使用兩種類型的ispg酶改善異戊二烯產量的組合物和方法
2023-04-24 18:26:46
使用兩種類型的ispg酶改善異戊二烯產量的組合物和方法
【專利摘要】本發明提供通過使用重組工程改造的細胞產生異戊二烯的組合物和方法，所述細胞除了異戊二烯合酶外還利用雙IspG酶系統。
【專利說明】使用兩種類型的ISPG酶改善異戊二烯產量的組合物和方法
[0001]相關專利串請的交叉引用
[0002]本專利申請要求2010年12月22日提交的美國臨時專利申請N0.61/426，505的優先權，該臨時專利申請的內容據此以引用方式全文併入本文。
【技術領域】
[0003]本發明整體涉及通過利用兩種類型的IspG酶改善來自重組細胞的異戊二烯產量的組合物和方法。
_4]發明背景
[0005]異戊二烯(2-甲基-1，3-丁二烯)是多種合成聚合物(最值得注意的是合成橡膠)的關鍵原料。異戊二烯由多種微生物、植物和動物物種自然產生。具體地講，已經發現了兩種進行異戊二烯生物合成的途徑:甲羥戊酸(MvA)途徑和非甲羥戊酸(DXP)途徑。然而，天然存在的生物體的異戊二烯產率沒有商業吸引力。每年大約有800，000噸順式聚異戊二烯由異戊二烯的聚合反應產生；這種聚異戊二烯大部分用於輪胎和橡膠工業。異戊二烯還通過共聚反應用作其他產品中的合成彈性體，這些產品例如為鞋類、機械產品、醫療產品、體育用品和乳膠。
[0006]目前，輪胎和橡膠工業立足於天然和合成橡膠的使用。天然橡膠得自存在於非洲雨林的橡膠樹或植物的乳狀汁液。合成橡膠則主要基於丁二烯聚合物。對於這些聚合物，丁二烯作為乙烯和丙烯製造的副產物而獲得。
[0007]儘管可以通過分餾石油獲得異戊二烯，但該材料的純化昂貴而且耗時。C5烴流的石油裂解僅生成約15%的異戊二烯。因此，需要更經濟的產生異戊二烯的方法。具體地講，以足以滿足穩定商業過程的需求的速率、滴度和純度產生異戊二烯的方法是所需的。還需要的是由低成本的起始物質產生異戊二烯的系統。本文所述的發明解決了這些需要並且還提供了另外的有益效果。
[0008]將本說明書中引述的所有出版物、專利申請和專利均以引用的方式併入本文，就如同具體且獨立地表明將每篇獨立 的出版物、專利申請或專利以引用的方式併入本文一樣。具體地講，將本文引述的所有出版物明確地以引用的方式併入本文以描述和公開可結合本發明使用的組合物和方法。
【發明內容】
[0009]本發明尤其提供以提高的量產生異戊二烯的組合物和方法，其中使用兩種類型的
1-羥基-2-甲基-2- (E) - 丁烯基4- 二磷酸合酶(HDS或IspG) IspG酶和/或其他DXP途徑核酸和多肽、鐵-硫簇相互作用氧化還原核酸和多肽以及異戊二烯合酶核酸和多肽。
[0010]在一個方面，本發明提供能夠產生異戊二烯的重組細胞，該細胞包含(i)編碼第一物種的第一 1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸合酶(IspG)多肽的異源核酸，或編碼第一物種的IspG多肽的內源核酸的一個或多個拷貝；(ii)編碼第二物種的第二 IspG多肽的異源核酸，或編碼第二物種的IspG多肽的內源核酸的一個或多個拷貝，其中第二物種不同於第一物種；(iii)編碼至少一種另外的DXP途徑酶的異源核酸；和(iv)編碼異戊二烯合酶多肽的核酸。在另一方面，本發明提供能夠產生異戊二烯的重組細胞，該細胞用以下核酸轉化:(i)編碼第一物種的第一 1-羥基-2-甲基-2-(E)- 丁烯基4- 二磷酸合酶(IspG)多肽的核酸；(ii)編碼第二物種的第二 IspG多肽的核酸，其中第二物種不同於第一物種；(iii)編碼至少一種DXP途徑酶的核酸以及(iv)編碼異戊二烯合酶多肽的核酸。在這些方面的任何一者中，第一 IspG來自T.elongatus。在其他方面,第二 IspG來自大腸桿菌(E.coli)。在一些方面，該另外的DXP途徑酶選自DXS、DXR、MCT、CMK、MCS、HDR(IspH)和ID10在一些方面，該另外的DXP途徑酶可以為以下任意一者或多者:DXS、DXR、HDR(IspH)和 IDI。
[0011]在本文的任何方面，重組細胞還包含編碼鐵-硫簇相互作用氧化還原多肽的異源核酸，或編碼鐵-硫簇相互作用氧化還原多肽的內源核酸的一個或多個拷貝。在一些方面，鐵-硫簇相互作用氧化還原多肽選自鐵氧還蛋白和黃素氧還蛋白。
[0012]在本文的任何方面，重組細胞還包含編碼DXP途徑相關多肽(如DXP伴侶蛋白)的異源核酸，或編碼DXP途徑相關多肽(如DXP伴侶蛋白)的內源核酸的一個或多個拷貝。在某些方面，DXP途徑相關多肽選自伴侶素，其中包括表現出熟知的蛋白摺疊和/或重摺疊功能的酶以及功能性鐵-硫簇的運輸、維持和/或修復中涉及到的酶。
[0013]在本文的任何方面，重組細胞還包含編碼異戊烯基二磷酸δ-異構酶(IDI)多肽的一個或多個異源核酸，或編碼IDI多肽的內源核酸的一個或多個拷貝。
[0014]在本文的任何方面，重組細胞還包含編碼MVA途徑多肽的一個或多個異源核酸，或編碼MVA途徑多肽的內源核酸的一個或多個拷貝。
[0015]在本文的任何方面，異戊二烯合酶多肽為植物異戊二烯合酶多肽。在本文的任何方面，異戊二烯合酶多肽為銀白楊(P.alba)異戊二烯合酶。在一些方面，異戊二烯合酶多妝為得自葛屬(Pueraria)或楊屬(Populus)或雜交體(Populus alba x Populus tremula)的多肽。在其他方面，異戍二烯合酶多肽選自葛麻姆(Pueraria montana)或野葛(Pueraria1bata)、山楊(Populus tremuloides)、銀白楊(Populus alba)、黑楊(Populus nigra)和毛果楊(Populus trichocarpa)。在其他方面,植物異戍二烯合酶多肽為葛根異戍二烯合酶多肽。在一些方面，異戊二烯合酶多肽為天然存在的異戊二烯合酶多肽。在其他方面，異戊二烯合酶多肽為非天然存在的異戊二烯合酶多肽。在其他方面，異戊二烯合酶多肽為如W02009/041581、美國專利公布N0.2010/0003716、W02010/0124146或美國專利申請13/283，564中所公開的異戊二烯合酶變體或異戊二烯合酶突變體。
[0016]在本文的任何方面，重組細胞為細菌、藻類、真菌或酵母細胞。在一些方面，重組細胞為細菌細胞。在一些方面，細菌細胞為革蘭氏陽性細菌細胞或革蘭氏陰性細菌細胞。在一些方面，細菌細胞為大腸桿菌。在其他方面，細菌細胞選自大腸桿菌、檸檬假交替單胞菌(P.citrea)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、地衣芽孢桿菌(B.1icheniformis)、遲緩芽孢桿菌(B.1entus)、短芽孢桿菌(B.brevis)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermophilus)、嗜鹼芽孢桿菌(B.alkalophilus)、解澱粉芽孢桿菌(B.amy1liquefaciens)、克勞氏芽孢桿菌(B.clausii)、耐鹽芽孢桿菌(B.halodluranls)、巨大芽孢桿菌(B.megaterium)、凝結芽孢桿菌(B.coagulans)、環狀芽孢桿菌(B.circulans)、燦爛芽孢桿菌(B.1autus)、蘇雲金芽孢桿菌(B.thuringiensis)、白色鏈黴菌(S.albus)、變鉛青鏈黴菌(S.1ividans)、天藍色鏈黴菌(S.coelicolor)、灰色鏈黴菌(S.griseus)、假單胞菌(Pseudomonassp.)和產鹼假單胞菌(P.alealigenes)細胞。在本文的任何方面，核酸可在一個或多個質粒上。
[0017]在另一方面，本發明還提供包含如本文所公開的任何重組細胞的細胞培養物，其中該細胞培養物能夠產生至少約8.4g/l的異戊二烯。
[0018]在另一方面，本發明還提供產生異戊二烯的方法，該方法包括:(a)將本文所公開的任何重組細胞在適於產生異戊二烯的條件下培養，以及(b)產生異戊二烯。在一些方面，該方法還包括回收異戊二烯。在其他方面，重組細胞產生大於約8.4g/l的異戊二烯。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0019]圖1 不出了 Ptac 魚渥藻 ispH-T elong ispG 系統 aspA term/pEWL454 的質粒圖譜。kan-卡那黴素抗生素抗性標記；pl5A or1-質粒複製起點；RBS—核糖體結合位點。Tac啟動子、aspA終止子以及編碼IspH和IspG系統組分的基因的位置在圖譜上指出；魚腥藻ispH編碼4-羥基-3-甲基丁 -2-烯基二磷酸還原酶(IspH), T elong gcpE編碼1-輕基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸合酶(IspG), T elong petF編碼鐵氧還蛋白(Fd),並且T elong petH編碼鐵氧還蛋白-NADP+氧化還原酶(Fpr)。
[0020]圖2顯示了在REM F2_18的15L規模發酵中異戊二烯滴度與時間的關係圖。
