脫氫酶活性提高的阿馬多裡酶的製作方法

2023-04-25 03:43:11 3

本發明涉及一種脫氫酶活性提高的阿馬多裡酶(amadoriase)、氧化酶活性降低的阿馬多裡酶、脫氫酶活性提高且氧化酶活性降低的阿馬多裡酶、其基因和重組dna以及該阿馬多裡酶的製備方法。此外本發明涉及可有效用於作為糖尿病的診斷用酶、傳感器、以及糖尿病標記物的測定試劑盒的阿馬多裡酶。

背景技術：

糖化蛋白是葡萄糖等醛糖(潛在地具有醛基的單糖及其衍生物)的醛基與蛋白質的氨基以非酶的方式形成共價鍵並通過阿馬多裡重排而產生的。作為蛋白質的氨基，可舉出氨基末端的α氨基、蛋白質中賴氨酸殘基側鏈的ε氨基。作為在生物體內產生的糖化蛋白，已知有血液中的血紅蛋白被糖化的糖化血紅蛋白、白蛋白被糖化的糖化白蛋白等。

這些生物體內產生的糖化蛋白中，作為在糖尿病的臨床診斷領域用於糖尿病患者的診斷及症狀管理的重要的血糖控制標記物，糖化血紅蛋白(hba1c)越來越受到關注。血液中的hba1c濃度可反映過去一定期間的平均血糖值，其測定值在糖尿病症狀的診斷及管理中已成為重要的指標。

作為快速簡便的測定該hba1c的方法，提出有使用阿馬多裡酶的酶方法，即用蛋白酶等分解hba1c，對從其β鏈氨基末端游離的α-果糖基纈氨醯基組氨酸(下面表示為「αfvh」)或者α-果糖基纈氨酸(下面表示為「αfv」)進行定量的方法(例如，參照專利文獻1～7)。實際上，在從hba1c切出αfv的方法中，存在著受雜質等的影響很大，不能獲得準確測定值的問題，出於獲得更準確測定值的目的，特別是現在測定αfvh的方法已成為主流。

阿馬多裡酶催化如下反應：在氧存在下，將亞氨基二乙酸或其衍生物(也稱為「阿馬多裡化合物」)氧化而生成乙醛酸或α-酮醛、胺基酸或肽和過氧化氫。

阿馬多裡酶發現於細菌、酵母、真菌中，作為特別是對hba1c測定有用的具有對αfvh和/或αfv的酶活性的阿馬多裡酶，例如，報告有來源於錐毛殼(coniochaeta)屬、正青黴(eupenicillium)屬、棘殼孢(pyrenochaeta)屬、節菱孢(arthrinium)屬、彎孢(curvularia)屬、新赤殼(neocosmospora)屬、隱球菌(cryptococcus)屬、暗球腔菌(phaeosphaeria)屬、麴黴(aspergillus)屬、裸孢殼(emericella)屬、細基格孢(ulocladium)屬、青黴(penicillium)屬、鐮刀菌((fusarium)屬、achaetomiella屬、無毛毛殼(achaetomium)屬、梭孢殼(thielavia)屬、毛殼(chaetomium)屬、五穀麻孢殼(gelasinospora)屬、小囊菌(microascus)屬、小球腔菌(leptosphaeria)屬、蛇孢腔菌(ophiobolus)屬、格孢腔菌(pleospora)屬、閉毛孢殼(coniochaetidium)屬、畢赤酵母(pichia)屬、棒狀桿菌(corynebacterium)屬、土壤桿菌(agrobacterium)屬、節桿菌(arthrobacter)屬的阿馬多裡酶(例如，參照專利文獻1、6～15、非專利文獻1～11)。予以說明，上述報告例中，阿馬多裡酶因文獻不同而有被記載為酮胺氧化酶及果糖基胺基酸氧化酶、果糖基肽氧化酶、果糖基胺氧化酶等的情況。

阿馬多裡酶可以通過與過氧化物酶共軛，利用顯色底物而用於測定樣品中的糖化底物。現有的阿馬多裡酶在氧化糖化底物時，能夠向氧分子傳遞電子。該活性稱為氧化酶活性。如果降低酶的氧化酶活性並增加脫氫酶活性，則可以代替氧分子使用電子受體(電子媒介體)作為電子受體。通過代替氧分子而使用電子受體，能夠不受氧氣的影響進行測定。

公知文獻中可見到公開了關於阿馬多裡酶的脫氫酶活性提高：例如，通過將來源於phaeosphaerianodorum的果糖基胺基酸氧化酶的56位天冬醯胺取代為丙氨酸，顯示出相對於脫氫酶活性中αfv的vmax/km提高2.3倍(參照專利文獻16)。但是，公開的突變體相對於氧化酶活性中αfv的vmax/km與野生型相比提高1.2倍，因此認為依然受到了氧氣的影響。

現有技術文獻

專利文獻

專利文獻1：國際公開第2004/104203號

專利文獻2：國際公開第2005/49857號

專利文獻3：日本特開2001-95598號公報

專利文獻4：日本特公平05-33997號公報

專利文獻5：日本特開平11-127895號公報

專利文獻6：國際公開第97/13872號

專利文獻7：日本特開2011-229526號公報

專利文獻8：日本特開2003-235585號公報

專利文獻9：日本特開2004-275013號公報

專利文獻10：日本特開2004-275063號公報

專利文獻11：日本特開2010-35469號公報

專利文獻12：日本特開2010-57474號公報

專利文獻13：國際公開第2010/41715號

專利文獻14：國際公開第2010/41419號

專利文獻15：國際公開第2011/15325號

專利文獻16：日本特表2013-500729號公報

非專利文獻

非專利文獻1：biochem.biophys.res.commun.311,104-11,2003

非專利文獻2：biotechnol.bioeng.106,358-66,2010

非專利文獻3：j.biosci.bioeng.102,241-3,2006

非專利文獻4：eur.j.biochem.242,499-505,1996

非專利文獻5：arch.microbiol.178,344-50,2002

非專利文獻6：mar.biotechnol.6,625-32,2004

非專利文獻7：biosci.biotechnol.biochem.59,487-91,1995

非專利文獻8：appl.microbiol.biotechnol.74,813-819,2007

非專利文獻9：biosci.biotechnol.biochem.66,1256-61,2002

非專利文獻10：biosci.biotechnol.biochem.66,2323-29,2002

非專利文獻11：biotechnol.letters27,27-32,2005

技術實現要素：

發明所要解決的問題

本發明的目的在於提供氧化酶活性降低、脫氫酶活性增強的阿馬多裡酶。此外本發明的目的還在於提供活性幾乎不受溶解氧水平影響的阿馬多裡酶。

解決問題的技術方案

目前的現狀是幾乎沒有公開的用於酶的氧化酶活性降低及賦予脫氫酶活性的信息，在這樣的情況中，本發明人進行了反覆專心研究，結果發現了對於來源於錐毛殼屬的阿馬多裡酶，通過導入特定的胺基酸殘基的取代，能夠解決上述問題，從而完成了本發明。

即，本發明包含如下內容。

[1]一種阿馬多裡酶，其為氧化酶活性相對於脫氫酶活性的比率(ox/dh)與修飾前的阿馬多裡酶相比發生降低的修飾阿馬多裡酶，所述修飾阿馬多裡酶為如下的阿馬多裡酶：

(i)在將阿馬多裡酶的胺基酸序列與序列號1中記載的胺基酸序列進行比對時，序列號1所示的胺基酸序列中選自由280位、267位、269位、54位和241位構成的組的位置所對應位置的1個以上的胺基酸被取代，且具有脫氫酶活性的阿馬多裡酶；

(ii)所述(i)的阿馬多裡酶中，序列號1所示的胺基酸序列中280位、267位、269位、54位和241位所對應位置以外的位置的1個或更多個胺基酸由被取代、缺失或添加的胺基酸序列組成，且具有脫氫酶活性的阿馬多裡酶；

(iii)所述(i)的阿馬多裡酶中，該阿馬多裡酶的全長胺基酸序列與序列號1、序列號3、序列號6、序列號9、序列號10、序列號11、序列號44、序列號53或序列號67的胺基酸序列有70％以上的序列同源性，由序列號1的第10位～32位、36～41位、49～52位、54～58位、63～65位、73～75位、84～86位、88～90位、120～122位、145～150位、156～162位、164～170位、180～182位、202～205位、207～211位、214～224位、227～230位、236～241位、243～248位、258～261位、266～268位、270～273位、275～287位、295～297位、306～308位、310～316位、324～329位、332～334位、341～344位、346～355位、357～363位、370～383位、385～387位、389～394位、405～410位和423～431位的胺基酸序列組成的同源性區域中的胺基酸序列與該阿馬多裡酶的對應位置的同源性區域中的胺基酸序列有90％以上的序列同源性，且具有脫氫酶活性的阿馬多裡酶；或者

(iv)所述(i)的阿馬多裡酶中，該阿馬多裡酶的全長胺基酸序列與序列號1、序列號3、序列號6、序列號9、序列號10、序列號11、序列號44、序列號53或序列號67的胺基酸序列有80％以上的序列同源性，且具有脫氫酶活性的阿馬多裡酶。

[2]如1所述的阿馬多裡酶，其為如下的阿馬多裡酶：

序列號1所示的胺基酸序列中280位所對應位置的胺基酸被取代為選自由穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸和天冬醯胺構成的組的極性胺基酸；選自由天冬氨酸、穀氨酸、賴氨酸、精氨酸和組氨酸構成的組的帶電胺基酸；或者選自由甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸構成的組的胺基酸；

序列號1所示的胺基酸序列中267位所對應位置的胺基酸被取代為甲硫氨酸、亮氨酸、酪氨酸、異亮氨酸、色氨酸、纈氨酸或丙氨酸；

序列號1所示的胺基酸序列中269位所對應位置的胺基酸被取代為甲硫氨酸、亮氨酸、酪氨酸、異亮氨酸、色氨酸、纈氨酸或丙氨酸；

序列號1所示的胺基酸序列中54位所對應位置的胺基酸被取代為選自由天冬醯胺、丙氨酸、穀氨醯胺、組氨酸、甘氨酸或纈氨酸構成的組的胺基酸；或者

序列號1所示的胺基酸序列中241位所對應位置的胺基酸被取代為選自由穀氨醯胺、賴氨酸、穀氨酸、天冬醯胺、精氨酸、天冬氨酸或組氨酸構成的組的胺基酸。

[3]如2所述的阿馬多裡酶，其為如下的阿馬多裡酶：

序列號1所示的胺基酸序列中280位所對應位置的胺基酸被取代為穀氨醯胺、絲氨酸、組氨酸、蘇氨酸、天冬醯胺、天冬氨酸、穀氨酸、賴氨酸、精氨酸或甲硫氨酸；

序列號1所示的胺基酸序列中267位所對應位置的胺基酸被取代為甲硫氨酸、亮氨酸、酪氨酸、異亮氨酸或色氨酸；

序列號1所示的胺基酸序列中269位所對應位置的胺基酸被取代為甲硫氨酸、亮氨酸、酪氨酸、異亮氨酸或色氨酸；

序列號1所示的胺基酸序列中54位所對應位置的胺基酸被取代為天冬醯胺或丙氨酸；或者

序列號1所示的胺基酸序列中241位所對應位置的胺基酸被取代為穀氨醯胺、穀氨酸或賴氨酸。

[4]如3所述的阿馬多裡酶，其為如下的阿馬多裡酶：

序列號1所示的胺基酸序列中280位所對應位置的胺基酸被取代為穀氨醯胺、絲氨酸、組氨酸、蘇氨酸、天冬醯胺、天冬氨酸、穀氨酸、賴氨酸、精氨酸或甲硫氨酸；

序列號1所示的胺基酸序列中267位所對應位置的胺基酸被取代為甲硫氨酸、亮氨酸或酪氨酸；

序列號1所示的胺基酸序列中269位所對應位置的胺基酸被取代為甲硫氨酸、亮氨酸或酪氨酸；

序列號1所示的胺基酸序列中54位所對應位置的胺基酸被取代為天冬醯胺或丙氨酸；或者

序列號1所示的胺基酸序列中241位所對應位置的胺基酸被取代為穀氨醯胺、穀氨酸或賴氨酸。

[5]如3所述的阿馬多裡酶，其為如下的阿馬多裡酶：

序列號1所示的胺基酸序列中280位所對應位置的胺基酸被取代為穀氨醯胺或絲氨酸；

序列號1所示的胺基酸序列中267位所對應位置的胺基酸被取代為甲硫氨酸、亮氨酸或酪氨酸；

序列號1所示的胺基酸序列中269位所對應位置的胺基酸被取代為甲硫氨酸、亮氨酸或酪氨酸；或者

序列號1所示的胺基酸序列中241位所對應位置的胺基酸被取代為穀氨醯胺。

[6]如3所述的阿馬多裡酶，其為如下的阿馬多裡酶：

序列號1所示的胺基酸序列中280位所對應位置的胺基酸被取代為穀氨醯胺或組氨酸；

序列號1所示的胺基酸序列中267位所對應位置的胺基酸被取代為甲硫氨酸或亮氨酸；或者

序列號1所示的胺基酸序列中269位所對應位置的胺基酸被取代為甲硫氨酸或亮氨酸。

[7]如3所述的阿馬多裡酶，其為如下的阿馬多裡酶：

序列號1所示的胺基酸序列中280位所對應位置的胺基酸被取代為穀氨醯胺；

序列號1所示的胺基酸序列中267位所對應位置的胺基酸被取代為甲硫氨酸或亮氨酸；或者

序列號1所示的胺基酸序列中269位所對應位置的胺基酸被取代為甲硫氨酸或亮氨酸。

[8]如1～7中任意一項所述的阿馬多裡酶，其氧化酶活性相對於脫氫酶活性的比率(ox/dh)與修飾前的阿馬多裡酶(100％)相比，降低至小於80％。

[9]如1～8中任意一項所述的阿馬多裡酶，其中，所述阿馬多裡酶來源於錐毛殼(coniochaeta)屬、正青黴(eupenicillium)屬、棘殼孢(pyrenochaeta)屬、節菱孢(arthrinium)屬、彎孢(curvularia)屬、新赤殼(neocosmospora)屬、隱球菌(cryptococcus)屬、暗球腔菌(phaeosphaeria)屬、麴黴(aspergillus)屬、裸孢殼(emericella)屬、細基格孢(ulocladium)屬、青黴(penicillium)屬、鐮刀菌(fusarium)屬、achaetomiella屬、無毛毛殼(achaetomium)屬、梭孢殼(thielavia)屬、毛殼(chaetomium)屬、五穀麻孢殼(gelasinospora)屬、小囊菌(microascus)屬、小球腔菌(leptosphaeria)屬、蛇孢腔菌(ophiobolus)屬、格孢腔菌(pleospora)屬、閉毛孢殼(coniochaetidium)屬、畢赤酵母(pichia)屬、德巴利酵母(debaryomyces)屬、棒狀桿菌(corynebacterium)屬、土壤桿菌(agrobacterium)屬或節桿菌(arthrobacter)屬。

[10]如1～9中任意一項所述的阿馬多裡酶，其具有序列號1、序列號3、序列號4、序列號5、序列號6、序列號7、序列號8、序列號9、序列號10、序列號11、序列號12、序列號13、序列號44、序列號53或序列號67所示的胺基酸序列，並具有1～7中任意一項規定的胺基酸取代。

[11]如1～10中任意一項所述的阿馬多裡酶，在將阿馬多裡酶的胺基酸序列與序列號1中記載的胺基酸序列進行比對時，所述阿馬多裡酶在序列號1所示的胺基酸序列中選自由如下構成的組的位置所對應位置上進一步有1個以上的胺基酸取代或缺失，且具有脫氫酶活性，

(a)62位、63位、102位、106位、110位、113位、355位、419位、68位和356位；

(b)262位、257位、249位、253位、337位、340位、232位、129位、132位、133位、44位、256位、231位和81位；以及

(c)羧基末端的435位、436位和437位缺失3個胺基酸殘基。

[12]如11所述的阿馬多裡酶，在將阿馬多裡酶的胺基酸序列與序列號1中記載的胺基酸序列進行比對時，所述阿馬多裡酶在序列號1所示的胺基酸序列中選自由如下構成的組的位置所對應位置的1個以上的胺基酸進一步被取代為選自由如下構成的組的胺基酸或缺失，且具有脫氫酶活性，

(a)62位精氨酸所對應位置的胺基酸被取代為丙氨酸、天冬醯胺或天冬氨酸、

63位亮氨酸所對應位置的胺基酸被取代為組氨酸或丙氨酸、

102位穀氨酸所對應位置的胺基酸被取代為賴氨酸、

106位天冬氨酸所對應位置的胺基酸被取代為丙氨酸、賴氨酸或精氨酸、

110位穀氨醯胺所對應位置的胺基酸被取代為亮氨酸或酪氨酸、

113位丙氨酸所對應位置的胺基酸被取代為賴氨酸或精氨酸、

355位丙氨酸所對應位置的胺基酸被取代為絲氨酸、

419位丙氨酸所對應位置的胺基酸被取代為賴氨酸、

68位天冬氨酸所對應位置的胺基酸被取代為天冬醯胺、

356位丙氨酸所對應位置的胺基酸被取代為蘇氨酸；

(b)262位天冬醯胺所對應位置的胺基酸被取代為組氨酸、

257位纈氨酸所對應位置的胺基酸被取代為半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、

249位穀氨酸所對應位置的胺基酸被取代為賴氨酸、精氨酸、

253位穀氨酸所對應位置的胺基酸被取代為賴氨酸、精氨酸、

337位穀氨醯胺所對應位置的胺基酸被取代為賴氨酸、精氨酸、

340位穀氨酸所對應位置的胺基酸被取代為脯氨酸、

232位天冬氨酸所對應位置的胺基酸被取代為賴氨酸、精氨酸、

129位天冬氨酸所對應位置的胺基酸被取代為賴氨酸、精氨酸、

132位天冬氨酸所對應位置的胺基酸被取代為賴氨酸、精氨酸、

133位穀氨酸所對應位置的胺基酸被取代為丙氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸、精氨酸、

44位穀氨酸所對應位置的胺基酸被取代為脯氨酸、

256位甘氨酸所對應位置的胺基酸被取代為賴氨酸、精氨酸、

231位穀氨酸所對應位置的胺基酸被取代為賴氨酸、精氨酸、

81位穀氨酸所對應位置的胺基酸被取代為賴氨酸、精氨酸；以及

(c)435位脯氨酸、436位賴氨酸和437位亮氨酸所對應位置的羧基末端缺失3個胺基酸。

[13]一種hba1c測定試劑盒，其包含1～12中任意一項所述的阿馬多裡酶。

[14]一種酶電極，其包含1～12中任意一項所述的阿馬多裡酶。

[15]一種酶傳感器，其具有如14所述的酶電極作為工作電極。

[16]一種hba1c的測定方法，其使用1～12中任意一項所述的阿馬多裡酶、如14所述的酶電極或15所述的酶傳感器和電子媒介體。

本說明書包含了本申請的優先權文件日本專利申請號2014-217405的公開內容。

發明效果

根據本發明，能夠提供一種不易受氧氣的影響，還可以作為高靈敏度測定的糖尿病診斷用酶，此外在糖尿病標記物測定用傳感器中使用的優異的阿馬多裡酶，以及提供編碼該酶的基因等。如果使用該阿馬多裡酶，則在氧氣存在下也能夠更準確地進行糖化血紅蛋白的測定。

附圖說明

圖1-1是示例各種公知的阿馬多裡酶的胺基酸序列的同源性和相似胺基酸的圖。除了co、et、py、ar、cc、nv之外，還比對了cn、pn、an、en、ul和pj。

圖1-2是圖1-1的續圖。

圖1-3是圖1-2的續圖。

圖1-4是圖1-3的續圖。

圖1-5是圖1-4的續圖。

圖2表示阿馬多裡酶的氧化酶活性和脫氫酶活性。圖2是用於說明酶促反應的示意圖，但並不限定酶的底物特異性等特性。

圖3-1表示使用cfp―t7阿馬多裡酶的αfvh的電化學測定結果。

圖3-2是圖3-1的續圖。

圖4-1是使用cfp-t7―280q阿馬多裡酶的αfvh的電化學測定結果。

圖4-2是圖4-1的續圖。

具體實施方式

下面，詳細地說明本發明。

本發明的阿馬多裡酶可以將糖化蛋白、糖化肽作為底物。

(糖化蛋白、血紅蛋白a1c)

本發明的糖化蛋白是指非酶糖化的蛋白質。糖化蛋白在生物體內、外均存在，作為在生物體內存在的例子，有血液中的糖化血紅蛋白、糖化白蛋白等，在糖化血紅蛋白中將血紅蛋白的β鏈氨基末端的纈氨酸被糖化的糖化血紅蛋白特別地稱為血紅蛋白a1c(hba1c)。作為在生物體外存在的例子，有蛋白質、肽與糖共存的液狀調味料等飲料食品及輸液等。

(糖化肽、果糖基肽)

本發明的糖化肽是指來源於糖化蛋白的非酶糖化的肽，包括肽被直接非酶糖化而成的肽、通過蛋白酶等分解糖化蛋白而結果產生的肽、構成糖化蛋白的(多)肽被糖化而成的肽。有時也將糖化肽稱為果糖基肽。糖化蛋白中，作為受到糖化的肽側的氨基，可舉出氨基末端的α-氨基、肽內部的賴氨酸殘基側鏈的ε-氨基等，本發明的糖化肽更具體地是指α-糖化肽(α-果糖基肽)。α-糖化肽是從n末端的α-胺基酸被糖化的糖化蛋白通過某種手段，例如蛋白酶的限定分解等使其游離而形成的。例如，對象物的糖化蛋白為血紅蛋白a1c(hba1c)時，該α-糖化肽是指從n末端被糖化的hba1c的β鏈切出的糖化的肽。由146殘基的胺基酸構成的hba1c的β鏈也屬於α-糖化肽(αf146p)。

一實施方式中本發明的阿馬多裡酶進行作用的測定物質(底物)為hba1c、更具體地為hba1c的β鏈。另一實施方式中本發明的阿馬多裡酶進行作用的測定物質為從hba1c的β鏈切出的α-糖化肽，例如為αfv～αf128p、αfv～αf64p、αfv～αf32p、αfv～αf16p；例如為αf6p(α-果糖基纈氨醯基組氨醯基亮氨醯基蘇氨醯基脯氨醯基穀氨酸)。另一實施方式中本發明的阿馬多裡酶進行作用的測定物質為αfvh(α-果糖基纈氨醯基組氨酸)或αfv(α-果糖基纈氨酸)。

(阿馬多裡酶)

阿馬多裡酶也稱為酮胺氧化酶、果糖基胺基酸氧化酶、果糖基肽氧化酶、果糖基胺氧化酶等，是在氧存在下，催化亞氨基二乙酸或其衍生物(阿馬多裡化合物)氧化而生成乙醛酸或α-酮醛、胺基酸或肽以及過氧化氫的反應的酶。阿馬多裡酶廣泛分布於自然界，可以通過探索起源於微生物、動物或植物的酶來獲得。微生物中，例如，可以從絲狀菌、酵母或細菌等中獲得。

本發明阿馬多裡酶的一個實例是根據具有序列號1所示的胺基酸序列的來源於錐毛殼(coniochaeta)屬的阿馬多裡酶、或者具有序列號6所示的胺基酸序列的來源於棒狀彎孢(curvulariaclavata)的阿馬多裡酶而製作的脫氫酶活性提高的阿馬多裡酶的突變體。

