圖像差異化多重測定的製作方法

2023-04-24 16:12:42 2

本申請要求2015年6月11日提交的美國臨時申請序列號62/174,401的優先權權益，所述臨時申請以引用的方式整體併入本文。

領域

本文提供用於多重測定中的分析物檢測的編碼的微載體，以及製備和使用所述微載體的方法和與所述微載體相關的試劑盒。所述微載體使用用於辨識的模擬代碼編碼，並且包括用於捕獲分析物的捕獲劑。

背景

免疫學測定和分子診斷測定在研究領域和臨床領域中均發揮關鍵作用。通常，有必要進行一組多個靶標的測定來獲得結果的有意義或鳥瞰視圖，以有助於研究或臨床決策。這在基因組學和蛋白質組學的時代中尤其如此，其中大量的遺傳標誌物和/或生物標誌物被認為影響或預測特定疾病狀態。理論上，多個靶標的測定可通過在不同反應容器中並行地或順序地分別測試每個靶標來完成(即，多項單重法(multiple singleplexing))。然而，採用單重法策略的測定不僅通常是繁瑣的，而且它們通常還需要較大樣品體積，特別是當待分析的靶標數量較大時。

多重測定在單個測定中同時測量多個分析物(兩個或更多個)。多重測定通常用於高通量篩選環境中，其中可一次分析許多試樣。同時測定許多分析物和並行測定許多試樣的能力是多重測定的標誌並且是此類測定已經成為從藥物發現到功能基因組學到臨床診斷學的領域中的有力工具的原因。與單重法相比，通過在同一反應容器中組合所有靶標，所述測定不太繁瑣且更容易執行，因為每一樣品僅操作一個反應容器。因此，所需的測試樣品的體積可顯著減小，這在樣品(例如，腫瘤組織、腦脊髓液或骨髓)難以大量取得和/或對於大量取得來說為侵入性時尤其重要。同樣重要的是以下事實，可降低試劑成本並且測定通量顯著增加。

複雜大分子樣品的許多測定由兩個步驟組成。在第一步驟中，將能夠特異性地捕獲目標大分子的試劑附接至固相表面。這些固定的分子可用於通過諸如雜交(例如，在基於DNA、RNA的測定中)或抗原-抗體相互作用(在免疫測定中)的各種方式從複雜樣品中捕獲目標大分子。在第二步驟中，檢測分子與捕獲分子和靶標的複合物一起孵育並且結合至所述複合物，從而發射信號，如螢光或其他電磁信號。然後通過那些信號的強度來定量靶標的量。

多重測定可通過利用多種捕獲劑來進行，每種捕獲劑對不同的目標大分子具有特異性。在基於晶片的陣列多重測定中，使每種類型的捕獲劑附接至晶片上的預定位置。通過在對應於一種類型的捕獲劑的每個位置處測量檢測分子的信號來測定複雜樣品中的多重靶標的量。在懸浮陣列多重測定中，微粒或微載體懸浮於測定溶液中。這些微粒或微載體含有可通過微粒/微載體的一個或多個元件嵌入、印刷或以其他方式產生的辨識元件。每種類型的捕獲劑被固定至具有相同ID的顆粒，並且從具有特定ID的顆粒表面上的檢測分子發射的信號反映相應靶標的量。

用於懸浮陣列多重測定的現有系統在解析度上受限制。一些多重系統使用利用標準半導體製造技術印刷在扁平微珠上的數字條形碼。然而，可由特定數量的數字產生的標識符的數量是有限的。增加唯一標識符的數量需要增加條形碼數字的數目，從而在已經微小的微珠上需要更多的空間用於印刷。另一種類型的多重系統使用顏色編碼，如用獨特的螢光染料編碼的螢光珠粒。然而，可用於此類螢光系統的唯一標識符的數量由於重疊的激發/發射光譜而受到限制，並且辨識誤差可能由(例如)螢光染料的批次間變化而產生。

因此，需要一種模擬編碼的多重測定系統，例如不受諸如數字條形碼大小或螢光團解析度的限制約束的多重測定系統。這樣一種系統允許幾乎無限的唯一標識符並且使由於使用模擬代碼所致(例如，來自重疊光譜或批次間螢光團變化)的識別誤差最小化。

出於所有目的，本文所引用的所有出版物、專利和專利申請特此以引用的方式整體併入。

簡述

為了滿足這種需求，本文尤其提供了用模擬代碼編碼的微載體，所述微載體包括用於捕獲分析物的捕獲劑。這些微載體可用於例如多重測定中，其中每個微載體包括用於捕獲特定分析物的捕獲劑和用於辨識的模擬代碼。還提供了製備和使用此類微載體的方法，以及與所述方法相關的試劑盒。

因此，一方面，本文提供一種編碼的微載體，其包括(a)基本上透明的聚合物層，所述聚合物層具有第一表面和第二表面，所述第一表面和所述第二表面彼此平行；(b)基本上不透明的聚合物層，其中所述基本上不透明的聚合物層被固定至所述基本上透明的聚合物層的第一表面，並且包圍所述基本上透明的聚合物層的中心部分，並且其中所述基本上不透明的聚合物層包括表示模擬代碼的二維形狀；以及(c)用於捕獲分析物的捕獲劑，其中所述捕獲劑在所述基本上透明的聚合物層的至少所述中心部分中偶聯至所述基本上透明的聚合物層的第一表面和第二表面中的至少一個。

在一些實施方案中，所述微載體還包括(d)基本上不透明的磁性層，所述磁性層在所述基本上不透明的聚合物層與所述基本上透明的聚合物層的中心部分之間包圍所述基本上透明的聚合物層的中心部分，其中所述基本上不透明的磁性層被固定至所述基本上透明的聚合物層的第一表面或第二表面。在一些實施方案中，所述微載體還包括(e)與所述第一基本上透明的聚合物層對齊的第二基本上透明的聚合物層，所述第二基本上透明的聚合物層具有與所述第一基本上透明的聚合物層的中心部分對齊的中心部分，其中所述第二基本上透明的聚合物層被固定至所述第一基本上透明的聚合物層的第二表面並且不延伸超出所述第一基本上透明的聚合物層的二維形狀；以及(f)基本上不透明的磁性層，所述磁性層在所述基本上不透明的聚合物層與所述基本上透明的聚合物層的中心部分之間包圍所述第一基本上透明的聚合物層的中心部分，其中所述基本上不透明的磁性層被固定在所述第一基本上透明的聚合物層與所述第二基本上透明的聚合物層之間。在一些實施方案中，所述微載體還包括用於定向所述基本上不透明的聚合物層的模擬代碼的定向指標。在一些實施方案中，所述定向指標包括所述基本上不透明的磁性層的不對稱性。在一些實施方案中，所述基本上不透明的磁性層包括鎳。在一些實施方案中，所述基本上不透明的磁性層的厚度介於約50nm與約10μm之間。在一些實施方案中，所述基本上不透明的磁性層的厚度是約0.1μm。在一些實施方案中，所述基本上不透明的聚合物層的二維形狀包括齒輪形狀，所述齒輪形狀包括多個齒輪齒，並且其中所述模擬代碼由一個或多個選自由以下組成的組的方面表示：所述多個齒輪齒中的一個或多個齒輪齒的高度、所述多個齒輪齒中的一個或多個齒輪齒的寬度、所述多個齒輪齒中的齒輪齒數量以及所述多個齒輪齒內的一個或多個齒輪齒的布置。在一些實施方案中，所述多個齒輪齒包括寬度介於約1μm與約10μm之間的一個或多個齒輪齒。在一些實施方案中，所述多個齒輪齒包括高度介於約1μm與約10μm之間的一個或多個齒輪齒。在一些實施方案中，所述多個齒輪齒包括間隔介於約1μm與約10μm之間的兩個或更多個齒輪齒。在一些實施方案中，所述微載體還包括(g)從所述第一基本上透明的聚合物層的第一表面突出的一個或多個柱，其中所述一個或多個柱不在所述第一基本上透明的聚合物層的中心部分內；和/或(h)從所述第一基本上透明的聚合物層的第二表面或所述第二基本上透明的聚合物層的未固定至所述第一基本上透明的聚合物層的表面突出的一個或多個柱，其中所述一個或多個柱不在所述第一基本上透明的聚合物層或所述第二基本上透明的聚合物層的中心部分內。在一些實施方案中，所述微載體是基本上圓形的盤。在一些實施方案中，所述第一基本上透明的聚合物層的中心部分佔所述第一基本上透明的聚合物層的表面積的介於約5％與約90％之間。在一些實施方案中，所述第一基本上透明的聚合物層的中心部分佔所述第一基本上透明的聚合物層的表面積的約25％。在一些實施方案中，所述微載體的直徑小於約200μm。在一些實施方案中，所述微載體的直徑是約50μm。在一些實施方案中，所述微載體的厚度小於約50μm。在一些實施方案中，所述微載體的厚度是約10μm。在一些實施方案中，所述分析物選自由以下組成的組：DNA分子、DNA類似物分子、RNA分子、RNA類似物分子、多核苷酸、蛋白質、酶、脂質、磷脂、碳水化合物部分、多糖、抗原、病毒、細胞、抗體、小分子、細菌細胞、細胞器以及抗體片段。在一些實施方案中，用於捕獲所述分析物的捕獲劑選自由以下組成的組：DNA分子、DNA類似物分子、RNA分子、RNA類似物分子、多核苷酸、蛋白質、酶、脂質、磷脂、碳水化合物部分、多糖、抗原、病毒、細胞、抗體、小分子、細菌細胞、細胞器以及抗體片段。在一些實施方案中，所述第一基本上透明的聚合物層或所述第二基本上透明的聚合物層的基本上透明的聚合物包括環氧基聚合物(epoxy-based polymer)。在一些實施方案中，所述環氧基聚合物是SU-8。

另一方面，本文提供一種編碼的微載體，其包括：(a)基本上不透明的聚合物層，所述聚合物層具有第一表面和第二表面，所述第一表面和所述第二表面彼此平行，其中所述基本上不透明的聚合物層的輪廓包括表示模擬代碼的二維形狀；以及(b)用於捕獲分析物的捕獲劑，其中所述捕獲劑在所述基本上不透明的聚合物層的至少中心部分中偶聯至所述基本上不透明的聚合物層的第一表面和第二表面中的至少一個。

在一些實施方案中，所述微載體還包括(c)從所述基本上不透明的聚合物層的第一表面和/或第二表面突出的一個或多個柱，其中所述一個或多個柱包含磁性材料。在一些實施方案中，所述一個或多個柱的高度介於約1μm與約10μm之間。在一些實施方案中，所述一個或多個柱的直徑介於約1μm與約10μm之間。在一些實施方案中，所述微載體還包括(d)包含磁性材料的磁性層，所述磁性層固定至所述基本上不透明的聚合物層的第二表面，其中所述磁性層不延伸超出所述基本上不透明的聚合物層的中心部分，並且其中所述捕獲劑偶聯至所述基本上不透明的聚合物層的至少所述第一表面。在一些實施方案中，所述微載體還包括(e)與所述第一基本上不透明的聚合物層對齊的第二基本上不透明的聚合物層，其中所述第二基本上不透明的聚合物層被固定至所述第一基本上透明的聚合物層的第二表面並且不延伸超出所述第一基本上透明的聚合物層的輪廓，並且其中所述磁性層被固定在所述第一基本上透明的聚合物層與所述第二基本上透明的聚合物層之間。在一些實施方案中，所述磁性材料包括鎳。在一些實施方案中，所述微載體還包括用於定向所述基本上不透明的聚合物層的模擬代碼的定向指標。在一些實施方案中，所述定向指標包括所述基本上不透明的聚合物層的輪廓的不對稱性。在一些實施方案中，所述基本上不透明的聚合物層的輪廓包括二維齒輪形狀，所述齒輪形狀包括多個齒輪齒，並且其中所述模擬代碼由一個或多個選自由以下組成的組的方面表示：所述多個齒輪齒中的一個或多個齒輪齒的高度、所述多個齒輪齒中的一個或多個齒輪齒的寬度、所述多個齒輪齒中的齒輪齒數量以及所述多個齒輪齒內的一個或多個齒輪齒的布置。在一些實施方案中，所述多個齒輪齒包括寬度介於約1μm與約10μm之間的一個或多個齒輪齒。在一些實施方案中，所述多個齒輪齒包括高度介於約1μm與約10μm之間的一個或多個齒輪齒。在一些實施方案中，所述多個齒輪齒包括間隔介於約1μm與約10μm之間的兩個或更多個齒輪齒。在一些實施方案中，所述微載體是基本上圓形的盤。在一些實施方案中，所述第一基本上不透明的聚合物層的中心部分佔所述第一基本上不透明的聚合物層的表面積的介於約5％與約90％之間。在一些實施方案中，所述第一基本上不透明的聚合物層的中心部分佔所述第一基本上不透明的聚合物層的表面積的約25％。在一些實施方案中，所述微載體的直徑小於約200μm。在一些實施方案中，所述微載體的直徑是約60μm。在一些實施方案中，所述微載體的厚度小於約50μm。在一些實施方案中，所述微載體的厚度是約10μm。在一些實施方案中，所述分析物選自由以下組成的組：DNA分子、DNA類似物分子、RNA分子、RNA類似物分子、多核苷酸、蛋白質、酶、脂質、磷脂、碳水化合物部分、多糖、抗原、病毒、細胞、抗體、小分子、細菌細胞、細胞器以及抗體片段。在一些實施方案中，用於捕獲所述分析物的捕獲劑選自由以下組成的組：DNA分子、DNA類似物分子、RNA分子、RNA類似物分子、多核苷酸、蛋白質、酶、脂質、磷脂、碳水化合物部分、多糖、抗原、病毒、細胞、抗體、小分子、細菌細胞、細胞器以及抗體片段。在一些實施方案中，所述基本上不透明的聚合物包括環氧基聚合物。在一些實施方案中，所述基本上不透明的聚合物包括黑色基質抗蝕劑。

另一方面，本文提供一種製備編碼的微載體的方法，所述方法包括：(a)沉積基本上透明的聚合物層，其中所述基本上透明的聚合物層具有第一表面和第二表面，所述第一表面和所述第二表面彼此平行；(b)在所述基本上透明的聚合物層的第一表面上沉積基本上不透明的磁性層；(c)蝕刻所述基本上不透明的磁性層以除去所述基本上不透明的磁性層的沉積在所述基本上透明的聚合物層的中心部分上的部分；(d)在所述基本上不透明的磁性層上沉積第二基本上透明的聚合物層，其中所述第二基本上透明的聚合物層具有第一表面和第二表面，所述第一表面和所述第二表面彼此平行，其中所述第二表面被固定至所述基本上不透明的磁性層，並且其中所述第二基本上透明的聚合物層與所述第一基本上透明的聚合物層對齊並且具有與所述基本上透明的聚合物層的中心部分對齊的中心部分；以及(e)在所述第二基本上透明的聚合物層的第一表面上沉積基本上不透明的聚合物層，其中所述基本上不透明的聚合物層包圍所述第一基本上透明的聚合物層和所述第二基本上透明的聚合物層的中心部分，並且其中所述基本上不透明的聚合物層包括表示模擬代碼的二維形狀。

在一些實施方案中，所述基本上不透明的磁性層通過溼式蝕刻(wet etching)來蝕刻。在一些實施方案中，所述基本上不透明的磁性層包括鎳。在一些實施方案中，所述基本上不透明的磁性層的厚度介於約50nm與約10μm之間。在一些實施方案中，所述基本上不透明的磁性層的厚度小於約0.1μm。在一些實施方案中，所述基本上不透明的磁性層包括用於定向所述基本上不透明的聚合物層的模擬代碼的不對稱性。在一些實施方案中，所述基本上不透明的聚合物層的二維形狀通過光刻(lithography)來產生。在一些實施方案中，所述基本上不透明的聚合物層的二維形狀包括齒輪形狀，所述齒輪形狀包括多個齒輪齒，並且其中所述模擬代碼由一個或多個選自由以下組成的組的方面表示：所述多個齒輪齒中的一個或多個齒輪齒的高度、所述多個齒輪齒中的一個或多個齒輪齒的寬度、所述多個齒輪齒中的齒輪齒數量以及所述多個齒輪齒內的一個或多個齒輪齒的布置。在一些實施方案中，所述多個齒輪齒包括寬度介於約1μm與約10μm之間的一個或多個齒輪齒。在一些實施方案中，所述多個齒輪齒包括高度介於約1μm與約10μm之間的一個或多個齒輪齒。在一些實施方案中，所述多個齒輪齒包括間隔介於約1μm與約10μm之間的兩個或更多個齒輪齒。在一些實施方案中，所述方法還包括：(f)在步驟(a)之前，在基底上沉積犧牲層(sacrificial layer)；(g)使用光刻在所述犧牲層中產生一個或多個柱狀孔；(h)在所述犧牲層中的一個或多個柱狀孔中沉積第三基本上透明的聚合物層，其中在步驟(a)中將所述第一基本上透明的聚合物層沉積在所述第三基本上透明的聚合物層和所述犧牲層的頂部上；(i)在步驟(e)之後，在所述第二基本上透明的聚合物層的第一表面上在未被所述基本上不透明的聚合物層覆蓋的部分處使用光刻沉積一個或多個包含所述基本上透明的聚合物的柱；(j)將所述犧牲層溶解於溶劑中；以及(k)除去所述基底。在一些實施方案中，所述方法還包括：(f)在步驟(a)之前，在基底上沉積犧牲層；(g)作為步驟(a)的一部分，在所述犧牲層上沉積所述基本上透明的聚合物層；(h)在步驟(e)之後，將所述犧牲層溶解於溶劑中；以及(i)除去所述基底。在一些實施方案中，所述編碼的微載體是基本上圓形的盤。在一些實施方案中，所述第一基本上透明的聚合物層的中心部分佔所述第一基本上透明的聚合物層的表面積的介於約5％與約90％之間。在一些實施方案中，所述第一基本上透明的聚合物層的中心部分佔所述第一基本上透明的聚合物層的表面積的約25％。在一些實施方案中，所述編碼的微載體的直徑小於約200μm。在一些實施方案中，所述編碼的微載體的直徑是約50μm。在一些實施方案中，所述編碼的微載體的厚度小於約50μm。在一些實施方案中，所述編碼的微載體的厚度是約10μm。在一些實施方案中，所述方法還包括：(f)將用於捕獲分析物的捕獲劑在至少所述中心部分中偶聯至所述第二基本上透明的聚合物層的第一表面和所述第一基本上透明的聚合物層的第二表面中的至少一個。在一些實施方案中，所述第一基本上透明的聚合物層或所述第二基本上透明的聚合物層的基本上透明的聚合物包括環氧化物，並且偶聯所述捕獲劑包括：(i)使所述第一基本上透明的聚合物層和/或所述第二基本上透明的聚合物層的基本上透明的聚合物與光致產酸劑和光反應以產生交聯聚合物，其中所述光具有激活所述光致產酸劑的波長；以及(ii)使所述交聯聚合物的環氧化物與包含胺和羧基的化合物反應，其中所述化合物的胺與所述環氧化物反應以形成化合物偶聯的交聯聚合物；以及(iii)使所述化合物偶聯的交聯聚合物的羧基與所述捕獲劑反應以將所述捕獲劑在至少所述中心部分中偶聯至所述第二基本上透明的聚合物層的第一表面和所述第一基本上透明的聚合物層的第二表面中的至少一個。在一些實施方案中，所述化合物偶聯的交聯聚合物的羧基與所述捕獲劑的伯胺反應。在一些實施方案中，所述第一基本上透明的聚合物層和/或所述第二基本上透明的聚合物層的基本上透明的聚合物包括SU-8。在一些實施方案中，所述分析物選自由以下組成的組：DNA分子、DNA類似物分子、RNA分子、RNA類似物分子、多核苷酸、蛋白質、酶、脂質、磷脂、碳水化合物部分、多糖、抗原、病毒、細胞、抗體、小分子、細菌細胞、細胞器以及抗體片段。在一些實施方案中，用於捕獲所述分析物的捕獲劑選自由以下組成的組：DNA分子、DNA類似物分子、RNA分子、RNA類似物分子、多核苷酸、蛋白質、酶、脂質、磷脂、碳水化合物部分、多糖、抗原、病毒、細胞、抗體、小分子、細菌細胞、細胞器以及抗體片段。

另一方面，本文提供一種通過以上實施方案中的任一個的方法產生的編碼的微載體。

另一方面，本文提供一種製備編碼的微載體的方法，所述方法包括：(a)在基底上沉積犧牲層；(b)在所述犧牲層上沉積基本上不透明的聚合物層，所述基本上不透明的聚合物層具有輪廓、第一表面和第二表面，所述第一表面和所述第二表面彼此平行，其中所述第二表面被固定至所述犧牲層；(c)通過光刻使所述基本上不透明的聚合物層的輪廓成形，其中所述輪廓被成形為表示模擬代碼的二維形狀；(d)將所述犧牲聚合物層溶解於溶劑中；以及(e)除去所述基底。另一方面，本文提供一種製備編碼的微載體的方法，所述方法包括：(a)在基底上沉積犧牲層；(b)在所述犧牲層上沉積包含磁性材料的磁性層；(c)在所述磁性層上沉積基本上不透明的聚合物層，所述基本上不透明的聚合物層具有輪廓、第一表面和第二表面，所述第一表面和所述第二表面彼此平行，其中所述第二表面被固定至所述磁性層；(d)通過光刻使所述基本上不透明的聚合物層的輪廓成形，其中所述輪廓被成形為表示模擬代碼的二維形狀；(e)將所述犧牲聚合物層溶解於溶劑中；以及(f)除去所述基底。

在一些實施方案中，所述方法還包括(g)在步驟(b)之後且在步驟(c)之前，通過光刻使所述磁性層成形。在一些實施方案中，所述磁性材料包括鎳。在一些實施方案中，所述微載體包括用於定向所述基本上不透明的聚合物層的模擬代碼的定向指標。在一些實施方案中，所述定向指標包括所述基本上不透明的聚合物層的輪廓的不對稱性。在一些實施方案中，所述基本上不透明的聚合物層的二維形狀包括齒輪形狀，所述齒輪形狀包括多個齒輪齒，並且其中所述模擬代碼由一個或多個選自由以下組成的組的方面表示：所述多個齒輪齒中的一個或多個齒輪齒的高度、所述多個齒輪齒中的一個或多個齒輪齒的寬度、所述多個齒輪齒中的齒輪齒數量以及所述多個齒輪齒內的一個或多個齒輪齒的布置。在一些實施方案中，所述多個齒輪齒包括寬度介於約1μm與約10μm之間的一個或多個齒輪齒。在一些實施方案中，所述多個齒輪齒包括高度介於約1μm與約10μm之間的一個或多個齒輪齒。在一些實施方案中，所述多個齒輪齒包括間隔介於約1μm與約10μm之間的兩個或更多個齒輪齒。在一些實施方案中，所述微載體是基本上圓形的盤。在一些實施方案中，所述微載體的直徑小於約200μm。在一些實施方案中，所述微載體的直徑是約60μm。在一些實施方案中，所述微載體的厚度小於約30μm。在一些實施方案中，所述微載體的厚度是約10μm。在一些實施方案中，所述方法還包括(h)將用於捕獲分析物的捕獲劑偶聯至所述基本上不透明的聚合物層的第一表面和第二表面中的至少一個。在一些實施方案中，所述基本上不透明的聚合物層的基本上不透明的聚合物包括環氧化物，並且偶聯所述捕獲劑包括：(i)使所述基本上不透明的聚合物層的基本上不透明的聚合物與光致產酸劑和光反應以產生交聯聚合物，其中所述光具有激活所述光致產酸劑的波長；以及(ii)使所述交聯聚合物的環氧化物與包含胺和羧基的化合物反應，其中所述化合物的胺與所述環氧化物反應以形成化合物偶聯的交聯聚合物；以及(iii)使所述化合物偶聯的交聯聚合物的羧基與所述捕獲劑反應以將所述捕獲劑在至少所述中心部分中偶聯至所述第二基本上透明的聚合物層的第一表面和所述第一基本上透明的聚合物層的第二表面中的至少一個。在一些實施方案中，所述分析物選自由以下組成的組：DNA分子、DNA類似物分子、RNA分子、RNA類似物分子、多核苷酸、蛋白質、酶、脂質、磷脂、碳水化合物部分、多糖、抗原、病毒、細胞、抗體、小分子、細菌細胞、細胞器以及抗體片段。在一些實施方案中，用於捕獲所述分析物的捕獲劑選自由以下組成的組：DNA分子、DNA類似物分子、RNA分子、RNA類似物分子、多核苷酸、蛋白質、酶、脂質、磷脂、碳水化合物部分、多糖、抗原、病毒、細胞、抗體、小分子、細菌細胞、細胞器以及抗體片段。

另一方面，本文提供一種通過以上實施方案中的任一個的方法產生的編碼的微載體。

另一方面，本文提供一種檢測溶液中的兩種或更多種分析物的方法，所述方法包括：(a)使包含第一分析物和第二分析物的溶液與多個微載體接觸，其中所述多個微載體至少包括：(i)根據以上實施方案中的任一個的第一微載體，所述第一微載體特異性地捕獲所述第一分析物，其中用第一模擬代碼編碼所述第一微載體；以及(ii)根據以上實施方案中的任一個的第二微載體，所述第二微載體特異性地捕獲所述第二分析物，其中用第二模擬代碼編碼所述第二微載體，並且其中所述第二模擬代碼不同於所述第一模擬代碼；(b)使用模擬形狀識別解碼所述第一模擬代碼和所述第二模擬代碼以辨識所述第一微載體和所述第二微載體；以及(c)檢測結合至所述第一微載體的第一分析物的量和結合至所述第二微載體的第二分析物的量。

在一些實施方案中，步驟(b)在步驟(c)之前發生。在一些實施方案中，步驟(c)在步驟(b)之前發生。在一些實施方案中，步驟(b)與步驟(c)同時發生。在一些實施方案中，解碼所述第一模擬代碼和所述第二模擬代碼包括：(i)通過使光穿過所述第一微載體和所述第二微載體的基本上透明的部分和/或周圍溶液來照射所述第一微載體和所述第二微載體，其中所述光未能穿過所述第一微載體和所述第二微載體的基本上不透明的部分以產生對應於所述第一微載體的第一模擬編碼的光圖案和對應於所述第二微載體的第二模擬編碼的光圖案；(ii)使所述第一模擬編碼的光圖案成像以產生第一模擬編碼的圖像並且使所述第二模擬編碼的光圖案成像以產生第二模擬編碼的圖像；以及(iii)使用模擬形狀識別來使所述第一模擬編碼的圖像與所述第一模擬代碼匹配且使所述第二模擬編碼的圖像與所述第二模擬代碼匹配。在一些實施方案中，檢測結合至所述第一微載體的第一分析物的量和結合至所述第二微載體的第二分析物的量包括：(i)在步驟(a)之後，將所述第一微載體和所述第二微載體與檢測劑一起孵育，其中所述檢測劑結合由所述第一微載體捕獲的第一分析物和由所述第二微載體捕獲的第二分析物；以及(ii)測量結合至所述第一微載體和所述第二微載體的檢測劑的量。在一些實施方案中，所述檢測劑是螢光檢測劑，並且結合至所述第一微載體和所述第二微載體的檢測劑的量通過螢光顯微術來測量。在一些實施方案中，所述檢測劑是發光檢測劑，並且結合至所述第一微載體和所述第二微載體的檢測劑的量通過發光顯微術來測量。在一些實施方案中，所述溶液包含生物樣品。在一些實施方案中，所述生物樣品選自由以下組成的組：血液、尿液、痰液、膽汁、腦脊髓液、皮膚或脂肪組織的間質液、唾液、眼淚、支氣管肺泡灌洗液、口咽分泌物、腸液、子宮頸陰道或子宮分泌物以及精液。

另一方面，本文提供一種試劑盒或製品，所述試劑盒或製品包括多個微載體，其中所述多個微載體至少包括：(a)根據以上實施方案中的任一個的第一微載體，所述第一微載體特異性地捕獲第一分析物，其中用第一模擬代碼編碼所述第一微載體；以及(b)根據以上實施方案中的任一個的第二微載體，所述第二微載體特異性地捕獲第二分析物，其中用第二模擬代碼編碼所述第二微載體，並且其中所述第二模擬代碼不同於所述第一模擬代碼。

在一些實施方案中，所述試劑盒或製品還包括用於檢測結合至所述第一微載體的第一分析物的量和結合至所述第二微載體的第二分析物的量的檢測劑。在一些實施方案中，所述試劑盒或製品還包括有關使用所述試劑盒來檢測所述第一分析物和所述第二分析物的說明書。

應了解，本文所述的各個實施方案的一種、一些或所有特性可組合以形成本發明的其他實施方案。本發明的這些和其他方面對於本領域技術人員將變得顯而易見。

附圖簡述

圖1A和1B示出示例性微載體的兩個視圖。

圖1C和1D示出用於分析物檢測的使用示例性微載體的示例性測定。

圖2A和2B示出示例性微載體的兩個視圖。

圖3示出包括用於產生唯一模擬代碼的多個形狀變化點的示例性模擬編碼方案。

圖4A示出微載體的三個實例，所述微載體各自具有唯一模擬代碼。

圖4B示出根據一些實施方案，具有唯一模擬代碼的微載體的實例。

圖5A和5B示出示例性微載體的兩個視圖。

圖6A和6B示出示例性微載體的兩個視圖。

圖6C示出示例性模擬代碼的尺寸。尺寸基於μm單位。

圖7示出示例性微載體。

圖8A示出包括作為定向指標的不對稱起始位置的示例性微載體。

圖8B示出包括用於產生唯一模擬代碼的多個形狀變化點的示例性模擬編碼方案。

圖9A-9C示出示例性微載體的兩個視圖(圖9A和圖9B)，連同任選特徵的描繪(圖9C)。

圖10示出用於產生示例性微載體的方法。

圖11A和11B示出用於產生示例性微載體的方法。

圖12A-12E示出用於產生示例性微載體的方法。

圖13A-13C示出用於產生示例性微載體的方法。

詳述

一方面，本文提供用於多重測定中的分析物檢測的編碼的微載體。在一些實施方案中，所述微載體包括(a)具有第一表面和第二表面的基本上透明的聚合物層，所述第一表面和所述第二表面彼此平行；(b)基本上不透明的聚合物層，其中所述基本上不透明的聚合物層被固定至所述基本上透明的聚合物層的第一表面，並且包圍所述基本上透明的聚合物層的中心部分，並且其中所述基本上不透明的聚合物層包括表示模擬代碼的二維形狀；以及(c)用於捕獲分析物的捕獲劑，其中所述捕獲劑在所述基本上透明的聚合物層的至少所述中心部分中偶聯至所述基本上透明的聚合物層的第一表面和第二表面中的至少一個。在其他實施方案中，所述微載體包括(a)具有第一表面和第二表面的基本上不透明的聚合物層，所述第一表面和所述第二表面彼此平行，其中所述基本上不透明的聚合物層的輪廓包括表示模擬代碼的二維形狀；以及(b)用於捕獲分析物的捕獲劑，其中所述捕獲劑在所述基本上不透明的聚合物層的至少中心部分中偶聯至所述基本上不透明的聚合物層的第一表面和第二表面中的至少一個。

另一方面，本文提供製備編碼的微載體的方法。在一些實施方案中，所述方法包括：(a)沉積基本上透明的聚合物層，其中所述基本上透明的聚合物層具有第一表面和第二表面，所述第一表面和所述第二表面彼此平行；(b)在所述基本上透明的聚合物層的第一表面上沉積基本上不透明的磁性層；(c)蝕刻所述基本上不透明的磁性層以除去所述基本上不透明的磁性層的沉積在所述基本上透明的聚合物層的中心部分上的部分；(d)在所述基本上不透明的磁性層上沉積第二基本上透明的聚合物層，其中所述第二基本上透明的聚合物層具有第一表面和第二表面，所述第一表面和所述第二表面彼此平行，其中所述第二表面被固定至所述基本上不透明的磁性層，並且其中所述第二基本上透明的聚合物層與所述第一基本上透明的聚合物層對齊並且具有與所述基本上透明的聚合物層的中心部分對齊的中心部分；以及(e)在所述第二基本上透明的聚合物層的第一表面上沉積基本上不透明的聚合物層，其中所述基本上不透明的聚合物層包圍所述第一基本上透明的聚合物層和所述第二基本上透明的聚合物層的中心部分，並且其中所述基本上不透明的聚合物層包括表示模擬代碼的二維形狀。在其他實施方案中，所述方法包括：(a)在基底上沉積犧牲層；(b)在所述犧牲層上沉積基本上不透明的聚合物層，所述基本上不透明的聚合物層具有輪廓、第一表面和第二表面，所述第一表面和所述第二表面彼此平行，其中所述第二表面被固定至所述犧牲層；(c)通過光刻使所述基本上不透明的聚合物層的輪廓成形，其中所述輪廓被成形為表示模擬代碼的二維形狀；(d)將所述犧牲聚合物層溶解於溶劑中；以及(e)除去所述基底。在其他實施方案中，所述方法包括：(a)在基底上沉積犧牲層；(b)在所述犧牲層上沉積包括磁性材料的磁性層；(c)在所述磁性層上沉積基本上不透明的聚合物層，所述基本上不透明的聚合物層具有輪廓、第一表面和第二表面，所述第一表面和所述第二表面彼此平行，其中所述第二表面被固定至所述磁性層；(d)通過光刻使所述基本上不透明的聚合物層的輪廓成形，其中所述輪廓被成形為表示模擬代碼的二維形狀；(d)將所述犧牲聚合物層溶解於溶劑中；以及(e)除去所述基底。本文進一步提供通過本文公開的方法產生的編碼的微載體。

在又一方面，本文提供用於通過以下步驟來檢測溶液中的兩種或更多種分析物的方法：(a)使包含第一分析物和第二分析物的溶液與多個微載體接觸，其中所述多個微載體至少包括：(i)本公開的第一微載體，所述第一微載體特異性地捕獲所述第一分析物，其中用第一模擬代碼編碼所述第一微載體；以及(ii)本公開的第二微載體，所述第二微載體特異性地捕獲所述第二分析物，其中用第二模擬代碼編碼所述第二微載體，並且其中所述第二模擬代碼不同於所述第一模擬代碼；(b)使用模擬形狀識別解碼所述第一模擬代碼和所述第二模擬代碼以辨識所述第一微載體和所述第二微載體；以及(c)檢測結合至所述第一微載體的第一分析物的量和結合至所述第二微載體的第二分析物的量。

另一方面，本文提供用於進行多重測定的試劑盒或製品，所述試劑盒或製品包括多個微載體。所述多個微載體至少包括(a)本公開的第一微載體，所述第一微載體特異性地捕獲第一分析物，其中用第一模擬代碼編碼所述第一微載體；以及(b)本公開的第二微載體，所述第二微載體特異性地捕獲第二分析物，其中用第二模擬代碼編碼所述第二微載體，並且其中所述第二模擬代碼不同於所述第一模擬代碼。

I.一般技術

除非另有說明，否則本文所述的技術的實踐將採用聚合物技術、微製造、微機電系統(MEMS)製造、光刻、微流體、有機化學、生物化學、寡核苷酸合成和修飾、生物綴合物化學、核酸雜交、分子生物學、微生物學、遺傳學、重組DNA以及如在本領域技術內的相關領域中的常規技術。所述技術在本文引用的參考文獻中進行了描述並且在文獻中得到充分解釋。

關於分子生物學和重組DNA技術，參見例如(Maniatis，T.等人(1982)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor；Ausubel，F.M.(1987)，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience；Ausubel，F.M.(1989)，Short Protocols in Molecular Biology：A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology，Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience；Sambrook，J.等人(1989)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor；Innis，M.A.(1990)，PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications，Academic Press；Ausubel，F.M.(1992)，Short Protocols in Molecular Biology：A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology，Greene Pub.Associates；Ausubel，F.M.(1995)，Short Protocols in Molecular Biology：A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology，Greene Pub.Associates；Innis，M.A.等人(1995)，PCR Strategies，Academic Press；Ausubel，F.M.(1999)，Short Protocols in Molecular Biology：A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology，Wiley，以及每年更新。

關於DNA合成技術和核酸化學，參見例如Gait，M.J.(1990)，Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach，IRL Press；Eckstein，F.(1991)，Oligonucleotides and Analogues：A Practical Approach，IRL Press；Adams，R.L.等人(1992)，The Biochemistry of the Nucleic Acids，Chapman&Hall；Shabarova，Z.等人(1994)，Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids，Weinheim；Blackburn，G.M.等人(1996)，Nucleic Acids in Chemistry and Biology，Oxford University Press；Hermanson，G.T.(1996)，Bioconjugate Techniques，Academic Press)。

關於微製造，參見例如(Campbell，S.A.(1996)，The Science and Engineering of Microelectronic Fabrication，Oxford University Press；Zaut，P.V.(1996)，Microarray Fabrication：a Practical Guide to Semiconductor Processing，Semiconductor Services；Madou，M.J.(1997)，Fundamentals of Microfabrication，CRC Press；Rai-Choudhury，P.(1997).Handbook of Microlithography，Micromachining，&Microfabrication：Microlithography)。

II.定義

在詳細描述本發明之前，應理解本發明不限於特定組合物或生物系統，而所述組合物或生物系統當然可以變化。還將理解，本文所使用的術語僅是出於描述具體實施方案的目的，並且不意圖具有限制性。

如本文所用的術語「微載體」可指捕獲劑可偶聯至其上的物理基底。本公開的微載體可採取任何適合的幾何形式或形狀。在一些實施方案中，所述微載體可以是盤形的。通常，微載體的形式或形狀將包括至少一個大約10-4至10-7m的尺寸(因此前綴「微」)。

如本文所用的術語「聚合物」可指包括重複單體的任何大分子結構。聚合物可以是天然的(例如，在自然中發現的)或合成的(例如，人造的，如由非天然單體組成和/或以未在自然中發現的構造或組合聚合的聚合物)。

如本文所用的術語「基本上透明的」和「基本上不透明的」可指光(例如，具有特定波長的光，如紅外光、可見光、UV光等)穿過基底(如聚合物層)的能力。基本上透明的聚合物可指透明、半透明和/或可透光的聚合物，而基本上不透明的聚合物可指反射和/或吸收光的聚合物。應理解，材料是基本上透明的還是基本上不透明的可取決於照射所述材料的光的波長和/或強度，以及檢測行進穿過所述材料的光(或者其減少或不存在)的裝置。在一些實施方案中，例如，如通過光學顯微術(例如，明視野、暗視野、相差、微分幹涉差(DIC)、諾馬爾斯基幹涉差(NIC)、諾馬爾斯基(Nomarski)、霍夫曼(Hoffman)調製相差(HMC)或螢光顯微術)成像，與周圍材料或圖像場相比，基本上不透明的材料引起透射光的可感知的減少。在一些實施方案中，例如，如通過光學顯微術(例如，明視野、暗視野、相差、微分幹涉差(DIC)、諾馬爾斯基幹涉差(NIC)、諾馬爾斯基、霍夫曼調製相差(HMC)或螢光顯微術)成像，基本上透明的材料允許可感知量的透射光穿過所述材料。

如本文所用的術語「模擬代碼」可指以非量化和/或非離散方式(例如，如與數字代碼相反)表示編碼的信息的任何代碼。例如，數字代碼在值(例如，0/1類型值)的有限集合的離散位置處進行採樣，而模擬代碼可在更大範圍的位置(或作為連續的整體)處進行採樣和/或可包括值(例如，形狀)的更寬集合。在一些實施方案中，可使用一種或多種模擬形狀識別技術來讀取或解碼模擬代碼。

如本文所用的術語「捕獲劑」是廣義術語，並且以其通常意義使用來指能夠特異性地識別目標分析物的任何化合物或物質。在一些實施方案中，特異性識別可指特異性結合。捕獲劑的非限制性實例包括例如，DNA分子、DNA類似物分子、RNA分子、RNA類似物分子、多核苷酸、蛋白質、酶、脂質、磷脂、碳水化合物部分、多糖、抗原、病毒、細胞、抗體、小分子、細菌細胞、細胞器以及抗體片段。

如本文所用，「分析物」是廣義術語，並且以其通常意義用作待確定其存在、不存在或量的物質，包括但不限於來指樣品如生物樣品或細胞或細胞群體中可進行分析的物質或化學成分。分析物可以是存在針對其的天然存在的結合成員的物質，或者可製備針對其的結合成員的物質。分析物的非限制性實例包括例如，抗體、抗體片段、抗原、多核苷酸(如DNA分子、DNA模擬物分子、RNA分子或RNA模擬物分子)、多肽、蛋白質、酶、脂質、磷脂、碳水化合物部分、多糖、小分子、細胞器、激素、細胞因子、生長因子、類固醇、維生素、毒素、藥物和上述物質的代謝物，以及細胞、細菌、病毒、真菌、藻類、真菌孢子等。

術語「抗體」以最廣泛意義使用並且包括單克隆抗體(包括具有免疫球蛋白Fc區的全長抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體、雙功能抗體和單鏈分子)以及抗體片段(例如，Fab、F(ab′)2和Fv)。

如本文所用，「樣品」是指含有待檢測的材料(如分子)的組合物。在一個實施方案中，樣品是「生物樣品」(即，從活的來源(例如人、動物、植物、細菌、真菌、原生生物、病毒)獲得的任何材料)。生物樣品可呈任何形式，包括固體材料(例如組織、細胞沉澱和活檢)和生物流體(例如尿液、血液、唾液、淋巴、眼淚、汗液、前列腺液、精液(seminal fluid)、精液(semen)、膽汁、粘液、羊水和漱口水(含有口腔細胞))。固體材料通常與流體混合。樣品還可指環境樣品，如水、空氣、土壤或任何其他環境來源。

如本說明書和隨附權利要求中所用，除非內容另外明確指示，否則單數形式「一個(a/an)」和「所述」包括複數個指示物。因此，例如，提及「一個分子」任選地包括兩個或更多個此類分子的組合等。

如本文所用的術語「約」是指本技術領域中的技術人員容易地已知的相應值的通常誤差範圍。本文中對「約」某一個值或參數的提及包括(以及描述)針對所述值或參數本身的實施方案。

應理解，本文中描述的本發明的方面和實施方案包括「包括」方面和實施方案、「由方面和實施方案組成」和/或「主要由方面和實施方案組成」。

III.編碼的微載體

本文提供適合於分析物檢測，例如多重分析物檢測的編碼的微載體。本文涵蓋、描述且例示了編碼的微載體的多種構造。

在一些方面，本文提供編碼的微載體，其包括：具有第一表面和第二表面的基本上透明的聚合物層，所述第一表面和所述第二表面彼此平行；基本上不透明的聚合物層，其中所述基本上不透明的聚合物層被固定至所述基本上透明的聚合物層的第一表面，並且包圍所述基本上透明的聚合物層的中心部分，並且其中所述基本上不透明的聚合物層包括表示模擬代碼的二維形狀；以及用於捕獲分析物的捕獲劑，其中所述捕獲劑在所述基本上透明的聚合物層的至少所述中心部分中偶聯至所述基本上透明的聚合物層的第一表面和第二表面中的至少一個。因此，所述微載體含有至少兩個層：所述層中的一個是基本上透明的，並且所述層中的另一個是表示模擬代碼的基本上不透明的二維形狀。有利地，這些微載體可採用多種二維形狀，同時仍然保留均勻的總體形式(例如，基本上透明的聚合物層的周邊)以獲得包括例如總體尺寸、物理性質和/或溶液中的行為的方面的均勻性。這種類型的微載體及其方面的實例在圖1A-5B中示出。

在一些實施方案中，所述微載體還包括固定至基本上透明的聚合物層的表面的基本上不透明的磁性層，所述磁性層包圍所述基本上透明的聚合物層的中心部分。在一些實施方案中，所述基本上不透明的磁性層在基本上不透明的聚合物層與基本上透明的聚合物層的中心部分之間。

在一些實施方案中，所述微載體還包括第二基本上透明的聚合物層，所述第二基本上透明的聚合物層與第一基本上透明的聚合物層對齊且固定至所述第一基本上透明的聚合物層。在一些實施方案中，所述第一基本上透明的聚合物層和第二基本上透明的聚合物層各自具有中心部分，並且所述第一基本上透明的聚合物層和第二基本上透明的聚合物層兩者的中心部分對齊。在一些實施方案中，所述微載體還包括基本上不透明的磁性層，所述磁性層包圍所述第一基本上透明的聚合物層和第二基本上透明的聚合物層兩者的中心部分。在一些實施方案中，所述基本上不透明的磁性層被固定在所述第一基本上透明的聚合物層與第二基本上透明的聚合物層之間。在一些實施方案中，所述基本上不透明的磁性層在基本上不透明的聚合物層與所述第一基本上透明的聚合物層和第二基本上透明的聚合物層兩者的中心部分之間。

在一些實施方案中，所述基本上不透明的磁性層的厚度介於約50nm與約10μm之間。在一些實施方案中，所述基本上不透明的磁性層的厚度小於約以下厚度(nm)中的任一個：10000、9500、9000、8500、8000、7500、7000、6500、6000、5500、5000、4500、4000、3500、3000、2500、2000、1500、1000、950、900、850、800、750、700、650、600、550、500、450、400、350、300、250、200、150或100。在一些實施方案中，所述基本上不透明的磁性層的厚度大於約以下厚度(nm)中的任一個：50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000或9500。即，所述基本上不透明的磁性層的厚度可以是具有上限10000、9500、9000、8500、8000、7500、7000、6500、6000、5500、5000、4500、4000、3500、3000、2500、2000、1500、1000、950、900、850、800、750、700、650、600、550、500、450、400、350、300、250、200、150或100和獨立地選擇的下限50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000或9500的厚度(nm)範圍中的任一個，其中所述下限小於所述上限。

在一些實施方案中，所述基本上不透明的磁性層的厚度是約0.1μm。在一些實施方案中，所述基本上不透明的磁性層的厚度是約50nm、約100nm、約150nm、約200nm、約250nm、約300nm、約350nm、約400nm、約450nm、約500nm、約550nm、約600nm、約650nm、約700nm、約750nm、約800nm、約850nm、約900nm、約950nm、約1μm、約1.5μm、約2μm、約2.5μm、約3μm、約3.5μm、約4μm、約4.5μm、約5μm、約5.5μm、約6μm、約6.5μm、約7μm、約7.5μm、約8μm、約8.5μm、約9μm、約9.5μm或約10μm。在一些實施方案中，所述基本上不透明的磁性層的厚度是約0.01μm、約0.02μm、約0.03μm、約0.04μm、約0.05μm、約0.06μm、約0.07μm、約0.08μm、約0.09μm、約0.1μm、約0.11μm、約0.12μm、約0.13μm、約0.14μm、約0.15μm、約0.16μm、約0.17μm、約0.18μm、約0.19μm、約0.20μm、約0.25μm、約0.30μm、約0.35μm、約0.40μm、約0.45μm或約0.50μm。

在一些實施方案中，所述微載體還包括用於定向基本上不透明的聚合物層的模擬代碼的定向指標。微載體的通過成像(例如，本文描述的一種形式的顯微或其他成像)和/或通過圖像識別軟體可見和/或可檢測的任何特徵可用作定向指標。定向指標可用作例如圖像識別算法的參考點，以使模擬代碼的圖像在統一定向上取向(即，基本上不透明的聚合物層的形狀)。有利地，這簡化了圖像識別，因為算法將僅需要將特定模擬代碼的圖像與相同定向中的模擬代碼庫進行比較，而不是與包括所有可能定向中的所有模擬代碼的庫進行比較。在一些實施方案中，所述定向指標可獨立於基本上不透明的聚合物層。例如，它可形成為磁性層和/或基本上透明的聚合物層的一部分。在其他實施方案中，所述定向指標可形成為基本上不透明的聚合物層的一部分。在一些實施方案中，所述定向指標包括基本上不透明的磁性層的不對稱性(例如，如通過圖2A中的間隙210所示)。

在一些實施方案中，所述微載體還包括從微載體的表面(例如，微載體的頂表面和/或底表面)突出的一個或多個柱。如本文所用，「柱」可指從微載體表面突出的任何幾何形狀並且不一定表示尺寸的任何規則性，也不一定表示任何圓柱體特徵。例如，柱的外表面可以或可以不與微載體表面平行。可從微載體突出的柱狀形狀的實例包括但不限於矩形稜柱、三角形、角錐體、立方體、圓柱體、球體或半球體、圓錐體等。在一些實施方案中，所述一個或多個柱不在第一和/或第二基本上透明的聚合物層的中心部分內。在一些實施方案中，所述一個或多個柱可從第一基本上透明的聚合物層和第二基本上透明的聚合物層中的一個或多個的面向外的表面(例如，未固定至另一個層的表面)突出。應注意本文中微載體厚度的任何描述在所陳述尺寸中不包括所述一個或多個柱。換言之，如本文所描述的微載體厚度獨立於從其突出的任何任選的柱。

在一些實施方案中，所述一個或多個柱的高度介於約1μm與約10μm之間。在一些實施方案中，所述一個或多個柱是約1μm高、約1.5μm高、約2μm高、約2.5μm高、約3μm高、約3.5μm高、約4μm高、約4.5μm高、約5μm高、約5.5μm高、約6μm高、約6.5μm高、約7μm高、約7.5μm高、約8μm高、約8.5μm高、約9μm高、約9.5μm高或約10μm高。在一些實施方案中，所述一個或多個柱小於約以下高度(μm)中的任一個：10、9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5、3、2.5、2或1.5。在一些實施方案中，所述一個或多個柱大於約以下高度(μm)中的任一個：1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9或9.5。即，所述一個或多個柱可以是具有上限10、9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5、3、2.5、2或1.5和獨立地選擇的下限1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9或9.5的高度範圍中的任一個，其中所述下限小於所述上限。

在一些實施方案中，所述一個或多個柱可以是圓柱體形狀的。在一些實施方案中，所述一個或多個柱具有介於約1μm與約10μm之間的直徑。在一些實施方案中，所述一個或多個柱具有約1μm、約1.5μm、約2μm、約2.5μm、約3μm、約3.5μm、約4μm、約4.5μm、約5μm、約5.5μm、約6μm、約6.5μm、約7μm、約7.5μm、約8μm、約8.5μm、約9μm、約9.5μm或約10μm的直徑。在一些實施方案中，所述一個或多個柱具有小於約以下長度(μm)中的任一個的直徑：10、9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5、3、2.5、2或1.5。在一些實施方案中，所述一個或多個柱具有大於約以下長度(μm)中的任一個的直徑：1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9或9.5。即，所述一個或多個柱可具有有上限10、9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5、3、2.5、2或1.5和獨立地選擇的下限1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9或9.5的直徑範圍中的任一個，其中所述下限小於所述上限。在其他實施方案中，所述一個或多個柱可具有與上文描述的任何直徑大約相同的寬度，或與上文描述的任何直徑範圍大約相同的寬度範圍，但是所述一個或多個柱可採用橢圓柱、拋物線柱、雙曲柱或本文描述或本領域已知的任何其他圓柱體或多面體形狀。

在其他方面，本文提供編碼的微載體，其包括：具有第一表面和第二表面的基本上不透明的聚合物層，所述第一表面和所述第二表面彼此平行，其中所述基本上不透明的聚合物層的輪廓包括表示模擬代碼的二維形狀；以及用於捕獲分析物的捕獲劑，其中所述捕獲劑在所述基本上不透明的聚合物層的至少中心部分中偶聯至所述基本上不透明的聚合物層的第一表面和第二表面中的至少一個。因此，所述微載體由微載體本身的形狀(例如，輪廓)編碼：表示模擬代碼的二維形狀。有利地，這些微載體可有效且以高精度製造，從而允許高度精確的解碼和成本有效的生產。這種類型的微載體及其方面的實例在圖6A-9C中示出。

在一些實施方案中，所述微載體還包括從基本上不透明的聚合物層的表面突出的一個或多個柱。如在上文更詳細地描述，「柱」可指從微載體表面突出的任何幾何形狀並且不一定表示柱狀尺寸的任何規則性。可使用上文描述的示例性柱狀形狀中的任一種。

在一些實施方案中，所述一個或多個柱的高度介於約1μm與約10μm之間。在一些實施方案中，所述一個或多個柱是約1μm高、約1.5μm高、約2μm高、約2.5μm高、約3μm高、約3.5μm高、約4μm高、約4.5μm高、約5μm高、約5.5μm高、約6μm高、約6.5μm高、約7μm高、約7.5μm高、約8μm高、約8.5μm高、約9μm高、約9.5μm高或約10μm高。在一些實施方案中，所述一個或多個柱小於約以下高度(μm)中的任一個：10、9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5、3、2.5、2或1.5。在一些實施方案中，所述一個或多個柱大於約以下高度(μm)中的任一個：1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9或9.5。即，所述一個或多個柱可以是具有上限10、9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5、3、2.5、2或1.5和獨立地選擇的下限1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9或9.5的高度範圍中的任一個，其中所述下限小於所述上限。

在一些實施方案中，所述一個或多個柱可以是圓柱體形狀的。在一些實施方案中，所述一個或多個柱具有介於約1μm與約10μm之間的直徑。在一些實施方案中，所述一個或多個柱具有約1μm、約1.5μm、約2μm、約2.5μm、約3μm、約3.5μm、約4μm、約4.5μm、約5μm、約5.5μm、約6μm、約6.5μm、約7μm、約7.5μm、約8μm、約8.5μm、約9μm、約9.5μm或約10μm的直徑。在一些實施方案中，所述一個或多個柱具有小於約以下長度(μm)中的任一個的直徑：10、9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5、3、2.5、2或1.5。在一些實施方案中，所述一個或多個柱具有大於約以下長度(μm)中的任一個的直徑：1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9或9.5。即，所述一個或多個柱可具有有上限10、9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5、3、2.5、2或1.5和獨立地選擇的下限1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9或9.5的直徑範圍中的任一個，其中所述下限小於所述上限。在其他實施方案中，所述一個或多個柱可具有與上文描述的任何直徑大約相同的寬度，或與上文描述的任何直徑範圍大約相同的寬度範圍，但是所述一個或多個柱可採用橢圓柱、拋物線柱、雙曲柱或本文描述或本領域已知的任何其他圓柱體或多面體形狀。

在一些實施方案中，所述微載體還包括固定至基本上不透明的聚合物層的表面的磁性層，所述磁性層包括磁性材料。在一些實施方案中，所述磁性層不延伸超出基本上不透明的聚合物層的二維形狀。換言之，如果將使基本上不透明的聚合物層的輪廓成像，則所得到的圖像將不會因磁性層的存在或不存在而改變。在一些實施方案中，所述磁性層可包括上文描述的一個或多個柱。即，上文描述的一個或多個柱可由本文描述的磁性材料製成。

在一些實施方案中，所述微載體還包括用於定向基本上不透明的聚合物層的模擬代碼的定向指標。微載體的通過成像(例如，本文描述的一種形式的顯微或其他成像)和/或通過圖像識別軟體可見和/或可檢測的任何特徵可用作定向指標。定向指標可用作例如圖像識別算法的參考點，以使模擬代碼的圖像在統一定向上取向(即，基本上不透明的聚合物層的形狀)。有利地，這簡化了圖像識別，因為算法將僅需要將特定模擬代碼的圖像與相同定向中的模擬代碼庫進行比較，而不是與包括所有可能定向中的所有模擬代碼的庫進行比較。在一些實施方案中，所述定向指標包括所述基本上不透明的聚合物層的輪廓的不對稱性。例如，所述定向指標可包括可見特徵，如微載體的輪廓的不對稱性(例如，如通過圖8A和9A中的起始位置804和904所示)。

本文所述的任何微載體可包括下文描述的特徵、要素或方面中的一個或多個。此外，下文描述的特徵、要素或方面中的一個或多個可取決於微載體的實施方案採用不同的特徵，例如，如上文所描述。

在一些實施方案中，本公開的基本上透明的聚合物包括環氧基聚合物。用於製造本文描述的組合物的合適環氧基聚合物包括但不限於由Hexion Specialty Chemicals，Inc.(Columbus，OH)提供的環氧樹脂的EPONTM家族和由The Dow Chemical Company(Midland，MI)提供的任何數量的環氧樹脂。合適的聚合物的許多實例是本領域中通常已知的，包括但不限於SU-8、EPON 1002F、EPON 165/154和聚(甲基丙烯酸甲酯)/聚(丙烯酸)嵌段共聚物(PMMA-co-PAA)。關於另外的聚合物，參見例如，Warad，IC Packaging：Package Construction Analysis in Ultra Small IC Packaging，LAP LAMBERT Academic Publishing(2010)；The Electronic Packaging Handbook，CRC Press(Blackwell，編輯)，(2000)；以及Pecht等人，Electronic Packaging Materials and Their Properties，CCR Press，第1版，(1998)。這些類型的材料具有在水性環境中不膨脹的優點，這確保在微載體群體內維持均勻的微載體大小和形狀。在一些實施方案中，基本上透明的聚合物是光致抗蝕劑聚合物。在一些實施方案中，環氧基聚合物是環氧基的負型近UV光致抗蝕劑。在一些實施方案中，環氧基聚合物是SU-8。

在一些實施方案中，基本上不透明的聚合物是與一種或多種不透明的或有色染料混合的本文描述的聚合物(例如，SU-8)。在其他實施方案中，基本上不透明的聚合物是黑色基質抗蝕劑。可使用本領域中已知的任何黑色基質抗蝕劑；關於示例性黑色基質抗蝕劑和與其相關的方法，參見例如，美國專利號8,610,848。在一些實施方案中，黑色基質抗蝕劑可以是用黑色顏料著色，例如，如在作為黑色基質的一部分的LCD的濾色器上圖案化的光致抗蝕劑。黑色基質抗蝕劑可包括但不限於由Toppan Printing Co.(東京)、Tokyo OHKA Kogyo(川崎)和Daxin Materials Corp.(臺中市，臺灣)出售的那些。

在一些實施方案中，可參照一個或多個聚合物層的中心部分。本公開的中心部分可採用任何形狀。在一些實施方案中，所述中心部分的形狀可反映或對應於相應聚合物層的形狀(例如，輪廓)。在其他實施方案中，所述中心部分的形狀可獨立於相應聚合物層的形狀(例如，輪廓)。例如，圓形微載體表面的中心部分在一些實施方案中可以是圓形的並且在其他實施方案中可以是正方形的。正方形微載體表面的中心部分在一些實施方案中可以是正方形的並且在其他實施方案中可以是圓形的。

在一些實施方案中，本公開的聚合物層的中心部分是所述聚合物層的表面積的約5％、約7％、約10％、約15％、約20％、約25％、約30％、約35％、約40％、約45％、約50％、約55％、約60％、約65％、約70％、約75％、約80％、約85％或約90％。在一些實施方案中，本公開的聚合物層的中心部分小於基本上透明的聚合物層的約以下分數(％)中的任一個：90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10或7。在一些實施方案中，本公開的聚合物層的中心部分大於基本上透明的聚合物層的約以下分數(％)中的任一個：5、7、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80或85。即，包括於中心部分中的聚合物層表面積的分數可以是具有上限90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10或7和獨立地選擇的下限5、7、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80或85的百分比範圍中的任一個，其中所述下限小於所述上限。在一些實施方案中，聚合物層的中心部分佔所述聚合物層的表面積的約25％。在一些實施方案中，微載體表面的中心部分包括微載體的整個表面減去輪廓部分。

如上所述，本公開的微載體還可包括磁性層，所述磁性層可採用如本文所述的多種形狀。在一些實施方案中，磁性層可以是基本上不透明的層。在一些實施方案中，磁性層可包括磁性材料。本公開的磁性層可由任何合適的磁性材料製成，如具有順磁、鐵磁或亞鐵磁特性的材料。磁性材料的實例包括但不限於鐵、鎳、鈷和一些稀土金屬(例如，釓、鏑、釹等)以及其合金。在一些實施方案中，磁性材料包括鎳，包括但不限於元素鎳和磁性鎳合金，如鋁鎳鈷合金和坡莫合金。在本公開的微載體中包括磁性層可以是(例如)在促進磁性分離方面有利的，其可適用於洗滌、收集和以其他方式操縱一種或多種微載體。

如上所述，在一些實施方案中，磁性層可被固定至基本上透明的聚合物層的表面並且包圍所述基本上透明的聚合物層的中心部分。在其他實施方案中，如上所述，磁性層可包括一個或多個柱；即，以上所述的一個或多個柱可由本文所述的磁性材料製成。

在一些實施方案中，本公開的微載體可用構成二維形狀的基本上不透明的層編碼。例如，如上所述，二維形狀可構成與微載體的基本上透明的層形成對比的基本上不透明的層的形狀，或者它可構成微載體本身的形狀(例如周邊)。可使用可涵蓋多個可分辨和獨特變化的任何二維形狀。在一些實施方案中，二維形狀包括線性、圓形、橢圓形、矩形、四邊形或更高多邊形方面、單元和/或形狀中的一個或多個。

在一些實施方案中，基本上不透明的聚合物層的二維形狀包括齒輪形狀。如本文使用的齒輪形狀可指排列在基本上圓形、橢圓形或環形體的周邊上的多個形狀(例如，齒輪齒)，其中所述多個形狀中的至少兩個形狀在空間上分離。在一些實施方案中，所述齒輪形狀包括多個齒輪齒。在一些實施方案中，模擬代碼由一個或多個選自以下的方面表示：所述多個齒輪齒中的一個或多個齒輪齒的高度、所述多個齒輪齒中的一個或多個齒輪齒的寬度、所述多個齒輪齒中的齒輪齒數量以及所述多個齒輪齒內的一個或多個齒輪齒的布置。有利地，齒輪形狀涵蓋多個方面，包括齒輪齒的高度、齒輪齒的寬度、齒輪齒的數量和齒輪齒的布置，所述多個方面可變化以便產生各種各樣的潛在唯一二維形狀。然而，應理解，因為本公開的齒輪形狀用於編碼並且不需要與另一齒輪(例如，如與傳遞轉矩的機械齒輪)物理地互相嚙合，所以本公開的齒輪齒不受對在一個齒輪形狀內或多個齒輪形狀之間的相同或互相嚙合形狀的需要約束。因此，可視為本公開的齒輪齒的形狀的多樣性顯著大於機械齒輪的形狀的多樣性。

在一些實施方案中，所述多個齒輪齒包括寬度介於約1μm與約10μm之間的一個或多個齒輪齒。在一些實施方案中，所述多個齒輪齒包括約1μm寬、約1.5μm寬、約2μm寬、約2.5μm寬、約3μm寬、約3.5μm寬、約4μm寬、約4.5μm寬、約5μm寬、約5.5μm寬、約6μm寬、約6.5μm寬、約7μm寬、約7.5μm寬、約8μm寬、約8.5μm寬、約9μm寬、約9.5μm寬或約10μm寬的一個或多個齒輪齒。在一些實施方案中，所述多個齒輪齒包括小於約以下寬度(μm)中的任一個的一個或多個齒輪齒：10、9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5、3、2.5、2或1.5。在一些實施方案中，所述多個齒輪齒包括大於約以下寬度(μm)中的任一個的一個或多個齒輪齒：1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9或9.5。即，所述多個齒輪齒可包括可為具有上限10、9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5、3、2.5、2或1.5和獨立地選擇的下限1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9或9.5的寬度範圍中的任一個的一個或多個齒輪齒，其中所述下限小於所述上限。

在一些實施方案中，所述多個齒輪齒包括高度介於約1μm與約10μm之間的一個或多個齒輪齒。在一些實施方案中，所述多個齒輪齒包括約1μm高、約1.5μm高、約2μm高、約2.5μm高、約3μm高、約3.5μm高、約4μm高、約4.5μm高、約5μm高、約5.5μm高、約6μm高、約6.5μm高、約7μm高、約7.5μm高、約8μm高、約8.5μm高、約9μm高、約9.5μm高或約10μm高的一個或多個齒輪齒。在一些實施方案中，所述多個齒輪齒包括小於約以下高度(μm)中的任一個的一個或多個齒輪齒：10、9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5、3、2.5、2或1.5。在一些實施方案中，所述多個齒輪齒包括大於約以下高度(μm)中的任一個的一個或多個齒輪齒：1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9或9.5。即，所述多個齒輪齒可包括可為具有上限10、9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5、3、2.5、2或1.5和獨立地選擇的下限1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9或9.5的高度範圍中的任一個的一個或多個齒輪齒，其中所述下限小於所述上限。應理解，如果齒輪齒自其延伸的相鄰周邊區段是不均勻的，則所述齒輪齒可取決於參考點而具有不同的可測量的高度(參見例如，圖6C中的齒輪齒602，其取決於參考點可以是4或6.5μm高)。

在一些實施方案中，所述多個齒輪齒包括間隔介於約1μm與約10μm之間的一個或更多個齒輪齒。在一些實施方案中，所述多個齒輪齒包括間隔約1μm、約1.5μm、約2μm、約2.5μm、約3μm、約3.5μm、約4μm、約4.5μm、約5μm、約5.5μm、約6μm、約6.5μm、約7μm、約7.5μm、約8μm、約8.5μm、約9μm、約9.5μm或約10μm的一個或多個齒輪齒。在一些實施方案中，所述多個齒輪齒包括間隔小於約以下寬度(μm)中的任一個的一個或多個齒輪齒：10、9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5、3、2.5、2或1.5。在一些實施方案中，所述多個齒輪齒包括間隔大於約以下寬度(μm)中的任一個的一個或多個齒輪齒：1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9或9.5。即，所述多個齒輪齒可包括可間隔具有上限10、9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5、3、2.5、2或1.5和獨立地選擇的下限1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9或9.5的寬度範圍中的任一個的一個或多個齒輪齒，其中所述下限小於所述上限。

在一些實施方案中，本公開的微載體是基本上圓形的盤。如本文所用，基本上圓形的形狀可指在所述形狀的周邊和所述形狀的幾何中心的所有點之間具有大約相同距離的任何形狀。在一些實施方案中，如果連接幾何中心和周邊上的給定點的任何潛在半徑之間的變化表現出10％或更小的長度變化，則認為形狀是基本上圓形的。如本文所用，基本上圓形的盤可指任何基本上圓形的形狀，其中所述形狀的厚度顯著小於其直徑。例如，在一些實施方案中，基本上圓形的盤的厚度可以是其直徑的小於約50％、小於約40％、小於約30％、小於約20％、小於約15％、小於約10％或小於約5％。在某些實施方案中，基本上圓形的盤的厚度可以是其直徑的約20％。應理解，本公開的輪廓為齒輪形狀的微載體也可被認為是基本上圓形的盤；例如，所述微載體的除了一個或多個齒輪齒之外的形狀可包括基本上圓形的盤。

在一些實施方案中，所述微載體的直徑小於約200μm。例如，在一些實施方案中，所述微載體的直徑小於約200μm、小於約180μm、小於約160μm、小於約140μm、小於約120μm、小於約100μm、小於約80μm、小於約60μm、小於約40μm或小於約20μm。

在一些實施方案中，所述微載體的直徑是約180μm、約160μm、約140μm、約120μm、約100μm、約90μm、約80μm、約70μm、約60μm、約50μm、約40μm、約30μm、約20μm或約10μm。在某些實施方案中，所述微載體的直徑是約60μm。

在一些實施方案中，所述微載體的厚度小於約50μm。例如，在一些實施方案中，所述微載體的厚度小於約70μm、約60μm、約50μm、約40μm、約30μm、小於約25μm、小於約20μm、小於約15μm、小於約10μm或小於約5μm。在一些實施方案中，所述微載體的厚度小於約以下厚度(μm)中的任一個：70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3或2。在一些實施方案中，所述微載體的厚度大於約以下厚度(μm)中的任一個：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60或65。即，所述微載體的厚度可以是具有上限70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3或2和獨立地選擇的下限1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60或65的厚度(μm)範圍中的任一個，其中所述下限小於所述上限。

在一些實施方案中，所述微載體的厚度是約50μm、約45μm、約40μm、約35μm、約30μm、約25μm、約20μm、約19μm、約18μm、約17μm、約16μm、約15μm、約14μm、約13μm、約12μm、約11μm、約10μm、約9μm、約8μm、約7μm、約6μm、約5μm、約4μm、約3μm、約2μm或約1μm。在某些實施方案中，所述微載體的厚度是約10μm。

在一些方面，本公開的微載體可包括捕獲劑。在一些實施方案中，用於特定微載體種類的捕獲劑可以是「獨特捕獲劑」，例如捕獲劑與具有特定標識符(例如，模擬代碼)的特定微載體種類相關。捕獲劑可以是能夠結合溶液中存在的一種或多種分析物(如生物分子或化學化合物)的任何生物分子或化學化合物。生物分子捕獲劑的實例包括但不限於DNA分子、DNA類似物分子、RNA分子、RNA類似物分子、多核苷酸、蛋白質、酶、脂質、磷脂、碳水化合物部分、多糖、抗原、病毒、細胞、抗體、小分子、細菌細胞、細胞器以及抗體片段。化學化合物捕獲劑的實例包括但不限於化學品庫的個別組分、小分子或環境毒素(例如殺蟲劑或重金屬)。

在一些實施方案中，捕獲劑被偶聯至微載體的表面(在一些實施方案中，在微載體表面的至少中心部分中)。在一些實施方案中，捕獲劑可被化學連接至微載體。在其他實施方案中，捕獲劑可被物理地吸收至微載體的表面。在一些實施方案中，捕獲劑與微載體表面之間的連接鍵鏈可以是共價鍵。在其他實施方案中，捕獲劑與微載體表面之間的連接鍵聯可以是非共價鍵，包括但不限於鹽橋或其他離子鍵、一個或多個氫鍵、疏水相互作用、範德華力、倫敦分散力、機械鍵(mechanical bond)、一個或多個滷素鍵、親金作用(aurophilicity)、嵌入或堆積作用。

在一些方面，用於同一分析物的多於一種(如兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種或十種)捕獲劑可各自與本文所述的微載體締合。在此實施方案中，用於特定分析物的每種捕獲劑以不同親和力與分析物結合，如通過分析物/捕獲劑結合的解離常數所測量。因此，在組合物中的多個微載體內，可存在具有結合至同一分析物的捕獲劑的微載體的兩個或更多個亞群，但是其中與每個亞群締合的捕獲劑以不同的親和力結合至所述分析物。在一些實施方案中，分析物對於所述捕獲劑中的任一種的解離常數不大於10-6M，如10-7M或10-8M。在其他實施方案中，分析物對於所述捕獲劑中的任一種的解離常數是約10-10M至約10-6M，如約10-10M至約10-7M、約10-10M至約10-8M、約10-10M至約10-9M、約10-9M至約10-6M、約10-9M至約10-7M、約10-9M至約10-8M、約10-8M至約10-6M或約10-8M至約10-7M。在一些實施方案中，分析物對於任何兩種捕獲劑的解離常數相差多達約3log10，如相差多達約2.5log10、2log10、1.5log10或1log10。

在一些實施方案中，本公開的分析物被偶聯至用於捕獲一種或多種分析物的微載體。在一些實施方案中，可從樣品，如本文所述的生物樣品中捕獲一種或多種分析物。在一些實施方案中，分析物可包括但不限於DNA分子、DNA類似物分子、RNA分子、RNA類似物分子、多核苷酸、蛋白質、酶、脂質、磷脂、碳水化合物部分、多糖、抗原、病毒、細胞、抗體、小分子、細菌細胞、細胞器以及抗體片段。在其他實施方案中，分析物是能夠結合至諸如化學品庫的個別組分、小分子或環境毒素(例如殺蟲劑或重金屬)的捕獲劑的化學化合物(如小分子化學化合物)。

在一些方面，樣品(如生物樣品)中的分析物可用能夠在結合至捕獲劑時發射可檢測信號的信號發射實體標記。在一些實施方案中，信號發射實體可以是基於比色的。在其他實施方案中，信號發射實體可以是基於螢光的，包括但不限於藻紅蛋白、藍色螢光蛋白、綠色螢光蛋白、黃色螢光蛋白、青色螢光蛋白及其衍生物。在其他實施方案中，信號發射實體可以是基於放射性同位素的，包括但不限於用32P、33P、22Na、36Cl、2H、3H、35S和123I標記的分子。在其他實施方案中，信號發射實體是基於光的，包括但不限於螢光素酶(例如，基於化學發光的)、辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶及其衍生物。在一些實施方案中，可在與微載體接觸之前用信號發射實體標記樣品中存在的生物分子或化學化合物。在其他實施方案中，可在與微載體接觸之後用信號發射實體標記樣品中存在的生物分子或化學化合物。

IV.製備編碼的微載體的方法

本公開的某些方面涉及用於製備編碼的微載體(例如，本文所述的微載體)的方法。用於製備編碼的微載體的方法可包括本文例如在以上部分III和/或以下實施例中描述的微載體特徵或方面中的一個或多個。

在一些實施方案中，所述方法包括沉積基本上透明的聚合物層，其中所述基本上透明的聚合物層具有第一表面和第二表面，所述第一表面和第二表面彼此平行。在一些實施方案中，彼此平行的第一表面和第二表面可以是單個層的頂表面和底表面。可使用本領域中已知的或本文描述的任何合適的基本上透明的聚合物。在一些實施方案中，使用旋塗沉積基本上透明的聚合物層。

在一些實施方案中，基本上透明的聚合物層可被沉積在基底上。合適的基底可包括在標準半導體和/或微機電系統(MEMS)製造技術中使用的基底。在一些實施方案中，基底可包括玻璃、矽、石英、塑料、聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)、氧化銦錫(ITO)塗層等。

在一些實施方案中，犧牲層可被沉積在襯底(例如，如上所述的襯底)上。在一些實施方案中，犧牲層可由聚合物製成，所述聚合物包括但不限於聚乙烯醇(PVA)或OmniCoatTM(MicroChem；Newton，MA)。可例如根據製造商的說明書施加、使用並溶解或剝離犧牲層。

在一些實施方案中，本公開的基本上透明的聚合物層被沉積在犧牲層上。為了使用基本上透明的聚合物層產生平面微載體表面，基本上透明的聚合物層可被沉積到平面犧牲層上。為了產生具有從其突出的一個或多個柱的微載體表面，可例如通過使用標準光刻工藝來將犧牲層(例如，沉積到基底上的犧牲層)圖案化為具有一個或多個柱狀孔或空隙區域。在一些實施方案中，基本上透明的聚合物層可被沉積在犧牲層和任選的基底上，以使得所述層被沉積在一個或多個柱狀孔或空隙區域中。在一些實施方案中，另一個基本上透明的聚合物層然後可被沉積在犧牲層以及填充有第一基本上透明的聚合物層的一個或多個柱狀孔或空隙區域上。

在一些實施方案中，本公開的基本上不透明的磁性層被沉積在基本上透明的聚合物層的第一表面上。在一些實施方案中，通過濺射沉積所述基本上不透明的磁性層。所述基本上不透明的磁性層可由例如本文所述的任何磁性材料製成。例如，在一些實施方案中，所述基本上不透明的磁性層包括鎳(例如，元素鎳或其合金)。

在一些實施方案中，可蝕刻所述基本上不透明的磁性層以除去所述基本上不透明的磁性層的沉積在基本上透明的聚合物層的中心部分上的部分。所述基本上不透明的磁性層可通過本領域中已知的任何方式來蝕刻。例如，在一些實施方案中，所述基本上不透明的磁性層通過常規溼式蝕刻來蝕刻。上文提供了基本上不透明的磁性層的示例性尺寸、形狀和任選的不對稱性。

在一些實施方案中，本公開的第二基本上透明的聚合物層被沉積在基本上不透明的磁性層上。在一些實施方案中，所述第二基本上透明的聚合物層具有彼此平行的第一表面和第二表面(例如，單個層的頂表面和底表面)。在一些實施方案中，所述第二表面被固定至基本上不透明的磁性層。在一些實施方案中，所述第二基本上透明的聚合物層與第一基本上透明的聚合物層對齊，並且具有與基本上透明的聚合物層的中心部分對齊的中心部分。上文提供了基本上透明的聚合物層的中心部分的示例性尺寸。

在一些實施方案中，本公開的基本上不透明的聚合物層被沉積在第二基本上透明的聚合物層的第一表面上。在一些實施方案中，所述基本上不透明的聚合物層包圍第一基本上透明的聚合物層和第二基本上透明的聚合物層的中心部分。在一些實施方案中，所述基本上不透明的聚合物層包括表示模擬代碼的二維形狀。可使用本文描述或例示的任何二維形狀，例如本公開的齒輪形狀。在一些實施方案中，所述基本上不透明的聚合物層被沉積在第二基本上透明的聚合物層上並且被蝕刻(例如，使用標準光刻工藝)成所需的二維形狀。

在一些實施方案中，一個或多個柱可被沉積在基本上透明的聚合物上，例如沉積在第二基本上透明的聚合物層的第一表面上在未被基本上不透明的聚合物層覆蓋的部分處。所述一個或多個柱可如本文所描述來沉積，例如使用標準光刻工藝。

在採用本公開的任選犧牲層和/或基底的一些實施方案中，通過使用溶劑，可溶解或剝離犧牲層和/或可移除基底。適用於製造(例如，在標準半導體或MEMS製造工藝中，如光致抗蝕劑去除)的多種溶劑是本領域中已知的。在一些實施方案中，溶劑是光致抗蝕劑剝離劑溶劑，如基於DMSO或1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)的溶劑。在一些實施方案中，溶劑是光致抗蝕劑剝離劑，如300T(AZ Electronic Materials；Somerville，NJ)。

在一些實施方案中，所述方法包括在本公開的基底上沉積本公開的犧牲層。犧牲層、基底和合適的沉積方法是例如如上所述。

在一些實施方案中，本公開的基本上不透明的聚合物層被沉積在犧牲層上。在一些實施方案中，所述基本上不透明的聚合物層具有彼此平行的第一表面和第二表面(例如，單個層的頂表面和底表面)。在一些實施方案中，所述第二表面被固定至犧牲層。

在一些實施方案中，所述基本上不透明的聚合物層的輪廓被成形為表示模擬代碼的二維形狀，例如，如本文所述。所述基本上不透明的聚合物層可通過本領域中已知或本文所述的任何方法成形，例如使用標準光刻工藝，包括但不限於旋塗、軟烘、UV暴露、蝕刻以及硬烘。

在一些實施方案中，通過使用溶劑(例如，如上所述)，可溶解或剝離犧牲層和/或可移除基底。

在其他實施方案中，本公開的包括磁性材料的磁性層被沉積在犧牲層上。上文提供了示例性磁性材料、磁性層形狀/尺寸以及與其相關的沉積方法。例如，在一些實施方案中，所述磁性層可被成形為一個或多個柱，例如，如由柱906所示。在其他實施方案中，所述磁性層可(例如嵌入)在兩個不透明的聚合物層之間，如由磁性層704所示。磁性材料可包含例如本文所述的任何磁性材料。例如，在一些實施方案中，所述磁性材料包括鎳(例如，元素鎳或其合金)。

在一些實施方案中，本公開的基本上不透明的聚合物層被沉積在磁性層上。在一些實施方案中，所述基本上不透明的聚合物層具有彼此平行的第一表面和第二表面(例如，單個層的頂表面和底表面)。在一些實施方案中，所述基本上不透明的聚合物層的表面(例如，第二表面)被固定至所述磁性層。

在一些實施方案中，所述基本上不透明的聚合物層的輪廓被成形為表示模擬代碼的二維形狀，例如，如上所述。

在一些實施方案中，通過使用溶劑(例如，如上所述)，可溶解或剝離犧牲層和/或可移除基底。

在本公開通篇中提供了適合於以上所述的方法的示例性微載體形狀、尺寸和任選的特徵。

在一些實施方案中，捕獲劑可被偶聯至本公開的微載體，例如本文所述的微載體和/或通過本文所述的任何方法產生的微載體。本文所述的任何捕獲劑或本領域中已知適合於捕獲本文所述的分析物的任何捕獲劑可用於本公開的方法和/或微載體中。

在一些實施方案中，捕獲劑可被偶聯至本公開的聚合物層，例如本文所述的基本上透明的或基本上不透明的聚合物層。在一些實施方案中，捕獲劑可被偶聯至聚合物層的第一或第二表面中的一個或兩個。在一些實施方案中，捕獲劑可被偶聯至聚合物層的至少中心部分(例如，如本文所述的中心部分)。在一些實施方案中，聚合物包括環氧基聚合物或以其他方式含有環氧基團。

在一些實施方案中，偶聯捕獲劑涉及使聚合物與光致產酸劑和光反應以產生交聯聚合物。在一些實施方案中，所述光具有激活所述光致產酸劑的波長，例如UV或近UV光。光致產酸劑可從Sigma-Aldr ich(St.Louis)和BASF(Ludwigshafen)商購。可使用本領域中已知的任何合適的光致產酸劑，包括但不限於六氟銻酸三苯基或三芳基鋶；六氟磷酸三芳基鋶；全氟-1-丁磺酸三苯基鋶；三氟甲磺酸三苯基鋶；全氟-1-丁磺酸或三氟甲磺酸三(4-叔丁基苯基)鋶；含有雙(4-叔丁基苯基)碘鎓的光致產酸劑，如全氟-1-丁磺酸、對甲苯磺酸和三氟甲磺酸雙(4-叔丁基苯基)碘鎓；三氟甲磺酸Boc-甲氧基苯基二苯基鋶；三氟甲磺酸(叔丁氧基羰基甲氧基萘基)-二苯基鋶；三氟甲磺酸(4-叔丁基苯基)二苯基鋶；六氟磷酸、硝酸、全氟-1-丁磺酸、三氟甲磺酸或對甲苯磺酸二苯基碘鎓；三氟甲磺酸(4-氟苯基)二苯基鋶；三氟甲磺酸N-羥基萘二甲醯亞胺；全氟-1-丁磺酸N-羥基-5-降冰片烯-2，3-二甲醯亞胺；三氟甲磺酸(4-碘苯基)二苯基鋶；三氟甲磺酸(4-甲氧基苯基)二苯基鋶；2-(4-甲氧基苯乙烯基)-4，6-雙(三氯甲基)-1，3，5-三嗪；三氟甲磺酸(4-甲基苯基)二苯基鋶；三氟甲磺酸(4-甲硫基苯基)甲基苯基鋶；三氟甲磺酸(4-苯氧基苯基)二苯基鋶；三氟甲磺酸(4-苯硫基苯基)二苯基鋶；或在product-finder.basf.com/group/corporate/product-finder/de/literature-document：/Brand+Irgacure-Brochure--Photoacid+Generator+Selection+Guide-English.pdf中描述的任何光致產酸劑。在一些實施方案中，光致產酸劑是含鋶的光致產酸劑。

在一些實施方案中，偶聯捕獲劑包括使交聯聚合物的環氧化物與諸如胺、羧基、硫醇等的官能團反應。或者，表面上的環氧基可被氧化成羥基，所述羥基隨後用作水溶性聚合物如聚(丙烯酸)的接枝聚合的引發位點。聚(丙烯酸)中的羧基然後用於與捕獲劑中的氨基或羥基形成共價鍵。

在一些實施方案中，偶聯捕獲劑涉及使交聯聚合物的環氧化物與含有胺和羧基的化合物反應。在一些實施方案中，所述化合物的胺與環氧化物反應以形成化合物偶聯的交聯聚合物。不希望受理論束縛，據認為捕獲劑可在聚合物交聯之前偶聯至聚合物；然而，這可能降低所得表面的均勻性。可使用具有伯胺和羧基的任何化合物。化合物可包括但不限於甘氨酸、氨基十一烷酸、氨基己酸、丙烯酸、2-羧乙基丙烯酸、4-乙烯基苯甲酸、3-丙烯醯胺基-3-甲基-1-丁酸、甲基丙烯酸縮水甘油酯等。在一些實施方案中，所述化合物偶聯的交聯聚合物的羧基與捕獲劑的胺(例如伯胺)反應，以將捕獲劑偶聯至基本上透明的聚合物。

適合於上述方法的各種捕獲劑和分析物的描述可在本公開通篇中，例如在以上部分III和/或以下實施例中找到。

V.多重測定

本公開的某些方面涉及通過使用編碼的微載體(例如本文所述的微載體)來檢測溶液中的分析物的方法。用於分析物檢測的方法使用編碼的微載體，所述微載體包括本文例如在以上部分III和IV和/或以下實施例中描述的微載體特徵或方面中的一個或多個。有利地，與傳統的多重測定相比，這些編碼的微載體允許使用大量潛在獨特微載體的改進的多重測定中的分析物檢測和降低的識別誤差。本文使用的分析物檢測方法可在本領域中已知的任何合適的測定容器中進行，例如微板、培養皿或任何數量的其他熟知的測定容器。

在一些實施方案中，用於檢測溶液中的分析物的方法包括使包含第一分析物和第二分析物的溶液與多個微載體接觸，其中所述多個微載體至少包括本公開的第一微載體，所述第一微載體特異性地捕獲所述第一分析物並且用第一模擬代碼編碼，以及本公開的第二微載體，所述第二微載體特異性地捕獲所述第二分析物並且用第二模擬代碼編碼；使用模擬形狀識別解碼所述第一模擬代碼和所述第二模擬代碼以辨識所述第一微載體和所述第二微載體；以及檢測結合至所述第一微載體的第一分析物的量和結合至所述第二微載體的第二分析物的量。

在一些實施方案中，所述方法包括使包含第一分析物和第二分析物的溶液與多個微載體接觸。在一些實施方案中，所述多個微載體可包括本公開的第一微載體，所述第一微載體特異性地捕獲第一分析物(例如，使用偶聯至所述微載體的對第一分析物具有特異性的捕獲劑)，其中用第一模擬代碼編碼所述第一微載體；以及本公開的第二微載體，所述第二微載體特異性地捕獲第二分析物(例如，使用偶聯至所述微載體的對第二分析物具有特異性的捕獲劑)，其中用不同於所述第一模擬代碼的第二模擬代碼編碼所述第二微載體。在一些實施方案中，所述第一分析物和第二分析物可以是不同的。在其他實施方案中，所述第一分析物和第二分析物可以是相同的，例如，第一微載體和第二微載體可冗餘地識別同一分析物(這可以是有用的，例如出於質量控制目的)，或者它們可識別同一分析物的不同區域(例如，識別同一抗原的不同表位的抗體)。

本公開的方法可用於檢測任何合適溶液中的分析物。在一些實施方案中，所述溶液包含生物樣品。。生物樣品的實例包括但不限於血液、尿液、痰液、膽汁、腦脊髓液、皮膚或脂肪組織的間質液、唾液、眼淚、支氣管肺泡灌洗液、口咽分泌物、腸液、子宮頸陰道或子宮分泌物以及精液。在一些實施方案中，生物樣品可來自人。在其他實施方案中，溶液包含不為生物樣品的樣品，如環境樣品、在實驗室中製備的樣品(例如，含有一種或多種已經製備、分離、純化和/或合成的分析物的樣品)、固定的樣品(例如，福馬林固定的、石蠟包埋的或FFPE樣品)等。

在一些實施方案中，所述分析是多重的，即，對每種溶液(例如，樣品)進行分析以使得通過反應檢測系統針對至少2種目標分析物、至少3種目標分析物、至少4種目標分析物、至少5種目標分析物、至少10種目標分析物、至少15種目標分析物、至少20種目標分析物、至少25種目標分析物、至少30種目標分析物、至少35種目標分析物、至少40種目標分析物、至少45種目標分析物或至少50種目標分析物或更多種目標分析物檢測來自信號發射實體的信號。

在一些實施方案中，所述方法包括使用模擬形狀識別解碼第一模擬代碼和第二模擬代碼以辨識第一微載體和第二微載體。在概念上，解碼可涉及使(例如，溶液或樣品中的)每個微載體的模擬代碼成像，將每個圖像與模擬代碼庫進行比較，並且將每個圖像與來自所述庫的圖像進行匹配，從而明確地辨識所述代碼。任選地，如本文所述，當使用包括定向指標(例如，不對稱性)的微載體時，解碼還可包括旋轉每個圖像以與特定定向對齊(例如部分地基於定向指標)的步驟。例如，如果定向指標包括間隙，則可旋轉圖像直到間隙到達預定位置或定向(例如，圖像的0°位置)。

各種形狀識別軟體、工具和方法是本領域中已知的。此類API和工具的實例包括但不限於來自ReKognition的Research FaceSDK、OpenBR、Face和Scene Recognition、Betaface API以及各種ImageJ插件。在一些實施方案中，模擬形狀識別可包括但不限於圖像處理步驟，如前景提取、形狀檢測、閾值處理(thresholding)(例如，自動或手動圖像閾值處理)等。

本領域的技術人員應理解，本文所述的方法和微載體可適用於各種成像裝置，包括但不限於顯微鏡、酶標儀(plate reader)等。在一些實施方案中，解碼模擬代碼可包括通過使光穿過第一微載體和第二微載體的基本上透明的部分(例如，基本上透明的聚合物層)和/或周圍溶液來照射所述第一微載體和第二微載體。然後光可能未能穿過或以較低強度或其他明顯的差異穿過第一微載體和第二微載體的基本上不透明的部分(例如，基本上不透明的聚合物層)，以產生對應於第一微載體的第一模擬編碼的光圖案和對應於第二微載體的第二模擬編碼的光圖案。

如上文所述，任何類型的光學顯微術可用於本公開的方法，包括但不限於以下中的一種或多種：明視野、暗視野、相差、微分幹涉差(DIC)、諾馬爾斯基幹涉差(NIC)、諾馬爾斯基、霍夫曼調製相差(HMC)或螢光顯微術。在某些實施方案中，可使用亮視野顯微術來解碼模擬代碼，並且可使用螢光顯微術來檢測分析物。

在一些實施方案中，解碼模擬代碼還可包括使第一模擬編碼的光圖案成像以產生第一模擬編碼的圖像，並且使第二模擬編碼的光圖案成像以產生第二模擬編碼的圖像。換言之，成像的光的圖案可對應於微載體的基本上透明/基本上不透明的區域的圖案，從而產生模擬代碼的圖像。這種成像可包括多個步驟，包括但不限於捕獲圖像、對圖像進行閾值處理以及實現模擬代碼的更準確、精確或穩健成像所需的任何其他圖像處理步驟。

在一些實施方案中，解碼模擬代碼還可包括使用模擬形狀識別來使第一模擬編碼的圖像與第一模擬代碼匹配且使第二模擬編碼的圖像與第二模擬代碼匹配。在一些實施方案中，可使圖像與預定閾值內的模擬代碼(例如，來自圖像文件庫的圖像文件，其中每個圖像文件對應於唯一的二維形狀/模擬代碼)匹配，所述預定閾值例如容許圖像與示例模擬代碼圖像之間的預定量的偏差或不匹配。所述閾值可憑經驗確定並且可自然地基於用於模擬代碼的二維形狀的特定類型以及所述潛在二維形狀組之間的變化程度。

在一些實施方案中，所述方法包括檢測結合至第一微載體的第一分析物的量和結合至第二微載體的第二分析物的量。可使用本領域中已知的任何合適的分析物檢測技術。例如，在一些實施方案中，第一微載體和第二微載體可與一種或多種檢測劑一起孵育。在一些實施方案中，所述一種或多種檢測劑結合由第一微載體捕獲的第一分析物和由第二微載體捕獲的第二分析物。在一些實施方案中，所述方法還包括測量結合至第一微載體和第二微載體的檢測劑的量。

在一些實施方案中，溶液(如生物樣品)中的分析物可用能夠在結合至捕獲劑時發射可檢測信號的檢測劑(例如，信號發射實體)標記。在一些實施方案中，檢測劑可以是基於比色的。在其他實施方案中，檢測劑可以是基於螢光的，包括但不限於藻紅蛋白、藍色螢光蛋白、綠色螢光蛋白、黃色螢光蛋白、青色螢光蛋白及其衍生物。在其他實施方案中，檢測劑可以是基於放射性同位素的，包括但不限於用32P、33P、22Na、36Cl、2H、3H、35S和123I標記的分子。在其他實施方案中，檢測劑是基於光的，包括但不限於螢光素酶(例如，基於化學發光的)、辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶及其衍生物。在一些實施方案中，可在與微載體組合物接觸之前用檢測劑標記溶液中存在的生物分子或化學化合物。在其他實施方案中，可在與微載體組合物接觸之後用檢測劑標記溶液中存在的生物分子或化學化合物。在其他實施方案中，檢測劑可偶聯至特異性地結合目標分析物的分子或大分子結構，例如DNA分子、DNA類似物分子、RNA分子、RNA類似物分子、多核苷酸、蛋白質、酶、脂質、磷脂、碳水化合物部分、多糖、抗原、病毒、細胞、抗體、小分子、細菌細胞、細胞器和/或抗體片段。

在一些實施方案中，檢測劑是螢光檢測劑，並且結合至第一微載體和第二微載體的檢測劑的量通過螢光顯微術(例如，螢光顯微鏡或酶標儀)來測量。在其他實施方案中，檢測劑是發光檢測劑，並且結合至第一微載體和第二微載體的檢測劑的量通過發光顯微術(例如，發光顯微鏡或酶標儀)來測量。

在一些實施方案中，每種分析物/捕獲劑可與特異性檢測劑一起使用。作為非限制性實例，檢測劑可以是與特異性地結合分析物的抗體偶聯的檢測劑(例如，螢光、發光、酶或其他檢測劑；或如果分析物是配體-受體對的同源配體/受體，則檢測劑可以是所述配體-受體對的配體或受體。所述技術在概念上類似於包括捕獲和檢測抗體的夾心ELISA或蛋白質微陣列(但是在本發明的情況中應注意，此實例中的試劑不嚴格限於抗體)。作為另一個非限制性實例，檢測劑可以是偶聯至目標蛋白質(如標記的目標分析物)的螢光或其他可檢測的探針。例如，可使用反應來使檢測劑偶聯至目標溶液(例如樣品)中的一種或多種蛋白質，然後將通過捕獲劑捕獲所述一種或多種蛋白質(在概念上類似於蛋白質微陣列的抗原捕獲類型)。

在其他實施方案中，多種獨特的分析物/捕獲劑可與通用檢測劑一起使用。作為非限制性實例，如果分析物是抗體，則檢測劑可以是結合至抗體的Fc區的試劑；如果分析物是多核苷酸如DNA或RNA，則檢測劑可以是偶聯至寡核苷酸(例如，與分析物雜交的單鏈寡核苷酸)的螢光或其他可檢測的探針。後一種情況在概念上類似於微陣列技術。

在一些實施方案中，檢測步驟可包括一個或多個洗滌步驟，例如以減少汙染物、除去非特異性地結合至捕獲劑和/或微載體表面的任何物質等。在一些實施方案中，磁性分離步驟可用於洗滌含有本公開的磁性層或材料的微載體。在其他實施方案中，可使用本領域中已知的其他分離步驟。

在一些實施方案中，解碼步驟可在檢測步驟之後發生。在其他實施方案中，解碼步驟可在檢測步驟之前發生。在其他實施方案中，解碼步驟可與檢測步驟同時發生。

VI.試劑盒或製品

本文還提供含有本公開的多個微載體的試劑盒或製品。這些試劑盒或製品可尤其適用於進行多重測定，如本文描述的示例性多重測定(參見例如，上文部分V)。

在一些實施方案中，所述試劑盒或製品可包括本公開的第一微載體，所述第一微載體特異性地捕獲第一分析物(例如，使用偶聯至所述微載體的對第一分析物具有特異性的捕獲劑)，其中用第一模擬代碼編碼所述第一微載體；以及本公開的第二微載體，所述第二微載體特異性地捕獲第二分析物(例如，使用偶聯至所述微載體的對第二分析物具有特異性的捕獲劑)，其中用不同於所述第一模擬代碼的第二模擬代碼編碼所述第二微載體。在一些實施方案中，所述第一分析物和第二分析物可以是不同的。在其他實施方案中，所述第一分析物和第二分析物可以是相同的，例如，第一微載體和第二微載體可冗餘地識別同一分析物(這可以是有用的，例如出於質量控制目的)，或者它們可識別同一分析物的不同區域(例如，識別同一抗原的不同表位的抗體)。所述試劑盒或製品可包括本文所述的任何微載體(參見例如，上文的部分III和下文的實施例)或使用本文所述的方法(參見例如，上文的部分IV和下文的實施例)產生的任何微載體。

在一些實施方案中，所述試劑盒或製品還可包括本公開的一種或多種檢測劑，所述檢測劑用於檢測結合至第一微載體的第一分析物的量和結合至第二微載體的第二分析物的量。在一些實施方案中，用於第一分析物的檢測劑可與用於第二分析物的檢測劑相同。在其他實施方案中，用於第一分析物的檢測劑可與用於第二分析物的檢測劑不同。

在一些實施方案中，所述試劑盒或製品還可包括有關使用所述試劑盒或製品來檢測一種或多種分析物(例如第一和第二分析物)的說明書。這些說明書可以是針對例如在本文所述的任何方法中使用所述試劑盒或製品。

在一些實施方案中，所述試劑盒或製品還可包括一種或多種檢測劑(例如，如上文所述)，連同適合用於將檢測劑偶聯至一種或多種分析物或用於將檢測劑偶聯至識別分析物的一種或多種大分子的任何說明書或試劑。所述試劑盒或製品還可包括用於在測定(例如，多重測定)中使用微載體的任何另外部件，包括但不限於板(例如，96孔或其他類似的微板)、培養皿、顯微鏡載玻片或其他合適的測定容器；非暫態計算機可讀存儲介質(例如，包括用於模擬形狀或代碼識別的軟體和/或其他指令)；洗滌劑；緩衝劑；板密封劑；混合容器；稀釋劑或儲存溶液等。

實施例

通過參照以下實施例，將更全面地理解本發明。然而，其不應解釋為限制本發明的範圍。應該理解本文所描述的實施例和實施方案僅出於說明目的，並且將建議本領域技術人員根據它們進行各種修改或變化，並且它們被包括在本申請的精神和權限以及隨附權利要求書的範圍之內。

現在將注意力轉向用於多重測定(例如，分析物檢測)的微載體及其產生方法。以下實施例說明用於分析物檢測的模擬編碼的微載體的示例性實施方案，所述微載體可尤其用於本文所述的方法、測定和試劑盒或製品。應當注意，這些示例性實施方案決不意圖是限制性的，而是被提供來說明本文所闡述的一些方面和特徵。

實施例1：具有二維模擬代碼和均勻形狀的編碼的微載體

如上所述，由於大量潛在唯一標識符和減少的識別誤差，所以模擬編碼的微載體對於多重測定是非常有利的。此實施例描述用二維形狀編碼的各種類型的微載體，所述二維形狀可用作用於辨識的模擬代碼。應理解，本公開的編碼的微載體可包括呈任何組合的以下闡述的一些或所有任選特徵。

圖1A和1B示出示例性微載體100的兩個視圖。微載體100是直徑大約50μm和厚度10μm的圓形盤。圖1A提供在所述盤的圓形面處觀察的微載體100的視圖，而圖1B示出微載體100的與圖1A中所示的表面正交的側視圖。示出微載體100的兩個部件。第一，基本上透明的聚合物層102提供微載體的本體。層102可例如使用諸如SU-8的聚合物來產生，如上所述。

基本上不透明的聚合物層104被固定至層102的表面。儘管圖1B中所示的微載體100的截面示出層104的不連續視圖，但圖1A中所示的視圖示出層104的形狀像具有多個齒的圓形齒輪。這些齒輪齒的形狀、數量、大小和間距構成二維形狀，並且齒輪齒的這些方面中的一個或多個可進行修改以便產生用於模擬編碼的多個二維形狀。有利地，層104的齒輪齒的外側邊緣配合在層102的周邊內。這允許多種模擬代碼，每種模擬代碼表示用於一種微載體種類的唯一標識符，同時跨多種微載體種類維持均勻的總體形狀。換言之，多種種類的群體內的每種微載體種類可具有不同的二維齒輪形狀(即，模擬代碼)，但每個微載體將具有相同的周邊，從而產生物理性質(例如，大小、形狀、在溶液中的行為等)的更大均勻性。層104可例如使用與染料混合的諸如SU-8的聚合物或使用黑色基質抗蝕劑來產生，如上所述。

層104圍繞層102的中心部分106。用於捕獲分析物的捕獲劑偶聯至層102的一個或兩個表面(即，上/下表面)上的至少中心部分106。有利地，這允許中心部分106在沒有由層104產生的任何幹擾可能性的情況下成像。

圖1C和1D示出用於分析物檢測的使用微載體100的示例性測定。圖1C示出微載體100可包括在至少中心部分106中偶聯至一個或多個表面的捕獲劑108。使微載體100與含有分析物110的溶液接觸，所述分析物被捕獲劑108捕獲。如上所述，各種捕獲劑可用於捕獲從小分子、核酸和蛋白質(例如抗體)到細胞器、病毒和細胞的不同類型的分析物。圖1C示出捕獲分析物110的單一微載體種類(即，微載體100)，但在多重測定中使用多種微載體種類，每種種類具有識別特定分析物的特定捕獲劑。

圖1D示出用於「讀取」微載體100的示例性方法。所述方法包括可同時或分別完成的兩個步驟。首先，檢測捕獲劑108對分析物110的捕獲。在圖1D中所示的實施例中，檢測劑114結合至分析物110。未被偶聯至微載體100的捕獲劑捕獲的分析物可在檢測之前被洗掉，以使得僅檢測結合至微載體100的分析物。檢測劑114還包括用於檢測的試劑。作為一個實施例，檢測劑114可包括螢光團，當由所述螢光團的激發光譜內的波長下的光116激發時，所述螢光團發射光118(例如，光子)。光118可通過任何合適的檢測方式檢測，如螢光顯微鏡、酶標儀等。

此外，讀取微載體100的唯一標識符。在圖1D中所示的實施例中，光112用於照射含有微載體100的場(在一些實施方案中，光112可具有與光116和118不同的波長)。當光112照射含有微載體100的場時，所述光穿過基本上透明的聚合物層102，但是被基本上不透明的聚合物層104阻擋，如圖1D中所示。這產生可例如通過光學顯微術(例如，使用微分幹涉差或DIC顯微術)成像的光圖案。所述光圖案基於微載體100的二維形狀(即，模擬代碼)。標準圖像識別技術可用於解碼由微載體100的圖像表示的模擬代碼。

分析物檢測步驟和標識符成像步驟可以任何順序發生或同時發生。有利地，圖1D中所示的兩個檢測步驟可在一個成像裝置上完成。作為一個實施例，能夠進行螢光和光學(例如，明視野)顯微術的顯微鏡可用於定量結合至微載體100的分析物110的量(例如，如通過檢測劑114所檢測)並且使由層102和104產生的模擬代碼成像。這允許具有更少設備要求的更有效的測定方法。

現在轉到圖2A和2B，示出另一種示例性微載體200。與微載體100類似，微載體200包括基本上透明的聚合物層202和基本上不透明的聚合物層204。此外，微載體200包括磁性層206。如圖2A中所示，磁性層206可被成形為在中心部分208與基本上不透明的層204之間的環。

圖2B示出磁性層206可被嵌入在層202內。層202還可包括多於一個層，以使得磁性層206被夾在兩個基本上透明的聚合物層之間(例如，如圖2B中)。或者，磁性層206可被固定至層202的與層204相同的表面，或者磁性層206可被固定至層202的與層204相對的表面。在一些實施方案中，磁性層206可包括鎳。

磁性層206將磁性性質賦予到微載體200上，其有利地可用於許多應用。例如，微載體200可在洗滌步驟期間通過磁吸引固定至表面，從而允許有效洗滌而不損失或以其他方式破壞所述微載體。

除了其磁性性質外，層206也是基本上不透明的。當如圖1D中所示(例如，使用光112)成像時，層206將部分地或完全地阻擋透射光，從而產生用於成像的圖案。如圖2A中所示，層206也是不對稱的-在此實施例中，其包括間隙210。這種不對稱性產生可(例如)如圖1D中所示使用光112成像的定向指標。有利地，可在圖像識別期間利用定向指標來使由成像層204產生的二維形狀在統一定向上取向，以實現更容易的模擬代碼識別。這允許解碼以任何定向成像的微載體。

圖3示出使用圖1A-2B中所示的齒輪形狀可能的大量潛在模擬代碼。圖3示出示例性編碼方案，其中標記多個形狀變化點，例如，在示例性微載體300上的位置302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326和328處。即使使用簡單的「填充或未填充」方案，基於使用14個形狀變化點，多達214個唯一代碼也是可能的。這種方案對於製造和用於產生對於圖像識別分析來說容易區分的二維形狀兩者均是方便的。然而，由於使用模擬編碼，所以使用多於2種可能性(例如，在如圖3中標記的每個形狀變化點處)的更複雜方案是可能的，從而成指數地擴展唯一標識符的數量。例如，多個齒輪齒形狀和/或齒輪齒的多個大小是可能的。如圖1A-3中所示的二維齒輪形狀有助於廣泛範圍的唯一模擬代碼，同時為分析物檢測提供較大中心部分(例如，中心部分106和208)。

圖4A示出圖3中所示的編碼方案的三個示例性實施方案：微載體400、402和404。微載體400、402和404的唯一代碼是使用圖3的簡單「填充或未填充」方案產生的。圖4B示出代碼(cod)的10個示例性實施方案，尤其是就形狀的數量(例如，與代碼ZN_10中的七個不同形狀相比，代碼ZN_3中的兩個不同形狀)和/或形狀的大小(例如，代碼ZN_2中的大、小和中等大小的形狀)而言。重要的是，如上所述，使用模擬圖像識別可獲得更複雜的編碼方案，從而極大地擴展潛在唯一代碼的數量。

現在轉到圖5A和5B，示出另一種示例性微載體500。與微載體200類似，微載體500包括基本上透明的聚合物層502、基本上不透明的聚合物層504、磁性層506和中心部分508。此外，微載體500具有包括柱510的四個柱，所述柱可具有從層502的表面延伸的任何形狀。如圖5A中所示，這些柱可與磁性層506對齊排列，從而防止幹擾中心部分508中的分析物檢測或者讀取層504的二維形狀(即，模擬代碼)的任何可能性。圖5B示出這些柱可從微載體500的上表面和下表面延伸。柱510可例如使用與層502相同的基本上透明的聚合物製成(示例性生產方法在下文中描述)。有利地，諸如柱510的一個或多個柱可用於例如通過光學接觸粘合來防止微載體與彼此和/或容器(例如，多孔板中的孔的側面)粘附。

實施例2：具有在微載體形狀中編碼的二維模擬代碼的微載體

前面的實施例示出微載體的多個示例性實施方案，其中通過固定至透明聚合物層的不透明層提供模擬代碼。這例如在允許不同種類的微載體之間的更大均勻性(即，各自具有由透明聚合物層提供的相同周邊形狀)方面是有利的。

然而，出於其他原因，可能有利的是使用微載體本身的周邊作為用於模擬編碼的二維形狀。例如，如果模擬代碼由微載體本身的形狀提供，則僅需要一個層，從而簡化製造過程。此外，使微載體的周邊成形可通過高度精確的製造技術來實現，從而允許高度可再現的形狀以用於更精確的圖像識別。

圖6A和6B示出這種類型的示例性微載體600。微載體600是直徑大約80μm和高度15μm的齒輪狀盤，包括任選的柱元件(類似於如上所述的柱510)。微載體600由單個不透明的聚合物層602製成，而不是分開的透明聚合物層和不透明聚合物層。微載體600可如圖1D中所示成像，但是其模擬代碼基於整個微載體形狀(例如，不透明聚合物層的周邊)成像。微載體600的一個或兩個表面可用於偶聯如上所述的捕獲劑，並且可使用中心部分或整個表面。

圖6C示出微載體600的齒輪齒604的尺寸。如所示，在此實施方案中，齒輪齒604是4μm寬並且與相鄰齒輪齒606間隔4μm。由於微載體600的二維形狀是模擬編碼的，所以相鄰齒輪齒之間的周邊可以是可變的，從而允許多種齒輪齒形狀。例如，齒輪齒604分別相對於緊鄰左邊或右邊的相鄰周邊區段在高度上延伸4或6.5μm。

圖7示出這種類型的微載體的另一個實施方案，微載體700。類似於微載體600，微載體700由不透明的聚合物層702製成。此外，微載體包括磁性層704。磁性層704可被固定至微載體700的表面中的一個，或它可嵌入在微載體700內(例如，在兩個不透明的聚合物層之間)。磁性層704可例如通過沉積鎳而產生。如上所述，磁性層允許另外的功能，如用於在磁性附接至另一表面同時洗滌微載體700的選擇。

現在轉到圖8A，示出另一種示例性微載體800。與微載體700類似，微載體800包括不透明的聚合物層802(以及任選地，諸如層704的磁性層)。此外，微載體800包括起始位置804，其具有與微載體800的周邊的其餘部分不同的形狀。起始位置804可用作用於圖像識別的定向指標，如上文關於圖2A中所示的間隙210所描述。

圖8B示出可使用的編碼方案。圖8B示出微載體810，與微載體800類似，其包括不透明的聚合物層812和起始位置814(以及任選地，諸如層704的磁性層)。在所述方案中，標記圍繞齒輪的潛在形狀變化點，例如，在位置820、822、824、826、828、830、832、834、836、838、840、842和844處。如圖8B中所示，雖然僅兩種潛在形狀可用於位置820、822、824、826、828、830、832、834、836、838、840、842和844，但此實施方案允許多達213個唯一代碼。此外，如上所述，使用模擬編碼通過允許在圍繞周邊的任何或所有所指示位置處(例如，在如圖8B中標記的每個形狀變化點處)使用多於兩種潛在形狀而極大地擴展了此數量。

圖9A-9C示出微載體900中的另一潛在實施方案。與微載體800類似，微載體900是包括不透明的聚合物層902和起始位置904(以及任選地，諸如層704的磁性層)的齒輪形狀的微載體。此外，微載體900可具有固定至微載體900的一個或兩個表面的一個或多個柱(例如，柱906)。如圖9B中的截面所示，柱906從層902的表面延伸。有利地，柱906有助於降低光學接觸粘合的可能性(如上文參考柱510所描述)。

圖9C示出柱906的尺寸。在此實施例中，柱906是高度3μm和直徑3μm的圓柱體，但是如上所述，此類柱決不限於圓柱體形狀。在一些實施方案中，柱906由磁性材料(如鎳)製成。這允許柱906另外用作用於微載體900的磁性操縱的磁性元件，如上所述。

實施例3：產生具有在微載體形狀中編碼的二維模擬代碼的微載體的方法

已經在前述實施例中描述了多種類型的微載體的示例性實施方案，現在關注產生微載體的方法。如上所述，取決於所需的構造和/或任選的特徵，本公開的微載體可由一個、兩個或更多個組成層製成。

圖10中所示的過程1000示出用於製造單層微載體的示例性工作流程，所述微載體如以上實施例2中所描述的那些。在框1002處，在基底1004上構造犧牲層1006。在一些實施方案中，基底1004可以是玻璃基底。在框1010處，在犧牲層1006上沉積層1012。在一些實施方案中，層1012是不透明的聚合物層。在框1020處，使用光刻來將層1012的周邊成形為齒輪形狀(如上所述)以產生齒輪狀層1022。在框1030處，將整個結構(即，層1022、犧牲層1006和基底1004)浸入溶劑中。這種溶劑處理使犧牲層1006溶解並且從基底1004釋放齒輪狀層1022，從而產生微載體1032。在一些實施方案中，可例如通過將捕獲劑偶聯至一個或兩個表面來進一步修改微載體1032。

如以上實施例2中所描述，齒輪狀微載體可包括任選的元件，如磁性部件(例如，柱和/或磁性層)。圖11A和11B中所示的過程1100示出用於製造具有一個或多個磁性部件的齒輪形狀的微載體的示例性工作流程。

如圖11A中所示，在框1102處，在基底1104上構造犧牲層1106。在一些實施方案中，基底1104可以是玻璃基底。在框1110處，在犧牲層1106上沉積磁性層1112。在一些實施方案中，磁性層1112包括鎳。在框1120處，通過光刻將磁性層1112成形為成形的磁性層1122。成形的磁性層1122可採取任何所需的形狀，例如，它可被成形為一個或多個柱，如圖9A中用柱906所示。

如圖11B中所示，在框1130處，在成形的磁性層1122和犧牲層1106上沉積基本上不透明的聚合物層1132。在框1140處，通過光刻將層1132的周邊成形為基本上不透明的齒輪狀層1142(如圖6A-9A中所示的齒輪形狀之一)。在框1150處，將整個結構(即，層1142、成形的磁性層1122、犧牲層1106和基底1104)浸入溶劑中。這種溶劑處理使犧牲層1106溶解並且從基底1104釋放齒輪狀層1142和成形的磁性層1122，從而產生微載體1152。在一些實施方案中，可例如通過將捕獲劑偶聯至一個或兩個表面來進一步修改微載體1152。

實施例4：產生具有二維模擬代碼和均勻形狀的編碼的微載體的方法

現在關注產生具有一個或多個基本上透明的聚合物層和一個或多個基本上不透明的聚合物層的編碼的微載體的方法，所述微載體如實施例1中描述的那些。圖12A-12E示出過程1200，其是用於製造具有基本上透明的聚合物層、基本上不透明的聚合物層(其二維形狀構成模擬代碼)和一個或多個柱的微載體的示例性工作流程。

以圖12A開始，在框1202處，將犧牲層1206沉積(例如，通過旋塗)到基底1204上。在一些實施方案中，基底1204可以是玻璃基底。在框1208處，施加掩模1210，並且用UV光暴露犧牲層1206。通過掩模1210施加UV光，從而允許UV光區段1212和1214穿過並處理犧牲層1206。在框1216處，在通過標準光刻顯影使結構顯影之後，由於UV處理的掩蔽，犧牲層1206被成形為成形的犧牲層1218。

過程1200在框1220(圖12B)處繼續，其中用基本上透明的聚合物填充成形的犧牲層1218中的掩蔽的孔，從而產生柱1222和1224。在框1226處，在柱1222和1224以及成形的犧牲層1218上沉積基本上透明的聚合物層1228。

過程1200在框1230(圖12C)處繼續，其中在層1228上沉積磁性層1232。在一些實施方案中，磁性層1232包括鎳。在一些實施方案中，磁性層1232通過濺射沉積。在框1234處，在磁性層1232上沉積蝕刻阻擋層，如由蝕刻塊1236和1238表示。在框1240處，磁性層1232的未阻擋區段被蝕刻掉，從而產生成形的磁性層1242。在一些實施方案中，成形的磁性層1242可被成形為圍繞層1228(參見例如，圖2A中的層206)的中心部分的環形狀(具有用於指示定向的任選不對稱性)。在框1244處，移除蝕刻阻擋層(如由蝕刻塊1236和1238表示)。

過程1200在框1246(圖12D)處繼續，其中在層1228和1242上沉積基本上透明的聚合物層1248(從而填充通過蝕刻阻擋產生的層1242中的任何孔)。在框1250，通過光刻在層1248的頂部上沉積且成形基本上不透明的層1252。在一些實施方案中，層1252被成形為在圍繞磁性層1242的環中具有一個或多個齒輪齒(參見例如，關於圖2A的層202和206以及中心部分208的層204)。

過程1200在框1254(圖12E)處繼續，其中通過光刻在層1248的頂部上成形柱1256和1258。在一些實施方案中，柱1256和1258由基本上透明的聚合物製成。在一些實施方案中，如圖5A和5B中所示來定位所述柱。在框1260處，將基底1204切割成具有相同形狀的一個或多個微載體(即，儘管為了解釋的簡潔性，在圖12A-12E中僅描繪了一個微載體，但是在過程1200中可在基底1204上構造多於1個微載體)。也在框1260處，將整個結構(即，包括1204、1218、1222、1224、1228、1242、1248、1252、1256和1258)浸入溶劑中。這種溶劑處理使犧牲層1218溶解並且從基底1204釋放微載體1262。在一些實施方案中，可例如通過將捕獲劑偶聯至一個或兩個表面來進一步修改微載體1262。

圖13A-13C示出過程1300，其是用於產生不同類型的多層微載體的示例性工作流程。以圖13A開始，在框1302處，在基底層1304上沉積犧牲層1306。在一些實施方案中，基底1304是玻璃基底。在框1308處，在犧牲層1306上沉積基本上透明的層1310。在框1312處，在層1310上沉積磁性層1314。在一些實施方案中，磁性層1314包括鎳。

過程1300在框1316(圖13B)處繼續，其中將磁性層1314限定為成形的磁性層1318。在一些實施方案中，成形的磁性層1318被限定為圍繞層1310(參見例如，圖2A中的層206)的中心部分的環形狀(具有用於指示定向的任選不對稱性)。在框1320處，在層1318和1310上沉積基本上透明的層1322，從而填充通過限定成形的層1318產生的任何孔中。在框1324處，在層1322上沉積基本上不透明的聚合物層1326。

過程1300在框1328(圖13C)處繼續，其中基本上不透明的聚合物層1326通過光刻成形為齒輪形狀的基本上不透明的聚合物層1330。在一些實施方案中，層1330被成形為在圍繞成形的磁性層1318(參見例如，關於圖2A的層202和206以及中心部分208的層204)的環中具有一個或多個齒輪齒。在框1332處，將整個結構(即，包括1304、1306、1310、1318、1322和1330)浸入溶劑中。這種溶劑處理使犧牲層1306溶解並且從基底1304釋放微載體1334。在一些實施方案中，可例如通過將捕獲劑偶聯至一個或兩個表面來進一步修改微載體1334。

儘管為了理解清楚的目的已經通過說明和實施例詳細地描述了前述發明，但是所述描述和實施例不應被解釋為限制本發明的範圍。本文所引用的所有專利和科學文獻的公開內容均明確地以引用的方式整體併入。