/ml以上的RAGE融合蛋白濃度的重構製劑的調配條件。測試含有乙酸鈉、檸檬酸鈉、磷酸鈉、琥珀酸鈉、組氨酸及氯化鈉以及蔗糖及甘露糖醇的製劑。還評估介於5.5與7.0之間的各種pH值。使用尺寸排阻層析法(SEC)、SDS-Page、傅立葉轉換紅外光譜學(FTIR)、圓二色性(CD)、肽圖及紫外光-可見光吸光率(UV-Vis)評估TTP-4000的生物物理及化學穩定性。基於含有檸檬酸鈉、組氨酸、蔗糖、甘露糖醇及Tween8Q之一或多者的製劑中RAGE融合蛋白在7.0或7.0以下的pH值下的穩定性，選擇含有這些緩衝劑、凍幹保護劑或表面活性劑之一或多者的製劑以供進一步研究。實施例10-RAGE融合蛋白凍幹製劑基於實施例9中所收集的信息，研究TTP-4000的額外製劑。研究集中於鑑別用於保持經由冷凍乾燥過程穩定的產物且在重構後潛在達到高濃度TTP-4000(即約50mg/ml或50mg/ml以上)的緩衝劑和/或凍幹保護劑。在2周加速穩定性研究期間研究六個製劑。這些製劑概述於表9中。研究還集中於發展用於如下所述的更大劑量的TTP-4000(250mg)的冷凍乾燥循環。冷凍乾燥後，製劑研製樣品小瓶起褶且置於40C腔室中歷時2周。在2。C至8。C下儲存按比例增加的研製樣品直至進行測試。樣品分析方法通過UV-Vis光謙法測量樣品中TTP-4000濃度。AglientUV-Vis用於獲得蛋白質光譜以及緩衝劑空白光鐠。獲得後，針對作為任何蛋白質聚集的結果可能發生的任何光散射校正吸光率值。使用KarlFisher滴定方法分析殘餘水分。用適當量的WFI重構冷凍乾燥製劑研製樣品。認為重構時間為從水添加的時間至無可見固體的時間。重構後使用適當校準的半微探針測量各樣品的pH值。使用TSKgelSuperSW2000柱來進行尺寸排阻層析法(SEC)以分析或監測冷凍乾燥及在加速條件下儲存期間TTP-4000的物理穩定性(降解及可溶聚集體形成)。將樣品注射至適配有兩個TSKgelS叩erSW2000,4.6x300mm,4ym柱(TosohBioscience,18674)的Aglient1100系列LC中。為測量微粒數，將1mL樣品20倍稀釋成20mL。通過超聲處理約3G秒使樣品脫氣，且通過不產生氣泡的手動旋渦輕輕攪拌樣品。將三個等分試樣(體積各為5mL)抽至不透光度計數感應器中。將儀器設置成積分模式，在大於或等於10ym及大於或等於25jam的設置下收集微粒。結果基於實施例9中的預調配研究，最初研究兩個緩衝劑檸檬酸鈉及L-組氨酸。使用離心濃縮機製備濃縮製劑1-6(表9)。表9中製劑1-6的最終蛋白濃度在約4-15mg/ml之間的範圍內。表9TTP-4000的調配tableseeoriginaldocumentpage102使用表9中製劑1-6，使用具有O.7mL填充體積的小瓶(2mL)。小瓶頂部空間充滿空氣。在乾燥前，在-5(TC至-20'C之間的保存溫度下冷凍樣品約12小時。將樣品在lOOmTorr的減壓及-20'C與-10r之間的保存溫度下乾燥約36小時，接著在20。C的保存溫度下乾燥約12小時。冷凍千燥後，塞住小瓶且頂部變硬。自各製劑l-6產生粗糙餅塊。使冷凍乾燥產物經受加速穩定性研究以獲得製劑的化學穩定性。將冷凍乾燥產物置於40'C及75%相對溼度下儲存2周。用0.206mLWFI重構冷凍乾燥產物。所有冷凍乾燥產物均在20秒或少於20秒內重構。所有重構製劑中pH值在整個2周的儲存期保持一致。在0及2周時刻測定的冷凍乾燥產物的殘餘水分值介於3.0%與0.8%之間且展示冷凍乾燥循環能夠充分乾燥預凍幹的製劑。所有重構製劑的滲透壓度均在250mOsm/kg與400mOsm/kg之間的所要等滲範圍內(參見表IO)。各重構製劑的黏度在3.7cP(釐泊)以下。表IO.TTP-4000的重構製劑及滲透壓度tableseeoriginaldocumentpage102對在冷凍乾燥過程的各步驟下採用的表10中製劑5的樣品進行SEC分析且基於一致低水平的聚集體及分解物質表明在這些製劑中TTP-4000不對冷凍乾燥過程的任一步尤其靈敏。還對冷凍乾燥前預凍幹製劑以及零時刻和2周加速穩定性研究後的重構製劑進行SEC分析。雜質(聚集體或分解產物)量一致為低的(即低於4%)(表ll)。