人胎盤、臍帶間充質幹細胞庫及其構建方法

2023-04-24 22:06:36

專利名稱：人胎盤、臍帶間充質幹細胞庫及其構建方法
技術領域：
本發明涉及一種幹細胞庫及其構建方法，具體地說是涉及一種人胎盤、臍帶間充質幹細胞庫及其構建方法。
背景技術：
間充質幹細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是幹細胞的一種類型，具備幹細胞的兩個重要特徵很強的自我增殖能力和多分化潛能。MSCs起源於中胚層，理論上講，它可以向其它中胚層組織分化。近期研究表明，在適宜的體內或體外環境下MSCs不僅可以分化為中胚層的間質組織，還保持有內胚層的分化潛能，可分化為神經細胞、上皮細胞、心肌細胞以及成骨細胞等。將MSCs與胎鼠的中腦或紋狀體細胞共同培養，它可分化為神經元和膠質細胞，而將MSCs移植到心肌缺血壞死區周圍，3周後漸與周圍心肌細胞相似，並可見大量新生血管在新生心肌細胞周圍，這些均表明MSCs的分化趨勢與周圍微環境密切相關。現在大多數學者認為MSCs的分化由特殊轉錄因子決定，不同的誘導條件可以決定其分化方向，可能是這些誘導條件啟動了決定分化方向的轉錄因子。
MSCs具有類似胚胎幹細胞的多向分化潛能。因此從這個意義上講，也許MSCs最為深遠的潛在用途是生產細胞和組織，可作為當前的「細胞療法」的一種應用方式。許多疾病及功能失調往往是由於細胞功能障礙或組織破壞所致。如今，一些捐贈的器官和組織常常用以取代生病的或遭破壞的組織。遺憾的是，受這些疾病折磨的病人數量遠遠超過了可供移植的器官數量。MSCs經刺激後可發育分化為特定的細胞，使替代細胞和組織來源的更新成為可能，從而可用於治療無數的疾病、身體不適狀況和殘疾，包括帕金森病、Alzheimer病(痴呆症)、脊髓損傷、中風、燒傷、心臟病、糖尿病、骨關節炎和類風溼性關節炎。目前世界各國都投入了大量的人力、物力和財力進行了廣泛而深入的研究，利用MSCs移植的方法，具有簡單、實用、費用低和不存在免疫排斥等優點，而且MSCs無論從它的來源、分離方法及可分化的組織上都有其獨特的優勢，應用前景十分廣闊。
目前MSCs的主要來源為成人骨髓，但成人骨髓源MSCs細胞數量及增殖分化潛能隨年齡的增大而下降，病毒感染率較高，且供者MSCs的採集須行骨髓穿刺術，來源受到限制。研究發現，MSCs在人胎兒和生後多種組織廣泛存在，包括骨膜、脂肪、羊水、真皮、牙、骨骼肌、胎肺、胎肝和臍血等。但是，從胎兒體內提取MSCs需要將流產胎兒的身體組織破壞，因此此種技術的應用又受到道德倫理的質疑和傳統觀念的限制。因此，尋找新的MSCs的來源成為目前國內外研究的熱點。我們開展了對胎盤及臍帶源MSCs的研究。根據文獻，採用傳統的內皮消化法，從胎兒臍帶內皮/內皮下分離MSCs樣細胞時，我們發現所獲細胞數很少，且成功率低，只有30％的標本可以得到MSCs，70％的標本不能得到可多次傳代的MSCs。
