人黑色素瘤細胞相關的長非編碼rna的rna幹擾靶點rna及用途的製作方法

2023-05-02 22:45:21

專利名稱：人黑色素瘤細胞相關的長非編碼rna的rna幹擾靶點rna及用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物醫學專業領域，涉及屬於人源IncRNA的一種新型IncRNA、其RNA 幹擾(RNA interference, RNAi)靶點序列和短髮夾 RNA (short-hairpin RNA, shRNA)序列、 shRNA編碼的小分子幹擾RNA (small interference RNA, si RNA)、編碼shRNA的正義及反義 鏈DNA、編碼shRNA的真核重組質粒、以及在製備診斷黑色素瘤疾病試劑及製備治療黑色素 瘤疾病藥物中的用途。
背景技術：
人體中編碼蛋白質的基因大約有2-3萬個，僅佔人類基因組的2%，其餘98%不 編碼蛋白質的基因組DNA最初被認為是沒有功能的，是生物體中的垃圾，通常被稱為「垃圾 DNA」(junk DNA)。但目前的研究表明，這些垃圾DNA大多可轉錄產生非編碼RNA (non-coding RNA, ncRNA)。根據成熟轉錄本大小的不同，ncRNA可分為小分子ncRNA(如siRNA、mi RNA, pi RNA 等)，中等長度 ncRNA (70-200nt)和長 ncRNA (long ncRNA, IncRNA,彡 200nt)。目前， ncRNA領域研究較多的是小分子ncRNA，而對IncRNA的研究還處於起步階段。由於序列內 部存在過多的終止密碼子，IncRNA不能被翻譯成蛋白質，他們通常是以RNA轉錄本的形式 行使其生物學功能，如發育過程中的細胞分化、細胞增殖、細胞凋亡和類固醇代謝等，越來 越多的證據表明IncRNA在細胞中起著調控基因表達的重要作用。最近的研究發現IncRNA 與細胞的癌變有著極為密切的聯繫，起腫瘤抑制基因作用的IncRNA表達下降或者缺失會 導致腫瘤的發生，已經發現IncRNA與肺癌、非霍傑金淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤和慢性淋巴 細胞白血病等腫瘤疾病有關。這些研究結果都表明IncRNA在細胞增殖、分化和癌變中發揮 著重要的作用，腫瘤相關IncRNA的發現可能會對腫瘤的診斷及基因治療產生重大的影響。 通過大範圍分析腫瘤和正常組織的IncRNA，可以鑑定與腫瘤特異相關的IncRNA，使其成為 潛在的病理診斷標記。通過引入針對具有癌基因特性的IncRNA的shRNA可以有效地表達 特異性的siRNA並抑制IncRNA作用的發揮，比其他的治療手段的毒副作用會更低。相反， 通過病毒載體或質粒載體過表達具有腫瘤抑制基因作用的IncRNA，進而抑制其調控的特定 靶基因的表達，也可以達到抑制腫瘤生長的效果。因此，發現腫瘤特異性表達的IncRNA對 基於IncRNA的腫瘤診斷和治療具有十分重要的意義。

發明內容
惡性黑色素瘤是一種產生黑色素的高度惡性腫瘤。惡性黑色素瘤多發於歐美白 種人，發病率佔全部惡性腫瘤的_3%，但呈明顯上升趨勢，針對惡性黑色素瘤的診斷和 治療的生物分子的發現具有重要的應用價值。本發明的目的是提供一種人黑色素瘤細胞 相關相關的長非編碼 RNA (long non-coding RNA, IncRNA)-lncRNA_HN3、其 RNA 幹擾(RNA interference, RNAi)靶點 RNA 和短髮夾 RNA (short-hairpin RNA, shRNA)、shRNA 編碼的小 分子幹擾RNA (small interference RNA, siRNA)、編碼shRNA的正義及反義鏈DNA及轉錄shRNA的重組質粒；本發明的再一目的是提供所述人黑色素瘤細胞相關的IncRNA及shRNA、 siRNA和轉錄shRNA的重組質粒的用途。本發明以人惡性黑色素瘤細胞yusac為材料進行與PSF蛋白結合的IncRNA分子 的篩選、克隆及分析。採用分子生物學常規技術，從yusac細胞分離獲得總RNA，逆轉錄得到 總cDNA並構建yusac細胞的總cDNA文庫；通過原核表達及親和純化得到帶組氨酸標籤的 His-PSF融合蛋白；用T7RNA聚合酶將cDNA文庫中的cDNA插入片段體外轉錄為RNA混合 體；通過組氨酸標籤將His-PSF融合蛋白固定於鈷離子親和層析柱上，並將RNA混合體反覆 過柱，使能夠與PSF蛋白結合的RNA吸附於樹脂上；將RNA從樹脂上洗脫後，經逆轉錄構建 cDNA子文庫，文庫中富集了編碼與PSF蛋白結合的RNA的克隆。挑選文庫中的克隆測序，獲 得基因片段的核酸序列。