含有非天然胺基酸的蛋白質的無細胞合成的製作方法

2023-04-24 20:28:46

專利名稱：含有非天然胺基酸的蛋白質的無細胞合成的製作方法
含有非天然胺基酸的蛋白質的無細胞合成
背景技術：
蛋白質合成是一種基礎生物過程、是開發多肽治療、疫苗、診斷和工
業酶的基礎。隨著重組DNA(rDNA)技術的出現、可以利用細胞的催化機器來產生所需的蛋白質。這可利用衍生自細胞的提取物在細胞環境內或體外實現。
無細胞蛋白質合成提供優於體內蛋白質表達方法的一些優點。無細胞系統可使大多數(如果不是所有的)細胞代謝原料用於專門產生一種蛋白質。此外，在體外沒有細胞壁也具有優點，因為這能控制合成環境。例如，可改變tRNA水平來反映待表達基因的密碼子使用。由於無需考慮細胞的培養或存活，所以改變氧化還原電位、pH或離子強度也可能比體內更加易行。此外，可以容易地實現純化的、適當摺疊的蛋白質的直接回收。
認為體外翻譯還能夠摻入非天然的及同位素標記的胺基酸，和能夠產
生在體內不穩定、不溶或有細胞毒性的蛋白質。此外，無細胞蛋白質合成對改革蛋白質工程和蛋白質組篩選技術可能起作用。無細胞方法繞過克隆和轉化細胞以在體內表達新基因產物所需的艱苦費力過程，從而成為該領域的技術平臺。
相關文獻
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發明概述
提供使用來自多核苷酸模板細菌細胞提取物進行高產量無細胞蛋白質合成的方法，其中對合成蛋白質進行修飾使其含有一個或多個位點特異性摻入的非天然胺基酸。蛋白質在包含至少一種非天然胺基酸氨醯化的正交tRNA的無細胞反應混合物中合成，其中正交tRNA鹼基對攜帶的密碼子通常不與胺基酸關聯，如終止密碼子、4bp密碼子等。反應混合物還包含能夠用非天然胺基酸氨醯化正交tRNA的tRNA合成酶。正交tRNA合成酶易於被細菌細胞提取物中的蛋白酶降解，通常外源性合成正交tRNA合成酶並在啟動多肽合成前加入反應混合物。正交tRNA可在獲取細胞提取物的細菌細胞中合成，可在多肽反應過程中從頭合成，或可外源性加入反應混合物中。
本發明提供大量生產活性修飾蛋白質的方法。由此生產的蛋白質，包括含二硫鍵的蛋白質、分泌蛋白質、膜結合蛋白質和多聚蛋白質等具有生物學活性。在一些實施方式中，通過偶聯的轉錄和翻譯反應進行合成。
在一個實施方式中，合成反應條件能在體外激活氧化磷酸化。氧化磷酸化激活的證據是合成對電子傳遞鏈抑制劑的敏感。此類反應基本不用聚乙二醇。
所述無細胞蛋白質合成體系提供了用於表達含非天然胺基酸蛋白質的靈活的平臺。在各種實施方式中，改進該體系以得到特定結果。根據期望的改進，來改變非天然胺基酸的數目和特性。正交tRNA和tRNA合成酶可來自數種來源，包含細菌、古細菌或哺乳動物。
在反應混合物中任選地加入影響非天然胺基酸插入和蛋白質插入或摺疊的組分。此類組分包括濃度升高的翻譯因子，以儘量減少釋放因子1和2的影響並進一步優化正交組分濃度。可在反應混合物中加入侶伴蛋白(氧化還原酶和異構酶的Dsb系統，GroES、 GroEL、 DNAJ、 DNAK和Skp等)，或者在用
5於製備細胞提取物的來源細胞中過度表達上述侶伴蛋白。
附圖簡要說明
圖l.利用非天然胺基酸摻入方案1在mGM-CSF中摻入鄰甲基-酪氨酸(OMe-Tyr)的放射性自顯影分析。在PANOx-SP無細胞反應中，加入純化正交(o-)詹氏甲垸球菌(M^2flwococcw 7'朋wwcM) tRNA和鄰甲基-酪氨酸合成酶的量不同。在10% Bis-TrisNuPAGE凝膠上分離樣品並與Markl2分子量標準品比較。條帶l包含二聚化蛋白產物，條帶2是摻入鄰甲基酪氨酸的全長蛋白產物，條帶3是截短蛋白產物(在75位殘基上截短)。泳道2顯示具有所有天然胺基酸的純化mGM-CSF標準品。
圖2.利用不同工藝方案在氯黴素乙醯基轉移酶(CAT)中摻入鄰甲基-酪氨酸的無細胞蛋白質合成產量。通過基於比色的活性實驗測定活性CAT濃度[26]並在L-[U-"C]-亮氨酸摻入後通過閃爍計數進行驗證。在MES緩衝液中利用10%Bis-Tris NuPAGE凝膠進行放射性自顯影分析。該數據為n=6次實驗的平均值。
圖3.含對-疊氮基-苯丙氨酸的CAT的放射性自顯影分析(鄰甲基-酪氨酸和對-乙醯基-苯丙氨酸結果類似)。用MES緩衝液中電泳的10% Bis-TrisNuPAGE凝膠進行放射性自顯影，(A)在細胞提取物(例子來源於KC6細胞株的細胞提取物)中進行受控tRNA轉錄後，加入遞增量的正交合成酶在30°C進行5小時無細胞反應後的修飾蛋白產量。(B， C)unAA-PANOx-SP系統中無細胞蛋白合成期間放射性自顯影時程和活性CAT產量。用約167 pg/mL正交對-疊氮基-苯丙氨酸合成酶於30°C進行22小時無細胞反應。
圖4.無細胞蛋白質合成反應中正交合成酶蓄積的放射性自顯影分析。用MES緩衝液中電泳的10% Bis-Tris NuPAGE凝膠進行放射性自顯影。對-疊氮基-苯丙氨酸tRNA合成酶被KC6細胞提取物中的蛋白酶嚴重降解。當使用ARG1、 ARG2或MCJ29突變細胞株產生細胞提取物時，合成酶不被降解(因為所有結果均類似故只給出一個實例)。當om; r缺失或突變摻入KC6或KGK10細胞株時，新產生的合成酶是穩定的。
圖5。採用反應方案I-IIIc反應的活性氯黴素乙醯基轉移酶(CAT)的產量顯
6示了本發明提供的顯著改進。發展I和II期包括摻入生理量的純化tRNA和合成酶(與實施例1中所述那些產量類似)。發展方案IIIa包括體內表達正交合成酶和tRNA (KC6細胞提取物)。發展方案nib包括體內tRNA轉錄並加入少於167 lag/mL活性純化正交合成酶。通過改進unAA-PANOx-SP組分比例、反應環境、提取製備方法和tRNA表達得到發展方案IIIc。通過放射性自顯影進行蛋白產物分析顯示無細胞反應的大部分產物為含有非天然胺基酸的全長蛋白。這些結果在多於n=6次實驗中重現。
圖6.包含二硫鍵的修飾蛋白質的產量。成功將對-疊氮基和對-乙醯基-苯丙氨酸非天然胺基酸摻入hGM-CSF和mGM-CSF(僅顯示對-疊氮基-苯丙氨酸無細胞產量)。對-乙醯基-苯丙氨酸和對-疊氮基-苯丙氨酸摻入的放射性自顯影確認，通過unAA-PANOx-SP無細胞體系合成全長的修飾產物。使用含有pK7tRNAmj質粒的KC6細胞株製備細胞提取物。對每一非天然胺基酸和蛋白質，在30。C進行三個單獨的無細胞反應6小時。
圖7.圖6所述修飾蛋白的hGM-CSF和mGM-CSF的生物活性實驗結果。幾乎所有產生的全長產物(可溶部分)都能正確摺疊並在細胞增殖實驗中顯示出生物活性。 一式三份的檢測樣品(n=3)。
圖8.在34或182位殘基摻入unAA (對-疊氮基-苯丙氨酸)的全長TetA膜蛋白的無細胞產量的放射性自顯影分析。同時顯示了蔗糖梯度懸浮實驗分離的TetA蛋白產物的分布。在摻入14C亮氨酸後鑑定合成的TetA蛋白的放射性。小泡相連的浮於組分2之上，而聚集TetA保留在組分5-7梯度的底部。使用
穀氨酸磷酸鹽無細胞體系合成這些膜蛋白以保證活性氧化磷酸化通路。
圖9.在殘基34和182上用對-疊氮基-苯丙氨酸修飾的TetA的蛋白酶K
消化的放射性自顯影分析。實驗中使用MES緩衝液中10% Bis-Tris NuPAGE
凝膠。"內部"非天然胺基酸取代位於膜的周質側(小泡內側)，"外部"插入
的非天然胺基酸位於膜的胞質側(小泡外側)。


圖10:利用pET24a—MS2cp—T15ST0P表達載體進行的無細胞蛋白質合成
的產量(30iiil反應，n=2)。
圖11:利用天然胺基酸合成的MS2衣殼樣品(+對照)以及15位上對-疊氮
基-苯丙氨酸產生終止密碼子抑制的MS2衣殼樣品(非天然AA)，在10%-40%
7(2.5%步進)蔗糖密度梯度中的速率沉降特徵。對摻入"C-亮氨酸閃爍計數測定
放射性標記MS2外被蛋白的位置。
圖12:通過圖11所示的蔗糖密度梯度分離的非天然胺基酸樣品組分12-15以及+對照樣品的組分11-15(20 |ul組分，7.25^1 NuPAGE LDS上樣緩衝液-英傑公司，0.625 mM DTT-英傑公司)在SDS-Page凝膠(10% Bis-Tris凝膠w/MES電泳緩衝液，英傑公司(Invitrogen);電泳條件60mA 60分鐘；SimplySafe Stain，英傑公司)上進行電泳。MS2外被蛋白單體分子量為13.7kDa。
圖13:圖12所示凝膠的放射性自顯影圖。
圖14A-D:分離自15位合成有對-疊氮基-苯丙氨酸或酪氨酸的VLP的MS2外被蛋白的相關糜蛋白酶消化片段的質譜分析。分離對照和對-疊氮基-苯丙氨酸產物後，用糜蛋白酶消化。
實施方式詳述
本發明的方法中，在包含至少一個非天然胺基酸氨醯化的正交tRNA的無細胞反應混合物中合成靶蛋白，其中正交tRNA鹼基對攜帶的無義密碼子通常不與胺基酸關聯，如終止密碼子、，4bp密碼子等。該方法包括偶聯的轉錄-翻譯反應。本發明在無細胞蛋白合成中利用無義密碼子抑制以產生大量包含非天然胺基酸的多肽。感興趣的多肽包括但不限於含二硫鍵的蛋白、任何異源或同源的蛋白組合，包括融合蛋白、病毒外被蛋白和/或最初通過細胞膜分泌或位於膜內的蛋白。非天然胺基酸包括任一在自然界中一般無法找到的胺基酸類似物或類似實體，包括但不限於用於靶向翻譯後修飾的那些分子。反應混合物包括細胞提取物，任選是胺基酸穩定化的、還原酶最小化的和/或蛋白酶突變的細胞提取物。
令人驚奇的發現，儘管正交tRNA可靠地由獲得無細胞合成所用提取物的細菌細胞合成，但正交tRNA合成酶在細菌細胞提取物中易被降解。此種降解至少一個原因是細菌細胞中存在ompT蛋白酶。該蛋白酶通常不與細胞質內的多肽接觸，因此不影響完整細胞中利用非天然胺基酸進行多肽合成的正交組分。在本發明的方法中，外源性合成tRNA合成酶並加入無細胞反應混合物中。
8或者，從ompT被滅活或本身處於失活狀態的細菌細胞中製備反應混合物。
本發明方法能得到大量活性修飾蛋白，其產量大於體內表達系統所能得到 的產量。在本發明的一個實施方式中，活性修飾蛋白的產量為至少約50pg/ml 反應混合物；至少約100pg/ml反應混合物；至少約250 pg/ml反應混合物；或 更多。大部分由此產生的靶多肽中非天然胺基酸含量通常為至少約50%、至少 約75%、至少約85%、至少約95%、至少約99%、甚至更高。
本文所用修飾蛋白或靶蛋白在一個預定位點包含至少一個非天然胺基酸， 並可包含或含有l、 2、 3、 4、 5或多個非天然胺基酸。在多肽兩個或多個位點 出現的非天然胺基酸可為相同或不同的。當非天然胺基酸不同時，對每一非天 然胺基酸而言，都存在一種正交tRNA和關聯tRNA合成酶。非天然胺基酸包 括但不限於對-乙醯基-苯丙氨酸、對-乙炔基-苯丙氨酸、對-炔丙基氧基苯丙氨 酸和對-疊氮基-苯丙氨酸。