[0021]圖3顯示了異戍二烯的MVA和DXP代謝途徑(根據F.Bouvier et al.,Progressin Lipid Res.44:357-429, 2005 (F.Bouvier 等人，《脂類研究進展》，第 44 卷，第 357-429頁，2005年))。下面說明包括途徑中每種多肽的別名以及公開測量所指示多肽的活性的測定法的參考文獻(據此將這些參考文獻中的每一篇各自全文以引用方式併入本文中)。甲羥戊酸途徑=AACT ;乙醯輔酶A乙醯轉移酶，MvaE, EC2.3.1.9。測定法:J.Bacteriol.184:2116-2122，2002(《細菌學雜誌》，第184卷，第2116-2122頁，2002年)；HMGS;羥甲基戊二醯輔酶 A 合酶，MvaS, EC2.3.3.10。測定法:J.Bacteriol.184:4065-4070,2002(《細菌學雜誌》，第184卷，第4065-4070頁，2002年)；HMGR ;3_羥基-3-甲基戊二醯輔酶A還原酶，MvaE, ECl.1.1.34。測定法 J.Bacteriol.184:2116_2122，2002 (《細菌學雜誌》，第184 卷，第 2116-2122 頁，2002 年);MVK ;甲羥戊酸激酶，ERG12，EC2.7.1.36。測定法=CurrGenetl9:9-14,1991(《當代遺傳學》，第19卷，第9-14頁，1991年)；PMK ;磷酸甲羥戊酸激酶，ERG8，EC2.7.4.2，測定法:Mol.Cell.Biol.11:620-631,1991(《分子與細胞生物學》，第11卷，第620-631頁，1991年)；DPMDC ;二磷酸甲羥戊酸脫羧酶，MVD1，EC4.1.1.33。測定法=Biochemistry, 33:13355-13362,1994(《生物化學》，第 33 卷，第 13355-13362 頁，1994 年)；IDI ;異戊烯基二磷酸 δ -異構酶，IDI1，EC5.3.3.2。測定法 J.Biol.Chem.264:19169-19175,1989 (《生物化學雜誌》，第264卷，第19169-19175頁，1989年)；DXP途徑:DXS ;1-脫氧木酮糖-5-磷酸合酶，dxs，EC2.2.1.7。測定法=PNAS, 94:12857_62，1997 (《美國國家科學院院刊》，第94卷，第12857-12862頁，1997年)；DXR ； 1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶，dxr, EC2.2.1.7。測定法:Eur.J.Biochem.269:4446-4457,2002(《歐洲生物化學雜誌》，第269卷，第4446-4457頁，2002年)；MCT ;4_ 二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤蘚糖醇合酶，IspD, EC2.7.7.60。測定法:PNAS97:6451-6456,2000(《美國國家科學院院刊》，第97卷，第6451-6456頁，2000年)；CMK ;4_ 二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤蘚糖醇激酶，IspE, EC2.7.1.148。測定法:PNAS97:1062-1067，2000 (《美國國家科學院院刊》，第97卷，第1062-1067頁，2000年)；MCS ;2C-甲基-D-赤蘚糖醇2，4-環二磷酸合酶，IspF, EC4.6.1.12。測定法:PNAS96:11758-11763,1999(《美國國家科學院院刊》，第96卷，第 11758-11763 頁，1999 年)；HDS ;1_ 羥基-2-甲基 _2_ (E) - 丁烯基-4-二-磷酸合酶，ispG，ECl.17.4.3。測定法 J.0rg.Chem.70:9168-9174,2005(《有機化學雜誌》，第 70卷，第9168-9174頁，2005年)；HDR ;1_羥基-2-甲基-2- (E) - 丁烯基-4- 二磷酸還原酶，IspH, ECl.17.1.2。測定法=JACS 126:12847-12855，2004 (《美國化學會志》，第 126 卷，第12847-12855 頁，2004 年)。
[0022]圖4顯示了在REM F2_18和REM H8-12的單獨15L規模發酵中異戊二烯滴度與時間的關係圖。
【具體實施方式】
[0023]本發明尤其提供用於提高異戊二烯產生的系統、組合物和方法，方式是用兩種類型的IspG酶、DXP途徑酶和異戊二烯合酶多肽進行重組細胞工程改造，使得可產生提高量的異戊二烯。
[0024]定義
[0025]除非另有定義，否則本文所用的所有技術和科學術語都是本發明所屬領域的技術人員通常所理解的意思。以下文獻給技術人員提供本發明中使用的許多術語的一般詞典:Singleton, etal., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology,2nd ed.,John Wiley and Sons, New York(1994) (Singleton等人，《微生物學和分子生物學詞典》，第2版,紐約約翰威立父子 出版公司，1994年)；以及Hale & Marham, The Harper CollinsDictionary of Biology, Harper Perennial, N.Y.(1991) (Hale 和 Marham,《哈勃考林斯生物學詞典》，紐約Harper Perennial, 1991年)。應當理解,本發明並不限於所述的具體方法、規程和試劑，它們可以有所不同。本領域的技術人員還將了解，也可以用類似於或等同於本文所述方法和材料的任何方法和材料實施或測試本發明。本文所提供的標題並未限制可參考作為一個整體的說明書的本發明的各個方面。
[0026]如本文所用，術語「異戊二烯」或「2-甲基-1，3-丁二烯」(CAS#78-79_5)是指從3，3_ 二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)中脫去焦磷酸的直接和最終揮發性C5烴產物，並且不涉及一個或多個異戊烯基二磷酸(IPP)分子與一個或多個DMAPP分子的連接或聚合。術語「異戊二烯」一般不旨在限於其製備方法。
[0027]如本文所用，術語「多肽」包括多肽、蛋白質、肽、多肽的片段和融合多肽。
[0028]如本文所用，「分離的多肽」不是多肽文庫(例如2、5、10、20、50或更多個不同多肽的文庫)的一部分，並且與其在自然界中一起存在的至少一種組分分離。分離的多肽可例如通過編碼多肽的重組核酸的表達而獲得。分離的多肽可以是非天然存在的多肽。
[0029]所謂「異源多肽」，是指由源自與宿主細胞不同的生物體、物種或菌株的核酸序列編碼的多肽。在一些方面，異源多肽不同於存在於自然界中的相同宿主細胞內存在的野生型多肽。
[0030]如本文所使用，「核酸」是指以單股或雙股形式共價連接在一起的兩個或更多個脫氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸。[0031]所謂「重組核酸」，是指這樣的所關注核酸，其缺少在該所關注核酸旁側的、所關注核酸所源自的生物體的天然存在的基因組中的一種或多種核酸(如，基因)。因此，該術語包括(例如)摻入載體中、摻入自主複製型質粒或病毒中或摻入原核生物或真核生物的基因組DNA中，或者獨立於其他序列作為單獨的分子(如，cDNA、基因組DNA片段或通過PCR或限制性核酸內切酶消化製備的cDNA片段)存在的重組DNA。在一些情況下，重組核酸是編碼非天然存在的多肽的核酸。
[0032]所謂「異源核酸」，是指源自與宿主細胞不同的生物體、物種或菌株的核酸序列。在一些方面，異源核酸不同於存在於自然界中的相同宿主細胞內存在的野生型核酸。
[0033]如本文所用，短語「與DXP途徑相關的各種核酸和多肽」或「DXP途徑相關核酸或多肽」是指直接或間接地與DXP途徑多肽或核酸相互作用的任何核酸或多肽，包括但不限於萜烯合酶(如，羅勒烯合酶、金合歡烯合酶和青蒿素合酶)。
[0034]如本文所用，除非另外明確指明，否則術語「一個」、「一種」等是指一個或多個、一種或多種。
[0035]對本文中的「約」值或參數的參考包括(並描述)涉及該值或參數自身的方面。例如，涉及「約X」的描述包括「X」的描述。數值範圍包括限定該範圍的端值在內。
[0036]應當理解，本文所述的本發明的方面包括「包含」、「由組成」和「基本上由組成」的各個方面。
[0037]能夠產生異戊二烯的重組細胞
[0038]如本文更詳細地描述和進一步舉例說明，可對能夠產生異戊二烯的重組細胞進行工程改造以提高異戊二烯的產生。如本文所述，提高的異戊二烯產生可通過包含以下核酸的能夠產生異 戊二烯的重組細胞實現:(i)編碼第一物種的第一 1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸合酶(IspG)多肽的異源核酸，或編碼第一物種的IspG多肽的內源核酸的一個或多個拷貝；(ii)編碼第二物種的第二 IspG多肽的異源核酸，或編碼第二物種的IspG多肽的內源核酸的一個或多個拷貝，其中第二物種不同於第一物種編碼至少一種另外的DXP途徑酶的異源核酸；和(iv)編碼異戊二烯合酶多肽的核酸。在一個方面,第一物種的第一 IspG多肽來自大腸桿菌。在另一方面，第二物種的第二 IspG多肽來自 T.elongatus IspG0
[0039]IspG酶和系統
[0040]IspG酶是下遊DXP途徑的一部分。IspG核酸編碼1_羥基_2_甲基-2_(E)_ 丁烯基4- 二磷酸合酶(IspG)或HDS多肽，其將2-C-甲基-D-赤蘚糖醇2，4-環二磷酸(ME-CPP或cMEPP)轉化成(E) -4-羥基-3-甲基丁 -2-烯-1-基二磷酸(HMBPP或HDMAPP)。
[0041]一些已進行工程改造以利用類異戊二烯生物合成的DXP途徑的重組細胞(如，BL21大腸桿菌菌株)具有的IspG活性過低，而不能支持由葡萄糖高產率地生成異戊二烯。因此，對於異戊二烯的商業生產，這些重組細胞不足以產生所需的商業相關水平的異戊二烯。因此，本發明提供了通過提高IspG多肽活性而提高異戊二烯產生的組合物和方法。
[0042]對於提高IspG多肽活性，一種選擇是更多地表達內源大腸桿菌IspG系統。本文所述的系統、重組細胞組合物和方法利用不同的方法，其中IspG多肽活性和後續異戊二烯的產生通過兩種類型的IspG多肽編碼核酸的過表達而增強。在一個方面，這兩種類型的IspG多肽為大腸桿菌和T.elongatus IspG多肽。在一些方面，IspG多肽由異源核酸編碼。在其他方面，IspG多肽由引入宿主細胞(如，大腸桿菌)中的內源核酸的一個或多個拷貝編碼。在任何這些方面，核酸可通過一個或多個質粒引入宿主細胞(如，大腸桿菌)。在其他方面，核酸可通過整合進宿主細胞的染色體而引入宿主細胞(如，大腸桿菌)。本領域的技術人員將認識到，整合應發生在對宿主細胞非必需的位置處。例如，在細菌細胞(如，大腸桿菌細胞)中，整合到複製起點(或染色體的任何其他必需區域)將使得細菌不能複製。因此，應當小心避免整合到宿主生物體中染色體的必需位置。
[0043]大腸桿菌IspG系統包含但不限於酶IspG (由基因ispG編碼)和所需的黃素氧還蛋白氧化還原伴侶FldA (由基因fldA編碼)。
[0044]T.elongatus IspG系統包含但不限於酶IspG (由基因gcpE編碼)和所需的鐵氧還蛋白氧化還原伴侶Fd(由petF基因編碼)以及非必需的鐵氧還蛋白_NADP(+)氧化還原酶氧化還原伴侶Fpr (由petH基因編碼)。
[0045]在一些情況下，Fpr活性不是T.elongatus IspG在大腸桿菌內發揮作用所必需的，其中據發現T.elongatus IspG的活性依賴於Fd輔因子。大腸桿菌的fpr基因是非必需的，並且T.elongatus IspG在大腸桿菌內的活性依賴於T.elongatus Fd的共表達。