幹細胞庫是在約為-196℃液氮中(深低溫)儲存幹細胞或搜集存儲幹細胞資源相關資料的場所。一個完善的幹細胞庫應具備隨時隨地將健康幹細胞提供臨床使用的能力。目前在世界範圍內，按所儲存的幹細胞來源和採集方式，幹細胞庫主要分為臍血幹細胞庫、骨髓和外周血幹細胞庫。臍血幹細胞庫所做的工作是將新生兒的臍血採集後經過分離冷凍並儲存起來。在每份臍血中，大約含數百萬個幹細胞，足夠供一個幼兒或少年患者使用。如果是在成年後發病，一份臍血所提供的幹細胞數量就不夠用了，但是將來可以通過幹細胞的擴增技術得到解決。骨髓和外周血幹細胞庫可分為資料庫和實物庫。資料庫所做的工作是將健康者提供的骨髓或外周血幹細胞進行HLA配型和資料登記，待需要時再採集其骨髓。實物庫則是在進行細胞配型和資料登記的同時，採集和儲存健康提供者可供移植用的骨髓或外周血幹細胞。幹細胞庫按提供方式又分為公共庫和自體庫。公共庫所儲存的幹細胞是他人的幹細胞，以滿足需要移植但自體幹細胞沒有被保存的病人的需求。自體庫則是儲存在自己出生或健康時採集的部分幹細胞，以備自己生病時用。目前世界上尚無胎盤及臍帶間充質幹細胞庫，每年大量新生兒的胎盤和臍帶被廢棄，其中的幹細胞資源白白流失。

發明內容
本發明的目的在於提供一種充分利用新生兒的胎盤和臍帶為資源的人胎盤、臍帶間充質幹細胞庫。
本發明的第二個目的是提供一種人胎盤、臍帶間充質幹細胞庫的構建方法。
本發明的技術方案概述如下一種人胎盤、臍帶間充質幹細胞庫，是由下述步驟建成(1)取人胎盤、臍帶進行ABO/Rh血型檢測、HLA分型的檢測、微生物免疫檢測，用pH為7.2-7.4的磷酸緩衝液衝洗去除殘留血液，粉碎，加入1～1.5倍於粉碎物體積的磷酸緩衝液稀釋(pH為7.2-7.4)；(2)加入步驟(1)所獲得溶液體積的1/2～1/3的質量/體積比為0.05％～0.2％的膠原酶磷酸緩衝液溶液消化，溫度為37℃，消化40～70分鐘，優選60分鐘，過100-200目篩，將濾過的細胞混懸液與未消化組織分開；(3)向未消化組織中，加入1～1.5倍於未消化組織體積的磷酸緩衝液稀釋(pH為7.2-7.4)；(4)加入步驟(3)所獲得溶液體積的1/2～1/3的質量/體積比為0.05％～0.2％的胰酶磷酸緩衝液溶液消化，消化溫度為37℃，消化時間為10～30分鐘，優選20分鐘，在此100ml溶液中加入1-2g的血清終止胰酶作用，過100-200目篩，濾過液為細胞混懸液；(5)將步驟(2)及步驟(4)所獲得的細胞混懸液混合，離心，離心機的轉速為1500轉～2500轉/分鐘，時間為10～20分鐘，棄去上清液，用磷酸緩衝液(pH為7.2-7.4)洗滌1～3次去除殘餘酶，再離心，離心機的轉速為1500轉/分鐘～2500轉/分鐘，時間為10～20分鐘，棄去上清液，即獲得間充質幹細胞，兩次離心轉速優選為2000轉/分鐘，時間為15分鐘；(6)將間充質幹細胞置液氮冷凍，液氮冷凍的溫度為-196℃，按其ABO/Rh分型和HLA分型進行保存，建立可供檢索的細胞信息檔案，即構建出人胎盤、臍帶間充質幹細胞庫。