表ll.TTP-4000的重構製劑及完整蛋白質％tableseeoriginaldocumentpage103肽圖說明TTP-400G未因為冷凍乾燥及在加速條件下儲存而氧化或脫醯胺。對製劑1、3、4及6進行SDS-PAGE且展示這些製劑中TTP-4000在整個冷凍乾燥及儲存過程中保持物理穩定性。為擴大冷凍乾燥過程以與50mLlyo小瓶及250mg劑量的TTP-4000—起4吏用，通過4吏用超過濾將溶液濃縮成15mg/mLTTP-4000且接著經由在pH6.0下逆著10mM組氨酸及65mM蔗糖透析過濾(diafilter)溶液來製備樣品。添加Tween80至0.01°/。的最終量(體積比)。將預凍幹製劑(16.67mL)添加至各50mL小瓶中。將樣品暴露於冷凍乾燥循環，其中樣品在5。C與-5。C之間的保存溫度下冷卻30min，接著在-50。C的保存溫度下冷卻約3小時。在100mTorr的減壓及-20。C與-1(TC之間的保存溫度下乾燥約34小時接著在5X:與20C之間的保存溫度下乾燥約11小時來乾燥樣品。冷凍乾燥後，塞住小瓶且頂部變硬。產生藥學上優良的白色餅塊。餅塊外觀粗糙且在處理及儲存期間未失去其結構。如通過在280nm下的吸光率所測定的，重構樣品的濃度為40.5mg/mL的TTP-4000。在類似條件下的額外研究中，重構樣品中TTP-4000的濃度一致為約50mg/mL。在室溫下儲存0、2及6個小時，測量重構樣品的微粒含量。表12中結果展示重構樣品具有低量的微粒含量。表12儲存期間重構樣品中所檢測的微粒數粒徑時間=0時間=2h時間=6h每毫升微粒>10/am562368948〉25)im81620每個容器的微粒>10|Jm275318034645>25pm397898總之，在含有蔗糖、甘露糖醇及Tween80之一或多者的檸檬酸及組氨酸緩衝劑中調配TTP-4000。測試展示含有檸檬酸鈉或組氨酸的製劑具有類似工作特徵且TTP-4000在含有組氨酸的製劑中更可溶。關注於含有組氨酸的製劑的進一步的擴大研究。冷凍乾燥循環後，評估TTP-400G的化學及物理穩定性且檢測到組氨酸製劑之間無顯著差異。還從製劑中除去甘露糖醇。從製劑研製研究選擇的最終製劑含有約pH6.0的10mM組氨酸、60mM蔗糖及0.01%Tween80。該製劑證實在冷凍乾燥及儲存期間保持TTP-4000穩定的較好能力且還提供研究期間最高濃度的TTP-4000。在擴大研究中，蔗糖水平升至65mM以將製劑的滲透壓度調節至接近等滲性。在擴大研究期間，還發現將TTP-4000預凍幹製劑及重構製劑的pH值保持為pH6.O或pH6.0附近，且小於6.7的pH值為適於減少蛋白沉澱或聚集的pH值。認為上文僅作為本發明的主題的說明。因為本領域技術人員可容易地提出許多修改及變化，所以不欲將本發明限於所示及所述的確切實施方案，且認為所有在隨附權利要求範圍內的適合修改及等價物均在本發明的概念內。附圖簡述參考下列附圖，本發明的各種特徵，方面和優點將更明顯。圖1展示本發明替代實施方案的各種RAGE序列及免疫球蛋白序列圖A，SEQIDNO:1，人類RAGE的胺基酸序列；及SEQIDNO:2，無胺基酸1-22的信號序列的人類RAGE的胺基酸序列；圖B，SEQIDNO:3，無胺基酸1-23的信號序列的人類RAGE的胺基酸序列；圖C，SEQID104NO:4，人類sRAGE的胺基酸序列；SEQIDNO:5,無胺基酸1-22的信號序列的人類sRAGE的胺基酸序列；及SEQIDNO:6，無胺基酸1-23的信號序列的人類sRAGE的胺基酸序列；圖D，SEQIDNO:7，包含人類RAGE的V結構域的胺基酸序列；SEQIDNO:8，包含人類RAGE的V結構域的另一胺基酸序列；SEQIDNO:9，人類RAGE的V結構域的N末端片段；SEQIDNO:10,人類RAGE的V結構域的另一N末端片段；SEQIDNO:11，人類RAGE的胺基酸124-221的胺基酸序列；SEQIDNO:12，人類RAGE的胺基酸227-317的胺基酸序列；SEQIDNO:13,人類RAGE的胺基酸23-123的胺基酸序列；圖E，SEQIDNO:14，人類RAGE的胺基酸24-123的胺基酸序列；SEQIDNO:15，人類RAGE的胺基酸23-136