抗體-藥物結合物的製作方法

2023-05-02 20:21:06 3

專利名稱：抗體-藥物結合物的製作方法
技術領域：
本發明屬於有機化學、藥物化學和免疫學領域，本發明提供了抗體與藥物的結合物。該結合物可用於藥物的定靶施用，即抗體將藥物傳遞至需要此藥物的組織或細胞。抗體與藥物的結合通過雙價連接子完成，該連接子在一個鍵合點與抗體結合，而在另一點與藥物結合。本發明還提供了製備結合物的中間產物。
藥物化學提供了日益增多的特異性高效藥物以治療和預防疾病。但直至最近，還沒有一種方法可將藥物傳遞至身體中需要它的特定部位。因此，雖然通常能夠使用具有所需特異效應的藥物來治療病人，並且對身體沒有其他副作用，但仍然必須按全身劑量給藥。而另一方面，如果有可能將藥物傳遞至需要治療的器官、組織甚或細胞，則通常能夠施用極少的總劑量，因為藥物將濃縮於需要它的地方。這對於病人的安全性和藥物的經濟使用來說都具有明顯的優越性。
近年來，免疫學領域一直在嘗試通過使藥物與抗體結合而達到定靶治療的目的，而這種抗體是針對於與藥物需要位點相結合的特異抗原的。目前，關於這種抗體藥物結合物的專利和科學文獻已為數不少了。但直至最近，還沒有一種抗體藥物結合物獲準用於治療目的。
本發明提供了一種具有下式的生理上可接受的藥物結合物
其中Ab是抗體或其識別抗原的片段，它識別與需要傳遞藥物的細胞相結合的抗原;
Q是-NH-，-O-或-S-;
R-Q-是藥物殘基，它具有可參與反應的氨基、羥基或巰基;
R1是羧酸保護基團;
Y是-O-，-NH-，-NCH3-或-NC2H5-;
n是1至大約8的整數;
m是1至大約10的整數。
本發明還提供了含有本發明結合物及非腸道施用基質的藥物組合物，並提供了治療方法，該方法包括對需要該藥物治療的病人非腸道施用本發明的結合物。
本發明還提供了具有下式的中間產物丙二酸酯
其中R2是羥基、羧酸保護基團或構成羧酸鹽的半分子;
R3是羥基、羧酸保護基團、羧酸活化基團或構成羧酸鹽的半分子子;
R4是C1-C4烷氧基。
本發明進一步提供了具有下式的修飾抗體或抗體片段
本發明還提供了具有下式的衍生藥物
本發明進一步提供了製備上述式Ⅰ的藥物結合物的方法，包括(A)使上述式Ⅲ的修飾抗體與式子為R-QH的藥物反應，其中Q和R-Q-如上面所定義;或(B)使上述式Ⅳ的衍生藥物與上述式子為Ab的抗體或抗體片段反應。
在本說明書中，所有溫度都是指攝氏溫度。除非特別指出，所有百分比、濃度等都是重量單位。藥物結合物中的所有濃度和劑量都是指結合物中所含藥物的濃度或數量。
在上述通式中，術語C1-C4烷氧基是指甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基和各種異構體的丁氧基，包括n-丁氧基和t-丁氧基。
在本申請文件中，化合物一般都將稱為丙二酸酯。但是，其中Y是氨基的那些化合物應當稱為丙醯胺酸酯，在特別提到這種化合物時將使用這一術語。
術語羧酸保護基團是指能用於在其他位點進行反應時保護羧酸的有機基團。這種基團在合成化學中使用得極為廣泛，尤其是在肽化學領域，保護基團是有機化學家眾所周知的。關於這方面特別方便的教科書是Greene所著的《有機合成中的保護基團》(JohnWileyandSons，NewYork，1981)。Greene在第5章中討論了酸保護基團。本發明中最優選的保護基團是低級烷氧基，尤其是乙氧基。根據Greene的著作，進一步優選的方便的酸保護基團包括例如甲氧基甲氧基、四氫吡喃氧基、四氫呋喃氧基、苄氧甲氧基、苯甲醯甲氧基和取代的苯甲醯甲氧基、2，2，2-三氯乙氧基和其他的滷代乙氧基、三甲基甲矽烷乙氧基、甲硫乙氧基、甲苯磺醯乙氧基、t-丁、氧基、環戊氧基、苄氧基、二苯基和三苯基甲氧基等，以及醯胺形成基團如氨基、乙氨基、二甲氨基、吡咯烷子基、嗎啉代、哌啶子基、二乙氨乙氨基、嗎啉代乙氨基、苄甲氨基乙氨基等。
術語羧酸活化基團包括合成有機化學中用以提高羧酸反應活性的基團。這種基團合成化學家經常使用，包括例如苯磺醯氧基、甲烷磺醯氧基、甲苯磺醯氧基、苯二甲醯亞氨氧基、琥珀醯亞胺氧基、氯、苯並三唑氧基、溴、迭氮基等。本發明中優選的活化基團是N-琥珀醯亞胺氧基、苯二甲醯亞氨氧基和苯並三唑氧基。
術語構成羧酸鹽的半分子是指通常意義上的化學半分子，它通過氧原子連接後構成羧酸的鹽類。例如，最好使用這樣的鹽形成半分子，如鹼金屬、胺基和季銨基團。更具體說，更為優選的半分子是鈉、鉀、鋰、C1-C4烷基氨基、二烷基氨基和三烷基氨基以及其中的氮原子被四個氫、C1-C4烷基、苯基或苄基取代的季銨基團。作為進一步的例子，可以方便地選來用作半分子的季銨基團有銨、四甲基銨、二乙基二甲基銨、二乙基二丁基銨、苄基三甲基銨、t-丁基三甲基銨、苯基三乙基銨、二乙基二丙基銨、s-丁基三甲基銨、異丁基三乙基銨等。進一步，胺類例如甲胺、丁基胺、三乙基胺、二丙基胺、二乙醇胺等也可方便地用於鹽的形成。
本發明的藥物結合物由抗體、某些化學類型的藥物和連接抗體與藥物的有機化學基團組成。本發明還提供了用於製備所述結合物的中間產物丙二酸酯，以及通過抗體或抗體片段與活化形式的丙二酸酯中間產物反應而產生的修飾抗體。下面，將首先分別討論抗體和藥物，然後說明丙二酸酯中間產物及其合成，最後給出合成實例及結合物的生物學性能。
抗體應當認識到，本發明的藥物結合物的功能是由藥物的生物學效能和抗體的抗原選擇性決定的。所選擇的抗體應當識別與將要傳遞特殊藥物的細胞相結合的抗原。例如，如果藥物是抗腫瘤的，則所選擇的抗體應當識別與腫瘤細胞相結合的抗原。如果藥物是抗細菌的，例如一種頭孢菌素，則應當選擇識別細菌抗原的抗體。根據所用藥物的特性，在一給定條件下可優先選擇被細胞內化的抗體，或可以優先使用通過識別表面抗原而保留在細胞表面的抗體。
抗體的來源對於本發明並不是重要的。它可以從免疫球蛋白的任何一類或亞類中選擇，包括IgG、IgA、IgM、IgE和IgD。同樣，來源的種也不是重要的，只要抗體能定靶於藥物可發揮作用的細胞就行。
在現有技術中，藥物結合物中使用最多的是單克隆抗體，本發明也優先使用它們。但並不排除多克隆抗體。一種更新的抗體是嵌合抗體，它是由實驗室重組技術製備的，該技術能夠表達修飾過的DNA分子，這種分子可編碼任何所需抗體的抗原結合區，並且還可編碼任何其他的所需胺基酸順序。因此，本發明可以得到並使用這樣的嵌合抗體。其中一部分來自一個種，另一部分來自另一個種。
抗體的來源和特性並不是重要的，只要它能定靶於待治療的細胞並對病人無毒性就行。普通技術人員很容易用候選抗體製備結合物並對其作出評價。為方便起見，下面將討論評價抗體和結合物的方法。首先，抗體應當由足夠穩定的雜交瘤產生，以製備足夠數量的抗體。抗體本身應當能經受純化過程，尤其應當有足夠的水溶性，以能夠用需要的濃度進行化學操作。
首先評價用候選抗體製備的結合物的抗原結合能力。游離抗體的結合能力可能會有可以接受的適度下降。然後，測定結合物針對抗原陽性細胞的體外效能，例如抗癌藥物的細胞毒性。在同樣的檢測中，有效結合物的效能可能比游離藥物的稍低，這是因為它能夠將藥物高濃度地集中於細胞。然後，根據Johason和Laguzza的方法(CancerRes.47∶3118-22，1987)，利用裸鼠人腫瘤異體移植模型評價通過了前兩種測試的結合物。在裸鼠中測試候選結合物時，應當與游離藥物、游離藥物與游離抗體的混合物、與非定靶免疫球蛋白的結合物作比較，候選結合物應當比它們有更好的效能或安全性。在異體移植模型中應當進行劑量範圍的研究。
再對異體移植模型中有效的結合物進行動物測試，已知所用動物能表達與人體相似形式的抗原。如果結合物在這種測試中與抗原有顯著的結合作用，並且如果它在由上述異體移植模型預測有治療效應的劑量下基本上沒有毒性，則此候選結合物可被認為是具有治療潛力的。
應當理解，正確選擇的抗體片段與完整抗體具有相同的效應。因此在實施本發明時，識別與待治療細胞相結合抗原的抗體片段，尤其是F(ab′)2片段，可與完整抗體一樣使用。
式Ⅰ中並未給出連接基團與抗體反應並附著於抗體的嚴格的機理，因為這一點並不十分清楚。如下所示，該反應也許是醯化作用，抗體分子上有若干可進行醯化作用的位點。通常認為，抗體的醯化作用發生於賴氨酸殘基的游離氨基上。然而，醯化作用也能開始於羥基、苯酚基、咪唑環及其他基團。