[0046]不受理論的約束，據信，大腸桿菌IspG系統和T.elongatus IspG系統最終通過一些黃素氧還蛋白/鐵氧還蛋白_NADP(+)氧化還原酶活性從NADPH獲得執行其催化功能所必需的電子。具有黃素氧還蛋白/鐵氧還蛋白-NADP(+)氧化還原酶活性的酶已在體外經證實起著將電子轉運到IspG活性所必需的期望黃素氧還蛋白和鐵氧還蛋白輔因子的作用，然而這些還原酶的體內生理相關性尚不明確，因此不能進行預測。
[0047]示例性多肽和核酸
[0048]如上所述，對本發明的重組細胞及其子代進行工程改造，以具有兩種類型的IspG酶、異戊二烯合酶以及一種或多種其他DXP途徑多肽。在某些方面，細胞還可包含各種鐵-硫簇相互作用氧化還原多肽和核酸、MVA途徑多肽和核酸、DXP途徑相關多肽(如，DXP伴侶蛋白)和核酸、PGL多肽和核酸以及IDI多肽和核酸。
[0049]多肽包括多肽、蛋白質、肽、多肽的片段和融合多肽。在一些方面，融合多肽包含第一多肽(如鐵-硫簇相互作用氧化還原多肽、DXP途徑多肽、DXP途徑相關多肽(如，DXP伴侶蛋白)、異戊二烯合酶多肽和IDI多肽或其催化活性片段)的部分或全部，並可任選地包含第二多肽(如有利於融合多肽的純化或檢測的肽，諸如組氨酸標籤)的部分或全部。在一些方面，融合多肽具有兩種或更多種DXP途徑多肽的活性。
[0050]在特定方面，核酸包含任何鐵-硫簇相互作用氧化還原核酸、IspG核酸、DXP途徑核酸、DXP途徑相關核酸(如DXP伴侶蛋白)、異戊二烯合酶核酸或IDI核酸的片段或整個核酸序列。在一些方面，核酸包含鐵-硫簇相互作用氧化還原核酸、IspG、DXP途徑核酸、DXP途徑相關核酸、異戊二烯合酶核酸或IDI核酸中至少或約50、100、150、200、300、400、500、600、700、800個或更多 個鄰接核苷酸。在一些方面，核酸與野生型(即在自然界中存在的)IspG核酸、鐵-硫簇相互作用氧化還原核酸、DXP途徑核酸、DXP途徑相關核酸、異戊二烯合酶核酸或IDI核酸的序列相比具有一個或多個突變。在一些方面，核酸具有增加IspG核酸、鐵-硫簇相互作用氧化還原核酸、DXP途徑核酸、DXP途徑相關核酸、異戊二烯合酶核酸或IDI核酸的轉錄或翻譯的一個或多個突變(如，沉默突變)。在一些方面，核酸為編碼IspG多肽、鐵-硫簇相互作用氧化還原多肽、DXP途徑多肽、DXP途徑相關多肽、異戊二烯合酶多肽或IDI多肽的任何核酸的簡併變體。
[0051]示例性異戊二烯合酶與DXP途徑多肽和核酸的登錄號在W02009/076676的附錄I中列出並且也在本文進一步詳細描述。
[0052]示例性鐵-硫簇相互作用氧化還原多肽和核酸
[0053]鐵-硫簇相互作用氧化還原多肽在類異戊二烯生物合成的DXP途徑中發揮著不可或缺的作用。示例性鐵-硫簇相互作用氧化還原多肽包括具有鐵-硫簇相互作用氧化還原多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。可通過使用測量甲硝唑[1-(2-羥基乙基)-2-甲基-5-硝基咪唑]還原率的氫化酶聯測定法(Chen and Blanchard,Analytical Biochem, 93: 216-222 (1979) (Chen 和 Blanchard,《分析生物化學》，第 93 卷，第216-222頁，1979年))，將標準方法用於確定多肽是否具有鐵-硫簇相互作用氧化還原多肽活性。
[0054]示例性鐵-硫簇相互作用氧化還原多肽核酸包括編碼具有鐵-硫簇相互作用氧化還原多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例性鐵-硫簇相互作用氧化還原多肽和核酸包括來自本文所述的任何來源生物體的天然多肽和核酸以及源自本文所述的任何來源生物體的突變多肽和核酸。
[0055]鐵-硫簇相互作用氧化還原多肽是一種能夠將電子轉移到含鐵-硫簇的多肽的多肽。鐵-硫簇相互作用氧化還原多肽包括但不限於黃素氧還蛋白(如黃素氧還蛋白I)、黃素氧還蛋白還原酶、鐵氧還蛋白(如鐵氧還蛋白I)、鐵氧還蛋白-NADP+氧化還原酶，及其編碼基因或多肽(如fpr或fldA)。例如，DXP途徑多肽HDS(GcpE)是具有[4Fe_4S]2+中心的金屬酶，並在黃素氧還蛋白/黃素氧還蛋白還原酶的存在下通過還原[4Fe-4S]2+中心介導的兩個連續單電子轉移而催化cMEPP還原成HMBPP (參見Wolff et al.,FEBS Letters,541 =115-120(2003) (Wolff等人，《歐洲生物化學學會聯盟通訊》，第541卷，第115-120頁，2003年))。相似地,DXP途徑多肽HDR(LytB)也是在黃素氧還蛋白/黃素氧還蛋白還原酶/NADPH體系的存在下通過兩個連續單電子轉移而催化HMBPP還原成IPP或DMAPP的Fe/S蛋白。參見例如 Seemann, M.et al.Agnew.Chem.1nt.Ed.,41:4337-4339(2002) (Seemann,Μ.等人，《德國應用化學》，第41卷，第4337-4339頁，2002年)；Wolff，M.et al.，FEBSLetters, 541 =115-120(2003) (WoIff,Μ.等人，《歐洲生物化學學會聯盟通訊》，第541卷，第115-120 頁，2003 年)。
[0056]黃素氧還蛋白是一種能夠轉移電子並含有輔基黃素單核苷酸的蛋白。在大腸桿菌(Escherichia coli)中，黃素氧還蛋白由fldA基因編碼並由含FAD的蛋白NADPH:鐵氧還蛋白氧化還原酶還原，同時在類異戊二烯生物合成的DXP途徑中發揮著不可或缺的作用(參見例如 Kia-Joo, P.et al.FEBS Letters, 579:3802-3806, 2005 (Kia-Joo, P.等人，《歐洲生物化學學會聯盟通訊》，第579卷，第3802-3806頁，2005年))。
[0057]鐵氧還蛋白是一種能夠轉移電子並包含等量的鐵和不穩定硫、同時在類異戊二烯生物合成的DXP途徑中發揮著不可或缺的作用的蛋白質。例如，已表明植物和藍細菌中的HDS為鐵氧還蛋白、而不是黃素氧還蛋白依賴性酶(Seemannet al., FEBS Lett.,580(6) =1547-52(2006) (Seemann等人，《歐洲生物化學學會聯盟通訊》》，第580卷第6期，第 1547-1552 頁，2006 年))。
[0058]Fpr編碼黃素氧還蛋白/鐵氧還蛋白NADPH-氧化還原酶並通過FldA為HDS和HDR提供源自NADPH的必要電子以執行它們的催化功能(綜述報告:L.A.Furgerson, TheMevalonate-1ndependent Pathway to Isoprenoid Compounds:Discovery,Elucidation,and Reaction Mechanisms, published Februaryl3, 2006 (L.A.Furgerson,《類異戍二烯化合物的非甲羥戊酸依賴性途徑:發現、說明和反應機理》，2006年2月13日發表))。
[0059]示例件DXP塗徑多狀和核酸
[0060]示例性DXP途徑多肽包括但不限於下列多肽中的任一者:DXS多肽、DXR多肽、MCT多肽、CMK多肽、MCS多肽、HDS多肽、HDR多肽、IDI多肽以及具有DXP途徑多肽中的一種、兩種或更多種的活性的多肽(如，融合多肽)。具體地講，DXP途徑多肽包括具有DXP途徑多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性DXP途徑核酸包括編碼具有DXP途徑多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例性DXP途徑多肽和核酸包括來自本文所述的任何來源生物體的天然存在的多肽和核酸以及源自本文所述的任何來源生物體的突變型多肽和核酸。
[0061]具體地講，DXS多肽將丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸轉化為1-脫氧-d-木酮糖-5-磷酸(DXP)。可使用標準方法通過測定多肽在體外、在細胞提取物中或體內轉化丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸的能力來確定多肽是否具有DXS多肽活性。
[0062]DXR多肽將1-脫氧-d-木酮糖-5-磷酸(DXP)轉化為2_C_甲基-D-赤蘚糖醇4-磷酸(MEP)。可使用標準方法通過測定多肽在體外、在細胞提取物中或在體內轉化DXP的能力來確定多肽是否具有DXR多肽活性。
[0063]MCT多肽將2-C-甲基-D-赤蘚糖醇_4_磷酸(MEP)轉化為4_ (胞苷_5' - 二磷酸)-2-甲基-D-赤蘚糖醇(CDP-ME)。可使用標準方法通過測定多肽在體外、在細胞提取物中或在體內轉化MEP的能力來確定多肽是否具有MCT多肽活性。
[0064]CMK多肽將4_(胞苷-5' - 二磷酸)_2_C_甲基-D-赤蘚糖醇(CDP-ME)轉化為
2-二磷酸4-(胞苷-5' - 二磷酸)-2-C-甲基-D-赤蘚糖醇(⑶P-MEP)。可使用標準方法通過測定多肽在體外、在細胞提取物中或在體內轉化CDP-ME的能力來確定多肽是否具有CMK多肽活性。
[0065]MCS多肽將2-磷酸-4-(胞苷_5' - 二磷酸)~2~C~甲基-D-赤蘚糖醇(CDP-MEP)轉化為2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-2，4-環二磷酸(ME-CPP或cMEPP)。可使用標準方法通過測定多肽在體外、在細胞提取物中或在體內轉化CDP-MEP的能力來確定多肽是否具有MCS多肽活性。
[0066]HDS多肽將2-C-甲基-D-赤蘚糖醇_2，4_環二磷酸轉化為(E) ~4~羥基_3_甲基丁 -2-烯-1-基二磷酸(HMBPP或HDMAPP)。可使用標準方法通過測定多肽在體外、在細胞提取物中或在體內轉化ME-CPP的能力來確定多肽是否具有HDS多肽活性。
[0067]HDR多肽將(E) _4_羥基_3_甲基丁 _2_烯_1_基二磷酸(HMBPP或HDMAPP)轉化為異戊烯基二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)。在一個實施例中，ispH基因可用於編碼HDR多肽。IspH也稱為1-羥基-2-甲基-2-(E)- 丁烯基4- 二磷酸還原酶、4Fe_4S蛋白、LytB、ECK0030、JW0027、lytB、yaaE和b0029。可使用標準方法通過測定多肽在體外、在細胞提取物中或在體內轉化HMBPP的能力來確定多肽是否具有HDR多肽活性。