的胺基酸序列；SEQIDNO:16，人類RAGE的胺基酸24-136的胺基酸序列；SEQIDNO:17，人類RAGE的胺基酸23-226的胺基酸序列；SEQIDNO:18,人類RAGE的胺基酸24-226的胺基酸序列；圖F，SEQIDNO:19，人類RAGE的胺基酸23-251的胺基酸序列；SEQIDNO:20，人類RAGE的胺基酸24-251的胺基酸序列；SEQIDNO:21,RAGE域間連接子；SEQIDNO:22，第二RAGE域間連接子；SEQIDNO:23，第三RAGE域間連接子；SEQIDNO:24，第四RAGE域間連接子；圖G，SEQIDNO:25，編碼人類RAGE胺基酸1-118的DNA;SEQIDNO:26，編碼人類RAGE胺基酸1-123的DNA;及SEQIDNO:27,編碼人類RAGE胺基酸1-136的DNA;圖H，SEQIDNO:28，編碼人類RAGE胺基酸1-230的DNA;及SEQIDNO:29,編碼人類RAGE胺基酸1-251的DNA;圖I，SEQIDNO:38,人類IgG的CH2及Ch3結構域的部分胺基酸序列；SEQIDNO:39,編碼人類IgG的一部分人類CH2及CH3結構域的DNA;SEQIDNO:40,人類IgG的(:2及(:3結構域的胺基酸序列；圖J，SEQIDNO:41，編碼人類IgG的人類CH2及CH3結構域的DNA;SEQIDNO:42，人類IgG的CH2結構域的胺基酸序列；SEQIDNO:43，人類IgG的CH3結構域的胺基酸序列；及SEQIDNO:44，第五RAGE域間連接子；圖K，SEQIDNO:45，無胺基酸1-23的信號序列的人類sRAGE的胺基酸序列，其中N末端的穀氨醯胺殘基環化形成焦穀氨酸；SEQIDNO:46，包含人類sRAGE的V結構域的另一胺基酸序列，其中N末端的穀氨醯胺殘基環化形成焦穀氨酸；SEQIDNO:47,人類RAGE的V結構域的另一N末端片段，其中N末端的穀氨醯胺殘基環化形成焦穀氨酸；SEQIDNO:48,人類RAGE的胺基酸24-123的胺基酸序列，其中N末端的穀氨醯胺殘基環化形成焦穀氨酸；圖L,SEQIDNO:49,人類RAGE的胺基酸24-136的胺基酸序列，其中N末端的穀氨醯胺殘基環化形成焦穀氨酸；SEQIDNO:50，人類RAGE的胺基酸24-226的胺基酸序列，其中N末端的穀氨醯胺殘基環化形成焦穀氨酸；SEQIDNO:51，人類RAGE的胺基酸24-251的胺基酸序列，其中N末端的穀氨醯胺殘基環化形成焦穀氨酸；圖M，SEQIDNO:52，編碼SEQIDNO:38中人類IgG的人類CH2及CH3結構域的部分的另一DNA序列；及SEQIDNO:53，編碼SEQIDNO:40中人類IgG的人類CH2及Ch3結構域的另一DNA序列。圖2展示根據本發明的一個實施方案編碼第一RAGE融合蛋白(TTP-4000)編碼區的其它DNA序列SEQIDNO:30(圖A)及SEQIDNO:54(圖B)。以粗體突出的編碼序列1-753編碼RAGEN末端蛋白序列，而序列754-1386編碼無鉸鏈區的人類IgGFc(yl)蛋白序列。圖3展示根據本發明的一個實施方案編碼第二RAGE融合蛋白(TTP-3000)編碼區的其它DNA序列SEQIDNO:31(圖A)及SEQIDNO:55(圖B)。以粗體突出的編碼序列1-408編碼RAGEN末端蛋白序列，而序列409-1041編碼無鉸鏈區的人類IgGFc(yl)蛋白序列。圖4展示根據本發明的替代實施方案各編碼四域RAGE融合蛋白的胺基酸序列SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34及SEQIDNO:56。RAGE序列以粗體字體突出。圖5展示根據本發明的替代實施方案各編碼三域RAGE融合蛋白的胺基酸序列SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37及SEQIDNO:57。RAGE序列以粗體字體突出。圖6圖A展示根據本發明的替代實施方案人類RAGE及人類IgY-1Fc蛋白中蛋白域的比較及用於製備TTP-3000(在位置136處)及TTP-4000(在位置251處)的切除位點；及圖B展示根據本發明的替代實施方案TTP-3000及TTP-4000的域結構。