重組人psp94蛋白在大腸桿菌中分泌表達的方法
2023-04-24 22:12:26 3
專利名稱：重組人psp94蛋白在大腸桿菌中分泌表達的方法
技術領域：
本發明涉及一種採用大腸桿菌分泌表達有生物活性的人PSP94蛋白的方法。
背景技術：
前列腺癌是老年男性代表性疾病。1996年起美國前列腺癌的發病率已居男性惡性腫瘤的第一位，而死亡率僅次於肺癌位居癌症死亡第二位。因為，前列腺位置隱蔽，癌多發生在遠離尿道的周邊區，現代檢測技術血清PSA檢測難以滿足早期診斷的需要，使很多患者失去治療的機會。
迄今，我國臨床前列腺癌仍是晚期才能診斷。1999年起，本課題組所在的「前列腺疾病防治研究中心」在中日政府間專項技術合作項目的援助下，應用血清PSA對長春市16500餘名50歲以上男性進行了前列腺癌集團普查，前列腺癌的發現率超過1.7％。其中，中晚期病例佔42％，伴有骨轉移者佔18.8％。我們認為PSA＞10.0ng/ml的可疑人群中PSA對前列腺癌診斷有明顯的特異性。譬如，PSA含量＞40.0ng/ml的可疑人群中前列腺癌診斷率超過95％，而PSA＞20.0ng/ml的人群中診斷率超過75％。然而，在PSA含量≥4.0ng/ml-10.0ng/ml，所謂「灰色區」的可疑人群經超聲引導下活檢，前列腺癌的診斷率僅15％上下。因此，為提高PSA灰色區域的前列腺癌診斷效率，急需探索新的腫瘤標誌物。
近年國內外的研究結果表明，前列腺上皮細胞合成分泌的一種含有94個胺基酸的蛋白，即PSP94，在治療和監測前列腺癌進展方面具有良好的應用前景。因PSP94主要存在於前列腺液中，天然的PSP94很難大量獲得。目前國內外對PSP94的表達多採用重組融合蛋白形式，這種融合表達雖然具有表達效率較高、蛋白降解較少等優點，但表達後需酶切或化學裂解去除融合蛋白，並且產生的蛋白以無活性的包涵體形式存在，需要體外變性再復性的過程，大大增加了產品下遊的工作量。由於PSP94為多半胱氨酸蛋白，體外復性，難以形成正確的二硫鍵，所得蛋白的幾乎無生物活性。
現有的蛋白分泌表達技術，是在載體編碼信號肽序列的DNA下遊連接多克隆位點。連入目的基因後，多克隆位點的DNA也翻譯成胺基酸，從而有可能使表達的分泌蛋白失去生物活性，作為藥物有可能引起人體的免疫反應，產生各種副作用。
發明內容
為了克服現有的PSP94表達後處理繁瑣，工作量大，活性產品得率低的不足，本發明提供一種重組人PSP94蛋白在大腸桿菌中分泌表達的方法。通過對信號肽的基因突變，將酶切位點設計到信號肽內部，去除多克隆位點引起的多餘胺基酸問題。重組蛋白直接分泌到雜蛋白較少的周質空間，不但避免了菌體內各種蛋白酶對重組蛋白的降解，增高了表達水平，易於純化。而且在周質空間的氧化型環境下蛋白可以形成天然情況下的二硫鍵，直接得到具有天然結構的蛋白質，細胞學實驗證明了其生物學活性。採用溫控型表達，避免了使用誘導劑的成本。
本發明採用的技術方案是一、PSP94 cDNA的克隆擴增提取前列腺組織總RNA，通過RT-PCR方法釣取中國人PSP94cDNA序列，插入克隆載體pUC19中，PCR粗篩後進行序列測定；二、重組分泌型表達載體的構建將雙酶切後的PSP94蛋白編碼基因、信號肽和pBV220質粒進行連接，構建重組質粒pBV-PSP94；
三、重組PSP94蛋白表達陽性重組質粒pBV-PSP94分別轉化大腸桿菌菌株，如JM109、HB101、LB21菌株，優選JM109表達效果最好，故PSP94蛋白選取JM109作為宿主菌進行表達，經摸索蛋白誘導表達最適溫度為40℃，最佳表達時間為5小時。
步驟二信號肽採取經修飾過的天然白喉毒素信號肽。
步驟二經修飾過的天然白喉毒素信號肽為ES1為含EcoR I酶切位點的信號肽有意鏈引物5』-CGGAATTCGTGAGCAGAAAACT-3』ES25』-GATGC ATG CGC TGA AGG TGG GGC CCC TAT CCCCAG TAG CGC CCC TAT TAA GAT TGA CGC AAA CAG TTT TCTGCT CAC GAATTCCG-3』我們利用pBV220質粒作為表達載體，其含有受溫度調控的強啟動子PRPL。引入了改造的白喉毒素信號肽順序。利用胺基酸密碼字的兼併性，即利用基因編碼多個密碼子對應一種胺基酸的性質，在不改變胺基酸序列的前提下突變白喉毒素的信號肽的基因，將限制性內切酶位點SphI引入到信號肽序列內，便於PSP94基因的連接。利用RT-PCR技術從人前列腺組織中複製人PSP94基因。採用PCR技術在PSP94蛋白編碼基因的N端引入SphI位點。C端引入連接的限制性內切酶位點並設計了雙終止密碼子，可保證蛋白翻譯的正確終止。經酶切，連入改造後含有白喉毒素信號肽順序的載體。篩選具有插入基因的克隆質粒。優化表達的菌株和表達條件。利用半透膜的截留性質，分離純化PSP94。採用SDS-PAGE電泳技術檢驗其純度，細胞學實驗驗證其生物學活性。
