由HLA－A2402－限制的Ep－CAM－特異的CTL識別的表位/肽及其應用的製作方法

2023-04-24 13:25:01 2

專利名稱：由HLA－A2402－限制的Ep－CAM－特異的CTL識別的表位/肽及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及由HLA-A2402-限制的胞毒T淋巴細胞識別的表位肽，抗原呈遞細胞和主要組織相容性抗原複合體；含有這些物質作為活性成分的癌症疫苗或胞毒T淋巴細胞誘導劑；含有此種胞毒T淋巴細胞誘導劑作為活性成分的表皮癌的被動免疫治療藥物；利用上述物質的癌症治療或改善方法；以及特異於癌症的HLA-A2402-限制的胞毒T淋巴細胞的定量方法。
背景技術：
胞毒T淋巴細胞(下文稱為「CTL」)被認為是抵抗癌症的重要因子。
在癌症患者的腫瘤部位可觀察到針對腫瘤細胞顯示胞毒性的CTL滲入。腫瘤抗原為被這種腫瘤特異的CTL靶向的分子，在細胞中分解成含有8-11個胺基酸的肽(腫瘤表位肽)，結合到人白細胞抗原(下文稱為「HLA」，為一種主要組織相容性抗原)，然後呈遞在腫瘤細胞表面。CTL識別含有HLA和腫瘤抗原肽的複合體，並攻擊腫瘤細胞。由此，CTL通過腫瘤抗原的HLA限制識別腫瘤細胞。
HLA為在幾乎所有細胞上表達的細胞膜抗原，並被主要分成I型抗原和II型抗原。與表位肽一起被CTL識別的HLA劃分為I型抗原。HLAI型抗原進一步被分成HLA-A，HLA-B，HLA-C等，而且它們的基因還具有亞型。例如，HLA-A是多態性的，並具有A1，A2，A24，A26等亞型。因此，各個人個體的HLA不總是相同，CTL在識別HLAI型抗原和腫瘤表位肽的複合體時甚至可識別這些HLA亞型。進一步，能夠結合到HLA的表位肽已知具有能夠結合到各型HLA之一的肽序列基元(模式序列)。因此，對誘導和/活化CTL而言，選擇含有能夠結合到每個患者不同型HLA的基元的肽是必要的。
Ep-CAM是在上皮起源的癌細胞表面上廣泛表達的分子，並擔當非鈣依賴性細胞—細胞附著的中間物。Ep-CAM也稱作EGP-2，17-1A，GA733-2或KSA。Ep-CAM在衍生自諸如大腸，肺，頭和頸，乳腺等不同組織起源的許多腫瘤中是高度表達的，而其表達在正常上皮細胞中是區域性的。進一步，由於腫瘤發展和Ep-CAM表達水平相關，因此Ep-CAM表達的檢測作為標記診斷最低存在的腫瘤轉移和在預測患者預後中是有用的。
Ep-CAM在源自上皮細胞的癌細胞中廣泛表達，但在正常細胞中局部表達。鑑於此，Ep-CAM是利用單克隆抗體進行免疫治療和基因治療中的重要靶。
例如，有報導，給其腫瘤已通過手術摘除的患者施用Ep-CAM-特異的鼠單克隆抗體(命名為17-1A)可有效預防遠距離轉移，以及連續7年給藥對提高生存率是有效的。還有報導，命名為17-1A的Ep-CAM-特異的單克隆抗體在用於治療大腸癌患者時對減少死亡率和腫瘤復發是有效的。
此外，最近的一些報導公開的事實顯示利用CTL靶向HLA-限制的Ep-CAM治療癌症的可能性。
例如，專利文獻1報導，HLA-A0201-限制的Ep-CAM-特異性CTL破壞上皮腫瘤細胞，但不影響正常細胞。專利文獻1中公開的肽由SEQID NO12所示的序列YQLDPKFITSI組成，作為被HLA-A0201-限制的CTL識別的Ep-CAM 174-184表位肽。
T-細胞對Ep-CAM的反應還在沒有接受免疫治療的結腸和大腸癌患者中觀察到。另外，在大腸癌患者免疫以Ep-CAM表達的重組金絲雀痘病毒時，抗Ep-CAM-特異性CTL反應的獲得不會引起自身免疫反應。
在HLA I型抗原的HLA-A型中，日本人的HLA-A24表達最多。結果，HLA-A24-限制的Ep-CAM表位肽推測是理想的癌症疫苗。有關這種表位肽的報導例子如下。
專利文獻2公開5種表位肽，由含有9個胺基酸殘基的胺基酸序列組成，來自SART-2腫瘤抗原蛋白，作為HLA-A2402-限制的CTL表位肽。
專利文獻3公開6種表位肽，由含有8-11個胺基酸殘基的胺基酸序列組成，來自ART-4腫瘤抗原蛋白，作為HLA-A2402-限制的CTL表位肽。
專利文獻4公開7種表位肽，由含有8-11個胺基酸殘基的胺基酸序列組成，來自在大腸癌細胞和小細胞肺癌細胞中異常表達的p56luk蛋白(由luk基因編碼的腫瘤抗原蛋白)，作為獲自從食道癌患者建立的細胞系的HLA-A2402-限制的CTL表位肽。
專利文獻5公開4種PI-9-衍生的表位肽，由含有9-10個胺基酸殘基的胺基酸序列組成，獲自KE4腫瘤細胞系—衍生的cDNA文庫，作為獲自從食道癌患者建立的細胞系的HLA-A2402-限制的CTL表位肽。
專利文獻6公開17種PI-9-衍生的表位肽，由含有9-10個胺基酸殘基的胺基酸序列組成，獲自11-18肺腺癌細胞系cDNA文庫，作為獲自從肺癌患者建立的細胞系的HLA-A2402-限制的CTL表位肽。
專利文獻7公開由9-10個胺基酸殘基組成的表位肽，具有能夠結合到HLA-A24.1的基元(HLA-A2402)，並在N-端具有第一保守殘基Y，F或W，以及在C-端具有第二保守殘基F，I，W或M，其中第一和第二保守殘基由6-7個殘基分開。
如上所例證，腫瘤相關抗原中的不同HLA-A2402-限制的CTL表位已被鑑定；然而腫瘤抗原的表達依據組織起源，個體癌症患者和各患者損傷而變化，因此其他新表位預計被指定。
此外，由於通過能夠結合到HLA-A2402分子的Ep-CAM表位肽衍生CTL尚未確認，因此對開發能夠結合到HLA-A2402分子及能夠誘導CTL的新型癌細胞-特異的Ep-CAM表位肽存在需求。
專利文獻1國際專利公布No.WO 97/15597專利文獻2未審日本專利申請公布No.1999-318455專利文獻3未審日本專利申請公布No.2000-116383專利文獻4國際專利公布No.WO2000-06595專利文獻5未審日本專利申請公布No.2001-245675專利文獻6未審日本專利申請公布No.2003-270專利文獻7未審日本專利申請公布No.1996-500103(權利要求11等)發明內容發明解決的問題本發明目的是提供能夠誘導HLA-A2402-限制的胞毒T淋巴細胞的Ep-CAM表位肽，抗原呈遞細胞和主要組織相容性抗原複合體；含有這些物質作為活性成分的癌症疫苗或胞毒T淋巴細胞誘導劑；Ep-CAM-特異性HLA-A2402-限制的胞毒T淋巴細胞；含有此種淋巴細胞的被動免疫治療藥物；利用上述物質的癌症治療或改善方法；以及上皮癌特異的HLA-A2402-限制的胞毒T淋巴細胞的定量方法。
解決問題的方法為了實現上述目的，本發明人通過生物信息學途徑在Ep-CAM蛋白中預測和合成了7種肽序列，找到了具有結合到HLA-A2402分子能力的表位肽序列，HLA-A2402分子在日本人中是最常見的HLA-A類型(60％以上)，以及在歐洲人中約20％。
當通過生物學信息途徑預測能夠結合到特異性HLA分子的肽時，由這種預測的肽誘導的胞毒T淋巴細胞實際上通常不識別含有這種肽的抗原。
在此情形下，本發明人發現，特異於7種預測的表位肽中的2種的CTL克隆真正對HLA-A2402陽性Ep-CAM表達癌細胞顯示胞毒性，但對HLA-A2402陰性癌細胞不顯示胞毒性。
而且，冷靶抑制分析證明，這些表位肽被加工，並作為抗原呈遞在HLA-A2402陽性Ep-CAM陽性癌細胞上。
結果，這兩種肽可用作具有HLA-A2402人的癌症疫苗。
本發明基於上述發現而完成，並提供下列表位肽等。