本發明方法提供與天然蛋白具有相當生物學活性的包含非天然胺基酸的 蛋白質。可通過功能性實驗測定組合物中蛋白比活，通過非功能性實驗，如免 疫染色、ELISA、在考馬斯或銀染凝膠上定量測定存在的蛋白，並測定生物學 活性蛋白佔總蛋白的比例。通常，由此定義的比活為天然蛋白的至少約5%、 10%，或約25%、 50%、 90%或更高。
本發明方法能大量獲得自我組裝的病毒外被蛋白。大部分蛋白質可組裝成 為穩定的病毒樣顆粒(VLP)，通常至少約25%、至少約50%、至少約75%或更 多，其中穩定VLP在生理條件下能在延長時間如至少約24小時、至少約1周、 至少約1個月甚至更長時間中保持含有至少約60個多肽鏈的衣殼結構。 一旦 組裝，VLP暴露於pH變化、熱、冷凍和離子交換等條件時與天然病毒顆粒的 穩定性相當。
本發明方法合成的多肽提供了能夠通過非天然胺基酸之間的共價鍵將任 何配體(包含或不包含二硫鍵)連接於多肽的優點。可使用接頭連接兩個相似或 獨特的非天然胺基酸，如在兩條多肽鏈間連接。利用相似或不同配體在單一或 多個位點進行位點特異性翻譯後修飾可通過但不限於以下方法進行溫和[3+2] 環加成反應或利用獨特"酮柄"的配體特異性反應。或者，可將疊氮基團與炔 相連，其中一個摻入了多肽表面，另一個則是接頭或配體的一部分。定義
應當理解本發明不受限於所述特定方法、實驗方法、細胞系、動物種屬和
試劑，因為這些可變。也應理解本文所用術語僅為了描述特定實施方式，並無 意限制本發明範圍，僅有所附的權利要求書才能限制本發明範圍。
本文所用單數形式"一個"、"一種"和"這種"包括複數含義，除非上 下文另有清楚地說明。因此，例如，提及"細胞"包括該細胞的複數形式，提 及"培養物"包括提及一種或多種培養物及其本領域熟練技術人員所知等價物 等等。除非另有說明，本文所用的技術和科學術語與本發明所屬領域一般技術 人員理解含義相同。
術語"所需蛋白"或"所選蛋白"可互換使用，通常指任何含多於5個氨 基酸的肽或蛋白，其中包含至少一個非天然胺基酸，其中非天然胺基酸在編碼 該蛋白的多核苷酸的特定位點編碼。所述多肽可與細菌(細菌無細胞提取物來 源於該細菌)同源或外源(指異源的)，即外來的，如細菌無細胞提取物中產生的 人蛋白、病毒蛋白、酵母蛋白等。
哺乳動物多肽的例子包括但不限於分子如腎素；生長激素，包括人生長 激素；牛生長激素；生長激素釋放因子；甲狀旁腺激素；促甲狀腺激素；脂蛋 白；a-l-抗胰蛋白酶；胰島素A鏈；胰島素；胰島素原；促卵泡激素；降鈣素； 黃體生成素；胰高血糖素；凝集因子如VIIIC因子、IX因子、組織因子和von Willebrands因子；抗凝集因子，如蛋白C;心房鈉元素；肺表面活性劑；纖溶
酶原激活物，如尿激酶或人尿或組織類型纖溶酶原激活物(t-PA);鈴蟾肽；凝 血酶；造血生長因子；腫瘤壞死因子-a和-j3;腦啡肽酶；RANTES和其它趨化 因子；人巨噬細胞炎症蛋白(MIP-la);血清白蛋白如人血清白蛋白；苗勒管抑 制物質；鬆弛素A鏈；鬆弛素B鏈；前鬆弛素(prorelaxin);小鼠促性腺素相關 肽；微生物蛋白，如p-內醯胺酶；DNA酶；抑制素；活化素；血管內皮生長 因子(VEGF);激素或生長因子受體；整聯蛋白；蛋白A或D;類風溼性因子； 神經營養因子如骨源性神經營養因子(BDNF),神經營養因子-3、 -4、 -5或 -6(NT-3、 NT-4、 NT-5或NT-6)，或神經生長因子如NGF,P;血小板衍生生長 因子(PDGF);成纖維細胞生長因子如aFGF和(3FGF;表皮生長因子(EGF);轉
10化生長因子(TGF)如TGF-a和TGF-(3，包括TGF-|31、 TGF.-卩2、 TGF.-卩3、 TGF,p4 或TGF-P5;胰島素樣生長因子-I禾口-II(IGF-I和IGF-II); des(l-3)-IGF-I (腦 IGF-I)、胰島素樣生長因子結合蛋白；CD蛋白如CD-3、 CD-4、 CD-8和CD-19; 紅細胞生成素；成骨誘導因子；免疫毒素；骨形態發生蛋白(BMP);幹擾素如 幹擾素a、卩和Y;集落刺激因子(CSF)，如M-CSF、 GM-CSF和G-CSF;白介
素(IL)，如IL-1至IL-18;超氧化物歧化酶；T細胞受體；表面膜蛋白；促衰變
因子；病毒抗原如AIDS包膜的一部分，轉運蛋白、歸巢受體、定居因子、調 節蛋白、抗體和上述任何多肽的片段。
感興趣的病毒外被蛋白包括任何已知病毒類型，如dsDNA病毒如天花(天 花)；牛痘；皰疹病毒包括水痘帶狀皰疹；HSV1、 HSV2、 KSVH、 CMV、 EBV; 腺病毒；B型肝炎病毒；SV40; T偶數噬菌體如T4噬菌體、T2噬菌體；X噬 菌體；等。單鏈DNA病毒包括4)X-174;腺伴隨病毒等。負鏈RNA病毒包括 麻疹病毒、腮腺炎病毒、呼吸道合胞病毒(RSV);副流感病毒(PIV);肺炎後病 毒；狂犬病病毒；艾波拉病毒；流感病毒等。正鏈RNA病毒包括脊髓灰質炎 病毒、鼻病毒、冠狀病毒、風疹病毒、黃熱病病毒、西尼羅河熱病毒、登革熱 病毒、馬腦炎病毒、A型肝炎和C型肝炎病毒、菸草花葉病毒(TMV)等。雙 鏈RNA病毒包括呼腸病毒等等。逆轉錄病毒包括勞氏肉瘤病毒；慢病毒如 HIV-1和HIV-2等。
感興趣的是細菌噬菌體，如MS2噬菌體。肌病毒科(有收縮性尾部的噬菌 體)包括p樣病毒；P1-樣病毒如P1; (pW39等；P2-樣病毒；SPO-l-樣病毒； T4-樣病毒等。短尾噬菌體科(具有短尾部的噬菌體)包括N4-樣病毒；P22-樣病 毒如P22; (p-29-樣病毒如cp-29; T7-樣病毒如T3、 T7、 W31等。長尾噬菌體
科(具有長的非收縮性尾部的噬菌體)包括c2-樣病毒；L5-樣病毒；Mf病毒如 噬菌體人、HK022; HK97等；N15-樣病毒；(pC31-樣病毒；WMl-樣病毒；Tl-樣病毒如噬菌體T1等。微小病毒科(等長(isometric)ssDNA噬菌體)包括衣原體 微小噬菌體病毒；微小病毒，如噬菌體a3、噬菌體WA13等；噬菌體G4;噬 菌體cpX174和相關大腸桿菌噬菌體。本領域熟練技術人員所知的許多其它噬菌 體尚未分類。許多外被蛋白的序列已公開可查。
孝天^f^"^^。可用於本發明使用方法的非天然胺基酸的例子包括酪氨
11酸的非天然同系物；谷胺醯胺的非天然同系物；苯丙氨酸的非天然同系物；絲 氨酸的非天然同系物；蘇氨酸的非天然同系物；垸基、芳基、醯基、疊氮基、 氰基、滷素、肼、醯肼、羥基、烯基、炔基、醚、巰基、磺醯基、硒基、酉旨、 硫代酸、硼酸鹽、硼酸酯(boronate)、磷酸基、膦醯基、膦、雜環、烯酮(enone)、 亞胺、乙醛、羥胺、酮或氨基取代胺基酸或其任何組合；具有光敏型交聯接頭 的胺基酸；自旋標記胺基酸；螢光胺基酸；具有新穎官能團的胺基酸；與其它 分子共價或非共價相互作用的胺基酸；金屬結合胺基酸；含金屬的胺基酸；放 射性胺基酸；光捕獲(photocaged)和/或光異構化(photoisomerizable)胺基酸；含 生物素或生物素類似物的胺基酸；糖基化的或糖修飾胺基酸；含酮胺基酸；含 聚乙二醇或聚醚的胺基酸；重原子取代的胺基酸；化學切割或光切割胺基酸； 有延伸側鏈的胺基酸；含毒性基團的胺基酸；糖取代的胺基酸，如糖取代的絲 氨酸等；碳連接的含糖胺基酸；氧化還原活性胺基酸；含a-羥基的酸；含氨基 硫代酸的胺基酸；a,a雙取代胺基酸；|3胺基酸；除脯氨酸外的環狀胺基酸等。
感興趣的非天然胺基酸包括但不限於為CLICK化學反應提供反應基團的 胺基酸(參見《克裡克化學來自數個好反應的不同化學功能》(C//cA:C/zemWo; ..D/verse CAem/ca/ Fww"/ow /h m a Few Good / efl"/o"s) Hartmuth C.Kolb， M.G.Finn， K.Barry Sharpless Angewandte Chemie International Edition 40巻， 2001， P. 2004,特別通過引用納入本文)。例如，感興趣的是胺基酸對-乙醯基 -L-苯丙氨酸和對-疊氮基-L-苯丙氨酸。
iF3 資分。本文所使用的正交組分包括具有非天然胺基酸的氨醯化的 tRNA，其中正交tRNA鹼基對具有通常與胺基酸無關的密碼子，如終止密碼子、 4 bp密碼子等。反應混合物還可包含能氨醯化(用非天然胺基酸)關聯的正交 tRNA的tRNA合成酶。此類組分為本領域所知，參見例如2006年5月16日 批准的美國專利7,045,337。正交tRNA識別可為無義密碼子的選擇密碼子，如 終止密碼子，如琥珀、赭石和蛋白石密碼子；四鹼基或多鹼基密碼子；起源於 天然或非天然鹼基對的密碼子等。正交tRNA的反密碼子環能識別mRNA上的 選擇密碼子並在多肽的該位點上插入非天然胺基酸。
優選外源性合成正交tRNA合成酶，純化並加入到本發明的反應混合物 中，通常其含量確定，為至少約10ng/ml、至少約20pg/ml、至少約30 pg/ml和不超過約200 pg/ml。可在細菌或真核細胞中合成該蛋白並通過本領域熟知 的計數如親和色譜、PAGE、凝膠排阻色譜、反向色譜純化該蛋白。
可在用於無細胞合成的提取物來源細胞中合成正交tRNA;正交tRNA可 外源性合成、純化並加入反應混合物，或從頭合成，其中無細胞合成反應允許 轉錄和翻譯反應。當在用於無細胞合成的提取物來源細胞中合成正交tRNA時， 可通過選擇適當的啟動子、培養基等控制表達。
本文所用體外合成，指在包含生物學提取物和/或確定試劑的反應混合物 中無細胞合成多肽。反應混合物可包含用於產生大分子的模板，如DNA、mRNA
等；用於大分子合成的單體，如胺基酸、核苷酸等和此類輔因子，酶和其它合 成所必需的試劑，如核糖體、tRNA、聚合酶、轉錄因子等。此類合成反應體 係為本領域所熟知並在文獻中有記載。可以分批、連續流或半連續流等本領域 所知形式進行無細胞合成。
在本發明的一些實施方式中，無細胞合成在氧化磷酸化激活的反應中進 行，如CYTOMIMTM系統。呼吸鏈和氧化磷酸化激活的證據是在02存在時， 多肽合成增加。在氧化磷酸化激活的反應中，與02存在時相比，當存在特異 性電子傳遞鏈抑制劑如HQNO或缺少02時總多肽合成量至少降低約40% 。反 應化學在通過引用納入本文的國際專利申請WO 2004/016778中有記載。