式Ⅰ指出，有1至大約10個連接子-藥物半分子附著於抗體的每個分子。當然，每個抗體分子上的這種半分子數目是平均數，因為，在一批給定的結合物所含的分子中，藥物-連接子與抗體的比例必定落在一個範圍中。如果使每個抗體分子上附著若干藥物分子，則當然能使價格昂貴的抗體得到最大效率的使用。但是，附著過多的藥物-連接子半分子，通常會使抗體識別和結合其抗原的能力受到不利影響，因此必須找到一個合適的m值。一般說來，優選的m值為大約4至大約10;另一優選值為大約3至大約8。
有大量的抗體可為免疫學家用於本發明中，在每一期的有關雜誌中，都正在公開進一步有用的抗體。不可能也沒必要窮舉能夠用於本發明的抗體。普通的免疫學家和化學家完全能夠從下述來源選擇抗體，例如美國典型培養物收集中心目錄(Rockville，Mayland，U.S.A.)和Linscott′sDirectoryofImmunologicalandBiologicalReagents(Linscott′sDirectory出版，40GlenDrive，MillValley，California，U.S.A.94941)。因此，本領域的普通技術人員很容易選擇針對幾乎任何決定基的抗體，例如腫瘤、細菌、真菌、病毒、寄生蟲、支原體，或組織相容性抗原，以及病原體表面抗原、毒素、酶、變應原和與生理重要細胞相關的其他類型的抗原。
本發明最優選的用途是將細胞毒性藥物傳遞給癌細胞，尤其包括鱗狀癌細胞、腺癌細胞、小細胞癌細胞、glyoma細胞、黑素瘤細胞、腎細胞癌細胞、移行細胞癌細胞、肉瘤細胞、支持腫瘤維管結構的細胞、淋巴類腫瘤細胞如白血病和淋巴瘤。可以得到定靶於所有這些細胞的合適抗體，在Linscott中可找到其來源。另外，通過常規方法生產這種抗體的必需雜交瘤可得自ATCC和其他的細胞系收集中心。
目前已知的若干抗體尤其適用於本發明的抗腫瘤方面。例如，一個優選的特異抗體是L/1C2，由ATCC雜交瘤HB9682產生。
另一種有用的抗體是KS1/4，它是首先由Varki等人公開的(CancerResearch44∶681-86，1984)。含有單克隆抗體KS1/4不同區域編碼順序的若干質粒現在已經保藏，並可從北方地區研究實驗室(NorthernRegionalResearchLaboratoryPeoria，IL，USA)得到。普通技術人員能夠使用這些質粒通過重組技術生產嵌合抗體，該抗體與以高密度存在於腺癌細胞上的表面抗原結合。1989年4月18日提交的歐洲專利申請89303814.1詳細討論了這種抗體的構建方法。下述質粒涉及KS1/4。
質粒pGKC2310，輕鏈、與輕鏈結合的信號肽及5′和3′非轉譯區的編碼順序，分離自大腸桿菌K12MM294/pGKC2310(NRRLB-18356)。
質粒pG2A52，重鏈的編碼順序、與重鏈結合的信號肽及5′和3′非轉譯區的編碼順序;分離自大腸桿菌K12MM294/pG2A52(NRRLB-18357)。
質粒CHKC2-6，輕鏈可變區的編碼順序、與輕鏈結合的信號肽的編碼順序、以及人IgG輕鏈恆定區的編碼順序;分離自大腸桿菌K12DH5/CHKC2-6(NRRLB-18358)。
質粒CHKC2-18，衍生的輕鏈可變區的編碼順序、與輕鏈結合的信號肽的編碼順序以及人IgG輕鏈恆定區的編碼順序;分離自大腸桿菌K12DH5/CHKC2-18(NRRLB-18359)。
質粒CH2A5，重鏈可變區的編碼順序、與重鏈結合的信號肽的編碼順序及人IgGl的重鏈恆定區的編碼順序;分離自大腸桿菌K12MM294/CH2A5(NRRLB-18360)。
質粒CH2A5IG2，重鏈可變區的編碼順序、與重鏈結合的信號肽的編碼順序以及人IgG2的重鏈恆定區的編碼順序;分離自大腸桿菌K12DH5/CH2A5IG2(NRRLB-18361)。
質粒CH2A5IG3，重鏈可變區的編碼順序、與重鏈結合的信號肽的編碼順序以及人IgG3的重鏈恆定區的編碼順序;分離自大腸桿菌K12DH5/CH2A5IG3(NRRLB-18362)。
質粒CH2A5IG4，重鏈可變區的編碼順序、與重鏈結合的信號肽的編碼順序以及人IgG4的重鏈恆定區的編碼順序;分離自大腸桿菌K12DH5/CH2AIG4(NRRLB-18363)。
由ATCC雜交瘤HB21產生的抗體5E9Cll識別轉鐵蛋白受體，後者可由許多腫瘤表達。可由國立癌症研究所得到的稱為B72.3的抗體識別由乳腺和結腸癌表達的抗原。
OKT3和OKT4是兩種具有針對非腫瘤抗原有反應活性的有用抗體，它們分別與外圍T細胞和人體T輔助細胞結合。它們分別由保藏於ATCC的雜交瘤CRL8001和CRL8002產生。
下面列出了可用於不同治療目的的抗體的其他來源。可用於免疫調節和腫瘤治療的抗人淋巴細胞和單核細胞抗體，由ATCC培養物HB2、HB22、HB44、HB78和HB136產生。可用於腫瘤治療的抗轉鐵蛋白受體抗體，由ATCC培養物HB84產生。ATCC培養物HB8059產生針對結直腸癌單唾液醯神經節苷脂的抗體;培養物HB8136產生針對成熟的人T細胞表面抗原的抗體，它可用於免疫調節和T細胞白血病的治療。
更進一步，ATCC雜交瘤HB9620將產生一種方便的抗癌胚抗原的抗體CEM231.6.7。
免疫學家或本領域的普通技術人員，藉助於本領域的公知出版物和上述指導性實例和描述，可以方便地選擇一種抗體，以將任何合適的藥物定靶傳遞至需用該藥物治療的任何細胞。
藥物應當理解，本發明的實質是通過上述丙二酸酯連接子連接藥物和抗體的方法，而藥物和抗體都不限制本發明。因此，本發明的丙二酸酯連接子可有利地用於任何治療或預防目的的藥物，而只受到這樣的限制即藥物必須具有與丙二酸酯連接的化學功能團，以及抗體必須定靶於該藥物能發揮有益作用的細胞。本發明提供的亞甲基連接機理需要藥物具有可參與反應的氨基、羥基或硫醇功能團。進一步，藥物必須具有這樣的特性，即可參與反應的功能團與連接子的反應不會破壞藥物的活性。
因此，本發明的連接子可用於幾乎所有種類的藥物的連接，例如包括抗菌劑、抗病毒劑、抗真菌劑、抗癌藥物、抗支原體藥物等。這樣構建的藥物結合物能有效地實現相應藥物的效力，並具有更優越的效能，因為抗體能夠將藥物傳遞給特別需要此藥物的細胞。
美國專利4，671，958提供了可進行藥物連接的藥物和其他化合物的信息，該專利中有關藥物的公開被作為本發明的參考文獻。
如前所述，藥物通過其氨基、羥基或硫醇基團反應。這些術語是以其擴展意義使用的;也就是說，術語「氨基」包括作為羧基醯胺、醯肼、氨基甲酸酯等的一部分的氨基，以及簡單地附著於碳氫化合物結構上的氨基。一個氨基上可以有第三個小的取代基，只要該基團不產生阻止與丙二酸酯反應的空間障礙就行。這種基團可以是例如直鏈烷基等。
同樣，羥基或硫醇基可以是羧酸或硫代酸的一部分。
雖然本發明包括使用任何化學類型以及任何治療或預防效能的藥物，但優選使用具有可參與反應的氨基的藥物。更優選使用氨基是醯肼或醯肼半分子一部分的藥物。
用於本發明的最有效的藥物是細胞毒性藥物，尤其是那些用於治療癌症的藥物。一般說來，這種藥物包括烷基化劑、抗增殖劑、微管蛋白結合劑等。優選的細胞毒性藥物包括例如柔毛黴素類藥物、長春花鹼藥物、絲裂黴素、博菜黴素、細胞毒性核苷、蝶啶類藥物、及鬼臼毒素等。而這些藥物中特別有用的藥物包括例如阿黴素、柔毛黴素、氨基蝶啶、氨甲蝶呤、甲蝶呤、二氯氨甲蝶呤、絲裂黴素C、甲基絲裂黴素、5-氟尿嘧啶、6-巰基嘌呤、阿糖胞苷、鬼臼毒素、鬼臼乙叉甙、苯丙氨酸氮芥、長春花鹼、長春新鹼、長春西定、長春花鹼醯胺、長春素等。應當理解，為了使反應更為方便地進行，普通專業人員可對優選的和一般的化合物作一些適當的化學修飾。
還應當理解，優選的結合物是由優選的藥物製備的。
本發明中作為藥物使用的一組更為高度優選的細胞毒性藥物包括具有下列式子的藥物。
其中R5是氫或羥基;
其中R6是氨基或羥基;
R7是氫或甲基;
R8是氫、氟、氯、溴或碘;
R9是羥基或構成羧酸鹽的半分子;
其中R10是氫或甲基;
其中R11是氨基、C1-C3烷基氨基、二(C1-C3烷基)-氨基或C4-C6眾亞甲基氨基;
其中，一個R12是一個鍵，而其他的則是氫;
其中R13是氫或甲基;
R14是甲基或噻嗯基;
其中R15是H、CH3或CHO;R17和R18單獨看待時，R18是H，R16和R17之一是乙基，另一個則是H或OH;當R17、R18與它們與之結合的碳原子一起看待時，它們構成一個環氧乙烷環，此時R16是乙基;R19是氫、(C1-C3烷基)-CO或氯取代的(C1-C3烷基)-CO;
p是0或1;
R20是一個鍵或(C2-C4烷基)-X;
X是-O-、-S-或-NH-;
其中R21是一個具有下式的鹼基
其中R22是氫、甲基、溴、氟、氯或碘;
R23是-OR12或-NHR12;
R24是氫、溴、氯或碘。
在以上的優選結構式中，式Ⅴ的化合物代表柔毛黴素(或亞德裡亞黴素)組的化合物，式Ⅵ代表氨甲蝶呤組的化合物;式Ⅶ代表絲裂黴素;式Ⅷ代表博菜黴素;式Ⅸ代表苯丙氨酸氨芥;式Ⅹ代表6-巰基嘌呤;式Ⅺ代表阿糖胞苷;式Ⅻ代表鬼臼毒素;式ⅩⅢ代表長春花鹼藥物;式ⅪⅤ代表二氟核苷。
在這些優選的藥物中，最優選的是長春花鹼藥物和柔毛黴素類的藥物;另一類優選的藥物包括長春花鹼藥物、柔毛黴素類和氨甲蝶呤類。
另一類優選藥物包括6-巰基嘌呤、二氟核苷和阿糖胞苷。還有一類優選藥物包括二氟核苷、長春花鹼藥物和柔毛黴素藥物。
優選藥物中的另一優選組包括通過氨基連接的那些藥物。
用於本發明中的長春花鹼藥物是本領域內已知的，尤其可參閱Cullinan等人和Trouet等人的各種專利和出版物。關於本發明中所用長春花鹼藥物的合成，尤其可以參見Cullinan的4，203，898號美國專利。
最高度優選的藥物是上述式ⅩⅢ的長春花鹼化合物。應當理解，結構式所包括的化合物是具有若干不同普通名或俗名的藥物或其衍生物。因此，為了簡化長春花鹼藥物的複雜命名，它們在本申請文件中將作為長春花鹼的衍生物命名。應當理解，長春花鹼即是上式的化合物，其中，R15是甲基，R16是乙基，R17是羥基，R18是氫，R19是乙醯基，而C23處的羰基是甲酯的形式，而不是上面所示的羧基醯胺。
下表給出了一些本發明中所用的長春花鹼藥物。
表ⅠR15R16R17R18R19P R20H H C2H5H H O -CH3C2H5OH H H 0 (CH2)2O-CHO C2H5H H COCH31 -CHO OH C2H5H COC2H51 (CH2)3S-CH3C2H5環氧乙烷 COCH(CH3)21 (CH2)4NH-H C2H5H H COCH2Cl 0 (CH2)2NH-CH3C2H5環氧乙烷 COCHClCH2Cl 1 CH2CH2(CH3)CH2O-H C2H5環氧乙烷 COCCl31 C(CH3)2CH2O-CHO OH C2H5H CO(CH2)2CHCl20 C(CH3)CH2CH2NH-CH3H C2H5H H 0 (CH2)2S-CH3C2H5OH H H 1 CH(CH3)CH2NH-美國專利4，692，434記載的二氟核苷提供了若干能夠通過氨基或羥基與連接基團反應的位置。一種尤其優選的式ⅩⅣ的藥物是2′-脫氧-2′，2′-二氟胞苷，它也可以命名為1-(2-氧代-4-氨基-1H-嘧啶-1-基)-2-脫氧-2，2-二氟核糖。應當理解，該化合物可以在5′-羥基、3-羥基或鹼基上的氨基處反應以形成結合物。
由於二氟核苷在本領域中相對來說比較新，為了確保理解給出下面一組二氟核苷。
1-(5-甲基-2，4-二氧-1H，3H-嘧啶-1-基)-2-脫氧-2，2-二氟核糖1-(2，4-二氧-1H，3H-嘧啶-1-基)-2-脫氧-2，2-二氟核糖
1-(5-溴-2，4-二氧-1H，3H-嘧啶-1-基)-2-脫氧-2，2-二氟核糖1-(5-氯-2，4-二氧-1H，3H-嘧啶-1-基)-2-脫氧-2，2-二氟核糖1-(5-碘-2，4-二氧-1H，3H-嘧啶-1-基)-2-脫氧-2，2-二氟核糖1-(4-氨基-5-氯-2-氧-1H-嘧啶-1-基)-2-脫氧-2，2-二氟核糖1-(4-氨基-5-溴-2-氧-1H-嘧啶-1-基)-2-脫氧-2，2-二氟核糖1-(4-氨基-2-氧-1H-嘧啶-1-基)-2-脫氧-2，2-二氟核糖1-(4-氨基-5-甲基-2-氧-1H-嘧啶-1-基)-2-脫氧-2，2-二氟核糖1-〔5-(2-溴乙烯基)-4-羥基-2-氧-1H-嘧啶-1-基〕-2-脫氧-2，2-二氟核糖1-〔4-氨基-5-(2-溴乙烯基)-2-氧-1H-嘧啶-1-基〕-2-脫氧-2，2-二氟核糖1-〔4-氨基-5-(2-碘乙烯基)-2-氧-1H-嘧啶-1-基〕-2-脫氧-2，2-二氟核糖1-〔5-(2-氯乙烯基)-4-羥基-2-氧-1H-嘧啶-1-基〕-2-脫氧-2，2-二氟核糖1-〔4-羥基-5-(2-碘乙烯基)-2-氧-1H-嘧啶-1-基〕-2-脫氧-2，2-二氟核糖
1-〔4-氨基-5-(2-氯乙烯基)-2-氧-1H-嘧啶-1-基〕-2-脫氧-2，2-二氟核糖1-(2-氨基-6-氧-1H，9H-嘌呤-9-基)-2-脫氧-2，2-二氟核糖1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2-脫氧-2，2-二氟核糖1-(5-氟-2，4-二氧-1H，3H-嘧啶-1-基-2-脫氧-2，2-二氟核糖1-(2，4-二氧-1H，3H-嘧啶-1-基)-2-脫氧-2，2-二氟木糖1-(5-溴-2，4-二氧-1H，3H-嘧啶-1-基)-2-脫氧-2，2-二氟木糖1-(5-氯-2，4-二氧-1H，3H-嘧啶-1-基)-2-脫氧-2，2-二氟木糖1-(5-碘-2，4-二氧-1H，3H-嘧啶-1-基)-2-脫氧-2，2-二氟木糖1-(4-氨基-5-氟-2-氧-1H-嘧啶-1-基)-2-脫氧-2，2-二氟核糖1-(4-氨基-5-氯-2-氧-1H-嘧啶-1-基)-2-脫氧-2，2-二氟木糖1-(4-氨基-2-氧-1H-嘧啶-1-基)-2-脫氧-2，2-二氟木糖1-(4-氨基-5-氟-2-氧-1H-嘧啶-1-基)-2-脫氧-2，2-二氟木糖1-(4-氨基-5-甲基-2-氧-1H-嘧啶-1-基)-2-脫氧-2，2-二氟木糖1-〔5-(2-溴乙烯基)-4-羥基-2-氧-1H-嘧啶-1-基〕-2-脫氧-2，2-二氟木糖1-〔4-氨基-5-(2-溴乙烯基)-2-氧-1H-嘧啶-1-基〕-2-脫氧-2，2-二氟木糖1-〔4-氨基-5-(2-碘乙烯基)-2-氧-1H-嘧啶-1-基〕-2-脫氧-2，2-二氟木糖1-〔5-(2-氯乙烯基)-4-羥基-2-氧-1H-嘧啶-1-基〕-2-脫氧-2，2-二氟木糖1-〔4-羥基-5-(2-碘乙烯基)-2-氧-1H-嘧啶-1-基〕-2-脫氧-2，2-二氟木糖1-〔4-氨基-5-(2-氯乙烯基)-2-氧-1H-嘧啶-1-基〕-2-脫氧-2，2-二氟木糖1-(2-氨基-6-氧-1H，9H-嘌呤-9-基)-2-脫氧-2，2-二氟木糖1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2-脫氧-2，2-二氟木糖。
由下列限制所描述的化合物是尤其優選的長春花鹼藥物。下面的各種不同限定能夠結合起來，以形成進一步更加限制的優選類別。
A.R15是甲基;
B.R15是氫或甲醯基;
C.R16是乙基;
D.R18是氫;
E.R16和R17之一是乙基，另一者是氫或羥基;
F.R17是羥基;
G.R19是氫;
H.R19是乙醯基;
I.R19是C1-C3烷基-CO;
J.P是l;
K.R20是一個鍵;
L.R20是(C2-C4烷基)-X;
M.P是O;
N.X是-NH-;
O.X是-O-或-S-;
P.R20是乙氧基，乙基硫或乙氨基;
Q.R20是一個鍵;
R.R20是(C2-C4烷基)-NH-。
中間產物本發明的中間產物丙二酸酯是與抗體和藥物反應所產生的中間產物。因此，中間產物丙二酸酯是使抗體與藥物結合的連接子的前體;因此，優選的中間產物丙二酸酯將其結構賦予優選的結合物。
此中間產物是丙二酸的衍生物，根據已知方法或者普通的有機化學專業人員很容易想像的方法製備。但為了保證使讀者理解，下面根據不同的基團給出了一組化合物。
下面是優選的中間產物丙二酸酯的不同亞組。應當理解，優選的亞組可以結合起來以形成進一步限制的優選組。
A.R4是C2-C3烷氧基;
B.R4是乙氧基;
C.R2是羥基或形成鹽的半分子;
D.R2是一個保護基團;
E.R2是一個通過氧原子連接的保護基團;
F.R2是一個通過氮原子連接的保護基團;
G.R2是一個烷氧基;
H.R2是一個氨基或烷基氨基;
I.R3是一個活化基團;
J.R3是一個保護基團;
K.R3是羥基或形成鹽的半分子;
L.R3是N-琥珀醯亞胺氧基、N-苯二甲醯亞胺氧基或N-苯並三唑氧基;
M.n從1至大約3;
N.n從1至大約6;
O.n從大約3至大約8;
P.n從大約5至大約8;
Q.Y是-O-;
R.Y是-NH-;
S.Y是-NCH3-或-NC2H5-。
修飾抗體修飾抗體是製備給合物的中間產物，它由除藥物外的全體結合物構成。它們是通過中間產物丙二酸酯與抗體反應而製備的，所用方法將在本文下面的合成部分中描述。
優選的修飾抗體是由優選的各組丙二酸酯中間產物與優選抗體反應而製備的。為了便於理解，下面將給出一組典型的修飾抗體。由於很難對這些複雜分子命名，因此這些化合物不是用其化學名稱，而是通過其組成的變化加以鑑別。此處提及的抗體是免疫學領域公知的。
〔表Ⅲ見27頁〕衍生藥物本發明的衍生藥物是中間產物，通過使藥物與中間產物丙二酸酯反應而形成，它用來通過與抗體反應而形成結合物。在上面的衍生藥物的定義式中，R、R1、R3、Y和n的廣泛定義和優選意義與上面討論的一樣，但應當清楚地理解，通過選擇不同的所需可變基團，尤其是優選的中間產物丙二酸酯，能夠製備任何所需的或優選的衍生藥物。衍生藥物按下面合成部分討論的方法製備。
合成有機化學家們將會理解，在本合成的許多步驟中，必須保護起始化合物和中間產物上的各種反應基團，當所需的反應在其他反應基團上進行時。而反應結束以後，則一般需要去除這些保護基團。這種保護和去保護作用在有機化學中完全是常規方法，本申請文件中無須對此多加說明。但應注意，在上述Greene的關於保護基團的教科書中，詳細說明了所有常規的反應基團的保護基，包括羥基、硫醇基、氨基等，並概述了安置和去除這些保護基的方法。
中間產物丙二酸酯的合成根據一般常識和普通文獻，一個普通的有機化學工作者就能夠制
備任一種中間產物丙二酸酯。但優選的製備方法是以丙二酸衍生物為起始，其中在一個羧基上有一個羧酸保護基，R2。另一個羧基可以相同或不同的方式取代。在不同的情況下，非R2基必須比R2基更易去除。使起始化合物與滷代鏈烷酸酯或氨基鏈烷酸酯反應，其烷基鏈的長度提供了幾個亞甲基。滷代鏈烷酸酯用來製備Y是氧的中間產物，以產生一個酯鍵連接。這時滷素原子(或其他易去除基團)位於鏈的端部。氨基鏈烷酸酯中的氨基位於鏈的端部，它用來製備Y是氨基的中間產物。鏈烷酸酯的酯部分是一個酸保護基，R3。
該反應如下進行去除起始化合物和非R2基，然後使這樣形成的羧酸基與鏈烷酸酯反應。通過初始還原已成功地進行了此反應，例如，在環己二烯的存在下使用加氫催化劑。另外，可在合適的催化劑(例如貴重金屬催化劑)存在下使用加氫作用。
也可以通過用強鹼分解非R2酯而進行反應，尤其是使用在含水溶劑(如含水丙酮)中的氫氧化鋰。羧酸根形成以後，加入滷代鏈烷酸酯，則中間產物丙二酸酯迅速形成，尤其是在一種酸清除劑的存在下。然而，如果用氨基鏈烷酸酯進行反應，則應當通過加入一種上述的活化基團而使羧酸根活化，然後進行反應以形成丙二酸酯。
上述反應形成中間產物丙二酸酯，在R3上有一個酸保護基，但缺失R4-CH＝部分。該基團(即烷氧亞甲基)通過使第一個中間產物與適當的烷基原甲酸酯在路易斯酸(例如氯化鋅)存在下反應而插入。該反應在較高的溫度下進行，範圍為100-200°，反應在幾小時內完成。
在上述反應中，以及在下述的其他方法中，無須使用大為過量的起始化合物。就象有機化學中的一般情況那樣，最好使用適度過量的相對廉價的反應劑，以確保更為昂貴的反應劑被完全消耗。在與抗體本身反應時這一原則尤為重要，因為抗體一般都相當昂貴並難於製備和純化。但一般說來，過量反應劑的選擇應考慮到使該方法最為經濟，既要考慮到成分的費用還要考慮設備的生產能力，不應僅僅為了促使反應的發生而使用過量的反應劑。
與藥物的反應使中間產物丙二酸酯與藥物在這樣的條件下反應該條件能使烷氧基R4切除，而使剩餘的亞甲基與藥物的活性氨基、羥基或硫醇基反應。一般說來，反應在溫和條件下進行，從0°左右到50℃左右，在不與任一種反應劑反應的有機溶劑或這種有機溶劑的含水混合物中進行，並且通常存在有溫和鹼例如鹼金屬碳酸氫鹽、碳酸鹽和氫氧化物。反應一般是定量的，不需要大為過量的反應劑。但產物的分離可能需要在高壓下層析或其他的複雜方法，因為非常小心地純化衍生藥物通常是很要的。由於衍生藥物要與抗體反應才能構成結合物，因此伴隨衍生藥物的任何活性雜質都將消耗抗體的反應位點，從而浪費耗資昂貴而製備的抗體。
在藥物具有多重反應位點的情況下，例如具有多羥基的核苷，通常必須阻斷藥物上不想使用的反應基團。這種阻斷通過討論過的保護基進行，這對於有機化學家來說並沒有特殊的困難。
羧酸保護基R3可在與藥物反應之前或之後從中間產物丙二酸酯上除去。如果必須在藥物上使用保護基，則完全能夠在除去R3保護基的同樣條件下除去這些基團，從而以雙倍的效率利用了去保護步驟。
修飾抗體的合成使抗體與活性形式的中間產物丙二酸酯反應，即中間產物丙二酸酯的R3基團是上面說明過的羧酸活化基團。活化基團是通過使用常規的酯化劑如碳化二亞胺而連在羧酸(R3是氫)上的，尤其是二環己基碳化二亞胺。這種反應是在通過適當的方法(根據所用的保護基)除去酸保護基R3後進行的。與活化基團的反應是在惰性有機溶劑中進行的，例如二噁烷、四氫呋喃、氯化碳氫化合物等，並可在0-50°的適度溫度下進行。
在選擇使中間產物丙二酸酯與抗體反應的條件時，主要應考慮維持抗體的穩定性。反應必須在含水基質中進行，其組成不應傷害抗體。一種尤其合適的含水基質是硼酸緩衝液，其中，硼酸鹽離子的濃度在0.1-0.5M的範圍內。另一種可進行反應的合適的含水基質是生理緩衝鹽水。反應基質的pH應是微鹼性，在大約7-9的範圍內。雖然反應基質應是水溶液，但少量有機溶劑的存在沒有壞處，也許還非常有益。例如，最好是將中間產物丙二酸酯溶於少量有機溶劑例如二甲基甲醯胺、乙腈、四氫呋喃、二噁烷或乙二醇醚中，並將有機溶液加至在基質水溶液中的抗體溶液中。
一般說來，必須以相對較低的濃度進行反應，因為抗體的溶解度一般都較低。例如，抗體濃度一般在大約5-25mg/毫升基質水溶液。
如上所述，每摩爾抗體結合有大約1至10摩爾的連接子和藥物。為了達到這一結合比例，通常需要使用過量的連接子中間產物。抗體與活性酯在醯化條件下的反應活性略有不同，但一般說來，在該方法中，每摩爾抗體使用大約5至15摩爾左右的連接子中間產物。
使醯化反應在大約0°至40°左右的溫度下進行幾分鐘至幾小時。顯而易見，較高的溫度可能傷害抗體，因此最好在低溫下進行反應，尤其是該反應本身很迅速。
製備好了具有連接基團的衍生抗體後，則如下面的實例所示，通過常規方法層析反應混合物，以從未反應的連接子中間產物中分離出衍生抗體。
結合物的合成製備好修飾藥物後，作為結合物製備的最後一步，使之與抗體反應，上述涉及與抗體反應時應注意的地方在這兒是完全適用的。選擇抗體用量和衍生藥物用量之間的比例時遵循同樣的原則。一般說來，反應條件的選擇必須考慮抗體的穩定性，因為藥物可望忍受任何抗體能忍受的條件。
衍生藥物必須轉化為活性形式，即R3處是羧酸活化基團，轉化反應在如上所述的修飾抗體合成條件下進行。
另一方面，製備好修飾抗體後，最後一步是使之與藥物反應，必須小心確保抗體的穩定性。
因此，優選的方法是製備衍生藥物，然後作為最終步驟使之與抗體反應。修飾抗體與藥物的反應必須在較低溫度下進行，例如從0°至40°左右，在抗體能夠接受的基質中進行。例如，尤其合適的反應基質是硼酸緩衝液，尤其是pH為大約7至9的0.1-0.5M硼酸鈉緩衝液。但反應也可以在硼酸緩衝液、微酸性磷酸緩衝液、生理鹽水等中進行。反應基質中有少量有機溶劑沒有害處，如上所述，只要該溶劑沒有損傷抗體的傾向就行。
最後，常規地通過層析法分離和純化藥物結合物。有可能從層析基質中洗脫出適用於病人所需濃度的結合物。但在通常情況下，結合物是以其溶解度允許的最高濃度通過層析而純化的，可用任何適宜的溶劑洗脫，但最優選使用生理鹽水。通常使洗脫液冷凍乾燥，以提供穩定的乾燥形式的結合物，它能夠安全地貯存和銷售，並且最終能與無菌水重新配製以進行施用。
下述的製備和實例進一步說明了本發明各種中間產物和結合物的合成。
製備1苄氧基羰甲基乙基丙二酸酯在裝有攪拌器的圓底燒杯中加入400ml丙酮和50g二乙基丙二酸酯。形成溶液後，加入200ml水，然後加入156ml2N氫氧化鋰溶液。混合物於室溫下攪拌30分鐘，然後在真空下濃縮成固體。在其中加入350ml二甲基亞碸，攪拌混合物，同時加入71.5g苄基2-溴乙酸酯。然後使混合物於室溫下攪拌3小時，再用1000ml乙酸乙酯和鹽水萃取，萃取液用鹽水洗滌2次。萃取液在硫酸鈉上乾燥，過濾後在真空下濃縮過夜，產生76.4g粘液，使之在0.1mm汞柱下蒸餾，產生18.8g基本上純化形式的所需中間產物。
製備2苄氧基羰基甲基乙基丙二酸酯在裝有攪拌器的燒杯中加入60ml無水乙醇，使5g氫化催化劑鈀碳懸浮於其中，加入25g苄基乙基丙二酸酯和16ml1，4-環己二烯。混合物攪拌1.5小時，然後過濾，濾液在真空下濃縮成漿液。在殘渣中加入60ml二甲基甲醯胺和15.6ml三乙基胺，然後加入17.7ml苄基2-溴乙酸酯。混合物於室溫下攪拌1小時，然後用600ml乙酸乙酯和鹽水萃取，萃取液用飽和的碳酸氫鈉溶液、用鹽水、用10%檸檬酸溶液、用鹽水並再用飽和的碳酸氫鈉和鹽水洗滌。洗滌過的萃取液在硫酸鎂上乾燥，過濾後在真空下濃縮，得到28.2g純化的所需中間產物，它在薄層層析上只有一個物質點，用1∶1的乙酸乙酯∶己烷洗脫，Rf＝0.55。質譜結果為m/e＝280。
製備3苄氧基羰甲基乙基2-乙氧基亞甲基丙二酸酯在裝有攪拌器的燒杯中加入11.1ml乙酸酐，使10g製備1的產物溶於其中，加入7.8ml三乙基原甲酸酯。混合物在140-50°下加熱6.5小時，然後真空下除去揮發物質。殘渣溶於11.1ml乙酸酐和7.8ml三乙基原甲酸酯中，加入50mg氯化鋅。然後，混合物於140-150°下加熱回流16小時，然後冷卻，用600ml乙酸乙酯和鹽水萃取，用2份鹽水洗滌。洗滌過的萃取液在硫酸鎂上乾燥，過濾和濃縮，殘渣溶於最少量的乙酸乙酯中，將此溶液與己烷攪拌。使此溶液通過充滿矽膠的漏鬥，用1升含10%乙酸乙酯的己烷洗脫，然後再用1升含20%乙酸乙酯的己烷洗脫。所需產物在另外2升含20%乙酸乙酯的己烷中得到，使之在真空下濃縮，得到4.9g無色漿液，它基本上是純化的所需產物。
分析計算C，60.71;H，5.99;
測得C，60.98;H，6.03;
製備4羧甲基乙基2-乙氧基亞甲基丙二酸酯在裝有攪拌器的燒杯中加入15ml無水乙醇，使1g氫化催化劑鈀碳懸浮於其中，加入4.9g在10ml乙醇中的製備3產物的溶液，然後加入2.8ml1，4-環己二烯。將混合物攪拌5分鐘，然後加熱至45°，在這一點開始放熱。然後除掉加熱，混合物攪拌45分鐘，在此時達到室溫。然後使混合物過濾，在真空下濃縮後得到3.6g黃色液體，它通過質譜鑑別即是所需的中間產物。m/e＝246。
製備5羧甲基乙基2-亞甲基丙二酸酯的阿黴素加成物此製備的產物是加成物，其中，阿黴素通過道諾胺環(daunosaminering)的氨基與中間產物丙二酸酯的亞甲基連接。
在圓底燒杯中加入134mg阿黴素鹽酸和8.5ml二甲基甲醯胺，加入1ml水以溶解藥物。加入264mg製備4的產物(在0.5ml二甲基甲醯胺的溶液中)，混合物攪拌10分鐘。然後加入含有115mg碳酸氫鈉的1.25ml水溶液，混合物於室溫下攪拌2小時。在真空下除去揮發物質，殘渣溶於最少量的0.1M乙酸鈉緩衝液(pH5.4)中。溶液加到C18(J.T.Baker，Phillipsburg，N.J.)快速層析柱(1.75×6cm)中，柱子用含有增量甲醇的乙酸緩衝液洗脫。在含有50%以上甲醇的組分中得到所需產物，合併含有產物的組分並在真空下濃縮。殘渣溶於幾毫升水中，加到同樣的柱上，用40ml水洗脫，然後用80ml50%含水甲醇，再用20ml甲醇洗脫。所需產物在50%甲醇洗脫的組分中，使之合併後在真空下濃縮。殘渣溶於最少量的甲醇中，加入5倍體積的苯，使溶液冷凍乾燥過夜，得到146mg橙色固體，FAB質譜結果為m/e＝744。通過高效液相層析表明該產物是純化形式的，該層析法使用C18徑向柱，在5ml/分的流速和含有3%乙酸銨的70%含水甲醇下洗脫產物。
製備6乙基N-琥珀醯亞胺氧基羰基甲基2-亞甲基丙二酸酯的阿黴素加成物在裝有乾燥管和攪拌器的圓底燒杯中加入17.6mg製備5的產物，溶於1.5ml無水二甲基甲醯胺中。溶液冷卻至-5°，加入在0.1ml無水二甲基甲醯胺中的5.2μlN-甲基嗎啉，混合物於-5°攪拌5分鐘，然後加入0.1ml無水二甲基甲醯胺中的6.14ml異丁基氯甲酸酯，混合物在恆定溫度下攪拌30分鐘以上。然後加入在0.1ml無水二甲基甲醯胺中的5.45mg N-羥基琥珀醯亞胺，混合物攪拌20小時，同時使之加熱至室溫。然後在真空下濃縮成紅色殘渣，將其溶於最少體積的二氯甲烷中，加到用二氯甲烷平衡的矽膠柱上(0.75×4cm)。柱子用50ml二氯甲烷洗脫，然後用在二氯甲烷中的10%異丙醇洗脫。第二洗脫液在真空下濃縮，殘渣溶於最少體積的異丙醇中，在其中加入少量苯。使溶液凍乾燥，得到15.9mg所需產物，m/e＝742。在300mHz儀器上通過在CDCl3中的核磁共振譜(NMR)分析證實其身份，該分析在2.8ppm處顯示出N-羥基琥珀醯亞胺的信號。
實例1抗體007B與羰基甲基乙基2-亞甲基丙二酸酯的阿黴素加成物的結合物抗體007B由一雜交瘤產生，該雜交瘤是由產生抗體KS1/4的雜交瘤衍生的亞克隆，它在本說明書的上述抗體部分已討論過。在3ml的裝有攪拌器的管瓶中，加入508μl的0.34M硼酸鈉緩衝液(pH8.6)，其中抗體的含量為19.7mg/ml。將0.56mg溶於56.4μl無水二甲基甲醯胺中的製備6的產物在室溫下加至抗體溶液中，攪拌2小時。然後使混合物在室溫下離心，棄掉紅色沉澱，上清液加至用生理磷酸緩衝液平衡的1.75×25cmSephadexG-25M柱中(Pharmacia，Inc.，Piscataway，N.J.)。柱子用同樣的緩衝液洗脫，收集洗脫柱子的第一個峰。該組分通過Millex-GV(Millipore，Bedford，MA)0.22μ濾器過濾，於4°下貯存3天。然後以同樣方式再次過濾，用紫外光譜進行測定，顯示出抗體濃度為1.54mg/ml，表明回收到7.6mg結合物。結合比例為每摩爾抗體2.2摩爾藥物。
實例1A抗體007B與羰甲基乙基2-亞甲基丙二酸酯的阿黴素加成物的結合物按照實例1的方法，用7.5mg抗體和1.0mg製備6的產物開始。回收的結合物為4.94mg，結合比例為每摩爾抗體3.1摩爾藥物，形式為1.10mg/ml濃度的溶液。
實例2抗體HB21與羰甲基乙基2-亞甲基丙二酸酯的阿黴素加成物的結合物抗體HB21是由雜交瘤ATCCHB21產生。在3ml裝有攪拌器的管瓶中，加入在0.875ml上述實例1提及的硼酸緩衝液中的17.5mg抗體HB21，在其中加入溶於97.2μl無水二甲基甲醯胺中的1.3mg製備6的產物。攪拌反應液，如實例1分離結合物，得到濃度為2.57mg/ml的14.9mg結合物，結合比例為3.8。
實例2A抗體HB21與羰基甲基乙基2-亞甲基丙二酸酯的阿黴素加成物的結合物按照實例2的方法，用12mg抗體和1.30mg製備6的產物開始。過濾後的產物溶液通過真空透析而濃縮，得到含有3.25mg結合物的0.82ml溶液，結合比例為每摩爾抗體4.5摩爾藥物。
實例2B抗體HB21與羰基甲基乙基2-亞甲基丙二酸酯的阿黴素加成物的結合物按照實例2A的方法，用12mg抗體和2.60mg製備6的產物開始。產物為含有1.37mg結合物的0.72ml溶液，結合比例為每摩爾抗體5.6摩爾藥物。
實例3抗體L4KS與羰基甲基乙基2-亞甲基丙二酸酯的阿黴素加成物的結合物如Starling等人(J.Cell.Biochem.Supp.11B1982，1987)所述，抗體L4KS透析至0.34M硼酸鈉緩衝液(pH8.6)中，產生在0.875ml緩衝液中的17.5mg抗體溶液。在其中加入在97.2μl無水二甲基甲醯胺中的1.3mg製備6的產物。如實例1進行反應和分離產物，得到濃度為2mg/ml的11.6mg結合物。結合比例為每摩爾抗體2.6摩爾藥物。
實例3A抗體L4KS與羰基甲基乙基2-亞甲基丙二酸酯的阿黴素加成物的結合物重複實例3的方法，用10mg抗體和0.59mg製備6的產物開始。產物溶液通過真空透析而濃縮，得到1.16ml含有4.03mg結合物的溶液，結合比例為2.9。
製備7L/lC2抗體的生產從美國典型培養物收集中心以HB9682的保藏號得到L/lC2雜交瘤的冷凍小瓶。使小瓶在37℃水浴中旋轉而融化其內容物，收集存活細胞。細胞懸浮液用平衡鹽溶液(GrandJslandBiologicolCompany(GIBCO)，3175StaleyRoad，GrandIsland，NewYork14072)以1∶2稀釋，使懸浮液通過血清墊層離心，從冷凍基質中分離出細胞。吸出上清，沉澱中的細胞在5%二氧化碳和37℃下，懸浮於在T75組織培養瓶中的培養基中(VentrexHL-1VentrexLaboratories，Portland，ME)，該培養基補充有10%小牛血清，2mML-穀氨醯胺(GIBCO)和50μg/ml慶大黴素硫酸鹽(GIBCO)。從幾乎匯合的培養物中收集上清，通過離心去除殘留的細胞。使無細胞的上清通過蛋白ASepharose柱(Pharmacia)而從中純化抗體。抗體與柱子結合，而培養基被0.01M磷酸鈉(pH8.0)洗掉。然後用0.1M磷酸鈉緩衝液(pH3.5)從柱中洗脫抗體。洗脫的抗體立即用pH7.4的1MTrizma緩衝液(Sigma，St.Louis，MO)中和，在含有0.01M磷酸鈉(pH7.4)和0.15M氯化鈉的真空透析儀(Bio-MolecularDynamics，Beaverton，OR)中透析和濃縮。使抗體製劑通過0.2μm孔經過濾而消毒，貯存在4℃備用。
實例4抗體L/lC2與羰基甲基乙基2-亞甲基丙二酸酯的阿黴素加成物的結合物使在0.94ml0.34M硼酸鈉緩衝液中的10.1mg抗體L/lC2與在54.7μl無水二甲基甲醯胺中的0.85mg製備6的產物合併。反應混合物在室溫下攪拌1.5小時，然後如實例1分離產物，產生的溶液在大約5升生理磷酸緩衝液於4°真空透析大約16小時，得到9.16mg結合物，濃度為5.33mg/ml。結合比例為每摩爾抗體1.7摩爾藥物。
實例4A抗體L/lC2與羰基甲基乙基2-亞甲基丙二酸酯的阿黴素加成物的結合物重複實例4的方法，省掉透析步驟，用24mg抗體和1.75mg製備6的產物開始。回收到在2.69ml溶液中的8.56mg結合物，結合比例為2.8。
製備8苄氧基羰基戊基乙基丙二酸酯在裝有攪拌器的圓底燒杯中加入200ml丙酮、100ml水和25.3g二乙基丙二酸酯。在5分鐘內，向溶液中加入78.9ml2N氫氧化鋰溶液。在室溫下攪拌75分鐘後，除去揮發物質，殘渣懸浮於35ml無水二甲基甲醯胺中。向其中加入38.3g苄基6-溴己酸酯，混合物於65°攪拌20小時。然後使混合物冷卻至室溫，用1000ml乙酸乙酯和鹽水萃取。萃取液用鹽水洗滌2次，然後在真空下濃縮。液體殘渣倒在矽膠上，用500ml庚烷洗滌，用1升含10%乙酸乙酯的庚烷洗脫。然後，用1升含15%乙酸乙酯的己烷洗脫所需產物，通過真空濃縮得到22g產物。m/e＝336。
製備9苄氧基羰基戊基乙基2-亞甲基丙二酸酯在裝有冷凝器和攪拌器的燒杯中加入15g製備8的產物，再加入8.4ml三乙基原甲酸酯和8.6ml乙酸酐。然後加入48mg氯化鋅，混合物於125°攪拌16小時，然後於150-160°攪拌3.5小時。然後冷卻，萃取至600ml乙酸乙酯和鹽水中。萃取液用鹽水洗滌2次，在真空下濃縮。液體殘渣用500ml庚烷洗滌，用1500ml在庚烷中的15%乙酸乙酯，再用500ml在庚烷中的20%乙酸乙酯洗滌。然後，通過用500ml在庚烷中的40%乙酸乙酯洗脫而分離所需產物，數量為2.78g。m/e＝392。
製備105-羧基戊基乙基2-亞甲基丙二酸酯在裝有攪拌器的小瓶中，加入在2ml無水乙醇中的0.49g10%鈀碳催化劑、1g製備9的產物和1ml1，4-環己二烯。蓋上小瓶，在60°攪拌5分鐘，然後冷卻至室溫，攪拌30分鐘以上。然後過濾，使溶液在真空下濃縮。液體殘渣溶於最少體積的乙酸乙酯中，與庚烷混合，然後通過矽膠層析純化，首先用250ml含10%乙酸乙酯的庚烷洗滌，然後用250ml含30%乙酸乙酯的庚烷洗滌。500ml含50%乙酸乙酯的庚烷洗脫掉0.56g所需產物，m/e＝303。
製備115-羧基戊基乙基2-亞甲基丙二酸酯的阿黴素加成物以與上述製備5的產物相同的方法，使此處的中間產物丙二酸酯與阿黴素分子共價結合。
以與上述製備5的同樣方式進行反應，用142mg阿黴素鹽酸、159mg製備10的產物和75.5mg碳酸氫鈉開始。按製備5所述分離產物，用60ml70%甲醇的乙酸緩衝液從柱中洗脫產物。該產物如製備5所述進一步純化，得到95mg紅色固體產物，m/e＝403，398。
製備12乙基N-琥珀醯亞胺氧基羰基戊基2-亞甲基丙二酸酯的阿黴素加成物基本上如製備6所示，在N-甲基嗎啉和異丁基氯甲酸酯的存在下，使12.5mg製備11的產物與3.6mgN-羥基琥珀醯亞胺反應，得到9.7mg所需產物，m/e＝896。
實例5抗體007B與羰基戊基乙基2-亞甲基丙二酸酯的阿黴素加成物的結合物進行兩種結合反應。在每一種結合反應中，抗體007B都是0.862μl在0.34M硼酸鈉緩衝液(PH8.6)中的溶液，其中抗體的含量為17.4mg/ml。
1.加入溶於95.8μl無水二甲基甲醯胺中的1.17mg製備12的產物。
2.加入溶於95.8μl無水二甲基甲醯胺中的1.79mg同樣的中間產物。
兩種反應都在室溫下進行1.5小時，然後在1.75×25cmSephadexG-25M柱上層析。收集每一種中的含有產物的組分，通過Millex-GV0.22μ濾器過濾，在4℃下貯存16小時。再次使產物過濾，通過紫外分光光度法測定。
1.回收到濃度為1.75mg/ml的11.1mg結合物。結合比例為每摩爾抗體3.8摩爾藥物。
2.回收到濃度為1.33mg/ml的6.7mg產物，結合比例為4.5摩爾藥物/摩爾抗體。
製備13羧基戊基乙基2-(4-脫乙醯基-23-脫甲氧基長春花鹼-23-肼撐)-亞甲基丙二酸酯60.2mg4-脫乙醯基-23-脫甲氧基長春花鹼-23-肼硫酸鹽溶於1ml無水二甲基甲醯胺中，向其中加入48.6mg溶於0.5ml無水二甲基甲醯胺中的製備10產物。混合物於室溫下攪拌16小時，然後在真空下除去揮發物質。殘渣溶於最少量的甲醇中，加水使其產生15%的含水甲醇溶液。溶液加在用10%甲醇水溶液平衡的C18快速層析柱(1.5×6cm)中。柱子用濃度逐漸增高的含水甲醇洗脫，發現產物在含有60%甲醇和100%甲醇的組分中洗脫出。合併含有產物的組分並在真空下濃縮，殘渣溶於最少量的甲醇中。加入大量的苯(100ml)，使溶液冷凍乾燥後得到46mg所需中間產物，m/e＝952。
製備14乙基N-琥珀醯亞胺氧基羰基戊基2-(4-脫乙醯基-23-脫甲氧基長春花鹼-23-肼撐)亞甲基丙二酸酯36.9mg製備13的產物溶於2ml無水二甲基甲醯胺中，在10.8μlN-甲基嗎啉和8.5μl異丁基氯甲酸酯的存在下及在-20°下，使之與在無水二甲基甲醯胺中的7.56mgN-羥基琥珀醯亞胺反應5分鐘，混合物緩慢加熱至室溫，然後加熱至40°30分鐘。然後冷卻至室溫並攪拌16小時，在真空下除去揮發物質。殘渣溶於二氯甲烷中，並加到0.75×6cm矽膠柱上。柱子用20ml二氯甲烷洗脫，然後用30ml1∶1的乙酸乙酯∶二氯甲烷洗脫掉產物。洗脫液在真空下濃縮後得到28.3mg所需產物，通過NMR進行鑑別，呈現出2.88ppm處的N-羥基琥珀醯亞胺信號。
實例6抗體L4KS與羰基戊基乙基2-(4-脫乙醯基-23-脫甲氧基長春花鹼-23-肼撐)-亞甲基丙二酸酯的結合物進行兩種結合反應。在每一種結合反應中，抗體L4KS都是625μl含有16mg/ml的0.34M硼酸鈉緩衝液(pH0.6)。
1.在抗體溶液中加入0.75mg溶於51μl無水二甲基甲醯胺中的製備14的產物。
2.加入1.2mg溶於51μl無水二甲基甲醯胺中的同樣的中間產物。
兩種反應混合物都在室溫下攪拌1.5小時，然後離心分離出白色沉澱。上清都用1.75×25cmSephadexG-25M柱層析，該柱用生理磷酸緩衝液平衡並用同樣的緩衝液洗脫。收集每個柱中含有產物的組分，通過Millex-GV0.22μ濾器過濾，在4℃下貯存17天。然後以同樣方式再次過濾，通過紫外分光光度法測定。
1.回收到濃度為1.26mg/ml的6.3mg結合物，結合比例為2.5摩爾/摩爾。
2.產物為0.68mg/ml濃度的4.5mg結合物，結合比例為3.6摩爾/摩爾。
實例6A抗體L4KS與羰基戊基乙基2-(4-脫乙醯基-23-脫甲氧基長春花鹼-23-肼撐)-亞甲基丙二酸酯的結合物重複實例6的方法，用595mg抗體和57.9mg製備14的產物開始。通過真空透析濃縮產物溶液，濃縮液再次無菌過濾，得到17.8ml含有125mg結合物的溶液，結合比例為2.8摩爾/摩爾。
實例7抗體007B與羰基戊基乙基2-(4-脫乙醯基-23-脫甲氧基長春花鹼-23-肼撐)-亞甲基丙二酸酯的結合物進行3種結合反應。在每一種結合反應中，都是以0.5ml0.34M硼酸鈉緩衝液(pH8.6)的形式提供10mg抗體007B。
1.加入0.89mg在41μl無水二甲基甲醯胺中的製備14的中間產物。
2.加入1.20mg在41μl無水二甲基甲醯胺中的同樣的中間產物。
3.加入1.49mg在41μl無水二甲基甲醯胺中的同樣的中間產物。
三種反應都在室溫下攪拌1.5小時，然後離心，上清如實例6所述進行層析。收集含有產物的組分，通過紫外分光光度法測定。
1.回收到濃度為1.35mg/ml的結合物5.95mg，結合比例為3.0摩爾/摩爾。
2.回收到濃度為0.76mg/ml的結合物3.76mg，結合比例為3.6摩爾/摩爾。
3.回收到濃度為0.34mg/ml的結合物1.54mg，結合比例為6.1摩爾/摩爾。
實例7A抗體007B與羰基戊基乙基2-(4-脫乙醯基-23-脫甲氧基長春花鹼-23-肼撐)-亞甲基丙二酸酯的結合物重複實例7的方法，用396mg抗體和35.6mg製備14的產物開始。使產物真空透析和消毒過濾後得到含有307mg結合物的39.4ml溶液，結合比例為2.6摩爾/摩爾。
實例8抗體9.2.27與羰基戊基乙基2-(4-脫乙醯基-23-脫甲氧基長長春花鹼-23-肼撐)-亞甲基丙二酸酯的結合物抗體9.2.27可參見Bumol和Reisfeld(Proc.Natl.Acad.Sci.VSA79∶1245，1982)。與該抗體進行3種結合反應，在每一種反應中，都是以0.36ml0.34M硼酸鈉緩衝液(pH8.6)形式的10mg抗體開始。
1.加入0.6mg溶於41μl無水二甲基甲醯胺中的製備14的中間產物。
2.加入0.89mg溶於41μl無水二甲基甲醯胺中的同樣的中間產物。
3.加入1.2mg溶於41μl無水二甲基甲醯胺中的同樣的中間產物。
攪拌反應混合物，離心並如實例7所述層析，通過紫外分光光度法測定產物。
1.回收到濃度為0.95mg/ml的結合物5.2mg，結合比例為3.4摩爾/摩爾。
2.回收到濃度為0.32mg/ml的結合物1.5mg，結合比例為6.1摩爾/摩爾。
3.回收到濃度為0.16mg/ml的結合物0.6mg，結合比例為7.3摩爾/摩爾。
實例9抗體L/1C2與羰基戊基乙基2-(4-脫乙醯基-23-脫甲氧基長春花鹼-23-肼撐)-亞甲基丙二酸酯的結合物將2.9ml含有43mg抗體L/lC2的0.34M硼酸鈉緩衝液(pH8.6)與含有10.7mg/ml製備14中間產物的238μl無水二甲基甲醯胺溶液合併。如上述實例7進行反應，分離並測定產物。回收到濃度為0.69mg/ml的結合物9.35mg，結合比例為2.6摩爾/摩爾。
製備15乙基N-(2-苄氧基羰基乙基)丙二酸酯在100ml燒杯中加入2g5%的鈀碳氫化催化劑、10g苄基乙基丙二酸酯和8.6ml1，4-環己二烯。在室溫下攪拌混合物，在大約40分鐘後反應開始放熱。繼續攪拌，直到反應混合物再次冷卻至室溫，然後使混合物過濾，在真空下從濾液中除去溶劑。得到的漿液殘渣溶於最少量的乙酸乙酯中，倒入150ml的矽膠漏鬥中。用400ml含20%乙酸乙酯的己烷洗滌矽膠，然後用400ml乙酸乙酯洗滌所需的中間產物。洗脫液在真空下濃縮，得到5.48g作為粘液的中間產物。
上述中間產物溶於100ml無水二甲基甲醯胺中，加入並溶解4.77gN-羥基琥珀醯亞胺。然後，分步加入8.56g二環己基碳化二亞胺，反應混合物開始放熱。然後在室溫下攪拌過夜，過濾。加入8.95g苄基3-氨基丙酸酐並溶於濾液中，然後加入4.56mlN-甲基嗎啉。混合物在室溫下攪拌1.5小時，然後用乙酸乙酯和鹽水萃取混合物。有機層用10%的含水檸檬酸、鹽水、飽和的含水碳酸鈉洗滌，再用鹽水洗滌後乾燥，過濾並在真空下濃縮。漿液殘渣溶於乙酸乙酯中，加入己烷直至溶液呈現混濁。然後倒入矽膠中，用含10%、20%和30%乙酸乙酯的乙烷各200ml洗滌矽膠。然後，用600ml的含40%乙酸乙酯己烷洗脫所需產物。使產物溶液在真空下濃縮，得到5.05g淺黃色粘液狀的所需產物。用質譜進行鑑定，顯示出重293的分子離子。元素分析如下。
理論C，61.42;H，6.57;N，4.78;
測定C，61.21;H，6.31;N，4.76。
製備16乙基N-(2-苄氧基羰基乙基)-2-乙氧基亞甲基丙二酸酯5.05g製備15的產物溶於10.7ml乙酸酐中，加入7.45ml三乙基原甲酸酯。然後在混合物中加入80mg氯化鋅，在140-150°回流下攪拌混合物16小時。然後冷卻至室溫，在真空下除去揮發物質。用乙酸乙酯和鹽水萃取殘渣，有機層用鹽水洗滌後乾燥，過濾並在真空下濃縮。殘渣溶於最少量的乙酸乙酯中，通過加入己烷使溶液呈現混濁。然後倒在矽膠中，用乙酸乙酯含量逐漸升高的己烷洗脫矽膠。用30%和50%乙酸乙酯得到含有產物的組分，收集後在真空下濃縮，得到3.4g所需產物，質譜中的分子離子重為349。
製備17乙基N-(2-羧基乙基)-2-乙氧基亞甲基丙二酸酯1.64g製備16的產物加至10ml乙醇和0.5g5%鈀碳氫化催化劑中。加入0.89ml1，4-環己二烯，使混合物加熱回流，冷卻後在室溫下攪拌1小時。然後再加熱，冷卻並攪拌1小時以上。然後使混合物過濾，濾液在真空下濃縮。殘渣用乙酸乙酯研製，通過過濾收集固體，用乙醚洗滌後得到0.61g所需產物，質譜分析顯示260、244、214和171的分子離子。
製備18乙基N-(2-羧基乙基)-2-(4-脫乙醯基-23-脫甲氧基長春花鹼-23-肼撐)亞甲基丙二酸酯將67mg製備17的產物加至含有196mg 4-脫乙醯基-23-脫甲氧基長春花鹼-23-肼硫酸鹽的1ml無水二甲基甲醯胺溶液中。混合物在室溫下攪拌過夜，在真空下除去溶劑。殘渣溶於含有20%甲醇的0.5M KH2PO4緩衝液(pH7)中，並加到C18反相矽膠柱上。用甲醇濃度逐步上升的同樣緩衝液洗脫柱子，合併含有產物的組分，在真空下濃縮。然後使殘渣溶於幾毫升水中，溶液加到同一類型柱上，用甲醇含量逐步上升的水洗脫。合併含有產物的組分，在真空下濃縮後得到197mg所需的中間產物。
製備19乙基N-(2-琥珀醯亞胺氧基羰基乙基)-2-(4-脫乙醯基-23-脫甲氧基長春花鹼-23-肼撐)亞甲基丙二酸酯159mg製備18的產物溶於2ml無水二甲基甲醯胺中，向其中加入20.5mgN-羥基琥珀醯亞胺，33.4mg二環己基碳化二亞胺和30.8mg對甲苯磺酸水合物。混合物在室溫下攪拌24小時，在真空下除去溶劑。殘渣溶於二氯甲烷中，並加到用二氯甲烷平衡的矽膠柱上。柱子用1∶1的異丙醇∶二氯甲烷洗脫，合併含有產物的組分，在真空下濃縮後得到45.2mg所需的中間產物。
實例10抗體007B與乙基N-(2-羰基乙基)-2-(4-脫乙醯基-23-脫甲氧基長春花鹼-23-肼撐)-亞甲基丙二酸酯的結合物進行3種結合反應，基本上採用實例6的方法，在每一種反應中都用15mg在1.03ml硼酸緩衝液中的抗體開始。在3種反應中使用下列數量的製備19的產物。
1.0.86mg2.1.08mg3.1.30mg3種反應混合物都在室溫下攪拌1小時，進行離心和層析，使產物溶液滅菌過濾後得到下列產物。
123結合物14.9mg14.9mg13.6mg體積6.2ml6.5ml7.2ml結合比例3.34.14.9
實例11抗體007B與乙基N-(2-羰基乙基)-2-(4-脫乙醯基-23-脫甲氧基長春花鹼-23-肼撐)-亞甲基丙二酸酯的結合物基本上根據實例6進行結合反應，用200mg抗體007B(14.6mg/ml的溶液)和18mg製備19的產物開始。使產物滅菌過濾，真空透析後得到163mg形式為12.0mg/μl溶液的結合物，結合比例為4.3。
實例12 抗體007B的F(ab′)2片段與乙基N-(2-羰基乙基)-2-(4-脫乙醯基-23-脫甲氧基長春花鹼-23-肼撐)亞甲基丙二酸酯的結合物600mg抗體007B的F(ab′)2片段溶於30ml 0.34M的硼酸緩衝液(pH8.6)中。在其中滴加含有51mg製備19中間產物的3.75ml無水二甲基甲醯胺，混合物在室溫下攪拌30分鐘。然後離心，上清在Phenyl Sepharose CL-4B(Pharmacia)柱上層析，先用0.1M pH6.2磷酸緩衝液，然後用40%含水乙腈洗脫。通過在生理緩衝鹽水中透析濃縮含有產物的組分，得到214mg所需的結合物，結合比例為2.9摩爾/摩爾。
測試Ⅰ體外測試在離體系統中測試本發明的代表性結合物，以證實結合物的活性。在這些測試中，通過測定結合物對來自人癌細胞的組織培養物的細胞毒性，以確定細胞毒性藥物結合物的效力。所用細胞為UCLA/P3細胞系(一種人肺腺癌)和T222細胞系(一種人鱗狀癌)。下表以結合物中的藥物含量為基礎，以50%的抑制濃度給出了結合物的活性。
實例UCLA/P3T2222A0.1μg/ml＞10μg/ml2B＞10＞103A＞10＞104＞104A＞103.36A＜0.0001110.26測試Ⅱ小鼠中的UCLA/P3體內測試實例6A的結合物，在Charles River雌性裸鼠中測定它對於UCLA/P3肺腺癌的異體移植物的活性。測試開始時，在每隻小鼠中皮下移植107UCLA/P3腫瘤細胞。在移植後的第2、5和8天，對每隻小鼠注射結合物，或對未處理對照注射生理緩衝鹽水。結合物的劑量範圍為0.09mg/kg至3mg/kg，以藥物量為基礎。在移植後的第15、21和28天，測定由移植誘導的腫瘤的大小。每個處理組由5隻小鼠組成，而未處理對照組由10隻小鼠組成。
在第28天，0.38mg/kg或大於此劑量的處理均對腫瘤產生100%的抑制。0.19mg/kg的處理對腫瘤生長產生大約60%抑制，0.09mg/kg的處理對腫瘤生長產生大約25%的抑制。
測試Ⅲ小鼠中的UCLA/P3腫瘤基本上根據測試Ⅱ所述，測試實例7A的結合物針對小鼠中由UCLA/P3細胞移植而誘導的腫瘤的活性。在此測定中，在移植後的第16、19、22和25天，以0.25、0.5、1和2mg/kg(以藥物量為基礎)的劑量施用結合物。並在同一天測量腫瘤的大小。
發現0.25mg/kg的劑量對腫瘤稍有抑制，在移植後第50天，給予該劑量的小鼠的腫瘤平均重約7500mg。而此時對照小鼠的腫瘤平均重約8000mg。而其他劑量基本上能抑制腫瘤生長。
在移植後第70天，接受0.5mg/kg劑量的小鼠的腫瘤平均重約4000mg;接受1mg/kg劑量的小鼠的腫瘤平均重約2000mg;而接受2mg/kg劑量的小鼠的腫瘤平均重僅約500mg。
組合物及使用方法本發明的結合物可用於治療方法中，這是本發明的重要方面。因此，本發明還包括用於治療方法中的非腸道施用的藥物組合物。這種組合物由藥物化學領域中的常規方法製備。本發明的組合物能夠以可接受的溶解度溶於生理上可接受的液體(例如生理鹽水和其他能夠安全地進行非腸道施用的水溶液)。
非腸道施用的產品通常配製並分散於固體中，優選冷凍乾燥的固體，在使用前臨時再構成。這種製劑是本發明的有用組合物。藥物化學家非常熟悉其製備;一般說來，它們含有無機鹽混合物，以提供等滲性，以及分散劑如乳糖，以使乾燥製劑在再構成時迅速溶解。在使用時，用高度純化的水以已知濃度再配製這種製劑。
用結合物和含有結合物的組合物治療需用結合物中的藥物治療的病人。治療的特殊目的和給藥的劑量範圍，根據藥物的種類及待治療病人的狀況確定。從標準的醫學文獻中，可找到藥物的特殊效應及其適當的劑量範圍的指南。
權利要求
1.一種具有下式的藥物結合物
其中Ab是一種抗體或其識別抗原的片段，它可識別與需要傳遞藥物的細胞相結合的抗原；Q是-NH-，-O-，或-S-；R-Q-是藥物殘基，它具有可參與反應的氨基、羥基或硫醇基團；R1是羧酸保護基；Y是-O-，-NH-，-NCH3-或-NC2H5-；n是從1至大約8的整數；m是從1至大約10的整數。
2.權利要求1的結合物，其中，藥物是具有下式之一的細胞毒性藥物
其中R5是氫或羥基;
其中R6是氨基或羥基;R7是氫或甲基;R8是氫、氟、氯、溴或碘;R9是羥基或一種構成羧酸鹽的半分子;
其中R10是氫或甲基;
其中R11是氨基、C1-C3烷基氨基、二(C1-C3烷基)-氨基或C4-C6聚亞甲基氨基;
其中，R12半分子中的一個為一個鍵，其它的則為氫;
其中R13是氫或甲基;R14是甲基或噻吩基;
其中，R15是H、CH3或CHO;當R17和R18單獨看待時，R18是H，R16和R17之一是乙基，而另一個是H或OH;當將R17和R18與它們與之結合的碳一起看待時，它們構成一個環氧乙烷環，此時R16是乙基;R19是氫，(C1-C3烷基)-CO或氯取代的(C1-C3烷基)-CO;P是0或1;R20是一個鍵或(C2-C4烷基)-X;X是-O-，-S-或-NH-;
其中，R21是下式之一的鹼基
其中，R22是氫、甲基、溴、氟、氯或碘;R23是-OR12或-NHR12;R24是氫、溴、氯或碘。
3.權利要求1或2的結合物，其中的抗體是單克隆抗體。
4.權利要求1-3中任何一項的結合物，其中的m為大約3至大約8。
5.權利要求1-4中任何一項的結合物，其中的n為1至大約6。
6.權利要求5的結合物，其中的n為1至大約3。
7.前述權利要求中任何一項的結合物，其中的藥物為式Ⅴ、式Ⅵ或式ⅩⅢ的藥物。
8.一種藥物組合物，它含有非腸道施用的基質及權利要求1-7中任何一項的結合物。
9.權利要求1-7中任一項的結合物作為藥物使用。
10.一種製備如權利要求1-7中任何一項所要求的式Ⅰ的藥物結合物的方法，包括(A)使具有下式的修飾抗體
其中R1、Y、n、m和Ab都如權利要求1所定義，R4是C1-C4烷氧基，與式子為R-QH的藥物反應，其中Q和R-Q-都如權利要求1所定義;或(B)使具有下式的衍生藥物
其中Q、R-Q-、R1、Y和n都如權利要求1所定義，R3是羥基、羧酸保護基團或構成羧酸鹽的半分子，與如權利要求1所定義的式子為Ab的抗體或抗體片段反應。
11.一種具有下式的丙二酸酯
其中n和Y如權利要求1所定義;R2是羥基、一個羧酸保護基團或構成羧酸鹽的半分子;R3是羥基、一個羧酸保護基團、一個羧酸活化基團或一個構成羧酸鹽的半分子;R4是C1-C4烷氧基。
12.權利要求11的丙二酸酯，其中的R2是一個羧酸保護基團，R3是一個羧酸保護基團或羧酸活化基團，n是從1至大約6。
13.一種具有下式的修飾抗體或抗體片段
其中R1、Y、n、m和Ab如權利要求1所定義，R4是C1-C4烷氧基。
14.一種具有下式的衍生藥物
其中Q、R-Q-、R1、Y和n都如權利要求1所定義，R3是羥基、一個羧酸保護基團、一個羧酸活化基團或一個構成羧酸鹽的半分子。
15.一種製備如權利要求13所定義的式Ⅲ的修飾抗體或抗體片段的方法，包括使具有下式的丙二酸酯與如權利要求1定義的式子為Ab的抗體或抗體片段反應，
其中Y和n如權利要求1所定義;R2是一個羧酸保護基團;R3是羥基、一個羧酸活化基團或一個構成羧酸鹽的半分子;R4是C1-C4烷氧基;
16.一種製備如權利要求14定義的式Ⅳ的衍生藥物的方法，包括使具有下式的丙二酸酯
其中R2是一個羧酸保護基團;R4、Y、n和R3如權利要求12所定義，與式子為R-QH的藥物反應，其中的Q和R-Q-如權利要求1所定義。
全文摘要
使用由丙二酸酯構成的連接子製備了藥物與抗體或其抗原識別片段的結合物，其中抗體或其片段通過羰基連接到丙二酸酯的一個羧基上的酯或醯胺基上，而藥物則通過亞甲基連接到丙二酸酯的2位碳原子上。
文檔編號C07K16/00GK1042546SQ89108469
公開日1990年5月30日 申請日期1989年11月10日 優先權日1988年11月10日
發明者羅素·拉維恩·巴頓 申請人:伊萊利利公司