用於檢測霍亂弧菌或最小弧菌的引物和探針以及使用它們的檢測方法

2023-05-03 08:27:36

專利名稱:用於檢測霍亂弧菌或最小弧菌的引物和探針以及使用它們的檢測方法
技術領域：
本發明涉及在食品檢驗、流行病學環境檢驗、和臨床檢查中用於檢測、鑑定並計算霍亂弧菌(Vibrio cholerae)和最小弧菌(Vibrio mimicus)的方法。
背景技術：
霍亂弧菌在口腔感染後產生霍亂毒素並誘導劇烈的腹瀉和嘔吐。在某些情況下，感染性致病菌可導致感染患者死於極度脫水。人們認為對人類有毒的霍亂弧菌僅是O1霍亂，通過使用抗-O1抗體可使之凝集。人們還將不同於細菌的弧菌分為NAG(O1-不可凝集的)-弧菌其對人類無毒。然而，1995年在印度孟加拉地區，分離出了一種沒有O1抗原的新型霍亂弧菌，它引起的症狀與由傳統霍亂引起的症狀相似，揭示出該新的霍亂弧菌菌株具有被稱作O139的新O-抗原。該菌株被稱作孟加拉菌株且已被揭示出具有與傳統O1霍亂相似的產生霍亂毒素的基因，其產生毒素並誘導霍亂。因此，已經表明除O1霍亂外的弧菌可使人類感染並引起霍亂。事實上，除了O1和O139菌株外，還存在具有霍亂毒素基因的霍亂弧菌菌株。這類菌株可在人類中誘導霍亂。然而，除O1和O139菌株外的霍亂弧菌菌株所致的症狀作為感染性疾病還沒有進行過藥物治療。
在此期間，在霍亂弧菌非-O1菌株中已經很少檢測出非-糖分解菌株。Davis等人已經檢測了所述菌株與霍亂弧菌的DNA同源性，由此顯示所述菌株稍稍不同於霍亂弧菌並將所述菌株命名為最小弧菌。已經報導過最小弧菌是一種與霍亂弧菌密切相關的菌株。特別是，除了糖分解能力(霍亂弧菌是陽性的，最小弧菌是陰性的)外，兩個種類的生化性質非常相似(J.Clin.Microbiol.14，631-639，1981)(非專利文獻1)。已知在最小弧菌中，有些菌株所具有的霍亂毒素基因與霍亂弧菌的相似(Microbiol Immunol 1998，42，823-828)(非專利文獻2)。最小弧菌可因此誘導與霍亂相似的症狀。
此外，在沒有霍亂毒素基因的霍亂弧菌中，已被報導存在的菌株是具有熱穩定性直接溶血素(tdh)基因的菌株(Appl Environ Microbiol52，1218-20，1986)(非專利文獻3)，它是副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)的致病因子；和產生大腸桿菌熱穩定性腸毒素的菌株(J.Clin.Invest.85697-705，1990)(非專利文獻4)。它們可引起腹瀉等。同樣，在最小弧菌中，已經報導過存在具有tdh基因的菌株(FEMSMicrobiol 59319-23，1990)(非專利文獻5)，它可引起腹瀉等，甚至在它不產生任何霍亂毒素時也是如此。
如上所述，對檢測到具有O1或O139(孟加拉)血清型並產生霍亂毒素的霍亂弧菌的情況，按照「Law Concerning Prevention ofInfection of Infectious Diseases and Patients with Infectious Diseases」中詳細說明的情況進行測定。此外，在除O1霍亂和孟加拉霍亂外的霍亂弧菌中，也存在產生霍亂毒素的菌株，它誘導與霍亂相似的症狀。此外，不產生霍亂毒素的菌株不會引起霍亂。然而，這並不意味著它們是非致病性的。這類菌株通過產生除霍亂毒素外的毒素而誘導急性胃腸炎、腹瀉等。因此，需要快速並準確地檢測霍亂弧菌細菌類群。
此外，就最小弧菌而言，存在產生霍亂毒素、引起霍亂的菌株和通過產生除霍亂毒素外的毒素而引起急性胃腸炎、腹瀉等的菌株。因此，還需要快速並準確地檢測最小弧菌細菌類群。
使用生化技術的常規檢測方法需要熟練的技術和大量的努力和時間。為了彌補這種不足，已經嘗試使用基因的準確、快速且便利的方法來檢測或鑑定霍亂弧菌和最小弧菌。
用於檢測編碼引起霍亂的霍亂毒素基因的引物是已知的(J.Biol.Chem.1983，258，13722-13726)(非專利文獻6)。然而，不能通過使用這種引物檢測霍亂弧菌和最小弧菌，因為它們沒有任何霍亂毒素基因，但產生其它毒素。
在此期間，比較霍亂弧菌和最小弧菌的16S rRNA基因的全長核苷酸序列時，在1,456個核苷酸中僅有6個是不同的(Int.J.Syst.Bacteriol.44，416-426，1994)(非專利文獻7)。故而不能很清楚地將兩者區別開來。因此，有報導通過比較霍亂弧菌和最小弧菌的16S-23S rRNA基因間隔區，其表明能由此將它們進行分類並製備出了僅能檢測霍亂弧菌的引物(Appl.Environ.Microbiol.65，2202-2208，1999)(非專利文獻8)。然而，還是存在使用引物時，錯誤地檢測到了最小弧菌的報導(Appl.Environ.Microbiol.67，2360-2364 2001)(非專利文獻9)。
發明概述如上所述，還不能通過現有的基因檢測方法以高度準確性檢測霍亂弧菌和最小弧菌。
在常規基因篩選方法中，普遍都忽略了細菌「種類」是含有遺傳多樣性的群體的事實。被推斷為細菌群體成員的單一細菌菌株的核苷酸序列用作這類群體的共有序列或代表這類群體的序列，在基因的分子進化特徵方面是非常危險的，因為它快速積累中性突變。具體而言，這種使用可引起錯誤鑑定，從而使得所檢測的細菌菌株不能被檢測，這是因為由於引物區的少量突變使得擴增被抑制。且由於引物特異性不足夠高，可能檢測出本來不想檢測的某些密切相關菌株。因此，需要製備用於檢測、鑑定或量化霍亂弧菌和最小弧菌的高性能且特異性的基因擴增引物以及用於特異性檢測、鑑定或量化霍亂弧菌和最小弧菌的基因擴增引物，它們具有已經證實了的特異性背景、較低的錯誤鑑定可能性、和實際應用中足夠的擴增效率和擴增特異性。
為了建立特異性檢測細菌系統發育類群的基因的方法，需要儘可能多地從被檢測的生物類群和與這些類群系統發育接近的生物類群中收集核苷酸序列。此外，特異性檢測所針對的基因應具有足夠獨特的核苷酸序列，這樣才能將其與最密切相關的生物區別開來。為了滿足這些條件，靶基因必須具有足夠快速的進化速度。此外，在高頻水平傳遞基因(例如，副溶血弧菌的毒素基因)的情況下，不能使用獨立於系統發育系外存在的基因。在本發明中被用作靶的、由gyrB基因和rpoD基因編碼的蛋白對於存活是必需的。由於這個原因，這些基因幾乎不會水平傳遞並具有適宜的進化速率，因此它們優選用於細菌系統發育分析(Int.J.Syst.Bacteriol.1998，48，813-819；Int.J.Syst.Bacteriol.1999，49，87-95)。我們已經研究出了一種測定核苷酸序列的便利的方法，包括將gyrB基因和rpoD基因用於PCR直接測序方法(日本專利公開號(Kokai)No.07-213229A(1995)和08-256798A(1996))。此外，我們已經分離出了大量霍亂弧菌。在此期間，關於最小弧菌及通過以16SrRNA序列為基礎分析而報導與該細菌密切相關的那些—鰻弧菌(Listonella anguillarum)、奧氏弧菌(V.ordalii)、雙氮氧弧菌(V.diazotrophicus)、創傷弧菌(V.vulnificus)、納瓦拉弧菌(V.navarrensis)、梅氏弧菌(V.metschnikovii)和辛辛那提弧菌(V.cincinnatiensis)的已知親株(stock strain)(International Journal of Systematic andEvolutionary Microbiology 51，1449-1456(2001))，我們已經分析了表1所列細菌菌株的gyrB和rpoD基因的部分核苷酸序列並以這種序列為基礎進行了分子系統發育分析，由此揭示了系統發育關係。
表1 所用菌株




具體而言，在試驗菌株通過添加了2％NaCl的腦心融合培養基的富集培養後，使用PUREGENE DNA分離試劑盒(Gentra SYSTEMS)提取染色體DNA。使用提取出的DNA作為模板，使用gyrB通用擴增引物UP-1E和AprU，通過PCR擴增長度約為900bp的gyrB基因片段(與大腸桿菌菌株K-12的核苷酸序列第331-1212位或胺基酸序列第111-404位相對應的區)。此外，同樣，使用rpoD通用擴增引物70F-M13和70R-M13，通過PCR擴增長度約為800bp的rpoD基因片段(與大腸桿菌菌株K-12的核苷酸序列第334-1125位及胺基酸序列第112-375位相對應的區)。所得PCR產物經過1％瓊脂凝膠電泳，然後用溴化乙錠染色。在UV輻射下證實擴增產物的存在，然後使用Wizard PCRPreps DNA純化系統(Promega)純化，由此製備用於序列反應的模板。循環序列反應是使用先前加入到通用引物中的引物M13R和M13-21序列和ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing ReadyReaction Kit(PE Applied Biosystems)進行的。使用ABI PRISM 310Genetic Analyzer(PE Applied Biosystems)分析核苷酸序列。在使用測定的核苷酸序列進行分子系統發育分析，從而更準確了解了霍亂弧菌和最小弧菌的密切相關種類之後，連接gyrB和rpoD基因的部分序列，然後進行分析。所得核苷酸序列用Clustal W電腦程式經過多次序列對比分析。隨後，通過使用PHYLIP電腦程式包，通過以遺傳距離為基礎的鄰接方法製備分子系統發育樹，其中遺傳距離是使用Kimura′s 2-參數模型計算的。結果顯示霍亂弧菌和最小弧菌屬於不同於弧菌屬其它細菌單一系統發育系。具體而言，霍亂弧菌和最小弧菌各自形成獨立的單一系統發育類群(