用於合成的CYTOMIMTM環境使用在含葡萄糖和磷酸鹽的培養基中生長 的細菌細胞的提取物，其中起始葡萄糖濃度至少約0.25%(重量/體積)，更常用 的是至少約1%;常用的是不超過約4%，更常用的是不超過約2%。此類培養 基的例子是2YTPG培養基，然而本領域技術人員可意識到許多培養基經改造 均可用於此目的，其中許多公開培養基適用於細菌如大腸桿菌(五.co/Z)的生長， 其中使用明確的和未明確的營養物來源(參見Sambrook， J.， E.F. Fritsch和T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual(分子克隆實驗室手 冊)，第二版，冷泉港大學出版社，冷泉港，紐約(Cold Spring Harbor University Press, Cold Spring Harbor, NY)，例如含葡萄糖的培養基)。或者，培養物可根 據實驗方案生長，該實驗方案中葡萄糖根據需要連續添加於成分明確或複合的 生長培養基中以保持高生長速率。
可在反應混合物加入小泡作為補充，如加入內膜小泡溶液。所提供小泡可
13佔約0-約0.5體積，通常約0.1-約0.4體積。
在一些實施方式中，存在不超過痕量的PEG，例如少於0.1%並可少於 0.01%。基本不含PEG的反應包含極少量PEG，例如PEG不抑制氧化磷酸化。 亞精胺和腐胺分子可用於替代PEG。精胺或亞精胺的濃度為至少約0.5 mM， 通常至少約1 mM，優選約1.5 mM並且不超過約2.5 mM。腐胺的濃度為至少 約0.5 mM，優選至少約1 mM，優選約1.5 mM並且不超過約2.5 mM。亞精胺 和/或腐胺可存在於最初細胞提取物中或另行加入。
反應混合物中的鎂濃度影響總體合成。常常細胞提取物中存在鎂，可再加 入鎂優化濃度。此方法中所用鎂鹽的來源為本領域所知。在本發明的一個實施 方式中，鎂的來源為穀氨酸鎂。優選的鎂濃度為至少約5 mM，通常至少約IO mM，優選至少約12 mM;並且濃度不超過約25 mM，通常不超過約20 mM。 其它可提高合成或降低成本的變化包括省略反應混合物中的HEPES緩衝液和 磷酸烯醇式丙酮酸。
所述系統可在好氧和厭氧條件下運行。尤其當反應大於15 ^時可提供氧 氣以增加合成產量。反應室頂部空間可填充氧氣；氧氣可注入反應混合物中等。 氧氣可持續供給，或在更長反應時間進行蛋白表達的過程中在反應室頂部補充
氧氣。也可在製備細胞提取物中使用其它電子受體，如硝酸鹽、硫酸鹽或延胡 索酸鹽，以使細胞提取物中所需酶具有活性。
無需加入外源性輔因子激活氧化磷酸化。可使用化合物如煙醯胺腺嘌呤二 核苷酸(NADH)、 NAD+或乙醯輔酶A補充蛋白合成產量，但這並非必須。加 入草酸、磷酸烯醇式丙酮酸合成酶(Pps)代謝抑制劑，可有利於增加蛋白產量， 但這並非必須。
無細胞蛋白合成的模板可為mRNA或DNA，優選使用連續從具有可識別 啟動子的DNA模板中生成mRNA的聯合體系。可在反應混合物中直接加入內 源性RNA聚合酶或外源性噬菌體RNA聚合酶，通常為T7或SP6。或者，可 通過在QB複製酶(一種RNA依賴性RNA聚合酶)模板中插入信息以持續擴增 mRNA。通常在加入反應混合物前利用化學修飾穩定純化的mRNA。可從提取 物中去除核酸酶以穩定mRNA水平。所述模板可編碼任何感興趣的具體基因。
可加入其它鹽，尤其是生物學相關的鹽，如錳鹽。鉀的濃度為至少約50mM，且不超過約250 mM。銨的濃度通常不超過200 mM，更通常不超過100 mM。通常，反應保持在約pH5-10，溫度約20。C-50。C的範圍內；更通常，在 約pH 6-9和溫度約25°C-40°C的範圍內。這些範圍可根據感興趣的具體條件延 伸。
可在反應混合物中加入對不良酶活性的代謝抑制劑。或者，可直接從提取 物中移除引起不良活性的酶或因子，或者可使編碼不良酶活性的基因失活或從 染色體中缺失。
全教^碧欲^7。出於本發明的目的，生物提取物可為任何包含蛋白合成機器 所需組分的製備物，通常為細菌細胞提取物，其中此類組分能表達編碼所需蛋 白的核酸。因此，細菌提取物包含能翻譯編碼所需蛋白的信使核糖核酸(mRNA) 的組分，可選包括能夠轉錄編碼所需蛋白的DNA的組分。此類組分包括例如， DNA指導的RNA聚合酶(RNA聚合酶)、啟動編碼所需蛋白的DNA轉錄所需 的任何轉錄激活物、轉運核糖核酸(tRNA)、氨醯基-tRNA合成酶、70S核糖體、 N^甲醯基四氫葉酸、甲醯基甲硫氨酸-tRNA嚴et合成酶、肽基轉移酶、起始因 子如IF-1、 IF-2和IF-3，延伸因子如EF-Tu、 EF-Ts和EF-G，釋放因子如RF-1、 RF-2和RF-3等。
在本發明的一個優選實施方式中，反應混合物包含來自細菌細胞的提取 物，如大腸桿菌S30提取物，如本領域所知。在一些實施方式中，修飾菌株使 其能夠內源性表達正交tRNA。方便起見，用作提取物來源的有機體也稱作來 源有機體。生產活性提取物的方法為本領域所知，例如Pmtt(1984)，原核無細 胞體系中偶聯的轉錄翻譯(Coupled transcription-translation in prokaryote cell free systems), 179-209， Hames， B.D.和Higgins， S. J,(編)，轉錄和翻譯實踐方 法(Transcription and Translation: A Practical Approach), IRL出版社，紐約。 Kudlicki等(1992) Anal Biochem 206(2):389-93通過超速離心收集S30的核糖體 組分，以修飾S30大腸桿菌無細胞細胞提取物。Zawada和Swartz Biotechnol Bioeng， 2006， 94(4): 618-24和Liu等，2005， Biotechnol Progr 21:460教導了 改進的提取物製備方法。
可根據本發明目的進一步修飾提取物來源菌株。在一個實施方式中，提取 物來源於一種或多種蛋白有缺陷的大腸桿菌菌株，如菌株KC6
15(A19AtonAAtnaAAspeAAendAAsdaAAsdaBAgshA met+) 、 KGK10 (A19AspeAAtnaAAtonAAendAAsdaAAsdaBAgshAAgor met+，可包括TrxB-HA)、 ARG1 (A19AtonAAtnaAAspeAAendAAsdaAAsdaBAgshA met+ OmpTD83A)、 ARG2 (A19AspeAAtnaAAtonAAendAAsdaAAsdaBAgshAAgor met+ OmpTD83A， 可包括TrxB國HA); MCJ29 (A19AspeAAtnaAAompTAptrCAdegPAtonAAendA met+)等。
本文所用摺疊指形成多肽和蛋白三維結構的過程，其中胺基酸殘基間的相 互作用用於穩定該結構。非共價相互作用在決定結構時很重要，膜與蛋白接觸 效應對於正確結構有重要作用。對於天然產生的蛋白和多肽或其衍生物和變 體，正確摺疊的結果通常是產生最優生物學活性的排布，可方便地通過活性實 驗，如配體結合、酶活性實驗等進行檢測。
在一些例子中，如果所需產物是合成來源時，基於生物學活性的實驗將意 義不大。此類分子的正確摺疊可通過物理性質、能量考量、建模研究等測定。
膜相關蛋白的合成後，可直接分離活性的膜相關形式，即不用進行再摺疊 或翻譯後膜引入。分離過程可用本領域所知保持膜完整性的條件或使用任何本 領域實踐常用於分離膜蛋白的數種膜活性去汙劑。
感興趣的分離步驟包括親和色譜。親和色譜利用常出現於生物大分子上的 高特異性結合位點，通過其與特定配體結合的能力分離分子。共價鍵以將配體 公開呈現於蛋白樣品的方式將該配體連接於不溶性的多孔支持介質，從而利用 一種分子的天然生物特異性結合從混合物中區分並純化第二種分子。親和色譜 中常使用抗體。優選將微球或基質作為親和色譜的支持物。此類支持物是本領 域了解的並可購得，包括能與接頭分子偶聯的活化支持物。例如，基於瓊脂糖 或聚丙烯醯胺的Affi-Gel支持物是適合用蠕動泵或重力流動洗脫的多數實驗室 規模純化的低壓凝膠。基於壓力穩定型大孔徑聚合物的Affi-Prep支持物適合 製備和加工規模的應用。
也可通過離子交換色譜和/或濃縮、過濾、透析等本領域所知方法分離蛋 白質。
合成方法
16可使用大規模、小規模反應器或疊加同時進行數個合成反應來進行反應。 連續反應使用給料機制來引入試劑流，並可作為工藝的一部分分離最終產物。 同樣感興趣的是分批體系，其中可引入另外的試劑以延長活性合成的時間。反 應器可以任何模式運行，如分批、延伸分批、半分批、半連續、分批及連續給 料模式，根據應用目的選擇具體模式。
在延長過程中在多肽鏈中引入至少一個非天然胺基酸的合成方案包括但 不限於(I)在無細胞反應中加入外源性純化的正交合成酶、非天然胺基酸及正 交tRNA， (II)在反應混合物中加入外源性純化的正交合成酶和非天然胺基酸，
但在無細胞反應中轉錄正交tRNA， (m)在反應混合物中加入外源性純化的正 交合成酶和非天然胺基酸，但通過細胞提取物來源有機體合成正交tRNA。盡 管可使用其它方法如通過加入或特異性消化控制相關DNA水平來控制合成水
平，但優選通過可調節啟動子驅動正交組分來控制合成水平。
為了防止正交合成酶的降解，用於生產提取物的菌株可含缺失或突變的 om;pr(外膜蛋白T)。當ompT突變時，優選蛋白酶功能失活但侶伴蛋白功能保 留的突變方式。此類提取物與沒有突變或缺失的提取物相比，具有降低的合成 酶降解水平。
可修飾反應混合物以保持氧化蛋白摺疊環境，例如在反應混合物中補充濃 度約為0.5 mM-約10 mM，通常約1 mM-4 mM的GSSG;補充濃度約0.5 mM-約10 mM，通常約1 mM-約4 mM的GSH。也可包含如100 (ig/mL DsbC或 Skp等蛋白組分。任選地，用碘代乙醯胺(IAM)預處理細胞提取物。
反應混合物可為任意體積，可以是小規模，例如通常至少約1 pl且不超過 15 pl，或是擴大規模，例如反應體積至少約15 ^、通常至少約50 pl、更通常 至少約100|11，並可為500 ^1、 1000 ^或更大。大多數情況下，單個反應不超 過約10 ml，儘管可平行進行多重反應。然而，原則上，只要當需要時有充足 的氧氣(或其它電子受體)，反應可以任意規模進行。
除了上述組分，如無細胞提取物、遺傳模板和胺基酸外，可在反應中加入 蛋白合成所需特定材料。這些材料包括鹽、亞葉酸、環AMP、蛋白質或核酸 降解酶的抑制劑、氧化還原電位調節劑、非變性表面活性劑、緩衝液組分、精 胺、亞精胺、腐胺等。優選的鹽包括鉀、鎂和銨鹽(如乙酸或穀氨酸鹽)。 一種或多種此類鹽可具 有一個候選胺基酸作為抗衡陰離子。離子種類最佳濃度相互依賴。這些離子種 類通常根據蛋白生產優化。當改變反應介質中某一特定組分的濃度時，可相應 地改變其它組分的濃度。例如，根據其它組分濃度的改變，可同時調整數種組 分如核苷酸和能源化合物的濃度。同樣，反應器中組分的濃度可隨時間改變。 氧化還原電位調節劑可為二硫蘇糖醇、抗壞血酸、穀胱甘肽和/或其氧化形式。