在用膠原酶和胰酶消化時，可用轉子同時進行攪拌，提高消化的程度一種人胎盤、臍帶間充質幹細胞庫的構建方法，由下述步驟組成(1)取人胎盤、臍帶進行ABO/Rh血型檢測、HLA分型的檢測、微生物免疫檢測，用磷酸緩衝液(pH為7.2-7.4)衝洗去除殘留血液，粉碎，加入1～1.5倍於粉碎物體積的磷酸緩衝液稀釋(pH為7.2-7.4)；(2)加入步驟(1)所獲得溶液體積的1/2～1/3的質量/體積比為0.05％～0.2％的膠原酶磷酸緩衝液溶液消化，溫度為37℃，消化40～70分鐘，優選50-60分鐘，過100-200目篩，將濾過的細胞混懸液與未消化組織分開；(3)向未消化組織中，加入1～1.5倍於未消化組織體積的磷酸緩衝液稀釋(pH為7.2-7.4)；(4)加入步驟(3)所獲得溶液體積的1/2～1/3的質量/體積比為0.05％～0.2％的胰酶磷酸緩衝液溶液消化，消化溫度為37℃，消化時間為10～30分鐘，優選15-20分鐘，在此100ml溶液中加入1-2g的血清終止胰酶作用，過100-200目篩，濾過液為細胞混懸液；(5)將步驟(2)及步驟(4)所獲得的細胞混懸液混合，離心，離心機的轉速為1500轉～2500轉/分鐘，時間為10～20分鐘，棄去上清液，用磷酸緩衝液(pH為7.2-7.4)洗滌1～3次去除殘餘酶，再離心，離心機的轉速為1500轉/分鐘～2500轉/分鐘，時間為10～20分鐘，棄去上清液，即獲得間充質幹細胞，兩次離心轉速優選為2000轉/分鐘，時間為15分鐘；(6)將間充質幹細胞置液氮冷凍，液氮冷凍的溫度為-196℃，按其ABO/Rh分型和HLA分型進行保存，建立可供檢索的細胞信息檔案，即構建出人胎盤、臍帶間充質幹細胞庫。
在用膠原酶和胰酶消化時，可用轉子同時進行攪拌，提高消化的程度。
上述全部過程均在無菌環境中進行操作。
本發明中所獲得人胎盤、臍帶間充質幹細胞按1～2×104/cm2接種於塑料培養瓶，用含DMEM-LG/F12(Sigma，USA)，5％FCS(Gibco BRL，USA)的培養基，置37℃，5％CO2培養箱培養，4天後換液，棄去非貼壁細胞，以後每3天半量換液，待細胞80％融合，0.25％胰酶(Sigma，USA)消化，按1∶3傳代，可得到大量(1×1010)1人胎盤、臍帶間充質幹細胞用於臨床及科研。
本發明所述的一種人胎盤、臍帶間充質幹細胞庫及其構建方法，可從人胎盤、臍帶中獲得大量的MSCs，建立系統工程技術儲存庫，它是一種將現有資源充分利用的有效方法，根據本發明的方法，存儲於庫內的間充質幹細胞，經短期培養可獲得1×1010MSCs，可得到大量富有活性的胎盤及臍帶間充質幹細胞，並能夠長時間保存而不失其活性，且操作簡單易行，建庫成本低廉，富有應用前景。


圖1、胎盤及臍帶來源的MSCs的細胞形態(A-C)是採用本發明的方法獲得的MSCs培養7天後的細胞形態；(D，E)是MSCs傳第一代14-20天後的細胞形態；(F，G，H)是MSCs傳第二代第1、3、5天的細胞形態；(I-L)、傳統內皮消化法獲得MSCs培養的細胞形態，傳二代後細胞形態發生變化；
圖2、胎盤及臍帶來源的MSCs的細胞生長曲線第三代MSCs按2×104細胞/孔接種在24孔板內，每隔24h消化3個孔，收集細胞，並用0.4％的臺盼蘭染色後計數活細胞，取5次實驗結果的平均值，繪製生長曲線；
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步的說明，但本發明並不受限於下述實施例。