經過序列分析，我們共得到了數十條RNA分子。經Blast比對及生 物信息學分析，發現一條長236nt的IncRNA序列，其編碼序列位於HN基因的3』端轉錄非 編碼區(Untranslated Regions，UTR)，命名為 lncRNA_HN3。此 IncRNA 序列通過 RT-PCR 及 測序的方法獲得證實，並構建了這條IncRNA的質粒表達載體。針對獲得的IncRNA序列，找 到了 RNAi的靶點序列，構建了表達shRNA序列的質粒載體，當其被導入哺乳動物細胞後可 轉錄產生shRNA，shRNA分子在細胞內通過酶加工後形成成熟的並發揮RNAi功能的siRNA。 最後，對此IncRNA序列及對應的shRNA序列對人黑色素瘤細胞的惡性生長的影響進行了分 析。本發明所提供的IncRNA序列克隆自人惡性黑色素瘤細胞yusac，定量PCR檢測結 果表明此IncRNA在惡性黑色素瘤組織中高表達，而在癌旁組織中低表達。構建lncRNA-HN3 的質粒表達載體，並轉染人黑色素瘤細胞yusac，結果表明lncRNA-HN3在黑色素瘤細胞中 的過表達能明顯刺激黑色素瘤細胞的惡性生長。構建lncRNA-HN3的shRNA質粒表達載體， 並轉染人黑色素瘤細胞yusac，結果表明在黑色素瘤細胞中表達lncRNA-HN3對應的shRNA 能明顯降解細胞內源性lncRNA-HN3並抑制黑色素瘤細胞的惡性生長。基於上述工作本發 明得以完成。具體地說，本發明所提供了一種人黑色素瘤細胞相關的長非編碼 RNA(lncRNA-HN3)，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 1所示，或與序列表中SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列具有90%以上同源性，或為序列表中SEQ IDN0 1所示核苷酸序列經硫 代修飾或/和甲氧基修飾得到的核苷酸序列。基於上述人黑色素瘤細胞相關的長非編碼RNA，本發明提供的lncRNA-HN3的RNA 幹擾(RNAi)靶點，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO :2所示，或與序列表中SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列90%以上同源性，或為序列表中SEQ ID NO :2所示核苷酸序列經硫代 修飾或/和甲氧基修飾得到的序列核苷酸。基於上述lncRNA-HN3RNA幹擾(RNAi)靶點，本發明提供的RNAi的短髮夾 RNA (shRNA)，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO :3所示，或與序列表中SEQ ID NO :3所示 的核苷酸序列90%以上同源性，或為序列表中SEQ IDN0 :3所示核苷酸序列經硫代修飾或/ 和甲氧基修飾得到的序列核苷酸。本發明提供的人黑色素瘤細胞相關的的長非編碼RNA的RNA幹擾靶點的小分子幹 擾RNA(siRNA)，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO :4所示，或與序列表中SEQ ID NO 4 所示的核苷酸序列90%以上同源性，或為序列表中SEQ ID NO :4所示核苷酸序列經硫代修飾或/和甲氧基修飾得到的序列核苷酸。對於上述短髮夾RNA (shRNA)的編碼正義鏈DNA和反義鏈DNA，所述正義鏈DNA其 核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 5所示，或與序列表中SEQIDN0 5所示的核苷酸序列 90%以上同源性，或為序列表中SEQ ID NO :5所示核苷酸序列經硫代修飾得到的序列核苷 酸；所述反義鏈DNA其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO :6所示，或與序列表中SEQ ID NO: 6所示的核苷酸序列90%以上同源性，或為序列表中SEQ ID NO 6所示核苷酸序列經硫代 修飾得到的序列核苷酸。本發明所述轉錄短髮夾RNA的真核重組質粒，由編碼人黑色素瘤細胞相關的長非 編碼RNA的RNA幹擾靶點的shRNA的正義鏈DNA和反義鏈DNA退火後形成的雙鏈DNA片段 與真核表達載體構建而成。本發明所提供的人源lnCRNA-lnCRNA-HN3的編碼DNA序列定位於人線粒體基因組 2710-2945位核苷酸。本發明提供的IncRNA序列，IncRNA的RNAi靶點序列，IncRNA的RNAi靶點的shRNA 序列，RNAi靶點shRNA編碼的siRNA序列，及編碼shRNA的DNA序列既可通過生物學方法 獲得，又可通過化學合成方法獲得，若通過化學合成方法製備，只要將其核苷酸序列提供給 有關專業公司，委託其合成即可。為增強其穩定性、生物利用度、組織靶向性等藥學特徵，可 對其進行硫代修飾或甲氧基修飾等。本發明提供的人黑色素瘤細胞相關的長非編碼RNA(lncRNA-HN3)，包括與其90% 以上同源的核苷酸序列，或經硫代修飾或/和甲氧基修飾得到的核苷酸序列，可用於製備 診斷黑色素瘤疾病的試劑，並且，其RNAi靶點、RNAi靶點shRNA序列及其表達載體、RNAi 靶點shRNA編碼的siRNA可用於製備治療黑色素瘤疾病的藥物。例如以其單獨或混合形式 為有效組分配製成非腸道給藥製劑，依據給藥模式、受者年齡、體重、疾病程度等以適量劑 量給藥；也可以採用基因治療的方法，以質粒或腺病毒為表達載體，使其在癌變部位高效表 達。


圖1是定量PCR檢測本發明所述lncRNA-HN3在人惡性黑色素瘤組織及癌旁組織 中表達的結果圖。圖2是對單克隆黑色素瘤細胞株yuSaC-lnCRNA-HN3和轉入空真核表達載體 pcDNA-3. 1的對照細胞株yuSac-pcDNA3. 1進行軟瓊脂集落生長檢測的結果圖。圖3是將單克隆黑色素瘤細胞株yuSaC-lnCRNA-HN3和轉入空真核表達載體 pcDNA-3. 1的對照細胞株yuSac-pcDNA3. 1注入裸鼠後的實驗結果圖，圖中，1-1和1-2為第 1隻裸鼠的移植瘤，2-1、2-2為第2隻裸鼠的移植瘤，3-1、3-2為為第3隻裸鼠的移植瘤。圖4是本發明所述lncRNA-HN3在對照細胞株yusac-shLUC和穩定低表達細胞株 yusac-shHN3中的表達情況圖，圖中，1泳道為lncRNA_HN3在對照細胞株yusac-shLUC中的 表達，2泳道為lncRNA-HN3在穩定細胞株yusac_shHN3中的表達。圖5是對穩定細胞株yusaC-shHN3和對照細胞株yusac-shLUC進行軟瓊脂集落生 長檢測的結果圖。圖6是將穩定細胞株yusaC-shHN3和對照細胞株yusac-shLUC注入裸鼠後的實驗結果圖，圖中，1-1和1-2為各實驗組中第1隻裸鼠的移植瘤，2-1,2-2為各實驗組中第2隻 裸鼠的移植瘤，3-1、3-2為各實驗組中第3隻裸鼠的移植瘤。
具體實施例方式以下結合實施例對本發明作進一步說明。下屬實施例中，凡未註明具體實驗條件 的，均為按照本領域技術人員熟知的常規條件，例如Sambrook等著的分子克隆實驗室手 冊(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press，1989)，Freshney 著的動物細胞培 養基本技術指南第五版(John ffiley&Sons, Inc,2005)中所述的條件及實驗步驟，或按照 製造廠商所建議的條件及實驗步驟。實施例1 :lncRNA_HN3的克隆與分析1、試劑Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；匪LV逆轉錄酶、DNA聚合酶、pfu酶、Nde I酶、Xho I酶、RNase抑制劑均購自立陶宛Fermentas公司；T7RNA聚合酶購自美國NEB公 司；隨機引物購自美國Promega公司；TAL0N金屬離子樹脂購自美國BD Clontech公司；PCR 引物由Invitrogen公司合成。2、菌株、細胞株和載體人惡性黑色素瘤細胞yusac購自美國標準菌種收藏所(ATCC) ；E. coli BL2菌株購 自天津天有利科技有限公司；PCR-blunt-TOPO載體購自美國Invitrogen公司；pET_28a(+) 載體購自德國Novagen公司。3、實驗方法3. 1人惡性黑色素瘤細胞yusac總cDNA文庫的構建3. 1. 1 yusac 細胞總 RNA 的提取1)人惡性黑色素瘤細胞yusac培養至75%匯合度，加入lmL Trizol試劑，用槍頭 吹打混勻；2)用5mL 1次性注射器吹打10次進行勻漿，將勻漿樣品在室溫孵育5min ；3)加0. 2mL氯仿，蓋緊Ep管蓋，用手振蕩15s並於室溫孵育2-3min ；4)41，12，000\8離心15111土11;5)將水相層轉移到1乾淨的1. 5mLEp管中，加入0. 5mL異丙醇及20 y g糖原，顛倒 混勻，將混勻後的樣品於室溫孵育lOmin ；6)4°C，12，000Xg離心lOmin。倒掉上清液，用75%的乙醇lmL洗滌RNA沉澱1-2 次，旋渦振蕩混合樣品後，4°C，7，500 X g離心5min ；