圖7展示根據本發明的一個實施方案sRAGE及第一RAGE融合蛋白TTP-4000(TT4)及第二RAGE融合蛋白TTP-3000(TT3)結合RAGE配體澱粉狀蛋白P(A3)、S100b(S100)及兩性蛋白(Ampho)的體外結合試驗的結果。圖8展示根據本發明的一個實施方案與僅包括免疫檢測試劑("單獨的複合物")的陰性對照相比第一RAGE融合蛋白TTP-4000(TT4)("蛋白質")結合澱粉狀蛋白P的體外結合試驗及該結合通過RAGE拮抗劑("RAGE配體")的拮抗作用的結果。圖9展示根據本發明的一個實施方案與僅包括免疫檢測試劑("單獨的複合物")的陰性對照相比第二RAGE融合蛋白TTP-3000(TT3)("蛋白質")結合澱粉狀蛋白P的體外試驗及該結合通過RAGE拮抗劑("RAGE配體")的拮抗作用的結杲。圖10展示根據本發明的一個實施方案測量RAGE融合蛋白TTP-3000(TT3)及TTP-4000(TT4)及sRAGE對S100b-RAGE"i秀導TNF-a產生的抑制作用的基於細胞的試驗的結果。圖11展示根據本發明的一個實施方案測量RAGE融合蛋白TTP-4000及抗RAGE抗體對HMGB1-RAGEi秀導TNF-a產生的抑制作用的基於細胞的試驗的結果。圖12展示根據本發明的一個實施方案RAGE融合蛋白TTP-4000的藥代動力學概況，其中各曲線表示在相同實驗條件下的不同動物。圖13展示根據本發明的一個實施方案由於RAGE融合蛋白TTP-4000刺激及人類IgG刺激而從THP-l細胞釋放的作為炎症反應的量度的TNF-cc相對水平。圖14展示根據本發明的替代實施方案RAGE融合蛋白TTP-4000減少糖尿病動物再狹窄的用途，其中圖A展示與陰性對照(IgG)相比TTP-4000RAGE融合蛋白減少內膜/介質比率；且圖B展示TTP-4000RAGE融合蛋白以劑量反應方式減少血管平滑肌細胞增殖。圖15展示根據本發明的替代實施方案RAGE融合蛋白TTP-4000能障礙的用途，其中圖A展示TTP-4000RAGE融合蛋白減少腦中澱粉狀蛋白負荷，且圖B展示TTP-4000RAGE融合蛋白改善認知功能。圖16展示根據本發明的一個實施方案TTP-4000與各種被固定的已知的RAGE配體的飽和結合曲線。圖17展示根據本發明的替代實施方案RAGE融合蛋白TTP-4000減少同種異體胰島細胞移植物的排斥反應的用途，其中空心(未填充)圓圏表示未經治療的對照動物；具有對角陰影的圓圏表示經第一劑量TTP-4000治療的動物；具有波浪陰影的圓圏表示經第二劑量TTP-4000治療的動物；經菱形填充的圓圏表示經對照PBS治療的動物；且實心圓圏表示經對照IgG治療的動物。圖18展示根據本發明的替代實施方案RAGE融合蛋白TTP-4000減少同源胰島細胞移植物的排斥反應的用途，其中空心(未填充)圓圏表示未經治療的對照動物；且實心圓圏表示經TTP-4000治療的動物。權利要求1.一種RAGE融合蛋白，其包含如SEQIDNO56或SEQIDNO57中所述的胺基酸序列或與其至少90％一致的序列。2.如權利要求1的RAGE融合蛋白，其中與SEQIDNO:56或SEQIDNO:57至少90%—致的序列包含無C末端賴氨酸的SEQIDNO:56或SEQIDNO:57的序列。3.—種分離的DNA分子，其編碼如權利要求1的RAGE融合蛋白。4.如權利要求3的分離的DNA分子，其中該DNA包含如SEQIDNO:54或SEQIDN0:55中所述的序列或與其至少90%—致的序列。5.—種表達載體，其編碼如權利要求1的RAGE融合蛋白。6.—種細胞，其被權利要求5的表達載體轉染，使得該細胞表達包含如SEQIDNO:56或SEQIDNO:57中所述的胺基酸序列或與其至少90%—致的序列的RAGE融合蛋白。7.如權利要求6的細胞，其中與SEQIDNO:56或SEQIDNO:57至少90%—致的序列包含無C末端賴氨酸的SEQIDNO:56或SEQIDNO:57的序列。8.—種製劑，其包含凍幹保護劑、RAGE融合蛋白與緩衝劑的凍幹混合物。9.如權利要求8的製劑，其中所述凍幹保護劑包含非還原性糖。10，如權利要求9的製劑，其中所述非還原性糖包含蔗糖、甘露糖醇或海藻糖的至少一種。