圖1)。因此，為了建立可僅檢測霍亂弧菌和最小弧菌細菌類群的遺傳篩選方法，首先找出了密切相關種類核苷酸序列的差異。即，鑑定在霍亂弧菌和最小弧菌類群內保守但與弧菌屬其它細菌不同的核苷酸位點。具體而言，找出霍亂弧菌和最小弧菌所屬系統發育類群的共有序列並與基於分子系統發育分析結果確定與該系統發育系密切相關的、圖1所示C1-C3聚簇的共有序列進行比較。因此，製備系統發育特異性信息圖(圖2和3)。下列位點對霍亂弧菌和最小弧菌所屬的系統發育系是特異的如圖2所示，就gyrB基因而言，序列表中SEQ ID NO1的第21、96、107、126、153、190、258、270、279、285、357、543、552、557、600、690、702、714、729、733、734、759、771、782、786、792、795、和885位(此後也稱作核苷酸數)；以及如圖3所示，就rpoD基因而言，序列表中SEQ ID NO2的第3、27、66、67、75、90、117、123、141、144、177、178、180、186、223、227、228、231、250、251、255、257、259、264、300、301、302、303、305、313、314、350、351、362、369、373、374、380、390、400、402、409、410、415、416、423、427、433、444、447、504、510、513、543、556、558、618、638、649、663、685、711、747、757、762、763、和789位。使用對含有這些特徵核苷酸的系統發育系特異的序列可設計出具有高度特異性的探針和具有高度特異性和極佳擴增效率的基因擴增引物。例如，可設計含有gyrB和rpoD基因核苷酸序列中的15個或以上連續核苷酸(其含有不同於密切相關種類的核苷酸，從而總含有不同於密切相關種類的核苷酸位點)的引物，優選含有20個或以上核苷酸，且進一步優選含有gyrB和rpoD基因核苷酸序列的20個以上、40個以下的連續核苷酸。同樣，還可設計含有gyrB和rpoD基因核苷酸序列中的15個或以上連續核苷酸(其含有不同於密切相關種類的核苷酸，從而總是含有不同於密切相關種類的核苷酸位點)的探針，優選含有20個或以上核苷酸，且進一步優選含有gyrB和rpoD基因核苷酸序列的20個以上、100個以下的連續核苷酸。此外，為了製備引物和探針，可優選使用高頻含有上述不同核苷酸的區(含有2個或以上這樣的核苷酸)，如就gyrB基因而言，含第96和107位的區，含第258、270、279、或285位中任意2個或多個位點的區域；含第543、552、或557位中任意2個或多個位點的區域；含第690、702、或714位中任意2個或多個位點的區域；和含第729、733、或734位中任意2個或多個位點的區域；含第759和771位的區；含第782、786、792、或795位中任意2個或多個位點的區域；就rpoD基因而言，含第66、67、75、或90位中任意2個或多個位點的區域；含第177、178、180、或186位中任意2個或多個位點的區域；含第223、227、228、或231位中任意2個或多個位點的區域；含第250、251、255、257、259、或264位中任意2個或多個位點的區域；含第300、301、302、303、305、313、或314位中任意2個或多個位點的區域；含第362、369、373、374、或380位中任意2個或多個位點的區域；含第400、402、409、410、415、或416位中任意2個或多個位點的區域；含第423、427、433、444、或447位中任意2個或多個位點的區域；含第504、510、或513位中任意2個或多個位點的區域；含第543、556、或558位中任意2個或多個位點的區域；及含第747、757、762、或763位中任意2個或多個位點的區域。此外，就引物而言，3』-末端優選是對霍亂弧菌和最小弧菌細菌類群特異的核苷酸。本發明包括使用這些引物和探針以及其它試劑用於檢測、定量或鑑定霍亂弧菌和最小弧菌的試劑盒。
在此期間，霍亂弧菌和最小弧菌細菌類群，即，霍亂弧菌細菌類群和最小弧菌細菌類群，進一步形成獨立的單一系統發育類群(圖1)。因此，為了建立可分開檢測霍亂弧菌和最小弧菌細菌類群的遺傳篩選方法，以和上述相似的方式鑑定了在各霍亂弧菌和最小弧菌類群內保守的區，以及它們之中彼此不同的核苷酸位點。具體而言，將霍亂弧菌和最小弧菌所屬的系統發育類群的共有序列彼此進行比較，從而製備系統發育-特異性信息圖(圖4、5、6、和7)。關於霍亂弧菌所屬的單一系統發育類群，下列位點是特異的如圖4所示，就gyrB基因而言，序列表中SEQ ID NO3的第15、36、39、42、45、48、51、90、111、133、226、285、291、306、330、384、390、399、507、708、756、837、867、873、879、882、和885位；如圖5所示，就rpoD基因而言，序列表中SEQ ID NO4的第12、93、96、105、114、115、116、117、126、132、141、156、198、201、216、222、231、240、252、254、255、260、261、264、276、285、291、327、333、342、345、424、426、432、441、445、446、448、450、453、468、489、495、501、519、522、525、540、549、570、585、591、600、603、606、639、645、654、657、666、675、679、680、681、687、702、705、708、714、720、723、729、732、741、750、765、768、795、和804位。關於最小弧菌所屬的系統發育類群，下列位點是特異的如圖6所示，就gyrB基因而言，序列表中SEQ ID NO5的第15、36、39、42、45、48、51、90、111、133、226、285、291、306、330、384、390、399、507、708、756、837、867、873、879、882、和885位；如圖7所示，就rpoD基因而言，序列表中SEQID NO6的第12、93、96、105、114、115、116、117、126、132、141、156、198、201、216、222、231、240、252、254、255、260、261、264、276、285、291、327、333、342、345、424、426、432、441、445、446、448、450、453、468、489、495、501、519、522、525、540、549、570、585、591、600、603、606、639、645、654、657、666、675、679、680、681、687、702、705、708、714、720、723、729、732、741、750、765、768、795、和804位。使用對霍亂弧菌或最小弧菌所屬的系統發育類群特異並含有這些特徵核苷酸的序列可設計出具有高度特異性的探針和具有高度特異性和極佳擴增效率的基因擴增引物。例如，可設計含有gyrB和rpoD基因核苷酸序列中的15個或以上連續核苷酸(含有區別兩個細菌種類的核苷酸，從而總是含有區別霍亂弧菌和最小弧菌的核苷酸位點)的引物，優選含有20個或以上核苷酸，且進一步優選含有gyrB和rpoD基因核苷酸序列的20個以上、40個以下的連續核苷酸。同樣，還可設計含有gyrB和rpoD基因核苷酸序列中的15個或以上連續核苷酸(其含有區別兩個細菌種類的核苷酸，從而總是含有區別霍亂弧菌和最小弧菌的核苷酸位點)的探針，優選含有20個或以上核苷酸，且進一步優選含有gyrB和rpoD基因核苷酸序列的20個以上、100個以下的連續核苷酸。此外，為了製備引物和探針，可優選使用高頻含有上述不同核苷酸的區(含有2個或以上這樣的核苷酸)，如就gyrB基因而言，含第36、39、42、45、48、或51位中任意2個或多個位點的區域；含第285、291、或306位中任意2個或多個位點的區域；含第384、390、或399位中任意2個或多個位點的區域；和含第867、873、879、882、或885位中任意2個或多個位點的區域；就rpoD基因而言，含第93、96、105、114、115、116、或117位中任意2個或多個位點的區域；含第126、132、或141位中任意2個或多個位點的區域；含第216、222、231、或240位中任意2個或多個位點的區域；含第252、254、255、260、261、或264位中任意2個或多個位點的區域；含第276、285、或291位中任意2個或多個位點的區域；含第327、333、342、或345位中任意2個或多個位點的區域；含第424、426、432、441、445、或446位中任意2個或多個位點的區域；含第448、450、453、或468位中任意2個或多個位點的區域；含第489、495、或501位中任意2個或多個位點的區域；含第519、522、525、或540位中任意2個或多個位點的區域；含第585、591、600、603、或606位中任意2個或多個位點的區域；含第639、645、654、或657位中任意2個或多個位點的區域；含第666、675、679、680、681、或687位中任意2個或多個位點的區域；含第702、705、708、714、720、或723位中任意2個或多個位點的區域；及含第729、732、741、或750位中任意2個或多個位點的區域。此外，就引物而言，3』-末端優選是對霍亂弧菌或最小弧菌特異的核苷酸。