7)倒掉乙醇，常溫乾燥RNA沉澱lOmin，加入50 y L無RNA酶的H20，並於55°C孵 育5min，以使RNA充分溶解，於260nm測定RNA濃度。3. 1. 2 逆轉錄(RT)在500 ii L EP管中加入以下組分yusac 細胞 RNA 10 u L隨機引物(10u mol/L) 1 u LH20 18 U L混勻後70°C溫育5min，迅速置冰浴中，靜置3min後加樣如下
RNase 抑制劑 1 ii LdNTP (1 Ommo 1/L) 1 u L5 X逆轉錄酶緩衝液8 ii LMMLV 逆轉錄酶 1 ii L混勻後42°C溫育lh，70°C lOmin滅活逆轉錄酶，_20°C保存樣品。3. 1. 3yusac細胞總cDNA文庫的構建將本實施例3. 1. 2所得單鏈cDNA經DNA聚合酶及pfu酶處理得到平末端雙 鏈cDNA(操作步驟見DNA聚合酶、pfu酶操作手冊)。所得平末端雙鏈cDNA連接到 PCR-blunt-TOPO載體上，構建yusac細胞總cDNA文庫。3. 2帶組氨酸標籤His-PSF融合蛋白的原核表達及親和純化3. 2. 1多聚酶鏈式反應(PCR)擴增PSF基因的編碼序列(Coding Sequence, CDS)反應體系為PCR 緩衝液(10X)5u LMgCl2 (2. 5m mo 1/L) 2. 5 u LdNTP(2. 5m mo 1/L) 1. Ou L上遊引物(10iimol/L)0.5ii L下遊引物(10iimol/L)0.5ii LpcDNA3. 1-PSF (連接位點為 EcoR I 和 EcoRV) 0. 1 u LTaq DNA 聚合酶(5U/ u L)0. 1 u LPfu DNA 聚合酶(5U/ u L)0. 3u LddH20 40 u L礦物油30 ii L反應參數為94°C lmin (預變性)；94 V 30sec (變性)，65 V 30sec (復性)， 72°C 2min (延伸)，所述變性_復性_延伸23個循環；72°C lOmin (終延伸)。引物序列如下上遊引物(FP):5，ATATTACCATATGTCTCGGGATCGGTTCCGG-3，(下劃線標示 Nde I 酶 切位點)下遊引物(RP):5，-GGGCTCGAGCTAAAATCGGGGTTTTTTGTT-3，(下劃線標示 Xho I 酶 切位點)3. 2. 2His-PSF融合蛋白的原核表達載體的構建將PSF的編碼序列通過Nde I和Xho I酶切位點克隆到原核表達載體pET_28a (+) 的多克隆位點區，得到重組質粒pET-28a(+)-PSF(載體多克隆位點區末端自帶組氨酸His 標籤)。3. 2. 3His-PSF融合蛋白的原核表達1)將本實施例3. 2. 2所得重組質粒pET-28a(+)_PSF轉化到E. coli BL21菌株中；2)接種轉化了重組質粒pET-28a(+)_PSF的E. coli BL21單菌落於LB液體培養基 (含50i!g/ml卡那黴素)中，37°C震蕩培養；3)檢測菌液0D6(K1至0. 6-0. 7時加入1. 0mmol/L IPTG，並將溫度調至25°C，誘導培 養過夜。
3. 2. 4His-PSF融合蛋白的親和純化1)離心收集菌體，菌體經 PBS 緩衝液(140mmol/L NaCl,2. 7mmol/L KC1,5mmol/LNa2HP04,1. 8mmol/LKH2P04 及 5mmol/LEDTA，pH7. 2)洗滌後重新懸浮於 20mL PBS (含 0. 5mol/L NaCl, lmmol/L PMSF 及 lmmol/L DTT)；2)冰浴超聲破壁，13，OOOXg離心30min收集上清；3)沉澱以相同步驟重複處理一次，合併兩次上清收集液，得到蛋白粗提液；4)將TAL0N金屬離子親和樹脂(BD Clontech)用平衡-洗滌緩衝液(250mmol/ LNa3P04,1. 5mol/LNaCl, pH7. 0)預平衡；5)加適量蛋白粗提液於預平衡後的TAL0N金屬離子親和樹脂，輕柔搖晃1. 5hrs ；6)加入平衡-洗滌緩衝液(含有lOmmol/L咪唑)洗滌樹脂兩次；7)用平衡-洗滌緩衝液(含有250mmol/L咪唑)洗脫樹脂上結合的His_PSF重組 蛋白；8)洗脫得到的重組蛋白用50倍體積的透析緩衝液(20mM Hepes,20% glycerol, 100mM KC1，0. 2mM EDTA，0. 2mM PMSF，0. 5mM DTT, pH7. 9)在 4°C透析過夜，中途更換透析緩 衝液一次；9)得到的透析產物用液氮速凍，lhrs後長期凍存於-80°C ；3. 