在半連續的操作模式中，膜的外側或外表面與以預定次序循環改變的預定 溶液接觸。這些溶液包含底物如胺基酸和核苷酸。這時，以透析、分批滲濾或 分批給料的模式操作反應器。通過同一膜或不同的注射單元為反應器提供給料 溶液。合成蛋白在反應器中蓄積，在完成系統操作後利用常用蛋白純化方法分 離和純化蛋白。包含產物的小泡可以被連續分離，例如隨著反應液體被泵送通 過吸附介質時，從反應混合物中親和吸附(原位或在循環迴路中)。
當存在試劑流時，液流方向可為膜的垂線或切線方向。切向流能夠有效回 收ATP並防止膜堵塞，可附加於垂直流上。使用正壓力泵或真空抽吸泵或利 用本領域其它已知方法實加跨膜壓力，能夠引起或實現垂直於膜的流動。與膜
外表面接觸的溶液可循環更換，並且可為與膜相切的穩定切向流。通過合適的 攪拌方法可從內部或外部攪動反應器。
在反應器蛋白合成的過程中，選擇性分離所需蛋白的蛋白分離方法可包括 包裝有包被能吸附合成的所需蛋白的抗體分子或其它分子的顆粒的單元。蛋白 分離方法優選包括兩個柱子交替使用。
可用不同方式測定翻譯反應中產生蛋白質的量。一種方法依賴於測定所翻 譯具體蛋白的活性的實驗。測定蛋白質活性實驗的一個例子是螢光素酶實驗系
統，或氯黴素乙醯基轉移酶實驗系統。這些實驗檢測產自翻譯反應的功能性蛋 白的量。活性實驗不檢測因為不正確的蛋白摺疊或缺少其它蛋白活性所必需的 翻譯後修飾而失活的全長蛋白質。
另一檢測偶聯的體外轉錄和翻譯反應所產生蛋白量的方法是利用已知量
的放射性標記的胺基酸如"S-甲硫氨酸、SH-亮氨酸或"C-亮氨酸進行反應，然
後檢測摻入新翻譯蛋白質的放射性胺基酸的量。摻入實驗測定所有體外翻譯反 應中產生的蛋白質，包括截短的蛋白質產物中放射性標記胺基酸的量。放射性標記的蛋白質可進一步在蛋白凝膠上分離，並通過放射性自顯影確認該產物大 小正確並且未產生第二種蛋白質產物。
也提供了用於實施主題方法的試劑盒。此類試劑盒可包括用於蛋白質合成
以及定點插入非天然胺基酸的細菌提取物，如包含正交tRNA和/或tRNA合成 酶或其編碼多核苷酸、適用於氧化磷酸化被激活的反應的緩衝劑，以及小泡。
試劑盒也可包括用於蛋白質合成的載體，包括表達SRP和SR蛋白的載體；其 中載體可包含用於細菌提取物的啟動子系統。
提供以下實施例是為向本領域的普通技術人員完全公開並描述如何製造 和使用本發明，而不是要限制本發明的範圍。我們努力保證使用數值(例如， 量、溫度、濃度等)的精確性，但應該允許有一些實驗失誤和偏差。除非另有 指出，份數是以重量計的份數，分子量是平均分子量，溫度是攝氏度，壓力是 大氣壓或接近大氣壓。
實驗
作為例子的無細胞蛋白合成反應是穀氨酸磷酸鹽/塞多米(Glutamate Phosphate/Cytomim)和PANOx-SP系統。修飾這些系統使之能有效將非天然 胺基酸摻入蛋白。使用來自詹氏甲垸球菌的正交tRNATW酪氨酸-合成酶將非 天然胺基酸鄰甲基-L-酪氨酸、對-乙醯基-L-苯丙氨酸或對-疊氮基-L-苯丙氨
酸位點特異性引入琥珀終止密碼子的位置。非天然胺基酸市售可得，基因序 列如科學文獻所述(Wang等(2001) Science 292(5516):498-500; Wang等(2003) Proc Natl Acad Sci U S A 100(1):56-61; Chin等(2002) J Am Chem Soc 124(31):9026-7; Farrell等(2005) Nat Methods, 2005。 2(5):377-84; Liu等(2003) JAmChemSoc 125(7):1702-3;通過引用納入本文)。將這些非天然胺基酸摻 入到可溶性細菌蛋白、包含二硫鍵的分泌型哺乳動物蛋白及膜蛋白中。通過 改變用於製備提取物的細胞株、提取物製備方案、輔助蛋白濃度及無細胞反 應條件來開發該無細胞蛋白合成平臺。可通過合適的比色法、細胞增殖、免 疫沉澱和轉運實驗來檢驗靶蛋白活性。
實施例1
使用無細胞蛋白合成法高產表達含非天然胺基酸的複合蛋白的方法
19使用本發明方法合成細菌蛋白氯黴素乙醯基轉移酶(CAT)、 二硫鍵連接的
mGM-CSF和hGM-CSF蛋白以及膜蛋白TetA。為了高產合成靶蛋白，通過重
疊PCR利用為大腸桿菌tRNA相關濃度優化的寡核苷酸(優選密碼子)合成模板
基因。此外，優化基因序列的N末端使其促進我們無細胞體系的翻譯啟動(使
N末端富含A-T)。將優化的蛋白序列連接入pK7載體(參見所附序列)的Ndd
和Sail限制性位點得到野生型質粒pK7CAT 、 pK7hGM-CSF 、
pK7hGM-CSFOPT(或進一步根據罕用密碼子進行優化)、pK7mGM-CSF和
pK7TetA。然後我們進行重疊PCR和/或QuikChange定位誘變將琥珀終止密碼
子(TAG)插入到不會顯著影響摺疊或已知為天然糖基化位點的殘基上。這樣得
到pK7CAT—Y109STOP (SEQ ID NO:l)、 pK7hGM-CSF—N36STOP (SEQ ID
NO:2)、 pK7hGM-CSFOPT—N36STOP (SEQ ID NO:3)、 pK7mGM-CSF—N75STOP
(SEQ ID NO:4)、 pK7TetA—D34STOP (SEQ ID NO:5)和pK7TetA一Q182STOP
(SEQIDNO:6)。 {問題該申請將包括這些序列嗎？末尾好像這些序列被刪除}
這些基因在T7啟動子和終止子的控制下。將這些質粒轉化入XL1-Blue化學感
受態細胞中進行製備，並利用凱傑公司(Qiagen)質粒大抽試劑盒(凱傑，巴倫西
亞，加州)進行純化。
用於摻入非天然胺基酸的穀氨酸磷酸鹽/塞多米無細胞反應的組分包括
13.3 ixg/mL模板質粒、1.2mMAMP、 0.86mMCMP、 0.86mMGMP、 0.86 mM UMP、 34嗎/mL亞葉酸、170.6嗎/mL大腸桿菌tRNA混合物、20種天然氨基 酸各2mM、非天然胺基酸0.5-10 mM、 1-200 pg/mL氨醯基合成酶、0.33 mM 煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、 0.27 mM輔酶A(CoA)、 1 mM腐胺、1.5 mM亞 精胺、4mM草酸鈉、lmM二硫蘇糖醇、10mM穀氨酸銨、130mM穀氨酸鉀、 8mM穀氨酸鎂、10mM磷酸鉀pH7.2、 12 L-["C]-亮氨酸、0.1mg/mLT7 RNA聚合酶、0.01-0.4體積大腸桿菌S30提取物和0-0.41體積內膜小泡溶液。 如Grodberg和Dunn J Bacteriol， 1988. 170(3): 1245-53所述的T7 RNA聚 合酶優選來自大腸桿菌菌株BL21 (pAR1219)。可從下列任何菌株製備大腸杆 菌S30提取物菌株KC6 (A19AtonAAtnaAAspeAAendAAsdaAAsdaBAgshA met+) (Calhoun禾口 Swartz Biotechnol Prog, 2005. 21(4): 1146-53)、 KGK10 (A19AspeAAtnaAAtonAAendAAsdaAAsdaBAgshAAgor met+，可包f舌TrxB-HA)、ARG1 (A19AtonAAtnaAAspeAAendAAsdaAAsdaBAgshA met OmpTD83A)、 ARG2 (A19AspeAAtnaAAtonAAendAAsdaAAsdaBAgshAAgor met十OmpTD83A， 可包括 TrxB-HA)(基因組修飾步驟如下所述)和 MCJ29 (A19AspeAAtnaAAompT厶ptrCAdegPAtonAAendA met+)，根據如下所述步驟進 行培養(Zawada禾卩Swartz, 2006, Biotechnol禾Q Bioeng 94:618並如Liu等， Biotechnol Prog. 2005. 21(2):第460-5頁所述製備)。對於本領域熟練技術人員 來說，可構建任何其它細胞株用於產生此種無細胞體系所使用的細胞提取物。 在細胞生長過程中表達的pK7tRNAmj質粒或合成酶質粒(pK70MeTyr)產物也 可用於產生提取物。構建這些質粒使其在組成型(/;^)或可控啟動子(/"c、 am等) 與或T7終止子之間包含合適的基因序列(參見pK7tRNAmj)。
選擇unAA-PANOx-SP系統作為能量系統。該反應包括170 mM穀氨酸鉀、 10 mM穀氨酸銨、0.6 mM ATP， GTP、 UTP和CTP各0.43 mM、 1.5 mM亞精 胺、1.0mM腐胺、17 ing/mL亞葉酸、85.3 ^g/mL大腸桿菌tRNA混合物、20 種胺基酸各2mM、 0.5-10 mM非天然胺基酸、0-200 pg/mL氨醯基合成酶、10 HM L-[U-"C]-亮氨酸、0.33 mM煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、 0.27 mM輔酶 A(CoA)、 13.3 pg/mL模板質粒、0.1 mg/mL T7 RNA聚合酶和0.01-0.40體積大 腸桿菌S30提取物。細胞提取物來源如上所述。unAA-PANOx-SP體系也包括 16 mM穀氨酸鎂、33 mM磷酸烯醇式丙酮酸，和2.7 mM草酸鈉。
合成鼠GM-CSF (mGM-CSF)和人GM-CSF (hGM-CSF)活性蛋白以展示修 飾的二硫鍵連接蛋白的生產。通常這些反應為30nL總體積的unAA-PANOx-SP 反應，其中補充l-16mM氧化穀胱甘肽緩衝劑(GSSG)、 1-4 mM還原穀胱甘肽 緩衝劑(GSH)和約0-200 (ig/mL DsbC或Skp。此外，預先用0-2 mM碘化乙醯 胺(IAM)處理細胞提取物。所必需的DsbC和Skp在菌株BL21(DE3)中過表達 並純化(Yin和Swartz， 2004， Biotechnol Bioeng， 86:188-95)。在需要碘化乙醯 胺(IAM)處理提取物的反應中，首先在反應容器中加入小體積的濃縮IAM。然 後快速加入較大體積的S30細胞提取物並與小體積IAM充分混和。在用於無 細胞反應前，將提取物在室溫下與IAM孵育30分鐘。
如注釋所述，組合的轉錄-翻譯反應在1.5 mL Eppendorf試管或皮氏培養 皿中於25-37"C下進行3-24小時。摻入非天然(氨基)酸的方案包括但不限於(I)在無細胞反應中加入純化的 正交合成酶和正交tRNA， (II)加入純化的正交合成酶，但在無細胞反應中轉錄 正交tRNA， (m)從表達正交合成酶和/或正交tRNA的細胞產生細胞提取物(若 需要的話，在無細胞反應中加入細胞提取物中未表達的純化因子)，以及(IV) 開發順序蛋白表達方法。
實施例2
無細胞反應中的純化合成酶和純化/受控的tRNA轉錄 該實施例描述摻入非天然胺基酸的方案I和II。方案I是在無細胞反應中 加入純化的正交合成酶和純化的正交tRNA，方案II在無細胞反應混合物中加 入純化的正交合成酶，但在無細胞反應中轉錄正交tRNA。