第1項.下列(1)-(4)任一項的肽(1)基本上由SEQ ID NO1所示的胺基酸序列組成的肽；(2)基本上由SEQ ID NO2所示的胺基酸序列組成的肽；
(3)基本上由通過添加，缺失或替換一個或多個胺基酸而衍生自SEQ ID NO1所示胺基酸序列的胺基酸序列組成的突變肽，所述肽能夠與HLA-A2402分子形成複合體而被HLA-A2402-限制的胞毒T淋巴細胞識別或誘導這種淋巴細胞；(4)基本上由通過添加，缺失或替換一個或多個胺基酸而衍生自SEQ ID NO2所示胺基酸序列的胺基酸序列組成的突變肽，所述肽能夠與HLA-A2402分子形成複合體而被HLA-A2402-限制的胞毒T淋巴細胞識別或誘導這種淋巴細胞。
第2項.下列(1)或(2)的肽(1)基本上由SEQ ID NO1所示胺基酸序列組成的肽；(2)基本上由SEQ ID NO2所示胺基酸序列組成的肽。
第3項.包含第1或2項的肽作為活性成分的癌症疫苗。
第4項.第3項的癌症疫苗，其中癌症為上皮癌。
第5項.第3或4項的癌症疫苗，其中癌症選自大腸癌，肺癌，乳腺癌，胃癌，口腔癌，胰腺癌，食道癌，鼻咽癌，子宮癌，前列腺癌，和膽囊癌。
第6項.第3-5任一項的癌症疫苗，其用於治療具有HLA-A2402作為白細胞抗原的人。
第7項.包含第1或2項的肽作為活性成分的胞毒T淋巴細胞誘導劑。
第8項.第7項的胞毒T淋巴細胞誘導劑，其用於治療具有HLA-A2402作為白細胞抗原的人。
第9項.下列(5)-(8)任一項的多核苷酸(5)基本上由SEQ ID NO10所示鹼基序列組成的多核苷酸；(6)基本上由SEQ ID NO11所示鹼基序列組成的多核苷酸；(7)在嚴格條件下與由SEQ ID NO10所示鹼基序列組成的多核苷酸雜交的突變多核苷酸，其編碼的肽能夠與HLA-A2402分子形成複合體而被HLA-A2402-限制的胞毒T淋巴細胞識別或誘導這種淋巴細胞；(8)在嚴格條件下與由SEQ ID NO11所示鹼基序列組成的多核苷酸雜交的突變多核苷酸，其編碼的肽能夠與HLA-A2402分子形成複合體而被HLA-A2402-限制的胞毒T淋巴細胞識別或誘導這種淋巴細胞。
第10項.上皮癌的基因治療藥物，包含第9項的多核苷酸作為活性成分。
第11項.重組載體，包含第9項的多核苷酸。
第12項.轉化體，其中導入第11項的重組載體。
第13項.第1或2項的肽的製備方法，包括培育第12項的轉化體，以及從培養物中收集第1或2項的肽的步驟。
第14項.抗原呈遞細胞，其脈衝以第1或2項的肽。
第15項.癌症疫苗，包含第14項的抗原呈遞細胞作為活性成分。
第16項.第15項的癌症疫苗，其中癌症為上皮癌。
第17項.第15或16項的癌症疫苗，其中癌症選自大腸癌，肺癌，乳腺癌，胃癌，口腔癌，胰腺癌，食道癌，鼻咽癌，子宮癌，前列腺癌，和膽囊癌。
第18項.第15-17任一項的癌症疫苗，其用於治療具有HLA-A2402作為白細胞抗原的人。
第19項.胞毒T淋巴細胞誘導劑，包括第14項的抗原呈遞細胞作為活性成分。
第20項.第19項的胞毒T淋巴細胞誘導劑，其用於治療具有HLA-A2402作為白細胞抗原的人。
第21項.主要組織相容性抗原複合體，包含主要組織相容性抗原，和第1或2項的肽，或者存在於第14項的抗原呈遞細胞上的腫瘤抗原表位肽。
第22項.第21項的主要組織相容性抗原複合體，包括HLA-A2402分子，β2-微球蛋白，和第1或2項的肽，或者存在於第14項的抗原呈遞細胞上的腫瘤抗原表位肽。
第23項.癌症疫苗，包括第21或22項的主要組織相容性抗原複合體作為活性成分。
第24項.第23項的癌症疫苗，其中癌症為上皮癌。
第25項.第23或24項的癌症疫苗，其中癌症選自大腸癌，肺癌，乳腺癌，胃癌，口腔癌，胰腺癌，食道癌，鼻咽癌，子宮癌，前列腺癌，和膽囊癌。
第26項.第23-25任一項的癌症疫苗，其用於治療具有HLA-A2402作為白細胞抗原的人。
第27項.胞毒T淋巴細胞誘導劑，包括第21或22項的主要組織相容性抗原複合體作為活性成分。
第28項.第27項的胞毒T淋巴細胞誘導劑，其用於治療具有HLA-A2402作為白細胞抗原的人。
第29項.主要組織相容性抗原複合體四聚體，包括主要組織相容性抗原，和第1或2項的肽，或者存在於第14項的抗原呈遞細胞上的腫瘤抗原表位肽。
第30項.利用一種或多種下列(a)-(d)物質，通過刺激外周血淋巴細胞獲得的胞毒T淋巴細胞(a)第1或2項的肽；(b)第14項的抗原呈遞細胞；(c)第21或22項的主要組織相容性抗原複合體；(d)第29項的主要組織相容性抗原複合體四聚體。
第31項.第30項的胞毒T淋巴細胞，其是通過下列步驟獲得的利用第30項限定的一種或多種(a)-(d)物質，通過刺激外周血淋巴細胞，在主要組織相容性抗原複合體和/或其四聚體與胞毒T淋巴細胞之間形成複合體，並從複合體中分離胞毒T淋巴細胞。
第32項.被動免疫治療藥物，包括第30或31項的胞毒T淋巴細胞作為活性成分。
第33項.第32項的被動免疫治療藥物，其中癌症為上皮癌。
第34項.第32或33項的被動免疫治療藥物，其中癌症選自大腸癌，肺癌，乳腺癌，胃癌，口腔癌，胰腺癌，食道癌，鼻咽癌，子宮癌，前列腺癌，和膽囊癌。
第35項.第32-34任一項的被動免疫治療藥物，其用於治療具有HLA-A2402作為白細胞抗原的人。
第36項.定量外周血中HLA-A2402-限制的胞毒T淋巴細胞的方法，其包括下列步驟
使一種或多種下列(a)-(d)物質作用於外周血(a)第1或2項的肽；(b)第14項的抗原呈遞細胞；(c)第21或22項的主要組織相容性抗原複合體；(d)第29項的主要組織相容性抗原複合體四聚體，以及定量外周血中的胞毒T淋巴細胞或者由這樣的胞毒淋巴細胞產生的細胞因子。
第37項.癌症治療和/或改善方法，包括給具有HLA-A2402作為白細胞抗原的人施用一種或多種下列(a)-(d)物質(a)第1或2項的肽；(b)第14項的抗原呈遞細胞；(c)第21或22項的主要組織相容性抗原複合體；(d)第29項的主要組織相容性抗原複合體四聚體。
第38項.癌症治療和/或改善方法，包括下列步驟從具有HLA-A2402作為白細胞抗原的人患者的外周血中收集單核細胞部分，採用一種或多種下列(a)-(d)物質培養單核細胞部分(a)第1或2項的肽；(b)第14項的抗原呈遞細胞；(c)第21或22項的主要組織相容性抗原複合體；(d)第29項的主要組織相容性抗原複合體四聚體，以及將其中胞毒T淋巴細胞被誘導和/或激活的單核細胞部分返回至患者血液。
第39項.誘導胞毒T淋巴細胞的方法，包括給具有HLA-A2402作為白細胞抗原的人施用一種或多種下列(a)-(d)物質(a)第1或2項的肽；(b)第14項的抗原呈遞細胞；(c)第21或22項的主要組織相容性抗原複合體；(d)第29項的主要組織相容性抗原複合體四聚體。
第40項.癌症治療或改善方法，包括給具有HLA-A2402作為白細胞抗原的人施用第30或31項的胞毒T淋巴細胞。
第41項.第21項的主要組織相容性抗原複合體四聚體，其中四聚體為包括HLA-A2402分子，β2-微球蛋白，和第1或2項的肽，或者存在於第14項的抗原呈遞細胞上的腫瘤抗原表位肽的複合體。
第42項.癌症疫苗，包括第41項的主要組織相容性抗原複合體四聚體作為活性成分。
第43項.第42項的癌症疫苗，其中癌症為上皮癌。
第44項.第42或43項的癌症疫苗，其中癌症選自大腸癌，肺癌，乳腺癌，胃癌，口腔癌，胰腺癌，食道癌，鼻咽癌，子宮癌，前列腺癌，和膽囊癌。