[0068]IDI多肽將異戊烯基二磷酸轉化成二甲基烯丙基二磷酸。可使用標準方法通過測定多肽在體外、在細胞提取物中或在體內轉化異戊烯基二磷酸的能力來確定多肽是否具有IDI多肽活性。
[0069] 與DXP途徑相關的示例性多肽和核酸
[0070]各種與DXP途徑相關的多肽(如DXP伴侶蛋白)和編碼那些多肽的核酸可結合異戊二烯合酶、DXP途徑多肽和/或MVA途徑多肽中的任何一者或多者使用。在一個實施例中，可使用伴侶素。伴侶素有利於蛋白的摺疊和去摺疊，這是要獲得功能性三級結構所需的活性。此類分子伴侶涉及蛋白質三維結構的生成和修復，從而用於實現和維持蛋白質的功能。大腸桿菌伴侶素DnaK和GroEL/GroES是此類酶充分表徵的例子(Bukau et al.,Cell,92:351-366 (1998) (Bukau等人，《細胞》，第92卷，第351-366頁，1998年))。伴侶素有利於酶催化所需的輔因子的運輸、維持和修復。在一個實施例中，此類伴侶素可以是鐵-硫簇輔因子的功能所涉及的那些酶分子伴侶。大腸桿菌的iscR操縱子基因hreA、hrcB和iscA以及erpA和另外的A型載體蛋白是在大腸桿菌內涉及鐵_硫簇運輸、維持和修復的那些中的可用伴侶素類別的非限制性例子。(Tokumoto and Takahashi, J.Biochem., 130:63-71(2001)(Tokumoto 和 Takahashi,《生物化學雜誌》，第 130 卷，第 63-71 頁,2001 年)；Loiseauetal.，PNAS，104(34):13626-13631(2007) (Loiseau 等人，《美國國家科學院院刊》，第 104卷第 34 期，第 13626-13631 頁，2007 年)；Vinella et al., PLOS Genetics, 5 (5):l-16ofel000497 (2009) (Vinella等人，《公共科學圖書館_遺傳學》，第5卷第5期，el000497第1-16頁，2009年))。在另一個實施例中，可以使用iscS基因。除了在從頭鐵-硫簇生物發生中更好表徵的作用外，iscS基因也已涉及被損壞的鐵-硫簇的修復並可用作所述分子伴侶的一個例子(Djaman et al., J.Biol.Chem., 279 (43):44590-44599(2004) (Djaman 等人，《生物化學雜誌》，第279卷第43期，第44590-44599頁，2004年)。相似地，由大腸桿菌的ytfE編碼的Ric蛋白質和由ftn編碼的鐵蛋白A是鐵-硫簇修復中涉及到的伴侶素的另外例子(Justino et al.，Biometals, 22:99-108 (2009) (Justino 等人，《生物金屬》，第 22卷，第 99-108 頁，2009 年)Justino et al., J.Biol.Chem.,282(14):10352-10359(2007)(Justino等人，《生物化學雜誌》，第282卷第14期，第10352-10359頁，2007年)；Bitounet al.,Biometals, 21:693-703(2008) (Bitoun 等人，《生物金屬》，第 21 卷，第 693-703 頁，2008 年)。
[0071]示例性異戊二烯合酶多肽和核酸
[0072]如上所述，異戊二烯合酶多肽將二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)轉化成異戊二烯。示例性異戊二烯合酶核酸包括編碼具有異戊二烯合酶多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例性異戊二烯合酶多肽和核酸包括來自本文所述的任何來源生物體的天然存在的多肽和核酸以及源自本文所述的任何來源生物體的突變型多肽和核酸。
[0073]在本發明的一些方面，在本文所述的任何組合物或方法中所述的重組細胞還包含編碼異戊二烯合酶多肽或具有異戊二烯合酶活性的多肽的一種或多種核酸。在一些方面，異戊二烯合酶多肽為內源多肽。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的內源核酸可操作地連接至組成型啟動子。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的內源核酸可操作地連接至誘導型啟動子。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的內源核酸可操作地連接至強啟動子。在一些方面，使用不止一個編碼異戊二烯合酶多肽的內源核酸(如，編碼異戊二烯合酶多肽的內源核酸的2個、3個、4個或更多個拷貝)。在特定方面，對細胞進行工程改造，以相對於野生型細胞過表達內源異戊二烯合酶途徑多肽。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的內源核酸可操作地連接至弱啟動子。
[0074]在一些方面，異戊二烯合酶多肽為異源多肽。在一些方面，細胞包含編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸的不止一個拷貝。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至組成型啟動子。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至誘導型啟動子。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至強啟動子。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸可操作地連接至弱啟動子。
[0075]編碼異戊二烯合酶多肽的核酸可整合進宿主細胞的基因組，或者可在細胞中穩定表達。編碼異戊二烯合酶多肽的核酸另外可位於載體上。
[0076]在一些方面，異戊二烯合酶多肽或核酸來自豆科(Fabaceae)，諸如蝶形花亞科(Faboideae)。在一些方面,異戍二烯合酶多肽為來自葛屬或楊屬或諸如(Populus albaX Populus tremula)的雜交體的多肽。在一些方面，異戍二烯合酶多肽或核酸為來自以下的多肽或核酸:葛麻姆(葛根)(Sharkey et al., Plant Physiologyl37:700-712,2005 (Sharkey等人，《植物生理學》，第137卷，第700-712頁，2005年))、野葛、楊樹(諸如銀白楊、黑楊、毛果楊或(Populus alba x tremula) (CAC35696) Mi 11 er et al.,Planta213:483-487,2001 (Miller等人，《植物》，第213卷，第483-487頁，2001年))、白楊類(諸如山楊)(Silver et al.，JBC270 (22): 13010-1316，1995 (Silver 等人，《生物化學雜誌》，第270 卷第 22 期，第 13010-1316 頁，1995 年))或英國櫟(Quercus robur) (Zimmer 等人，W098/02550)。合適的異戊二烯合酶包括但不限於Genbank登記號AY341431、AY316691、AY279379、AJ457070和AY182241所標示的那些。在一些方面，異戊二烯合酶多肽或核酸不是來自英國櫟的天然存在的多肽或核酸(即，異戊二烯合酶多肽或核酸為來自英國櫟的天然存在的多肽或核酸之外的異戊二烯合酶多肽或核酸)。在一些方面，異戊二烯合酶核酸或多肽是來自楊樹的天然存在的多肽或核酸。在一些方面，異戊二烯合酶核酸或多肽不是來自楊樹的天然存在的多肽或核酸。
[0077]在一些方面，異戊二烯合酶核酸或多肽是天然存在的多肽或核酸(例如，來自楊屬的天然存在的多肽或核酸)。在一些方面，異戊二烯合酶核酸或多肽不是野生型或天然存在的多肽或核酸。在一些方面，異戊二烯合酶核酸或多肽是野生型或天然存在的多肽或核酸的變體(例如，來自楊屬的野生型或天然存在的多肽或核酸的變體)。
[0078]在一些方面，異戊二烯合酶多肽為變體。異戊二烯合酶的變體可具有改善的活性，諸如改善的酶活性。在一些方面，異戊二烯合酶變體具有其他改善的特性，諸如改善的穩定性(如熱穩定性)和/或改善的可溶性。在一些方面，異戊二烯合酶多肽是野生型或天然存在的異戊二烯合酶的變體。在一些方面，變體與野生型或天然存在的異戊二烯合酶相比具有改善的活性，諸如改善的催化活性。活性(如催化活性)的增加可為至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%中的任意一者。在一些方面，諸如催化活性的活性增加為至少約I倍、2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、75倍或100倍中的任意一者。在一些方面，諸如催化活性的活性增加為約10%至約100倍(如，約20%至約100倍、約50%至約50倍、約I倍至約25倍、約2倍至約20倍或約5倍至約20倍)。在一些方面，變體與野生型或天然存在的異戊二烯合酶相比具有改善的可溶性。可溶性的增加可為至少約 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或 95%中的任意一者。可溶性的增加可為至少約I倍、2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、75倍或100倍中的任意一者。在一些方面，可溶性的增加為約10%至約100倍(如，約20%至約100倍、約50%至約50倍、約I倍至約25倍、約2倍至約20倍或約5倍至約20倍)。在一些方面，異戊二烯合酶多肽為天然存在的異戊二烯合酶的變體，並與天然存在的異戊二烯合酶相比具有改善的穩定性(諸如熱穩定性)。
[0079]在一些方面，變體具有野生型或天然存在的異戊二烯合酶的活性的至少約10%、至少約20 %、至少約30 %、至少約40 %、至少約50 %、至少約60 %、至少約70 %、至少約80%、至少約90%、至少約100%、至少約110%、至少約120%、至少約130%、至少約140 %、至少約150 %、至少約160 %、至少約170 %、至少約180 %、至少約190 %、至少約200%。變體可與野生型或天然存在的異戊二烯合酶共有序列相似性。在一些方面，野生型或天然存在的異戊二烯合酶的變體可具有與野生型或天然存在的異戊二烯合酶至少約40%,50%,60%,70%,75%,80%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,99.5%或99.9%中任一者的胺基酸序列同一性。在一些方面，野生型或天然存在的異戊二烯合酶的變體具有與野生型或天然存在的異戊二烯合酶約70%至約99.9%、約75%至約99 %、約80 %至約98 %、約85 %至約97 %或約90 %至約95 %中任一者的胺基酸序列同一I"生。