具體而言，用於檢測、定量或鑑定霍亂弧菌和最小弧菌細菌類群的引物如下(1)就gyrB基因而言，這種基因擴增引物的例子包括包含SEQ IDNO1第96和107位核苷酸的SEQ ID NO1中15個或以上連續核苷酸的鏈或其互補鏈的基因擴增引物；包含SEQ ID NO1第258、270、279、或285位中的兩個或以上核苷酸的SEQ ID NO1中的15個或以上連續核苷酸的鏈或其互補鏈的基因擴增引物；包含SEQ ID NO1第543、552、或557位中的兩個或以上核苷酸的SEQ ID NO1中的15個或以上連續核苷酸的鏈或其互補鏈的基因擴增引物；包含SEQ ID NO1第690、702、或714位中的兩個或以上核苷酸的SEQ ID NO1中的15個或以上連續核苷酸的鏈或其互補鏈的基因擴增引物；包含SEQ IDNO1第729、733、或734位任何位核苷酸的SEQ ID NO1中15個或以上連續核苷酸的鏈或其互補鏈的基因擴增引物；包含SEQ ID NO1第759和771位上含兩個或以上核苷酸的SEQ ID NO1中的15個或以上連續核苷酸的鏈或其互補鏈的基因擴增引物；和包含SEQ ID NO1第782、786、792、或795位中的兩個或以上核苷酸的SEQ ID NO1中的15個或以上連續核苷酸的鏈或其互補鏈的基因擴增引物。更具體的例子包括下列基因擴增引物，它是5』-tycaywcscaaacttacca-3』或與其互補的鏈、5』-gaaytctggcgtgtcgatcaag-3』或與其互補的鏈、5』-catrtagttgttcaaagtacgg-3』或與其互補的鏈、5』-ggatttyacytccgaagaaacyagc-3』或與其互補的鏈、5』-ygccagcttctcattcatr-3』或與其互補的鏈、5』-cgcttcgcttgggttttcc-3』或與其互補的鏈、或5』-caataatcttcgaacaaacgt-3』或與其互補的鏈、以及所含鏈或其互補鏈包含上述序列的基因擴增引物中的任何一個。
(2)就rpoD基因而言，這種基因擴增引物的例子包括包含SEQ IDNO2的第66、67、75、或90位中的兩個或以上核苷酸的SEQ ID NO2中的15個或以上連續核苷酸的鏈或其互補鏈的基因擴增引物；包含SEQ ID NO2的第177、178、180、或186位中的兩個或以上核苷酸的SEQ ID NO2中的15個或以上連續核苷酸的鏈或其互補鏈的基因擴增引物；包含SEQ ID NO2的第223、227、228、或231位中的兩個或以上核苷酸的SEQ ID NO2中的15個或以上連續核苷酸的鏈或其互補鏈的基因擴增引物；包含SEQ ID NO2的第250、251、255、257、259、或264位中的兩個或以上核苷酸的SEQ ID NO2中的15個或以上連續核苷酸的鏈或其互補鏈的基因擴增引物；包含SEQ ID NO2的第300、301、302、303、305、313、或314位中的兩個或以上核苷酸的SEQ IDNO2中的15個或以上連續核苷酸的鏈或其互補鏈的基因擴增引物；包含SEQ ID NO2的第362、369、373、374、或380位中的兩個或以上核苷酸的SEQ ID NO2中的15個或以上連續核苷酸的鏈或其互補鏈的基因擴增引物；包含SEQ ID NO2的第400、402、409、410、415、或416位中的兩個或以上核苷酸的SEQ ID NO2中的15個或以上連續核苷酸的鏈或其互補鏈的基因擴增引物；包含SEQ ID NO2的第423、427、433、444、或447位中的兩個或以上核苷酸的SEQ ID NO2中的15個或以上連續核苷酸的鏈或其互補鏈的基因擴增引物；包含SEQ IDNO2的第504、510、或513位中的兩個或以上核苷酸的SEQ ID NO2中的15個或以上連續核苷酸的鏈或其互補鏈的基因擴增引物；包含SEQ ID NO2的第543、556、或558位中的兩個或以上核苷酸的SEQ IDNO2中的15個或以上連續核苷酸的鏈或其互補鏈的基因擴增引物；及包含SEQ ID NO2的第747、757、762、或763位中的兩個或以上核苷酸的SEQ ID NO2中的15個或以上連續核苷酸的鏈或其互補鏈的基因擴增引物。更具體的例子包括下列基因擴增引物，它是5』-gattgctgagtatcctggaaccatc-3』或與其互補的鏈、5』-gaycctaacgacatggaaacc-3』或與其互補的鏈、5』-ttcwgarctytctgaagcs-3』或與其互補的鏈、5』-agatgaygmkgtcgysgar-3』或與其互補的鏈、5』-cgacggtgaaagyagcgacag-3』或與其互補的鏈、5』-caatgaactgcgcggyaagtt-3』或與其互補的鏈、5』-gtcacgaccaaattcattaac-3』或與其互補的鏈、5』-gyytgamgcttcagawgcttgrtka-3』或與其互補的鏈、5』-ygargtrcgcagagtttcaacc-3』或與其互補的鏈、5』-catyaccaarcgytcttgg-3』或與其互補的鏈、或5』-cgytcaacagacagtgawgtc-3』或與其互補的鏈、以及所含鏈或其互補鏈包含上述序列的基因擴增引物的任何一個。
霍亂弧菌的引物如下(1)就gyrB而言，這種基因擴增引物的例子包括包含SEQ IDNO3的第36、39、42、45、48、或51位中的兩個或以上核苷酸的SEQID NO3中的15個或以上連續核苷酸的鏈或其互補鏈的基因擴增引物；包含SEQ ID NO3的第285、291、或306位中的兩個或以上核苷酸的SEQ ID NO3中的15個或以上連續核苷酸的鏈或其互補鏈的基因擴增引物；包含SEQ ID NO3的第384、390、或399位中的兩個或以上核苷酸的SEQ ID NO3中的15個或以上連續核苷酸的鏈或其互補鏈的基因擴增引物；包含SEQ ID NO3的第867、873、879、882、或885位中的兩個或以上核苷酸的SEQ ID NO3中的15個或以上連續核苷酸的鏈或其互補鏈的基因擴增引物。更具體的例子包括含5』-ggtggttaacgcgctytct-3』或與其互補的鏈的基因擴增引物、含5』-ycgatgaacgtgaagaagataaa-3』或與其互補的鏈的基因擴增引物、含5』-tgagaaagtcttccacttt-3』或與其互補的鏈的基因擴增引物、含5』-gttaaagtggaagactttc-3』或與其互補的鏈的基因擴增引物、含5』-gggtaagccwgcaagatcc-3』或與其互補的鏈的基因擴增引物以及所含鏈或其互補鏈含有上述序列的基因擴增引物。
(2)就rpoD而言，這種基因擴增引物的例子包括包含SEQ IDNO4的第93、96、105、114、115、116、或117位中的兩個或以上核苷酸的SEQ ID NO4中的15個或以上連續核苷酸的鏈或其互補鏈的基因擴增引物；包含SEQ ID NO4的第126、132、或141位中的兩個或以上核苷酸的SEQ ID NO4中的15個或以上連續核苷酸的鏈或其互補鏈的基因擴增引物；包含SEQ ID NO4的第216、222、231、或240位中的兩個或以上核苷酸的SEQ ID NO4中的15個或以上連續核苷酸的鏈或其互補鏈的基因擴增引物；包含SEQ ID NO4的第252、254、255、260、261、或264位中的兩個或以上核苷酸的SEQ ID NO4中的15個或以上連續核苷酸的鏈或其互補鏈的基因擴增引物；包含SEQ IDNO4的第276、285、或291位中的兩個或以上核苷酸的SEQ ID NO4中的15個或以上連續核苷酸的鏈或其互補鏈的基因擴增引物；包含SEQ ID NO4的第327、333、342、或345位中的兩個或以上核苷酸的SEQ ID NO4中的15個或以上連續核苷酸的鏈或其互補鏈的基因擴增引物；包含SEQ ID NO4的第424、426、432、441、445、或446位中的兩個或以上核苷酸的SEQ ID NO4中的15個或以上連續核苷酸的鏈或其互補鏈的基因擴增引物；包含SEQ ID NO4的第448、450、453、或468位中的兩個或以上核苷酸的SEQ ID NO4中的15個或以上連續核苷酸的鏈或其互補鏈的基因擴增引物；包含SEQ ID NO4的第489、495、或501位中的兩個或以上核苷酸的SEQ ID NO4中的15個或以上連續核苷酸的鏈或其互補鏈的基因擴增引物；包含SEQ ID NO4的第519、522、525、或540位中的兩個或以上核苷酸的SEQ ID NO4中的15個或以上連續核苷酸的鏈或其互補鏈的基因擴增引物；包含SEQ ID NO4的第585、591、600、603、或606位中的兩個或以上核苷酸的SEQ ID NO4中的15個或以上連續核苷酸的鏈或其互補鏈的基因擴增引物；包含SEQ ID NO4的第639、645、654、或657位中的兩個或以上核苷酸的SEQ ID NO4中的15個或以上連續核苷酸的鏈或其互補鏈的基因擴增引物；包含SEQ ID NO4的第679、680、681、687、或702位中的兩個或以上核苷酸的SEQ ID NO4中的15個或以上連續核苷酸的鏈或其互補鏈的基因擴增引物；包含SEQ ID NO4的第705、708、714、720、或723位中的兩個或以上核苷酸的SEQ ID NO4中的15個或以上連續核苷酸的鏈或其互補鏈的基因擴增引物；及包含SEQ ID NO4的第729、732、741、或750位中的兩個或以上核苷酸的SEQ ID NO4中的15個或以上連續核苷酸的鏈或其互補鏈的基因擴增引物。更具體的例子包括含5』-attcttgagcagtttgatcgt-3』或與其互補的鏈的基因擴增引物、含5』-caggccgaagagctacgtctc-3』或與其互補的鏈的基因擴增引物、含5』-tgagctttctgaagcggatctcgcg-3』或與其互補的鏈的基因擴增引物、含5』-gaagatgatgctgtcgtcgaa-3』或與其互補的鏈的基因擴增引物、含5』-gaagatgaagacgaagat-3』或與其互補的鏈的基因擴增引物、含5』-cggtatcgaccctgaactg-3』或與其互補的鏈的基因擴增引物、含5』-catcaagcttctgaagcgtcaga-3』或與其互補的鏈的基因擴增引物、含5』-tcaaccaagtggtcgaattgc-3』或與其互補的鏈的基因擴增引物、含5』-acggaagatatccarcactaa-3』或與其互補的鏈的基因擴增引物、含5』-gcgaacacgatccattgaagtg-3』或與其互補的鏈的基因擴增引物、含5』-gatgaacgatttcttcggcatc-3』或與其互補的鏈的基因擴增引物、含5』-aaggactttatccagccac-3』或與其互補的鏈的基因擴增引物、含5』-ttcttcttgctcacggactttcgc-3』或與其互補的鏈的基因擴增引物、含5』-ttctgaattgaacggcggatc-3』或與其互補的鏈的基因擴增引物、含5』-tgtctcttgctcgatcatttgt-3』或與其互補的鏈的基因擴增引物、以及所含鏈或其互補鏈含有上述序列的基因擴增引物。