3PSF蛋白結合RNA的篩選及編碼PSF結合RNA的cDNA子文庫的構建利用組氨酸標籤將原核重組質粒表達的His-PSF融合蛋白結合於TAL0N金屬離子 樹脂上，用T7RNA聚合酶將yusac細胞總cDNA文庫中的cDNA插入片段體外轉錄為RNA混 合體，RNA混合體通過5次反覆過柱，使能夠與His-PSF蛋白結合的RNA吸附於樹脂上；將 RNA從樹脂上洗脫，逆轉錄合成cDNA，將cDNA連接到PCR-blunt-TOPO載體(Invitrogen) 上構建cDNA子文庫，文庫中富集了編碼與His-PSF蛋白結合的RNA的克隆，挑取陽性克隆 克隆測序。3. 4所獲克隆序列的分析克隆測序獲得序列對人基因組序列(http://WWW. ncbi. nlm. nih. gov/blast)進 行BLAST分析，並找到它們在人染色體上的精確定位(http://genome.ucsc. edu/)。挑選出 彡200bp且位於基因組非蛋白質編碼區的序列。其中獲得一條236nt的IncRNA序列，其序 列如序列表中SEQ ID NO 1所示，定位於線粒體基因組的2710-2945位核苷酸，由HN基因 的3』 UTR編碼，命名為lncRNA-HN3。3. 51ncRNA-HN3 的 RT-PCR 鑑定使用Trizol試劑從人惡性黑色素瘤組織提取總RNA (方法同本實施例3. 1. 1)，按 照常規RT-PCR方法檢測lncRNA-HN3在人惡性黑色素瘤組織中的表達。3. 5. 1RT (方法同本實施例3. 1. 2)獲得黑色素瘤組織cDNA3.5.2PCR反應體系為PCR 緩衝液(10 X) 2. 5 ii LdNTP(2. 5mmol/L) 1. 0u L上遊引物(10u mol/L) 1. 0u L下遊引物(10u mol/L) 1. 0u L
黑色素瘤組織cDNA 0. 3u LDNA 聚合酶(5U/ u L)0. 2u LddH20 19 u L反應參數均為:94°C3min (預變性)；94°C 30sec (變性)，64 °C 30sec (復性)， 72°C 60sec (延伸)，所述變性-復性-延伸30次循環。引物序列如下5' -cacagcaagacgagaagaccc-3『5， -cgctgttatccctagggtaac-3，RT-PCR擴增獲得的序列如序列表中SEQ ID NO 1所示。實施例2 定量PCR檢測lncRNA-HN3在人惡性黑色素瘤組織及癌旁組織中的表達1、試劑、菌株、細胞株和載體採用常規的試劑、菌株、細胞株和載體，均與實施例1相同。QuantiTect SYBR Green PCR 試劑盒購自德國 Qiagen 公司。2、實驗方法2. 1. 1 合成的總 cDNA以人黑色素瘤組織及對應癌旁組織為材料，用Trizol試劑(Invitrogen)分別提 取黑色素瘤組織及對應癌旁組織的總RNA(方法同實施例1中的3. 1. 1)。將黑色素瘤組織 總RNA和對應癌旁組織總RNA各取1 y g，用隨機引物進行逆轉錄反應(方法同實施例1中 的3. 1. 2)獲黑色素瘤組織及對應癌旁組織的總cDNA，合成的黑色素瘤組織及對應癌旁組 織的總cDNA即為定量PCR反應的模板。2. 1. 2 用 QuantiTect SYBR Green PCR 試劑盒進行定量 PCR 反應以本實施例2. 1. 1所得黑色素瘤組織及對應癌旁組織的總cDNA為PCR反應的模 板，設計特異於lncRNA_HN3序列的引物(引物序列為5』 -gcaagacgagaagaccctatg-3』和 5，-agtagttcgctttgactggtga-3，)，用 QuantiTect SYBR Green POU式劑盒進行定量 PCR反應。2. 1.3實驗結果黑色素瘤組織及癌旁組織lncRNA-HN3的表達情況見圖1，圖1中1，3，5，7為對應 的黑色素瘤癌旁組織；2，4，6，8為黑色素瘤組織。從圖1可以看出，lncRNA-HN3在黑色素瘤 組織中高表達而在癌旁組織中低表達。實驗結果表明，lncRNA-HN3在黑色素瘤組織和癌旁 組織中的表達水平存在明顯差異，因而lncRNA-HN3在黑色素瘤的發生發展過程中具有重 要的生物學功能。實施例3 :lncRNA-HN3的過量表達促進黑色素瘤細胞的惡性生長特性1、試劑、菌株、細胞株和載體採用常規的試劑、菌株、細胞株和載體，與實施例1相同。pcDNA-3. 1真核表達載體、lipofectamine 2000轉染試劑、G418抗生素均購自美 國Invitrogen公司；DMEM培養基、胎牛血清均購自美國Gibico公司；硝基藍四唑(nitro blue tetrazolium, NBT)購自美國 Sigma 公司。Perfection 4990平板式掃描儀購自日本Epson公司。BALB/c裸鼠，SPF(Specific Pathogen-free，無特定病原體)級，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。2、實驗方法2. 1穩定高表達lncRNA-HN3的單克隆細胞株的構建2. 1. 1 構建 lncRNA-HN3 的真核重組質粒 pcDNA-lncRNA_HN3將原本克隆於PCR-blunt-TOPO載體上的編碼lncRNA_HN3的DNA序列(由實施例 1的3. 3和3. 4獲得)重新連接到真核表達載體pcDNA-3. 1的Nhe I和Apa I酶切位點，構 建 lncRNA-HN3 的真核重組質粒 pcDNA_lncRNA_HN3。2. 1. 2構建單克隆黑色素瘤細胞株yusac-lncRNA_HN3用含10 %胎牛血清的DMEM培養基將人黑色素瘤細胞yusac培養於5 % C02的37°C 培養箱中。轉染前一天於6孔板中接入IX 106個細胞/孔，用lipofectamindOOO進行轉 染，每孔轉染真核重組質粒pcDNA-lncRNA-HN3 3 u g。細胞轉染24小時後用濃度為700mg/ L的G418連續篩選1-2周，得到穩定轉染的單克隆黑色素瘤細胞株yusac-lncRNA-HN3。同 時以空載體pcDNA-3. 1穩定轉染yusac細胞(見lipofectamine 2000說明書)，得到對照 細胞株 yusac-pcDNA3. 1。2. 1. 3單克隆黑色素瘤細胞株中lncRNA-HN3的表達量檢測以常規半定量RT-PCR檢測各單克隆黑色素瘤細胞株中lncRNA-HN3的表達量，挑 選得到lncRNA-HN3表達量最高的穩定黑色素瘤細胞株yuSac-lncRNA-HN3。並以轉入空真 核表達載體pcDNA-3. 1的黑色素瘤細胞株yuSac-pcDNA3. 1作為對照。50iiL半定量PCR反應體系，其組分為PCR 緩衝液(10X)5ii LMgCl2 (25mM) 5 u LdNTP(2. 5mmol/L) 1. Oil L上遊引物(10iimol/L)0.5ii L下遊引物(10iimol/L)0.5ii L模板(yusac-lncRNA_HN3 或 yusac_pcDNA3. 1 的 cDNA) 2 u LDNA 聚合酶(5U/ u L)0. 4u LddH20 35. 6 u L所有PCR的反應參數為:94°C 3min (預變性)；94°C 30ec (變性)，64°C 30s ec (復 性)，72°C60sec(延伸)，所述變性-復性-延伸Xn cycles.循環次數根據PCR反應的起 跳點確定，一般情況下，每次具體的PCR反應較起跳點多1-2個循環。2. 2軟瓊脂集落生長檢測在6孔板中用lmL含0.6%瓊脂糖、700mg/LG418及10%胎牛血清的DMEM培養 基鋪設下層瓊脂；待下層瓊脂凝固後，將本實施例2. 1. 2構建的單克隆黑色素瘤細胞株 yusac-lncRNA-HN3和轉入空真核表達載體pcDNA-3. 1的黑色素瘤細胞株分別以5X 103個 細胞/孔的數量接入lmL含0. 3%瓊脂糖、700mg/LG418及10%胎牛血清的DMEM培養基， 混勻後鋪設上層瓊脂；待上層瓊脂凝固後，培養於5% C02的37°C培養箱中培養。2周後，加 A 400 u L 1. 25g/L 的硝基藍四唑(nitro blue tetrazolium,NBT)染色液，置於 5%0)2的 37°C培養箱中孵育過夜，透射掃描儀掃描的圖像見圖2。圖2表明，與轉染空真核表達載體pcDNA-3. 1的yusac細胞相比，轉染真核重組質粒pcDNA-lncRNA-HN3的yusac細胞穩定過量表達lncRNA_HN3可以顯著促進黑色素瘤細胞 yusac的集落性生長，增強了 yusac細胞的體外惡性生長特性。2. 3裸鼠移植瘤生長檢測實驗裸鼠為5周齡裸鼠，分成兩組，每組3隻，一組用於注射本實施例2. 1. 2構建 的單克隆黑色素瘤細胞株yusac-lncRNA-HN3，一組用於注射本實施例2. 1. 2構建的轉入空 真核表達載體pcDNA-3. 1的對照黑色素瘤細胞株yuSac-pcDNA3. 1。將單克隆黑色素瘤細胞株yuSaC-lnCRNA-HN3和對照黑色素瘤細胞株 yusac-pcDNA3. 1分別以5X 105個細胞/注射點的劑量對裸鼠進行頸部皮下注射(每隻裸 鼠2個注射點)，待移植瘤長出後，每3天檢測一次大小，移植瘤長出後約一個月，將裸鼠脫 頸椎處死，取出腫瘤，3隻裸鼠移植瘤的照片見圖3。圖3表明，與轉染空真核表達載體pcDNA-3. 