本發明的有益效果是，通過分子生物學技術，突變分泌表達載體的信號肽，在信號肽上引入酶切位點，克服了傳統分泌表達載體在表達的蛋白前添加多餘胺基酸的問題，獲得了一級結構與人PSP94天然蛋白完全相同的產物，使表達的PSP94在人體內沒有免疫排斥反應，有可能成為新的抗前列腺癌的藥物。重組得到的PSP94分泌型表達質粒可使表達的重組蛋白分泌到大腸桿菌周質空間中，避免了菌體內蛋白酶的降解作用，周質空間內含量極微的菌體本身蛋白又使得重組蛋白的分離純化更加容易，並且周質空間中的氧化型環境還可以模擬真核細胞的內質網，形成天然PSP94蛋白中的二硫鍵，使蛋白空間結構更加接近天然狀態。這種表達方式避免了傳統的包涵體技術在菌體內表達蛋白後複雜的復性純化過程，重組蛋白也具有更高的生物學活性。在得到分泌型重組蛋白的基礎上，又通過活性驗證證明，重組蛋白具有非常明顯的抑制細胞增殖、促進細胞凋亡並使癌細胞良性轉化的活性
圖1、所示為RT-PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳結果，在480bp左右處可見到一條明顯的條帶，圖2、重組質粒PCR驗證結果圖，在280bp左右處有一條明顯DNA帶，與PSP94蛋白編碼基因長度一致。
圖3、重組質粒DNA測序圖，下劃線部分為PSP94 cDNA序列，與預期結果完全相同。
圖4、構建重組分泌型表達質粒pBV-PSP94流程圖。
圖5、重組質粒pBV-PSP220的PCR粗篩後電泳結果圖。
圖6、重組質粒pBV-PSP94的測序結果圖。
圖7、重組分泌型PSP94蛋白的SDS-PAGE和Western blot分析。
圖8、不同劑量PSP94處理48h後PC-3細胞的抑制率。
圖9、PSP94處理不同時間對於PC-3細胞的抑制率。
圖10、a，b部分，重組PSP94蛋白處理48h後PC-3細胞的形態學改變。
圖11、PSP94處理後PC-3細胞DNA含量變化直方圖。
圖12、PBV220的物理圖譜。
具體實施例方式
材料、菌株、細胞株和試劑所用人正常前列腺組織前列腺癌組織均由吉林大學臨床醫學院泌尿外科提供。
各種工具酶包括逆轉錄酶、限制性內切酶、連接酶、TaqDNA聚合酶為TaKaRa公司產品。
DNA凝膠回收試劑盒購自TaKaRa公司，蛋白定量試劑盒為Bio-Rad公司產品。
菌株E.coli JM109和質粒pUC19、pBV220由本實驗室傳代保存。E.coli JM109和質粒pUC19是可購買到的商品，關於pBV220本實施例中提供全序列和物理圖譜。
PC-3細胞株由原北京醫科大學泌尿外科研究所提供，已經可以購買到。
各種引物自行設計後，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，分別包括RT-PCR擴增PSP94 cDNA的引物CP1和CP2；成熟PSP94蛋白基因引物EP1和EP2和信號肽序列ES1和ES2。
其它常規化學試劑為進口或國產分析純產品。
實施例一、PSP94 cDNA的克隆擴增利用異硫氰酸胍一步法提取人正常前列腺組織總RNA，在引物Oligo(dT)15引導下，經AMV逆轉錄酶作用合成cDNA，再以CP1、CP2為引物PCR擴增PSP94 cDNA。
CP1(5』TTACTGATAGGCATGGCTAC-3』)
CP2(5』-TGCTTATCACAATGAATGTTCTCCTGGGG-3』)擴增產物凝膠回收後與經SmaI酶切的pUC19質粒連接，構建克隆質粒pUC-PSP94。連接產物轉化感受態且E.coli JM109細菌，鋪於含氨苄青黴素、IPTG和X-Gal的LB瓊脂平板上，37℃倒置培養過夜後，選擇白色菌落接種於含氨苄的LB液體培養基中，37℃振蕩培養過夜後，用鹼裂解法小量提取質粒，以EP1和EP2為引物擴增PSP94蛋白基因片段對陽性重組質粒進行粗篩，之後將選出的重組質粒送上海生工牛物工程技術服務有限公司進行序列測定。
EP1(5』-GCGCATGCATCATGCTATTTCATACCTAAT-3』)EP2(5』-CGGGATCCTTATCAGATTATCCATTCACT-3』)將測序證明為正確重組的pUC-PSP94質粒以EP1和EP2為引物擴增PSP94蛋白基因，經BamHI/SphI雙酶切後，凝膠回收備用。
圖1所示為RT-PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳結果，在480bp左右處可見到一條明顯的條帶，與PSP94 cDNA序列長度一致。
重組質粒PCR驗證結果見圖2，在280bp左右處有一條明顯DNA帶，與PSP94蛋白編碼基因長度一致。重組質粒DNA測序結果見圖3，下劃線部分為PSP94 cDNA序列，與預期結果完全相同。說明我們克隆獲得了正確的PSP94 cDNA序列。
二、重組分泌型表達載體的構建a.)信號肽序列的設計天然白喉毒素信號肽含25個胺基酸，DNA編碼序列為GTG AGC AGA AAA CTG TTT GCG TCA ATC TTA ATA GGG GCGCTA CTG GGG ATA GGG GCC CCA CCT TCA 天然白喉毒素信號肽胺基酸序列的-1、-2和-3位，即胺基酸序列Ala-His-Ala構成信號肽酶的識別位點(編碼鹼基序列為GCCCATGCA，如方框內所示)，白喉毒素分泌到胞外後，信號肽酶將從此位點切去信號肽序列，只留下成熟蛋白質。