對於方案I，從線性模板進行體外tRNA轉錄。lmL反應需要200 pL5x 轉錄緩衝液(200 mM Tris-HCl pH 7.9、 100 mM DTT、 125 mM MgCl2)、 80或 160 pL NTP(每種NTP 25 mM)混合物、10 2化M的3H UTP、 50 pL約0.1 mg/mi經PCR產生的純化線性DNA模板(位於T7啟動子後，利用QIA快速 PCR純化試劑盒純化)、25 |iL 40 U/ml RNA酶(out)、 580或505 pl水、10 pL 1 U/ml焦磷酸酶、20 nL 100mM亞精胺和20 pL 5 mg/ml T7 RNA聚合酶。在37 DC孵育該反應混合物3-3.5小時。反應後加入5 DNA酶並在室溫下孵育10 分鐘降解DNA。酚/氯仿抽提法進行純化。方案II中，將tRNA表達基因盒(包 括/pp啟動子和/r C終止子)克隆入pK7載體(參見所附序列)的Pstl位點。
在此實施例中，我們選擇將鄰甲基-L-酪氨酸摻入 pK7mGM-CSF—N75STOP。為進行此項實驗，還需表達和純化起源於詹氏甲垸 球菌的酪氨酸-合成酶突變體。將酪氨酸-合成酶基因克隆入pK7載體並將六組 氨酸標籤與C末端連接。同上所述，Wang等發表了關於產生鄰甲基-酪氨酸取 代所必需的合成酶突變。利用合成酶突變體質粒轉化BL21DE3細胞，在LB 培養基中生長，在0.6OD時用lmMIPTG誘導。3 OD時收集細胞，7140 xg 離心30分鐘。在S30緩衝液(10mM醋酸Tris pH8.2、 14mM醋酸鎂、60 mM 醋酸鉀)中重懸並連續洗滌細胞3次。然後重懸細胞團塊，通過單道勻漿(大於 20,000 V)裂解細胞。裂解的細胞於20,000 x g離心30分鐘。將上清裝載於1 mLNi-NTA柱(安瑪西亞生物科技公司)(Amersham Biosciences),該柱用10 mM咪 唑、50mM磷酸緩衝液(pH8.0)和300m畫aCl平衡。用30ml含25mM咪唑 的同一緩衝液洗柱，用含250mM咪唑的同一緩衝液洗脫。用愛米康(Amicon) Ultra-15離心過濾單元(Centrifugal Filter Unit)(5,000 MWCO)濃縮純化的樣品， 然後用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)重懸並重新濃縮。
本實施例使用能夠保持氧化環境(為二硫鍵的形成和異構化所必需)的標 準PANOx-SP系統，包含如下組分170mM穀氨酸鉀、10mM穀氨酸銨、16 mM穀氨酸鎂、33 mM磷酸烯醇式丙酮酸、2.7 mM草酸鈉、0.6 mM ATP、 GTP、 UTP和CTP各0.43 mM、 1.5 mM亞精胺、1.0 mM腐胺、17 fig/mL亞葉酸、 85.3 |ig/mL大腸桿菌tRNA混合物、20種天然胺基酸各2 mM、 10 |iM L-[U-14C〗-亮氨酸、0.33mM煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、 0.27 mM輔酶A (CoA)、 13.3 |ig/mL pK7mGM-CSF—N75STOP、 0.1 mg/mL T7 RNA聚合酶、4 mM氧化穀胱 甘肽緩衝劑(GSSG)、 lmM還原穀胱甘肽緩衝劑(GSH)、 100 pg/mL DsbC和用 1 mM碘化乙醯胺(IAM)預處理30分鐘的0.24體積KC6大腸桿菌S30細胞提 取物。如Zawada和Swartz Biotechnol Bioeng， 2006. 94(4): 618-24和Liu等(同 上)所述製備細胞提取物。
利用上述PANOx-SP系統37'C合成3小時後，利用液體閃爍計數儀 (LS3801，貝克曼庫爾特公司(Beckman Coulter, Inc.))測量TCA-可沉澱的放射 性並進行SDS-PAGE放射性自顯影(10% Bis-TrisNuPAGE凝膠在MES緩衝液 中電泳)，以便對合成的蛋白進行定量。使用方案I， r^9次反應後最大活性無 細胞合成的mGM-CSF(含鄰甲基-酪氨酸)約為50ng/mL，如圖l定量所示，這 與閃爍計數結果一致。如圖l所示，產生的修飾蛋白量處於這些實驗的檢測下 限。方案II產量同樣很低，『9次PANOx-SP無細胞反應產生20土5ng/mL。
實施例3 體內表達正交tRNA和合成酶 本實施例所使用的標準PANOx-SP無細胞表達環境包含如下組分170 mM穀氨酸鉀、10mM穀氨酸銨、16mM穀氨酸鎂、33mM磷酸烯醇式丙酮 酸、2.7 mM草酸鈉、0.6 mM ATP， GTP、 UTP和CTP各0.43 mM， 1.5 mM亞精胺、1.0mM腐胺、17ng/mL亞葉酸、85.3 |ig/mL大腸桿菌tRNA混合物 、20種天然胺基酸各2mM、 10nML-[U少C]-亮氨酸、0.33mM煙醯胺腺嘌呤 二核苷酸(NAD)、 0.27 mM輔酶A(CoA)、 13.3 |ug/mL pK7CAT—Y109STOP、 0.1 mg/mL T7 RNA聚合酶和0.24體積含體內表達正交rRNA和tRNA合成酶 的KC6大腸桿菌S30細胞提取物。將正交tRNA和合成酶質粒(pDule質粒， 如Wang等公開，同上)轉化入化學感受態KC5細胞後，如Zawada和Swartz， 同上，和Liu等，同上(如下述進行修飾)所述製備細胞提取物，並在3 0D時收 集。
方案III包括從同時表達正交合成酶和正交tRNA的修飾細胞株中產生細 胞提取物。最初按照Zawada等，發酵生物技術(Fermentation Biotechnology), S.B.編，2003，華盛頓特區(Washington， DC): ACS出版社，142-156所述的 步驟進行發酵。然而，大腸桿菌A19苯丙氨酸營養缺陷型菌株和KC6細胞株 在成分確定的培養基上的生長速度為約0.5-0.6小時"。這樣得到的細胞提取物 在我們的無細胞體系中生產CAT修飾蛋白的產量與方案I和II相比並未顯著 提高(如圖2)。換成2x YTPG生長培養基使37°C生長速度增至0.7-0.9小時"。 在提高生長速度後，進行細胞提取物的分析鑑定。通過分析實驗發現細胞提取 物中總蛋白質濃度可接受( 42 mg/mL，布來得福特實驗測定(Bmdford assay))， 天然胺基酸濃度低(<0.2 mM， Dionex HPLC系統測定)，並且小泡濃度不同 (0.5-3.5 mg/L，氯仿抽提後通過磷酸實驗測定(Chen等，Anal.Chem. 1956. 28: 第1756-1758頁，Fiske和Subbarow， 1925， J. Biol. Chem.， 66:第374-389頁。 在系統鑑定中發現升高小泡濃度有助於提高含非天然胺基酸的蛋白產量。如圖 2所示，經系統開發後，含4 mM鄰甲基-酪氨酸的CAT無細胞蛋白合成產量 增至約17 pg/mL活性CAT。圖2所示的放射性自顯影圖(來自MES緩衝液中 電泳的10% Bis-Tris NuPAGE凝膠)表明包含非天然胺基酸的全長蛋白濃度增 加，並且截短蛋白產物的濃度降低。
實施例4
體內表達tRNA並加入純化合成酶 增加無細胞反應中正交合成酶和tRNA的濃度能增加無細胞產物的蓄積並減少琥珀終止密碼子處的蛋白截短。可能的原因是更高的濃度克服了限制正
交合成酶和tRNA濃度的蛋白酶或核酸酶，引起修飾的蛋白產物產量增加。
這個方法中，實現了升高的正交tRNA水平(利用修飾的去除tRNA合成酶 基因的pDULE載體)，並在細胞提取物的生產中進行控制(使用確定培養基)。 然而為了最大程度降低對細胞的應激，另外生產正交合成酶。對於該實驗，生 產並純化易於摻入對-疊氮基-苯丙氨酸的詹氏甲垸球菌酪氨酸-合成酶。Chin 等，同上公開了必要的突變。將該基因插入至T7啟動子後，C末端連接六組 氨酸標籤，所得質粒轉化到BL21DE3 pLys細胞株中。細胞生長於LB培養基 並在0.6 OD時用1 mM IPTG誘導。在3 OD時收集培養物，7140xg離心30 分鐘。在S30緩衝液(10mM醋酸Tris pH8.2、 14mM醋酸鎂、60 mM醋酸鉀) 中重懸並連續離心細胞3次。重懸細胞團塊，通過單道勻漿裂解細胞。裂解的 細胞於20,000 x g離心30分鐘。收集上清，並在室溫下與DNA酶一起培育30 分鐘。將上清裝載於1 mL或5 ml Ni-NTA柱(安瑪西亞生物科技公 司)(Amersham Biosciences),該柱用10 mM咪唑、50 mM磷酸鹽緩衝液(pH 8.0) 和300 mM NaCl平衡。用30 ml含25 mM咪唑的同一緩衝液洗柱，用含250 mM 咪唑的同一緩衝液洗脫。用愛米康(Amicon) Ultra-15離心過濾單元(Centrifugal Filter Unit)(5,000MWCO)濃縮純化的樣品，並用7,000 MWCO透析管對磷酸鹽 緩衝鹽水(PBS)透析。
將含有pK7tRNAmj質粒的KC6細胞株(也可使用前述KGKIO、 MCJ29、 ARGl和ARG2株)培養於裝有確定培養基的4或10升發酵罐中。在3 OD時 收集發酵物，根據Liu等，同上所述簡略步驟製備提取物。對該步驟進行如下 修改(l)勻漿離心後不進行S30緩衝液稀釋，(2)進行一個透析步驟。在一些 情況下，90分鐘徑流(runoff)反應後的最終離心步驟可略去，以保存更高的小 泡濃度。檢測小泡濃度的步驟可獲自Chen等，同上和Fiske和Subbarow，同 上。
本實施例中進行的unAA-PANOx-SP反應包括170 mM穀氨酸鉀、10 mM 穀氨酸銨、0.6 mM ATP， GTP、 UTP和CTP各0.6 mM， 1.5 mM亞精胺、1.0 mM 腐胺、17 pg/mL亞葉酸、85.3嗎/mL大腸桿菌tRNA混合物、20種天然胺基酸 各2mM、 4mM非天然胺基酸、0-167 jig/mL氨醯基合成酶、10 L-[U-14C]-亮氨酸、0.33mM煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、 0.27 mM輔酶A (CoA)、 13.3pg/mL pK7CAT—Y109STOP、 0.1 mg/mL T7 RNA聚合酶和0.24體積大腸桿菌S30細胞提取物。細胞提取物的來源如上所述。unAA-PANOx-SP系統也包括16 mM穀氨酸鎂、33 mM磷酸烯醇式丙酮酸和2.7 mM草酸鈉。這些反應在30。C下進行所示時間長度。