本發明阿馬多裡酶的一個實例是根據具有序列號3或序列號44所示的胺基酸序列的來源於土正青黴(eupenicilliumterrenum)的阿馬多裡酶而製作的、脫氫酶活性提高的阿馬多裡酶的突變體。

本發明阿馬多裡酶的一個實例是根據具有序列號9所示的胺基酸序列的來源於phaeosphaerianodorum的阿馬多裡酶而製作的脫氫酶活性提高的阿馬多裡酶的突變體。

本發明阿馬多裡酶的一個實例是根據具有序列號10或序列號序列號53所示的胺基酸序列的來源於構巢麴黴(aspergillusnidulans)的果糖基胺基酸氧化酶而製作的脫氫酶活性提高的阿馬多裡酶的突變體。

本發明阿馬多裡酶的一個實例是根據具有序列號11或序列號67所示的胺基酸序列的來源於構巢裸孢殼(emericellanidulans)的果糖基肽氧化酶而製作的脫氫酶活性提高的阿馬多裡酶的突變體。

作為這樣的突變體的例子，可舉出與序列號1、序列號3、序列號6、序列號9、序列號10、序列號11、序列號44、序列號53或序列號67有高序列同源性(例如，70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、例如99％以上)的胺基酸序列的阿馬多裡酶，以及在序列號1、序列號3、序列號6、序列號9、序列號10、序列號11、序列號44、序列號53或序列號67的胺基酸序列中，有1個至數個的胺基酸被修飾或突變、或者缺失、取代、添加和/或插入而成的胺基酸序列的阿馬多裡酶。

予以說明，本發明的阿馬多裡酶可以根據來源於例如正青黴(eupenicillium)屬、棘殼孢(pyrenochaeta)屬、節菱孢(arthrinium)屬、彎孢(curvularia)屬、新赤殼(neocosmospora)屬、隱球菌(cryptococcus)屬、暗球腔菌(phaeosphaeria)屬、麴黴(aspergillus)屬、裸孢殼(emericella)屬、細基格孢(ulocladium)屬、青黴(penicillium)屬、鐮刀菌(fusarium)屬、achaetomiella屬、無毛毛殼(achaetomium)屬、梭孢殼(thielavia)屬、毛殼(chaetomium)屬、五穀麻孢殼(gelasinospora)屬、小囊菌(microascus)屬、小球腔菌(leptosphaeria)屬、蛇孢腔菌(ophiobolus)屬、格孢腔菌(pleospora)屬、閉毛孢殼(coniochaetidium)屬、畢赤酵母(pichia)屬、棒狀桿菌(corynebacterium)屬、土壤桿菌(agrobacterium)屬、節桿菌(arthrobacter)屬等生物種的阿馬多裡酶製作而成。這些中優選具有脫氫酶活性且/或胺基酸序列如上所述與序列號1具有高序列同源性的阿馬多裡酶。

氧化酶活性降低、脫氫酶活性提高的阿馬多裡酶的突變體(修飾體)可以通過在阿馬多裡酶的胺基酸序列中將至少1個的胺基酸殘基進行取代或添加或缺失而得到。

(帶來脫氫酶活性提高/氧化酶活性降低的取代)

作為帶來脫氫酶活性提高和/或氧化酶活性降低的胺基酸取代，可舉出與序列號1所示的胺基酸序列中如下位置的胺基酸所對應位置的胺基酸取代。

(1)280位半胱氨酸的取代，例如被取代為選自由穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸和天冬醯胺構成的組的極性胺基酸；選自由天冬氨酸、穀氨酸、賴氨酸、精氨酸和組氨酸構成的組的帶電胺基酸；或者選自由甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸構成的組的胺基酸。

(2)267位苯丙氨酸的取代，例如被取代為選自由酪氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、異亮氨酸、纈氨酸或丙氨酸構成的組的疏水性胺基酸殘基。

(3)269位苯丙氨酸的取代，例如被取代為選自由酪氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、異亮氨酸、纈氨酸或丙氨酸構成的組的疏水性胺基酸殘基。

(4)54位天冬氨酸的取代，例如被取代為天冬醯胺、丙氨酸、穀氨醯胺、組氨酸、甘氨酸或纈氨酸。

(5)241位酪氨酸的取代，例如被取代為穀氨醯胺、賴氨酸、穀氨酸、天冬醯胺、天冬氨酸、精氨酸或組氨酸。

本說明書為了方便，有時將穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸和天冬醯胺稱為極性胺基酸。此外有時將天冬氨酸、穀氨酸、賴氨酸、精氨酸和組氨酸稱為帶電胺基酸。此外有時將丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸稱為疏水性胺基酸。此外有時將甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、脯氨酸稱為體積大的胺基酸。

本發明的脫氫酶活性提高/氧化酶活性降低的阿馬多裡酶的突變體可以是有至少1個上述胺基酸取代，也可以是有多個胺基酸取代。例如，有1、2、3、4或5個上述胺基酸取代。

其中，優選具有如下胺基酸位置所對應的胺基酸取代的脫氫酶活性提高且氧化酶活性降低的突變體。

(1)280位半胱氨酸的取代，例如被取代為穀氨醯胺、絲氨酸、組氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、穀氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸、精氨酸或天冬醯胺。

(2)267位苯丙氨酸的取代，例如被取代為酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸。

(3)269位苯丙氨酸的取代，例如被取代為酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸。

(4)54位天冬氨酸的取代，例如被取代為天冬醯胺、丙氨酸。

(5)241位酪氨酸的取代，例如被取代為穀氨醯胺、賴氨酸或穀氨酸。

本發明的阿馬多裡酶突變體可在序列號1所示的胺基酸序列中具有帶來上述的脫氫酶活性提高和/或氧化酶活性降低的胺基酸取代。而且，本發明的阿馬多裡酶突變體可以進一步在這些取代胺基酸以外的位置將1個或數個(例如1～15個、例如1～10個、優選為1～5個、進一步優選為1～3個、特別優選為1個)的胺基酸進行缺失、插入、添加和/或取代。本發明進一步包含如下的阿馬多裡酶突變體，該阿馬多裡酶突變體具有帶來上述的脫氫酶活性提高和/或氧化酶活性降低的胺基酸的取代突變、提高底物特異性等脫氫酶活性提高以外性質的胺基酸的取代突變，相對於序列號1所示的胺基酸序列中除了所述取代的胺基酸以外的胺基酸部分的胺基酸序列，有70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、例如99％以上的胺基酸序列同源性，具有阿馬多裡酶活性，脫氫酶活性被修改。

予以說明，具有序列號1所示的胺基酸序列的阿馬多裡酶是在國際公開2007/125779號中由保有稱為pkk223-3-cfp-t7重組質粒(保藏編號：fermbp-10593)的大腸桿菌生產的來源於錐毛殼屬的阿馬多裡酶(cfp-t7)，為申請人之前發現的熱穩定性優異的修飾型阿馬多裡酶。該cfp-t7為相對於來源於天然型錐毛殼屬的阿馬多裡酶，在272位、302位和388位依次導入人工突變而獲得的三重突變體。

上述的胺基酸取代中，胺基酸位置表示序列號1所示的來源於錐毛殼屬的阿馬多裡酶的胺基酸序列中的位置，在來源於其他生物種的阿馬多裡酶的胺基酸序列中，序列號1所示的胺基酸序列中的位置所對應位置的胺基酸被取代。關於「對應位置」的含義在後記述。

(進一步取代)

(關於使阿馬多裡酶的底物特異性發生變化的胺基酸取代)

本發明人以前報告過通過取代阿馬多裡酶的胺基酸殘基能夠使其底物特異性發生變化(例如參照國際公開2013/162035號並通過參照將其全部內容併入本說明書中)。本發明的阿馬多裡酶根據情況可以進一步有這類胺基酸取代。

作為使阿馬多裡酶的底物特異性發生變化的胺基酸取代，可舉出序列號1所示的胺基酸序列中如下位置的胺基酸所對應位置的胺基酸取代。

(a)62位精氨酸

(b)63位亮氨酸

(c)102位穀氨酸

(d)106位天冬氨酸

(e)110位穀氨醯胺

(f)113位丙氨酸

(g)355位丙氨酸

(h)419位丙氨酸

(i)68位天冬氨酸

(j)356位丙氨酸

根據情況62位精氨酸所對應位置的胺基酸可以被取代為丙氨酸、天冬醯胺或天冬氨酸。

根據情況(b)63位亮氨酸所對應位置的胺基酸可以被取代為組氨酸或丙氨酸。

根據情況(c)102位穀氨酸所對應位置的胺基酸可以被取代為賴氨酸。

根據情況(d)106位天冬氨酸所對應位置的胺基酸可以被取代為丙氨酸、賴氨酸或精氨酸。

根據情況(e)110位穀氨醯胺所對應位置的胺基酸可以被取代為亮氨酸或酪氨酸。

根據情況(f)113位丙氨酸所對應位置的胺基酸可以被取代為賴氨酸或精氨酸。

根據情況(g)355位丙氨酸所對應位置的胺基酸可以被取代為絲氨酸。

根據情況(h)419位丙氨酸所對應位置的胺基酸可以被取代為賴氨酸。

根據情況(i)68位天冬氨酸所對應位置的胺基酸可以被取代為天冬醯胺。

根據情況(j)356位丙氨酸所對應位置的胺基酸可以被取代為蘇氨酸。

(關於使阿馬多裡酶的表面活性劑耐受性提高的胺基酸取代)

本發明人確認到通過取代阿馬多裡酶的胺基酸殘基能夠使其表面活性劑耐受性提高。例如參照日本特願2013-221515號和pct/jp2014/071036號說明書。這些文獻通過參照將其全部內容併入本說明書中。

作為使阿馬多裡酶的表面活性劑耐受性提高的胺基酸取代，可舉出序列號1所示的胺基酸序列中如下位置的胺基酸所對應位置的胺基酸取代。

(i)262位天冬醯胺、

(ii)257位纈氨酸、

(iii)249位穀氨酸

(iv)253位穀氨酸、

(v)337位穀氨醯胺、

(vi)340位穀氨酸、

(vii)232位天冬氨酸、

(viii)129位天冬氨酸、

(ix)132位天冬氨酸、

(x)133位穀氨酸、

(xi)44位穀氨酸、

(xii)256位甘氨酸、

(xiii)231位穀氨酸、和

(xiv)81位穀氨酸、

根據情況262位天冬醯胺所對應位置的胺基酸可以被取代為組氨酸。

根據情況257位纈氨酸所對應位置的胺基酸可以被取代為半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸。

根據情況249位穀氨酸所對應位置的胺基酸以被取代為賴氨酸、精氨酸可。

根據情況253位穀氨酸所對應位置的胺基酸可以被取代為賴氨酸、精氨酸。

根據情況337位穀氨醯胺所對應位置的胺基酸可以被取代為賴氨酸、精氨酸。

根據情況340位穀氨酸所對應位置的胺基酸可以被取代為脯氨酸。

根據情況232位天冬氨酸所對應位置的胺基酸可以被取代為賴氨酸、精氨酸。

根據情況129位天冬氨酸所對應位置的胺基酸可以被取代為賴氨酸、精氨酸。

根據情況132位天冬氨酸所對應位置的胺基酸可以被取代為賴氨酸、精氨酸。

根據情況133位穀氨酸所對應位置的胺基酸可以被取代為丙氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸、精氨酸。

根據情況44位穀氨酸所對應位置的胺基酸可以被取代為脯氨酸。

根據情況256位甘氨酸所對應位置的胺基酸可以被取代為賴氨酸、精氨酸。

根據情況231位穀氨酸所對應位置的胺基酸可以被取代為賴氨酸、精氨酸。

根據情況81位穀氨酸所對應位置的胺基酸可以被取代為賴氨酸、精氨酸。

(關於使阿馬多裡酶的熱穩定性提高的胺基酸缺失)

本發明人以前報告過通過從阿馬多裡酶的羧基末端缺失3個胺基酸殘基，能夠使其熱穩定性提高(參照國際公開第2013/100006號說明書並通過參照將其全部內容併入本說明書中)。在一實施方式中，本發明的阿馬多裡酶除了上述的取代之外可以進一步缺失從羧基末端起的3個胺基酸殘基。本說明書中有時將從羧基末端起的3個胺基酸殘基缺失稱為使熱穩定性提高的缺失。

(編碼阿馬多裡酶的基因的獲得)

為了得到這些編碼阿馬多裡酶的本發明基因(下面也僅稱為「阿馬多裡酶基因」)，通常利用一般使用的基因克隆方法。例如，可以從具有阿馬多裡酶生產能力的微生物菌體及各種細胞，利用常規方法例如，currentprotocolsinmolecularbiology(wileyinterscience，1989)記載的方法，提取染色體dna或mrna。還可以將mrna作為模板來合成cdna。使用這樣得到的染色體dna或cdna，能夠製作染色體dna或cdna文庫。

接著，根據上述阿馬多裡酶的胺基酸序列，合成適當的探針dna，利用使用其從染色體dna或cdna文庫中篩選阿馬多裡酶基因的方法；或者根據上述胺基酸序列，製作適當的引物dna，利用5』race法及3』race法等適當的聚合酶鏈反應(pcr法)，擴增包含編碼阿馬多裡酶的目的基因片段的dna，連接這些dna片段，能夠得到包含目標阿馬多裡酶基因全長的dna。

作為這樣得到的編碼阿馬多裡酶的基因的優選一例，可舉出來源於錐毛殼屬的阿馬多裡酶基因(日本特開2003-235585號公報)的例子等。

這些阿馬多裡酶基因從操作上優選按照常規方法連接到各種載體。例如，可舉出將編碼來源於錐毛殼屬nisl9330株的阿馬多裡酶基因的dna插入到pkk223-3載體(gehealthcare公司制)中而得到的重組質粒pkk223-3-cfp(日本特開2003-235585號公報)。

(載體)

作為本發明中可使用的載體，並不限定為上述質粒，可以使用除上述以外的例如噬菌體、粘粒等本領域技術人員公知的任意載體。具體地優選例如pbluescriptiisk+(stratagene公司制)等。

(阿馬多裡酶基因的突變處理)

阿馬多裡酶基因的突變處理可以根據預期的突變形式，利用任何公知的方法來進行。即，可以廣泛採用使阿馬多裡酶基因或者整合了該基因的重組dna與作為突變原的藥劑進行接觸/作用的方法；紫外線照射法；基因工程手段；或者運用蛋白質工程手段的方法等。

作為上述突變處理中使用的突變原的藥劑，例如，可舉出羥基胺、n-甲基-n』-硝基-n-亞硝基胍、亞硝酸、亞硫酸、肼、甲酸或5-溴尿嘧啶等。

上述接觸/作用的各條件可以採用與使用的藥劑種類等相應的條件，只要是實際中在阿馬多裡酶基因中引起所期望的突變就沒有特別限定。通常，優選在0.5～12m的上述藥劑濃度，在20～80℃的反應溫度下接觸/作用10分鐘以上、優選為10～180分鐘，由此能夠引起所期望的突變。在進行紫外線照射時，也可以按照如上所述的常規方法進行(現代化學，p24～30，1989年6月號)。

作為運用蛋白質工程手段的方法，一般採用作為位點特異性突變(site-specificmutagenesis)而已知的手段。例如，可舉出kramer法(nucleicacidsres.，12，9441(1984)：methodsenzymol.，154，350(1987)：gene，37，73(1985))、eckstein法(nucleicacidsres.，13，8749(1985)：nucleicacidsres.，13，8765(1985)：nucleicacidsres，14，9679(1986))、kunkel法(proc.natl.acid.sci.u.s.a.，82，488(1985)：methodsenzymol.，154，367(1987))等。作為改變dna中的鹼基序列的具體方法，例如可舉出利用市售的試劑盒(transformermutagenesiskit，clonetech公司；exoiii/mungbeandeletionkit，stratagene公司制；quickchangesite-directedmutagenesiskit，stratagene公司制等)。

另外，也可以使用作為一般的pcr法(聚合酶鏈反應，polymerasechainreaction)而已知的手段(technique，1，11(1989))。予以說明，除了上述基因修飾法之外，也可以通過有機合成法或酶合成法來直接合成所期望的修飾阿馬多裡酶基因。

對通過上述方法得到的阿馬多裡酶基因的dna鹼基序列進行確定或確認時，例如可以使用多毛細管dna分析系統ceq2000(beckmancoulter公司制)等來進行。

(轉化/轉導)

可通過常規方法將如上所述得到的阿馬多裡酶基因整合到噬菌體、粘粒、或者原核細胞或真核細胞的轉化中使用的質粒等載體上，再通過常規方法對與各載體對應的宿主進行轉化或轉導。例如，可以使用得到的重組dna，對任意宿主進行轉化或轉導到這些宿主中而得到各菌株，例如屬於埃希氏菌屬的微生物，作為具體例為大腸桿菌k-12株、優選大腸桿菌jm109株、大腸桿菌dh5α株(均為寶生物工程株式會社制)及大腸桿菌b株，優選大腸桿菌bl21株(株式會社nippongene制)等。

(胺基酸序列的同源性或相似性)

胺基酸序列的同源性或相似性可以通過genetyxver.11(株式會社genetyx制)的最大匹配及同源性檢索等程序或dnasispro(株式會社日立解決方案制)的最大匹配及多序列比對等程序進行計算。為了計算胺基酸序列同源性，在比對2個以上的阿馬多裡酶時，可以研究該2個以上的阿馬多裡酶中相同的胺基酸位置。根據所述信息，能夠確定胺基酸序列中的相同區域。

另外，也可以研究2個以上的阿馬多裡酶中相似的胺基酸位置。例如使用clustalw能夠比對多個胺基酸序列，此時，算法使用blosum62，在比對多個胺基酸序列時，有時將判斷為相似的胺基酸稱為相似胺基酸。本發明的突變體中，胺基酸取代可以由這類相似胺基酸間的取代而成的突變體。通過所述比對，對於多個胺基酸序列，可以研究胺基酸序列相同的區域和被相似胺基酸佔據的位置。根據所述信息，能夠確定胺基酸序列中的同源性區域(保守區域)。

本說明書中「同源性區域」是指在比對2個以上的阿馬多裡酶時，某一基準的阿馬多裡酶與比較對象的阿馬多裡酶的對應位置中胺基酸為由相同或相似胺基酸組成的區域，為由連續的3個以上、4個以上、5個以上、6個以上、7個以上、8個以上、9個以上或10個以上的胺基酸組成的區域。例如，圖1中比對了全長胺基酸序列的序列同源性為74％以上的阿馬多裡酶。其中，以序列號1表示的錐毛殼屬阿馬多裡酶為基準，第10位～32位為由相同或相似胺基酸組成，因此屬於同源性區域。同樣以序列號1表示的錐毛殼屬阿馬多裡酶為基準，36～41位、49～52位、54～58位、63～65位、73～75位、84～86位、88～90位、120～122位、145～150位、156～162位、164～170位、180～182位、202～205位、207～211位、214～224位、227～230位、236～241位、243～248位、258～261位、266～268位、270～273位、275～287位、295～297位、306～308位、310～316位、324～329位、332～334位、341～344位、346～355位、357～363位、370～383位、385～387位、389～394位、405～410位和423～431位能屬於同源性區域。

優選的阿馬多裡酶的同源性區域是以序列號1表示的錐毛殼屬阿馬多裡酶為基準，由第11位～32位、36～41位、50～52位、54～58位、84～86位、88～90位、145～150位、157～168位、202～205位、207～212位、215～225位、236～248位、258～261位、266～268位、270～273位、275～287位、347～354位、357～363位、370～383位、385～387位、和405～410位的胺基酸序列組成的區域。

進一步優選的阿馬多裡酶的同源性區域是以序列號1表示的錐毛殼屬阿馬多裡酶為基準，由第11～18位、20～32位、50～52位、54～58位、266～268位、270～273位、277～286位、和370～383位的胺基酸序列組成的區域。

本發明的阿馬多裡酶突變體在與有序列號1、序列號3、序列號6、序列號9、序列號10、序列號11、序列號44、序列號53或序列號67所示的胺基酸序列的阿馬多裡酶進行比對時，為有50％以上、例如60％以上、70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、例如99％以上的全長胺基酸序列同源性，並具有脫氫酶活性。進一步，本發明的阿馬多裡酶突變體的同源性區域中的胺基酸序列與序列號1中的同源性區域的胺基酸序列有75％以上、例如80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、例如99％以上的序列同源性。

(胺基酸所對應位置的確定)

「胺基酸所對應的位置」是指序列號1所示的來源於錐毛殼屬的阿馬多裡酶的胺基酸序列中的特定位置的胺基酸所對應的來源於其他生物種的阿馬多裡酶的胺基酸序列中的位置。

作為確定「胺基酸所對應的位置」的方法，例如可以通過利用lipman-pearson法等公知算法對胺基酸序列進行比較，對存在於各阿馬多裡酶的胺基酸序列中的保守胺基酸殘基賦予最大的同源性來進行。通過用這樣方法排列阿馬多裡酶的胺基酸序列，能夠不管胺基酸序列中存在的插入、缺失，而確定相同胺基酸殘基在各阿馬多裡酶序列中序列中的位置。認為相同位置在三維結構中存在於同位置，能夠推定具有與作為對象的阿馬多裡酶的特異性功能相關的相似效果。

圖1-1、1-2、1-3、1-4、1-5示例了來源於各種公知的生物種的阿馬多裡酶序列。序列號1表示的胺基酸序列如最上列所示。圖1中所示的各種序列均與序列號1的序列有70％以上的同源性並利用公知算法進行排列。圖中示出了本發明的突變體中的突變點。由圖1-1、1-2、1-3、1-4、1-5可知來源於錐毛殼(coniochaeta)屬的阿馬多裡酶的胺基酸序列中的特定位置的胺基酸所對應的來源於其他生物種的阿馬多裡酶的胺基酸序列中位置。圖1-1、1-2、1-3、1-4、1-5中示出了來源於錐毛殼屬的阿馬多裡酶(序列號1)、來源於土正青黴(eupenicilliumterrenum)的阿馬多裡酶(序列號3)、來源於棘殼孢屬(pyrenochaetasp.)的酮胺氧化酶(序列號4)、來源於節菱孢屬(arthriniumsp.)的酮胺氧化酶(序列號5)、來源於棒狀彎孢(curvulariaclavata)的酮胺氧化酶(序列號6)、來源於侵管新赤殼(neocosmosporavasinfecta)的酮胺氧化酶(序列號7)、來源於新型隱球菌(cryptococcusneoformans)的果糖基胺基酸氧化酶(序列號8)、來源於phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶(序列號9)、來源於構巢麴黴(aspergillusnidulans)的果糖基胺基酸氧化酶(序列號10)、來源於構巢裸孢殼(emericellanidulans)的果糖基肽氧化酶(序列號11)、來源於細基格孢屬(ulocladiumsp.)的果糖基胺基酸氧化酶(序列號12)和來源於微紫青黴(penicilliumjanthinellum)的果糖基胺基酸氧化酶(序列號13)的胺基酸序列。

(取代位置所對應的位置)

予以說明，本發明中「序列號1中記載的胺基酸序列的280位半胱氨酸所對應的位置」是指將確定的阿馬多裡酶的胺基酸序列在與序列號1中所示的來源於錐毛殼屬的阿馬多裡酶的胺基酸序列進行比較時，序列號1的阿馬多裡酶的280位半胱氨酸所對應的胺基酸。由此，可以通過用上述確定「對應位置的胺基酸殘基(相當於位置的胺基酸殘基)」的方法對胺基酸序列進行排列的圖1-3來確定。

即，在來源於土正青黴的阿馬多裡酶中為280位半胱氨酸、在來源於棘殼孢屬的酮胺氧化酶中為278位半胱氨酸、在來源於節菱孢屬的酮胺氧化酶中為280位半胱氨酸、在來源於棒狀彎孢的酮胺氧化酶中為278位半胱氨酸、在來源於侵管新赤殼的酮胺氧化酶中為280位半胱氨酸、在來源於新型隱球菌的果糖基胺基酸氧化酶中為280位半胱氨酸、在來源於phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶中為276位半胱氨酸、在來源於構巢麴黴的果糖基胺基酸氧化酶中為280位半胱氨酸、在來源於構巢裸孢殼的果糖基肽氧化酶中為280位半胱氨酸、在來源於細基格孢屬的果糖基胺基酸氧化酶中為278位半胱氨酸、在來源於微紫青黴的果糖基胺基酸氧化酶中為280位半胱氨酸。

另外，「序列號1中記載的胺基酸序列的267位苯丙氨酸所對應的位置」是指將確定的阿馬多裡酶的胺基酸序列在與序列號1中所示的來源於錐毛殼屬的阿馬多裡酶的胺基酸序列進行比較時，序列號1的阿馬多裡酶的267位苯丙氨酸所對應的胺基酸。這也可以通過用上述方法對胺基酸序列進行排列的圖1-3來確定。

即，在來源於土正青黴的阿馬多裡酶中為267位苯丙氨酸、在來源於棘殼孢屬的酮胺氧化酶中為265位苯丙氨酸、在來源於節菱孢屬的酮胺氧化酶中為267位苯丙氨酸、在來源於棒狀彎孢的酮胺氧化酶中為265位苯丙氨酸、在來源於侵管新赤殼的酮胺氧化酶中為267位苯丙氨酸、在來源於新型隱球菌的果糖基胺基酸氧化酶中為267位苯丙氨酸、在來源於phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶中為263位苯丙氨酸、在來源於構巢麴黴的果糖基胺基酸氧化酶中為267位苯丙氨酸、在來源於構巢裸孢殼的果糖基肽氧化酶中為267位苯丙氨酸、在來源於細基格孢屬的果糖基胺基酸氧化酶中為265位苯丙氨酸、在來源於微紫青黴的果糖基胺基酸氧化酶中為267位苯丙氨酸。

另外，「序列號1中記載的胺基酸序列的269位苯丙氨酸所對應的位置」是指將確定的阿馬多裡酶的胺基酸序列在與序列號1中所示的來源於錐毛殼屬的阿馬多裡酶的胺基酸序列進行比較時，序列號1中記載的胺基酸序列的269位苯丙氨酸所對應的胺基酸。這也可以通過用上述方法對胺基酸序列進行排列的圖1-3來確定。

即，在來源於土正青黴的阿馬多裡酶中為269位苯丙氨酸、在來源於棘殼孢屬的酮胺氧化酶中為267位苯丙氨酸、在來源於節菱孢屬的酮胺氧化酶中為269位苯丙氨酸、在來源於棒狀彎孢的酮胺氧化酶中為267位苯丙氨酸、在來源於侵管新赤殼的酮胺氧化酶中為269位苯丙氨酸、在來源於新型隱球菌的果糖基胺基酸氧化酶中為269位苯丙氨酸、在來源於phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶中為265位苯丙氨酸、在來源於構巢麴黴的果糖基胺基酸氧化酶中為269位苯丙氨酸、在來源於構巢裸孢殼的果糖基肽氧化酶中為269位異亮氨酸、在來源於細基格孢屬的果糖基胺基酸氧化酶中為267位苯丙氨酸、在來源於微紫青黴的果糖基胺基酸氧化酶中為269位苯丙氨酸。

另外，「序列號1中記載的胺基酸序列的54位天冬氨酸所對應的位置」是指將確定的阿馬多裡酶的胺基酸序列在與序列號1中所示的來源於錐毛殼屬的阿馬多裡酶的胺基酸序列進行比較時，序列號1中記載的胺基酸序列的54位天冬氨酸所對應的胺基酸。這也可以通過用上述方法對胺基酸序列進行排列的圖1-1來確定。

即，在來源於土正青黴的阿馬多裡酶中為54位天冬氨酸、在來源於棘殼孢屬的酮胺氧化酶中為54位天冬氨酸、在來源於節菱孢屬的酮胺氧化酶中為54位天冬氨酸、在來源於棒狀彎孢的酮胺氧化酶中為54位天冬氨酸、在來源於侵管新赤殼的酮胺氧化酶中為54位天冬氨酸、在來源於新型隱球菌的果糖基胺基酸氧化酶中為54位天冬氨酸、在來源於phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶中為54位天冬氨酸、在來源於構巢麴黴的果糖基胺基酸氧化酶中為53位天冬氨酸、在來源於構巢裸孢殼的果糖基肽氧化酶中為53位天冬氨酸、在來源於細基格孢屬的果糖基胺基酸氧化酶中為54位天冬氨酸、在來源於微紫青黴的果糖基胺基酸氧化酶中為54位天冬氨酸。

進一步，「序列號1中記載的胺基酸序列的241位酪氨酸所對應的位置」是指將確定的阿馬多裡酶的胺基酸序列在與序列號1中所示的來源於錐毛殼屬的阿馬多裡酶的胺基酸序列進行比較時，序列號1的阿馬多裡酶的241位酪氨酸所對應的胺基酸。這也可以通過用上述方法對胺基酸序列進行排列的圖1-3來確定。

即，在來源於土正青黴的阿馬多裡酶中為241位苯丙氨酸、在來源於棘殼孢屬的酮胺氧化酶中為239位酪氨酸、在來源於節菱孢屬的酮胺氧化酶中為241位酪氨酸、在來源於棒狀彎孢的酮胺氧化酶中為239位酪氨酸、在來源於侵管新赤殼的酮胺氧化酶中為241位酪氨酸、在來源於新型隱球菌的果糖基胺基酸氧化酶中為241位酪氨酸、在來源於phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶中為237位酪氨酸、在來源於構巢麴黴的果糖基胺基酸氧化酶中為241位苯丙氨酸、在來源於構巢裸孢殼的果糖基肽氧化酶中為241位苯丙氨酸、在來源於細基格孢屬的果糖基胺基酸氧化酶中為239位酪氨酸、在來源於微紫青黴的果糖基胺基酸氧化酶中為241位苯丙氨酸。

(底物特異性修飾突變的對應位置)

予以說明，本發明中「序列號1中記載的胺基酸序列的62位精氨酸所對應的位置」的胺基酸是指將確定的阿馬多裡酶的胺基酸序列在與序列號1中所示的來源於錐毛殼屬的阿馬多裡酶的胺基酸序列進行比較時，序列號1的阿馬多裡酶的62位精氨酸所對應的胺基酸。由此，可以通過用上述確定「對應位置的胺基酸殘基」的方法對胺基酸序列進行排列並確定。

即，「序列號1中記載的胺基酸序列的62位精氨酸所對應的位置」的胺基酸在來源於土正青黴的阿馬多裡酶、來源於棘殼孢屬的酮胺氧化酶、來源於節菱孢屬的酮胺氧化酶、來源於棒狀彎孢的酮胺氧化酶、來源於侵管新赤殼的酮胺氧化酶、來源於新型隱球菌的果糖基胺基酸氧化酶、來源於細基格孢屬的果糖基胺基酸氧化酶、來源於微紫青黴的果糖基胺基酸氧化酶中為62位精氨酸；在來源於phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶中為62位絲氨酸；在來源於構巢裸孢殼的果糖基肽氧化酶中為61位精氨酸；在來源於構巢麴黴的果糖基胺基酸氧化酶中為61位精氨酸。

另外，本發明中「序列號1中記載的胺基酸序列的63位亮氨酸所對應的位置」的胺基酸是指將確定的阿馬多裡酶的胺基酸序列在與序列號1中所示的來源於錐毛殼屬的阿馬多裡酶的胺基酸序列進行比較時，序列號1的阿馬多裡酶的63位亮氨酸所對應的胺基酸。由此，可以通過用上述確定「對應位置的胺基酸殘基」的方法對胺基酸序列進行排列並確定。

即，「序列號1中記載的胺基酸序列的63位亮氨酸所對應的位置」的胺基酸在來源於土正青黴的阿馬多裡酶、來源於棘殼孢屬的酮胺氧化酶、來源於節菱孢屬的酮胺氧化酶、來源於棒狀彎孢的酮胺氧化酶、來源於侵管新赤殼的酮胺氧化酶、來源於phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶、來源於細基格孢屬的果糖基胺基酸氧化酶、來源於微紫青黴的果糖基胺基酸氧化酶中為63位亮氨酸；在來源於新型隱球菌的果糖基胺基酸氧化酶中為63位異亮氨酸；在來源於構巢麴黴的果糖基胺基酸氧化酶、在來源於構巢裸孢殼的果糖基肽氧化酶中為62位亮氨酸。

另外，本發明中「序列號1中記載的胺基酸序列的102位穀氨酸所對應的位置」的胺基酸是指將確定的阿馬多裡酶的胺基酸序列在與序列號1中所示的來源於錐毛殼屬的阿馬多裡酶的胺基酸序列進行比較時，序列號1的阿馬多裡酶的102位穀氨酸所對應的胺基酸。由此，可以通過用上述確定「對應位置的胺基酸殘基」的方法對胺基酸序列進行排列並確定。

即，「序列號1中記載的胺基酸序列的102位穀氨酸所對應的位置」的胺基酸在來源於土正青黴的阿馬多裡酶、來源於棒狀彎孢的酮胺氧化酶、來源於侵管新赤殼的酮胺氧化酶、來源於新型隱球菌的果糖基胺基酸氧化酶、來源於微紫青黴的果糖基胺基酸氧化酶中為102位穀氨酸；在來源於棘殼孢屬的酮胺氧化酶、來源於節菱孢屬的酮胺氧化酶、來源於phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶、來源於細基格孢屬的果糖基胺基酸氧化酶中為102位賴氨酸；在來源於構巢裸孢殼的果糖基肽氧化酶、來源於構巢麴黴的果糖基胺基酸氧化酶中為101位穀氨酸。

另外，本發明中「序列號1中記載的胺基酸序列的106位天冬氨酸所對應的位置」的胺基酸是指將確定的阿馬多裡酶的胺基酸序列在與序列號1中所示的來源於錐毛殼屬的阿馬多裡酶的胺基酸序列進行比較時，序列號1的阿馬多裡酶的106位天冬氨酸所對應的胺基酸。由此，可以通過用上述確定「對應位置的胺基酸殘基」的方法對胺基酸序列進行排列並確定。

即，「序列號1中記載的胺基酸序列的106位天冬氨酸所對應的位置」的胺基酸在來源於土正青黴的阿馬多裡酶中為106位天冬醯胺；在來源於棘殼孢屬的酮胺氧化酶、來源於棒狀彎孢的酮胺氧化酶、來源於phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶、來源於細基格孢屬的果糖基胺基酸氧化酶中為106位天冬氨酸；在來源於節菱孢屬的酮胺氧化酶中為106位丙氨酸；在來源於侵管新赤殼的酮胺氧化酶中為106位甘氨酸；在來源於新型隱球菌的果糖基胺基酸氧化酶、來源於微紫青黴的果糖基胺基酸氧化酶中為106位絲氨酸；在來源於構巢裸孢殼的果糖基肽氧化酶中為105位賴氨酸；在來源於構巢麴黴的果糖基胺基酸氧化酶中為105位甘氨酸。

另外，本發明中「序列號1中記載的胺基酸序列的110位穀氨醯胺所對應的位置」的胺基酸是指將確定的阿馬多裡酶的胺基酸序列在與序列號1中所示的來源於錐毛殼屬的阿馬多裡酶的胺基酸序列進行比較時，序列號1的阿馬多裡酶的110位穀氨醯胺所對應的胺基酸。由此，可以通過用上述確定「對應位置的胺基酸殘基」的方法對胺基酸序列進行排列並確定。

即，「序列號1中記載的胺基酸序列的110位穀氨醯胺所對應的位置」的胺基酸在來源於土正青黴的阿馬多裡酶、來源於微紫青黴的果糖基胺基酸氧化酶中為110位賴氨酸；在來源於棘殼孢屬的酮胺氧化酶、來源於棒狀彎孢的酮胺氧化酶、來源於細基格孢屬的果糖基胺基酸氧化酶中為110位丙氨酸；在來源於節菱孢屬的酮胺氧化酶中為110位穀氨醯胺；在來源於侵管新赤殼的酮胺氧化酶中為110位穀氨酸；在來源於新型隱球菌的果糖基胺基酸氧化酶中為110位絲氨酸；在來源於phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶中為110位甘氨酸；在來源於構巢裸孢殼的果糖基肽氧化酶中為109位精氨酸；在來源於構巢麴黴的果糖基胺基酸氧化酶中為109位賴氨酸。

另外，本發明中「序列號1中記載的胺基酸序列的113位丙氨酸所對應的位置」的胺基酸是指將確定的阿馬多裡酶的胺基酸序列在與序列號1中所示的來源於錐毛殼屬的阿馬多裡酶的胺基酸序列進行比較時，序列號1的阿馬多裡酶的113位丙氨酸所對應的胺基酸。由此，可以通過用上述確定「對應位置的胺基酸殘基」的方法對胺基酸序列進行排列並確定。

即，「序列號1中記載的胺基酸序列的113位丙氨酸所對應的位置」的胺基酸在來源於土正青黴的阿馬多裡酶、來源於棘殼孢屬的酮胺氧化酶、來源於節菱孢屬的酮胺氧化酶中為113位蘇氨酸；在來源於棒狀彎孢的酮胺氧化酶、來源於新型隱球菌的果糖基胺基酸氧化酶、來源於phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶、來源於細基格孢屬的果糖基胺基酸氧化酶中為113位丙氨酸；在來源於侵管新赤殼的酮胺氧化酶中為113位賴氨酸；在來源於構巢麴黴的果糖基胺基酸氧化酶、來源於構巢裸孢殼的果糖基肽氧化酶中為112位絲氨酸；在來源於微紫青黴的果糖基胺基酸氧化酶中為113位天冬氨酸。

另外，本發明中「序列號1中記載的胺基酸序列的355位丙氨酸所對應的位置」的胺基酸是指將確定的阿馬多裡酶的胺基酸序列在與序列號1中所示的來源於錐毛殼屬的阿馬多裡酶的胺基酸序列進行比較時，序列號1的阿馬多裡酶的355位丙氨酸所對應的胺基酸。由此，可以通過用上述確定「對應位置的胺基酸殘基」的方法對胺基酸序列進行排列並確定。

即，「序列號1中記載的胺基酸序列的355位丙氨酸所對應的位置」的胺基酸在來源於土正青黴的阿馬多裡酶、來源於新型隱球菌的果糖基胺基酸氧化酶、來源於構巢麴黴的果糖基胺基酸氧化酶、來源於構巢裸孢殼的果糖基肽氧化酶、來源於微紫青黴的果糖基胺基酸氧化酶中為355位丙氨酸；在來源於棘殼孢屬的酮胺氧化酶、來源於棒狀彎孢的酮胺氧化酶、來源於細基格孢屬的果糖基胺基酸氧化酶中為353位丙氨酸；在來源於節菱孢屬的酮胺氧化酶中為356位丙氨酸；在來源於侵管新赤殼的酮胺氧化酶中為355位絲氨酸；在來源於phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶中為351位丙氨酸。

另外，本發明中「序列號1中記載的胺基酸序列的419位丙氨酸所對應的位置」的胺基酸是指將確定的阿馬多裡酶的胺基酸序列在與序列號1中所示的來源於錐毛殼屬的阿馬多裡酶的胺基酸序列進行比較時，序列號1的阿馬多裡酶的419位丙氨酸所對應的胺基酸。由此，可以通過用上述確定「對應位置的胺基酸殘基」的方法對胺基酸序列進行排列並確定。

即，「序列號1中記載的胺基酸序列的419位丙氨酸所對應的位置」的胺基酸在來源於土正青黴的阿馬多裡酶中為419位甘氨酸；在來源於棘殼孢屬的酮胺氧化酶、來源於棒狀彎孢的酮胺氧化酶、來源於細基格孢屬的果糖基胺基酸氧化酶中為418位丙氨酸；在來源於節菱孢屬的酮胺氧化酶中為421位丙氨酸；在來源於侵管新赤殼的酮胺氧化酶、來源於新型隱球菌的果糖基胺基酸氧化酶、來源於構巢裸孢殼的果糖基肽氧化酶中為420位丙氨酸；在來源於phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶中為416位絲氨酸；在來源於微紫青黴的果糖基胺基酸氧化酶中為419位絲氨酸；在來源於構巢麴黴的果糖基胺基酸氧化酶中為420位丙氨酸。

另外，本發明中「序列號1中記載的胺基酸序列的68位天冬氨酸所對應的位置」的胺基酸是指將確定的阿馬多裡酶的胺基酸序列在與序列號1中所示的來源於錐毛殼屬的阿馬多裡酶的胺基酸序列進行比較時，序列號1的阿馬多裡酶的68位天冬氨酸所對應的胺基酸。由此，可以通過用上述確定「對應位置的胺基酸殘基」的方法對胺基酸序列進行排列並確定。

即，「序列號1中記載的胺基酸序列的68位天冬氨酸所對應的位置」的胺基酸在來源於土正青黴的阿馬多裡酶、來源於棘殼孢屬的酮胺氧化酶、來源於節菱孢屬的酮胺氧化酶、來源於棒狀彎孢的酮胺氧化酶、來源於侵管新赤殼的酮胺氧化酶、來源於新型隱球菌的果糖基胺基酸氧化酶、來源於phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶、來源於細基格孢屬的果糖基胺基酸氧化酶、來源於微紫青黴的果糖基胺基酸氧化酶中為68位天冬氨酸；在來源於構巢裸孢殼的果糖基肽氧化酶和來源於構巢麴黴的果糖基胺基酸氧化酶中為67位天冬氨酸。

另外，本發明中「序列號1中記載的胺基酸序列的356位丙氨酸所對應的位置」的胺基酸是指將確定的阿馬多裡酶的胺基酸序列在與序列號1中所示的來源於錐毛殼屬的阿馬多裡酶的胺基酸序列進行比較時，序列號1的阿馬多裡酶的356位丙氨酸所對應的胺基酸。由此，可以通過用上述確定「對應位置的胺基酸殘基」的方法對胺基酸序列進行排列並確定。

即，「序列號1中記載的胺基酸序列的356位丙氨酸所對應的位置」的胺基酸在來源於土正青黴的阿馬多裡酶中為356位天冬醯胺、在來源於棘殼孢屬的酮胺氧化酶中為354位丙氨酸、在來源於節菱孢屬的酮胺氧化酶中為357位丙氨酸、在來源於棒狀彎孢的酮胺氧化酶中為354位丙氨酸、在來源於侵管新赤殼的酮胺氧化酶中為356位丙氨酸、在來源於新型隱球菌的果糖基胺基酸氧化酶中為356位天冬醯胺、在來源於phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶中為352位丙氨酸、在來源於構巢麴黴的果糖基胺基酸氧化酶中為356位天冬醯胺、在來源於構巢裸孢殼的果糖基肽氧化酶中為356位天冬醯胺、在來源於細基格孢屬的果糖基胺基酸氧化酶中為354位丙氨酸、在來源於微紫青黴的果糖基胺基酸氧化酶中為356位天冬醯胺。

(表面活性劑耐受性提高突變的對應位置)

予以說明，本說明書中「序列號1中記載的胺基酸序列的44位穀氨酸所對應的位置」是指將確定的阿馬多裡酶的胺基酸序列在與序列號1中所示的來源於錐毛殼屬的阿馬多裡酶的胺基酸序列進行比較時，序列號1的阿馬多裡酶的44位穀氨酸所對應的胺基酸。由此，可以通過用上述確定「對應位置的胺基酸殘基」的方法對胺基酸序列進行排列的圖1來確定。

即，在來源於土正青黴的阿馬多裡酶中為44位賴氨酸、在來源於棘殼孢屬的酮胺氧化酶中為44位脯氨酸、在來源於節菱孢屬的酮胺氧化酶中為44位脯氨酸、在來源於棒狀彎孢的酮胺氧化酶中為44位脯氨酸、在來源於侵管新赤殼的酮胺氧化酶中為44位脯氨酸、在來源於新型隱球菌的果糖基胺基酸氧化酶中為44位亮氨酸、在來源於phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶中為44位脯氨酸、在來源於構巢麴黴的果糖基胺基酸氧化酶中為43位脯氨酸、在來源於構巢裸孢殼的果糖基肽氧化酶中為43位脯氨酸、在來源於細基格孢屬的果糖基胺基酸氧化酶中為44位脯氨酸、在來源於微紫青黴的果糖基胺基酸氧化酶中為44位脯氨酸。

另外，「序列號1中記載的胺基酸序列的81位穀氨酸所對應的位置」是指將確定的阿馬多裡酶的胺基酸序列在與序列號1中所示的來源於錐毛殼屬的阿馬多裡酶的胺基酸序列進行比較時，序列號1的阿馬多裡酶的81位穀氨酸所對應的胺基酸。這也可以通過用上述方法對胺基酸序列進行排列的圖1來確定。

即，在來源於土正青黴的阿馬多裡酶中為81位天冬醯胺、在來源於棘殼孢屬的酮胺氧化酶中為81位穀氨酸、在來源於節菱孢屬的酮胺氧化酶中為81位組氨酸、在來源於棒狀彎孢的酮胺氧化酶中為81位穀氨酸、在來源於侵管新赤殼的酮胺氧化酶中為81位天冬醯胺、在來源於新型隱球菌的果糖基胺基酸氧化酶中為81位天冬醯胺、在來源於phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶中為81位穀氨酸、在來源於構巢麴黴的果糖基胺基酸氧化酶中為80位天冬醯胺、在來源於構巢裸孢殼的果糖基肽氧化酶中為80位天冬醯胺、在來源於細基格孢屬的果糖基胺基酸氧化酶中為81位穀氨酸、在來源於微紫青黴的果糖基胺基酸氧化酶中為81位天冬醯胺。

另外，「序列號1中記載的胺基酸序列的133位穀氨酸所對應的位置」是指將確定的阿馬多裡酶的胺基酸序列在與序列號1中所示的來源於錐毛殼屬的阿馬多裡酶的胺基酸序列進行比較時，序列號1中記載的胺基酸序列的133位穀氨酸所對應的胺基酸。這也可以通過用上述方法對胺基酸序列進行排列的圖1來確定。

即，在來源於土正青黴的阿馬多裡酶中為133位穀氨酸、在來源於棘殼孢屬的酮胺氧化酶中為133位穀氨酸、在來源於節菱孢屬的酮胺氧化酶中為133位丙氨酸、在來源於棒狀彎孢的酮胺氧化酶中為133位穀氨酸、在來源於侵管新赤殼的酮胺氧化酶中為133位丙氨酸、在來源於新型隱球菌的果糖基胺基酸氧化酶中為133位穀氨酸、在來源於phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶中為131位穀氨酸、在來源於構巢麴黴的果糖基胺基酸氧化酶中為132位穀氨酸、在來源於構巢裸孢殼的果糖基肽氧化酶中為132位穀氨酸、在來源於細基格孢屬的果糖基胺基酸氧化酶中為133位賴氨酸、在來源於微紫青黴的果糖基胺基酸氧化酶中為133位天冬氨酸。

另外，「序列號1中記載的胺基酸序列的253位穀氨酸所對應的位置」是指將確定的阿馬多裡酶的胺基酸序列在與序列號1中所示的來源於錐毛殼屬的阿馬多裡酶的胺基酸序列進行比較時，序列號1中記載的胺基酸序列的253位穀氨酸所對應的胺基酸。這也可以通過用上述方法對胺基酸序列進行排列的圖1來確定。

即，在來源於土正青黴的阿馬多裡酶中為253位丙氨酸、在來源於棘殼孢屬的酮胺氧化酶中為251位丙氨酸、在來源於節菱孢屬的酮胺氧化酶中為253位穀氨酸、在來源於棒狀彎孢的酮胺氧化酶中為251位穀氨酸、在來源於侵管新赤殼的酮胺氧化酶中為253位纈氨酸、在來源於新型隱球菌的果糖基胺基酸氧化酶中為253位穀氨酸、在來源於phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶中為249位精氨酸、在來源於構巢麴黴的果糖基胺基酸氧化酶中為253位丙氨酸、在來源於構巢裸孢殼的果糖基肽氧化酶中為253位丙氨酸、在來源於細基格孢屬的果糖基胺基酸氧化酶中為251位穀氨酸、在來源於微紫青黴的果糖基胺基酸氧化酶中為253位穀氨醯胺。

進一步，「序列號1中記載的胺基酸序列的256位甘氨酸所對應的位置」是指將確定的阿馬多裡酶的胺基酸序列在與序列號1中所示的來源於錐毛殼屬的阿馬多裡酶的胺基酸序列進行比較時，序列號1的阿馬多裡酶的256位甘氨酸所對應的胺基酸。這也可以通過用上述方法對胺基酸序列進行排列的圖1來確定。

即，在來源於土正青黴的阿馬多裡酶中為256位天冬醯胺、在來源於棘殼孢屬的酮胺氧化酶中為254位天冬氨酸、在來源於節菱孢屬的酮胺氧化酶中為256位甘氨酸、在來源於棒狀彎孢的酮胺氧化酶中為254位天冬醯胺、在來源於侵管新赤殼的酮胺氧化酶中為256位甘氨酸、在來源於新型隱球菌的果糖基胺基酸氧化酶中為256位穀氨酸、在來源於phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶中為252位天冬醯胺、在來源於構巢麴黴的果糖基胺基酸氧化酶中為256位天冬醯胺、在來源於構巢裸孢殼的果糖基肽氧化酶中為256位天冬醯胺、在來源於細基格孢屬的果糖基胺基酸氧化酶中為254位天冬醯胺、在來源於微紫青黴的果糖基胺基酸氧化酶中為256位天冬氨酸。

進一步，「序列號1中記載的胺基酸序列的257位纈氨酸所對應的位置」是指將確定的阿馬多裡酶的胺基酸序列在與序列號1中所示的來源於錐毛殼屬的阿馬多裡酶的胺基酸序列進行比較時，序列號1的阿馬多裡酶的257位纈氨酸所對應的胺基酸。這也可以通過用上述方法對胺基酸序列進行排列的圖1來確定。

即，在來源於土正青黴的阿馬多裡酶中為257位纈氨酸、在來源於棘殼孢屬的酮胺氧化酶中為255位蘇氨酸、在來源於節菱孢屬的酮胺氧化酶中為257位半胱氨酸、在來源於棒狀彎孢的酮胺氧化酶中為255位纈氨酸、在來源於侵管新赤殼的酮胺氧化酶中為257位半胱氨酸、在來源於新型隱球菌的果糖基胺基酸氧化酶中為257位半胱氨酸、在來源於phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶中為253位絲氨酸、在來源於構巢麴黴的果糖基胺基酸氧化酶中為257位蘇氨酸、在來源於構巢裸孢殼的果糖基肽氧化酶中為257位蘇氨酸、在來源於細基格孢屬的果糖基胺基酸氧化酶中為255位纈氨酸、在來源於微紫青黴的果糖基胺基酸氧化酶中為257位纈氨酸。

進一步，「序列號1中記載的胺基酸序列的262位天冬醯胺所對應的位置」是指將確定的阿馬多裡酶的胺基酸序列在與序列號1中所示的來源於錐毛殼屬的阿馬多裡酶的胺基酸序列進行比較時，序列號1的阿馬多裡酶的262位天冬醯胺所對應的胺基酸。這也可以通過用上述方法對胺基酸序列進行排列的圖1來確定。

即，在來源於土正青黴的阿馬多裡酶中為262位天冬氨酸、在來源於棘殼孢屬的酮胺氧化酶中為260位天冬醯胺、在來源於節菱孢屬的酮胺氧化酶中為262位組氨酸、在來源於棒狀彎孢的酮胺氧化酶中為260位天冬醯胺、在來源於侵管新赤殼的酮胺氧化酶中為262位組氨酸、在來源於新型隱球菌的果糖基胺基酸氧化酶中為262位天冬醯胺、在來源於phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶中為258位天冬醯胺、在來源於構巢麴黴的果糖基胺基酸氧化酶中為262位天冬氨酸、在來源於構巢裸孢殼的果糖基肽氧化酶中為262位天冬氨酸、在來源於細基格孢屬的果糖基胺基酸氧化酶中為260位天冬醯胺、在來源於微紫青黴的果糖基胺基酸氧化酶中為262位天冬氨酸。

進一步，「序列號1中記載的胺基酸序列的337位穀氨醯胺所對應的位置」是指將確定的阿馬多裡酶的胺基酸序列在與序列號1中所示的來源於錐毛殼屬的阿馬多裡酶的胺基酸序列進行比較時，序列號1的阿馬多裡酶的337位穀氨醯胺所對應的胺基酸。這也可以通過用上述方法對胺基酸序列進行排列的圖1來確定。

即，在來源於土正青黴的阿馬多裡酶中為337位賴氨酸、在來源於棘殼孢屬的酮胺氧化酶中為335位賴氨酸、在來源於節菱孢屬的酮胺氧化酶中為338位穀氨醯胺、在來源於棒狀彎孢的酮胺氧化酶中為335位蘇氨酸、在來源於侵管新赤殼的酮胺氧化酶中為337位賴氨酸、在來源於新型隱球菌的果糖基胺基酸氧化酶中為337位賴氨酸、在來源於phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶中為333位賴氨酸、在來源於構巢麴黴的果糖基胺基酸氧化酶中為337位天冬醯胺、在來源於構巢裸孢殼的果糖基肽氧化酶中為337位天冬醯胺、在來源於細基格孢屬的果糖基胺基酸氧化酶中為335位蘇氨酸、在來源於微紫青黴的果糖基胺基酸氧化酶中為337位賴氨酸。

進一步，「序列號1中記載的胺基酸序列的340位穀氨酸所對應的位置」是指將確定的阿馬多裡酶的胺基酸序列在與序列號1中所示的來源於錐毛殼屬的阿馬多裡酶的胺基酸序列進行比較時，序列號1的阿馬多裡酶的340位穀氨酸所對應的胺基酸。這也可以通過用上述方法對胺基酸序列進行排列的圖1來確定。

即，在來源於土正青黴的阿馬多裡酶中為340位穀氨酸、在來源於棘殼孢屬的酮胺氧化酶中為338位穀氨酸、在來源於節菱孢屬的酮胺氧化酶中為341位穀氨酸、在來源於棒狀彎孢的酮胺氧化酶中為338位穀氨酸、在來源於侵管新赤殼的酮胺氧化酶中為340位脯氨酸、在來源於新型隱球菌的果糖基胺基酸氧化酶中為340位穀氨酸、在來源於phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶中為336位賴氨酸、在來源於構巢麴黴的果糖基胺基酸氧化酶中為340位穀氨酸、在來源於構巢裸孢殼的果糖基肽氧化酶中為340位穀氨酸、在來源於細基格孢屬的果糖基胺基酸氧化酶中為338位穀氨酸、在來源於微紫青黴的果糖基胺基酸氧化酶中為340位穀氨酸。

進一步，「序列號1中記載的胺基酸序列的129位天冬氨酸所對應的位置」是指將確定的阿馬多裡酶的胺基酸序列在與序列號1中所示的來源於錐毛殼屬的阿馬多裡酶的胺基酸序列進行比較時，序列號1的阿馬多裡酶的129位天冬氨酸所對應的胺基酸。這也可以通過用上述方法對胺基酸序列進行排列的圖1來確定。

即，在來源於土正青黴的阿馬多裡酶中為129位穀氨酸、在來源於棘殼孢屬的酮胺氧化酶中為129位天冬氨酸、在來源於節菱孢屬的酮胺氧化酶中為129位天冬氨酸、在來源於棒狀彎孢的酮胺氧化酶中為129位天冬氨酸、在來源於侵管新赤殼的酮胺氧化酶中為129位天冬氨酸、在來源於新型隱球菌的果糖基胺基酸氧化酶中為129位絲氨酸、在來源於phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶中為127位天冬氨酸、在來源於構巢麴黴的果糖基胺基酸氧化酶中為128位穀氨酸、在來源於構巢裸孢殼的果糖基肽氧化酶中為128位穀氨酸、在來源於細基格孢屬的果糖基胺基酸氧化酶中為129位天冬氨酸、在來源於微紫青黴的果糖基胺基酸氧化酶中為129位穀氨酸。

進一步，「序列號1中記載的胺基酸序列的132位天冬氨酸所對應的位置」是指將確定的阿馬多裡酶的胺基酸序列在與序列號1中所示的來源於錐毛殼屬的阿馬多裡酶的胺基酸序列進行比較時，序列號1的阿馬多裡酶的132位天冬氨酸所對應的胺基酸。這也可以通過用上述方法對胺基酸序列進行排列的圖1來確定。

即，在來源於土正青黴的阿馬多裡酶中為132位天冬氨酸、在來源於棘殼孢屬的酮胺氧化酶中為132位天冬氨酸、在來源於節菱孢屬的酮胺氧化酶中為132位天冬氨酸、在來源於棒狀彎孢的酮胺氧化酶中為132位天冬氨酸、在來源於侵管新赤殼的酮胺氧化酶中為132位穀氨酸、在來源於新型隱球菌的果糖基胺基酸氧化酶中為132位天冬氨酸、在來源於phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶中為130位天冬氨酸、在來源於構巢麴黴的果糖基胺基酸氧化酶中為131位天冬氨酸、在來源於構巢裸孢殼的果糖基肽氧化酶中為131位天冬氨酸、在來源於細基格孢屬的果糖基胺基酸氧化酶中為132位天冬氨酸、在來源於微紫青黴的果糖基胺基酸氧化酶中為132位天冬氨酸。

進一步，「序列號1中記載的胺基酸序列的231位穀氨酸所對應的位置」是指將確定的阿馬多裡酶的胺基酸序列在與序列號1中所示的來源於錐毛殼屬的阿馬多裡酶的胺基酸序列進行比較時，序列號1的阿馬多裡酶的231位穀氨酸所對應的胺基酸。這也可以通過用上述方法對胺基酸序列進行排列的圖1來確定。

即，在來源於土正青黴的阿馬多裡酶中為231位穀氨酸、在來源於棘殼孢屬的酮胺氧化酶中為229位穀氨酸、在來源於節菱孢屬的酮胺氧化酶中為231位穀氨酸、在來源於棒狀彎孢的酮胺氧化酶中為229位穀氨酸、在來源於侵管新赤殼的酮胺氧化酶中為231位穀氨酸、在來源於新型隱球菌的果糖基胺基酸氧化酶中為231位穀氨酸、在來源於phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶中為227位組氨酸、在來源於構巢麴黴的果糖基胺基酸氧化酶中為231位穀氨酸、在來源於構巢裸孢殼的果糖基肽氧化酶中為231位穀氨酸、在來源於細基格孢屬的果糖基胺基酸氧化酶中為229位穀氨醯胺、在來源於微紫青黴的果糖基胺基酸氧化酶中為231位穀氨酸。

進一步，「序列號1中記載的胺基酸序列的232位天冬氨酸所對應的位置」是指將確定的阿馬多裡酶的胺基酸序列在與序列號1中所示的來源於錐毛殼屬的阿馬多裡酶的胺基酸序列進行比較時，序列號1的阿馬多裡酶的232位天冬氨酸所對應的胺基酸。這也可以通過用上述方法對胺基酸序列進行排列的圖1來確定。

即，在來源於土正青黴的阿馬多裡酶中為232位天冬氨酸、在來源於棘殼孢屬的酮胺氧化酶中為230位天冬氨酸、在來源於節菱孢屬的酮胺氧化酶中為232位穀氨酸、在來源於棒狀彎孢的酮胺氧化酶中為230位天冬氨酸、在來源於侵管新赤殼的酮胺氧化酶中為232位穀氨酸、在來源於新型隱球菌的果糖基胺基酸氧化酶中為232位甘氨酸、在來源於phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶中為228位穀氨酸、在來源於構巢麴黴的果糖基胺基酸氧化酶中為232位穀氨酸、在來源於構巢裸孢殼的果糖基肽氧化酶中為232位穀氨酸、在來源於細基格孢屬的果糖基胺基酸氧化酶中為230位天冬氨酸、在來源於微紫青黴的果糖基胺基酸氧化酶中為232位天冬氨酸。

進一步，「序列號1中記載的胺基酸序列的249位穀氨酸所對應的位置」是指將確定的阿馬多裡酶的胺基酸序列在與序列號1中所示的來源於錐毛殼屬的阿馬多裡酶的胺基酸序列進行比較時，序列號1的阿馬多裡酶的249位穀氨酸所對應的胺基酸。這也可以通過用上述方法對胺基酸序列進行排列的圖1來確定。

即，在來源於土正青黴的阿馬多裡酶中為249位賴氨酸、在來源於棘殼孢屬的酮胺氧化酶中為247位賴氨酸、在來源於節菱孢屬的酮胺氧化酶中為249位組氨酸、在來源於棒狀彎孢的酮胺氧化酶中為247位穀氨酸、在來源於侵管新赤殼的酮胺氧化酶中為249位穀氨酸、在來源於新型隱球菌的果糖基胺基酸氧化酶中為249位穀氨酸、在來源於phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶中為245位穀氨酸、在來源於構巢麴黴的果糖基胺基酸氧化酶中為249位丙氨酸、在來源於構巢裸孢殼的果糖基肽氧化酶中為249位丙氨酸、在來源於細基格孢屬的果糖基胺基酸氧化酶中為247位絲氨酸、在來源於微紫青黴的果糖基胺基酸氧化酶中為249位穀氨醯胺。

(熱穩定性提高缺失的對應位置)

本說明書中「從序列號1記載的阿馬多裡酶的羧基末端起的3個胺基酸殘基所對應的位置」是指將阿馬多裡酶的胺基酸序列在與序列號1中所示的來源於錐毛殼屬的阿馬多裡酶的胺基酸序列進行比較時，從序列號1中記載的胺基酸序列的羧基末端起的3個胺基酸殘基。來源於錐毛殼屬的阿馬多裡酶中該位置的3個殘基序列由435位脯氨酸、436位賴氨酸和437位亮氨酸組成，對應於這些位置的胺基酸序列也可以通過用上述方法對胺基酸序列進行排列的圖1來確定。

即，在來源於土正青黴的阿馬多裡酶中為羧基末端的3個胺基酸由435位丙氨酸、436位組氨酸和437位亮氨酸組成；在來源於棘殼孢屬的酮胺氧化酶中為羧基末端的3個胺基酸由438位丙氨酸、439位賴氨酸和440位亮氨酸組成；在來源於節菱孢屬的酮胺氧化酶中為羧基末端的3個胺基酸由450位組氨酸、451位賴氨酸和452位亮氨酸組成；在來源於棒狀彎孢的酮胺氧化酶中為羧基末端的3個胺基酸由438位絲氨酸、439位賴氨酸和440位亮氨酸組成；在來源於phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶中為羧基末端的3個胺基酸由435位丙氨酸、436位天冬醯胺和437位亮氨酸組成；在來源於構巢麴黴的果糖基胺基酸氧化酶中為羧基末端的3個胺基酸由436位丙氨酸、437位賴氨酸和438位甲硫氨酸組成；在來源於構巢裸孢殼的果糖基肽氧化酶中為羧基末端的3個胺基酸由436位丙氨酸、437位賴氨酸和438位甲硫氨酸組成；在來源於細基格孢屬的果糖基胺基酸氧化酶中為羧基末端的3個胺基酸由439位丙氨酸、440位賴氨酸和441位亮氨酸組成；在來源於微紫青黴的果糖基胺基酸氧化酶中為羧基末端的3個胺基酸由435位丙氨酸、436位賴氨酸和437位亮氨酸組成。

(本發明阿馬多裡酶的生產)

在使用具有如上所述得到的阿馬多裡酶生產能力的菌株進行生成該阿馬多裡酶時，可以利用通常的固體培養法培養該菌株，在可能的範圍內優選採用液體培養法進行培養。

另外，作為培養上述菌株的培養基，例如，可使用如下得到的培養基：在酵母提取物、胰蛋白腖、蛋白腖、肉提取物、玉米漿或大豆或者小麥麩的浸出液等一種以上的氮源中添加氯化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鎂、氯化鐵、硫酸鐵或硫酸錳等一種以上的無機鹽，根據需要進一步適當添加糖質原料、維生素等而成。

予以說明，培養基的初始ph值優選調整為ph7～9。

另外，培養可以採用任意的條件，例如，可以通過深層通氣攪拌培養、振蕩培養、靜置培養等在20～42℃的培養溫度、優選30℃左右的培養溫度下實施4～24小時、進一步優選在30℃左右的培養溫度下實施8～16小時。

培養結束後，由該培養物採集阿馬多裡酶可以使用通常的酶採集手段而得到。例如，可以通過常規方法對菌體實施超聲波破壞處理、研磨處理等、或者使用溶菌酶等裂解酶提取該酶、或者在甲苯等存在下振蕩或者放置進行溶菌，使該酶向菌體外排出。然後，過濾該溶液並進行離心分離等除去固體部分，根據需要利用鏈黴素硫酸鹽、魚精蛋白硫酸鹽或硫酸錳等除去核酸後，向其中添加硫酸銨、乙醇、丙酮等並進行分離，採集沉澱物，從而得到阿馬多裡酶的粗酶。

為了由上述阿馬多裡酶的粗酶進一步得到阿馬多裡酶純化酶標準品，例如，可適當選擇使用sephadex、superdex或ultrogel等的凝膠過濾法；使用離子交換體的吸附溶出法；使用聚丙烯醯胺凝膠等的電泳法；使用羥基磷灰石的吸附溶出法；蔗糖密度梯度離心法等沉降法；親和層析法；使用分子篩膜或者中空纖維膜等的分離法等，或將這些方法組合實施，從而能夠得到經純化的阿馬多裡酶酶標準品。由此，能夠得到所期望的脫氫酶活性提高的阿馬多裡酶。

本發明試劑盒所包含的阿馬多裡酶可以是來源於正青黴屬、棘殼孢屬、節菱孢屬、彎孢屬、新赤殼屬、隱球菌屬、暗球腔菌屬、麴黴屬、裸孢殼屬、細基格孢屬、青黴屬、鐮刀菌屬、achaetomiella屬、無毛毛殼屬、梭孢殼屬、毛殼屬、五穀麻孢殼屬、小囊菌屬、小球腔菌屬、蛇孢腔菌屬、格孢腔菌屬、閉毛孢殼屬、畢赤酵母菌屬、棒狀桿菌屬、土壤桿菌屬、節桿菌屬等的天然的阿馬多裡酶或它們的突變體。這樣的突變體在選自於序列號1所示的胺基酸序列的280位半胱氨酸、267位苯丙氨酸、269位苯丙氨酸、54位天冬氨酸、241位酪氨酸的位置的胺基酸所對應位置上有1個或1個以上的胺基酸取代。本領域技術人員可以通過例如後述的試驗法等，容易地研究出某種阿馬多裡酶或其突變體是否能用於本發明的試劑盒，即是否具有所期望的脫氫酶活性。

(本發明阿馬多裡酶中的脫氫酶活性的提高)

通過如上所述的手段得到的本發明阿馬多裡酶的特徵在於利用基因修飾等使其胺基酸序列產生突變，結果與修飾前的阿馬多裡酶相比，氧化酶活性降低、且/或脫氫酶活性提高。具體的特徵在於與修飾前的阿馬多裡酶相比，相當於「脫氫酶活性」的「氧化酶活性」的比率降低。氧化酶活性是指在氧化底物時，向氧分子傳遞電子的活性。脫氫酶活性是指在氧化底物時，將氫(h-)傳遞到電子受體的活性。

在使用傳感器的糖化血紅蛋白的測定中，為了降低氧氣的影響，希望氧化酶活性低。另一方面，從與底物的反應性角度出發，則優選脫氫酶的活性高。如果兼具考慮二者，在使用電子媒介體的糖化血紅蛋白測定中，優選阿馬多裡酶的氧化酶活性(ox)與脫氫酶活性(dh)之比ox/dh為低，此外，優選阿馬多裡酶的氧化酶活性(ox)低且脫氫酶活性(dh)高。所以本說明書中為了方便起見，有時使用脫氫酶活性相對於氧化酶活性的比率dh/ox或者氧化酶活性相對於脫氫酶活性的比率ox/dh來表示阿馬多裡酶的特性。一實施方式中本發明的修飾阿馬多裡酶與修飾前的阿馬多裡酶相比，脫氫酶活性增強。一實施方式中本發明的修飾阿馬多裡酶與修飾前的阿馬多裡酶相比，氧化酶活性降低。一實施方式中本發明的修飾阿馬多裡酶與修飾前的阿馬多裡酶相比，脫氫酶活性與氧化酶活性之比ox/dh比低(dh/ox比高)。一實施方式中本發明的修飾阿馬多裡酶與修飾前的阿馬多裡酶相比，不僅脫氫酶活性增強，而且氧化酶活性降低。具體地，本發明的修飾阿馬多裡酶中的表示脫氫酶活性相對於氧化酶活性的比率dh/ox，與修飾前(1.0倍)相比，優選增強1.3倍以上、2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、100倍以上、200倍以上、300倍以上、400倍以上、例如450倍以上。此外，本發明的修飾阿馬多裡酶中的表示氧化酶活性相對於脫氫酶活性的比率ox/dh，與修飾前(100％)相比，優選降低至小於90％、小於80％、小於75％、小於50％、小於40％、小於30％、小於20％、小於10％、小於5％、小於2％、小於1％、0.5％、例如小於0.2％。

氧化酶活性相對於脫氫酶活性的比率可以使用公知的阿馬多裡酶測定法在任意條件下進行測定，並與修飾前的阿馬多裡酶進行比較。例如，在ph7.0時，用添加1mm的某種糖化底物例如添加αfv而測定的脫氫酶活性除以添加1mm的該糖化底物例如添加αfv而測定的氧化酶活性而求出比率，由此計算出氧化酶活性相對於脫氫酶活性的比率，從而能夠將其在修飾前與修飾後的阿馬多裡酶中進行比較。

(高通量篩選)

為了獲得功能性阿馬多裡酶突變體還可以將阿馬多裡酶用於高通量篩選。例如製作具有導入突變的阿馬多裡酶基因的轉化或轉導株的文庫，可以將其用於基於微量滴定板的高通量篩選、或者可以將其用於基於液滴型微流體的超高通量篩選。作為例子，可舉出構建編碼突變的突變基因的組合文庫，接著利用噬菌體展示技術(例如chem.rev.105(11)：4056-72,2005)、酵母展示技術(例如combchemhighthroughputscreen.2008；11(2)：127-34)、細菌展示技術(例如curropinstructbiol17：474-80,2007)等，對突變阿馬多裡酶的大群落進行篩選的方法。此外參照agrestietal,"ultrahigh-throughputscreeningindrop-basedmicrofluidicsfordirectedevolution"proceedingsofthenationalacademyofsciences107(9)：4004-4009(mar,2010)。關於可用於阿馬多裡酶突變篩選的超高通量篩選手段的該文獻的記載通過參照併入本說明書中。例如可通過錯配pcr法來構建文庫。此外也可以使用飽和誘變，以本說明書所記載的位置或其所對應位置為目標導入突變來構建文庫。利用文庫轉化電轉化感受態eby-100細胞等適當的細胞，可獲得約107個突變體。可將用該文庫轉化的酵母細胞接著用於細胞分選。也可以使用利用標準軟光刻法製作的聚二甲基矽氧烷(pdms)微流體裝置。可使用流動聚焦裝置形成單分散的液滴。將含有個別突變體而形成的液滴用於適當的分選裝置中。在分選細胞時可利用有無脫氫酶活性。突變導入和分選可以重複多次。

(阿馬多裡酶活性的測定方法)

阿馬多裡酶的活性具有氧化酶活性與脫氫酶活性，可以通過使用各種方法進行測定。作為一例，下面對本發明中使用的阿馬多裡酶活性的測定方法進行說明。

(阿馬多裡酶的氧化酶活性的測定方法)

作為本發明中阿馬多裡酶的氧化酶活性的測定方法，可舉出測定由酶促反應而生成的過氧化氫量的方法、測定由酶促反應而消耗的氧量的方法等作為主要的測定方法。下面作為一例，示出測定過氧化氫量的方法。

下面除非另有說明，則在本發明中阿馬多裡酶的氧化酶活性測定中使用果糖基纈氨酸作為底物。予以說明，在一實施方式中，酶效價在使用果糖基纈氨酸為底物進行測定時，每分鐘生成1μmol過氧化氫的酶量定為1u。果糖基纈氨酸等糖化胺基酸、以及果糖基纈氨醯基組氨酸等糖化肽可根據阪上等人的方法進行合成、純化(參照日本特開2001-95598號)。予以說明，這是為了說明測定方法的方便，但本發明中使用的阿馬多裡酶的底物特異性絕不限於果糖基纈氨酸。

a.試劑的製備

(1)試劑1：pod-4-aa溶液

將4.0ku的過氧化酶(龜甲萬株式會社制)、100mg的4-氨基安替比林(東京化成工業株式會社制)溶解於0.1m的磷酸鉀緩衝液(ph7.0)中，定容至1l。

(2)試劑2：toos溶液

500mg的toos(n-乙基-n-(2-羥基-3-磺丙基)-m-甲基苯胺鈉、株式會社同仁化學研究所制)溶解於離子交換水中，定容至100ml。

(3)試劑3：底物溶液(30mm；終濃度1mm)

將果糖基纈氨酸83mg溶解於離子交換水中，定容至10ml。

b.測定法

混合2.7ml的試劑1，100μl的試劑2、和100μl的試劑3，在37℃下預加溫5分鐘。然後，加入100μl的酶液並充分混合後，利用分光光度計(u-3010，株式會社日立高新技術制)測定555nm處的吸光度。測定值為在555nm處1分鐘後至3分鐘後的每分鐘的吸光度變化。予以說明，對照液除了加入100μl的離子交換水代替100μl的試劑3以外，與上述同樣地製備。將在37℃下每分鐘生成的過氧化氫的微摩爾數作為酶液中的活性單位(u)，並按照下述式計算。

活性(u/ml)＝{(δas-δa0)×3.0×df}÷(39.2×0.5×0.1)

δas：反應液每分鐘的吸光度變化

δa0：對照液每分鐘的吸光度變化

39.2：反應生成的醌亞胺的毫摩爾吸光係數(mm-1·cm-1)

0.5：每mol過氧化氫生成的醌亞胺色素的mol數

df：稀釋係數。

(阿馬多裡酶的脫氫酶活性的測定方法)

作為本發明中阿馬多裡酶的脫氫酶活性的測定方法，可舉出利用氧以外的電子媒介體作為電子受體，對氧化型電子媒介體的消耗量進行測定的方法、對由酶促反應得到的甲染料的生成量進行測定的方法等作為主要測定方法。下面作為一例，示出測定甲染料生成量的方法。

下面除非另有說明，則在本發明中阿馬多裡酶的氧化酶活性測定中使用果糖基纈氨酸作為底物。予以說明，酶效價在使用果糖基纈氨酸為底物進行測定時，每分鐘生成1μmol甲染料的酶量定為1u。

c.試劑的製備

(4)試劑4：wst-3溶液

將700mg的wst-3(2-(4-碘苯)-3-(2，4-二硝基苯)-5-(2，4-二磺基苯)-2h-四氮唑單鈉鹽，株式會社同仁化學研究所制)溶解於離子交換水(ph7.0)中，定容至100ml。

(5)試劑5：甲氧基pms(mpms)溶液

將50mg的mpms(1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酯鹽，株式會社同仁化學研究所制)溶解於離子交換水中，定容至10ml。

d.測定法

在541μl的95mm磷酸鉀緩衝液(ph7.0)中混和150μl的試劑4、9μl的試劑5和25μl的酶液，在37℃下預加溫5分鐘。然後，加入25μl的試劑3並充分混合後，利用分光光度計(u-3010，株式會社日立高新技術制)測定在433nm處的吸光度。測定值為在433nm處1分鐘後至2分鐘後的每分鐘的吸光度變化。予以說明，對照液除了加入25μl的離子交換水代替25μl的試劑3以外，與上述同樣地製備。將在37℃下每分鐘生成的wst-3的甲染料的微摩爾數作為酶液中的活性單位(u)，並按照下述式計算。

活性(u/ml)＝{(δas-δa0)×0.75×df}÷(31×0.025)

δas：反應液每分鐘的吸光度變化

δa0：對照液每分鐘的吸光度變化

31：反應生成的wst-3的甲染料的毫摩爾吸光係數(mm-1·cm-1)

df：稀釋係數。

(測定試劑盒、傳感器)

一實施方式中，本發明提供包含脫氫酶活性提高的本發明阿馬多裡酶的hba1c測定試劑盒及hba1c測定裝置。該試劑盒或裝置根據情況也可以含有電子媒介體。

一實施方式中，本發明提供包含脫氫酶活性提高的本發明阿馬多裡酶的固定酶電極。一實施方式中，脫氫酶活性提高的本發明阿馬多裡酶可以塗布、吸附或固定化於酶電極上。另一實施方式中，電子媒介體也可以塗布、吸附或固定化於電極上。作為電極可以使用碳素電極、鉑、金、銀、鎳、鈀等金屬電極等。碳素電極時，作為材料可舉出熱解石墨(pg)、玻璃碳(gc)、碳糊、塑性成型炭(pfc)等。測定體系可以是二電極系也可以是三電極系，例如可在工作電極上固定酶。作為參比電極，可舉出標準氫電極、可逆氫電極、銀-氯化銀電極(ag/agcl)、鈀-氫電極、飽和甘汞電極等，從穩定性及再現性的角度出發，優選使用ag/agcl。

酶可通過交聯、透析膜的包覆、包封到聚合物基質、使用光交聯聚合物、使用導電性聚合物、使用氧化/還原聚合物等固定在電極上。此外也可以將酶與電子媒介體一起固定在聚合物中或者吸附固定在電極上，也可以組合這些手段。

本發明的阿馬多裡酶通過使用恆電位儀、恆電流儀等，可以適用於各種電化學測定手段。作為電化學測定法，可舉出電流測定法、電勢測定法、電量測定法等各種手段。例如通過電流測定法對被還原的媒介體被外加電壓氧化時產生的電流值進行測定，由此可以計算樣品中糖化底物的濃度。外加電壓也根據媒介體及裝置設定，例如可設為-1000～+1000mv(相對於ag/agcl)等。

糖化底物(例如αfvh)濃度的測定，例如可如下所述進行。恆溫皿中放入緩衝液，保持一定溫度。作為媒介體，可使用鐵氰化鉀、吩嗪硫酸甲酯等。作為工作電極使用固定化本發明修飾型阿馬多裡酶的電極，並使用對電極(例如鉑電極)和參比電極(例如ag/agcl電極)。向碳電極外加一定電壓，電流穩定後，加入含有糖化底物(例如αfvh)的樣品測定電流的增加。按照由標準濃度的糖化底物(例如αfvh)溶液製作的校準曲線，可以計算樣品中的糖化底物(αfvh)濃度。

進一步，為了降低測定所需的溶液量，可使用印刷電極。此時，電極優選在絕緣基板上形成。具體地為理想地利用光刻技術、絲網印刷、凹版印刷、柔性版印刷等印刷技術在基板上形成電極。此外，作為絕緣基板的原材料，可舉出矽、玻璃、陶瓷、聚氯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚酯等，更優選對各種溶劑及化學品耐受性強的材料。

一實施方式中，本發明提供包括該酶電極的傳感器。

另一實施方式中，可利用本發明的酶電極，通過測定由酶促反應產生的電流，從而確定樣品中的阿馬多裡化合物的濃度。作為一例，將酶電極作為工作電極，將其與對電極和參比電極一起使用。對電極可為例如鉑電極，參比電極可為例如ag/agcl電極。保持一定溫度，將電極插入含有媒介體的緩衝液中。對工作電極外加電壓，添加樣品後，測定電流變化。

本發明的測定方法、試劑盒、裝置及用於傳感器的媒介體(也稱為人工電子媒介體、人工電子受體、電子媒介體)只要是從脫氫酶活性提高的本發明阿馬多裡酶接受電子則無特別限定。作為媒介體，醌類、吩嗪類、紫精類、細胞色素類、吩噁嗪類、吩噻嗪類、鐵氰化物例如鐵氰化鉀、鐵氧還蛋白類、二茂鐵、鋨配合物及其衍生物等，作為吩嗪化合物可舉出例如pms、甲氧基pms，但並不限定於這些。

一實施方式中本發明的修飾阿馬多裡酶的脫氫酶活性提高。一實施方式中本發明的修飾阿馬多裡酶的氧化酶活性降低。一實施方式中，本發明的修飾阿馬多裡酶的氧化酶活性/脫氫酶活性比(ox/dh比)降低。此外一實施方式中，本發明的修飾阿馬多裡酶的脫氫酶活性提高、且氧化酶活性降低。這樣的本發明的修飾阿馬多裡酶的催化酶促反應不受、幾乎不受或不易受氧氣的影響。本發明的修飾阿馬多裡酶可以與現有的阿馬多裡酶用於相同的用途。此外，本發明的阿馬多裡酶可以用於樣品中的糖化底物濃度的測定，這能有助於例如糖尿病的診斷。此外，本發明的阿馬多裡酶可以作為酶電極進行使用。這可以用於各種電化學的測定。此外，本發明的阿馬多裡酶可以作為酶傳感器進行使用。此外，本發明的阿馬多裡酶可以用在糖尿病標記物的測定試劑盒中。但這是示例，本發明的修飾阿馬多裡酶的用途並不限於這些。

[實施例1]

(關於脫氫酶活性提高型突變)

(1)重組質粒pkk223-3-cfp-t7dna的製備

將具有包含cfp-t7基因(序列號2)的重組體質粒的大腸桿菌jm109(pkk223-3-cfp-t7)株(參照國際公開2007/125779號)接種於lb-amp培養基[1％(w/v)bacto胰蛋白腖、0.5％(w/v)蛋白腖、0.5％(w/v)nacl、50μg/ml氨苄青黴素]2.5ml中，在37℃下振蕩培養20小時，得到培養物。

以7,000rpm對該培養物離心分離5分鐘進行菌體收集而得到菌體。接著，使用qiagentip-100(qiagen公司制)從該菌體提取重組質粒pkk223-3-cfp-t7並純化，得到2.5μg重組質粒pkk223-3-cfp-t7的dna。

(2)重組質粒pkk223-3-cfp-t7dna的位點特異性修飾操作

以得到的重組質粒pkk223-3-cfp-t7dna為模板，使用序列號14、15的合成寡核苷酸、kod-plus-(東洋紡株式會社制)，按照下面的條件進行pcr反應。

即，加入10×kod-plus-緩衝液5μl、使dntp各為2mm製備而成的dntps混合溶液5μl、25mm的mgso4溶液2μl、50ng作為模板的pkk223-3-cfp-t7dna、上述合成寡核苷酸各15pmol、1u的kod-plus-，用滅菌水調整總體積為50μl。使用熱循環儀(eppendorf公司制)對製備的反應液在94℃下孵育2分鐘，接著，重複進行30次的「94℃，15秒」-「50℃，30秒」-「68℃，6分」的循環。

將一部分反應液用1.0％瓊脂糖凝膠進行電泳，確認約6,000bp的dna得到特異性地擴增。這樣得到的dna用限制性內切酶dpni(newenglandbiolabs公司制)處理，切斷殘存的模板dna後，轉化大腸桿菌jm109，塗布於lb-amp瓊脂培養基上。將生長的菌落接種於lb-amp培養基進行振蕩培養，用與上述(1)同樣的方法分離質粒dna。使用多毛細管dna分析系統appliedbiosystems3130xl基因分析儀(lifetechnologies公司制)確定該質粒中編碼阿馬多裡酶的dna鹼基序列，其結果，得到編碼序列號1中記載的胺基酸序列的280位半胱氨酸被取代為穀氨醯胺的修飾型阿馬多裡酶的重組質粒(pkk223-3-cfp-t7-280q)。

用同樣的操作步驟，為了將序列號1中記載的胺基酸序列的280位半胱氨酸取代為絲氨酸，以重組質粒pkk223-3-cfp-t7dna為模板，使用序列號15、16的合成寡核苷酸、kod-plus-(東洋紡株式會社制)，在與上述同樣的條件下進行pcr反應、轉化大腸桿菌jm109和確定生長菌落所保有的質粒dna中編碼阿馬多裡酶的dna的鹼基序列。其結果，得到編碼序列號1中記載的胺基酸序列的280位半胱氨酸被取代為絲氨酸的修飾型阿馬多裡酶的重組質粒(pkk223-3-cfp-t7-280s)。

同樣地以重組質粒pkk223-3-cfp-t7dna為模板，但使用序列號15、17的合成寡核苷酸，得到編碼序列號1中記載的胺基酸序列的280位半胱氨酸被取代為天冬氨酸的修飾型阿馬多裡酶的重組質粒(pkk223-3-cfp-t7-280d)。

同樣地以重組質粒pkk223-3-cfp-t7dna為模板，但使用序列號15、18的合成寡核苷酸，得到編碼序列號1中記載的胺基酸序列的280位半胱氨酸被取代為穀氨酸的修飾型阿馬多裡酶的重組質粒(pkk223-3-cfp-t7-280e)。

同樣地以重組質粒pkk223-3-cfp-t7dna為模板，但使用序列號15、19的合成寡核苷酸，得到編碼序列號1中記載的胺基酸序列的280位半胱氨酸被取代為甲硫氨酸的修飾型阿馬多裡酶的重組質粒(pkk223-3-cfp-t7-280m)。

同樣地以重組質粒pkk223-3-cfp-t7dna為模板，但使用序列號15、20的合成寡核苷酸，得到編碼序列號1中記載的胺基酸序列的280位半胱氨酸被取代為賴氨酸的修飾型阿馬多裡酶的重組質粒(pkk223-3-cfp-t7-280k)。

同樣地以重組質粒pkk223-3-cfp-t7dna為模板，但使用序列號15、21的合成寡核苷酸，得到編碼序列號1中記載的胺基酸序列的280位半胱氨酸被取代為精氨酸的修飾型阿馬多裡酶的重組質粒(pkk223-3-cfp-t7-280r)。

同樣地以重組質粒pkk223-3-cfp-t7dna為模板，但使用序列號15、22的合成寡核苷酸，得到編碼序列號1中記載的胺基酸序列的280位半胱氨酸被取代為纈氨酸的修飾型阿馬多裡酶的重組質粒(pkk223-3-cfp-t7-280v)。

同樣地以重組質粒pkk223-3-cfp-t7dna為模板，但使用序列號15、23的合成寡核苷酸，得到編碼序列號1中記載的胺基酸序列的280位半胱氨酸被取代為天冬醯胺的修飾型阿馬多裡酶的重組質粒(pkk223-3-cfp-t7-280n)。

同樣地以重組質粒pkk223-3-cfp-t7dna為模板，但使用序列號24、25的合成寡核苷酸，得到編碼序列號1中記載的胺基酸序列的267位苯丙氨酸被取代為酪氨酸的修飾型阿馬多裡酶的重組質粒(pkk223-3-cfp-t7-267y)。

同樣地以重組質粒pkk223-3-cfp-t7dna為模板，但使用序列號26、27的合成寡核苷酸，得到編碼序列號1中記載的胺基酸序列的269位苯丙氨酸被取代為酪氨酸的修飾型阿馬多裡酶的重組質粒(pkk223-3-cfp-t7-269y)。

同樣地以重組質粒pkk223-3-cfp-t7dna為模板，但使用序列號28、29的合成寡核苷酸，得到編碼序列號1中記載的胺基酸序列的54位天冬氨酸被取代為天冬醯胺被的修飾型阿馬多裡酶的重組質粒(pkk223-3-cfp-t7-54n)。

同樣地以重組質粒pkk223-3-cfp-t7dna為模板，但使用序列號29、30的合成寡核苷酸，得到編碼序列號1中記載的胺基酸序列的54位天冬氨酸被取代為丙氨酸的修飾型阿馬多裡酶的重組質粒(pkk223-3-cfp-t7-54a)。

同樣地以重組質粒pkk223-3-cfp-t7dna為模板，但使用序列號31、32的合成寡核苷酸，得到編碼序列號1中記載的胺基酸序列的241位酪氨酸被取代為穀氨酸的修飾型阿馬多裡酶的重組質粒(pkk223-3-cfp-t7-241e)。

同樣地以重組質粒pkk223-3-cfp-t7dna為模板，但使用序列號32、33的合成寡核苷酸，得到編碼序列號1中記載的胺基酸序列的241位酪氨酸被取代為穀氨醯胺的修飾型阿馬多裡酶的重組質粒(pkk223-3-cfp-t7-241q)。

同樣地以重組質粒pkk223-3-cfp-t7dna為模板，但使用序列號32、34的合成寡核苷酸，得到編碼序列號1中記載的胺基酸序列的241位酪氨酸被取代為賴氨酸的修飾型阿馬多裡酶的重組質粒(pkk223-3-cfp-t7-241k)。

同樣地以重組質粒pkk223-3-cfp-t7dna為模板，但使用序列號35、36的合成寡核苷酸，得到編碼序列號1中記載的胺基酸序列的280位半胱氨酸被取代為組氨酸的修飾型阿馬多裡酶的重組質粒(pkk223-3-cfp-t7-280h)。

同樣地以重組質粒pkk223-3-cfp-t7dna為模板，但使用序列號35、37的合成寡核苷酸，得到編碼序列號1中記載的胺基酸序列的280位半胱氨酸被取代為蘇氨酸的修飾型阿馬多裡酶的重組質粒(pkk223-3-cfp-t7-280t)。

同樣地以重組質粒pkk223-3-cfp-t7dna為模板，但使用序列號38、39的合成寡核苷酸，在進行pcr反應、dpni處理後，加入dpni處理過的dna2μl、ligationhighver.2(東洋紡株式會社制)5μl、5u/μl的t4多聚核苷酸激酶1μl，用滅菌水調整總體積為15μl，在16℃下反應1小時。然後，使用反應液轉化大腸桿菌jm109，得到保有編碼序列號1中記載的胺基酸序列的267位苯丙氨酸被取代為亮氨酸的修飾型阿馬多裡酶的重組質粒(pkk223-3-cfp-t7-267l)的大腸桿菌jm109株。

同樣地以重組質粒pkk223-3-cfp-t7dna為模板，但使用序列號38、40的合成寡核苷酸，在進行pcr反應、dpni處理後，加入dpni處理過的dna2μl、ligationhighver.2(東洋紡株式會社制)5μl、5u/μl的t4多聚核苷酸激酶1μl，用滅菌水調整總體積為15μl，在16℃下反應1小時。然後，使用反應液轉化大腸桿菌jm109，得到編碼序列號1中記載的胺基酸序列的267位苯丙氨酸被取代為甲硫氨酸的修飾型阿馬多裡酶的重組質粒(pkk223-3-cfp-t7-267m)。

同樣地以重組質粒pkk223-3-cfp-t7dna為模板，但使用序列號41、42的合成寡核苷酸，在進行pcr反應、dpni處理後，加入dpni處理過的dna2μl、ligationhighver.2(東洋紡株式會社制)5μl、5u/μl的t4多聚核苷酸激酶1μl，用滅菌水調整總體積為15μl，在16℃下反應1小時。然後，使用反應液轉化大腸桿菌jm109，得到編碼序列號1中記載的胺基酸序列的269位苯丙氨酸被取代為亮氨酸的修飾型阿馬多裡酶的重組質粒(pkk223-3-cfp-t7-269l)。

同樣地以重組質粒pkk223-3-cfp-t7dna為模板，但使用序列號41、43的合成寡核苷酸，在進行pcr反應、dpni處理後，加入dpni處理過的dna2μl、ligationhighver.2(東洋紡株式會社制)5μl、5u/μl的t4多聚核苷酸激酶1μl，用滅菌水調整總體積為15μl，在16℃下反應1小時。然後，使用反應液轉化大腸桿菌jm109，得到編碼序列號1中記載的胺基酸序列的269位苯丙氨酸被取代為甲硫氨酸的修飾型阿馬多裡酶的重組質粒(pkk223-3-cfp-t7-269m)。

pcr反應、轉化和鹼基序列確定均與上述同樣地進行。

(3)各種修飾型阿馬多裡酶的生產

將保有由上述操作步驟得到的上述重組質粒的各大腸桿菌jm109株在添加有0.1mmiptg的lb-amp培養基3ml中在30℃下培養16小時。然後，用ph7.0的0.01m磷酸緩衝液洗滌各菌體，並進行超聲波粉碎，以15000rpm離心分離10分鐘，製備各粗酶液1.5ml。

(4)各種修飾型阿馬多裡酶的氧化酶活性和脫氫酶活性評價

將這樣製備的各粗酶液作為樣品，按照上述的氧化酶活性測定法和脫氫酶活性測定法，對各種修飾型阿馬多裡酶的氧化酶活性和脫氫酶活性進行評價。結果的一例如表1所示。

表1中，cfp-t7表示來源於大腸桿菌jm109(pkk223-3-cfp-t7)株的阿馬多裡酶。予以說明，本實施例中將來源於大腸桿菌jm109(pkk223-3-cfp-t7)株的阿馬多裡酶的cfp-t7作為突變原酶，因此表中記載的「胺基酸突變」的記載中cfp-t7未包含已經導入的各種突變點。表中，氧化酶活性(％)和脫氫酶活性(％)以原酶cfp-t7的氧化酶活性(u/ml)為100時的百分率來表示。此外，表中的ox/dh(％)表示為以原酶cfp-t7的ox/dh比為100時的百分率。

[表1]

如表1所示，可知在本實施例的條件下，cfp-t7的氧化酶活性相對於脫氫酶活性的比率ox/dh為26.0，受到很強的氧氣的影響。對此，在通過位點特異性突變導入而得到的22個突變體中，全部是除去c280v的突變體，即，在cfp-t7的280位半胱氨酸至穀氨醯胺、絲氨酸、天冬氨酸、穀氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸、精氨酸、天冬醯胺、組氨酸、蘇氨酸；267位苯丙氨酸至酪氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸；269位苯丙氨酸至酪氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸；54位天冬氨酸至天冬醯胺、丙氨酸；241位酪氨酸至穀氨酸、穀氨醯胺、賴氨酸的各突變的阿馬多裡酶中，ox/dh均改善至19以下，明顯地改善至10以下，更明顯地改善至6以下，進一步明顯的改善至3.7以下。特別是對於c280q、c280s、f267y、f267l、f267m、f269y、f269l、f269m、y241q，與cfp-t7相比，顯示出不但脫氫酶活性提高，而且氧化酶活性也降低。因此，表明這些各突變點是使阿馬多裡酶的脫氫酶活性提高的突變點。

對於280位，由於被取代為穀氨醯胺、絲氨酸、天冬醯胺得到良好的結果，因此認為被取代為相同極性胺基酸殘基的蘇氨酸也能得到同樣的結果，該結果如上所述得到確認。

此外對於280位，由於被取代為天冬氨酸、穀氨酸、賴氨酸、精氨酸得到良好的結果，因此認為被取代為相同帶電胺基酸殘基的組氨酸也能得到同樣的結果，該結果如上所述得到確認。

此外對於280位，由於被取代為甲硫氨酸得到良好的結果，因此認為被取代為相同的大體積的胺基酸的苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、以及脯氨酸也能得到同樣的結果。

對於267位和269位，由於被取代為酪氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸得到良好的結果，因此認為被取代為相同疏水性胺基酸殘基的異亮氨酸、色氨酸、以及纈氨酸、丙氨酸也能得到同樣的結果。

對於54位，由於被取代為天冬醯胺得到良好的結果，因此認為被取代為相同極性胺基酸殘基的穀氨醯胺也能得到同樣的結果。此外，由於被取代為極性胺基酸殘基得到良好的結果，因此認為被取代為帶電胺基酸的組氨酸也能得到同樣的結果。

此外對於54位，由於被取代為丙氨酸得到良好的結果，因此認為被取代為相同非極性且側鏈較小的甘氨酸和纈氨酸也能得到同樣的結果。

對於241位，由於被取代為穀氨醯胺得到良好的結果，因此認為被取代為相同極性胺基酸殘基的天冬醯胺也能得到同樣的結果。

此外對於241位，由於被取代為賴氨酸、穀氨酸得到良好的結果，因此認為被取代為相同帶電胺基酸殘基的精氨酸、天冬氨酸和組氨酸也能得到同樣的結果。

[實施例2]

(cfp-t7、cfp-t7-280q的純化)

使用在實施例1得到的cfp-t7和cfp-t7-280q的粗酶，使製備的粗酶液吸附於用20mm磷酸鉀緩衝液(ph8.0)平衡的4ml的qsepharosefastflow樹脂(gehealthcare公司制)上，接著用80ml的上述緩衝液洗滌樹脂，接著用含有100mmnacl的20mm磷酸鉀緩衝液(ph8.0)使吸附於樹脂的蛋白溶出，回收顯示阿馬多裡酶活性的組分。

用amiconultra-15，30knmwl(millipore公司制)對得到的顯示阿馬多裡酶活性的組分進行濃縮。然後，用含有150mmnacl的20mm磷酸鉀緩衝液(ph7.0)平衡的hiload26/60superdex200pg(gehealthcare公司制)中上樣，用上述緩衝液使其溶出，回收顯示阿馬多裡酶活性的組分，得到野生型和修飾型阿馬多裡酶的純化標準品。得到的純化標準品通過sds-page的分析，確認純化至單一的條帶。

(氧化酶活性和脫氫酶活性評價)

對如上所述得到的純化酶cfp-t7和cfp-t7-280q的氧化酶活性、脫氫酶活性進行評價。按照實施例1的氧化酶活性和脫氫酶活性測定方法進行評價。其中，使用的底物為30mm的αfvh，計算測定中使用的酶在280nm處的吸光度每1個的酶活性值(u/a280)。結果的一例如表2所示。表中的ox/dh(％)表示將原酶cfp-t7的ox/dh比作為100時的百分率。

[表2]

由表2可知，在本實施例的條件下，cfp-t7的氧化酶活性與脫氫酶活性的比率ox/dh為9.9，αfvh的測定中也受到很強的氧氣的影響。與此相對，cfp-t7-280q的ox/dh為0.037，大幅得到改善。本發明的c280q突變體使氧化酶活性降低208倍，脫氫酶活性提高1.3倍。即，可以認為能夠幾乎不受氧氣影響地測定αfvh。

[實施例3](各種阿馬多裡酶的位點特異性修飾操作)

(重組質粒pute100k』-efp-t5dna的製備)

序列號44是來源於土正青黴的果糖基肽氧化酶(efp-t5)的修飾型酶的胺基酸序列，可以通過保有插入了編碼序列號44的胺基酸序列的基因(序列號45)的重組質粒pute100k』-efp-t5的大腸桿菌進行生產(參照國際公開第2007/125779號公報)。將保有pute100k』-efp-t5的大腸桿菌jm109株按照「實施例1(1)重組質粒pk223-3-cfp-t7dna的製備」中記載的方法進行培養，提取並純化pute100k』-efp-t5。

(向來源於土正青黴的果糖基肽氧化酶基因導入點突變)

為了在efp-t5中導入底物特異性改善型突變，以重組質粒pute100k』-efp-t5為模板，使用序列號46、47的合成寡核苷酸、kod-plus-(東洋紡株式會社制)，在與實施例同樣的條件下進行pcr反應、轉化大腸桿菌jm109和確定生長菌落所保有的質粒dna中編碼efp-t5突變體的dna鹼基序列。其結果，得到編碼序列號44中記載的胺基酸序列的280位半胱氨酸被取代為穀氨醯胺的efp-t5基因的重組質粒(pute100k』-efp-t5-280q)。

同樣地以重組質粒pute100k』-efp-t5為模板，但使用序列號35、36的合成寡核苷酸，得到編碼序列號1中記載的胺基酸序列的280位半胱氨酸被取代為絲氨酸的修飾型阿馬多裡酶的重組質粒(pute100k』-efp-t5-280s)。

(重組質粒pet22b-pnfxdna的製備)

序列號9是來源於phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶(pnfx)的胺基酸序列，可以通過保有插入了編碼序列號9的胺基酸序列的基因(序列號49)的重組質粒pet22b－cnfx的大腸桿菌進行生產(參照國際公開第2013/162035號公報)。將保有pet22b-pnfx的大腸桿菌jm109株按照「實施例1(1)重組質粒pk223-3-cfp-t7dna的製備」中記載的方法進行培養，提取並純化pet22b-pnfx。

(向來源於phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶基因導入點突變)

為了在pnfx中導入底物特異性改善型突變，以如上所述製備的重組質粒pet22b-pnfx為模板，使用序列號50、51的合成寡核苷酸、kod-plus-(東洋紡株式會社制)，在與實施例同樣的條件下進行pcr反應、轉化大腸桿菌jm109和確定生長菌落所保有的質粒dna中編碼pnfx突變體的dna鹼基序列。其結果，得到編碼序列號9中記載的胺基酸序列的276位半胱氨酸被取代為穀氨醯胺的pnfx基因的重組質粒(pet22b-pnfx-276q)。

接著，與上述同樣地以pet22b-pnfx為模板，使用序列號50、52的合成寡核苷酸，得到編碼序列號9中記載的胺基酸序列的276位半胱氨酸被取代為絲氨酸的pnfx基因的重組質粒(pet22b-pnfx-276s)。

然後，在與實施例1同樣的條件下轉化大腸桿菌bl21(de3)株，得到大腸桿菌bl21(de3)(pet22b-pnfx-276q)株、大腸桿菌bl21(de3)(pet22b-pnfx-276s)株。

(重組質粒pet22b-anfxdna的製備)

序列號53是為了賦予果糖基肽氧化酶活性而將59位絲氨酸取代為甘氨酸的來源於構巢麴黴果糖基胺基酸氧化酶(anfx)的胺基酸序列，可以通過保有插入了編碼序列號53的胺基酸序列的基因(序列號54)的重組質粒pet22b-anfx的大腸桿菌進行生產(參照國際公開第2012/018094號公報)。將保有pet22b-anfx的大腸桿菌jm109株按照「實施例1(1)重組質粒pk223-3-cfp-t7dna的製備」中記載的方法進行培養，提取並純化pet22b-anfx。

(向來源於構巢麴黴的果糖基肽氧化酶基因導入點突變)

為了在anfx中導入底物特異性改善型突變，以重組質粒pet22b-anfx為模板，使用序列號55、56的合成寡核苷酸、kod-plus-(東洋紡株式會社制)，在與實施例1同樣的條件下進行pcr反應、轉化大腸桿菌jm109和確定生長菌落所保有的質粒dna中編碼anfx突變體的dna鹼基序列。其結果，得到編碼序列號53中記載的胺基酸序列的280位半胱氨酸被取代為穀氨醯胺的anfx基因的重組質粒(pet22b-anfx-280q)。

接著，與上述同樣地以pet22b-anfx為模板，使用序列號55，57的合成寡核苷酸，得到編碼序列號53中記載的胺基酸序列的280位半胱氨酸被取代為絲氨酸的anfx基因的重組質粒(pet22b-anfx-280s)。

然後，在與實施例1同樣的條件下轉化大腸桿菌bl21(de3)株，得到大腸桿菌bl21(de3)(pet22b-anfx-280q)株、大腸桿菌bl21(de3)(pet22b-anfx-280s)株。

(重組質粒pkk223-3-ccfxdna的製備)

序列號6是來源於棒狀彎孢的酮胺氧化酶(ccfx)的胺基酸序列(國際公開第wo2004/104203號)。可以通過保有插入了編碼序列號6的胺基酸序列的基因(序列號58)的重組質粒pkk223-3-ccfx的大腸桿菌進行生產(參照國際公開第2015/020200號公報)。將保有pkk223-3-ccfx的大腸桿菌jm109株按照「實施例1(1)重組質粒pk223-3-cfp-t7dna的製備」中記載的方法進行培養，提取並純化pkk223-3-ccfx。

(向來源於棒狀彎孢的酮胺氧化酶基因導入點突變)

為了在ccfx中導入底物特異性改善型突變，以重組質粒pkk223-3-ccfx為模板，使用序列號59、60的合成寡核苷酸、kod-plus-(東洋紡株式會社制)，在與實施例1同樣的條件下進行pcr反應、轉化大腸桿菌jm109和確定生長菌落所保有的質粒dna中編碼ccfx突變體的dna鹼基序列。其結果，得到編碼序列號6中記載的胺基酸序列的278位半胱氨酸被取代為穀氨醯胺的ccfx基因的重組質粒(pkk223-3-ccfx-278q)。

接著，與上述同樣地以pkk223-3-ccfx為模板，使用序列號59，61的合成寡核苷酸，得到編碼序列號6中記載的胺基酸序列的278位半胱氨酸被取代為絲氨酸的ccfx基因的重組質粒(pkk223-3-ccfx-278s)。

接著，與上述同樣地以pkk223-3-ccfx為模板，使用序列號62，63的合成寡核苷酸，在進行pcr反應、dpni處理後，加入dpni處理過的dna2μl、ligationhighver.2(東洋紡株式會社制)5μl、5u/μl的t4多聚核苷酸激酶1μl，用滅菌水調整總體積為15μl，在16℃下反應1小時。然後，使用反應液轉化大腸桿菌jm109，得到編碼序列號6中記載的胺基酸序列的265位苯丙氨酸被取代為亮氨酸的ccfx基因的重組質粒(pkk223-3-ccfx-265l)。

接著，與上述同樣地以pkk223-3-ccfx為模板，使用序列號62，64的合成寡核苷酸，在進行pcr反應、dpni處理後，加入dpni處理過的dna2μl、ligationhighver.2(東洋紡株式會社制)5μl、5u/μl的t4多聚核苷酸激酶1μl，用滅菌水調整總體積為15μl，在16℃下反應1小時。然後，使用反應液轉化大腸桿菌jm109，得到編碼序列號6中記載的胺基酸序列的265位苯丙氨酸被取代為甲硫氨酸的ccfx基因的重組質粒(pkk223-3-ccfx-265m)。

接著，與上述同樣地以pkk223-3-ccfx為模板，使用序列號65，66的合成寡核苷酸，在進行pcr反應、dpni處理後，加入dpni處理過的dna2μl、ligationhighver.2(東洋紡株式會社制)5μl、5u/μl的t4多聚核苷酸激酶1μl，用滅菌水調整總體積為15μl，在16℃下反應1小時。然後，使用反應液轉化大腸桿菌jm109，得到編碼序列號6中記載的胺基酸序列的267位苯丙氨酸被取代為亮氨酸的ccfx基因的重組質粒(pkk223-3-ccfx-267l)。

接著，與上述同樣地以pkk223-3-ccfx為模板，使用序列號65，82的合成寡核苷酸，在進行pcr反應、dpni處理後，加入dpni處理過的dna2μl、ligationhighver.2(東洋紡株式會社制)5μl、5u/μl的t4多聚核苷酸激酶1μl，用滅菌水調整總體積為15μl，在16℃下反應1小時。然後，使用反應液轉化大腸桿菌jm109，得到編碼序列號6中記載的胺基酸序列的267位苯丙氨酸被取代為甲硫氨酸的ccfx基因的重組質粒(pkk223-3-ccfx-267m)。

(向來源於構巢裸孢殼的酮胺氧化酶基因導入點突變)

序列號67是來源於構巢裸孢殼的糖化六肽氧化酶(en42fx)的胺基酸序列(國際公開第wo2015/005258號)。通過利用既定的基因片段的pcr全合成對cdna進行全合成而獲得編碼序列號67的胺基酸序列的基因(序列號68)(含有終止密碼子taa)。接著，為了使獲得的序列號69基因在大腸桿菌中表達，進行如下的操作步驟。首先，按照in-fusionhd克隆試劑盒(clontechlaboratories,inc.制)的操作手冊，使用序列號69、70的合成寡核苷酸擴增包含序列號68基因的片段。同時，使用序列號71、72的合成寡核苷酸擴增包含pet22b的片段。接著，通過in-fusion反應將包含序列號68基因的片段亞克隆到包含pet22b的片段中，獲得重組質粒pet22b-en42fx，在與上述同樣的條件下轉化大腸桿菌jm109株，得到大腸桿菌jm109(pet22b-en42fx)株。

為了在en42fx中導入底物特異性改善型突變，以重組質粒pet22b-en42fx為模板，使用序列號73、74的合成寡核苷酸、kod-plus-(東洋紡株式會社制)，在與實施例1同樣的條件下進行pcr反應後，加入dpni處理過的dna2μl、ligationhighver.2(東洋紡株式會社制)5μl、5u/μl的t4多聚核苷酸激酶1μl，用滅菌水調整總體積為15μl，在16℃下反應1小時。然後，使用反應液轉化大腸桿菌jm109，進行生長菌落所保有的質粒dna中編碼en42fx突變體的dna鹼基序列確定。其結果，得到編碼序列號67中記載的胺基酸序列的280位半胱氨酸被取代為穀氨醯胺的en42fx基因的重組質粒(pet22b-en42fx-280q)。

接著，與上述同樣地以pet22b-en42fx為模板，使用序列號73、75的合成寡核苷酸，得到編碼序列號67中記載的胺基酸序列的280位半胱氨酸被取代為絲氨酸的en42fx基因的重組質粒(pet22b-en42fx-280s)。

接著，與上述同樣地以pet22b-en42fx為模板，使用序列號76、77的合成寡核苷酸，得到編碼序列號67中記載的胺基酸序列的267位苯丙氨酸被取代為亮氨酸的en42fx基因的重組質粒(pet22b-en42fx-267l)。

接著，與上述同樣地以pet22b-en42fx為模板，使用序列號76、78的合成寡核苷酸，得到編碼序列號67中記載的胺基酸序列的267位苯丙氨酸被取代為甲硫氨酸的en42fx基因的重組質粒(pet22b-en42fx-267m)。

接著，與上述同樣地以pet22b-en42fx為模板，使用序列號79、80的合成寡核苷酸，得到編碼序列號67中記載的胺基酸序列的269位異亮氨酸被取代為亮氨酸的en42fx基因的重組質粒(pet22b-en42fx-269l)。

接著，與上述同樣地以pet22b-en42fx為模板，使用序列號79、81的合成寡核苷酸，得到編碼序列號67中記載的胺基酸序列的269位異亮氨酸被取代為甲硫氨酸的en42fx基因的重組質粒(pet22b-en42fx-269m)。

然後，在與實施例1同樣的條件下轉化大腸桿菌bl21(de3)株，得到大腸桿菌bl21(de3)(pet22b-en42fx-280q)株、大腸桿菌bl21(de3)(pet22b-en42fx-280s)株、大腸桿菌bl21(de3)(pet22b-en42fx-267l)株、大腸桿菌bl21(de3)(pet22b-en42fx-267m)株、大腸桿菌bl21(de3)(pet22b-en42fx-269l)株、大腸桿菌bl21(de3)(pet22b-en42fx-269m)株。

(各種修飾型阿馬多裡酶的生產)

將保有由上述操作步驟得到的上述重組質粒的各大腸桿菌jm109株、或者大腸桿菌bl21(de3)株在添加有0.1mmiptg的lb-amp培養基3ml中在25℃下培養16小時。然後，用ph7.0的0.01m磷酸緩衝液洗滌各菌體，並進行超聲波粉碎，以15000rpm離心分離10分鐘，製備各粗酶液1.5ml。

(各種修飾型阿馬多裡酶的氧化酶活性和脫氫酶活性評價)

將這樣製備的各粗酶液作為樣品，按照上述的氧化酶活性測定法和脫氫酶活性測定法，對各種修飾型阿馬多裡酶的氧化酶活性和脫氫酶活性進行評價。結果如表3-7所示。表4、5、6中，氧化酶活性(％)與脫氫酶活性(％)表示為將各野生型酶或原酶的氧化酶活性(u/ml)作為100時的百分率。此外表3-7中的ox/dh(％)表示為將各野生型酶或原酶的ox/dh比作為100時的百分率。

[表3]

[表4]

[表5]

[表6]

[表7]

如表3-7所示，將序列號1的阿馬多裡酶的280位半胱氨酸所對應位置的胺基酸殘基取代為穀氨醯胺或絲氨酸的所有情形下，與胺基酸取代前的野生型酶相比，ox/dh值得到改善。這說明由前述的胺基酸取代帶來的ox/dh改善效果與阿馬多裡酶的來源無關，均能得到發揮。

[實施例4]

(印刷電極的αfvh定量)

使用實施例2中得到的cfp-t7和cfp-t7-280q的純化酶，進行由印刷電極測定的αfvh定量。具體地，在由碳的工作電極、銀/氯化銀的參比電極印刷而成的dep晶片電極(dep-ep-pp，圓形/碳/帶阻水環；有限會社biodevicetechnology制)上，載置15μl溶解有如下的液體：終濃度3.75mm或7.5mm的mpms、終濃度約10mm的磷酸緩衝液(ph7.0)及相對於1mmαfvh的50mu的各種純化酶液。然後，使用dep晶片專用連接器，連接到小型恆電位儀bdtministat100(有限會社biodevicetechnology制)。然後，外加+200mv(相對於ag/agcl)的電壓，將規定濃度的αfvh溶液5μl載置於各自電極上進行反應，測定120秒後的電流值。繪製使用cfp-t7進行反應的各αfvh濃度中的電流響應值的結果如圖3所示，繪製使用cfp-t7-280q進行反應的各αfvh濃度中的電流響應值的結果如圖4所示。

圖3-1、4-1顯示了在添加3.75mm的mpms的體系中，cfp-t7-280q比cfp-t7更能高精度地對αfvh進行定量。此外，圖3-2、4-2顯示了在添加7.5mm的mpms體系中，cfp-t7-280q比cfp-t7更能高精度地對αfvh進行定量。

本說明書中引用的全部刊物、專利和專利申請直接作為參考引入本說明書中。

序列說明

序列號1cfp-t7的胺基酸序列

序列號2cfp-t7的基因序列

序列號3來源於土正青黴的阿馬多裡酶

序列號4來源於棘殼孢屬的酮胺氧化酶

序列號5來源於節菱孢屬的酮胺氧化酶

序列號6來源於棒狀彎孢的酮胺氧化酶

序列號7來源於侵管新赤殼的酮胺氧化酶

序列號8來源於新型隱球菌的果糖基胺基酸氧化酶

序列號9來源於phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶

序列號10來源於構巢麴黴的果糖基胺基酸氧化酶

序列號11來源於構巢裸孢殼的果糖基肽氧化酶

序列號12來源於細基格孢屬的果糖基胺基酸氧化酶

序列號13來源於微紫青黴的果糖基胺基酸氧化酶

序列號14c280q-fw

序列號15c280q-rv

序列號16c280s-fw

序列號17c280d-fw

序列號18c280e-fw

序列號19c280m-fw

序列號20c280k-fw

序列號21c280r-fw

序列號22c280v-fw

序列號23c280n-fw

序列號24f267y-fw

序列號25f267x-rv

序列號26f269y-fw

序列號27f269x-rv

序列號28d54n-fw

序列號29d54x-rv

序列號30d54a-fw

序列號31y241e-fw

序列號32y241x-rv

序列號33y241q-fw

序列號34y241k-fw

序列號35cfp-t7c280xr

序列號36cfp-t7c280hf

序列號37cfp-t7c280tf

序列號38cfp-t7f267xr

序列號39cfp-t7f267lf

序列號40cfp-t7f267mf

序列號41cfp-t7f269xr

序列號42cfp-t7f269lf

序列號43cfp-t7f269mf

序列號44efp-t5蛋白

序列號45efp-t5基因

序列號46efpc280xr

序列號47efpc280qf

序列號48efpc280sf

序列號49pnfx基因

序列號50pnc276xr

序列號51pnc276qf

序列號52pnc276sr

序列號53anfx蛋白

序列號54anfx基因

序列號55anc280xr

序列號56anc280qf

序列號57anc280sf

序列號58ccfx基因

序列號59ccc278xr

序列號60ccc278qf

序列號61ccc278sf

序列號62ccf265xr

序列號63ccf265lf

序列號64ccf265mf

序列號65ccf267xr

序列號66ccf267lf

序列號67en42fx蛋白

序列號68en42fx基因

序列號69in-fusionen42x插入片段

序列號70in-fusionen42x插入片段

序列號71in-fusionpet22b載體

序列號72in-fusionpet22b載體

序列號73enc280xr

序列號74enc280qf

序列號75enc280sf

序列號76enf267xr

序列號77enf267lf

序列號78enf267mf

序列號79eni269xr

序列號80eni269lf

序列號81eni269mf

序列號82ccf267mf

　　　　　　　　　　　序列表

龜甲萬株式會社

脫氫酶活性提高的阿馬多裡酶

ph-6321-pct

jp2014-217405

2014-10-24

82

patentinversion3.5

1

437

prt

錐毛殼屬（coniochaetasp.）

1

metthrserasnargalaaspthrargvalilevalvalglyglygly

151015

glythrileglyserserthralaleuhisleuvalargserglytyr

202530

alaproalaasnilethrvalleuaspthrphegluileproserala

354045

glnseralaglyhisaspleuasnlysilemetglyileargleuarg

505560

asnlysvalaspleuglnmetserleuglualaargglnmettrplys

65707580

gluaspgluleupheglnprophephehisasnthrglyargmetasp

859095

cysgluhisthrprogluglyilegluaspleulyslysglntyrgln

100105110

alaleuhisaspalaglyalaglyleuglulysthrhisalatrpleu

115120125

aspasngluaspgluileleuserlysmetproleuleuglnargasp

130135140

glnileglnglytrplysalailetrpserglnaspglyglytrpleu

145150155160

alaalaalalysalaileasnalaileglyglnpheleulysgluarg

165170175

glyvallyspheglypheglyglyalaglyserphelysglnproleu

180185190

pheaspaspgluglythrthrcysileglyvalgluthralaaspgly

195200205

thrlystyrtyralaasplysvalvalleualaalaglyalatrpser

210215220

prothrleuvalaspleugluaspglncyscysserlysalatrpval

225230235240

tyralahisileglnleuthrprogluglualaalaglutyrlysgly

245250255

valprovalvaltyrasnglyglupheglyphephephegluproasp

260265270

glupheglyvalilelysvalcysaspglupheproglypheserarg

275280285

phelysgluhisglnprotyrglyalaproserprolysargileser

290295300

valproargserhisalalyshisprothraspthrtyrproaspala

305310315320

sergluvalserilelyslysalailealathrpheleuproargphe

325330335

glnasplysgluleupheasnargalaleucystrpcysthraspthr

340345350

alaaspalaalaleuleumetcysgluhisprolystrplysasnphe

355360365

ileleualathrglyaspserglyhisserphelysileleuproasn

370375380

valglylystyrvalvalgluleuilegluglyargleuprogluglu

385390395400

metalatyrglntrpargtrpargproglyglyaspalaleulysser

405410415

argargalaalaproprolysaspleualaaspmetproglytrplys

420425430

hisaspprolysleu

435

2

1314

dna

錐毛殼屬（coniochaetasp.）

2

atgacgtcgaatcgtgcagatacaagggtgattgtcgtcggtggcggaggaacgattggt60

tcctcgacagcgctgcatcttgtgaggagtggttatgctcccgcaaatatcacggtcttg120

gacacatttgagattccatcggctcaatcagccggccatgatctcaacaagatcatggga180

atacgactgcgcaacaaggtggacctgcaaatgagtctagaggctagacagatgtggaag240

gaggatgagttattccagcccttctttcacaataccggcagaatggactgcgaacacacg300

cctgagggtatcgaggacctgaaaaagcagtaccaggcactgcacgatgccggtgcgggt360

ctggagaagactcatgcctggttggacaacgaggatgagatcttatccaagatgccgttg420

cttcaacgtgaccaaatacaaggatggaaagcaatatggagtcaagatggcggctggtta480

gctgcggcaaaggccatcaatgcgatcggacagttcttgaaagaacgtggtgtaaagttc540

ggattcggcggcgctggatccttcaagcaaccccttttcgacgatgaaggcacaacttgc600

attggcgttgagacggcagatggtaccaaatattacgctgacaaggtggtcttagcagct660

ggcgcatggagcccaaccctggtggacctggaagatcaatgttgctcgaaggcttgggtg720

tatgctcatattcagttgacgcctgaagaggccgctgagtataagggtgtcccagttgtg780

tataatggcgaatttggcttcttctttgagcctgatgagtttggtgtaataaaggtgtgc840

gacgagttcccaggattctcgcgcttcaaggaacatcaaccctatggcgccccatctccg900

aaacggatatcagtaccacgatcgcacgccaagcatcccacagacacttatccagacgca960

tccgaagtcagcatcaaaaaagcaatcgcgacgtttctccctcgatttcaggacaaggag1020

ctcttcaatcgcgccttgtgctggtgtacagacactgcggacgctgctctcttgatgtgt1080

gaacaccccaaatggaagaatttcattctagcgaccggcgacagcggacactcattcaaa1140

atcttgcctaacgtcggaaaatacgtagtcgagttgatagagggccgcctgccggaggaa1200

atggcttatcaatggaggtggcggccaggaggcgatgcactcaagtctagacgtgcggca1260

ccgccaaaagatcttgcagacatgccaggatggaaacatgatccgaaattgtaa1314

3

437

prt

土正青黴（eupenicilliumterrenum）

3

metalahisserargalaserthrlysvalvalvalvalglyglygly

151015

glythrileglyserserthralaleuhisleuileargserglytyr

202530

thrproserasnilethrvalleuaspvaltyrlysthrproserleu

354045

glnseralaglyhisaspleuasnlysilemetglyileargleuarg

505560

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65707580

asnaspgluleuphelysprophephehisglnvalglymetileasp

859095

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100105110

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115120125

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130135140

glnvallysglytrplysglyleuphecysthraspglyglytrpleu

145150155160

alaalaalalysalaileasnalaileglyilepheleuglnasplys

165170175

glyvallyspheglypheglyaspalaglythrpheglnglnproleu

180185190

phealaalaaspglylysthrcysileglyleugluthrthraspgly

195200205

thrlystyrphealaasplysvalvalleualaalaglyalatrpser

210215220

prothrleuvalaspleugluaspglncysvalserlysalatrpval

225230235240

phealahisileglnleuthrprolysglualaaspalatyrlysasn

245250255

valprovalvaltyraspglyglutyrglyphephephegluproasp

260265270

glutyrglyvalilelysvalcysaspglupheproglypheserarg

275280285

phelysleuhisglnprotyrglyalaalaserprolysmetileser

290295300

valproargserhisalalyshisprothraspthrtyrproaspala

305310315320

sergluvalthrilearglysalailealaargpheleuprogluphe

325330335

lysasplysgluleupheasnargthrmetcystrpcysthraspthr

340345350

alaaspalaasnleuleuilecysgluhisprolystrplysasnphe

355360365

ileleualathrglyaspserglyhisserphelysleuleuproasn

370375380

ileglylystyrvalvalgluleuleugluglyserleuserglnglu

385390395400

metalaglyalatrpargtrpargproglyglyaspalaleuargser

405410415

argargglyalaproalalysaspleualaglumetproglytrplys

420425430

hisaspalahisleu

435

4

440

prt

棘殼孢屬（pyrenochaetasp.）

4

metalaalaserargalalysthrthrvalilevalvalglyglygly

151015

glythrileglyserserthralaleuhisleuleuargserglytyr

202530

thrproserasnilethrvalleuaspthrtyrproileproserleu

354045

glyseralaglyasnaspleuasnlysilemetglyileargleuarg

505560

asnlysvalaspleuglnleuserleuglualaargglumettrparg

65707580

gluaspgluleupheargaspphephehisasnthrglyargleuasp

859095

cysalahisglyglulysglyileasnaspleuargglnalatyrgln

100105110

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115120125

aspsergluaspgluileleualaargmetproleuleuserargglu

130135140

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145150155160

alaalaglylysalaileasnalaileglyglutyrleuarglysglu

165170175

glyvallyspheglypheglyglyalaglyserpheglnglnproleu

180185190

leualagluglyilecysileglyvalgluthrthraspglythrarg

195200205

tyrtyralaasplysvalvalleualaalaglyalatrpserproala

210215220

leuvalaspleugluaspglncysvalserlysalatrpvaltyrala

225230235240

hismetglnleuthrprolysglualaalaalatyrlysaspthrpro

245250255

valvaltyrasnglyaspleuglyphephephegluproasngluhis

260265270

glyvalilelysvalcysaspglupheproglyphethrargphelys

275280285

lyshisglnpropheglyalaargalaprolysargileservalpro

290295300

argserhisalalyshisprothraspthrtyrprohisalaserglu

305310315320

alaserilelyslysalailealaalapheleuproglnphelysasp

325330335

lysgluleupheasnargalametcystrpcysthraspthralaasp

340345350

alaalaleuleuilecysgluhisproglntrplysasnphemetleu

355360365

alathrglyaspserglyhisserphelysleuleuproasnilegly

370375380

lyshisvalvalgluleuilegluglythrleualaalaaspleuala

385390395400

hisalatrpargtrpargproglyileglyaspalaleuglnserarg

405410415

argalaalaproalalysaspleualaaspmetproglytrpasnhis

420425430

aspgluserproargalalysleu

435440

5

452

prt

節菱孢屬（arthriniumsp.）

5

metalaalaserarglysthrthrlysvalilevalvalglyglygly

151015

glythrileglyserserthralaleuhisleuleuargserglytyr

202530

thralathrasnilethrvalleuaspthrtyrproileproserala

354045

glnseralaglyasnaspleuasnlysilemetglyileargleuarg

505560

asnprovalasplysglnleuserleuglualaglnaspmettrpcys

65707580

hisaspgluleuphelysprotyrphehisasnthrglyargmetasp

859095

cysgluglythrglulysglyilealaalaleulysglnglntyrgln

100105110

thrleuleuaspalaaspvalglyleuglulysthrthrglutrpleu

115120125

aspsergluaspalaileleualalysmetproleuleugluargasp

130135140

glnilelysglytrplysalailepheserglnaspglyglytrpleu

145150155160

alaalaalalysalaileasnalaileglyglugluleulysarggln

165170175

glyvalasnpheglypheglyglyalaglyalaphelyslysproleu

180185190

phealaproaspglyserthrcysileglyvalgluthrvalaspgly

195200205

thrlystyrtyrglyasplysvalvalleualaalaglyalatrpser

210215220

proalaleuvalaspleuglugluglncyscysserlysalatrpval

225230235240

tyralahismetglnleuthrprohisglualaalaglutyrglngly

245250255

cysprovalvaltyrhisglyaspleuglyphephephegluproasn

260265270

gluhisglyvalilelysvalcysaspglupheproglyphethrarg

275280285

pheleugluglnhisglnsertyrglyalaproalaprothrargval

290295300

servalproargserhisalalyshisprothraspthrtyrproasp

305310315320

alasergluglnserileargargalavalalaalapheleuproarg

325330335

pheglnserlysgluleupheasnargalametcystrpcysthrasp

340345350

thralaaspalaalaleuleuilecysgluhisproargtrpargasn

355360365

pheileleualathrglyaspserglyhisserphelysleuleupro

370375380

asnileglylyshisvalvalgluleuleugluglyargleualaasp

385390395400

aspleualaglnalatrpargtrpargproglyglnglyaspalaleu

405410415

lysserargargalaalaproalalysaspleualaaspmetprogly

420425430

trpasnhisaspglyaspserglyasnalathrserglythrserser

435440445

gluhislysleu

450

6

440

prt

棒狀彎孢（curvulariaclavata）

6

metalaproserargalaasnthrservalilevalvalglyglygly

151015

glythrileglyserserthralaleuhisleuvalargserglytyr

202530

thrproserasnilethrvalleuaspthrtyrproileproserala

354045

glnseralaglyasnaspleuasnlysilemetglyileargleuarg

505560

asnlysvalaspleuglnleuserleuglualaargglnmettrparg

65707580

gluaspaspleuphelysglutyrphehisasnthrglyargleuasp

859095

cysalahisglyglugluglyleualaaspleuargglnalatyrgln

100105110

alaleuleuaspalaasnalaglyleuglugluthrthrglutrpleu

115120125

aspsergluaspgluileleulyslysmetproleuleuaspargglu

130135140

glnilelysglytrplysalavaltyrserglnaspglyglytrpleu

145150155160

alaalaalalysalaileasnalaileglyglutyrleuargalagln

165170175

glyvallyspheglypheglyglyalaglyserphelysglnproleu

180185190

leualagluglyvalcysileglyvalgluthrvalaspglythrarg

195200205

tyrtyralaasplysvalvalleualaalaglyalatrpserproval

210215220

leuvalaspleugluaspglncysvalserlysalatrpvaltyrala

225230235240

hisileglnleuthrprogluglualaalaglutyrlysasnvalpro

245250255

valvaltyrasnglyaspvalglyphephephegluproaspgluhis

260265270

glyvalilelysvalcysaspglupheproglyphethrargphelys

275280285

glnhisglnprotyrglyalalysalaprolysargileservalpro

290295300

argseralaalalyshisprothraspthrtyrproaspalaserglu

305310315320

lysserilearglysalailealathrpheleuprolysphethrglu

325330335

lysgluleupheasnarghisleucystrpcysthraspthralaasp

340345350

alaalaleuleumetcysgluhisproglutrplysasnphevalleu

355360365

alathrglyaspserglyhisthrphelysleuleuproasnilegly

370375380

lyshisvalvalgluleuleugluglythrleualagluaspleuala

385390395400

hisalatrpargtrpargproglythrglyaspalaleulysserarg

405410415

argalaalaproalalysaspleualaaspmetproglytrplyshis

420425430

aspaspvalvallysserlysleu

435440

7

441

prt

侵管新赤殼（neocosmosporavasinfecta）

7

metthrthrproarglysgluthrthrvalleuileileglyglygly

151015

glythrileglyserserthralaleuhisleuleuargalaglytyr

202530

thrproserasnilethrvalleuaspthrtyrproileproserala

354045

glnseralaglyasnaspleuasnlysilemetglyileargleuarg

505560

asnlysvalaspleuglnleuserleuglualaargaspmettrparg

65707580

asnaspalaleupheargprophephehisasnthrglyargleuasp

859095

cysgluserseralagluglyvalgluglyleuargargglutyrgln

100105110

lysleuvalglualaglyvalglyleuglugluthrhisglutrpleu

115120125

aspsergluglualaileleuglulysalaproleuleuglnargglu

130135140

gluilegluglytrplysalailetrpserglugluglyglytrpleu

145150155160

alaalaalalysalaileasnalaileglyglugluleuglnarggln

165170175

glyvalargpheglypheglyglyalaglyserphelysargproleu

180185190

phealaaspaspglythrthrcysileglyvalgluthrvalaspgly

195200205

thrglntyrhisalaasplysvalvalleualaalaglyalatrpser

210215220

proalaleuvalaspleuglugluglncyscysserlysalatrpval

225230235240

tyralahismetglnleuthrprogluglualaalavaltyrlysgly

245250255

cysprovalvaltyrhisglyaspvalglyphephephegluproasn

260265270

gluasnglyvalilelysvalcysaspglupheproglyphethrarg

275280285

phelysglnhisglnprotyrglyalaproalaprolysprovalser

290295300

valproargserhisalalyshisprothraspthrtyrproaspala

305310315320

serglugluserilelysargalavalserthrpheleuproargphe

325330335

lysasplysproleupheasnargalaleucystrpcysthraspthr

340345350

alaaspseralaleuleuilecysgluhisproargtrplysasnphe

355360365

ileleualathrglyaspserglyhisserphelysleuleuproile

370375380

ileglylyshisvalvalgluleuvalgluglyargleualaaspasp

385390395400

leualaglualatrpargtrpargproglyglnglyaspalaarglys

405410415

serileargalaalaproalalysaspleualaaspmetproglytrp

420425430

lyshisaspglnaspsergluserarg

435440

8

477

prt

新型隱球菌（cryptococcusneoformans）

8

metproproserargalaserthrlysvalilevalileglyglygly

151015

glythrleuglyserserthralaleuhisleuleuargalaglytyr

202530

thrproserasnilethrvalleuaspthrtyrleuileproserala

354045

glnseralaglyasnaspleuasnlysilemetglyileargilearg

505560

asnprovalasplysglnleuserleuglualaargaspmettrparg

65707580

asnaspgluvalphelysprotyrphehisasnthrglyargleuasp

859095

cysalahisthrprogluserilealaserleuarglyssertyrglu

100105110

alaileleulysalaglyserglyleuglulysthrhishistrpleu

115120125

serthrgluaspgluileleualaargalaproleuleuasparglys

130135140

glnilelysglytrplysalailetyrsergluaspglyglytrpleu

145150155160

alaalaalalysalaileasnserileglyglnvalleulysglulys

165170175

glyvalthrpheglypheglyseralaglyserphelyslysproleu

180185190

pheaspgluaspglythrlysalaileglyilegluthrvalaspgly

195200205

thrglntyrphealaasplysvalvalleualaalaglyalatrpser

210215220

prothrleuvalaspleugluglyglncyscysserlysalatrpval

225230235240

tyralahismetglnleuthrprogluglualaalaglutyrlysglu

245250255

cysprovalvaltyrasnsergluleuglyphephephegluproasn

260265270

glulysglyvalilelysvalcysaspglupheproglyphethrarg

275280285

phelysglnhisglnprotyrglyalaserserthrlyshisileser

290295300

pheproargserhisalalyshisprothraspthrileproaspglu

305310315320

seraspalaserileargargalaileseralapheleuproargphe

325330335

lysglulysgluleupheasnargalaleucystrpcysthraspthr

340345350

alaaspalaasnleuleuilecysgluhisprolystrplysasnphe

355360365

ileleualathrglyaspserglyhisserphelysileleuproasn

370375380

ileglylyshisvalvalgluleuilegluglythrleualagluasp

385390395400

leualaglusertrpargtrpargproglyserglyaspproleuile

405410415

serargargalaalaproalaargaspleualaaspleuproglytrp

420425430

asnhisaspgluproseraspaspaspmetaspvallysaspvalala

435440445

valserleualaservallysileglygluasnileglyglulysval

450455460

valgluaspglyalaargvalglyvallysvalleuala

465470475

9

437

prt

phaeosphaerianodorum

9

metalaproserargalaasnthrservalilevalvalglyglygly

151015

glythrileglyserserthralaleuhisleuvalargserglytyr

202530

thrproserasnvalthrvalleuaspalatyrproileproserser

354045

glnseralaglyasnaspleuasnlysilemetglyvalserleuarg

505560

asnprovalaspleuglnleualaleuglualaargglnmettrpasn

65707580

gluaspgluleuphelyslysphephehisasnthrglyargleuasp

859095

cysalahisglyglulysaspilealaaspleulysserglytyrgln

100105110

alaleuvalaspalaglyleuaspalathrasnglutrpleuaspser

115120125

gluaspgluileleulysargmetproleuleuserargaspglnile

130135140

lysglytrplysalailepheserlysaspglyglytrpleualaala

145150155160

alalysalaileasnalavalglyglutyrleuargaspglnglyval

165170175

argpheglyphetyrglyalaglyserphelysalaproleuleuala

180185190

gluglyvalcysileglyvalgluthrvalaspglythrargtyrtyr

195200205

alaasplysvalvalleualaalaglyalatrpserprothrleuval

210215220

gluleuhisgluglncysvalserlysalatrpvaltyrglyhisile

225230235240

glnleuthrprogluglualaalaargtyrlysasnserprovalval

245250255

tyrasnglyaspvalglyphephephegluproasngluhisglyval

260265270

ilelysvalcysaspglupheproglyphethrargphelysmethis

275280285

glnpropheglyalalysalaprolysargileservalproargser

290295300

hisalalyshisprothraspthrileproaspalaseraspvalser

305310315320

ileargargalailealathrphemetproglnphelysasnlyslys

325330335

metpheasnglnalametcystrpcysthraspthralaaspalaala

340345350

leuleuilecysgluhisproglutrplysasnphevalleualathr

355360365

glyaspserglyhisserphelysleuleuproasnileglylyshis

370375380

valvalgluleuleugluglythrleualaaspaspleualahisala

385390395400

trpargtrpargproglyserglyaspalaleulysserargargser

405410415

alaproalalysaspleualaaspmetproglytrpasnhisasplys

420425430

proargalaasnleu

435

10

438

prt

構巢麴黴（aspergillusnidulans）

10

metthrproargalaasnthrlysileilevalvalglyglyglygly

151015

thrmetglyserserthralaleuhisleuleuargalaglytyrthr

202530

proserasnilethrvalleuaspthrcysproileproseralagln

354045

seralaglytyraspleuasnlysilemetserileargleuargasn

505560

lysproaspleuglnleuserleuglualaleuaspmettrplysasn

65707580

aspproleuphelysprophephehisasnvalglymetileaspval

859095

serserthrglugluglyilegluglyleuarglyslystyrglnser

100105110

leuleuaspalaglyileglyleuglulysthrasnphemetleuglu

115120125

sergluaspgluileleualalysalaprohisphethrglnglugln

130135140

ilelysglytrplysglyleuphecysglyaspglyglytrpleuala

145150155160

alaalalysalaileasnalaileglyglnpheleulysgluglngly

165170175

vallyspheglypheglyglyalaglythrphelyslysproleuphe

180185190

alaaspalahisglulysthrcysileglyvalgluthrvalaspgly

195200205

thrlystyrtyralaasplysvalvalleualaalaglyalatrpser

210215220

serthrleuvalaspleuglugluglncysvalserlysalatrpval

225230235240

phealahisileglnleuthrproalaglualaalaalatyrlysasn

245250255

thrprovaliletyraspglyasptyrglyphephephegluproasn

260265270

gluasnglyileilelysvalcysaspglupheproglyphethrhis

275280285

phelysmethisglnprotyrglyserproalaprolysproileser

290295300

valproargserhisalalyshisprothraspthrtyrprohisala

305310315320

sergluvalthrilelyslysalaileasnargpheleuproargphe

325330335

asnasplysgluleupheasnargalametcystrpcysthraspthr

340345350

alaaspalaasnleuleuvalcysgluhisproargtrplysglyphe

355360365

tyrleualathrglyaspserglyhisserphelysleuleuproasn

370375380

ileglylyshisvalvalgluleuleuglugluargleugluserval

385390395400

phelysaspalatrpargtrpargproglyserglyaspalaleulys

405410415

serargargalaalaproalalysaspleualaaspmetproglytrp

420425430

argasnglualalysmet

435

11

438

prt

構巢裸孢殼（emericellanidulans）

11

metalaproargalaasnthrlysileilevalvalglyglyglygly

151015

thrmetglyserserthralaleuhisleuleuargalaglytyrthr

202530

proserasnilethrvalleuaspthrtyrproileproseralagln

354045

seralaglytyraspleuasnlysilepheglyileargleuargasn

505560

lysproaspleuglnleutyrleuglualaleuaspmettrplysasn

65707580

aspproleuphelysprophephehisasnvalglyglnmetaspval

859095

serserthrglugluglyilelyslysleuargmetargtyrglnser

100105110

leuleuaspalaglyileglyleuglulysthrasnpheleuleuglu

115120125

sergluaspgluileleualalysalaprohisphethrargglugln

130135140

ilelysglytrplysglyleuphecysglyaspglyglytrpleuala

145150155160

alaalalysalaileasnalaileglyglnpheleulysgluglngly

165170175

vallyspheglypheglyglualaglythrphelyslysproleuphe

180185190

alaaspalaaspglulysthrcysileglyvalgluthrvalaspgly

195200205

thrlystyrtyralaasplysvalvalleualaalaglyalatrpser

210215220

serthrleuvalaspleuglugluglncysvalserlysalatrpval

225230235240

phealahisileglnleuthrproalaglualaalaalatyrlysasn

245250255

thrprovaliletyraspglyasptyrglyphepheilegluproasp

260265270

gluasnglyileilelysvalcysaspglupheproglyphethrhis

275280285

phelysmethisglnprotyrglyserprovalprolysleuileser

290295300

valproargserhisalalyshisprothraspthrtyrprohisala

305310315320

sergluvalthrilelyslysalaileasnargpheleuproargphe

325330335

asnasplysgluleupheasnargalametcystrpcysthraspthr

340345350

alaaspalaasnleuleuvalcysgluhisproargtrplysglyphe

355360365

tyrleualathrglyaspserglyhisserphelysleuleuproasn

370375380

ileglylyshisvalvalgluleuleugluglyargleugluserval

385390395400

phelysaspalatrpargtrpargproglyserglyaspalaleulys

405410415

serargargalaalaproalalysaspleualaaspmetproglytrp

420425430

argasnglualalysmet

435

12

441

prt

細基格孢屬（ulocladiumsp.）

12

metalaproasnargalaasnileservalilevalvalglyglygly

151015

glythrileglyserserthralaleuhisleuvalargserglytyr

202530

thrproserasnilethrvalleuaspthrtyrproileproserala

354045

glnseralaglyasnaspleuasnlysilemetglyileargleuarg

505560

asnlysvalaspleuglnleuserleuglualaargglnmettrpthr

65707580

gluaspaspleuphelysglutyrphehislysthrglyargleuasp

859095

cysalahisglyglulysglyleualaaspleulysglnalatyrgln

100105110

alaleuleuaspalaasnalaglyleuglualathrthrglutrpleu

115120125

aspsergluasplysileleuglulysmetproleuleuasnargasp

130135140

glnilelysglytrplysalavalphesergluaspglyglytrpleu

145150155160

alaalaalalysalaileasnalaileglyargpheleuargaspgln

165170175

glyvallyspheglypheglyglyalaglyserphelysglnproleu

180185190

leualagluglyvalcysvalglyvalgluthrvalaspglythrarg

195200205

tyrtyralaasplysvalvalleualaalaglyalatrpserproala

210215220

leuvalaspleuglnaspglncysvalserlysalatrpvaltyrala

225230235240

hisileglnleuserproserglualaalaglutyrlysasnvalpro

245250255

valvaltyrasnglyaspvalglyphephephegluproaspglutyr

260265270

glyvalilelysvalcysaspglupheproglyphethrargphelys

275280285

glnhisglnpropheglyalaseralaprolysargileservalpro

290295300

argseralaalalyshisprothraspthrtyrproaspalaserglu

305310315320

valserilearglysalailealathrpheleuprolysphethrglu

325330335

lysgluvalpheasnarghisleucystrpcysthraspthralaasp

340345350

alaalaleuleumetcysgluhisproglutrplysasnphevalleu

355360365

alathrglyaspserglyhisthrphelysleuleuproasnilegly

370375380

lyshisvalvalgluleuleugluglythrleualaaspaspleuala

385390395400

hisalatrpargtrpargproglythrglyaspalaleulysserarg

405410415

argalaalaargalalysaspleualaaspmetproglytrpasnhis

420425430

aspglyglualaproargalalysleu

435440

13

437

prt

微紫青黴（penicilliumjanthinellum）

13

metalahisserarggluserthrlysilevalilevalglyglygly

151015

glythrmetglyserserthralaleuhisleuileargserglytyr

202530

thrproserasnilethrvalleuaspvaltyrproileproserleu

354045

glnseralaglytyraspleuasnlysilemetserileargleuarg

505560

asnglyproaspleuglnleuserleuglualaleuaspmettrplys

65707580

asnaspproleuphelysprophephehisasnvalglymetleuasp

859095

cysserserserglngluglyilealaserleuargarglyshisgln

100105110

aspleuileaspalaasnileglyleuglulysthrasniletrpleu

115120125

glusergluaspaspileleualalysalaprohisphethrargglu

130135140

glnilelysglytrplysglyleuphecysglyaspglyglytrpleu

145150155160

alaalaalalysalaileasnalaileglythrpheleulyssergln

165170175

glyvallyspheglypheglyseralaglythrphelysargproleu

180185190

phealaproaspglyalathrcysserglyvalgluthrvalaspgly

195200205

thrlystyrphealaasplysvalvalleualaalaglyalatrpser

210215220

serthrleuvalaspleugluaspglncysvalserlysalatrpval

225230235240

phealahisileglnleuthrproglngluseralaglntyrlysasp

245250255

valprovalvaltyraspglyasptyrglyphephephegluproasn

260265270

gluhisglyvalilelysvalcysaspglupheproglypheserarg

275280285

phelysleuhisglnprotyrglyalathrserprolysleuileser

290295300

valproargserhisalalyshisprothraspthrtyrproaspser

305310315320

serglugluthrilearglysalailealaargphemetproargphe

325330335

lysasplysgluleupheasnargsermetcystrpcysthraspthr

340345350

alaaspalaasnleuleuilecysgluhisprolystrplysasnphe

355360365

ileleualathrglyaspserglyhisserphelysvalleuproasn

370375380

ileglylyshisvalvalgluleuilegluglyargleuproglnasp

385390395400

leualaglyalatrpargtrpargproglyglyaspalaleulysser

405410415

lysargseralaproalalysaspleualaglumetproglytrplys

420425430

hisaspalalysleu

435

14

30

dna

人工的

引物

14

gtaataaaggtgcaggacgaattcccagga30

15

27

dna

人工的

引物

15

gaagcgcgagaatcctgggaattcgtc27

16

30

dna

人工的

引物

16

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17

30

dna

人工的

引物

17

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18

30

dna

人工的

引物

18

gtaataaaggtggaagacgaattcccagga30

19

30

dna

人工的

引物

19

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20

30

dna

人工的

引物

20

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21

30

dna

人工的

引物

21

gtaataaaggtgcgtgacgaattcccagga30

22

30

dna

人工的

引物

22

gtaataaaggtggtggacgaattcccagga30

23

30

dna

人工的

引物

23

gtaataaaggtgaacgacgaattcccagga30

24

30

dna

人工的

引物

24

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25

30

dna

人工的

引物

25

tattacaccaaactcatcaggttcgaagaa30

26

27

dna

人工的

引物

26

ggcttcttctatgaacctgatgagttt27

27

27

dna

人工的

引物

27

ctttattacaccaaactcatcaggttc27

28

30

dna

人工的

引物

28

tcagccggccataacctcaacaagatcatg30

29

30

dna

人工的

引物

29

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30

30

dna

人工的

引物

30

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31

30

dna

人工的

引物

31

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32

30

dna

人工的

引物

32

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33

30

dna

人工的

引物

33

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34

30

dna

人工的

引物

34

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35

30

dna

人工的

引物

35

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36

30

dna

人工的

引物

36

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37

30

dna

人工的

引物

37

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38

30

dna

人工的

引物

38

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39

30

dna

人工的

引物

39

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40

30

dna

人工的

引物

40

atgttctttgagcctgatgagtttggtgta30

41

30

dna

人工的

引物

41

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42

30

dna

人工的

引物

42

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43

30

dna

人工的

引物

43

atggagcctgatgagtttggtgtaataaag30

44

437

prt

土正青黴（eupenicilliumterrenum）

44

metalahisserargalaserthrlysvalvalvalvalglyglygly

151015

glythrileglyserserthralaleuhisleuileargserglytyr

202530

thrproserasnilethrvalleuaspvaltyrlysthrproserleu

354045

glnseralaglyhisaspleuasnlysilemetglyileargleuarg

505560

asnglyproaspleuglnleuserleugluserleuaspmettrpgln

65707580

asnaspgluleuphelysprophephehisglnvalglymetileasp

859095

cysserserserlysgluglyilegluasnleuargarglystyrgln

100105110

thrleuleuaspalaglyileglyleuglulysthrasnvaltrpleu

115120125

glusergluaspgluileleualalysalaproasnphethrargglu

130135140

glnvallysglytrplysglyleuphecysthraspglyglytrpleu

145150155160

alaalaalalysalaileasnalaileglyilepheleuglnasplys

165170175

glyvallyspheglypheglyaspalaglythrpheglnglnproleu

180185190

phealaalaaspglylysthrcysileglyleugluthrthraspgly

195200205

thrlystyrphealaasplysvalvalleualaalaglyalatrpser

210215220

prothrleuvalaspleugluaspglncysvalserlysalatrpval

225230235240

phealahisileglnleuthrprolysglualaaspalatyrlysasn

245250255

valprovalvaltyraspglyglutyrglyphephephegluproasp

260265270

glutyrglyvalilelysvalcysaspglupheproglypheserarg

275280285

phelysleuhisglnprotyrglyalaalaserprolysmetileser

290295300

valproargserhisalalyshisprothraspthrtyrproaspala

305310315320

sergluvalthrilearglysalailealaargpheleuprogluphe

325330335

lysasplysgluleupheasnargthrmetcystrpcysthraspthr

340345350

alaaspalaasnleuleuilecysgluhisprolystrplysasnphe

355360365

ileleualathrglyaspserglyhisserphelysleuleuproasn

370375380

ileglylystyrvalvalgluleuleugluglyserleuserglnglu

385390395400

metalaglyalatrpargtrpargproglyglyaspalaleuargser

405410415

argargglyalaproalalysaspleualaglumetproglytrplys

420425430

hisaspalahisleu

435

45

1314

dna

土正青黴（eupenicilliumterrenum）

45

atggctcattcgcgtgcaagcaccaaagtcgtcgtggttgggggaggtggtacgatcggg60

tcttcgacggctctgcacttaatccgctctggatataccccctcaaatatcaccgtgctt120

gacgtatacaagaccccttcattgcaatctgcaggacatgatttgaacaagatcatgggc180

attcgattgcgcaacgggcctgacttgcagctttcgctggaatcactcgacatgtggcaa240

aacgatgagttgttcaagccattctttcaccaagtgggcatgattgattgttcgtcatcc300

aaagagggtattgaaaatcttcgacgaaaataccagaccctcctcgatgcgggcattggg360

ctggagaagacgaacgtttggctggaatctgaagatgagatcctcgccaaagcgccgaat420

ttcacgcgtgaacaagtcaaggggtggaaaggcttattttgcactgatggaggctggctt480

gctgcagccaaggctatcaatgcgatcggaattttcctccaggacaaaggtgtcaagttt540

ggctttggagatgctggtacctttcagcaacctctgttcgccgctgatggaaaaacttgc600

atcggacttgaaactacagacggaaccaagtactttgctgacaaggttgtcttggctgct660

ggtgcgtggagtcccaccttggtggatctagaagatcagtgtgtttcaaaggcctgggtt720

ttcgctcatattcaactcacacccaaagaagcggacgcgtacaagaatgtgcctgtggtc780

tatgatggtgaatatgggttctttttcgaacccgacgagtatggggtgatcaaagtctgt840

gacgagttccctggtttctctcgcttcaaactgcatcaaccgtacggggctgcatctccc900

aagatgatatccgtaccgcgatcacacgccaagcatcccacagatacctaccctgatgcc960

tccgaagtcaccatacgcaaagcgatcgcaaggttcctgccagaatttaaagacaaggag1020

ctcttcaaccgtaccatgtgctggtgtacagatacggccgatgctaacttattgatttgc1080

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atggctggtgcctggagatggagacccggaggtgatgctcttagatctagacgcggtgct1260

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46

30

dna

人工的

引物

46

gactttgatcaccccatactcgtcgggctc30

47

30

dna

人工的

引物

47

ggtgatcaaagtccaggacgagttccctgg30

48

30

dna

人工的

引物

48

ggtgatcaaagtcagtgacgagttccctgg30

49

1314

dna

phaeosphaerianodorum

49

atggccccgtcgcgtgctaatacgtcggtcattgtggttggtggtggtggtacgattggc60

tcatctacggctctgcatctggtccgctcaggctataccccgtcgaacgtgacggttctg120

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gtctctctgcgtaatccggtggatctgcagctggctctggaagcgcgccaaatgtggaac240

gaagacgaactgttcaagaagtttttccataacaccggccgtctggattgcgcgcacggt300

gaaaaagatattgccgacctgaagagcggctatcaggctctggtggatgcgggtctggac360

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cgcgatcaaattaaaggctggaaggcgatcttttcaaaagacggtggttggctggcagca480

gcaaaggcaattaatgcagttggtgaatatctgcgtgatcagggcgtccgcttcggtttt540

tacggcgccggttctttcaaagcaccgctgctggctgaaggcgtctgcatcggtgtcgaa600

accgtggatggcacgcgctattacgcagacaaagtggttctggctgcaggtgcatggtcg660

ccgaccctggttgaactgcatgaacagtgtgtgagcaaagcgtgggtttacggccacatt720

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gtgggctttttctttgaaccgaacgaacatggcgttatcaaagtctgcgatgaatttccg840

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gtgccgcgctcccatgccaaacacccgaccgatacgatcccggatgcaagtgacgtttcc960

attcgtcgcgctatcgcgacctttatgccgcagttcaagaacaaaaagatgttcaaccaa1020

gcgatgtgctggtgtaccgatacggccgacgctgcgctgctgatttgtgaacatccggaa1080

tggaaaaactttgttctggcgaccggcgattcaggtcattcgttcaaactgctgccgaat1140

atcggcaagcacgttgtcgaactgctggagggtacgctggcagatgacctggcacacgca1200

tggcgttggcgtccgggtagtggtgatgcactgaaaagccgtcgctctgctccggcgaaa1260

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50

30

dna

人工的

引物

50

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51

30

dna

人工的

引物

51

cgttatcaaagtccaggatgaatttccggg30

52

30

dna

人工的

引物

52

cgttatcaaagtcagcgatgaatttccggg30

53

438

prt

構巢麴黴（aspergillusnidulans）

53

metthrproargalaasnthrlysileilevalvalglyglyglygly

151015

thrmetglyserserthralaleuhisleuleuargalaglytyrthr

202530

proserasnilethrvalleuaspthrcysproileproseralagln

354045

seralaglytyraspleuasnlysilemetglyileargleuargasn

505560

lysproaspleuglnleuserleuglualaleuaspmettrplysasn

65707580

aspproleuphelysprophephehisasnvalglymetileaspval

859095

serserthrglugluglyilegluglyleuarglyslystyrglnser

100105110

leuleuaspalaglyileglyleuglulysthrasnphemetleuglu

115120125

sergluaspgluileleualalysalaprohisphethrglnglugln

130135140

ilelysglytrplysglyleuphecysglyaspglyglytrpleuala

145150155160

alaalalysalaileasnalaileglyglnpheleulysgluglngly

165170175

vallyspheglypheglyglyalaglythrphelyslysproleuphe

180185190

alaaspalahisglulysthrcysileglyvalgluthrvalaspgly

195200205

thrlystyrtyralaasplysvalvalleualaalaglyalatrpser

210215220

serthrleuvalaspleuglugluglncysvalserlysalatrpval

225230235240

phealahisileglnleuthrproalaglualaalaalatyrlysasn

245250255

thrprovaliletyraspglyasptyrglyphephephegluproasn

260265270

gluasnglyileilelysvalcysaspglupheproglyphethrhis

275280285

phelysmethisglnprotyrglyserproalaprolysproileser

290295300

valproargserhisalalyshisprothraspthrtyrprohisala

305310315320

sergluvalthrilelyslysalaileasnargpheleuproargphe

325330335

asnasplysgluleupheasnargalametcystrpcysthraspthr

340345350

alaaspalaasnleuleuvalcysgluhisproargtrplysglyphe

355360365

tyrleualathrglyaspserglyhisserphelysleuleuproasn

370375380

ileglylyshisvalvalgluleuleuglugluargleugluserval

385390395400

phelysaspalatrpargtrpargproglyserglyaspalaleulys

405410415

serargargalaalaproalalysaspleualaaspmetproglytrp

420425430

argasnglualalysmet

435

54

1317

dna

構巢麴黴（aspergillusnidulans）

54

atgacgccccgagccaacaccaaaatcattgtcgtcggcggcggcggcacaatgggctcg60

tcgacagccctacacctcctgcgcgccggctacacgccgtccaacattacagtgctcgac120

acgtgccctatcccctccgcacagtctgcaggctacgacctgaacaaaatcatggggatc180

cgtctgcgcaacaagcctgatttacagctctctcttgaggcgctggacatgtggaaaaat240

gatcctctcttcaagccgtttttccacaatgttggaatgatcgacgtctcttcaacagag300

gaaggcatcgagggtcttcggaagaaataccagtctcttctcgacgcaggcattgggctc360

gagaagacgaatttcatgctggaaagtgaagacgagatcctggctaaagcgccgcatttc420

acgcaggagcagattaaaggctggaaaggcctgttctgtggcgacggcggctggctcgct480

gcagccaaagccatcaatgccattgggcagttcctcaaggaacagggcgtcaagtttgga540

ttcggcggcgccggcacgttcaaaaagccactcttcgccgatgcccacgagaagacgtgc600

atcggcgtcgagactgtagacggcacaaagtactacgccgacaaggtcgttctagcagct660

ggtgcctggagttcgacgttggtcgatctggaggagcagtgcgtttcaaaggcctgggtc720

tttgcccacatccaactgacgcccgctgaagcagccgcgtataagaacactcctgttata780

tacgacggtgactatgggtttttctttgagccgaatgaaaacggcatcataaaagtctgt840

gacgaattccctggcttcacgcatttcaaaatgcaccagccgtacggctcgccggcgccc900

aaacccatctctgtgcctcgttcccatgcgaagcaccccacagatacatacccgcacgcg960

tcggaggtcacgatcaaaaaggctatcaaccggttcctgccgaggttcaatgacaaggaa1020

ctgtttaacagggccatgtgctggtgcaccgataccgcggatgcaaatctgcttgtttgt1080

gagcatccacgctggaaggggttttatcttgcaacaggggacagtgggcattcgttcaag1140

ttgctgccgaatattggaaagcatgttgtcgagttattggaggagaggctggaaagtgtg1200

tttaaggatgcttggaggtggaggcctggcagtggggatgcattaaaaagtagacgggct1260

gcgcctgcgaaggacctggcggatatgccggggtggaggaatgaggcaaagatgtag1317

55

30

dna

人工的

引物

55

gacttttatgatgccgttttcattcggctc30

56

30

dna

人工的

引物

56

catcataaaagtccaggacgaattccctgg30

57

30

dna

人工的

引物

57

catcataaaagtcagtgacgaattccctgg30

58

1323

dna

棒狀彎孢（curvulariaclavata）

58

atggccccgagtcgcgctaacacgagcgtcattgtggtgggtggtggtggcacgattggt60

tcctcaacggcactgcatctggtccgtagcggctataccccgtctaacattaccgtgctg120

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atccgtctgcgcaacaaagttgatctgcagctgtcactggaagcccgtcaaatgtggcgc240

gaagatgacctgtttaaagaatacttccataacaccggccgtctggattgcgcacacggt300

gaagaaggtctggccgacctgcgccaggcttaccaagcgctgctggatgccaacgcaggt360

ctggaagaaaccacggaatggctggattcagaagacgaaattctgaagaaaatgccgctg420

ctggatcgtgaacagatcaaaggttggaaagccgtgtattcgcaagatggcggttggctg480

gcggccgcaaaagccattaatgcaatcggcgaatacctgcgcgcgcagggcgttaaattc540

ggttttggcggtgctggttcctttaaacagccgctgctggcagaaggcgtctgcattggt600

gtcgaaaccgtggatggcacgcgttattacgcggacaaagtggttctggctgcaggtgca660

tggagtccggtgctggttgatctggaagaccagtgtgtgtccaaagcgtgggtttatgcg720

catatccaactgaccccggaagaagccgcagaatataaaaacgtcccggtcgtgtacaat780

ggcgatgtgggctttttctttgaaccggacgaacatggcgttattaaagtctgcgatgaa840

tttccgggttttacccgcttcaaacagcaccaaccgtatggcgctaaagcgccgaaacgt900

atctcagtgccgcgttcggctgcaaaacacccgaccgatacgtacccggacgcgagtgaa960

aaatccattcgtaaagccatcgcaacctttctgccgaaattcacggaaaaagaactgttt1020

aatcgccatctgtgctggtgtaccgatacggccgacgccgcactgctgatgtgtgaacac1080

ccggaatggaaaaactttgttctggcgaccggcgatagcggtcatacgttcaaactgctg1140

ccgaatattggcaaacacgttgtcgaactgctggaaggtaccctggcagaagacctggct1200

catgcgtggcgttggcgtccgggtacgggtgatgcactgaaatctcgtcgcgctgcgccg1260

gcgaaagacctggcggatatgccgggctggaaacacgacgatgtggtgaaaagcaaactg1320

taa1323

59

30

dna

人工的

引物

59

gactttaataacgccatgttcgtccggttc30

60

29

dna

人工的

引物

60

cgttattaaagtccaggatgaatttccgg29

61

29

dna

人工的

引物

61

cgttattaaagtcagcgatgaatttccgg29

62

30

dna

人工的

引物

62

gcccacatcgccattgtacacgaccgggac30

63

30

dna

人工的

引物

63

ttattctttgaaccggacgaacatggcgtt30

64

30

dna

人工的

引物

64

atgttctttgaaccggacgaacatggcgtt30

65

30

dna

人工的

引物

65

gaaaaagcccacatcgccattgtacacgac30

66

30

dna

人工的

引物

66

ttagaaccggacgaacatggcgttattaaa30

67

438

prt

構巢裸孢殼（emericellanidulans）

67

metalaproargalaasnthrlysileilevalvalglyglyglygly

151015

thrmetglyserserthralaleuhisleuleuargalaglytyrthr

202530

proserasnilethrvalleuaspthrtyrproileproseralagln

354045

seralaglytyraspleuasnlysilepheglyileserglyalaasn

505560

lyshisaspleuglnleuserleuglualapheaspmettrplysasn

65707580

aspproleuphelysprophephehisasnvalglyglnmetaspval

859095

serserthrglugluglyilelysargleuargargargtyrglnser

100105110

leuleuargalaglyileglyleuglulysthrasnpheleuleuglu

115120125

sergluaspgluileleualalysalaprohisphethrargglugln

130135140

ilelysglytrplysglyleuphecysglyaspglyglytrpleuala

145150155160

alaalalysalaileasnalaileglyglnpheleulysgluglngly

165170175

vallyspheglypheglyglualaglythrphelyslysproleuphe

180185190

alaaspalaaspglulysthrcysileglyvalgluthrvalaspgly

195200205

thrlystyrtyralaasplysvalvalleualaalaglyalatrpser

210215220

serthrleuvalaspleuglugluglncysvalserlysalatrpval

225230235240

phealahisileglnleuthrproalaglualaalaalatyrlysasn

245250255

thrprovaliletyraspglyasptyrglyphepheilegluproasp

260265270

gluasnglyileilelysvalcysaspglupheproglyphethrhis

275280285

phelysmethisglnprotyrglyserprovalprolysleuileser

290295300

valproargserhisalalyshisprothraspthrtyrprohisala

305310315320

sergluvalthrilelyslysalaileasnargpheleuproargphe

325330335

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構巢裸孢殼（emericellanidulans）

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