第45項.第42-44任一項的癌症疫苗，其用於治療具有HLA-A2402作為白細胞抗原的人。
第46項.胞毒T淋巴細胞誘導劑，包括第41項的主要組織相容性抗原複合體四聚體。
第47項.第46項的胞毒T淋巴細胞誘導劑，其用於治療具有HLA-A2402作為白細胞抗原的人。
發明效果本發明提供的表位肽衍生自在上皮癌細胞上廣泛表達的Ep-CAM分子，並可被限制至HLA-A2402的胞毒T淋巴細胞識別，HLA-A2402為日本人中最常見的人白細胞抗原類型。結果，這種表位肽可用作癌症疫苗來治療分布廣泛的HLA-A2402-陽性人上皮癌。
附圖簡述

圖1示出多克隆肽激活的CTL細胞系的ELISOT分析評估結果。
圖2示出Ep-CAM肽特異的多克隆(A)和單克隆(B)CTL的四聚體染色結果。
圖3示出Ep173-特異性-CTL-克隆特徵。
圖3A示出51Cr釋放分析，表明在肽Ep173或對照肽EBV-LMP419存在下C27(Ep173-特異的CTL克隆)針對T2-A24的胞毒性。
圖3B示出抗-HLA-A24單克隆抗體對Ep173-特異的CTL克隆(C27)針對HLA-A2402陽性細胞系(PC9)的胞毒性的抑制作用。
圖3C示出在Ep173存在下，基於冷靶抑制分析，C27的胞毒性。
圖4示出基於PCR的Ep-CAM分析。
圖5示出Ep173-特異性CTL克隆(C27)針對多種不同的癌細胞系的胞毒性。
實施發明的最佳方式本發明詳細描述如下。
(I)表位/肽結構參照HLA肽結合預測(HLA Peptide Binding Predictions)，BioInformatics Molecular Analysis Section(BIMAS)，(http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla bind/index.html)，這是檢索組成為9-10個胺基酸、在胺基酸序列中具有HLA-A2402-結合基元的表位肽的參考位點，所述序列衍生自在起源於上皮細胞的癌細胞上廣泛表達的Ep-CAM蛋白，作為篩選潛在的肽為表位肽的結果，本發明的肽經確認是被胞毒T淋巴細胞(下文稱為「CTL」)識別的表位肽。
更具體而言，本發明的肽為下列(1)-(4)任一種(1)基本上由SEQ ID NO1所示的胺基酸序列組成的肽；(2)基本上由SEQ ID NO2所示的胺基酸序列組成的肽；(3)基本上由通過添加，缺失或替換一個或多個胺基酸而衍生自SEQ ID NO1所示胺基酸序列的胺基酸序列組成的突變肽，所述肽能夠與HLA-A2402分子形成複合體而被HLA-A2402-限制的胞毒T淋巴細胞識別或誘導這種淋巴細胞；(4)基本上由通過添加，缺失或替換一個或多個胺基酸而衍生自SEQ ID NO2所示胺基酸序列的胺基酸序列組成的突變肽，所述肽能夠與HLA-A2402分子形成複合體而被HLA-A2402-限制的胞毒T淋巴細胞識別或誘導這種淋巴細胞。
在本發明中，肽表示生物活性胺基酸分子鏈，其中相鄰胺基酸殘基的α-氨基和羧基通過肽鍵連接。
除上述肽之外，肽還包括其鹽和衍生物，這是因為它們的生物活性沒被破壞。這些衍生物的例子包括那些糖基化、醯胺化、磷酸化、羧化、膦酸化、甲醯化、醯化等衍生物。優選的鹽為酸加成鹽。這種鹽的例子包括鹽酸、磷酸、硫酸等無機酸加成鹽；以及甲酸、乙酸、丙酸、酒石酸等有機酸加成鹽。
(1)-(4)中限定的肽分別衍生自在起源於上皮細胞的癌細胞上廣泛表達的Ep-CAM，並被HLA-A2402-限制的CTL識別，或誘導或進一步激活這種CTL。因此，這些肽可合適地用作CTL-誘導或激活腫瘤抗原，即癌症疫苗，來治療或改善具有HLA-A2402的人癌症。而且，這些肽可用於製備各種不同的腫瘤抗原表位特異的肽。本發明肽的應用如下所述。
(3)和(4)中限定的突變肽的胺基酸最小數通常約為5，優選約為7。胺基酸的最大數不受限制，只要肽可被HLA-A2402-限制的CTL識別，並通常約為12，含有約9至約11個胺基酸的突變肽是優選的。
通過參照上述HLA肽結合預測(HLA Peptide Binding Predictions)，設計HLA-A2402-結合基元的序列，並且從中選擇那些真正被HLA-A2402-限制的CTL識別或誘導這種CTL的序列，可獲得這種突變肽。
HLA-A2402陽性Ep-CAM表位肽例如通過下列方法鑑定。
淋巴細胞分離自HLA-A2402-陽性成人，並以細胞濃度2×106/ml懸浮於含有10％人血清的RPMI1640培養基。向各細胞懸浮液以濃度1μg/ml加入其中一種表位候選肽。將懸浮液在CO2培養箱中37℃下溫育7天，並在第7天加入IL-2。其後，每周1次重複由候選肽刺激和IL-2刺激的循環，以誘導Ep-CAM-特異的CTL。
通過ELISPOT分析(Kuzushima K.等，The Journal of ClinicalInvestigation，(1999)，Vol.104，p.163-171)確定如此誘導的上皮癌-特異的CTL是否被表位候選肽刺激。
利用上述候選肽，合成含有約20個胺基酸的肽的肽文庫，覆蓋整個Ep-CAM蛋白，對合成的肽進行ELISPOT分析，CTL對其反應的肽逐漸縮短，以致最終包含約9至約10個胺基酸，從而用作本發明的表位肽。
此外，關於胺基酸替換，具有等同活性的突變肽極可能獲得，如果胺基酸的電荷，可溶性，親水性/疏水性，極性等性質類似於那些替換前的胺基酸，則替換後的蛋白結構予以保存。
導入缺失，添加(包括插入)和替換的方法是眾所周知的，例子包括Wurmer氏技術(Science，219，666(1983))。
本發明的肽可以與糖類，聚乙二醇，脂質等加成的複合體，放射性同位素衍生物和聚合物等的形式使用。
(II)多核苷酸本發明的多核苷酸編碼上述本發明肽，並具體由下列(5)-(8)任一項限定(5)基本上由SEQ ID NO10所示鹼基序列組成的多核苷酸；(6)基本上由SEQ ID NO11所示鹼基序列組成的多核苷酸；(7)在嚴格條件下與由SEQ ID NO10所示鹼基序列組成的多核苷酸雜交的突變多核苷酸，其編碼的肽能夠與HLA-A2402分子形成複合體而被HLA-A2402-限制的胞毒T淋巴細胞識別或誘導這種淋巴細胞；(8)在嚴格條件下與由SEQ ID NO11所示鹼基序列組成的多核苷酸雜交的突變多核苷酸，其編碼的肽能夠與HLA-A2402分子形成複合體而被HLA-A2402-限制的胞毒T淋巴細胞識別或誘導這種淋巴細胞。
除非另有說明，本發明的多核苷酸包括DNA和RNA。DNA包括cDNA，基因組DNA和合成DNA。RNA包括mRNA，rRNA和合成RNA。除具有這種鹼基序列的多核苷酸之外，那些互補於這種多核苷酸的多核苷酸以及雙鏈多核苷酸也包括在內。
SEQ ID NO10所示鹼基序列的多核苷酸(編碼SEQ ID NO1所示胺基酸序列的多核苷酸之一)，和SEQ ID NO11所示鹼基序列的多核苷酸(編碼SEQ ID NO2所示胺基酸序列的多核苷酸之一)是獲自人腫瘤相關抗原GA733-2的Ep-CAM基因的部分序列(Szala，S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1990)87(9)，3542-3546)。
(7)和(8)中限定的突變多核苷酸為任一那些在編碼本發明表位肽的區域中通常含有15或更多，優選21或更多，但通常45或更少核苷酸的多核苷酸。其中，含有約27至約33個核苷酸的多核苷酸是優選的。