1的yusac細胞相比，轉染真核重組質 粒pcDNA-lncRNA-HN3的yusac細胞穩定過量表達lncRNA_HN3可以顯著促進黑色素瘤細胞 yusac的體內成瘤性，增強了 yusac細胞的體內惡性生長特性。實施例4 :lncRNA-HN3特異性shRNA抑制黑色素瘤細胞的惡性生長特性1試劑、菌株、細胞株和載體採用常規的試劑、菌株、細胞株和載體，與實施例1相同。正義鏈DNA和反義鏈DNA模板由美國Invitrogen公司合成；限制性內切酶BamH I 和Hindlll均購自立陶宛Fermentas公司；真核表達載體pGenesil_l購自武漢賽晶公司。2、實驗方法2. llncRNA-HN3特異性RNA幹擾載體的構建將lncRNA-HN3的序列信息提交siRNA網際網路設計工具(www. dharmacon. com)，獲 得可信度最高的RNAi靶點序列(如序列表中SEQ IDN0 :2所示)。根據lnCRNA_HN3的RNAi 靶點序列設計編碼特異性shRNA分子的正義鏈DNA和反義鏈DNA模板(如序列表中SEQ ID NO :5和SEQ ID NO 6所示)，將所述正義鏈DNA和反義鏈DNA退火後形成的雙鏈DNA片段 克隆進RNA幹擾載體pGenesil-1，構建lncRNA_HN3幹擾重組質粒。將構建好的lncRNA_HN3 幹擾重組質粒導入哺乳動物細胞後，能在其中轉錄出shRNA(如序列表中SEQ ID NO 3所 示)，shRNA在動物細胞內被動物細胞固有的Dicer酶進一步切割形成具有RNA幹擾功能的 siRNA (如序列表中SEQ ID NO 4所示)，從而誘導RNA幹擾程序的啟動。正義鏈DNA和反 義鏈DNA模板序列如下1)編碼 lncRNA-HN3RNAi 靶點 shRNA 的正義鏈 DNA 5' - IGATCC丨 acaaRttaccctaRRRataTTCAAGAGATATCCCTAGGGTAACTTGTTTTTTT @ -3'2)編碼 lncRNA-HN3RNAi 靶點 shRNA 的反義鏈 DNA 5 『 - lAGCTTl AAAAAAacaaRttaccctaRRRataTCTCTTGAATATCCCTAGGGTAACTTGT g -3'序列中下劃線部分為靶基因的RNAi靶點序列及相應互補序列；方框部分為限制 性內切酶BamH I和Hindlll的識別位點，用於退火後形成的雙鏈DNA片段克隆進RNA幹擾 載體；中間未標示部分編碼shRNA的莖環(loop)。2. 1. 1正義鏈DNA和反義鏈DNA的退火
11
將編碼lncRNA-HN3RNAi靶點shRNA的正義鏈DNA和反義鏈DNA片段濃度分別調整 為250iiM，退火形成互補雙鏈DNA分子(經退火處理後5，及3，端分別帶有BamH I/HindIII 酶切位點)。退火反應條件如下
shRNA-S 模板(250 u M) 5 u LshRNA-A 模板(250 u M) 5 u L10X 退火緩衝液(lOOmM Tris-HCl, pH7. 5, lOmM EDTA, lMNaCl) 1. 25 u LH20 1. 25u L混勻，石蠟油覆蓋後離心10seC，95°C溫育5min，經1_2小時緩慢降溫至室溫，此時 兩條寡核苷酸精確退火為寡核苷酸雙鏈(濃度為100 yM)；退火後的雙鏈DNA用滅菌水稀 釋100倍，濃度為liiM。2.1.2構建lncRNA_HN3幹擾重組質粒將退火形成的雙鏈DNA片段連接到RNA幹擾載體pGenesil-1的BamH I/HindIII 酶切位點，構建lncRNA-HN3特異性shRNA的真核重組質粒pGenesil-shHN3。連接反應條件 如下pGenesil 載體(約 0. 005 u M) 10 u L雙鏈DNA(liiM)0. 5iiL10 X連接酶緩衝液2 ii LH20 5. 5 U L連接酶2iiL混勻，離心5sec，16°C連接過夜，70°C lOmin滅活連接酶，_20°C保存樣。2. 1. 3構建作為負對照的RNA幹擾重組質粒pGenesil-shLUC構建作為負對照的RNA幹擾重組質粒pGenesil-shLUC的方法同本實施例2. 1. 1 和2. 1. 2。將負對照的RNA幹擾重組質粒pGenesil-shLUC導入哺乳動物細胞後轉錄出螢火 蟲螢光素酶基因luciferase特異的shRNA-shLUC，其編碼DNA序列的正義及反義鏈分別為5 『 - |gatcc| gtagcgcggtgtattatacttcaagagagtataatacaccgcgctactttttt § _3 『5 『 ~ |agctt| aaaaaagtagcgcggtgtattatactctcttgaagtataatacaccgcgctac ^ ~3 『 a2. 