11.如權利要求8的製劑，其中所述緩衝劑包含組氨酸。12.如權利要求8的製劑，其中所述RAGE融合蛋白包含RAGE多肽，所述RAGE多肽直接連接於包含免疫球蛋白的CH2結構域或免疫球蛋白的CH2結構域的部分的多肽。13.如權利要求12的製劑，其中所述RAGE多肽包含連接於RAGE免疫球蛋白域的RAGE域間連接子，以便所述RAGE免疫球蛋白域的C末端胺基酸連接於所述域間連接子的N末端胺基酸，且所述RAGE域間連接子的C末端胺基酸直接連接於包含免疫球蛋白的CH2結構域或其部分的多肽的N末端胺基酸。14.如權利要求12的製劑，其中所述RAGE融合蛋白包含連接於第二RAGE免疫球蛋白域及第二RAGE域間連接子的第一RAGE免疫球蛋白域及第一RAGE域間連接子，以便所述第一域間連接子的N末端胺基酸連接於所述第一RAGE免疫球蛋白域的C末端胺基酸，所述第二RAGE免疫球蛋白域的N末端胺基酸連接於所述第一域間連接子的C末端胺基酸，所述第二域間連接子的N末端胺基酸連接於所述第二RAGE免疫球蛋白域的C末端胺基酸，且所述RAGE第二域間連接子的C末端氨基的N末端胺基酸，15.如權利要求12的製劑，其中所述RAGE多肽包含RAGE配體結合位點，所述RAGE配體結合位點包含如SEQIDNO:10中所述的胺基酸序列或與其至少90°/。一致的序列，或如SEQIDNO:47中所述的胺基酸序列或與其至少90%—致的序列。16.如權利要求8的製劑，其中所述RAGE融合蛋白包含如SEQIDNO:32、33、34、35、36、37、56或57的至少一個中所述的胺基酸序列或與其至少90°/。一致的序列。17.如權利要求16的製劑，其中與SEQIDNO:32、33、34、35、36、37、56或57至少90%—致的序列包含無C末端賴氨酸的SEQIDNO:32、33、34、35、36、37、56或57的多肽。18.如權利要求8的製劑，其進一步包含表面活性劑、螯合劑或膨化劑的至少一種。19.一種重構製劑，其包含在稀釋劑中重構的凍幹RAGE融合蛋白，其中所述重構製劑中RAGE融合蛋白濃度在約1mg/mL至約400mg/mL的範圍內。20.如權利要求19的重構製劑，其中所述RAGE融合蛋白包含RAGE多肽，所述RAGE多肽直接連接於包含免疫球蛋白的CH2結構域或免疫球蛋白的CH2結構域的部分的多肽。21.如權利要求20的重構製劑，其中所述RAGE多肽包含連接於RAGE免疫球蛋白域的RAGE域間連接子，以便所述RAGE免疫球蛋白域的C末端胺基酸連接於所述域間連接子的N末端胺基酸，且所述RAGE域間連接子的C末端胺基酸直接連接於包含免疫球蛋白的CH2結構域或其部分的多肽的N末端胺基酸。22.如權利要求20的重構製劑，其中所述RAGE融合蛋白包含連接於第二RAGE免疫球蛋白域及第二RAGE域間連接子的第一RAGE免疫球蛋白域及第一RAGE域間連接子，以便所述第一域間連接子的N末端胺基酸連接於所述第一RAGE免疫球蛋白域的C末端胺基酸，所述第二RAGE免疫球蛋白域的N末端胺基酸連接於所述第一域間連接子的C末端胺基酸，所述第二域間連接子的N末端胺基酸連接於所述第二RAGE免疫球蛋白域的C末端胺基酸，且所述RAGE第二域間連接子的C末端胺基酸直接連接於所述CH2免疫球蛋白域或免疫球蛋白的CH2結構域的部分的N末端胺基酸。23.如權利要求20的重構製劑，其中所述RAGE多肽包含RAGE配體結合位點，所述RAGE配體結合位點包含如SEQIDNO:1G中所述的胺基酸序列或與其至少90%—致的序列，或如SEQIDNO:47中所述的胺基酸序列或與其至少90%—致的序列。24.如權利要求19的重構製劑，其中所述RAGE融合蛋白包含如SEQIDNo:32、33、34、35、36、37、56或57的至少一個中所述的胺基酸序列或與其至少90%—致的序列。25.如權利要求24的重構製劑，其中與SEQIDNo:32、33、34、35、36、37、56或57至少90%—致的序列包含無C末端賴氨酸的SEQIDNO:32、33、34、35、36、37、56或57的多肽。26.如權利要求19的重構製劑，其中所述稀釋劑包含用於注射的水(WFI)。27.