以DNA分子為多核苷酸分子的代表性例子，「在嚴格條件下可與DNA分子雜交的DNA分子」可通過例如下列文獻所述的方法獲得《分子克隆實驗室手冊》(Sambrook等編，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989)等。在本發明中，「嚴格條件」是指，例如，在6×SSC，0.5％SDS，和50％甲醯胺的溶液中42℃下加熱，並且在0.1×SSC和0.5％SDS的溶液中68℃下洗滌時，觀察到陽性雜交信號的條件。
採用下述方法，利用公知的蛋白表達系統，通過確認在具有HLA-A2402的細胞上表達的肽被CTL識別或具有誘導CTL的能力，而選擇(7)和(8)的突變多核苷酸。
突變多核苷酸具有3』poly A結構，多核苷酸中poly A的核苷酸數沒有限制，因為不影響擔當腫瘤抗原的胺基酸編碼區。
當利用重組技術來製備本發明的表位肽時，本發明多核苷酸可提供有益的基因信息。這種多核苷酸可用作核酸試劑或標準多核苷酸。
(III)重組載體通過導入本發明多核苷酸至合適的載體DNA，獲得本發明的重組載體。
根據宿主細胞種類和用途目的，可合適地選擇載體DNA。載體DNA可以為那些天然存在的載體DNA，或者那些天然存在但有部分DNA從對增殖不必需的區域中丟失的載體DNA。載體DNA的例子包括那些起源於染色體，附加體和病毒的載體DNA。更具體而言，載體DNA包括那些衍生自細菌質粒，噬菌體，轉位子，酵母附加體，插入元件，酵母染色體元件，病毒(例如，baculoviruses，乳頭狀多瘤空泡病毒，SV40，牛痘病毒，腺病毒，禽痘病毒，偽狂犬病毒，逆轉錄病毒等)等的載體DNA，及其組合，以及那些衍生自質粒和噬菌體(例如，粘粒，噬粒等)的基因元件的載體DNA。
而且，表達載體和克隆載體可用於生物合成本發明肽。
重組載體具有目標多核苷酸的基因序列及編碼複製和控制信息的基因序列(例如，啟動子，核糖體結合位點，終止子，信號序列，增強子等)的組成元件，並可通過公知方法組合這些序列而製備。
本發明多核苷酸通過公知方法可插入載體DNA。例如，利用合適的限制性酶，DNA和載體DNA可在特異位點連接，並利用連接酶為重組而混合。或者，通過連接合適的接頭至本發明多核苷酸，並插入多核苷酸至滿足用途目的的載體DNA的多克隆位點可獲得載體DNA。
(IV)轉化體利用公知的方法，通過導入含有多核苷酸的上述重組載體至公知的宿主細胞，諸如，大腸桿菌(Escherichia coli)(例如，K12)，屬於桿菌屬的細菌(例如，MI114)，酵母(例如，AH22)，昆蟲細胞(例如，Sf細胞)，動物細胞(例如，COS-7細胞，Vero細胞，CHO細胞等)等，可獲得本發明的轉化體。
鑑於良好的基因穩定性，基因整合至染色體的方法是優選的基因轉移法。利用核外基因自動複製系統為簡單可用的方法。載體DNA轉移至宿主細胞可通過公開在例如下列文獻中的標準方法進行《分子克隆實驗室手冊》(Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989)等。更具體的例子包括磷酸鈣轉染，DEAE-葡聚糖介導轉染，微注射，陽離子脂質介導的轉染，電穿孔，轉導，刮載(scrape loading)，彈道導入和感染等。
(V)表位肽的製備方法本發明的肽可通過公知的肽合成法，諸如固相肽合成法等加以合成。這種肽合成法包括那些公開在「肽合成(Peptide Synthesis)」(Maruzen，1975)和「肽合成(Peptide Synthesis)」(Interscience，New York，1996)中的方法。或者，本發明的表位肽可利用公知的化學合成設備，諸如Applied Biosystems生產的肽合成儀製備。
此外，本發明肽的製備方法包括下列步驟培養上述本發明的轉化體，以及從該培養物中收集本發明的肽。
利用對宿主細胞適合的培養基，通過次培養或分批培養，進行這種培養。持續培養直到本發明肽以所需的量生產，這基於轉化體內外生產的肽量，和/或CTL誘導能力，所述能力是由轉化體生產的本發明肽顯示的作用之一。
在從培養基中收集之後，優選的是進一步純化本發明肽。純化可通過公知的方法進行，諸如分子篩層析，離子交換層析，親和層析等層析技術；利用硫酸銨和/或醇等，基於溶解性差異的分級方式的組合。這種純化的進行可基於通過CTL的肽識別或通過肽的CTL誘導，更具體例如，通過CTL的IFN-γ產量。
或者，培養基中的本發明肽利用多克隆或單克隆抗體可被特異性吸附回收，所述抗體的生產是基於本發明肽的胺基酸序列，並且特異於該胺基酸序列。
(VI)抗原呈遞細胞本發明的抗原呈遞細胞通過用本發明肽脈衝樹突細胞，巨噬細胞，B淋巴細胞等抗原呈遞細胞而獲得。本發明的抗原呈遞細胞能夠表達在其表面與本發明肽結合的HLA，並具有刺激CTL的能力。
「脈衝」不受限制，並可通過例如在含有約1-10μg/ml的本發明肽的培養基中，約20-約30℃下溫育這種抗原呈遞細胞約30分鐘至約1小時而進行。由HLA-A2402-限制的CTL識別的腫瘤抗原肽由此呈遞在抗原呈遞細胞表面。
腫瘤抗原是指存在於腫瘤細胞中被腫瘤-特異的CTL識別，或進一步誘導CTL或/和激活CTL的蛋白，多肽或肽。而且，腫瘤抗原肽是指通過分解腫瘤細胞中的腫瘤抗原而產生的肽，作為結合到HLA分子的結果，當呈遞在細胞表面上時，這種肽被CTL識別，誘導CTL，或/和激活CTL。
表位序列衍生自腫瘤抗原中的胺基酸序列，並被腫瘤特異的CTL識別，或進一步誘導或激活CTL，稱為腫瘤抗原表位(腫瘤抗原決定簇)。
在本說明書中，「識別」表示認識和區分靶和其他物質，以及例如，結合到被認識的靶。在本說明書中，「CTL識別腫瘤細胞或腫瘤抗原表位肽」表示通過T淋巴細胞受體，CTL結合到人白細胞抗原(HLA)或腫瘤抗原肽。
「激活」表示進一步增強或刺激具有某種活性或作用的物質或狀態。具體而言，「CTL被激活」表示CTL產生效應子，諸如，INF-γ，或顯示針對靶細胞的胞毒性，當CTL識別被HLA呈遞的表位肽時，識別這些靶細胞。
「誘導」表示從基本沒有某種活性或作用的物質或狀態引起這種活性或作用。具體而言，「誘導抗原特異的CTL」表示分化和/或增殖體外或體內特異性識別某種抗原的CTL。
以其脈衝本發明表位肽的抗原呈遞細胞可用作癌症疫苗。抗原呈遞細胞可進一步用於生產特異於上皮衍生的癌症的CTL，定量人外周血中的這種CTL等。
(VII)主要組織相容性抗原複合體本發明的主要組織相容性抗原複合體是主要組織相容性抗原和本發明肽或呈遞在脈衝以本發明肽的抗原呈遞細胞表面上的腫瘤抗原表位肽之間的複合體。
本發明中，主要組織相容性抗原是將被T淋巴細胞識別的肽呈遞至T淋巴細胞抗原受體的分子，並且是與表位肽一起被CTL識別的人白細胞抗原(HLA)。
更具體而言，本發明的主要組織相容性抗原複合體(下文簡稱「MHC」)是MHC I型人白細胞抗原(HLA)和被CTL識別或能夠誘導CTL的表位肽之間的複合體，所述HLA表達在與表位肽一起被CTL識別的靶細胞表面。這種複合體包括那些被β2微球蛋白結合的複合體。
Ep-CAM-特異的CTL表位肽是特異位點在Ep-CAM蛋白中的肽，並且是被CTL識別的抗原決定簇，免疫性結合到CTL的抗原受體。進一步，CTL表位肽通過直接進攻表達Ep-CAM分子的細胞能夠消除癌細胞。
尤其是，本發明MHC是指表達在靶細胞上的HLA-A2402分子和Ep-CAM蛋白中被CTL識別的特定表位肽之間的複合體，並且還可以是指與β2微球蛋白形成的這種複合體。