[0080]在一些方面，變體在野生型或天然存在的異戊二烯合酶中包含突變。在一些方面，變體具有至少一個胺基酸置換、至少一個胺基酸插入和/或至少一個胺基酸缺失。在一些方面，變體具有至少一個胺基酸置換。在一些方面，變體與野生型或天然存在的異戊二烯合酶之間的不同胺基酸殘基的數量可為一個或多個，例如1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50或更多個胺基酸殘基。天然存在的異戊二烯合酶可包括來自植物的任何異戊二烯合酶，例如葛根異戊二烯合酶、楊樹異戊二烯合酶、英國櫟異戊二烯合酶和柳樹異戊二烯合酶。在一些方面，變體為來自銀白楊的異戊二烯合酶的變體。在一些方面，來自銀白楊的異戊二烯合酶的變體具有至少一個胺基酸置換、至少一個胺基酸插入和/或至少一個胺基酸缺失。在一些方面，變體為截短的銀白楊異戊二烯合酶。在一些方面，編碼變體(如來自銀白楊的異戊二烯合酶的變體)的核 酸為密碼子優化的(例如，基於在其中表達異源異戊二烯合酶的宿主細胞而進行密碼子優化的)。
[0081]本文提供的異戊二烯合酶多肽可以是W02009/132220、W02010/124146、美國專利申請公布N0.2010/0086978、美國專利申請13/283，564和PCT/US2011/058188中所述的異戊二烯合酶或異戊二烯合酶變體中的任何一種，這些專利關於異戊二烯合酶和異戊二烯合酶變體的內容整體明確地以引用方式併入本文。合適的異戊二烯合酶包括但不限於 Genbank 登記號 AY341431、AY316691、AY279379、AJ457070 和 AY182241 所標示的那些。可用於本文所述的組合物或方法(包括用於製備編碼異戊二烯合酶的微生物的方法)的任何一種中的異戊二烯合酶的類型還在國際專利申請公布N0.W02009/076676、N0.W02010/003007, N0.W02009/132220, N0.W02010/031062, N0.W02010/031068,N0.W02010/031076, N0.W02010/013077, N0.W02010/031079, N0.W02010/148150,N0.W02010/124146、N0.W02010/078457 和 N0.W02010/148256 中有所描述，這些專利關於異戊二烯合酶和異戊二烯合酶變體的內容整體明確地以引用方式併入本文。
[0082]本文所述的啟動子中的任何一種(例如，本文所述的以及在本公開的實例中所鑑定的啟動子，包括誘導型啟動子和組成型啟動子)均可用於驅動本文所述的任何異戊二烯合酶的表達。
[0083]可使用標準的方法，通過測量多肽在體外、在細胞提取物中或在體內將DMAPP轉化為異戊二烯的能力，來測定該多肽是否具有異戊二烯合酶多肽活性。在示例性測定中，通過如實例I中所述的搖瓶法使菌株(例如，如本文所述的大腸桿菌/pTrcKudzu菌株)生長而製備細胞提取物。完成誘導後，將大約IOmL的細胞通過以7000 Xg離心10分鐘而沉澱，然後重懸在無甘油的5mlPEB中。使用標準程序用弗氏細胞壓碎器將細胞裂解。或者，在-80°C下進行凍融循環後將細胞用溶菌酶(Ready-Lyse溶菌酶溶液；EpiCentre)處理。
[0084]細胞提取物中的異戊二烯合酶多肽活性可例如按以下文獻中所述進行測量:Silver et al.，J.Biol.Chem.270:13010-13016，1995 (Silver 等人，《生物化學雜誌》，第270卷，第13010-13016頁，1995年)以及其中的參考文獻，它們均據此全文以引用方式併入，尤其是關於異戊二烯合酶多肽活性的測定法的內容。將DMAPP(西格瑪公司(Sigma))在氮氣流下蒸發至幹，然後在IOOmM磷酸鉀緩衝液(pH8.2)中再水化至IOOmM的濃度，並在-20°C下保藏。為進行該測定，將5μ L的IM MgCl2、lmM(250y g/ml)DMAPP、65uL的植物提取物緩衝液(PEB) (50mM Tris-HCl, pH8.0,20mM MgCl2, 5%甘油和 2mM DTT)的溶液加到20mL頂空小瓶中的25 μ L細胞提取物中，並在振動下於37°C培養15分鐘，其中小瓶具有金屬旋蓋和塗有特氟龍的娃隔膜(安捷倫科技公司(Agilent Technologies))。反應可通過加入200 μ L的250mM EDTA進行猝滅並通過GC/MS進行定量。
[0085]示例件MVA塗徑多狀和核酸
[0086]在本發明的一些方面，在本文所述的任何組合物或方法中描述到的細胞包含編碼MVA途徑多肽的核酸。在一些方面，MVA途徑多肽為內源多肽。在一些方面，細胞包含編碼MVA途徑多肽的內源核酸的一個或多個額外拷貝。在一些方面，編碼MVA途徑多肽的內源核酸可操作地連接至組成型啟動 子。在一些方面，編碼MVA途徑多肽的內源核酸可操作地連接至組成型啟動子。在一些方面，編碼MVA途徑多肽的內源核酸可操作地連接至強啟動子。在特定的方面，將細胞進行工程改造以相對於野生型細胞過表達內源MVA途徑多肽。
[0087]在一些方面，MVA途徑多肽為異源多肽。在一些方面，細胞包含編碼MVA途徑多肽的異源核酸的不止一個拷貝。在一些方面，編碼MVA途徑多肽的異源核酸可操作地連接至組成型啟動子。在一些方面，編碼MVA途徑多肽的異源核酸可操作地連接至強啟動子。
[0088]示例性MVA途徑多肽包括乙醯輔酶A乙醯轉移酶(AA-CoA硫解酶)多肽、乙醯乙醯輔酶A合酶(其利用乙醯輔酶A和丙二醯輔酶A)、3_羥基-3-甲基戊二醯輔酶A合酶(HMG-CoA合酶)多肽、3-羥基-3-甲基戊二醯輔酶A還原酶(HMG-CoA還原酶)多肽、甲羥戊酸激酶(MVK)多肽、磷酸甲羥戊酸激酶(PMK)多肽、二磷酸甲羥戊酸脫羧酶(MVD)多肽、磷酸甲羥戊酸脫羧酶(PMDC)多肽、異戊烯基磷酸激酶(IPK)多肽、IDI多肽以及具有兩種或更多種MVA途徑多肽的活性的多肽(例如融合多肽)。具體地講，MVA途徑多肽包括具有MVA途徑多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性MVA途徑核酸包括編碼具有MVA途徑多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例性MVA途徑多肽和核酸包括來自本文所述任何來源生物體的天然多肽和核酸。另外，也可使用能提高異戊二烯產量的MVA途徑多肽變體。
[0089]在某些方面，編碼一種或多種MVA途徑多肽的一種或多種核酸為異源核酸。在其他方面，編碼一種或多種MVA途徑多肽的一種或多種核酸為內源核酸的拷貝。在本文的任何方面，一種或多種MVA途徑多肽可選自:(a)縮合兩個乙醯輔酶A分子以形成乙醯乙醯輔酶A的酶(AA-CoA硫解酶)或可由丙二醯輔酶A和乙醯輔酶A合成乙醯乙醯輔酶A的酶(乙醯乙醯輔酶A合酶)；(b)縮合乙醯乙醯輔酶A與乙醯輔酶A以形成HMG-CoA的酶(如HMG合酶)；(c)將HMG-CoA轉化成甲羥戊酸的酶；(d)將甲羥戊酸磷酸化成5-磷酸甲羥戊酸的酶；(e)將5-磷酸甲羥戊酸轉化成5-焦磷酸甲羥戊酸的酶；(f)將5-焦磷酸甲羥戊酸轉化成異戊烯基焦磷酸的酶；以及(g)將異戊烯基焦磷酸轉化成二甲基烯丙基二磷酸的酶。在本文的任何方面，一種或多種MVA途徑多肽選自(a)縮合乙醯乙醯輔酶A與乙醯輔酶A以形成HMG-CoA的酶(如HMG合酶);(b)將HMG-CoA轉化成甲羥戊酸的酶；(c)將甲羥戊酸磷酸化成5-磷酸甲羥戊酸的酶；(d)將5-磷酸甲羥戊酸轉化成5-焦磷酸甲羥戊酸的酶；以及(e)將5-焦磷酸甲羥戊酸轉化成異戊烯基焦磷酸的酶。
[0090]可用的MVA途徑多肽和/或DXP途徑多肽的類型以及製備編碼MVA途徑多肽和/或DXP途徑多肽的微生物的方法還在國際專利申請公布N0.W02009/076676中有所描述。
[0091]本領域的技術人員可容易地選擇和/或使用合適的啟動子來優化異戊二烯合酶和/或一種或多種MVA途徑多肽和/或一種或多種DXP途徑多肽的表達。類似地，本領域的技術人員可容易地選擇和/或使用合適的載體(或轉移媒介)來優化異戊二烯合酶和/或一種或多種MVA途徑多肽和/或一種或多種DXP途徑多肽的表達。在一些方面，載體含有選擇性標記。選擇性標記的例子包括但不限於抗生素抗性核酸(例如，卡那黴素、氨苄青黴素、竣節青黴素、慶大黴素、潮黴素、腐早黴素、博來黴素、新黴素或氣黴素)和/或賦予宿主細胞代謝優勢(諸如營養優勢)的核酸。在一些方面，異戊二烯合酶或MVA途徑核酸在沒有選擇性標記的情況下整合到細胞的染色體中。
[0092]示例件來源牛物體
[0093]鐵-硫簇相互作用氧化還原核酸、DXP途徑核酸、DXP途徑相關核酸、異戊二烯合酶核酸或IDI核酸(及它們的編碼多肽)可得自天然包含鐵-硫簇相互作用氧化還原核酸、DXP途徑核酸、DXP途徑相關核酸、異戊二烯合酶核酸和/或IDI核酸的任何生物體。如上所述，異戊二烯由多種生物體(例如細 菌、酵母、植物和動物)天然地形成。生物體含有MVA途徑、DXP途徑或MVA和DXP途徑二者來產生異戊二烯(圖3)。因此，DXS、DXR、MCT、CMK、MCS,HDS或HDR核酸可例如從任何具有DXP途徑或同時具有MVA和DXP途徑的生物體獲得。IDI和異戊二烯合酶核酸可例如從任何含有MVA途徑、DXP途徑或同時含有MVA和DXP途徑的生物體獲得。