最小弧菌的引物如下(1)就gyrB而言，這種基因擴增引物的例子包括包含SEQ IDNO5的第36、39、42、45、48、或51位中的兩個或以上核苷酸的SEQID NO5中的15個或以上連續核苷酸的鏈或其互補鏈的基因擴增引物；包含SEQ ID NO5的第285、291、或306位中的兩個或以上核苷酸的SEQ ID NO5中的15個或以上連續核苷酸的鏈或其互補鏈的基因擴增引物；包含SEQ ID NO5的第384、390、或399位中的兩個或以上核苷酸的SEQ ID NO5中的15個或以上連續核苷酸的鏈或其互補鏈的基因擴增引物；包含SEQ ID NO5的第867、873、879、882、或885位中的兩個或以上核苷酸的SEQ ID NO5中的15個或以上連續核苷酸的鏈或其互補鏈的基因擴增引物。更具體的例子包括含5』-ggtagtgaatgccctgtca-3』或與其互補的鏈的基因擴增引物、含5』-cggatgagcgtgaagaagataag-3』或與其互補的鏈的基因擴增引物、含5』-tgaaaaagtattccacttc-3』或與其互補的鏈的基因擴增引物、含5』-gttgaagtggaatactttt-3』或與其互補的鏈的基因擴增引物、含5』-wggcaaaccagckarrtct-3』或與其互補的鏈的基因擴增引物、以及所含鏈或其互補鏈含有上述序列的基因擴增引物。
(2)就rpoD而言，這種基因擴增引物的例子包括包含SEQ IDNO6的第93、96、105、114、115、116、或117位中的兩個或以上核苷酸的SEQ ID NO6中的15個或以上連續核苷酸的鏈或其互補鏈的基因擴增引物；包含SEQ ID NO6的第126、132、或141位中的兩個或以上核苷酸的SEQ ID NO6中的15個或以上連續核苷酸的鏈或其互補鏈的基因擴增引物；包含SEQ ID NO6的第216、222、231、或240位中的兩個或以上核苷酸的SEQ ID NO6中的15個或以上連續核苷酸的鏈或其互補鏈的基因擴增引物；包含SEQ ID NO6的第252、254、255、260、261、或264位中的兩個或以上核苷酸的SEQ ID NO6中的15個或以上連續核苷酸的鏈或其互補鏈的基因擴增引物；包含SEQ IDNO6的第276、285、或291位中的兩個或以上核苷酸的SEQ ID NO6中的15個或以上連續核苷酸的鏈或其互補鏈的基因擴增引物；包含SEQ ID NO6的第327、333、342、或345位中的兩個或以上核苷酸的SEQ ID NO6中的15個或以上連續核苷酸的鏈或其互補鏈的基因擴增引物；包含SEQ ID NO6的第424、426、432、441、445、或446位中的兩個或以上核苷酸的SEQ ID NO6中的15個或以上連續核苷酸的鏈或其互補鏈的基因擴增引物；包含SEQ ID NO6的第448、450、453、或468位中的兩個或以上核苷酸的SEQ ID NO6中的15個或以上連續核苷酸的鏈或其互補鏈的基因擴增引物；包含SEQ ID NO6的第489、495、或501位中的兩個或以上核苷酸的SEQ ID NO6中的15個或以上連續核苷酸的鏈或其互補鏈的基因擴增引物；包含SEQ ID NO6的第519、522、525、或540位中的兩個或以上核苷酸的SEQ ID NO6中的15個或以上連續核苷酸的鏈或其互補鏈的基因擴增引物；包含SEQ ID NO6的第585、591、600、603、或606位中的兩個或以上核苷酸的SEQ ID NO6中的15個或以上連續核苷酸的鏈或其互補鏈的基因擴增引物；包含SEQ ID NO6的第639、645、654、或657位中的兩個或以上核苷酸的SEQ ID NO6中的15個或以上連續核苷酸的鏈或其互補鏈的基因擴增引物；包含SEQ ID NO6的第679、680、681、687、或702位中的兩個或以上核苷酸的SEQ ID NO6中的15個或以上連續核苷酸的鏈或其互補鏈的基因擴增引物；包含SEQ ID NO6的第705、708、714、720、或723位中的兩個或以上核苷酸的SEQ ID NO6中的15個或以上連續核苷酸的鏈或其互補鏈的基因擴增引物；及包含SEQ ID NO6的第729、732、741、或750位中的兩個或以上核苷酸的SEQ ID NO6中的15個或以上連續核苷酸的鏈或其互補鏈的基因擴增引物。更具體的例子包括含5』-cattcttgaacagtttgacaag-3』或與其互補的鏈的基因擴增引物、含5』-caggcagaagaactacgtctg-3』或與其互補的鏈的基因擴增引物、含5』-agarctctctgaagccgatctcgct-3』或與其互補的鏈的基因擴增引物、含5』-gaagatgacgaggtcgcggag-3』或與其互補的鏈的基因擴增引物、含5』-gaggatgaagatgaagac-3』或與其互補的鏈的基因擴增引物、含5』-gggtattgaccctgagctc-3』或與其互補的鏈的基因擴增引物、含5』-taaccaagcatctgaagcttcaag-3』或與其互補的鏈的基因擴增引物、含5』-tcaaccaaatggtcaaattgt-3』或與其互補的鏈的基因擴增引物、含5』-gcggaaratatccagtaccag-3』或與其互補的鏈的基因擴增引物、含5』-acgaacacgatccatcgaggta-3』或與其互補的鏈的基因擴增引物、含5』-aataaatgatttctttggcatt-3』或與其互補的鏈的基因擴增引物、含5』-gagyactttatcragccat-3』或與其互補的鏈的基因擴增引物、含5』-gtcttcttgctcacgtactttttg-3』或與其互補的鏈的基因擴增引物、含5』-ttggattgaagggcgaata-3』或與其互補的鏈的基因擴增引物、含5』-agtctcytgttcgatcatctgm-3』或與其互補的鏈的基因擴增引物、以及所含鏈或其互補鏈包含上述序列的基因擴增引物。
可將包含上述序列的區和鏈或其互補鏈直接用作引物。此外，如果需要，引物中可包含其它序列如銜接序列。
本發明包括一種使用這些引物和探針以及其它試劑用於檢測、定量或鑑定霍亂弧菌或最小弧菌的試劑盒。
本發明所用的基因擴增方法不限於PCR方法。所述引物和探針可用於以引物特異性為基礎的特異性擴增方法中或特異性抑制擴增的方法中。此外，所述引物和探針還可類似用於量化和擴增反應中，其中組合使用特異性擴增引物以及標記的特異性探針。此外，探針序列還可單獨使用。使用探針的方法不限於包括固相或液相的方法。所述引物和探針還可用於進行實時PCR其中使用試劑如cyber綠檢測擴增的雙鏈DNA或進行應用FRET等的實時PCR。
使用有關本發明所得核苷酸序列的系統發育類群(圖2、3和4)之間特異性的信息可設計出具有高度特異性的探針和具有高度特異性和極佳擴增效率的基因擴增引物。表2表示以關於本發明所得霍亂弧菌或最小弧菌(圖2、3和4)的特異性核苷酸信息為基礎製備的PCR引物的序列。
表2.特異性檢測霍亂弧菌和最小弧菌的引物


已經獲得有關系統發育類群的信息。因此，可設計出幾乎全部所分析序列的特異性引物或探針。
後面將參考實施例詳細描述本發明。每個實施例是本發明的一個實施方案，且本發明不受這些實施例的限制。
本說明書包括日本專利申請No.2002-362878的說明書或附圖中公開的部分或全部內容，其是本申請的優先權文件。
附圖簡述圖1表示連接gyrB和rpoD基因的部分序列後，分子系統發育分析的結果。這是通過鄰接方法製備的分子系統發育樹，表示霍亂弧菌和最小弧菌屬於不同於弧菌屬其它細菌那些類群的單一系統發育類群。此外，各霍亂弧菌和最小弧菌形成獨立的單一系統發育類群。
圖2表示霍亂弧菌和最小弧菌所屬聚簇(圖1所示)的gyrb基因共有序列(大寫字母)與密切相關聚簇(圖1中的C1、2和3)的gyrB基因共有序列(小寫字母)的測定和比較結果。用「●」表示的位點是對霍亂弧菌和最小弧菌特異的核苷酸。
圖3表示霍亂弧菌和最小弧菌所屬聚簇(圖1所示)的rpoD基因共有序列(大寫字母)與密切相關聚簇(圖1中的C1、2和3)的rpoD基因共有序列(小寫字母)的測定和比較結果。用「●」表示的位點是對霍亂弧菌和最小弧菌特異的核苷酸。
圖4表示霍亂弧菌所屬聚簇(圖1所示)的gyrB基因共有序列(大寫字母)與最小弧菌所屬聚簇(圖1所示)的gyrB基因共有序列(小寫字母)的測定和比較結果。用「●」表示的位點是對霍亂弧菌特異的核苷酸。
圖5表示霍亂弧菌所屬聚簇(圖1所示)的rpoD基因共有序列(大寫字母)與最小弧菌所屬聚簇(圖1所示)的rpoD基因共有序列(小寫字母)的測定和比較結果。用「●」表示的位點是對霍亂弧菌特異的核苷酸。
圖6表示最小弧菌所屬聚簇(圖1所示)的gyrB基因共有序列(大寫字母)與霍亂弧菌所屬聚簇(圖1所示)的gyrB基因共有序列(小寫字母)的測定和比較結果。用「●」表示的位點是對最小弧菌特異的核苷酸。
圖7表示最小弧菌所屬聚簇(圖1所示)的rpoD基因共有序列(大寫字母)與霍亂弧菌所屬聚簇(圖1所示)的rpoD基因共有序列(小寫字母)的測定和比較結果。用「●」表示的位點是對最小弧菌特異的核苷酸。
進行本發明的最佳方式[實施例1]下面給出利用對霍亂弧菌和最小弧菌特異的區域，使用按照本發明設計和獲得的基因擴增引物(表2所示)的例子。此外，權利要求
5(2)和(3)以及權利要求