本發明中的HLA-A2402是指人白細胞抗原中的I型抗原的亞型，A-24多態性，而HLA-2402分子表示抗原呈遞細胞表面上的HLA-A2402基因表達產物。
可用的HLA-A2402分子為純化自HLA-A2402表達用E.coli培養物的任一HLA-A2402分子，通過轉移基因至靶細胞強制表達的HLA-A2402分子，以及天然存在於靶細胞上的HLA-A2402分子。而且，本發明的HLA-A2402分子包括HLA-A2402分子的片段和重鏈。
本發明的MHC取決於其組成元件可通過多種不同的方法製備，並且通過例如將本發明肽、HLA-A2402分子和β2微球蛋白懸浮於諸如Tris等緩衝液，並在約4-約10℃下溫育該懸浮液約24-約72小時而形成。
MHC可以四聚體。MHC四聚體為四個亞複合體的多聚複合體，各亞複合體包括被CTL識別的Ep-CAM表位肽和HLA-A2402分子(通常β2微球蛋白結合的HLA-A2402分子)。
MHC四聚體通過生物素醯化MHC，並以1∶4之比混合鏈親和素和生物素醯化的MHC而獲得。或者，MHC四聚體通過添加生物素結合位點至HLA分子的C端，在形成MHC後使生物素結合至這樣的位點，然後以1∶4之比混合鏈親和素和生物素醯化的MHC而獲得。
更具體而言，MHC四聚體可以例如如下方式製備。為製備MHC，HLA-A2402分子重鏈和β2微球蛋白利用MHC表達的E.coli重組蛋白表達系統大量生產，並且純化。在HLA-A2402重鏈C端事先添加識別生物素連接酶的胺基酸序列。純化的HLA-A2402重鏈和β2微球蛋白分別溶解於8M尿素。向200ml重摺疊緩衝液(pH 8.0，100mMTris-HCl，400mM L-精氨酸-HCl，2mM EDTA，0.5mM氧化型穀胱苷肽，5mM還原型穀胱苷肽)，分別利用27號針的注射器，加入12mg具有SEQ ID NO1(RYQLDPKFI)所示胺基酸序列的本發明肽，18.6mgHLA-A2402重鏈，和13.2mgβ2微球蛋白。混合物於溫度維持在10℃的浴中攪拌48-72小時，以促進MHC形成。含有MHC的重摺疊緩衝液隨後於溫度維持在4℃的浴中對1.8L蒸餾水透析24小時，以及透析的重摺疊緩衝液利用Centriprep 10(Millipore Corporation，Bedford MA)濃縮至2ml。在分子量約45kD處被洗脫的MHC通過凝膠過濾層析，利用Superdex 200HR(Amersham Pharmacia Biotech AB，UppsalaSweden)而分離，從而得到所需的MHC四聚體。
為隨後製備生物素醯化的MHC，利用生物素連接酶(AVIDITY，LLC，Denver CO)，將生物素結合至HLA-A2402重鏈C端的特異位點。生物素結合的MHC通過凝膠過濾層析，利用Superdex 200HR而純化。
然後，PE-標記的鏈親和素(Molecular Probe，Eugene OR)和純化的生物素醯化的MHC以1∶4之摩爾比混合，以及在分子量約480kD處被洗脫的含有SEQ ID NO1(RYQLDPKFI)所示胺基酸序列的MHC四聚體通過凝膠過濾層析利用Superdex 200HR分離，通過Centricon10(Millipore Corporation)濃縮至約3mg/ml，並維持在4℃。諸如疊氮鈉，EDTA，亮抑酶肽，和抑肽素等防腐劑可加入其中。
在上述各製備步驟中，理想的是通過諸如凝膠過濾層析等公知的方法純化備用蛋白和肽。
本發明MHC可用作癌症疫苗。而且，其可用於製備上皮癌特異的CTL，以及用於定量人外周血中的這種CTL。
(VIII)癌症疫苗，CTL誘導劑和基因治療藥物癌症疫苗和CTL誘導劑本發明肽可有利地用作癌症疫苗的活性成分，以疫苗被動免疫治療。該癌症疫苗可用於具有HLA-A2402的人中。
即，給具有HLA-A2402作為白細胞抗原的癌症患者施用本發明肽誘導或激活特異性識別Ep-CAM的HLA-A2402-限制的CTL，由此使得治療或改善上皮癌等疾病成為可能。
由於癌症患者的CTL為一組識別兩種或更多種腫瘤抗原的細胞，因此利用多種表位肽作為癌症疫苗有時比利用單種表位肽具有更好效果。本發明肽可單獨或組合多種(兩種或更多種)利用。
含有本發明肽的Ep-CAM的mRNA表達在肺癌細胞系(QG56，LU99，LC99A，LC1-sq，LC65A和PC-9)，大腸癌細胞系，胃癌細胞系(MKN28，MKN45)，口腔癌細胞系(HSC-2)，乳腺癌細胞系，白血病細胞系(K562)等。Ep-CAM的表達也在來自肺癌，大腸癌，胃癌，乳腺癌或口腔癌患者的組織中觀察到。因此，本發明肽對治療或改善這種癌症是有益的。
本發明的肽，無論單獨還是與多種不同載體組合，可製成製劑。製劑可採用口服或腸胃外的形式。通常，腸胃外的形式是優選的。腸胃外製劑的例子包括皮下注射劑，肌內注射劑，靜脈內注射劑，栓劑等。
利用不會抑制本發明表位肽活性的可藥用賦形劑，可製備口服製劑。這種賦形劑的例子包括澱粉，甘露醇，乳糖，硬脂酸鎂，纖維素，聚合胺基酸，白蛋白等。
利用不會抑制本發明表位肽活性的可藥用載體，可製備腸胃外製劑。這種載體的例子包括水，氯化鈉，右旋葡萄糖，乙醇，甘油，DMSO等。如需要，腸胃外製劑可進一步含有白蛋白，潤溼劑，乳化劑等。為了刺激細胞介導的免疫性，表位肽優選與合適的佐劑組合使用。本發明肽可以天然或鹽形式使用。可藥用鹽的例子包括諸如鹽酸，磷酸等無機酸的鹽，以及諸如乙酸，酒石酸等有機酸的鹽。
通過與化合物、免疫識別肽的抗體等一起配製肽，可調節本發明肽的活性，所述化合物自身或與HLA-A2402相互作用增強肽被CTL的識別。
脈衝以本發明肽的抗原呈遞細胞和主要組織相容性抗原複合體，也可有利地用作癌症疫苗。這種疫苗的製劑形式，靶患者，靶癌症，效果等與含有本發明肽的癌症疫苗一樣。
治療方法本發明的肽，抗原呈遞細胞和主要組織相容性抗原複合體，當給藥於具有HLA-A2402作為白細胞抗原的人時，誘導或激活Ep-CAM-特異的HLA-A2402-限制的CTL，從而治療或改善上皮癌。
本發明肽的劑量隨肽被CTL識別程度而變化，並基於活性表位肽，成人每天可以例如，約0.01mg-約100mg，以及優選約0.1mg-約30mg。取決於給藥目的，劑量間隔可為患者個體合適地加以選擇。
或者，向患者血液循環導入單核細胞部分，可實現有效的癌症免疫接種，所述部分已分離自患者外周血，並與本發明肽一起培養以誘導和/或激活CTL。對培養條件，諸如單核細胞和本發明肽的濃度，加以選擇，使得成人給藥108-1010CTL/天。這種條件可由簡單測試方便確定。具有淋巴增殖能力的物質，諸如白介素-2，可在培養過程中加入。
抗原呈遞細胞的劑量對成人為例如，約106-109細胞/天，優選107-108細胞/天。而且，通過向患者血液循環導入分離自患者外周血的單核細胞部分與本發明抗原呈遞細胞的共培養物，可實現有效的癌症免疫接種。
主要組織相容性抗原複合體對成人為例如1-100mg/天，優選5-50mg/天。而且通過向患者血液循環導入分離自患者外周血的單核細胞部分與本發明主要組織相容性抗原複合體的共培養物，可實現有效的癌症免疫接種。
癌症的基因治療藥物本發明的多核苷酸(包括互補鏈)，作為例如肺癌，大腸癌，胃癌，乳腺癌，口腔癌等的基因治療藥物是有益的。
對癌症治療而言，含有本發明多核苷酸的載體可直接導入體內，或導入收集自人的細胞，所述細胞再返回至體內。載體不受限制，並可選自那些已知用於基因治療的載體，諸如逆轉錄病毒，腺病毒，牛痘病毒等，其中逆轉錄病毒是優選的。這種病毒是複製缺陷的。
本發明多核苷酸通過微注射技術可導入細胞，在所述技術中多核苷酸被封裝在脂質體中並轉移。
因此，本發明癌症基因治療藥物可為任何形式單獨的本發明多核苷酸，含有本發明多核苷酸的重組載體，使本發明多核苷酸封裝的脂質體等。
本發明多核苷酸的劑量隨由多核苷酸編碼的肽被CTL識別的程度而變化。例如，成人的合適劑量，基於編碼本發明表位肽的部分多核苷酸的量，約0.1μg-約100mg/天，優選約1μg-約50mg/天。這種劑量的給藥可每幾天一次至每數月一次。
本發明的多核苷酸可與細胞因子，諸如IL-2，或與本發明多核苷酸相互作用的物質組合使用，從而增強多核苷酸的表達。
(IX)胞毒T淋巴細胞利用下列(a)-(d)中的至少一種物質，通過刺激外周血淋巴細胞，可獲得本發明的胞毒T淋巴細胞(a)本發明的肽，(b)本發明的抗原呈遞細胞；(c)本發明的主要組織相容性抗原複合體，和(d)本發明的主要組織相容性抗原複合體四聚體。
本發明CTL的誘導方法是將外周血淋巴細胞與(a)-(d)中的至少一種物質一起在優選含有人血清的RPMI1640培養基中約37℃下培養約7-約14天。當外周血淋巴細胞被主要組織相容性抗原複合體(下文稱為「MHC」)或其四聚體刺激時，CTL被誘導並與MHC或四聚體組合。因此，通過合適的方法，CTL從MHC或四聚體中分離。
具體地，CTL可通過例如下列製備方法獲得。
當以表位肽或抗原呈遞細胞刺激時將分離自外周血的淋巴細胞與本發明肽或脈衝以該肽的抗原呈遞細胞一起在二氧化碳培養箱中約37℃下培養約7-約10天。然後，優選在加入IL-2，PHA，抗-CD3抗體等後，溫育約7-約14天，從而刺激和增殖CTL。
以所述肽或抗原呈遞細胞刺激，任選接著以IL-2等刺激，實施約3次，從而獲得所需數目的CTL。
如此獲得的上皮癌特異的CTL例如可以在含有人血清的PBS等中的懸浮液形式，作為上皮癌等的被動免疫治療藥物使用。被動免疫治療藥物的形式通常為注射劑，諸如肌內注射劑，皮下注射劑，靜脈內灌輸液等。
當以MHC或其四聚體刺激時染色分離將淋巴細胞從外周血等中分離，並與合適濃度的MHC或MHC四聚體在例如PBS中約4-約25℃下反應約30-約60分鐘。標記染料，諸如FITC或PE，加入反應混合物中，以使結合到MHC或MHC四聚體的CTL染色。隨後，染色的CTL利用流式細胞儀或顯微鏡分離。
通過MHC固定分離利用其表面固定有MHC或MHC四聚體的無菌板，將分離自外周血的淋巴細胞與板中固定的MHC或MHC四聚體在約4-約25℃下反應約30-約60分鐘。清洗掉其他未結合和漂浮的細胞後，板上遺留的上皮癌特異的CTL懸浮在新培養基中。如此分離的上皮癌特異的CTL可以T細胞刺激劑，諸如抗-CD3抗體，PHA，IL-2等刺激，從而使CTL增殖至被動免疫治療藥物應用所需的數目。
磁珠的使用如上所述製備的生物素醯化的MHC結合至鏈親和素標記的磁珠，以製備結合物(下文稱為「MHC-磁珠」)。隨後，淋巴細胞從外周血等中分離，並以合適的濃度添加MHC-磁珠，使得淋巴細胞∶珠之比成1∶5-20，接著反應。
當含有結合至MHC-磁珠的上皮癌特異的CTL的測試管置於磁場中時，與珠結合的CTL被吸附至測試管內壁的磁力一側。
由於與所述珠結合的CTL被附著至測試管內壁，其他細胞被衝洗掉。其後，測試管從磁場移出，測試管中剩餘的抗原特異的CTL懸浮在新培養基中。
如此分離的上皮癌特異的CTL可以T淋巴細胞刺激劑，諸如抗-CD3抗體，PHA，IL-2等刺激，從而使CTL增殖至被動免疫治療藥物應用所需的數目。
治療或改善癌症的方法本發明的CTL，當其作為被動免疫治療藥物給藥至上皮癌患者時，可治療或改善癌症。
劑量取決於給藥目的隨患者而變化。例如，成人的合適劑量約107-約1011細胞/天，優選約108-約1010細胞/天。這種劑量的給藥可每幾天一次至每數月一次。
(X)定量CTL的方法在癌症治療管理中，包括適當使用抗癌藥和化療藥，重要的是知曉，上皮癌特異的CTL是否存在於高風險癌症患者(由癌細胞或癌組織引起的免疫性降低的患者，併發症患者，老年患者，嬰兒患者，孕婦患者)的外周血中。上皮癌特異的HLA-A2402-限制的CTL可通過下列方法定量。
方法包括使下列(a)-(d)中任一物質作用於外周血樣品，以及定量樣品中的CTL或由此產生的細胞因子的步驟(a)本發明肽，(b)本發明抗原呈遞細胞，(c)本發明MHC，和(d)本發明MHC四聚體。
將所得值與通過相同方法(除使用含有已知濃度的HLA-A2402-限制的CTL的溶液以外)定量的值進行比較，從而計算外周血樣品中HLA-A2402-限制的CTL濃度。
由一種或多種(a)-(d)物質誘導的HLA-A2402-限制的CTL，或由此CTL生產的細胞因子，例如可定量測定如下。
當使用表位肽時將分離自外周血的淋巴細胞以本發明肽刺激，並測量誘導的CTL的數或由此CTL產生的諸如幹擾素-γ(IFN-γ)，白介素等細胞因子(包括趨化因子)的量。具體方法描述如下，以IFN-γ的情形為例。
胞內IFN-γ生產細胞的定量將分離自外周血的淋巴細胞以細胞濃度2×106/ml懸浮在含有10％人血清的RPMI1640培養基，並以濃度1mg/ml加入本發明的CTL表位肽。此外，加入胞內蛋白轉運抑制劑，諸如布雷菲爾德菌素A，接著在二氧化碳培養箱中37℃下培養5-6小時。培養後，細胞固定，進行膜滲透處理，並與螢光標記的抗-IFN-γ抗體反應。利用流式細胞儀等對CD8陽性淋巴細胞中的IFN-γ陽性細胞進行定量測定。
CD8陽性細胞的定量標記的CD8陽性細胞可按照上述定量胞內IFN-γ生產細胞的方法(除利用抗-CD8抗體代替螢光-標記的抗IFN-γ抗體之外)定量。
細胞因子的定量(ELISPOT分析)96孔MultiScreen-HA板(Millipore)在4℃下以抗-IFN-γ單克隆抗體包被過夜。以PBS洗滌孔之後，將分離自外周血的淋巴細胞接種至孔中。表位肽置於孔內，並在5％CO2培養箱中37℃下培養20小時。次日，板以含有0.05％Tween-20的PBS洗滌，並在室溫下與抗-IFN-γ兔血清反應90分鐘，然後與過氧化酶標記的抗兔IgG山羊血清反應90分鐘。此外，將含有3-氨基-9-乙基咔唑(Sigma)和0.015％過氧化氫溶液的0.1M乙酸鈉緩衝液(pH 5.0)置於孔中，並在室溫下反應40分鐘。IFN-γ點可視化並以立體顯微鏡計數。
定量分泌在培養物上清液中的細胞因子的方法將分離自外周血的淋巴細胞以細胞濃度2×106個細胞/ml懸浮在含有10％人血清的RPMI1640培養基，並以濃度1μg/ml加入本發明的CTL表位肽。在二氧化碳培養箱中37℃下培養24-48小時。培養後，收集上清液，並利用可商購的ELISA試劑盒(例如，ENDOGEN的人IFN-γELISA)測量上清液中IFN-γ的濃度。
當使用MHC四聚體時淋巴細胞從外周血等中分離，並與濃度為1-100μg/ml的MHC四聚體(螢光標記有鏈親和素)在37℃下反應15分鐘。與MHC結合的CTL通過添加抗體而染色，所述抗體結合至與MHC結合的CTL，並標記有另一螢光染料。利用流式細胞儀或顯微鏡，對染色的CTL計數。
實施例下文，參照實施例，將更詳細描述本發明，但本發明並不局限於實施例1
1)捐贈者和細胞系所有捐贈者完全知曉由Aichi癌症中心道德委員會批准的研究計劃及其目的。測試用的外周血樣品獲自5位知情同意後的HLA-A2402陽性健康捐贈者。從獲自各捐贈者的外周血樣品，通過Ficoll密度梯度離心，分離出外周血單核細胞(PBMC)。
大細胞癌細胞系LU99(JCRB0080)作為人肺癌細胞系；人表皮狀癌細胞系HSC-2(JCRB0622)；表皮狀癌細胞系MKN28(JCRB0253)和MKN45(JCRB0254)作為人胃癌細胞系；以及表皮狀癌細胞系COLO320DM(JCRB0225或ATCCCCL-220)作為人直腸癌細胞系購自JCRB細胞庫(Ministry of Health，Labour and Welfarehttp//Cellbank.nihs.go.jp)。表皮狀癌細胞系LC-1/sq(RCB0455)作為人肺癌細胞系購自Riken細胞庫。
LC/sq細胞維持在45％RPMI1640培養基和45％Ham氏F12培養基(Sigma產品)中，所述培養基通過加入液體營養補充物而製備，所述營養補充物包括10％FCS，L-穀氨醯胺，青黴素，鏈黴素，和卡那黴素。COLO320DM細胞和MKN28維持在DMEM培養基(Sigma產品)中。K562細胞維持在IMDM培養基(Sigma產品)中，所述培養基通過添加液體營養補充物而製備，所述補充物包括10％FCS(胎牛血清，LifeTechnology產品)，L-穀氨醯胺，青黴素，鏈黴素和卡那黴素。
將其他癌細胞系培養在RPMI1640培養基中，所述培養基通過添加液體營養補充物而製備，所述補充物包括10％FCS，2×10-3M L-穀氨醯胺，100U/ml青黴素，100μg/ml鏈黴素，100μg/ml卡那黴素，和5×10-5Mβ-巰基乙醇(作為完全培養基)。
HLA-A2402基因導入174CEM.T2(下文稱作「T2細胞」)，給出呈遞HLA-A2402結合肽的細胞(下文稱作「T2-24細胞」)作為肽呈遞細胞。T2-24細胞培養在含有10％胎牛血清，L-穀氨醯胺，青黴素，鏈黴素和G418(Gibco產品)的IMDM培養基(Iscove氏修改的Dulbecco氏培養基Gibco產品)中。
依據「組織抗原」(Tissue Antigens，59502-511，(2002))中所述的方法，HLA-A2402-陰性QG56細胞系和HLA-A2402-陰性A549(JCRB0076)細胞系以編碼HLA-A2402的逆轉錄病毒感染。為了檢測感染的細胞，將感染的QG56細胞維持在含有終濃度為0.6μg/ml的嘌呤黴素的完全培養基中，並命名為QG56-A24。同樣，感染的A549細胞維持在含有終濃度為0.9μg/ml的嘌呤黴素的完全培養基中，並命名為A549-A24。
2)肽合成在Ep-CAM(登錄號M33011)內潛在的HLA-A2402-結合的肽通過計算機預測，基於從環球網生物信息學分子分析部分(BIMASBioInformatics and Molecular AnalysisSection)(htt://bimas.dcrt.gov/molbio/hla_bind)可獲得的HLA肽複合體預計的半數時間解離，根據HLA肽結合預測計劃(HLA Peptide BindingPrediction Program)，而得以鑑定。
基於Ep-CAM表位肽預測結果選擇的7種肽由PepSet(Mimotope產品)合成。如果需要，將所得肽溶解於100μl二甲基亞碸中，並進一步以40％乙腈稀釋至0.1M(pH 7.4)。
各肽的生產量預估為1μmol。
7種合成肽分別命名為Ep31，Ep173，Ep185，Ep250，Ep225，Ep296，和Ep304。表1示出Ep-CAM的合成肽序列。
表1

備註a從HLA-A24分子解離的預計半數時間(分鐘)，通過訪問環球網生物信息學分子分析部分(BIMAS)HLA肽結合預測而獲得。
b基於MHC穩定性分析，評估合成肽對HLA-A24分子的結合活性。％MFI表示平均螢光強度。
另外，人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)包膜肽RYLRDQQLL(命名為ENV584，J.Immunol，1596242-6252，1997殘基584-592)和EBV潛在膜蛋白2肽(EBV潛在膜)(命名為EBV-LMP419，J.Immunol，1583325-3334，1997殘基419-427)合成用作對照(Toray Industriesresearch center company)。
3)細胞染色和流式細胞儀分析利用表達在細胞表面上的抗HLA-A2402單克隆抗體(One Lambda公司產品)和FITC標記的抗小鼠IgG(ab』)2片段(Immunotech產品)，通過間接免疫螢光抗體分析進行測試。根據「Blood，981872-1881，2001，Science，27494-96，1996」中所述步驟，製備MHC/肽四聚體。
CD8陽性T細胞系或其克隆以含有Ep-CAM肽和Ep173的藻紅蛋白(PE)-標記的HLA-A2402四聚體(稱作HLA-A2402/Ep173四聚體)，或含有HIV-1肽和ENV584的PE標記的HLA-A2402四聚體(稱作HLA-A2402/ENV584四聚體)染色。
利用FACSCalibur(Becton，Dickinson and Company產品)對染色的細胞進行流式細胞儀分析，並通過CellQuest軟體(Becton，Dickinson andCompany產品)分析數據。
MHC穩定性分析為評估合成肽的HLA-A2402結合效率，根據Kuzushima等的步驟(Blood，981872-1881，2001)，利用T2-A24細胞(其為表達HLA-A2402分子的質粒被轉染至T2[174×CEM.T2ATCC登錄號CRL-1992]的細胞系)進行MHC穩定性分析。
具體而言，將濃度為10μM的各個肽在200μl含有T2-A24細胞(2×105個細胞)、0.1％FCS和5×10-5Mβ-巰基乙醇的RPMI1640培養基中26℃下溫育16小時，接著在37℃下繼續溫育3小時。溫育後，細胞表面HLA-A2402分子以上述3)中的抗HLA-A2402單克隆抗體和FITC標記的抗體染色。通過FACSCalibur確定表達水平，並記錄平均螢光強度(MFI)。
％MFI增加由下列公式計算％MFI增加＝100×(以肽給藥的組的MFI-未以肽給藥的組的MFI)/(未以肽給藥的組的MFI)表1示出有關％MFI水平增加的結果。如表1所示，細胞表面上的HLA-A2402表達水平對大多數肽是增加的，表明這些肽結合至細胞表面，由此使MHC穩定。
特別是，在上述肽中，Ep173(RYQLDPKFI)對HLA-A2402顯示最高的親合力。Ep304(EMGEMHREL)由於顯示最低的親合力不繼續其他試驗。
5)Ep-CAM肽特異的CTL及其克隆的生產根據Dauer等的步驟(J.Immunol，1704069-4076)生產外周血單核細胞衍生的樹突細胞(DC)。
更具體而言，附著至塑料的細胞從HLA-A2402陽性健康志願者的外周血單核細胞中分離出來，並培養於含有5％熱滅活人血血清，10μg/ml重組人白介素-4(hIL-4，RD systems Company產品)和50ng/ml重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(hGM-CSF，RD systemsCompany產品)的RPMI1640培養基。溫育1天之後，為了細胞生長，加入50ng/ml IL-1β(PeproTech，Inc產品)，50ng/ml重組人腫瘤壞死因子-α(hTNF-αPeproTech Inc產品)和1μM前列腺素E2(CaymanChemical Company產品)。2或3天過後，收集細胞用於呈遞抗原的單核細胞衍生的樹突細胞。