2穩定低表達lncRNA-HN3的單克隆細胞株的構建同實施例3中的2. 1. 2所述方法將獲得的真核重組質粒pGeneSil-ShHN3穩定 轉染人黑色素瘤細胞yusac，經G418篩選、半定量RT-PCR檢測後，獲得lnCRNA_HN3表達 量最低、RNAi效果最好的穩定細胞株yusac-shHN3。同時，以負對照的RNA幹擾重組質粒 pGenesil-shLUC轉染yusac細胞，得到對照細胞株yusac-shLUC。lncRNA_HN3在對照細胞 株和穩定低表達細胞株中的表達情況見圖4。圖中(1)為對照細胞株yusac-shLUC，(2)為 穩定細胞株yusac-shHN3。圖4表明，穩定細胞株中lncRNA_HN3的表達量較對照細胞株 明顯降低，說明選用的RNAi靶點序列正確無誤，shRNA誘導的RNAi效果明顯，穩定低表達 lncRNA-HN3的單克隆細胞株構建成功。2. 3軟瓊脂集落生長檢測同實施例3中的2. 2所述方法對穩定細胞株yUSaC-ShHN3進行軟瓊脂集落生長 檢測(細胞接種量為1X104個細胞/孔)。結果見圖5。由圖5可知，轉染真核重組質粒 pGenesil-shHN3降解yusac細胞內源性lncRNA_HN3後，yusac細胞的集落性生長受到了一定程度的抑制，其體外惡性生長特性減弱，而轉染對照重組質粒pGenesil-shLUC對yusac 細胞的體外惡性生長特性沒有影響。這表明lncRNA-HN3特異性的shRNA對黑色素瘤細胞 的生長具有抑制作用，並具有治療黑色素瘤疾病的用途。2. 4裸鼠移植瘤生長檢測同實施例3中的2. 3所述方法對yuSaC-ShHN3細胞株進行裸鼠移植瘤生長檢測 (細胞注射劑量為2X106個細胞/注射點)。結果見圖6。由圖6可知，轉染真核重組質粒 pGenesil-shHN3降解yusac細胞內源性lncRNA_HN3後，yusac細胞的體內成瘤性受到了 一定程度的抑制，其體內惡性生長特性減弱，而轉染對照真核重組質粒PGenesil-shLUC對 yusac細胞的體內惡性生長特性沒有影響。這進一步表明lncRNA-HN3特異性的shRNA對黑 色素瘤的發生發展具有抑制作用，具有治療黑色素瘤相關疾病的用途。
權利要求
一種人黑色素瘤細胞相關的長非編碼RNA的RNA幹擾靶點RNA，其特徵在於幹擾靶點RNA的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO2所示。
2.—種權利要求1所述的人黑色素瘤細胞相關的長非編碼RNA的RNA幹擾靶點RNA的 短髮夾RNA，其特徵在於短髮夾RNA的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 3所示。
3.—種權利要求1所述人黑色素瘤細胞相關的長非編碼RNA的RNA幹擾靶點的小分子 幹擾RNA，其特徵在於小分子幹擾RNA的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 4所示。
4.一種編碼權利要求2所述短髮夾RNA的正義鏈DNA，其特徵在於正義鏈DNA的核苷 酸序列如序列表中SEQ ID NO 5所示。
5.一種編碼權利要求2所述短髮夾RNA的反義鏈DNA，其特徵在於反義鏈DNA的核苷 酸序列如序列表中SEQ ID NO 6所示。
6.一種轉錄權利要求3所述短髮夾RNA的真核重組質粒，其特徵在於含有權利要求4 所述正義鏈DNA和權利要求5所述反義鏈DNA退火後形成的雙鏈DNA片段。
7.權利要求1所述幹擾靶點RNA、權利要求2所述的短髮夾RNA、權利要求3所述的小 分子幹擾RNA、權利要求4所述的正義鏈DNA、權利要求5所述的反義鏈DNA或/和權利要 求6所述的真核重組質粒在製備治療黑色素瘤疾病的藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種人黑色素瘤細胞相關的長非編碼RNA的RNA幹擾靶點RNA及用途，具體提供了人黑色素瘤細胞相關的長非編碼RNA的RNA幹擾靶點RNA(RNA interference，RNAi)，幹擾靶點的短髮夾RNA(short-hairpin RNA，shRNA)、shRNA編碼的小分子幹擾RNA(small interference RNA，siRNA)、編碼shRNA的正義鏈DNA及反義鏈DNA、編碼shRNA的重組質粒，以及它們在製備治療黑色素瘤疾病藥物中的用途。
文檔編號C12N15/11GK101984056SQ20101054405
公開日2011年3月9日 申請日期2009年7月10日 優先權日2009年7月10日
發明者俸婷婷, 宋旭, 張廣豐, 李靈, 連瑩瑩 申請人:四川大學