[0094]在一些方面，鐵-硫簇相互作用氧化還原核酸、DXP途徑核酸、DXP途徑相關核酸、異戊二烯合酶核酸或IDI核酸的核酸序列與通過自然界中的任何以下生物體產生的核酸的序列相同。在一些方面，鐵-硫簇相互作用氧化還原多肽、DXP途徑多肽、DXP途徑相關多肽、異戊二烯合酶多肽或IDI多肽的胺基酸序列與通過自然界中的任何以下生物體產生的多肽的序列相同。在一些方面，鐵-硫簇相互作用氧化還原核酸、DXP途徑核酸、DXP途徑相關核酸、異戊二烯合酶核酸或IDI核酸或其編碼多肽為衍生自本文所述的任何生物體的突變型核酸或多肽。如本文所用，「衍生自」是指一個或多個突變所引入的核酸或多肽源。例如，「衍生自植物多肽」的多肽是指通過將一個或多個突變引入野生型(即，自然界中存在的)植物多肽的序列而得到的所關注多肽。[0095]在一些方面，來源生物體為真菌，其例子為麴黴屬(Aspergi I Ius)的種，諸如米麴黴(A.0ryzae)和黑麴黴(A.niger);酵母屬(Saccharomyces)的種，諸如釀酒酵母(S.cerevisiae);裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)的種，諸如粟酒裂殖酵母(S.pombe);以及木黴屬(Triohoderma)的種，諸如裡氏木黴(T.reesei)。在一些方面，來源生物體為絲狀真菌細胞。術語「絲狀真菌」是指真菌亞門的所有絲狀形式(參見Alexopoulos,C.J.(1962), Introductory Mycology, Wiley,New York(Alexopoulos,C.J.,1962年，《真菌學概論》，紐約威利出版社))。這些真菌的特徵是其營養菌絲體的細胞壁由幾丁質、纖維素和其他複合多糖構成。絲狀真菌在形態學上、生理學上和遺傳學上不同於酵母。絲狀真菌的營養生長是通過菌絲伸長來進行，並且碳分解代謝是專性好氧的。絲狀真菌親本細胞可以是以下各屬(但不限於以下各屬)的種的細胞:木黴屬(如裡氏木黴(其為之前歸類為長梗木黴(T.1ongibrachiatum)的紅褐肉座菌(Hypocrea jecorina)的無性形式)、綠色木黴(Trichoderma viride)、康寧木黴(Triohoderma koningii)、哈茨木黴(Trichoderma harzianum)) (Sheir-Neirs et al., Appl.Microbiol.Biotechnol20:46-53，1984 (Sheir-Neirs等人，《應用微生物學和生物技術》，第20卷，第46-53頁，1984年)；ATCC N0.56765和 ATCC N0.26921);青黴屬(Penicillium sp.);腐質黴屬(Humicolasp.)(如特異腐質黴(H.1nsolens)、柔毛腐質黴(H.1anuginose)或灰腐質黴(H.grisea))；金抱黴屬(Chrysosporium sp.)(如 C.1ucknowense);粘帚黴屬(Gliocladium sp.);麴黴屬(Aspergillus sp.)(如米麴黴、黑麴黴、醬油麴黴(A.sojae)、日本麴黴(A.japonicus)、構巢麴黴(A.nidulans)或泡盛麴黴(A.awamori)) (Ward et al.，Appl.Microbiol.Biotechnol.39:7380743,1993 (Ward等人，《應用微生物學和生物技術》，第39卷，第7380743 頁，1993年)和Goedegebuur et al.,Genet41:89-98, 2002 (Goedegebuur 等人，《遺傳學》，第41卷，第89-98頁，2002年));鐮孢屬(Fusarium sp.)(如粉紅鐮孢(F.roseum)、禾赤鍵抱(F.graminum)、F.cereal is、尖抱鍵刀菌(F.0xysporuim)或 F.venenatum);脈抱菌屬(Neurospora sp.)(如粗糙脈孢菌(N.crassa));肉座菌屬(Hypocrea sp.);毛黴屬(Mucor sp.)(如米黑毛黴(M.miehei));根黴屬(Rhizopus sp.)和裸胞殼屬(Emericellasp.)(另見 Innis et al.,Sc1.228:21-26,1985 (Innis 等人，《科學》，第 228卷，第 21-26 頁，1985 年))。術語木黴屬(「Tr ichoderma」或「Trichoderma sp.」或「Trichoderma spp.，，)是指之前或目前被歸類為木黴的任何真菌屬。
[0096]在一些方面，真菌為構巢麴黴、泡盛麴黴、米麴黴、棘孢麴黴(A.aculeatus)、黑麴黴、日本麴黴、裡氏木黴、綠色木黴、尖抱鍵刀囷或腐皮鍵抱黴(F.solani)。麴黴囷囷株在Ward et al.，Appl.Microbiol.Biotechnol.39:738-743,1993 (Ward 等人，《應用微生物學和生物技術》，第 39 卷，第 738-743 頁，1993 年)和 Goedegebuur et al.，Curr Gene41:89-98，2002 (Goedegebuur等人，《現代基因》，第41卷，第89-98頁，2002年)中有所公開，它們均據此全文以引用方式併入，尤其是關於真菌的內容。在特定方面，真菌為木黴屬菌株，諸如裡氏木黴菌株。裡氏木黴菌株是已知的，並且非限制性例子包括ATCC N0.13631、ATCC N0.2692 K ATCCN0.56764、ATCC N0.56765、ATCC N0.56767 和 NRRL15709，它們均據此全文以引用方式併入，尤其是關於裡氏木黴菌株的內容。在一些方面，宿主菌株為RL-P37的衍生物。RL-P37 在 Sheir-Neiss et al., Appl.Microbiol.Biotechnology20:46-53,1984 (Sheir-Neiss等人，《應用微生物學和生物技術》，第20卷，第46-53頁，1984年)中有所公開。
[0097]在一些方面,來源生物體為酵母,諸如酵母屬(Saccharomycessp.)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces sp.)、畢赤酵母屬(Pichia sp.)或假絲酵母屬(Candida sp.)。
[0098]在一些方面，來源生物體為細菌，諸如芽孢桿菌屬(Bacillus)的菌株，諸如地衣芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌；泛菌屬(Pantoea)的菌株，諸如檸檬假交替單胞菌；假單胞菌屬(Pseudomonas)的菌株，諸如產鹼假單胞菌；鏈黴菌屬(Streptomyces)的菌株，諸如變鉛青鏈黴菌或鏽赤鏈黴菌(S.rubiginosus);嗜熱藍藻屬(Thermosynechococcus)的菌株，諸如T.elongatus ;中華根瘤菌屬(Sinorhizobium)的菌株,諸如苜猜中華根瘤菌(S.meliloti);螺桿菌屬(Helicobacter)的菌株，諸如幽門螺旋桿菌(H.pylori)；農桿菌屬(Agrobacterium)的菌株，諸如根癌農桿菌(A.tumefaciens);異常球菌屬(Deinococcus)的菌株，諸如耐福射異常球菌(D.radiodurans);李斯特氏菌屬(Listeria)的菌株，諸如單核細胞增生李斯特菌(L.monocytogenes);乳桿菌屬(Lactobacillus)的菌株，諸如L.spp ;或者埃希桿菌屬(Escherichia)的菌株,諸如大腸桿菌。
[0099]本文所用的「芽孢桿菌屬」包括本領域技術人員已知的「芽孢桿菌屬」內的所有種，包括但不限於枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜鹼芽孢桿菌、解澱粉芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、耐鹽芽孢桿菌、巨大芽包桿菌、凝結芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌和蘇雲金芽孢桿菌。應該認識到，還在繼續對芽孢桿菌屬進行分類學整理。因此，意在使該屬包括已經重新分類的種，包括但不限於諸如現在命名為「嗜熱脂肪地芽孢桿菌(Geobacillus stearothermophilus)」的嗜熱脂肪芽孢桿菌之類的生物體。在存在氧氣的情況下抗性內生孢子的產生被視為芽孢桿菌屬的定義性特徵，但該特性還適用於最近命名的脂環酸芽孢桿菌屬(Alicyclobacillus)、雙芽孢桿菌屬(Amphibacillus)、解硫胺素芽孢桿菌屬(Aneurinibacillus)、厭氧芽孢桿菌屬(Anoxybacillus)、短芽抱桿菌屬(Brevibacillus)、線芽抱桿菌屬(Filobacillus)、薄壁芽孢桿菌屬(Gracilibacillus)、嗜鹽芽孢桿菌屬(Halobacillus)、類芽孢桿菌屬(Paerlibacillus)、鹽芽抱桿菌屬(Salibacillus)、熱芽抱桿菌屬(Thermobacillus)、服芽抱桿菌屬(Ureibaci llus)和枝芽抱桿菌屬(Virgibacillus)。
[0100]在一些方面，來源生物體為革蘭氏陽性細菌。非限制性例子包括鏈黴菌屬的菌株(如變鉛青鏈黴菌、天藍色鏈黴菌或灰色鏈黴菌)、芽孢桿菌屬的菌株、李斯特氏菌屬的菌株(如單核細胞增生李斯特菌)或乳桿菌屬的菌株(如L.spp)。在一些方面，來源生物體為革蘭氏陰性細菌，諸如大腸桿菌、假單胞菌或幽門螺旋桿菌。
[0101]在一些方面，來源生物體為植物，諸如來自豆科的植物，諸如蝶形花亞科。在一些方面，來源生物體為葛根、楊樹(諸如Populus alba xtremula CAC35696)、白楊類(諸如山楊)、英國櫟、擬南芥屬(Arabidopsis)(諸如阿拉伯芥(A.thaliana))或玉蜀黍屬(Zea)(諸如玉米(Z.mays))。
[0102]在一些方面，來源生物體為藻類，諸如綠藻、紅藻、灰胞藻門(glaucophyte)、chlorarachniophyte、鞭毛蟲、色藻界(chromista)或溝鞭藻類。
[0103]在一些方面，來源生物體為藍細菌，諸如基於形態學分類成以下任何族的藍細菌:色球藻目(Chroococcales)、寬球藻目(Pleurocapsales)、_ 藻目(Oscillatoriales)、念珠藻目(Nostocales)或真枝藻目(Stigonematales)。在一些方面，藍細菌為Thermosynechococcus elongates。
[0104]示例件宿豐細朐
[0105]多種宿主細胞可在受權利要求書保護的本發明的方法中用於表達鐵-硫簇相互作用氧化還原多肽、DXP途徑多肽、DXP途徑相關多肽、MVA途徑多肽、MVA途徑相關多肽、異戊二烯合酶多肽或IDI多肽並產生異戊二烯。示例性宿主細胞包括來自標題為「示例性來源生物體」的前面部分中所列出的任何生物體的細胞。宿主細胞可以是天然產生異戊二烯的細胞或不會天然產生異戊二烯的細胞。在一些方面，宿主細胞使用DXP途徑和異戊二烯合酶天然產生異戊二烯，並將一種或多種DXP途徑多肽和鐵-硫簇相互作用氧化還原多肽加入以使用該途徑提高異戊二烯的產量。在一些方面，宿主細胞使用DXP途徑和異戊二烯合酶天然產生異戊二烯，並將一種或多種DXP途徑核酸、一種或多種鐵-硫簇相互作用氧化還原核酸和IDI加入以使用該途徑提高異戊二烯的產量。