11(2)和(7)描述的引物分別與表2中的CMgF、CMgR、CMrF、和CMrR相對應。使用從試驗菌株中提取出來的染色體DNA作為模板、以及AmpliTaq Gold(PE Applied Biosystems)和總共20μl反應溶液進行PCR。關於熱循環條件，是在95℃加熱10分鐘後，94℃ 1分鐘循環35次、退火1分鐘(見表5的退火溫度)、和72℃ 1分鐘，最後在72℃下進行延長反應10分鐘。使反應後所得樣品經過1％瓊脂凝膠電泳，然後用溴化乙錠染色。是否存在擴增基因是在UV輻射下加以證實的。僅證實了來源於確定屬於霍亂弧菌和最小弧菌的細菌菌株DNA的擴增產物，具有針對gyrB基因的CMgF和CMgR以及針對rpoD基因的CMrF和CMrR的組合(表6)。
下面給出利用對霍亂弧菌或最小弧菌特異的區域，使用按照本發明設計和獲得的基因擴增引物(表3和表4所示)的例子。此外，權利要求
19(1)、(3)、(4)、和(5)以及權利要求
25(1)和(14)描述的引物對霍亂弧菌是特異性的。這些引物在表3中的CF1、CF2、CR2、CR1、CrF1、和CrR1描述。權利要求
33(1)、(3)、(4)、和(5)以及權利要求
39(7)和(13)描述的引物對最小弧菌是特異的。這些引物分別與表4中的MF1、MF2、MR2、MR1、MrF1、和MrR1相對應。
按照與實施例相似的方式，使用從試驗菌株中提取出來的染色體DNA作為模板進行PCR(見表5的退火溫度)。在所有情況下，使用霍亂弧菌-特異性引物僅檢測來源於霍亂弧菌的擴增產物，而使用最小弧菌-特異性引物僅檢測僅來源於最小弧菌的擴增產物(表6)。
表3.特異性檢測霍亂弧菌的引物


表4.特異性檢測最小弧菌的引物


表5.特異性檢測霍亂弧菌和最小弧菌的引物的PCR條件


表6






此處引用的所有公開出版物、專利和專利申請全部引入此處作為參考。
工業實用性本發明的gyrB和rpoD基因引物和探針是以霍亂弧菌和最小弧菌的系統發育關係為基礎設計的。因此，已經就提高特異性而研究了所述引物和探針且它們在檢測準確性方面是極佳的。因此，所述引物和探針適用於在不從被密切相關的細菌種類汙染的食品、臨床樣品等中分離細菌的情況下進行直接檢測。
序列表110Nichirei Corporation120用於檢測霍亂弧菌或最小弧菌的引物和探針以及使用它們的方法130PH-1967-PCT140
141
150JP 2002/3628781512002-12-131606170PatentIn Ver.2.12101211885212DNA213人工序列220
223人工序列的描述霍亂弧菌和最小弧菌的共有序列-gyrB4001gtmtccggyg gtctrcacgg ggtaggtgtg tcggtrgtka aygcsctbtc wgaaaaagtg 60ctrctbacca tytatcgygg yggcaaraty caywcscaaa cttaccatca yggtgtgcca 120caagcaccgt tgkctgtrgt rggtgakacw gagcgtaccg gtactaccgt acgtttctgg 180ccwagygcac aracytttac caatatcgaa ttycattacg acattytggc taaacgyctg 240cgtgagctgt cattcctgaa ytctggcgtg tcgatcaagc tgaysgatga rcgtgaagaa 300gataaraaag accacttyat gtatgaaggk ggtattcaag cgtttgtkac ccacttgaac 360cgyaayaaaa cgccratcca tgaraaagtm ttccacttya accaagagcg tgaagatggc 420atcagcgtgg aagtggcrat gcagtggaay gatggtttcc aagaaaacat ctactgcttt 480acyaacaaca tyccacagcg tgatggyggt acccayttag cyggtttccg tggtgcrttg 540acccgtactt tgaacaacta yatggayaaa gaaggcttct cgaagaaagc scaagcrgca 600acctcgggtg atgatgcgcg tgaaggctta acrgcdgtkg tdtcggtgaa agtrccrgat 660cctaaattct cragccaaac caaagataag ctrgtttctt cggargtraa atccgcrgtt 720gartcagcya tgaatgagaa gctggcrgat ttcctrgcgg aaaacccaag cgaagcgaaa 780aacgtttgtt cgaagattat tgatgcrgcr cghgckcgtg aagcvgcgcg taaagcmcgk 840gaaatgacyc gycgtaaagg cgcgytrgay ythgcwggyt trcch 8852102
211822212DNA213人工序列220
223人工序列的描述霍亂弧菌和最小弧菌的共有序列-rpoD4002acacgtgaag gygaaatcga tattgccaag cgcattgaag atggtattaa ccaagttcaa 60agtgcgattg ctgagtatcc tggaaccatc ccwtayattc ttgarcagtt tgaymrkgtt 120caggcmgaag arctacgtct sactgayctg atttcwggtt tcgttgaycc taacgacatg 180gaaaccgaag cgccaacygc kactcacatc ggttcwgarc tytctgaagc sgatctcgck 240gatgaagatg aygmkgtcgy sgargatgaa gacgargatg aagaygaaga yggcgacggt 300gaaagyagcg acagcgaaga agaagtsggt atygaccctg arctsgctcg tgagaaattc 360aatgaactgc gcggyaagtt ccaaaacctg caattagcgg ttaatgaatt tggtcgtgac 420agtmaycaag cwtctgaagc ktcarrcytr gtrytggata tyttccgyga attccgycta 480acaccaaarc aattygacca yttggttgaa actctgcgya cytcratgga tcgtgttcgy 540acccaagarc gyttggtrat gaaagcvgtr gttgaagtcg cgaaratgcc raagaaatcr 600ttyatygcyc trtttacagg caatgaatcg aatgargart ggctbgataa agtvctygct 660tctgayaarc cttaygtasm raaagtmcgt gagcaagaag amgakatycg ccgytcaaty 720caraaactdc aratgatcga rcargagacw tcactgtctg ttgarcgyat caaagacatc 780agccgtcgta tgtcwatcgg tgargcraaa gctcgccgtg cg 8222103211822212DNA213人工序列220
223人工序列的描述霍亂弧菌的共有序列-gyrB4003acacgtgaag gygaaatcga tattgccaag cgcattgaag atggtattaa ccaagttcaa 60agtgcgattg ctgagtatcc tggaaccatc ccwtayattc ttgarcagtt tgaymrkgtt 120caggcmgaag arctacgtct sactgayctg atttcwggtt tcgttgaycc taacgacatg 180gaaaccgaag cgccaacygc kactcacatc ggttcwgarc tytctgaagc sgatctcgck 240gatgaagatg aygmkgtcgy sgargatgaa gacgargatg aagaygaaga yggcgacggt 300gaaagyagcg acagcgaaga agaagtsggt atygaccctg arctsgctcg tgagaaattc 360aatgaactgc gcggyaagtt ccaaaacctg caattagcgg ttaatgaatt tggtcgtgac 420agtmaycaag cwtctgaagc ktcarrcytr gtrytggata tyttccgyga attccgycta 480acaccaaarc aattygacca yttggttgaa actctgcgya cytcratgga tcgtgttcgy 540acccaagarc gyttggtrat gaaagcvgtr gttgaagtcg cgaaratgcc raagaaatcr 600
ttyatygcyc trtttacagg caatgaatcg aatgargart ggctbgataa agtvctygct 660tctgayaarc cttaygtasm raaagtmcgt gagcaagaag amgakatycg ccgytcaaty 720caraaactdc aratgatcga rcargagacw tcactgtctg ttgarcgyat caaagacatc 780agccgtcgta tgtcwatcgg tgargcraaa gctcgccgtg cg 8222104211822212DNA213人工序列220