如權利要求19的重構製劑，其中所述重構製劑適於皮下或肌肉內給藥。28.如權利要求19的重構製劑，其中所迷重構製劑是等滲的。29.如權利要求19的重構製劑，其中所述製劑包含約1-400mg/mL的包含如SEQIDNO:32、33、34、35、36、37、56或57中所述的序列或與其至少90%—致的序列的RAGE融合蛋白、約1mM至約lOOmM組氨酸緩沖劑、約60mM至約65mM蔗糖、約0.001%至約0.05%Tween80及約6.0至6.5的pH值。30.如權利要求19的重構製劑，其中所述製劑包含約40-50mg/mL的包含如SEQIDNO:32、33、34、35、36、37、56或57中所述的序列或與其至少90%—致的序列的RAGE融合蛋白、約lOmM組氨酸、約65mM蔗糖、約0.01%Tween80及約6.0的pH值。31.如權利要求19的重構製劑，其中所述製劑在40'C下1周後展示少於5%的分解。32.如權利要求19的重構製劑，其中重構後少於約10%的所述RAGE融合蛋白以聚集體形式存在於所述製劑中。33.如權利要求19的重構製劑，其中所述RAGE融合蛋白的凍幹製劑包含凍幹保護劑。34.如權利要求33的重構製劑，其中所述凍幹保護劑包含非還原性糖。35.如權利要求34的重構製劑，其中所述非還原性糖包含蔗糖、甘露糖醇或海藻糖的至少一種。36.如權利要求19的重構製劑，其中所述RAGE融合蛋白的凍幹製劑包含緩衝劑、表面活性劑、螯合劑或膨化劑的至少一種。37.—種製品，其包含保存凍幹RAGE融合蛋白的容器及用稀釋劑重構所述凍幹製劑的說明。38.如權利要求37的製品，其中所述RAGE融合蛋白包含RAGE多肽，所述RAGE多肽直接連接於包含免疫球蛋白的CH2結構域或免疫球蛋白的CH2結構域的部分的多肽。39.如權利要求38的製品，其中所述RAGE多肽包含連接於RAGE免疫球蛋白域的RAGE域間連接子，以便所述RAGE免疫球蛋白域的C接子的C末端胺基酸直接連接於包含免疫球蛋白的CH2結構域或其部分的多肽的N末端胺基酸。40.如權利要求38的製品，其中所述RAGE融合蛋白包含連接於第二RAGE免疫球蛋白域及第二RAGE域間連接子的第一RAGE免疫球蛋白域及第一RAGE域間連接子，以便所述第一域間連接子的N末端胺基酸連接於所述第一RAGE免疫球蛋白域的C末端胺基酸，所述第二RAGE免疫球蛋白域的N末端胺基酸連接於所述第一域間連接子的C末端胺基酸，所述第二域間連接子的N末端胺基酸連接於所述笫二RAGE免疫球蛋白域的C末端胺基酸，且所述RAGE第二域間連接子的C末端氨基的N末端胺基酸。41.如權利要求38的製品，其中所述RAGE多肽包含RAGE配體結合位點，所述RAGE配體結合位點包含如SEQIDNO:10中所述的胺基酸序列或與其至少90%—致的序列，或如SEQIDNO:47中所述的胺基酸序列或與其至少90%—致的序列。42.如權利要求37的製品，其中所述RAGE融合蛋白包含如SEQIDNO:32、33、34、35、36、37、56或57的至少一個中所述的胺基酸序列或與其至少90%—致的序列。43.如權利要求42的製品，其中與SEQIDNO:32、33、34、35、36、37、56或57至少90%—致的序列包含無C末端賴氨酸的SEQIDNO:32、33、34、35、36、37、56或57的多肽。44.如權利要求37的製品，其中所述稀釋劑包含用於注射的水(WFI)。45.如權利要求37的製品，其中所述重構製劑適於皮下或肌肉內給藥。46.如權利要求37的製品，其中所述重構製劑是等滲的。47.如權利要求37的製品，其中根據所述說明重構後，所述製劑包含約1-400mg/mL的包含如SEQIDNO:32、33、34、35、36、`37、56或57中所述的序列或與其至少90°/。一致的序列的RAGE融合蛋白、約1mM至約100mM組氨酸緩衝劑、約60mM至約65mM庶糖、約0.001%至約0.05%Tween80及約6.0至6.5的pH值。48.如權利要求37的製品，其中重構後所述製劑包含約40-50mg/mL的包含如SEQIDNO:32、33、34、56、35、36、37、56或57中所述的序列或與其至少90%—致的序列的RAGE融合蛋白、約10mM組氨酸、約65mM蔗糖、約O.01%Tween80及約6.0的pH值。49.如權利要求37的製品，其中所述說明用於重構所述凍幹製劑，以便所述重構製劑中RAGE融合蛋白濃度在約40mg/mL至約100mg/mL的範圍內。50.如權利要求37的製品，其中所述凍千製劑是無菌的。51.如權利要求37的製品，其進一步包含保存用於重構所述凍幹製劑的稀釋劑的第二容器，其中所述稀釋劑為用於注射的水(WFI)。52.如權利要求37的製品，其中根據所述說明重構後，所述製劑在^'C下1周後展示少於5%的分解。53.如權利要求37的製品，其中重構後少於約10。/。的所述RAGE融合蛋白以聚集體形式存在於所述製劑中。54.如權利要求37的製品，其中所述凍幹RAGE融合蛋白包含凍幹保護劑。55.如權利要求54的製品，其中所述凍幹保護劑包含非還原性糖。56.如權利要求54的製品，其中所述非還原性糖包含蔗糖、甘露糖醇或海藻糖的至少一種。57.如權利要求37的製品，其中所述凍幹RAGE融合蛋白包含緩衝劑、表面活性劑、螯合劑或膨化劑的至少一種。58.—種製備RAGE融合蛋白的穩定重構製劑的方法，其包含在稀釋劑中重構所述RAGE融合蛋白與凍幹保護劑的凍幹混合物以便所述重構製劑中RAGE融合蛋白濃度在約1mg/mL至約400mg/mL的範圍內。59.如權利要求58的方法，其中所述RAGE融合蛋白包含RAGE多肽，所述RAGE多肽直接連接於包含免疫球蛋白的CH2結構域或免疫球蛋白的CH2結構域的部分的多肽。60.如權利要求58的方法，其中所述凍幹保護劑包含非還原性糖。61.如權利要求58的方法，其中所述凍幹保護劑包含蔗糖、甘露糖醇或海藻糖的至少一種。62.如權利要求58的方法，其中所述凍幹混合物進一步包含緩衝劑、表面活性劑、螯合劑或膨化劑的至少一種。63.如權利要求58的方法，其中所述RAGE融合蛋白包含如SEQIDNO:32、33、34、35、36、37、56或57的至少一個中所述的胺基酸序列或與其至少90%—致的序列。64.如權利要求63的方法，其中與SEQIDNO:32、33、34、35、36、37、56或57至少90%—致的序列包含無C末端賴氨酸的SEQIDNO:32、33、34、35、36、37、56或57的多肽。65.如權利要求58的方法，其中所述重構製劑包含約40-100mg/mL的包含如SEQIDN0:32、33、34、35、36、37、56或57中所述的序列的RAGE融合蛋白、約2mM至約60mM組氨酸、約60mM至約65mM蔗糖、約0.001°/。至約0.05%Tween80及約6.0至6.5的pH值。66.如權利要求58的方法，其進一步包含通過凍幹包含RAGE融合蛋白與凍幹保護量的凍幹保護劑的混合物來製備所述凍幹RAGE融合蛋白。67.—種治療受試者的RAGE介導的病症的方法，其包括向受試者施用治療有效量的包含RAGE融合蛋白、凍幹保護劑及緩沖劑的重構製劑。68.如權利要求67的方法，其中所述凍幹保護劑包含非還原性糖。69.如權利要求68的方法，其中所述非還原性糖包含蔗糖、甘露糖醇或海藻糖。70.如權利要求67的方法，其中所述緩衝劑包含組氨酸。71.如權利要求67的方法，其中所述RAGE融合蛋白包含RAGE多肽，所述RAGE多肽直接連接於包含免疫球蛋白的CH2結構域或免疫球蛋白的CH2結構域的部分的多肽。72.如權利要求71的方法，其中所述RAGE多肽包含連接於RAGE免疫球蛋白域的RAGE域間連接子，以便所述RAGE免疫球蛋白域的C末端胺基酸連接於所述域間連接子的N末端胺基酸，且所述RAGE域間連接子的C末端胺基酸直接連接於包含免疫球蛋白的CH2結構域或其部分的多肽的N末端胺基酸。73.如權利要求71的方法，其中所述RAGE融合蛋白包含連接於第二RAGE免疫球蛋白域及第二RAGE域間連接子的第一RAGE免疫球蛋白域及第一RAGE域間連接子，以便所述第一域間連接子的N末端胺基酸連接於所述第一RAGE免疫球蛋白域的C末端胺基酸，所述第二RAGE免疫球蛋白域的N末端胺基酸連接於所述第一域間連接子的C末端胺基酸，所述第二域間連接子的N末端胺基酸連接於所述第二RAGE免疫球蛋白域的C末端胺基酸，且所述RAGE第二域間連接子的C末端氨基的N末端胺基酸。74.如權利要求71的方法，其中所述RAGE多肽包含如SEQIDNO:10中所述的胺基酸序列或與其至少90%—致的序列，或如SEQIDNO:47中所述的胺基酸序列或與其至少90%—致的序列。75.如權利要求67的方法，其中所述RAGE融合蛋白包含如SEQIDNO:32、33、34、35、36、37、56或57的至少一個中所述的胺基酸序列或與其至少90%—致的序列。76.如權利要求75的方法，其中與SEQIDNO:32、33、34、35、36、37、56或57至少90%—致的序列包含無C末端賴氨酸的SEQIDNO:32、33、34、35、36、37、56或57的多肽。77.如權利要求67的方法，其中所述RAGE融合蛋白製劑進一步包含表面活性劑、螯合劑或膨化劑的至少一種。78.如權利要求67的方法，其中所述RAGE融合蛋白製劑在40X:下1周後展示少於5%的分解。79.如權利要求67的方法，其中少於約10°/。的所述RAGE融合蛋白以聚集體形式存在於所述RAGE融合蛋白製劑中。80.如權利要求67的方法，其包括對所述受試者的所述RAGE融合蛋白製劑的靜脈內、腹膜內或皮下施用中的至少一種。81.如權利要求67的方法，其中所述重構RAGE融合蛋白製劑包含約40-100mg/mL的包含如SEQIDNO:32、33、34、35、36、37、56或57中所述的序列的RAGE融合蛋白、約2mM至約50mM組氨酸、約60mM至約65mM篇糖、約0.001°/。至約0.05%Tween80及約6.0至6.5的pH值。82.如權利要求67的方法，其中所述重構RAGE融合蛋白製劑包含約40-50mg/mL的包含如SEQIDNO:32、33、34、35、36、37、56或57中所述的序列的RAGE融合蛋白、約10mM組氨酸、約65mM庶糖、約0.01%Tween80及約6.0的pH值。83.如權利要求67的方法，其中所述重構RAGE融合蛋白製劑用於治療糖尿病症狀或糖尿病晚期併發症的症狀。84.如權利要求83的方法，其中糖尿病或糖尿病晚期併發症的症狀包含糖尿病性腎病、糖尿病性#見網膜病、糖尿病性足部潰瘍、心血管併發症或糖尿病性神經病變的至少一種。85.如權利要求67的方法，其中所述重構RAGE融合蛋白製劑用於治療澱粉狀蛋白病、阿茲海默氏病、癌症、腎衰竭或與自身免疫相關的炎症、炎性腸病、類風溼性關節炎、牛皮瓣、多發性硬化症、缺氧、中風、心臟病發作、失血性休克、膿毒病、器官移植或傷口癒合不良的至少一種。86.如權利要求67的方法，其中所述重構RAGE融合蛋白製劑用於治療骨質疏鬆症。87.如權利要求86的方法，其中所述方法包括增加受試者骨密度或減緩受試者骨密度下降的速率。88.如權利要求85的方法，其中所述自身免疫包含皮膚細胞、胰腺細胞、神經細胞、肌肉細胞、內皮細胞、心臟細胞、肝細胞、腎細胞、心臟、骨髓細胞、骨、血細胞、動脈細胞、靜脈細胞、軟骨細胞、甲狀腺細胞或幹細胞的至少一種的排斥反應。89.如權利要求67的方法，其中所述重構RAGE融合蛋白製劑用於治療腎衰竭。90.如權利要求67的方法，其中所述重構RAGE融合蛋白製劑用於治療與器官、組織或多個細胞的至少一種從第一位點移植至第二位點相關的炎症和/或排斥反應。91.如權利要求90的方法，其中所述第一位點及所述第二位點在不同受試者體內。92.如權利要求90的方法，其中所述第一位點及所述第二位點在同一受試者體內。93.如權利要求90的方法，其中所述移植的細胞、組織或器官包含胰腺、皮膚、肝、腎、心臟、骨髓、血液、骨、肌肉、動脈、靜脈、軟骨、曱狀腺、神經系統的細胞、組織或器官，或者幹細胞。全文摘要本發明公開包含連接於第二非RAGE多肽的RAGE多肽序列的RAGE融合蛋白。RAGE融合蛋白可利用包含RAGE配體結合位點及直接連接於免疫球蛋白CH2結構域的N末端的域間連接子的RAGE多肽域。本發明還公開RAGE融合蛋白製劑及RAGE融合蛋白及RAGE融合蛋白製劑用作RAGE介導的病變的治療劑的用途。文檔編號C12N15/13GK101548012SQ200780018207公開日2009年9月30日申請日期2007年4月25日優先權日2006年5月5日發明者A·M·M·米賈裡,E·J·班傑明,J·C·韋伯斯特,R·羅思萊因,Y·E·田申請人:轉化技術製藥公司