方案IV中，細胞提取物製備中tRNA的受控表達(由缺少tRNA合成酶基因的修飾的pDule質粒表達)、修飾的細胞提取物製備實驗方法以及將純化的對-疊氮基-苯丙氨酸合成酶加入unAA-PANOx-SP無細胞反應中都引起修飾蛋白產量的提高。如圖3A所示，與圖2所示相比，提高合成酶濃度能使全長活性CAT產量提高約10倍(大於125iag/mL)。經過比色實驗的測定，90-100%可溶性CAT濃度為正確摺疊的活性蛋白。對細胞提取物製備實驗方案的這些修改有助於提供更高的正交tRNA和小泡濃度，這些是將修飾蛋白合成時間延長8小時所必需的(參見圖3B)。這保證了活性氧化磷酸化通路，其證據(參見圖3C)是在蛋白合成的第一個小時最初消耗PEP後持續形成產物。
實施例5
改進用於摻入非天然胺基酸的細胞提取物儘管在組合的轉錄/翻譯系統中產生了活性細菌和哺乳動物分泌蛋白，但我們追求更高的產量。我們發現其中一種限制性組分是正交合成酶的濃度。該組分限制的一個原因如圖4第一泳道所示。這是正交對-疊氮基-苯丙氨酸tRNA合成酶蛋白產物，產生於37°C下3小時標準PANox-SP無細胞蛋白質合成反應。反應條件如實施例2所述(用L-[U-"C]-亮氨酸標記產物)。正交合成酶似乎受到了蛋白酶降解。在KC6細胞細胞提取物中加入多於500 (ag/mL L-[U-"C]-亮氨酸標記的正交合成酶進一步證實了這一點。37。C孵育6小時後，放射性自顯影未檢測到全長合成酶。通過控制合成酶降解，我們嘗試增加修飾蛋白的產
使用Swartz實驗室產生並證實能夠將二硫鍵還原酶濃度降至最低並穩定胺基酸濃度的細胞株(KGKIO和KC6)來構建新的細胞株。缺失或突變編碼外膜蛋白T的o^ r基因對細胞進行修飾，使基因產物缺失，或者雖然仍出現在我
26們的細胞提取物中，但無蛋白酶活性，而保留侶伴蛋白活性。
如Jewett在其博士論文中(化學工程系，2005，史丹福大學斯坦福，第240頁)所述產生MCJ29突變株。利用pKO載體[28]構建用於等位基因交換的質粒，通過基因置換得到ARG1和ARG2突變體。利用引物ompTNo和ompTCo(基於獲自G.M. Church網站的序列)從基因組DNA中PCR擴增側接待置換基因0m;7r的約l kb片段。利用合適的限制性酶NotI和SalI，我們將PCR產物從野生型om/ r克隆到pKOV載體中。然後將所需的D83A突變引入野生型ompr基因序列，使用的是QuikChange定位誘變試劑盒及引物ompTD83AmutF(SEQ ID NO: 11)
(GTGGCAATATGGTCGCTCAGGACTGGATGG)禾口 mutR(SEQ ID NO: 12)(GGTAGGTCAAGGACTCGCTGGTATAACGGTG)。將克隆入pKOV基因置換載體的突變等位基因電穿孔到KC6(最終生成ARG1)或KGK10(最終生成ARG2)中，30°C下細胞恢復1小時。將細胞鋪於預熱的氯黴素/LB平板並在42°C孵育。為檢測整合頻率，電穿孔細胞也鋪於氯黴素/LB平板並在30°C孵育。從42°C平板上挑選1-5個集落到1 mL LB肉湯中，連續稀釋並立即鋪於30°C 5%w/v蔗糖平板上。在30°C氯黴素平板上篩選5%蔗糖平板上的集落以檢測置換載體的丟失。總而言之，我們通過"集落挑選"尋找蔗糖耐受和氯黴素敏感的集落中的置換事件，並用引物ompT5'和ompTD83APCR確證我們的選擇。結果是新細胞株ARG1和ARG2在ompT基因中包含失活的D83A突變。
圖4顯示在無細胞蛋白質合成反應中表達後正交合成酶蓄積的放射性自顯影分析。用MES緩衝液中電泳的10% Bis-Tris NuPAGE凝膠進行放射性自顯影。對-疊氮基-苯丙氨酸tRNA合成酶被KC6細胞提取物中的蛋白酶嚴重降解。當使用ARG1、 ARG2或MCJ29突變細胞株生產細胞提取物時，合成酶不被降解(因為所有結果均類似故只給出一個實例)。當將ompT缺失或突變摻入KC6或KGK10細胞株中時，新產生的合成酶是穩定的。
，第二泳道，對製備細胞提取物所使用細胞進行的這些基因組修飾幾乎可以消除標準PANOx-SP反應時產生的對-疊氮基-苯丙氨酸tRNA合成酶的降解作用。當對-乙醯基-苯丙氨酸合成酶與ARG1和MCJ29細胞提取物37°C共孵育6小時後，觀察到相同的結果。實施例6
在無細胞平臺中高水平生產含非天然胺基酸的細菌蛋白
當使用上述任何備選能量系統時，選擇unAA-PANOx-SP舉例說明包含非天然胺基酸的蛋白產量增加。具體說，在本實施例中無細胞反應包括170 mM穀氨酸鉀、10 mM穀氨酸銨、0.6 mM ATP， GTP、 UTP和CTP各0.6 mM， 1.5mM亞精胺、1.0 mM腐胺、17 ng/mL亞葉酸、85.3 ^g/mL大腸桿菌tRNA混合物、20種天然胺基酸各2 mM、 2 mM非天然胺基酸、150 pg/mL氨醯基tRNA合成酶、10 pML-[U-"C]-亮氨酸、0.33 mM煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、 0.27mM輔酶A(CoA)、 13.3 pg/mL模板質粒、0.1 mg/mL T7 RNA聚合酶和0.29體積含正交詹氏甲烷球菌tRNA的S30提取物(使用專用細胞系之一製備)。細胞提取物的來源如上所述。unAA-PANOx-SP系統也包括16 mM穀氨酸鎂、33 mM磷酸烯醇式丙酮酸和2.7 mM草酸。
圖5顯示含對-疊氮基或對-乙醯基-苯丙氨酸的CAT產量(與圖2顯示數據相比)有顯著性增加。方案I和II與圖1顯示的mGM-CSF產量相似。類似的，方案IIIa證實了圖2、實施例3中顯示的提高的修飾蛋白產量。此外，方案IIIb證實了圖3中顯示的重複性和合成酶限制。最後，利用本實施例所列舉的組合物，方案IIIc顯示unAA-PANOx-SP組分比例(非天然胺基酸、正交合成酶和細胞提取物)的優化、反應條件的優化(30。C 8小時)、使用突變細胞株製備細胞提取物(ARG1和ARG2)及其製造過程的修飾，將pK7tRNAmj質粒摻入新細胞株中， 一種新型基於細菌的無細胞體系，其產生包含對-疊氮基或對-乙醯基-苯丙氨酸的修飾蛋白的產量增加2-3倍(多於300 pg/mL)。其產量約為類似無細胞反應(不加入非天然胺基酸)中野生型CAT蛋白產量的75X。此外，如圖5所示，通過放射性自顯影分析方案IIIc中蛋白產物顯示，無細胞反應的產物主要是包含非天然胺基酸的全長蛋白。
實施例7
合成具有生物活性的含非天然胺基酸的哺乳動物分泌蛋白由於設計出一種新型基於細菌的無細胞體系並能增加CAT產量，因此可以開始將非天然胺基酸摻入到一些不同的複合蛋白中，而尚未生產出含有非天
然胺基酸的此類蛋白。本文所示複合蛋白的例子為mGM-CSF、 hGM-CSF和TetA膜蛋白。此類技術平臺可延伸至本實施例未指出的大量複合蛋白，包括但不限於融合蛋白、單鏈可變區片段(scFv)、 Fab抗體片段和全長抗體。
在進行類似於實施例6所述的unAA-PANOx-SP無細胞反應後，通過細胞增殖實驗檢測pK7mGM-CSF—N75STOP 、 pK7hGM隱CSF—N36STOP或pK7hGM-CSFOPT—N36STOP產生的活性蛋白。為了保證摺疊正確，通過補充4 mM GSSG、 1 mM GSH和約100 |ig/mL DsbC到反應混合物中修飾實施例6所述unAA-PANOx-SP系統，以保持氧化蛋白摺疊環境。此外，使用1 mM碘化乙醯胺(IAM)預處理細胞提取物。首先在反應容器中加入小體積的濃縮IAM。然後快速加入較大體積的S30提取物並與小體積IAM充分混和。在用於無細胞反應前，將提取物在室溫下與IAM孵育30分鐘。使用包含修飾的pDule質粒(缺少tRNA合成酶基因)的KC6細胞株製備細胞提取物並在30 °C下進行無細胞反應6小時。
利用mGM-CSF或hGM-CSF依賴性細胞系、NFS-60或TF1(購自ATCC)檢測鼠和人的GM-CSF生物學活性。將可溶性無細胞表達蛋白以及鼠和人GM-CSF的商品化標準品一式三分地進行連續稀釋。將等體積的含10。%FCS的RPMI培養液和對數期細胞培養物加入連續稀釋的無細胞產物和GM-CSF標準品中以檢測其刺激細胞增殖的能力。細胞以5000個細胞的濃度接種到96孔平底組織培養板中。37。C和5。/。 CO2孵育NSF-60細胞16-20小時，孵育TF1細胞36-48小時，每孔加入50 pI^H]-胸苷使終濃度為6.7 laCi/mL，通過卩H]-胸苷摻入檢測增殖。37°C和5% C02中孵育細胞8-10小時後，將細胞收集到玻璃纖維過濾墊上並洗滌。利用瓦拉赫(Wallach) 1450微p閃爍計數器(珀金埃爾默公司生命科學部(Perkin Elmer Life Sciences))測定[3H]-胸苷的摻入。
圖6顯示unAA-PANOx-SP無細胞蛋白合成體系產生修飾二硫鍵連接蛋白的產量。此外，如圖7的生物學活性數據(採用前述方法)所示，所產生的蛋白摺疊正確並具有生物學活性。這些結果表明新型無細胞體系產生包含非天然胺基酸的活性二硫鍵連接蛋白具有GM-CSF活性，與體內系統產生的蛋白活性相當。那些不包含正交tRNA、合成酶、非天然氨基的無細胞反應不產生任何刺激細胞增殖的蛋白。這些數據也表明在N或C末端含GM-CSF或類似免疫刺 激物的融合蛋白構建物可摻入非天然胺基酸，並可通過此種新型無細胞蛋白合 成平臺生產。
實施例8 將非天然胺基酸摻入膜蛋白
使用穀氨酸磷酸鹽無細胞體系產生正確摺疊膜蛋白的獨特性在於它也需 要使用由Muller和Blobel Proc Natl Acad Sci U S A， 1984， 81(24): 7737-41和 Osborn等，J Biol Chem 1972. 247(12): 3962-72改造的方法製備小泡溶液。重 懸KC6細胞並用20mM Tris-HCl pH 8.0， lmM EDTA洗滌。最終細胞團塊重 懸於同樣緩衝液(每克細胞使用1 mL緩衝液)並在冰上與0.2 mg/mL雞蛋白溶菌 酶共同孵育15分鐘。孵育後，細胞溶液通過20,000W勻漿器三次。30,000 x g 20 分鐘離心兩次去除未破碎的細胞和碎片。超速離心(154,000xg， 1.5小時)收集 小泡，並用0.5 mL/g細胞含250 mM蔗糖的緩衝液H(20 mM HEPES-KOH pH 7.5， 1 mM DTT、 5 mM EDTA)以231,000 x g離心1小時重新得到團塊。將這 些粗純化的小泡重懸於20。/。(w/w)蔗糖中，並裝載於含50%、 45%、 40%、 35%、 30°/4B25%(w/w)蔗糖層的步進梯度的頂部。114000 x g超速離心24小時後， 收集含內膜小泡的組分。小泡形成團塊後以高濃度(l-2 mg/mL)重懸於20mM HEPES-KOHpH7.2、 60mMKCl、 lmMDTT中。