223人工序列的描述霍亂弧菌的共有序列-rpoD4004acacgtgaag gtgaaatcga tattgccaag cgcattgaag atggtattaa ccaagttcaa 60agtgcgattg ctgagtatcc tggaaccatc ccttatattc ttgagcagtt tgatcgtgtt 120caggccgaag agctacgtct cactgacctg atttcaggtt tcgttgaycc taacgacatg 180gaaaccgaag cgccaaccgc gactcacatc ggttctgagc tttctgaagc ggatctcgcg 240gatgaagatg atgctgtcgt cgaagatgaa gacgaagatg aagacgaaga tggcgacggt 300gaaagcagcg acagcgaaga agaagtcggt atcgaccctg aactggctcg tgagaaattc 360aatgaactgc gcggyaagtt ccaaaacctg caattagcgg ttaatgaatt tggtcgtgac 420agtcatcaag cttctgaagc gtcagactta gtgytggata tcttccgtga attccgycta 480acaccaaagc aattcgacca cttggttgaa actctgcgca cttcaatgga tcgtgttcgc 540acccaagaac gtttggtrat gaaagcggta gttgaagtcg cgaagatgcc gaagaaatcg 600ttcatcgccc tatttacagg caatgaatcg aatgaagagt ggctggataa agtccttgct 660tctgacaagc cttacgtagc gaaagtccgt gagcaagaag aagagatccg ccgttcaatt 720cagaaactac aaatgatcga gcaagagaca tcactgtctg ttgaacgcat caaagacatc 780agccgtcgta tgtcaatcgg tgaggcraaa gctcgccgtg cg 8222105211885212DNA213人工序列220
223人工序列的描述最小弧菌的共有序列-gyrB4005gtctccggtg gtctacacgg ggtaggtgtg tcggtagtga atgccctgtc agaaaaagtg 60ctgctbacca tttatcgtgg tggcaagatt cacacccaaa cttaccatca cggtgtgcca 120caagcaccgt tgtctgtrgt gggtgagact gagcgtaccg gtactaccgt acgtttctgg 180cctagtgcac agacttttac caatatcgaa ttccattacg acattctggc taaacgyctg 240cgtgagctgt cattcctgaa ctctggcgtg tcgatcaagc tgacggatga gcgtgaagaa 300gataagaaag accacttyat gtatgaaggt ggtattcaag cgtttgtkac ccacttgaac 360
cgtaayaaaa cgccgatcca tgaaaaagta ttccacttca accaagagcg tgaagatggc 420atcagcgtgg aagtggcaat gcagtggaac gatggtttcc aagaaaacat ctactgcttt 480accaacaaca tyccacagcg tgatggcggt acccacttag cyggtttccg tggtgcrttg 540acccgtactt tgaacaacta catggacaaa gaaggcttct cgaagaaagc scaagcrgca 600acctcgggtg atgatgcgcg tgaaggctta acrgcrgtkg tktcggtgaa agtrccrgat 660cctaaattct cragccaaac caaagataag ctrgtttctt cggargtgaa atccgcggtt 720gagtcagcca tgaatgagaa gctggcggat ttcctggcgg aaaacccaag cgaagcgaaa 780aacgtttgtt cgaagattat tgatgcrgcr cghgctcgtg aagcvgcgcg taaagcacgt 840gaaatgacyc gtcgtaaagg cgcgctagay ytmgctggtt tgccw 8852106211822212DNA213人工序列220
223人工序列的描述最小弧菌的共有序列-rpoD4006acacgtgaag gcgaaatcga tattgccaag cgcattgaag atggtattaa ccaagttcaa 60agtgcgattg ctgagtatcc tggaaccatc ccatacattc ttgaacagtt tgacaaggtt 120caggcagaag aactacgtct gactgayctg atttctggtt tcgttgatcc taacgacatg 180gaaaccgaag cgccaactgc tactcacatc ggttcagarc tctctgaagc cgatctcgct 240gatgaagatg acgaggtcgc ggaggatgaa gacgaggatg aagatgaaga cggcgacggt 300gaaagyagcg acagcgaaga agaagtgggt attgaccctg agctcgctcg tgagaaattc 360aatgaactgc gcggcaagtt ccaaaacctg caattagcgg ttaatgaatt tggtcgtgac 420agtaaccaag catctgaagc ttcaagcctg gtactggata tyttccgcga attccgccta 480acaccaaaac aatttgacca tttggttgaa actctgcgta cctcgatgga tcgtgttcgt 540acccaagagc gyttggtgat gaaagcvgtg gttgaagtcg cgaaaatgcc aaagaaatca 600tttattgcyc trtttacagg caatgaatcg aatgargaat ggctygataa agtrctcgct 660tctgataarc cttatgtaca aaaagtacgt gagcaagaag acgatattcg ccgctcaatc 720caaaaactkc agatgatcga acargagact tcactgtctg ttgagcgtat caaagacatc 780agccgtcgta tgtctatcgg tgaagcgaaa gctcgccgtg cg 822
權利要求
1.一種如SEQ ID NO1所示基因的片段，它是編碼序列表中SEQID NO1的DNA促旋酶β亞單位的基因(gyrB)片段，並包含第21、96、107、126、153、190、258、270、279、285、357、543、552、557、600、690、702、714、729、733、734、759、771、782、786、792、795、或885位(也稱作核苷酸數)中的任意一個或多個核苷酸，上述位點對霍亂弧菌(Vibrio cholerae)和最小弧菌(Vibrio mimicus)細菌類群是特異的，其中，所述基因片段可用於設計特異性基因擴增引物或探針。
2.一種基因擴增引物，它所含的鏈或其互補鏈含有15個或以上連續的核苷酸，其中一個或多個核苷酸位於編碼含有權利要求
1片段的序列表中SEQ ID NO1的DNA促旋酶β亞單位的基因(gyrB)的第21、96、107、126、153、190、258、270、279、285、357、543、552、557、600、690、702、714、729、733、734、759、771、782、786、792、795、或885位中的任意位點，上述位點對霍亂弧菌和最小弧菌細菌類群是特異的。
3.根據權利要求
2所述的基因擴增引物，其中使用高頻含有權利要求
1所列霍亂弧菌和最小弧菌細菌類群特異的兩個或多個位點的區域。
4.根據權利要求
2所述的基因擴增引物，其中3』末端的核苷酸是位於權利要求
1所列霍亂弧菌和最小弧菌細菌類群特異的位點上的核苷酸。
5.根據權利要求
2所述的基因擴增引物，它包括下列任何一個(1)5′-tycaywcscaaacttacca-3′或與其互補的鏈；(2)5′-gaaytctggcgtgtcgatcaag-3′或與其互補的鏈；(3)5′-catrtagttgttcaaagtacgg-3′或與其互補的鏈；(4)5′-ggatttyacytccgaagaaacyagc-3′或與其互補的鏈；(5)5′-ygccagcttctcattcatr-3′或與其互補的鏈；(6)5′-cgcttcgcttgggttttcc-3′或與其互補的鏈；或(7)5′-caataatcttcgaacaaacgt-3′或與其互補的鏈。
6.一種用於檢測、定量或鑑定霍亂弧菌和最小弧菌的探針，它所含的鏈或其互補鏈含有15個或以上連續的核苷酸，其中一個或多個核苷酸位於編碼序列表中SEQ ID NO1的DNA促旋酶β亞單位基因(gyrB)的第21、96、107、126、153、190、258、270、279、285、357、543、552、557、600、690、702、714、729、733、734、759、771、782、786、792、795、或885位中的任意位點上，上述位點對霍亂弧菌和最小弧菌細菌類群是特異的。
7.一種如序列表中SEQ ID NO2所示基因的片段，其包含編碼SEQID NO2的RNA聚合酶σ70因子的基因(rpoD)的第3、27、66、67、75、90、117、123、141、144、177、178、180、186、223、227、228、231、250、251、255、257、259、264、300、301、302、303、305、313、314、350、351、362、369、373、374、380、390、400、402、409、410、415、416、423、427、433、444、447、504、510、513、543、556、558、618、638、649、663、685、711、747、757、762、763、或789位中任意一個或多個核苷酸，所述位點對霍亂弧菌和最小弧菌細菌類群是特異的，其中所述基因片段可用於設計特異性基因擴增引物或探針。