實施例1人胎盤臍帶間充質幹細胞的製備(1)將人胎盤、臍帶經過嚴格檢測程序(ABO/Rh血型檢測、HLA分型的檢測、梅毒抗體檢測、HIV免疫檢測、CMV抗體檢測、B型肝炎抗原抗體檢測等)確定安全性後，由pH為7.2的PBS(磷酸緩衝液)反覆衝洗，去除殘留血液，用無菌刀具將其切割至約1mm3-1.5mm3的小碎塊或者用其他無菌工具將其粉碎至肉糜狀(1mm3-1.5mm3)，取肉糜25ml，加入pH為7.2的PBS至50ml；(2)加入質量/體積比為0.1％的膠原酶磷酸緩衝液溶液20ml，置37℃消化1小時，其間對該混合液進行持續磁力攪拌；將該混合物用100目篩網過濾，將濾過的細胞混懸液與未消化組織分開，將濾過的細胞混懸液置高速離心機中，2000轉/分鐘，離心15分鐘，棄去上清液，將沉澱的細胞置于振蕩器上振蕩，使細胞鬆散，收集該細胞備用；(3)將上一步驟收集的未消化組織20ml加入pH為7.2的PBS至40ml；(4)再加入質量/體積比為0.125％的胰酶磷酸緩衝液溶液20ml，在37℃下消化20min，其間對該混合液進行持續磁力攪拌，之後加入混合物終濃度0.6g的血清終止胰酶的作用，用100目篩網過濾，濾過的細胞混懸液，棄去未消化的組織；將細胞混懸液高速離心，離心機轉速為2000轉/分鐘，離心15分鐘，棄去上清液，振蕩細胞使之鬆散，收集該細胞備用；(5)將步驟(2)和(4)所獲得的細胞置於50ml管中，加pH為7.2的PBS至滿，高速離心，離心機轉速為2000轉/分鐘，離心15分鐘，棄去上清液，振蕩細胞使之鬆散，該步驟重複2次以洗淨殘留的酶；最後將離心後的細胞收集，即製備出建庫所需的人胎盤、臍帶間充質幹細胞。
上述操作均在嚴格無菌環境內進行，為保證細胞不受汙染，所有使用的PBS均加入了1％的青黴素和鏈黴素。
細胞形態學觀察採用本方法分離的原代細胞多於24-48小時內貼壁，培養1-2周，倒置顯微鏡可見貼壁細胞呈梭形、多角形，2周以後增長速度較快，成為形態相對均一的梭形細胞，呈平行排列生長或旋渦狀生長，於第2-3周可形成80％融合貼壁細胞層。連續傳20代，細胞形態無明顯改變。而採用文獻報導的內皮消化法只有30％標本可以分離出MSCs，70％標本貼壁細胞傳代不超過2代。(圖1)本方法獲得的細胞數與成功率明顯高於依照文獻內皮消化的普通方法。
細胞生長曲線的測定將貼壁細胞用0.25％胰酶消化後，按2×104細胞/孔接種在24孔板內，每隔24h消化3個孔，收集細胞，並用0.4％的胎盼蘭計數活細胞，繪製生長曲線。細胞增殖較快，在對數生長期，細胞倍增時間均約為30h(圖2)。細胞每傳一代，細胞數約增長2倍。
人胎盤、臍帶間充質幹細胞庫的構建將所獲得的間充質幹細胞裝進冷凍袋內，用冷凍保護液預處理之後，抽取空氣，密封，放進幹細胞儲存盒，採用1010型冷凍系統(Forma Scientific Inc，USA)冷凍，然後將儲存盒保存在-196℃低溫的液氮罐中。留取小部分細胞儲存在-80℃冰箱裡，作為庫存產品信息的複查樣本。將其詳細信息(包括供者姓名，供者父母姓名、地址、聯繫方式，幹細胞的配型信息等)輸入電腦資料庫，建立完善的數據檔案備查詢。