[0106]因此，本領域的技術人員將認識到，可對表達載體進行設計，以便包含優化某些宿主菌株的基因表達的某些組分。此類優化組分包括但不限於複製起點、啟動子和增強子。本文引用的載體和組分僅出於示例性目的進行描述，且不旨在縮小本發明的範圍。
[0107]可用於異源表達基因的任何細胞或其子代均可在本文的受權利要求書保護的本發明的方法中用於表達鐵-硫簇相互作用氧化還原多肽、DXP途徑多肽、DXP途徑相關多肽、MVA途徑多肽、MVA途徑相關多肽、異戊二烯合酶多肽或IDI多肽並產生異戊二烯。在一些實施例中，宿主細胞為革蘭氏陽性細菌。非限制性例子包括鏈黴菌屬的菌株(如變鉛青鏈黴菌、天藍色鏈黴菌或灰色鏈黴菌)、芽孢桿菌屬的菌株、李斯特氏菌屬的菌株(如單核細胞增生李斯特菌)或乳桿菌屬的菌株(如L.Spp)。在一些實施例中，來源生物體為革蘭氏陰性細菌，諸如大腸桿菌、假單胞菌或幽門螺旋桿菌。在某些實施例中，大腸桿菌宿主細胞可在受權利要求書保護的本發明的方法中用於表達一種或多種鐵-硫簇相互作用氧化還原多肽、DXP途徑多肽、DXP途徑相關多肽、MVA途徑多肽、MVA途徑相關多肽、異戊二烯合酶多肽或IDI多肽並產生異戊二烯。
[0108]包括革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細菌的細菌細胞可用於表達上文所述的任何異源基因。具體地講，檸檬假交替單胞菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜鹼芽孢桿菌、解澱粉芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、耐鹽芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、蘇雲金芽孢桿菌、白色鏈黴菌、變鉛青鏈黴菌、天藍色鏈黴菌、灰色鏈黴菌、假單胞菌和產鹼假單胞菌細胞中的任何一者O
[0109]存在許多類型的可在本發明的組合物和方法中用作宿主細胞的厭氧細胞。在本發明的一個方面，在本文所述的任何組合物或方法中所述的細胞為專性厭氧細胞及其子代。專性厭氧菌在存在氧的條件下通常生長不良，或根本不生長。應當理解，可以存在少量的氧，也就是說，存在專性厭氧菌對低水平氧的一定耐受度。在一個方面，經工程改造以產生甲羥戊酸、類異戊二烯前體、異戊二烯和類異戊二烯的專性厭氧菌可作為本文所述的任何方法和/或組合物的宿主細胞，並在基本上無氧的條件下生長，其中氧的存在量對厭氧菌的生長、維持和/或發酵無害。
[0110]在本發明的另一方面，在本文所述的任何組合物或方法中所述和/或所用的宿主細胞為兼性厭氧細胞及其子代。兼性厭氧菌可在存在氧時通過有氧呼吸(例如利用TCA循環)生成細胞ATP。然而，兼性厭氧菌也可在不存在氧的情況下生長。這與在存在較高氧含量下死亡或生長不良的專性厭氧菌形成對照。在一個方面，因此，兼性厭氧菌可作為本文提供的任何組合物和/或方法的宿主細胞，並可經工程改造以產生甲羥戊酸、類異戊二烯前體、異戊二烯和類異戊二烯。兼性厭氧宿主細胞可在基本上無氧的條件下生長，其中氧的存在量對厭氧菌的生長、維持和/或發酵無害，或者作為另外一種選擇可在存在較高氧含量的情況下生長。
[0111]宿主細胞另外可以為絲狀真菌細胞及其子代。(參見例如Berka & Barnett，Biotechnology Advances, (1989),7(2): 127-154 (Berka 和 Barnett,《生物技術進展》，1989年，第7卷第2期，127-154頁))。在一些方面，絲狀真菌細胞可以為以下任何一者:長梗木黴(Trichoderma 1ngibrachiatum)、綠色木黴、康寧木黴、哈茨木黴、青黴屬、特異腐質黴、柔毛腐質黴、灰腐質黴、金孢黴屬、C.lucknowense、粘帚黴屬、麴黴菌(諸如米麴黴、黑麴黴、醬油麴黴、日本麴黴、構巢麴黴或泡盛麴黴)、鐮孢屬(諸如粉紅鐮孢、禾赤鐮孢、F.cerealis、尖孢鐮刀菌或F.venenatum)、脈孢菌屬(諸如粗糙脈孢菌)、肉座菌屬、毛黴屬(諸如米黑毛黴)、根黴屬或裸胞殼屬。在一些方面，真菌為構巢麴黴、泡盛麴黴、米麴黴、棘抱麴黴、黑麴黴、日本麴黴、裡氏木黴、綠色木黴、尖抱鍵刀囷或腐皮鍵抱黴。在某些實施例中，用於本文的質粒或質粒組分包括在美國專利公布N0.US2011/0045563中所述的那些。
[0112]宿主細胞也可以為酵母，諸如酵母屬、裂殖酵母屬、畢赤酵母屬或假絲酵母屬。在一些方面，酵母屬為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(參見例如Romanos et al.,Yeast, (1992) ,8(6):423-488 (Romanos 等人，《酵母》，1992 年，第 8 卷第 6 期，第 423-488頁))。在某些實施例中，用於本文的質粒或質粒組分包括在美國專利No，7，659，097和美國專利公布N0.US2011/0045563中所述的那些。
[0113]宿主細胞還可以為藻類的種,諸如綠藻、紅藻、灰胞藻門、chlorarachniophyte、鞭毛蟲、色藻界或溝鞭藻類。(參見例如 Saunders & Warmbrodt,「Gene Expression in Algaeand Fungi, Including Yeast,，，(1993), National Agricultural Librarw, Beltsville,MD (Saunders和Warmbrodt,《藻類和真菌(包括酵母)中的基因表達》，1993年，馬裡蘭州貝爾茨維爾美國國家農業圖書館))。在某些實施例中，用於本文的質粒或質粒組分包括在美國專利公布N0.US2011/0045563中所述的那些。在一些方面，宿主細胞為藍細菌，諸如基於形態學分類成以下任何族的藍細菌:色球藻目、寬球藻目、顫藻目、念珠藻目或真枝藻目(參見例如 Lindberg et al., Metab.Eng., (2010) 12 (I):70-79 (Lindberg 等人，《代謝工程》，2010年，第12卷第I期，第70-79頁))。在某些實施例中，用於本文的質粒或質粒組分包括在美國專利公布N0.US2010/0297749、US2009/0282545和國際專利申請N0.W02011/034863中所述的那些。
[0114]示例性轉化方法
[0115]IspG核酸、鐵-硫簇相 互作用氧化還原核酸、DXP途徑核酸、DXP途徑相關核酸、異戊二烯合酶核酸或IDI核酸或包含它們的載體可使用本領域的技術人員已知的標準技術插入宿主細胞(如本文所述的大腸桿菌細胞、藻類細胞、植物細胞、真菌細胞、酵母細胞或細菌細胞)。引入的核酸可整合進染色體DNA內或維持為染色體外複製型序列。
[0116]另外的宿主細胞突變
[0117]在本文所述的重組細胞還包含一種或多種MVA途徑多肽的某些實施例中，本發明還設想了通過MVA途徑增加碳通量的某些宿主細胞突變。在另一個實施例中，本發明設想了通過DXP途徑增加碳通量的某些宿主細胞突變。在另一個實施例中，本發明設想了通過DXP和MVA途徑增加碳通量的某些宿主細胞突變。通過增加碳流量，可以產生更多的異戊二烯。在某些實施例中，如本文所述的重組細胞還可經工程改造以增加朝向甲羥戊酸產生的碳通量，其中調節一種或多種選自以下的酶的活性:(a)檸檬酸合酶；(b)磷酸轉乙醯酶；(C)乙酸激酶；(d)乳酸脫氫酶；(e)NADP依賴性蘋果酸酶；以及(f)丙酮酸脫氫酶。
[0118]檸檬酸合酶途徑
[0119]檸檬酸合酶催化草醯乙酸和乙醯輔酶A的縮合以形成檸檬酸，其為三羧酸(TCA)循環的代謝物(Ner，S.et al.1983.Biochemistry22:5243-5249 (Ner, S.等人，1983 年，《生物化學》，第 22 卷，第 5243-5249 頁)；Bhayana, V.and Duckworth, H.1984.Biochemistry23:2900-2905 (Bhayana, V.和 Duckworth，H.，1984 年，《生物化學》，第 23 卷，第 2900-2905 頁))(圖5)。在大腸桿菌中，這種由gltA編碼的酶在表現上與二聚亞單元的三聚體相似。六聚形式允許酶由NADH別構調節。該酶已得到了廣泛研究(Wiegand, G., and Remington,S.1986.Annual Rev.Biophysics Biophys.Chem.15:97-117(Wiegand,G.和Remington, S.,1986年，《生物物理化學年評》,第15卷，第97-117頁)；Duckworth et al.1987.BiochemSoc Symp.54:83-92 (Duckworth等人，1987年，《生物化學社會研討會》,第54卷,第83-92頁)；Stockell, D.et al.2003.J.Biol.Chem.278:35435-43 (Stockell, D.等人，2003 年，《生物化學雜誌》，第 278 卷，第 35435-35443 頁)；Maurus, R.et al.2003.Biochemistry.42:5555-5565 (Maurus, R.等人，2003年，《生物化學》，第42卷，第5555-5565頁))。為了避免NADH產生的別構抑制，已考慮了通過枯草芽孢桿菌NADH非敏感性檸檬酸合酶進行替換或補充(Underwood et al.2002.Appl.Environ.Microbiol.68:1071-1081 (Underwood 等人，2002年，《應用與環境微生物》，第68卷，第1071-1081頁)；Sanchez et al.2005.Met.Eng.7:229-239 (Sanchez 等人，2005 年，《代謝工程》，第 7 卷，第 229-239 頁))。
[0120]由檸檬酸合酶催化的反應直接與催化甲羥戊酸途徑第一步的硫解酶競爭，因為它們都以乙醯輔酶 A 作為底物(Hedl et al.2002.J.Bact.184:2116-2122 (Hedl 等人，2002年，《細菌學雜誌》，第184卷，第2116-2122頁))。因此，本領域的技術人員可以調節檸檬酸合酶的表達(如，降低酶活性)以允許更多的碳流入甲羥戊酸途徑，從而增加甲羥戊酸和異戊二烯的最終產量。檸檬酸合酶活性降低可以是與未進行操縱時相比，比活性或總活性降低任何量。在一些情況下，酶活性的降低為降低至少約I %、2 %、3 %、4 %、5 %、6 %、7%,8%,9% ,10% ,15%,20%,25%,30%,35%,35%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%。在一些方面，檸檬酸合酶的活性通過降低內源檸檬酸合酶基因的活性而進行調節。這可通過以下方式實現:將內源檸檬酸合酶基因用編碼NADH非敏感性檸檬酸合酶的轉基因進行染色體替換，或使用源自枯草芽孢桿菌的編碼NADH非敏感性檸檬酸合酶的轉基因。檸檬酸合酶的活性還可以通過將內源檸檬酸合酶基因啟動子替換為合成的組成型低表達啟動子而進行調節(如，降低)。檸檬酸合酶活性的降低可導致與不具有降低的檸檬酸合酶表達的微生物相比更多的碳流入甲羥戊酸依賴性生物合成途徑。