根據白喉毒素的天然序列，設計了以下分泌PSP94重組蛋白的信號肽序列ES1和ES2。
ES15』-CGGAATTCGTGAGCAGAAAACT-3』ES25』GATGC ATG CGC TGA AGG TGG GGC CCC TAT CCCCAG TAG CGC CCC TAT TAA GAT TGA CGC AAA CAG TTT TCTGCT CACGAATTCCG-3』上述信號肽引物中，ES1為含EcoR I酶切位點的信號肽有意鏈引物，ES2中下劃線部分為白喉毒素信號肽全序列，與天然鹼基序列惟一不同之處是在不影響編碼胺基酸(丙氨酸)的前提下，將信號肽-3位胺基酸的密碼子由GCC變為GCG。同時，這種改變還引入了Sph I酶切位點(GCATGC)，就將信號肽與PSP94編碼基因連接的位點設計到信號肽序列內部，使得蛋白分泌到周質空間後信號肽完全被切除，避免了構建重組蛋白時接頭處引起的多餘胺基酸問題。
ES1和ES2在Klenow DNA聚合酶作用下，以dNTP為材料，室溫延伸，產物經EcoRI/SphI雙酶切後，瓊脂糖凝膠電泳回收備用。
b.)重組人PSP94分泌型表達質粒的構建質粒pBV220經BamHI/EcoRI雙酶切後，與上述雙酶切的PSP94蛋白基因產物及信號肽，在T4 DNA連接酶的作用下進行連接，構建重組分泌型表達質粒pBV-PSP94。構建流程如圖4所示。pBV220質粒序列全長(3666bp)1aattcccggg gatccgtcga cctgcagcca agcttctgtt ttggcggatg agagaagatt61 ttcagcctga tacagattaa atcagaacgc agaagcggtc tgataaaaca gaatttgcct121 cccggcagta gcgcggtggt cccacctgac cccatgccga actcagaagt gaaacgccgt181 agcgccgatg gtagtgtggg gtctccccat gcgagagtag ccaactgcca ggcatcaaat241 aaaacgaaag gctcagtcga aagactgggc ctttcgtttt atctgttgtt tgtcggtgaa
301 cgctctcctg agtaggacaa atccgccggg agcggatttg aacgttgcga agcaacggcc361 cggagggtgg cgggcaggac gcccgccata aactgccagg catcaaatta agcagaaggc421 catcctgacg gatggccttt ttgcgtttct acaaactctt tgtttatttt tctaaataca481 ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa541 aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt601 ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca661 gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag721 ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc781 ggtattatcc cgtgttgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca841 gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt901 aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct961 gacaacgatc gggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg1021 taactcgcct tgatcgttgg gaaccggatc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg1081 acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac1141 ttactctagc ttcccggcaa caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac1201 cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg1261 agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg1321 tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg1381 agataggtgc ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac1441 