8.一種基因擴增引物，它所含的鏈或其互補鏈含有序列表中SEQID NO2中的15個或以上連續的核苷酸，其中一個或多個核苷酸位於編碼SEQ ID NO2的RNA聚合酶σ70因子的基因(rpoD)的第3、27、66、67、75、90、117、123、141、144、177、178、180、186、223、227、228、231、250、251、255、257、259、264、300、301、302、303、305、313、314、350、351、362、369、373、374、380、390、400、402、409、410、415、416、423、427、433、444、447、504、510、513、543、556、558、618、638、649、663、685、711、747、757、762、763、或789位中的任意位點上，所述位點對霍亂弧菌和最小弧菌細菌類群是特異的。
9.根據權利要求
8所述的基因擴增引物，其中使用高頻含有權利要求
8所列霍亂弧菌和最小弧菌細菌類群特異的兩個或多個位點的區域。
10.根據權利要求
8所述的基因擴增引物，其中3』末端的核苷酸是位於權利要求
8所列霍亂弧菌和最小弧菌細菌類群特異的位點上的核苷酸。
11.根據權利要求
8所述的基因擴增引物，它包括下列任何一個(1)5′-gattgctgagtatcctggaaccatc-3′或與其互補的鏈；(2)5′-gaycctaacgacatggaaacc-3′或與其互補的鏈；(3)5′-ttcwgarctytctgaagcs-3′或與其互補的鏈；(4)5′-agatgaygmkgtcgysgar-3′或與其互補的鏈；(5)5′-cgacggtgaaagyagcgacag-3′或與其互補的鏈；(6)5′-caatgaactgcgcggyaagtt-3′或與其互補的鏈；(7)5′-gtcacgaccaaattcattaac-3′或與其互補的鏈；(8)5′-gyytgamgcttcagawgcttgrtka-3′或與其互補的鏈；(9)5′-ygargtrcgcagagtttcaacc-3′或與其互補的鏈；(10)5′-catyaccaarcgytcttgg-3′或與其互補的鏈；或(11)5′-cgytcaacagacagtgawgtc-3′或與其互補的鏈。
12.一種用於檢測、定量或鑑定霍亂弧菌和最小弧菌細菌類群的探針，它所含的鏈或其互補鏈含有序列表中SEQ ID NO2中的15個或以上連續的核苷酸，其中一個或多個核苷酸位於編碼SEQ ID NO2的RNA聚合酶σ70因子的基因(rpoD)的第3、27、66、67、75、90、117、123、141、144、177、178、180、186、223、227、228、231、250、251、255、257、259、264、300、301、302、303、305、313、314、350、351、362、369、373、374、380、390、400、402、409、410、415、416、423、427、433、444、447、504、510、513、543、556、558、618、638、649、663、685、711、747、757、762、763、或789位中的任意位點上，所述位點對霍亂弧菌和最小弧菌細菌類群是特異的。
13.一種用於檢測、定量或鑑定霍亂弧菌和最小弧菌細菌類群的方法，其中使用權利要求
2-6或8-12任何一項所述的引物或探針。
14.一種用於檢測、定量或鑑定霍亂弧菌和最小弧菌細菌類群的試劑盒，其中使用權利要求
2-6或8-12任何一項所述的引物或探針。
15.一種如序列表中SEQ ID NO3所示的基因的片段，它包含編碼SEQ ID NO3的DNA促旋酶β亞單位的基因(gyrB)的第15、36、39、42、45、48、51、90、111、133、226、285、291、306、330、384、390、399、507、708、756、837、867、873、879、882、或885位中任意的一個或多個核苷酸，所述位點對霍亂弧菌細菌類群是特異的，其中所述基因片段可用於設計特異性基因擴增引物或探針。
16.一種基因擴增引物，它所含的鏈或其互補鏈含有序列表中SEQID NO3中的15個或以上連續的核苷酸，其中一個或多個核苷酸位於編碼SEQ ID NO3的DNA促旋酶β亞單位的基因(gyrB)的第15、36、39、42、45、48、51、90、111、133、226、285、291、306、330、384、390、399、507、708、756、837、867、873、879、882、或885位中的任意位點上，所述位點對霍亂弧菌細菌類群是特異的。
17.根據權利要求
16所述的基因擴增引物，其中3』末端的核苷酸是位於權利要求
16所列對霍亂弧菌細菌類群獨特的位點上的核苷酸。
18.根據權利要求
16所述的基因擴增引物，其中使用高頻含有權利要求
16所列、對霍亂弧菌細菌類群特異的兩個或多個位點的區域。
19.根據權利要求
16所述的基因擴增引物，它包括下列任何一個(1)5′-ggtggttaacgcgctytct-3′或與其互補的鏈；(2)5′-ycgatgaacgtgaagaagataaa-3′或與其互補的鏈；(3)5′-tgagaaagtcttccacttt-3′或與其互補的鏈；(4)5′-gttaaagtggaagactttc-3′或與其互補的鏈；或(5)5′-gggtaagccwgcaagatcc-3′或與其互補的鏈。
20.一種用於檢測、定量或鑑定霍亂弧菌細菌類群的探針，它所含的鏈或其互補鏈含有15個或以上連續的核苷酸，其中一個或多個核苷酸位於編碼序列表中SEQ ID NO3的DNA促旋酶β亞單位的基因(gyrB)的第15、36、39、42、45、48、51、90、111、133、226、285、291、306、330、384、390、399、507、708、756、837、867、873、879、882、或885位中的任意位點上，所述位點對霍亂弧菌細菌類群是特異的。
21.一種如序列表中SEQ ID NO4所示的基因的片段，它包含編碼SEQ ID NO4的RNA聚合酶σ70因子的基因(rpoD)的第12、93、96、105、114、115、116、117、126、132、141、156、198、201、216、222、231、240、252、254、255、260、261、264、276、285、291、327、333、342、345、424、426、432、441、445、446、448、450、453、468、489、495、501、519、522、525、540、549、570、585、591、600、603、606、639、645、654、657、666、675、679、680、681、687、702、705、708、714、720、723、729、732、741、750、765、768、795、或804位的任意一個或多個核苷酸，所述位點對霍亂弧菌細菌類群是特異的，其中所述基因片段可用於設計特異性基因擴增引物或探針。
22.一種基因擴增引物，它所含的鏈或其互補鏈含有序列表中SEQID NO4中的15個或以上連續的核苷酸，其中一個或多個核苷酸位於編碼SEQ ID NO4的RNA聚合酶σ70因子的基因(rpoD)的第12、93、96、105、114、115、116、117、126、132、141、156、198、201、216、222、231、240、252、254、255、260、261、264、276、285、291、327、333、342、345、424、426、432、441、445、446、448、450、453、468、489、495、501、519、522、525、540、549、570、585、591、600、603、606、639、645、654、657、666、675、679、680、681、687、702、705、708、714、720、723、729、732、741、750、765、768、795、或804位中的任意位點上，所述位點對霍亂弧菌細菌類群是特異的。
23.根據權利要求
22所述的基因擴增引物，其中3』末端的核苷酸是位於權利要求
22所列對霍亂弧菌細菌類群獨特的位點上的核苷酸。
24.根據權利要求
22所述的基因擴增引物，其中使用高頻含有權利要求
22所列對霍亂弧菌細菌類群特異的兩個或多個位點的區域。
25.根據權利要求
22所述的基因擴增引物，它包括下列任何一個(1)5′-attcttgagcagtttgatcgt-3′或與其互補的鏈；(2)5′-caggccgaagagctacgtctc-3′或與其互補的鏈；(3)5′-tgagctttctgaagcggatctcgcg-3′或與其互補的鏈；(4)5′-gaagatgatgctgtcgtcgaa-3′或與其互補的鏈；(5)5′-gaagatgaagacgaagat-3′或與其互補的鏈；(6)5′-cggtatcgaccctgaactg-3′或與其互補的鏈；(7)5′-catcaagcttctgaagcgtcaga-3′或與其互補的鏈；(8)5′-acggaagatatccarcactaa-3′或與其互補的鏈；(9)5′-tcaaccaagtggtcgaattgc-3′或與其互補的鏈；(10)5′-gcgaacacgatccattgaagtg-3′或與其互補的鏈；(11)5′-gatgaacgatttcttcggcatc-3′或與其互補的鏈；(12)5′-aaggactttatccagccac-3′或與其互補的鏈；(13)5′-ttcttcttgctcacggactttcgc-3′或與其互補的鏈；(14)5′-ttctgaattgaacggcggatc-3′或與其互補的鏈；或(15)5′-tgtctcttgctcgatcatttgt-3′或與其互補的鏈。