生成無細胞組分後，我們使用組合穀氨酸磷酸鹽轉錄/翻譯體系合成含非 天然胺基酸(對-疊氮基-苯丙氨酸)的膜蛋白TetA，並評估它是否能夠正確摺疊 到小泡膜中。用於摻入非天然胺基酸的穀氨酸磷酸鹽無細胞反應的組分包括 13.3 pg/mL pK7TetA—D34STOP或pK7TetA—Q182STOP (參見所附序列)、1.2 mMAMP、 0,86mMCMP、 0.86 mM GMP、 0.86mMUMP、 34 |ig/mL亞葉酸、 170.6嗎/mL大腸桿菌tRNA混合物、20種天然胺基酸各2 mM、 4 mM非天然 胺基酸、75嗎/mL氨基醯基合成酶、0.33mM煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、 0.27 mM輔酶A(CoA)、 1 mM腐胺、1.5mM亞精胺、4mM草酸鈉、1 mM 二 硫蘇糖醇、10mM穀氨酸銨、130mM穀氨酸鉀、8mM穀氨酸鎂、10 mM磷 酸鉀pH7.2、 12 [14C]-亮氨酸、0.1 mg/mLT7RNA聚合酶、0.29體積大腸桿菌S30細胞提取物和0.21體積內膜小泡溶液。
圖8A的放射性自顯影中清楚表明，我們能生產含非天然胺基酸的TetA 膜蛋白(42.5 kDa)。這是在37'C無細胞蛋白質合成6小時的結果。使用液體閃 爍計數器測量TCA-可沉澱放射性，能定量測定合成的總蛋白質。質粒 pK7TetA—D34STOP和pK7TetAQ 182STOP產生的TetA突變蛋白為226和349 pg/mL。在進一步分析前，相對500-1000體積的10mM Tris-HCl pH 8.0、 100mM KC1緩衝液在100 kDa MWCO透析袋中透析三次，每次透析3小時，透析後 更換緩衝液，從而粗純化該反應。
為了測定插入大腸桿菌小泡的蛋白量，我們將透析的無細胞反應產物進行 蔗糖浮選實驗。將透析的無細胞反應產物與濃蔗糖溶液混和，並裝載於三步蔗 糖梯度的底部。選擇層密度，以便在超速離心(16小時，237,000 xg)後，錯誤 摺疊的蛋白聚集體(密度p 1.3g/mL)停留於底層，而較輕小泡(p 1.13-1.25g/mL，取決於被插入蛋白的量)漂浮於第二層之上的交界面上。圖8 顯示了蔗糖浮選分析後放射性標記的TetA的分布。在整個梯度中加入6M尿 素以減少合成蛋白與膜的非特異性結合。當反應中出現小泡時，我們發現大多 數合成TetA與小泡結合(組分2)。當蛋白合成反應中不加入小泡時不發生這種 結合，正如聚集TetA保留在較低組分中(組分6-8)所揭示的那樣。不包含另外 小泡的反應未出現大量膜結合或聚集的蛋白產物。這強調了包含非天然胺基酸 的蛋白質的生產過程中氧化磷酸化的重要性。當不另外加入小泡時此通路不激 活。如圖8B所示將要插入小泡的TetA的量對應於每mL無細胞反應產生大於 100嗎插入TetA的總體產量。既然Q182STOP反應的主要產物是截短且與小 泡連接的，因此顯然也插入了截短的182胺基酸TetA(參見圖8A)。
為了保證我們的膜蛋白正確插入小泡，我們將透析的反應混合物暴露於2 pg4iL非特異性蛋白酶-蛋白酶K。與膜內片段或小泡內部的片段相比，未包埋 入膜的膜蛋白部分-如胞質結構域或跨膜片段間的大環-被蛋白酶更快速降解。 因此，通過觀察隨時間推移蛋白酶K消化產生的蛋白片段，我們可以驗證蛋白 是否具有對應於正確摺疊的所需拓撲結構。
圖9顯示了與蛋白酶K25t孵育後的帶型。甚至在孵育60分鐘後，小泡 中仍然出現了顯著比例的全長TetA。然而，當用LDS去汙劑溶解膜後，TetA不再受到保護避免消化。因此，TetA被摻入小泡膜中。
這些數據表明利用無細胞表達系統合成大量修飾膜蛋白質；並進一步顯示 合成蛋白被插入小泡中並正確摺疊。
實施例9 合成優化的MS2基因
材料和方法
質粒構建利用DNAworks根據大腸桿菌tRNA相關濃度(優選密碼子)和 從寡核苷酸合成對MS2外被蛋白基因進行優化。利用兩步PCR，將基於 DNAworks推薦序列的寡核苷酸(平均長度60 bp，歐普龍技術公司，美 國)(OperonTechnologies，USA)組裝到優化的MS2外被蛋白基因核苷酸序列中。 將優化的MS2外被蛋白序列連接(T4 DNA連接酶，NEB公司，美國)入 pET-24a(+)載體(諾瓦基公司，美國)(Novagen， USA)的Nde I和Sal I限制性位 點中，產生pET24a-MS2cp。用pET24a-MS2cp轉化DH5a細胞(One Shot MAXX Efficiency DH5a-T^感受態細胞，英傑公司(Invitrogen))，並用凱傑質粒大抽試 劑盒(凱傑公司，瓦倫西亞，加州)純化質粒。利用兩步PCR和定製寡核苷酸(歐 普龍技術公司，美國)，將T15STOP(琥珀終止密碼子)取代突變入MS2cp序列。 將突變序列連接入pET24a(+)載體(諾瓦基公司，美國)的Nde I和Sal I限制性 位點中，命名為pET24a_MS2cp—T15STOP。用載體轉化DH5a細胞(One Shot MAXX Efficiency DH5a-TlK感受態細胞，英傑公司)，並用凱傑質粒大抽試劑 盒(凱傑公司，瓦倫西亞，力口州)純化用於無細胞蛋白合成反應的質粒。優化的 外被蛋白序列提供為SEQ IDNO:9。
實施例10
表達含非天然胺基酸的MS2外被蛋白
材料和方法
PANOx-SP無細胞表達系統。本實施例進行的PANOx-SP無細胞反應6為 30 pL體系，在1.5 mlEppendorf試管中30°C孵育8小時。該反應包括如下組 分1.2 mM ATP， GTP、UTP和CTP各0.85 mM， 34 pg/mL亞葉酸、170.6嗎/mL
32大腸桿菌tRNA混合物、24 nM pET24aMS2_T15STOP質粒、100 pg/mL T7 RNA 聚合酶、5 l-[U-"C]-亮氨酸、20種未標記的胺基酸各2 mM、 4 mM對-疊 氮基-苯丙氨酸、~150 )ig/mL純詹氏甲烷球菌突變的酪氨酸合成酶、0.33 mM 煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、 0.27 mM輔酶A (CoA)、 30mM磷酸烯丙醇丙 酮酸、1.5mM亞精胺、lmM腐胺、170mM穀氨酸鉀、10mM穀氨酸銨、20 mM穀氨酸鎂、2.7mM草酸鈉和28。/。v/vKC6jRNAS30細胞提取物，如下所 述進行製備。如Grodberg和Dunn所述從大腸桿菌菌株BL21 (pAR1219)中制 備T7RNA聚合酶。
純化詹氏甲垸球菌正交酪氨酸合成酶。在本實驗中生產並純化易於摻入對 -疊氮基-苯丙氨酸的詹氏甲垸球菌酪氨酸-合成酶突變體。Chin等，同上公開了 必要的突變。將該基因插入到T7啟動子後，六組氨酸標籤連接於C末端，將 所得質粒轉化到BL21DE3 pLys細胞株中。該細胞生長於LB培養基中並在0.6 OD時用1 mMIPTG誘導。在3 OD時收集細胞並以7140 x g離心30分鐘。重 懸細胞並用S30緩衝液(10mM醋酸TrispH 8.2， 14 mM醋酸鎂、60 mM醋酸 鉀)連續洗漆三次。重懸細胞團塊，通過單道勻漿裂解細胞。裂解的細胞於20,000 x g離心30分鐘。收集上清並在室溫下與DNA酶孵育30分鐘。將上清裝載於 1 mL或5 ml Ni-NTA柱(安瑪西亞生物科技公司)(Amersham Biosciences),該柱 用10 mM咪唑、50 mM磷酸鹽緩衝液(pH 8.0)禾卩300 mMNaCl平衡。用30 ml 含25 mM咪唑的同一緩衝液洗柱，用含250 mM咪唑的同一緩衝液洗脫。用 愛米康(Amicon) Ultra-15離心過濾單元(Centriftigal Filter Unit)(5,000 MWCO)濃 縮純化的產物，並用7,000 MWCO透析管對磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)透析。
生產含有髙濃度正交tRNA的S30細胞提取物。該方法中，得到升高的正 交tRNA水平(利用tRNAmj基因，SEQIDNO:IO，插入pK7載體)，並在細胞 提取物生產中加以控制。用細胞株 KC6(A19AtonAAtnaAAspeAAendAAsdaAAsdaBAgshA met+)生長中表達的 pK7tRNAmj質粒產生細胞提取物。包含pK7tRNAmj質粒(稱作KC6—tRNA)的 KC6細胞株(也可使用KGKIO、 MCJ29、 ARG1和ARG2)培養於含確定培養基 的4-升發酵罐中(18)。在3 OD時收集發酵物，並用Liu等所述簡略步驟製備 細胞提取物。對該步驟進行如下修改(1)勻槳離心後不進行S30緩衝液稀釋，(2)進行一次透析步驟。。
檢測蛋白產量利用液體閃爍計數儀(LS3801，貝克曼庫爾特公司(Beckman Coulter, Inc.))測量TCA-沉澱和放射性，以檢測蛋白合成總量。樣品在25°C 和15,000 RCF離心15分鐘後，對上清進行TCA沉澱和閃爍計數，以測定可 溶性蛋白的產量。
結果
進行使用pET24a—MS2cp—T15STOP的30 的PANOx SP系統無細胞反 應，經測定總蛋白和可溶性蛋白的產量分別為77嗎/ml (±6.6嗎/ml)和63 ng/ml (±3.2 |ng/ml)，如圖IO所示。
實施例11
展示摻入對-疊氮基-苯丙氨酸的MS2 VLP的組裝體 材料和方法
SDS-PAGE和放射性自顯影15,000 x g離心15分鐘將可溶性蛋白與不溶 性組分分離。將樣品與Markl2 MW分子量標準品(英傑公司)施加於MES緩衝 液中的NuPAGE 10% Bis Tris凝膠(英傑公司，加利福尼亞州拉霍亞)中電泳。 利用考馬斯亮藍染料(伯樂公司(BioRad))對凝膠進行染色，並在幹膠儀(型號 583)(伯樂公司，里奇蒙，加州)上乾燥，然後在柯達科學成像膠片(羅徹斯特， 紐約州)上曝光。
透析為了移除未摻入的L-[U-"C]-亮氨酸，在6-8000 MWCO Specra/Pro Molecularporous膜管(光譜實驗室公司)(Spectrum Labs)中對300 mL TSM緩衝 液(10mMTris-HCl、 lOOmM氯化鈉、lmM氯化鎂，pH 7.0)透析無細胞產物 過夜，期間緩衝液更換兩次。
蔗糖步進梯度速率沉降對透析的無細胞rxn產物進行蔗糖非連續梯度離 心。多聚阿洛糖16x102 mm離心管(貝克曼公司，加利福尼亞州帕洛阿爾託) 中依次充滿l mL蔗糖溶液，這些溶液是用TSM緩衝液和15mMEDTA配製的， 其中蔗糖濃度以2.5%w/v的步長逐步降低(40%、 37.5%、 35%、 32.5%、 30%、 27.5%、 25%、 22.5%、 20%、 17.5%、 15%、 12.5%、 10%w/v)。透析的無細胞 反應產物位於試管頂部，並在安裝貝克曼庫爾特公司的SW-32擺臂吊桶轉頭(加利福尼亞州富勒敦)的貝克曼L8-M超速離心機中以4°C 31,000 rpm離心3.5 小時，並採用"緩慢"加速(程序9)和"無剎車"減速。利用Teledyne Isco Foxy Jr.密度梯度分級系統(新英格蘭州林肯)收集0.5 mL組分，並用TCA-沉澱和液 體閃爍計數器(LS3801，貝克曼庫爾特公司)放射性測定來檢測每一組分中MS2 外被蛋白的濃度。
蔗糖梯度組分放射性標記的MS2外被蛋白產量的測定將各組分50 點 樣在不同色譜紙(沃特曼公司，美國)上，乾燥後通過檢測放射性從而測定每一 蔗糖梯度組分中MS2外被蛋白產量。將色譜紙浸沒於5 mL貝克曼Readysafe 閃爍混合物中，在液體閃爍計數器(LS3801，貝克曼庫爾特公司)上計算放射性。 根據MS2外被蛋白分子量及MS2外被蛋白中可摻入放射性標記的亮氨酸的亮 氨酸數目，將放射性計數轉化為產量。
VLP濃縮用梯度組分和TSM緩衝液填充艾米康(Amicon)Ultra-4 100,000 MWCO離心過濾裝置至4 ml，以便濃縮含VLP的蔗糖梯度組分。在配備 Fiberlite F13-14xl5cy轉頭(派拉蒙技術公司(Piramoon Tech.))和Fiberlight 15mL 適配器(派拉蒙公司)的索福(Sorvall) RC5B離心機中，將該單元4°C 5,500 rpm 離心15分鐘。立即取出濃縮樣品並儲存於4。C。
結果
平行進行陽性、陰性對照，以證實在使用pET24a—MS2cpJT15STOP載體 的PANOx-SP修飾的無細胞反應中產生的所有蛋白質均包含對-疊氮基-苯丙氨 酸非天然胺基酸。在相同條件、但不存在正交合成酶的情況下進行陰性對照。 在PANOx-SP修飾的無細胞反應中，利用pET24a一MS2cp載體進行陽性對照實 驗。在方法部分描述的基於原核細胞的無細胞反應中pET24a—MS2cp—T15STOP 載體表達的，經過蔗糖梯度速率沉降和放射性計數測定的摻入對-疊氮基-苯丙 氨酸的MS2外被蛋白的組裝體產量為22嗎/mL (+/- 0.6嗎/mL， n=2)，如圖11 所示。
實施例12
通過賽默菲尼根(ThermoFinnigan) LCO Deca XP+離子阱LC-MS檢驗含有 180個可及對-疊氮基-苯丙氨酸的MS2 VLP的組裝體材料和方法
質譜實驗方法利用艾米康-ultra4膜濾器濃縮非天然胺基酸慘入的MS2衣 殼和對照野生型MS2衣殼。這些樣品獲自組裝的MS2VLP，組裝的MS2VLP 來自與圖11所示類似的蔗糖密度梯度樣品。將這些樣品施加於SDS-PAGE NuPAGE10。/。BisTris凝膠(英傑公司，加利福尼亞州拉霍亞)。在MES電泳緩 衝液(英傑公司)中60 mA條件下將樣品與Markl2 MW分子量標準品(英傑公司) 電泳60分鐘，並用SimplySafe染料(英傑公司)進行染色。以少量水衝洗凝膠 過夜使其脫色。將13.7kD條帶從溼的凝膠上切下，儘可能避免周圍空白膠。
在切出的凝膠片段中加入IO mL 45 mM二硫蘇糖醇(DTT，西格瑪公司) 和100 mL 100 mM Tris pH 7.8， 55'C孵育樣品30分鐘，之後棄去溶液相。接 下來在凝膠片段中加入10 mL 100 mM丙烯醯胺(ICN)和100 mL 100 mM Tris pH 7.8並將混合物室溫下孵育30分鐘。再一次棄去溶液相。用500 mL 50 mM Tris pH 7.8/50。/。乙腈(ICN)洗滌凝膠片段30分鐘，棄去溶液相。然後在SpeedVac 旋轉蒸發裝置中將凝膠片段完全乾燥。最後，將25 mM Tris pH 7.8配製的5 pmol糜蛋白酶加入到凝膠片段中，溶脹後，加入足量的25 mM Tris pH 7.8剛 好淹沒凝膠片段。37°C孵育片段過夜。去除溶液相，不作進一步處理，直接 注入賽默菲尼根LCQ Deca XP+離子阱LC-MS並進行分析。
結果
圖13A顯示包含T15胺基酸的MS2野生型衣殼單體的糜蛋白酶消化 片段的HPLC圖(881.6m/z)。消化後，含T15片段的序列為(SEQ ID NO: 13) VLVDNGGTGDVTVAPSNF， MW=1761.91， m/z=882。圖13B顯示MS2 野生型單體樣品，並顯示我們預計若包含非天然胺基酸，則會出現如圖13A 所示同一片段的HPLC圖區域(912 m/z)。預計包含T15對-疊氮基-苯丙氨酸 的片段的序列為(SEQ ID NO:13) VLVDNGGXGDVTVAPSNF，其預計分子 量和質荷比為MW=1821， m/z=912。不出所料，野生型MS2對照樣品不包 含非天然胺基酸，因為糜蛋白酶解後未發現對應預計非天然氨 基酸摻入片段洗脫的峰。
圖13C顯示T15位被對-疊氮基-苯丙氨酸取代的MS2衣殼的色譜圖。 如前所述，若非天然胺基酸未被摻入，該位置出現我們期望的片段。顯然並非如此。最後，圖13D顯示了含T15對-疊氮基-苯丙氨酸取代的MS2單 體樣品的HPLC圖和測定的荷質比。在預期處洗脫出峰，且該峰具有摻入 非天然胺基酸的肽片段的預期質荷比。這些結果允許我們得出結論我們 成功將對-疊氮基-苯丙氨酸摻入到MS2病毒衣殼的外部表位上。
應當被理解的是本發明不局限於所述具體方法、實驗方法、細胞系、動物 種屬、構建物或諸如此類。同樣應被理解的是本文所用術語僅僅用於描述具體 實施方式，而非限制本發明的範圍，本發明的範圍僅受所附權利要求書的限制。
除非另有說明，所有本文使用的技術和科學術語具有本發明所屬領域一般 熟練技術人員通常理解的含義。儘管與本文所述相似或相等同的任意方法、設 備和材料均可用於實踐或檢測本發明，但本文仍敘述了優選的方法、設備和材 料。
所有本文提及的公開物通過引用納入本文，用以描述和公開，例如，公開 物中所述的細胞系、構建物和方法，它們可用於本發明。提供如上所述和遍及 全文的公開物僅因為其
公開日早於本申請的提交日。本文不承認本發明人沒有 資格根據現有發明而提前公開本申請。
權利要求
1. 一種在無細胞體外反應中合成多肽的方法，該多肽包含至少一個位點特定的非天然胺基酸，所述方法包括在無細胞體外翻譯反應混合物中合成所述多肽，所述反應混合物包含與無義密碼子形成鹼基配對的正交tRNA、細菌細胞提取物、多肽和/或mRNA合成機器組分；所述多肽的轉錄模板；合成所述多肽的單體；翻譯所需的輔因子、酶和其它試劑；其中所述反應混合物包含外源性合成的正交tRNA合成酶，所述正交tRNA合成酶能用非天然胺基酸氨醯化正交密碼子；其中合成所述多肽使其含有至少一個位點特定的非天然胺基酸。
2. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，加入所述反應混合物的所 述外源性合成的正交tRNA合成酶的濃度為至少30 ^g/ml。
3. 如權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述正交tRNA由作為所述 細菌細胞提取物來源的細菌內源性合成。
4. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述反應混合物產生至少 約50貼/ml含至少一個位點特定的非天然胺基酸的蛋白質。
5. 如權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述含至少一個位點特定 的非天然胺基酸的蛋白質中至少50%具有生物學活性。
6. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述含至少一個位點特定 的非天然胺基酸的蛋白質由偶聯的轉錄翻譯反應合成。
7. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述正交tRNA與終止密 碼子形成鹼基配對。
8. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，在所述無細胞體外翻印反 應中，氧化磷酸化是激活的。
9. 如權利要求8所述的方法，其特徵在於，在所述無細胞體外翻譯反 應中加入外源性膜小泡。
10. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述含至少一個位點特 定的非天然胺基酸的蛋白質為膜結合蛋白。
11. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述含至少一個位點特 定的非天然胺基酸的蛋白質為分泌蛋白。
12. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述含至少一個位點特 定的非天然胺基酸的蛋白質含有至少一個二硫鍵。
13. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述多肽為病毒外被蛋白。
14. 如權利要求13所述的方法，其特徵在於，合成兩種或多種外被蛋白。
15. 如權利要求13所述的方法，其特徵在於，所述病毒外被蛋白是噬 菌體外被蛋白。
16. 如權利要求15所述的方法，其特徵在於，所述噬菌體是MS2。
17. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述非天然胺基酸提供氨 基酸中少見的反應基團。
18. 如權利要求17所述的方法，其特徵在於，所述非天然胺基酸是修 飾的苯丙氨酸或酪氨酸。
19. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述非天然胺基酸是在鄰 位或對位進行修飾的胺基酸。
20. 如權利要求19所述的方法，其特徵在於，所述非天然胺基酸選自 對-乙醯基-苯丙氨酸、對-乙炔基-苯丙氨酸、對-炔丙基氧基苯丙氨酸或對-疊氮基-苯丙氨酸。
21. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述無細胞體外翻譯反 應包含衍生自ompT-突變細菌菌株的細菌提取物。
22. —種用於權利要求1-21中任一項所述方法的試劑盒。
全文摘要
本發明提供使用細菌無細胞提取物合成在一個或多個特定殘基上含有非天然胺基酸的多肽的方法。
文檔編號C12N9/10GK101479379SQ200780024345
公開日2009年7月8日 申請日期2007年6月29日 優先權日2006年6月29日
發明者A·R·戈爾科, J·R·斯沃茨 申請人:利蘭·斯坦福青年大學託管委員會