tttagattga tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg1501 ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg1561 tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc1621 aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc1681 tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt1741 agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc1801 taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact1861 caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac1921 agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagcattgag1981 aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg2041 gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg2101 tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga2161 gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt2221 ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct2281 ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg2341 aggaagcgga agagcgccct tatctttccc tttatttttg ctgcggtaag tcgcataaaa2401 accattcttc ataattcaat ccatttacta tgttatgttc tgaggggagt gaaaattccc2461 ctaattcgat gaagattctt gctcaattgt tatcagctat gcgccgacca gaacaccttg2521 ccgatcagcc aaacgtctct tcaggccact gactagcgat aactttcccc acaacggaac2581 aactctcatt gcatgggatc attgggtact gtgggtttag tggttgtaaa aacacctgac2641 cgctatccct gatcagtttc ttgaaggtaa actcatcacc cccaagtctg gctatgcaga2701 aatcacctgg ctcaacagcc tgctcagggt caacgagaat taacattccg tcaggaaagc2761 ttggcttgga gcctgttggt gcggtcatgg aattaccttc aacctcaagc cagaatgcag2821 aatcactggc ttttttggtt gtgcttaccc atctctccgc atcacctttg gtaaaggttc2881 taagcttagg tgagaacatc cctgcctgaa catgagaaaa aacagggtac tcatactcac2941 ttctaagtga cggctgcata ctaaccgctt catacatctc gtagatttct ctggcgattg
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三、重組PSP94蛋白表達a.)表達含陽性重組質粒pBV-PSP94及空的pBV220質粒的JM109菌種分別接種於100ml含氨苄的LB液體培養基中，31℃振蕩培養，待菌液OD600達到0.6時，將溫度調至40℃，繼續培養5h。
b.)純化及鑑定上述菌液在12000rpm、4℃離心10分鐘收集菌體，棄去上清，沉澱懸於新配製的溶菌酶溶液中，冰浴10分鐘，10,000rpm、4℃離心10分鐘收集上清，即為周質空間部分，周質空間液依次通過透析(分子量為7000)和半透膜離心法(截留分子量為30KD)進行純化，蛋白SDS-PAGE電泳結果見圖7，含pBV-PSP94的菌株周質空間液在11kD左右處有一明顯蛋白條帶，與PSP94蛋白分子量一致，純化後在電泳圖上幾乎表現為單一條帶，密度分析表明純化後的該條帶可佔純化後總蛋白的93％，而含pBV220空質粒的細菌周質空間產物純化後在11kD處幾乎看不到條帶，Western blotting結果表明所得蛋白為PSP94，重組蛋白表達量可達100mg/L。
實驗例 本發明重組PSP94蛋白活性分析採用Bio-Rad Protein Assay對純化後的重組蛋白進行定量，用RPMI-1640培養液將PSP94調成濃度分別為(1000，500，100，50，10，5，0)×10-4M，過濾除菌。
(1)MTT法測定將前列腺癌PC-3細胞濃度調至2×105/mL，接種於96孔平底培養板，每孔100μl。培養24小時後棄上清，各孔分別加入含不同濃度PSP94的培養液200μl，每組設3復孔，陰性對照為同期培養的相同濃度的僅含質粒pBV220的細菌周質空間上清純化物。細胞培養44小時後，各孔分別加入新鮮配製的5μg/mLMTT，37℃溫箱孵育4小時，棄去上清，分別加入100μl的DMSO，在37℃繼續孵育4小時，在酶聯檢測儀上檢測波長570nm處的吸光度(A)值。各組抑制率計算公式為抑制率(％)＝(對照組A平均值-實驗組A平均值)/對照組A平均值×100％。
通過體外細胞增殖實驗(MTT法)和流式細胞儀進行DNA含量和細胞周期分析表明，重組的分泌型PSP94具有很強的生物活性，能以時間和劑量依賴性的方式對前列腺癌PC-3細胞產生生長抑制作用，如圖8和圖9所示，重組蛋白濃度1000ug/ml作用24小時，抑制率能達到50％以上，作用48小時後出現凋亡。相差顯微鏡下，對照組細胞貼壁生長，狀況良好，多為梭形，大小適中，核仁清晰，可見核分裂相；PSP94作用細胞數量明顯減少，形態不規則，細胞皺縮，顆粒增多，細胞碎片增加(圖10)。以上結果表明rshPSP94具有抑制前列腺癌細胞增殖的活性。
(2)流式細胞技術檢測對細胞周期的影響將PC-3細胞分成兩組，實驗組加入重細PSP94蛋白，終濃度為1×10-4M，對照組加入相同濃度的含空質粒的細菌周質空間上清產物。細胞培養24小時和48小時後，分別製成單細胞懸液，經碘化丙啶染色流式細胞儀分析，計算各細胞周期內細胞所佔比例，分析細胞凋亡情況。
流式細胞儀分析PSP94對PC-3細胞周期的影響，結果見表1，10ug/ml作用細胞24小時後，細胞周期發生紊亂，表現為S、G2+M期細胞數減少，G1期細胞數明顯增多，作用48小時後，G1期細胞數增加更為明顯，佔總細胞數的85％，表明細胞周期受抑，主要抑制在G1期。DNA含量分布如圖11所示。G1峰前面出現亞2倍體峰，表明細胞出現凋亡(細胞凋亡時，DNA斷裂生成小的DNA片段，從細胞內釋放，導致亞2倍體峰出現)。
表1重組PSP94對PC-3M細胞周期的影響
▲▲P＜0.01，▲P＜0.05 vs Control
權利要求
1.一種重組人PSP94蛋白在大腸桿菌中分泌表達的方法，包括下列步驟一、PSP94cDNA的克隆擴增提取前列腺組織總RNA，通過RT-PCR方法釣取中國人PSP94cDNA序列，插入克隆載體pUC19中，PCR粗篩後進行序列測定；二、重組分泌型表達載體的構建將雙酶切後的PSP94蛋白編碼基因、信號肽和pBV220質粒進行連接，構建重組質粒pBV-PSP94；三、重組PSP94蛋白表達陽性重組質粒pBV-PSP94分別轉化大腸桿菌菌株，如JM109、HB101、或LB21菌株，經摸索蛋白誘導表達最適溫度為40℃，最佳表達時間為5小時。
2.如權利要求1所述重組人PSP94蛋白在大腸桿菌中分泌表達的方法中，步驟二信號肽採取經修飾過的天然白喉毒素信號肽。
3.如權利要求2所述重組人PSP94蛋白在大腸桿菌中分泌表達的方法中，步驟二經修飾過的天然白喉毒素信號肽為ES1為含EcoRI酶切位點的信號肽有意鏈引物5』-CGGAATTCGTGAGCAGAAAACT-3』ES25』-GATGC ATG CGC TGA AGG TGG GGC CCC TAT CCCCAG TAG CGC CCC TAT TAA GAT TGA CGC AAA CAG TTT TCTGCT CAC GAATTCCG-3』
4.如權利要求1所述重組人PSP94蛋白在大腸桿菌中分泌表達的方法中，步驟三含陽性重組質粒pBV-PSP94及空的pBV220質粒的JM109菌種分別接種於100ml含氨苄的LB液體培養基中，31℃振蕩培養，待菌液OD600達到0.6時，將溫度調至40℃，繼續培養5h。
全文摘要
本發明涉及一種重組人PSP94蛋白在大腸桿菌中分泌表達的方法，屬於採用大腸桿菌分泌表達有生物活性的人PSP94蛋白的方法。提取前列腺組織總RNA，通過RT－PCR方法釣取中國人PSP94 cDNA序列，插入克隆載體pUC19中，PCR粗篩後進行序列測定；將雙酶切後的PSP94蛋白編碼基因、信號肽和pBV220質粒進行連接，構建重組質粒pBV－PSP94；陽性重組質粒pBV－PSP94分別轉化大腸桿菌菌株，蛋白誘導表達最適溫度為40℃，最佳表達時間為5小時。本發明的有益效果是，通過分子生物學技術，突變分泌表達載體的信號肽，在信號肽上引入酶切位點，克服了傳統分泌表達載體在表達的蛋白前添加多餘胺基酸的問題。
文檔編號C12N15/12GK1673377SQ20051001662
公開日2005年9月28日 申請日期2005年3月15日 優先權日2005年3月15日
發明者田長生, 高瑞娟, 李揚, 趙丹, 劉喜春, 趙雪儉 申請人:吉林大學