[0121]涉及磷酸轉乙醯酶和/或乙酸激酶的途徑
[0122]憐酸轉乙酸酶(pta)(Shimizu et al.1969.Biochim.Biophys.Actal91:550-558 (Shimizu等人，《生物化學與生物物理學學報》，第191卷，第550-558頁，1969年))催化乙醯輔酶A與乙醯磷酸(acetyl-P)之間的可逆轉化,而乙酸激酶(ackA) (Kakuda,H.etal.1994.J.Biochem.11:916-922 (Kakuda，H.等人，1994 年，《生物化學雜誌》，第 11 卷，第916-922頁))則使用acetyl-P形成乙酸。這些基因可在大腸桿菌中作為操縱子而轉錄。它們一起催化乙酸的異化，同時釋放ATP。因此，本領域的技術人員可通過降低磷酸轉乙醯酶基因(如內源磷酸轉乙醯酶基因)和/或乙酸激酶基因(如內源乙酸激酶基因)的活性而增加可用乙醯輔酶A的量。一種實現降低的方式是缺失磷酸轉乙醯酶(pta)和/或乙酸激酶(ackA)。這可通過以下方式實現:將一個或兩個基因替換為氯黴素表達盒，然後將該表達盒環出(looping out)。乙酸由大腸桿菌因多種原因而產生(Wolfe, A.2005.Microb.Mol.Biol.Rev.69: 12-50 (Wolfe, A，2005年，《微生物學與分子生物學評論》，第69卷，第12-50頁))。不受理論的約束，由於ackA-pta使用乙醯輔酶A，因此缺失這些基因可能使碳不轉向乙酸，並從而增加甲羥戊酸或異戊二烯的產率。
[0123]在一些方面，重組微生物與不具有降低的內源磷酸轉乙醯酶基因和/或內源乙酸激酶基因表達的微生物相比產生量減少的乙酸。所產生乙酸的量的減少可通過本領域技術人員已知的常規測定法進行測量。乙酸減少的量與未進行分子操縱時相比為至少約1%、2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9% ,10% ,15%,20%, 25%,30%,35%,35%,40%,45%,50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%。
[0124]磷酸轉乙醯酶(pta)和/或乙酸激酶(ackA)的活性還可通過對酶進行其他分子操縱而降低。酶活性降低可以是與未進行操縱時相比，比活性或總活性降低任何量。在一些情況下，酶活性的降低為降低至少約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%,25%,30%,35%,35%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%、95%、96%、97%、98% 或 99%。
[0125]在一些情況下，降低內源磷酸轉乙醯酶基因和/或內源乙酸激酶基因的活性導致與不具有降低的內源磷酸轉乙醯酶基因和/或內源乙酸激酶基因表達的微生物相比更多的碳流入甲羥戊酸依賴性生物合成 途徑。
[0126]涉及乳酸脫氫酶的途徑
[0127]在大腸桿菌中，D-乳酸由丙酮酸通過乳酸脫氫酶(IdhA-圖5)產生(Bunch.P.etal.1997.Microbiol.143: 187-195 (Bunch, P.等人，1997 年，《微生物學》，第 143 卷，第187-195頁))。乳酸的產生伴隨NADH的氧化，因此，當氧被限制並且無法適應所有還原當量時，將產生乳酸。因此，乳酸的產生可能是碳消耗的源頭。因此，為了增加流向甲羥戊酸(和異戊二烯)產生的碳，本領域的技術人員可以調節乳酸脫氫酶的活性，諸如通過降低該酶的活性。
[0128]因此，在一個方面，乳酸脫氫酶的活性可通過降低內源乳酸脫氫酶基因的活性而進行調節。這種降低可以通過使內源乳酸脫氫酶基因缺失而實現。也可以使用本領域技術人員已知的降低乳酸脫氫酶基因活性的其他方式。通過操縱涉及乳酸脫氫酶的途徑，重組微生物與不具有降低的內源乳酸脫氫酶基因表達的微生物相比產生量減少的乳酸。所產生乳酸的量的減少可通過本領域技術人員已知的常規測定法進行測量。乳酸減少的量與未進行分子操縱時相比為至少約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%,30%,35%,35%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%、96%、97%、98% 或 99%。
[0129]乳酸脫氫酶的活性還可以通過對酶進行其他分子操縱而降低。酶活性降低可以是與未進行操縱時相比，比活性或總活性降低任何量。在一些情況下，酶活性的降低為降低至少約 I2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%,10%,15%,20%,25%,30%,35%,35%,40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或99%。
[0130]因此，在一些情況下，降低內源乳酸脫氫酶基因的活性導致與不具有降低的內源乳酸脫氫酶基因表達的微生物相比更多的碳流入甲羥戊酸依賴性生物合成途徑。
[0131]涉及蘋果酸酶的途徑
[0132]蘋果酸酶(在大腸桿菌中，為SfcA和maeB)是通過以下方程式催化蘋果酸轉化成丙酮酸(使用NAD+或NADP+)的回補酶:
[0133]
【權利要求】
1.一種能夠產生異戊二烯的重組細胞，所述細胞用以下核酸轉化:(i)編碼第一物種的第一 1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸合酶(IspG)多肽的核酸；(ii)編碼第二物種的第二 IspG多肽的核酸，其中所述第二物種不同於所述第一物種；(iii)編碼至少ー種DXP途徑酶的核酸以及(iv)編碼異戊二烯合酶多肽的核酸。
2.根據權利要求1所述的重組細胞，其中所述第一IspG多肽為T.elongatus IspG多肽。
3.根據權利要求1所述的重組細胞，其中所述第二IspG多肽為大腸桿菌IspG多肽。
4.根據權利要求1所述的重組細胞，其還包含編碼鐵-硫簇相互作用氧化還原多肽的核酸。
5.根據權利要求4所述的重組細胞，其中所述鐵-硫簇相互作用氧化還原多肽選自鐵氧還蛋白和黃素氧還蛋白。
6.根據權利要求1所述的重組細胞，其還包含編碼DXP途徑相關多肽的核酸。
7.根據權利要求6所述的重組細胞，其中所述DXP途徑相關多肽為分子伴侶蛋白。
8.根據權利要求1所述的重組細胞，其中所述細胞還包含編碼異戊烯基二磷酸5-異構酶(IDI)多肽的至少ー種異源核酸或編碼IDI多肽的內源核酸的至少ー個拷貝。
9.根據權利要求1所述的重組細胞，其中所述細胞還包含編碼MVA途徑多肽的至少ー種異源核酸或編碼MVA途徑多肽的內源核酸的至少ー個拷貝。
10.根據權利要求8所 述的重組細胞，其中所述細胞還包含編碼MVA途徑多肽的至少ー種異源核酸或編碼MVA途徑多肽的內源核酸的至少ー個拷貝。
11.根據權利要求1所述的重組細胞，其中所述異戊二烯合酶多肽為植物異戊二烯合酶多肽。
12.根據權利要求11所述的重組細胞，其中所述異戊二烯合酶多肽為來自葛屬或楊屬或雜交體 Populus alba x Populus tremula 的多妝。
13.根據權利要求11所述的重組細胞，其中所述異戊二烯合酶多肽選自葛麻姆或野葛、山楊、銀白楊、黑楊和毛果楊。
14.根據權利要求11所述的重組細胞，其中所述植物異戊二烯合酶多肽為葛根異戊二烯合酶多肽。
15.根據權利要求1所述的重組細胞，其中所述細胞為細菌、藻類、真菌或酵母細胞。
16.根據權利要求15所述的重組細胞，其中所述細胞為細菌細胞。
17.根據權利要求16所述的細菌細胞，其中所述細菌細胞為革蘭氏陽性細菌細胞或革蘭氏陰性細菌細胞。
18.根據權利要求17所述的細菌細胞，其中所述細菌細胞選自大腸桿菌、檸檬假交替單胞菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜鹼芽孢桿菌、解澱粉芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、耐鹽芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、蘇雲金芽孢桿菌、白色鏈黴菌、變鉛青鏈黴菌、天藍色鏈黴菌、灰色鏈黴菌、假單胞菌和產鹼假單胞菌細胞。
19.根據權利要求18所述的細菌細胞，其中所述細菌細胞為大腸桿菌細胞。
20.根據權利要求1所述的重組細胞，其中所述另外的DXP途徑酶選自DXS、DXR、MCT、CMK、MCS、HDR (IspH)和 IDI。
21.根據權利要求20所述的重組細胞，其中所述另外的DXP途徑酶選自DXS、DXR、HDR(IspH)和 IDI。
22.—種包含權利要求1所述的重組細胞的細胞培養物，其中所述細胞培養物產生至少約8.4g/l的異戊二烯。
23.—種包含權利要求10所述的重組細胞的細胞培養物，其中所述細胞培養物產生至少約8.4g/l的異戊二烯。
24.ー種產生異戊二烯的方法，所述方法包括:(a)將權利要求1所述的重組細胞在適於產生異戊二烯的條件下培養，以及(b)產生異戊二烯。
25.根據權利要求24所述的方法，其還包括回收所述異戊二烯。
26.根據權利要求24所述的方法，其中所述重組細胞產生多於約8.4g/l的異戊二烯。
27.—種產生異戊二烯的方法，所述方法包括:(a)將權利要求10所述的重組細胞在適於產生異戊二烯的條件下培養，以及(b)產生異戊二烯。
28.根據權利要求27所述的方法，其還包括回收所述異戊二烯。
29.根據權利 要求27所述的方法，其中所述重組細胞產生多於約8.4g/l的異戊二烯。
【文檔編號】C12N9/04GK103476926SQ201180068127
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2011年12月22日 優先權日:2010年12月22日
【發明者】R·E·穆爾, W·韋勒 申請人:丹尼斯科美國公司, 固特異輪胎和橡膠公司