實施例2(1)將人胎盤、臍帶經過嚴格檢測程序(ABO/Rh血型檢測、HLA分型的檢測、梅毒抗體檢測、HIV免疫檢測、CMV抗體檢測、B型肝炎抗原抗體檢測等)確定安全性後，由pH為7.4的PBS反覆衝洗，去除殘留血液，用無菌刀具將其切割至約1mm3-1.5mm3的小碎塊或者用其他無菌工具將其粉碎至肉糜狀(1mm3-1.5mm3)，取肉糜20ml，加入pH為7.4的PBS至50ml；(2)加入質量/體積比為0.05％的膠原酶磷酸緩衝液溶液25ml，置37℃消化70分鐘，其間對該混合液進行持續磁力攪拌；將該混合物用200目篩網過濾，將濾過的細胞混懸液與未消化組織分開，將濾過的細胞混懸液置高速離心機中，1500轉/分鐘，離心20分鐘，棄去上清液，將沉澱的細胞置于振蕩器上振蕩，使細胞鬆散，收集該細胞備用；(3)將上一步驟收集的未消化組織20ml加入pH為7.4的PBS至50ml；(4)再加入質量/體積比為0.05％的胰酶磷酸緩衝液溶液25ml，在37℃下消化30min，其間對該混合液進行持續磁力攪拌，之後加入1.5g血清終止胰酶的作用，用200目篩網過濾，濾過的細胞混懸液，棄去未消化的組織；將細胞混懸液高速離心，離心機轉速為1500轉/分鐘，離心20分鐘，棄去上清液，振蕩細胞使之鬆散，收集該細胞備用；(5)將步驟(2)和(4)所獲得的細胞置於50ml管中，加pH為7.4的PBS至滿，高速離心，離心機轉速為1500轉/分鐘，離心20分鐘，棄去上清液，振蕩細胞使之鬆散，該步驟重複3次以洗淨殘留的酶；最後將離心後的細胞收集，即製備出建庫所需的人胎盤、臍帶間充質幹細胞。
上述操作均在嚴格無菌環境內進行，為保證細胞不受汙染，所有使用的pH為7.4的PBS均加入了1％的青黴素和鏈黴素。
(6)幹細胞入庫之前，按2×104/cm2接種於塑料培養瓶，用含DMEM-LG/F12(Sigma，USA)，5％FCS(Gibco BRL，USA)的培養基，置37℃，5％CO2培養箱培養，4-5天後換液，棄去非貼壁細胞，以後每3-4天半量換液。待細胞80％融合，0.25％胰酶(Sigma，USA)消化，按1∶3傳代，擴增後得到大量幹細胞，將所獲得細胞分為5份裝進冷凍袋內，用50％DMSO和5％右旋糖苷冷凍保護劑預處理之後，將其放入保存細胞專用的小型存儲罐內，採用BioArchiveTM系統分步冷凍，將其保存在-196℃低溫的液氮罐中。留取小部分細胞儲存在-80℃冰箱裡，作為庫存產品信息的複查樣本。將其詳細信息(包括供者姓名，供者父母姓名、地址、聯繫方式，幹細胞的配型信息等)輸入電腦資料庫，建立完善的數據檔案備查詢。
實施例3(1)將人胎盤、臍帶經過嚴格檢測程序(ABO/Rh血型檢測、HLA分型的檢測、梅毒抗體檢測、HIV免疫檢測、CMV抗體檢測、B型肝炎抗原抗體檢測等)確定安全性後，由PBS(pH為7.4)反覆衝洗，去除殘留血液，用無菌刀具將其切割至約1mm3-1.5mm3的小碎塊或者用其他無菌工具將其粉碎至肉糜狀(1mm3-1.5mm3)，取肉糜25ml，加入PBS(pH為7.4)至50ml；(2)加入質量/體積比為0.2％的膠原酶磷酸緩衝液溶液16.7ml，置37℃消化40分鐘，其間對該混合液進行持續磁力攪拌；將該混合物用100目篩網過濾，將濾過的細胞混懸液與未消化組織分開，將濾過的細胞混懸液置高速離心機中，2500轉/分鐘，離心10分鐘，棄去上清液，將沉澱的細胞置于振蕩器上振蕩，使細胞鬆散，收集該細胞備用；(3)將上一步驟收集的未消化組織20ml加入PBS(pH為7.4)至40ml；(4)再加入質量/體積比為0.2％的胰酶磷酸緩衝液溶液16.7ml，在37℃下消化10min，其間對該混合液進行持續磁力攪拌，之後加入0.7g血清終止胰酶的作用，用100目篩網過濾，濾過的細胞混懸液，棄去未消化的組織；將細胞混懸液高速離心，離心機轉速為2500轉/分鐘，離心10分鐘，棄去上清液，振蕩細胞使之鬆散，收集該細胞備用；(5)將步驟(2)和(4)所獲得的細胞置於50ml管中，加(pH為7.4)PBS至滿，高速離心，離心機轉速為2500轉/分鐘，離心10分鐘，棄去上清液，振蕩細胞使之鬆散，洗淨殘留的酶；最後將離心後的細胞收集，即製備出建庫所需的人胎盤、臍帶間充質幹細胞。
上述操作均在嚴格無菌環境內進行，為保證細胞不受汙染，所有使用的(pH為7.4)PBS均加入了1％的青黴素和鏈黴素。
人胎盤、臍帶間充質幹細胞的製備方法(同實施例1)；人胎盤、臍帶間充質幹細胞庫構建將所獲得細胞裝進冷凍袋內，用50％DMSO和5％右旋糖苷冷凍保護劑預處理之後，將其放入透明包裝袋密封，再裝入幹細胞儲存盒，採用BioArchiveTM系統冷凍，然後將其保存在-196℃低溫的液氮罐中。留取小部分細胞儲存在-80℃冰箱裡，作為使用前HLA配型的複查樣本。將其具體信息輸入電腦資料庫，建立完善的數據檔案備查詢。
待使用前，將細胞取出解凍，按2×104/cm2接種於塑料培養瓶，用含DMEM-LG/F12(Sigma，USA)，5％FCS(Gibco BRL，USA)的培養基，置37℃，5％CO2培養箱培養，4-5天後換液，棄去非貼壁細胞，以後每3-4天半量換液。待細胞80％融合，0.25％胰酶(Sigma，USA)消化，按1∶3傳代。擴增後得到大量幹細胞，應用於製備各種幹細胞製劑。
膠原酶I/II型，GIBCO公司，100mg包裝，溶於100mlPBS中可得質量/體積比為0.1％酶溶液，然後再稀釋使用；胰蛋白酶(即胰酶)，GIBCO公司，100mg包裝，使用時也是按質量/體積比來配製。
權利要求
1.一種人胎盤、臍帶間充質幹細胞庫，其特徵是由下述步驟建成(1)取人胎盤、臍帶進行ABO/Rh血型檢測、HLA分型的檢測、微生物免疫檢測，用磷酸緩衝液衝洗去除殘留血液，粉碎，加入1～1.5倍於粉碎物體積的磷酸緩衝液稀釋；(2)加入步驟(1)所獲得溶液體積的1/2～1/3的質量/體積比為0.05％～0.2％的膠原酶磷酸緩衝液溶液消化，溫度為37℃，消化40～70分鐘，過100-200目篩，將濾過的細胞混懸液與未消化組織分開；(3)向未消化組織中，加入1～1.5倍於未消化組織體積的磷酸緩衝液稀釋；(4)加入步驟(3)所獲得溶液體積的1/2～1/3的質量/體積比為0.05％～0.2％的胰酶磷酸緩衝液溶液消化，消化溫度為37℃，消化時間為10～30分鐘，在此100ml溶液中加入1-2g的血清終止胰酶作用，過100-200目篩，濾過液為細胞混懸液；(5)將步驟(2)及步驟(4)所獲得的細胞混懸液混合，離心，棄去上清液，用磷酸緩衝液洗滌1～3次去除殘餘酶，再離心，棄去上清液，即獲得間充質幹細胞；(6)將間充質幹細胞置液氮冷凍，按其ABO/Rh分型和HLA分型進行保存，建立可供檢索的細胞信息檔案，即構建出人胎盤、臍帶間充質幹細胞庫。
2.一種人胎盤、臍帶間充質幹細胞庫的構建方法，由下述步驟組成(1)取人胎盤、臍帶進行ABO/Rh血型檢測、HLA分型的檢測、微生物免疫檢測，用磷酸緩衝液衝洗去除殘留血液，粉碎，加入1～1.5倍於粉碎物體積的磷酸緩衝液稀釋；(2)加入步驟(1)所獲得溶液體積的1/2～1/3的質量/體積比為0.05％～0.2％的膠原酶磷酸緩衝液溶液消化，溫度為37℃，消化40～70分鐘，過100-200目篩，將濾過的細胞混懸液與未消化組織分開；(3)向未消化組織中，加入1～1.5倍於未消化組織體積的磷酸緩衝液稀釋；(4)加入步驟(3)所獲得溶液體積的1/2～1/3的質量/體積比為0.05％～0.2％的胰酶磷酸緩衝液溶液消化，消化溫度為37℃，消化時間為10～30分鐘，在此100ml溶液中加入1-2g的血清終止胰酶作用，過100-200目篩，濾過液為細胞混懸液；(5)將步驟(2)及步驟(4)所獲得的細胞混懸液混合，離心，棄去上清液，用磷酸緩衝液洗滌1～3次去除殘餘酶，再離心，棄去上清液，即獲得間充質幹細胞；(6)將間充質幹細胞置液氮冷凍，按其ABO/Rh分型和HLA分型進行保存，建立可供檢索的細胞信息檔案，即構建出人胎盤、臍帶間充質幹細胞庫。
3.根據權利要求2所述一種人胎盤、臍帶間充質幹細胞庫的構建方法，其特徵是所述膠原酶消化時間為60分鐘。
4.根據權利要求2所述一種人胎盤、臍帶間充質幹細胞庫的構建方法，其特徵是所述胰酶消化時間為20分鐘。
5.根據權利要求2所述一種人胎盤、臍帶間充質幹細胞庫的構建方法，其特徵是所述步驟(5)的兩次離心時，離心機的轉速為1500轉/分鐘～2500轉/分鐘，時間為10～20分鐘。
6.根據權利要求5所述一種人胎盤、臍帶間充質幹細胞庫的構建方法，其特徵是所述步驟離心機的轉速為2000轉/分鐘，時間為15分鐘。
7.根據權利要求2所述一種人胎盤、臍帶間充質幹細胞庫的構建方法，其特徵是所述液氮冷凍的溫度為-196℃。
全文摘要
本發明公開了一種人胎盤、臍帶間充質幹細胞庫及其構建方法，本發明的構建步驟包括(1)取人胎盤、臍帶進行檢測，用磷酸緩衝液衝洗滌後粉碎，加磷酸緩衝液稀釋；(2)加入膠原酶消化；(3)加入磷酸緩衝液稀釋；(4)加入胰酶消化；(5)將步驟(2)及步驟(4)所獲得的細胞混合，離心，棄去上清液，用磷酸緩衝液洗滌，再離心，棄去上清液，即獲得間充質幹細胞；(6)將間充質幹細胞置液氮冷凍，按其ABO/Rh分型和HLA分型進行保存，建立可供檢索的細胞信息檔案，即構建出人胎盤、臍帶間充質幹細胞庫。本發明為新生兒儲存胎盤及臍帶間充質幹細胞，為其本人、家屬和他人提供間充質幹細胞治療疾病及其他應用。
文檔編號C12N5/08GK1786154SQ20051001549
公開日2006年6月14日 申請日期2005年10月18日 優先權日2005年10月18日
發明者韓忠朝, 劉擁軍 申請人:天津昂賽細胞基因工程有限公司