26.一種用於檢測、定量或鑑定霍亂弧菌細菌類群的探針，它所含的鏈或其互補鏈含有序列表中SEQ ID NO4中的15個或以上連續的核苷酸，其中一個或多個核苷酸位於編碼序列表中SEQ ID NO4的RNA聚合酶σ70因子的基因(rpoD)的第12、93、96、105、114、115、116、117、126、132、141、156、198、201、216、222、231、240、252、254、255、260、261、264、276、285、291、327、333、342、345、424、426、432、441、445、446、448、450、453、468、489、495、501、519、522、525、540、549、570、585、591、600、603、606、639、645、654、657、666、675、679、680、681、687、702、705、708、714、720、723、729、732、741、750、765、768、795、或804位中的任意位點上，所述位點對霍亂弧菌細菌類群是特異的。
27.一種用於檢測、定量或鑑定霍亂弧菌細菌類群的方法，其中使用權利要求
16-20或22-26任何一項的引物或探針。
28.一種用於檢測、定量或鑑定霍亂弧菌細菌類群的試劑盒，其中使用權利要求
16-20或22-26任何一項的引物或探針。
29.一種如序列表中SEQ ID NO5所示的基因的片段，它包含編碼SEQ ID NO5的DNA促旋酶β亞單位的基因(gyrB)的第15、36、39、42、45、48、51、90、111、133、226、285、291、306、330、384、390、399、507、708、756、837、867、873、879、882、或885位中任意一個或多個核苷酸，所述位點對最小弧菌細菌類群是特異的，其中所述基因片段可用於設計特異性基因擴增引物或探針。
30.一種基因擴增引物，它所含的鏈或其互補鏈含有序列表中SEQID NO3中的15個或以上連續的核苷酸，其中一個或多個核苷酸位於編碼SEQ ID NO3的DNA促旋酶β亞單位的基因(gyrB)的第15、36、39、42、45、48、51、90、111、133、226、285、291、306、330、384、390、399、507、708、756、837、867、873、879、882、或885位中的任意位點上，所述位點對最小弧菌細菌類群是特異的。
31.根據權利要求
30所述的基因擴增引物，其中使用高頻含有權利要求
30所列對最小弧菌細菌類群特異的兩個或多個位點的區域。
32.根據權利要求
30所述的基因擴增引物，其中3』末端的核苷酸是位於權利要求
31所列對最小弧菌細菌類群獨特的位點上的核苷酸。
33.根據權利要求
30所述的基因擴增引物，它包括下列任何一個(1)5′-ggtagtgaatgccctgtca-3′或與其互補的鏈；(2)5′-cggatgagcgtgaagaagataag-3′或與其互補的鏈；(3)5′-tgaaaaagtattccacttc-3′或與其互補的鏈；(4)5′-gttgaagtggaatactttt-3′或與其互補的鏈；或(5)5′-wggcaaaccagckarrtct-3′或與其互補的鏈。
34.一種用於檢測、定量或鑑定最小弧菌細菌類群的探針，它所含的鏈或其互補鏈含有序列表中SEQ ID NO5中的15個或以上連續的核苷酸，其中一個或多個核苷酸位於編碼SEQ ID NO5的DNA促旋酶β亞單位的基因(gyrB)的第15、36、39、42、45、48、51、90、111、133、226、285、291、306、330、384、390、399、507、708、756、837、867、873、879、882、或885位中的任意位點上，所述位點對最小弧菌細菌類群是特異的。
35.一種如序列表中SEQ ID NO6所示的基因的片段，它包含編碼SEQ ID NO6的RNA聚合酶σ70因子的基因(rpoD)的第12、93、96、105、114、115、116、117、126、132、141、156、198、201、216、222、231、240、252、254、255、260、261、264、276、285、291、327、333、342、345、424、426、432、441、445、446、448、450、453、468、489、495、501、519、522、525、540、549、570、585、591、600、603、606、639、645、654、657、666、675、679、680、681、687、702、705、708、714、720、723、729、732、741、750、765、768、795、或804位中的任意一個或多個核苷酸，所述位點對最小弧菌細菌類群是特異的，其中所述基因片段可用於設計特異性基因擴增引物或探針。
36.一種基因擴增引物，它所含的鏈或其互補鏈含有序列表中SEQID NO6中的15個或以上連續的核苷酸，其中一個或多個核苷酸位於編碼SEQ ID NO6的RNA聚合酶σ70因子的基因(rpoD)的第12、93、96、105、114、115、116、117、126、132、141、156、198、201、216、222、231、240、252、254、255、260、261、264、276、285、291、327、333、342、345、424、426、432、441、445、446、448、450、453、468、489、495、501、519、522、525、540、549、570、585、591、600、603、606、639、645、654、657、666、675、679、680、681、687、702、705、708、714、720、723、729、732、741、750、765、768、795、或804位中的任意位點上，所述位點對最小弧菌細菌類群是特異的。
37.根據權利要求
36所述的基因擴增引物，其中使用高頻含有權利要求
36所列對最小弧菌細菌類群特異的兩個或多個位點的區域。
38.根據權利要求
36所述的基因擴增引物，其中3』末端的核苷酸是位於權利要求
36所列對最小弧菌細菌類群獨特的位點上的核苷酸。
39.根據權利要求
36所述的基因擴增引物，它包括下列任何一個(1)5′-cattcttgaacagtttgacaag-3′或與其互補的鏈；(2)5′-caggcagaagaactacgtctg-3′或與其互補的鏈；(3)5′-agarctctctgaagccgatctcgct-3′或與其互補的鏈；(4)5′-gaagatgacgaggtcgcggag-3′或與其互補的鏈；(5)5′-gaggatgaagatgaagac-3′或與其互補的鏈；(6)5′-gggtattgaccctgagctc-3′或與其互補的鏈；(7)5′-taacaaagcatctgaagcttcaag-3′或與其互補的鏈；(8)5′-gcggaaratatccagtaccag-3′或與其互補的鏈；(9)5′-tcaaccaaatggtcaaattgt-3′或與其互補的鏈；(10)5′-acgaacacgatccatcgaggta-3′或與其互補的鏈；(11)5′-aataaatgatttctttggcatt-3′或與其互補的鏈；(12)5′-gagyactttatcragccat-3′或與其互補的鏈；(13)5′-gtcttcttgctcacgtactttttg-3′或與其互補的鏈；(14)5′-ttggattgaagggcgaata-3′或與其互補的鏈；或(15)5′-agtctcytgttcgatcatctgm-3′或與其互補的鏈。
40.一種用於檢測、定量或鑑定最小弧菌細菌類群的探針，它所含的鏈或其互補鏈含有序列表中SEQ ID NO6中的15個或以上連續的核苷酸，其中一個或多個核苷酸位於序列表中編碼SEQ ID NO6的RNA聚合酶σ70因子的基因(rpoD)的第12、93、96、105、114、115、116、117、126、132、141、156、198、201、216、222、231、240、252、254、255、260、261、264、276、285、291、327、333、342、345、424、426、432、441、445、446、448、450、453、468、489、495、501、519、522、525、540、549、570、585、591、600、603、606、639、645、654、657、666、675、679、680、681、687、702、705、708、714、720、723、729、732、741、750、765、768、795、或804位中的任意位點上，所述位點對最小弧菌細菌類群是特異的。
41.一種用於檢測、定量或鑑定最小弧菌細菌類群的方法，其中使用權利要求
30-34或36-40任何一項的引物或探針。
42.一種用於檢測、定量或鑑定最小弧菌細菌類群的試劑盒，其中使用權利要求
30-34或36-40任何一項的引物或探針。
專利摘要
為了製備用於檢測、定量或鑑定霍亂弧菌和最小弧菌的高性能特異性基因擴增引物，它具有較低的錯誤鑑定風險和實際應用中足夠的擴增效率和擴增特異性。我們已經測定了霍亂弧菌、最小弧菌和密切相關種類的rpoD和gyrB基因的部分核苷酸序列，揭示了它們的系統發育關係，然後分別鑑定了霍亂弧菌和最小弧菌的核苷酸特徵。因此，我們可設計出具有高度特異性的探針和具有高度特異性和極佳擴增效率的基因擴增引物，兩者都包含特徵核苷酸。
文檔編號C12Q1/68GKCN1748030SQ200380109740
公開日2006年3月15日 申請日期2003年12月11日
發明者小泉雄史, 西山葉子, 山本敏, 福山正文, 古畑勝則, 大仲賢二 申請人:株式會社日冷食品導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan