利用危害海洋養殖業生物生產抗蟲抑菌胺基酸肥料的方法與流程
2023-04-24 19:24:01
本發明屬於肥料領域，尤其涉及利用危害海洋養殖業生物生產抗蟲抑菌胺基酸肥料的方法。
背景技術：
：海星(AsteriasamurensisLutken)屬棘皮動物門(Echinodermata)海星綱(Asteroidea)有棘目(Spinulosa)，別名海盤車，已知我國沿海有100多個種類。海星以多種無脊椎動物或動物屍體為食,特別喜食牡礪、貽貝和蛤蜊等軟體動物，是貝類和沿海養殖業的大敵。海星體內含有豐富的營養成分，近30多年來，世界各國科研人員已相繼從海星體內獲得了十幾類化學物質,如皂苷、甾醇、多糖、維生素、蛋白質、胺基酸等，它們具有抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎、抗潰瘍、降血壓、降血脂等作用。同時，海星體內還含有多種礦物質元素，如Ca、Mg、Zn、Fe、Cu、Ni、Mn等。我國海域分布著大量的海星，如何將海星變廢為寶是我們深入研究的一個重要問題。海星成分之一的海星皂苷具有毒性，對環節動物、軟體動物、節肢動物以及脊椎動物均有毒性，其毒性效應可能大部分是由於其使細胞表面發生改變而破壞了細胞膜和組織膜的完整性所致。海星皂苷對革蘭氏陽性菌抗菌效果較好，韓國學者還報導海星的水提物和醇提物具有抑制真菌生長和孢子發育的作用，並發現其具有明顯與甾體寡糖苷相同的化學性質。上世紀七十年代，人們已經發現海星提取物具有抗病毒活性，到了九十年代發現從海星分離到的硫酸甾醇還具有抗HIV病毒的作用。如若能將海星皂苷等活性成分在肥料生產中得以應用，不僅能提高這種危害養殖業生物的利用率，增加漁民收入，還可以有效殺滅作物病蟲害，提高產量，增加農民收入，可謂是一箭雙鵰。公開號CN105016930A的中國發明專利公開了《一種促進土壤中有益菌群生長的有機肥》，其特徵包括40～50份海星粉、10～20份胺基酸粉、15～25份生化黃腐酸鉀、5～10份海藻酸鹽、5～10份植物多糖、1～2份微量元素、1～2份維生素、200～350份水，攪拌均勻即得能夠促進土壤中有益菌群生長的有機肥。其添加的海星未經處理加工，僅僅是簡單的烘乾、粉碎，抑制病蟲害的作用不強，不能達到有效殺滅的程度。山東半島海區海星分布數量很多，漁民常把海星直接作為肥料進行溝施和穴施，未經處理的海星雖具有一定肥效，但由於未經抗蟲抑菌成分的濃縮提取步驟，因此只具有增加肥效的作用，不具有抗蟲抑菌的作用，功能單一，不能全面地滿足農業生產的需求。為了解決上述問題，本發明由此而產生。技術實現要素：本發明提供一種利用危害海洋養殖業生物生產抗蟲抑菌胺基酸肥料的方法。為實現上述發明目的，本發明公開的技術方案特徵包含如下步驟：a)原料預處理：新鮮海星冰凍處死，化凍後對外表進行清洗，加入攪拌機絞碎；b)醇提：加入絞碎後海星重量0.2～1倍體積的乙醇溶液，攪拌提取2～10小時;c)離心：使用離心機將海星組織與乙醇進行分離，將離心沉澱進行回收，沉澱為海星組織，上清液為海星皂苷溶液;e)發酵脫腥：添加海星組織重量3～5倍的自來水，經攪拌後製備成為海星組織液，接種總質量1～5%的酵母乾粉，設置發酵罐溫度為30℃，轉速5～8r/min，發酵5～12h，獲得海星脫腥液;f)高溫滅菌：對海星脫腥液進行煮沸滅菌10min;g)酶解：將步驟f)獲得的冷卻滅菌海星脫腥液進行酶解，稱量脫腥液重量，添加其重量0.3～1%的蛋白酶粉一，保溫4～12h;h)第二次酶解：將步驟g)中獲得的酶解液，稱重後添加其重量0.1～0.8%的蛋白酶粉二，保溫4～12h;i)高溫滅酶：對海星酶解液進行煮沸滅酶10min;j)第二次離心：將冷卻的滅酶酶解液中的胺基酸溶液與海星殘渣進行分離，保留離心上清液，此為海星胺基酸液，海星殘渣棄用;k)脫色：將步驟c)中的上清液與步驟j)中的上清液進行合併，合併後加入其總質量2～10%的顆粒活性炭脫色0.5～2h，獲得脫色海星皂苷胺基酸液;l)噴霧乾燥：將步驟k)中獲得的脫色海星皂苷胺基酸液進行噴霧乾燥，設置進口溫度為160℃，出口溫度為60℃，噴霧乾粉為海星皂苷胺基酸粉。進一步地，步驟e)所述的酵母乾粉包括但不限於釀酒酵母、麵包酵母、假絲酵母等。進一步地，步驟g)、h)所述的蛋白酶粉一和蛋白酶粉二包括但不限於風味蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶等的一種或多種。與現有技術相比本發明的優點在於，整個製備過程反應條件溫和，工藝流程簡單，將殺蟲抑菌功效的海星皂苷與海星蛋白通過醇提的方式優先進行分離，以減少海星皂苷對發酵脫腥菌種的抑制作用。採用酵母菌進行脫腥處理後，又先後進行兩次不同蛋白酶的酶解，將蛋白質充分解離為胺基酸，同時，胺基酸種類更加多樣化。經檢測，各營養物及有效成分含量為：天冬氨酸3.8～4.15%，異亮氨酸1.35～1.60%，蘇氨酸0.12～0.19%，亮氨酸2.77～2.96%，絲氨酸0.25～0.31%，酪氨酸0.41～0.48%，穀氨酸8.97～9.47%，苯丙氨酸1.63～1.98%，甘氨酸22.97～23.66%，賴氨酸2.41～2.69%，丙氨酸7.99～8.96%，組氨酸0.48～0.61%，胱氨酸1.55～1.80%，精氨酸2.79～3.96%，纈氨酸2.23～2.49%，脯氨酸7.71～8.50%，蛋氨酸0.79～1.06%，胺基酸總和71.6～75.5%，海星皂苷0.051～2.527%，能為植物提供更全面的營養還可殺滅病蟲害，可做為葉面肥、濃縮肥原料使用。具體實施方式本發明實質性特點可從下述實施例中得以體現，但這些實施例僅作為說明，而不能對本發明進行限制。實施方式1稱量100kg新鮮羅氏海盤車，冰凍5h處死，化凍後挑揀雜物並使用自來水清洗泥沙，瀝乾並放入攪拌機中攪碎。將攪碎的海星組織加入到反應釜中，添加50L乙醇，攪拌提取4h。將料液轉移至工業離心機中進行第一次離心，4000r/min離心30min，保留第一次離心上清液以備後續操作，離心沉澱收集後稱量為96.4kg，將離心沉澱加入發酵罐中添加純化水300kg並攪拌均勻，再加入釀酒酵母乾粉8kg，設置發酵罐溫度為30℃，轉速8r/min，發酵5～12h，獲得海星脫腥液，將發酵罐升溫至100℃持續10min進行滅菌。滅菌結束後，降溫至50℃，添加中性蛋白酶粉2kg，轉速5r/min攪拌10min停止，保溫10h。再添加木瓜蛋白酶粉1.6kg，轉速5r/min攪拌10min停止，保溫6h。將發酵罐升溫至100℃持續10min進行滅酶。降至常溫後將酶解液放料至工業離心機進行第二次離心，4000r/min離心30min，保留上清液即為海星胺基酸液。將第一次離心保留的上清液與第二次離心的上清液進行合併，總重為389.2kg，轉入脫色池中加入30kg顆粒活性炭脫色1.5h，期間進行人工攪拌，靜置5h後過濾得脫色海星皂苷胺基酸液389kg。設置進口溫度為160℃，出口溫度為60℃，將海星皂苷胺基酸液進行噴霧乾燥，得海星皂苷胺基酸粉42.7kg。經檢測其含天冬氨酸4.12%，異亮氨酸1.58%，蘇氨酸0.17%，亮氨酸2.90%，絲氨酸0.28%，酪氨酸0.47%，穀氨酸9.33%，苯丙氨酸1.93%，甘氨酸23.47%，賴氨酸2.50%，丙氨酸8.90%，組氨酸0.53%，胱氨酸1.64%，精氨酸3.80%，纈氨酸2.34%，脯氨酸8.26%，蛋氨酸0.98%，胺基酸總和73.2%，海星皂苷0.674%。試驗一：進行番茄品質和產量試驗，試驗番茄品種為煙粉201，購買於煙臺市農業科學研究院。試驗於2015年4月4日進行播種，試驗地點為山東省煙臺市芝罘區南裡村自留地，土壤養分中等。每小區10m2，隨機排列，重複3次。按以下方法進行施肥，處理1：不施用任何肥料；處理2：施用本發明肥料，用量中期為0.05kg/m2，中後期為0.075kg/m2，1：300比例稀釋後進行葉面噴施；處理3：施用某品牌蔬果專用葉面肥，用法用量同處理2。試驗結果主要測定試驗品種的總產量及果實品質，果實品質包括VC含量、蛋白質含量、可溶性總糖含量、可溶性固形物含量。其中，VC含量採用2，6-二氯酚靛酚法測定，蛋白質採用凱氏定氮法測定，可溶性總糖採用蒽酮比色法測定，可溶性固形物含量採用阿貝折射儀測定。試驗結果如表1所示：表1處理總產量kg/m2VC含量mg/100mg蛋白質%可溶性總糖%可溶性固形物%111.1354.30.772.373.21212.5865.11.023.816.02311.9759.30.893.145.87由上述數據不難看出，施用本發明的處理2與施用某品牌葉面肥的處理3在產量及品質上都明顯優於未施肥的一組。施用本發明的番茄，在產量及品質上都優於施用某品牌蔬果專用葉面肥。可見，本發明在提高果蔬品質上具有明顯優勢。試驗二：進行韭蛆殺滅試驗，在韭菜收割後，對其根部進行澆注，使肥料或殺蟲劑滲達韭菜根部。實驗共設計4個處理。處理1：清水對照；處理2：1.5%天然除蟲菊素EW1200倍稀釋；處理3：本發明肥料300倍稀釋；處理4：含腐植酸水溶肥300倍稀釋，其有效成分為腐植酸≥3.0%，N+P2O5+K2O≥35.0%（N：P：K=15：5：15）。試驗地點為煙臺市福山區門樓鎮韭菜大棚內，種植的韭菜品種為平韭二號，土壤養分中等。每個處理小區面積3m2，設3次重複，共12個小區，隨機區組排列。於2015年4月22日上午施肥。施肥前調查韭蛆蟲口密度，施肥後14d和21d分別調查防治效果。每個小區取5個點，每點取樣0.25m2（約1穴），計算各處理的蟲口退減率。蟲口退減率（%）=（防治前蟲口數-防治後蟲口數）/防治前蟲口數×100試驗結果如表2所示：表2處理稀釋倍數處理前蟲口數（頭/穴）14d減退率%21d減退率%1-193.2436121200201.787963300185.085934300171.54467由上表可見，本發明殺滅韭蛆的效果與天然除蟲菊素EW效果相當，兩者的殺蟲效果較空白對照組及施用腐植酸水溶肥組有明顯提高，單獨施用腐植酸水溶肥與空白對照的殺蟲效果相當，幾乎無作用。可見，本發明產品具有較強的殺滅田間害蟲的作用。試驗三：灰黴菌分生孢子萌發試驗，本試驗於2015～2016年在煙臺豐成農業科技有限公司完成。灰黴菌採自蓬萊市劉家溝鎮受病葡萄，葡萄灰黴病的病果按照常規方法分離、純化後獲得灰黴菌，用PDA斜面培養基（馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1000ml）保存於4℃冰箱中。設計5組試驗，對灰黴病菌孢子萌發的抑制效果進行評價。處理1：清水對照；處理2：95%苯醚甲環唑按說明書稀釋；處理3:95.5%乙黴威按說明書稀釋；處理4：含腐植酸水溶肥300倍稀釋，其有效成分為腐植酸≥3.0%，N+P2O5+K2O≥35.0%（N：P：K=15：5：15）；處理5：本發明肥料300倍稀釋。取稀釋後的處理液1ml均勻塗布於PDA平板培養基中備用，共進行3組平行試驗。將冰箱保存的灰黴菌轉接於PDA平板培養基中，於25℃恆溫黑暗培養箱中培養，待有大量分生孢子團產生時，滴入滅菌蒸餾水，用接種針在平板上輕輕刮動，使孢子懸浮於水中，用滅菌紗布過濾去掉菌絲和培養基。加入適量滅菌蒸餾水稀釋，使在10×10倍顯微鏡下每視野中有40～50個分生孢子。取上述孢子懸浮液100ul加在添加處理液的PDA平板培養基中，並塗布均勻，放置於21℃黑暗條件下培養12h，在顯微鏡下觀察分生孢子萌發，並計算分生孢子萌發抑制率。分生孢子萌發抑制率%=（對照分生孢子萌發率-處理分生孢子萌發率）/對照分生孢子萌發率×100試驗結果如表3所示：表3處理稀釋倍數分生孢子萌發抑制率%1-021000053.8931000087.52430089.6453000含腐殖酸水溶肥對灰黴菌抑制率為0，本發明肥料對灰黴菌孢子萌發抑制率高於兩種化學藥劑，顯示其具有較強的抗菌作用。以上顯示和描述了本發明的基本原理和主要特徵和本發明的優點。本行業的技術人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發明的原理，在不脫離本發明精神和範圍的前提下，本發明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發明範圍內。本發明要求保護範圍由所附的權利要求書及其等效物界定。當前第1頁1 2 3