生產的細胞明顯表達樹突細胞介導的抗原，諸如CD1a，CD80，CD83，CD86，和HLA II型分子。
此外，利用CD8微珠(Milteny Biotec產品)，從相同捐獻者中分離出CD8陽性T淋巴細胞。
隨後，自衍生的樹突細胞室溫下脈衝以各個Ep-CAM合成肽2-4小時，該肽在含有5×10-5M β-巰基乙醇的AIM-V培養基(Gibco產品)中濃度為10μM，接著輻射(33Gy)。
然後，樹突細胞(1×105細胞)與CD8陽性T淋巴細胞(1×106淋巴細胞)共培育在含有10％人血血清，25ng/ml重組人IL-7(RD systemscomapany產品)，和5ng/ml重組人IL-12(RD systems company產品)的RPMI1640培養基的培養管中。
培育7天之後，加入1×105個上述製備的肽脈衝的自衍生的樹突細胞，來刺激細胞。繼續培育7天之後，以相同步驟刺激細胞3次。每次再刺激後，加入人重組IL-2(Takeda Pharmaceutical Company，Ltd.產品)給出終濃度20u/ml。如需要，活性增殖細胞分成2或3個管，並培養在含有20u/ml IL-2的新鮮培養基中。
T-細胞特異性通過ELISPOT分析進行檢查。
為建立T-細胞克隆，根據Blood，981872-1881，2001中所述的方法，對多克隆CTL進行有限稀釋。更具體而言，將多克隆CD8陽性T-細胞接種在96孔環形板(1，3，10個細胞/孔)，板中含有培養基(0.2ml)以及抗-CD3單克隆抗體(30ng/ml)(Orth Diagnostic Inc.產品)，IL-2(50u/ml)，1×105個γ-輻射(33Gy)的PBMC細胞，和2×104個被EBV轉化的γ-輻射(55Gy)的B淋巴母細胞(以95.8-細胞(JCRB9123)上清液轉化志願者的外周血B淋巴細胞而獲得的細胞)。
溫育兩周之後，增殖的細胞的特異性以與Lee等方法(J.Immunol，1583325-3334，1997)的同樣方式，通過CTL-CTL-殺傷分析確定。
CTL克隆僅在以終濃度為2μM含有同樣起源衍生自Ep-CAM的肽或對照肽ENV584的100μl完全培養基或96孔環形板(300細胞/孔)中溫育過夜。
CTL細胞的細胞殺傷能力利用倒置顯微鏡在次日確定。將這些僅在脈衝以Ep-CAM時顯示細胞-殺傷能力的克隆移至燒瓶，並如上所述增殖。
6)IFN-γ的ELISPOT分析具有硝酸纖維素膜的平底96孔MultiScreen-HA板(Millipore Corp.產品)包被以10μg/ml抗-IFN-γ單克隆抗體(RD systems company產品)，並在4℃下溫育過夜。以PBS(磷酸鹽緩衝液)洗滌後，該板以培養基在37℃下封閉1小時。在各個板孔中，T2-A24細胞(5×104細胞)在100μl含有0.1％FCS和5×105Mβ-巰基乙醇的RPMI1640培養基中室溫下脈衝以各個表位候選合成肽30分鐘。將1×105個懸浮在含有20％FCS的培養基中的CD8-陽性T細胞接種至各孔中。
當有太多點計數時，1×104CD8陽性T細胞用於對細胞作出反應。整個測量方法一式兩份進行。
板在5％CO2培養箱中37℃下溫育20小時，並充分洗滌以含有0.05％Tween 20的PBS。隨後，向各個孔中加入多克隆兔抗-IFN-γ抗體(Genzyme產品)，室溫下放置90分鐘，然後繼續暴露於過氧化酶-結合的山羊抗兔抗免疫球蛋白G(Genzyme產品)90分鐘。為了顯色IFN-γ特異點，向各孔中加入含有3-氨基-9-乙基咔唑(Sigma產品)和0.015％過氧化氫溶液的0.1M乙酸鈉緩衝液(pH 5.0)。40分鐘後，以水洗滌終止反應，並使板乾燥。擴散的大點數在顯微鏡下計數。
結果示於圖1和2。
圖1顯示當5位HLA-A2402陽性健康捐贈者的CD8陽性T-細胞由被6種肽中的一種脈衝的自-衍生的樹突細胞刺激時多克隆肽-激活的胞毒淋巴細胞系的ELISOT分析評價結果。
正如圖1所見，當5位HLA-A2402陽性健康捐贈者的CD8陽性T-細胞由被6種肽中的一種脈衝的自-衍生的樹突細胞刺激時，從4位捐贈者獲得的T-細胞系通過與被Ep173脈衝的T2-A24細胞溫育顯示主要產生IFN-γ點。
CTL系經歷獲自3號捐贈者的Ep250刺激，通過與Ep250溫育，特異性生產IFN-γ點。
圖2顯示Ep-CAM肽特異的多克隆和單克隆CTL的四聚體染色結果。
圖2A顯示，以Ep173刺激四次的多克隆CD8陽性T細胞用FITC-標記的抗-CD8抗體，含有Ep173的PE-標記的HLA-A24四聚體，或對照肽ENV584染色，並通過流式細胞儀分析。四聚體陽性細胞在總CD8陽性T-細胞中的比例以右上部的百分比顯示。
如圖2A所示，在大多數對照肽ENV584中，沒有觀察到IFN-γ點形成。四次刺激後，從4號捐贈者建立的CTL系以HLA-A24/Ep173四聚體而非以HLA-A24/ENV584四聚體特異性染色(相對總CD8陽性T-細胞，37.2％∶0.06％，圖2A)。
圖2B顯示，Ep173-特異的CTL克隆(C27)，以上述同樣方式染色。四聚體陽性細胞在CD8陽性T-細胞中的比例以右上部的百分比顯示。
如圖2B所示，四聚體陽性細胞的強度在對數上等同於或高於四聚體陰性細胞2-至3-倍。本發明人從4號捐贈者的Ep173特異性多克隆CTL系的有限稀釋培養基中建立T細胞克隆C27。
利用四聚體的該研究顯示，多克隆和單克隆Ep173-特異的CD8陽性T細胞皆具有特異於HLA-A2402/Ep173複合體的高親和性細胞受體。
因此，Ep173-特異的CTL克隆從該CTL系中建立。
實施例2肽Ep173特異的CTL克隆的性質，部分17)CTL分析本發明人進一步檢查在HLA-A24情形下，C27是否識別自發呈遞在腫瘤細胞表面上的肽。
Cr-標記的細胞在加入C27之前與特異於總HLA I型，HLA-A24或HLA-A2中的任一種的單克隆抗體溫育，並以效應子與靶之比為10進行CTL分析。
靶細胞(PC9細胞)在100μl培養基中37℃下以鎘(51Cr)標記1小時。在有些實驗中，為了指定HLA限制，在加入效應細胞之前30分鐘，向各孔加入預定量的封閉抗體W6/32(抗-HLA I型)，MA2.1(抗-HLA-A2)，和A11.1(抗-HLA-A24)。
板在37℃下溫育4小時，並利用γ-計數儀對上清液計數。
51Cr釋放％的計算公式為100×(實驗釋放—自發釋放)/(最大釋放—自發釋放)結果示於圖3和5。
圖3A顯示，在效應子與靶之比為1時，通過51Cr釋放分析確定的C27(Ep173-特異性CTL克隆)抗T2-A24在各指定濃度的肽Ep173和對照肽EBV-LMP419處的胞毒性。
結果，Ep173-特異的CTL克隆(C27)證實針對脈衝以低肽濃度100pM的Ep173的T2-A24細胞的胞毒性，而這種胞毒性利用EBV-LMP419(對照肽)並未被觀察到。
圖5和表2顯示C27針對多種不同癌細胞系的胞毒性的評價結果。
表2

備註a利用HLA-A24mAb和FITC標記的抗小鼠IgG抗體F(ab』)2片段，通過免疫螢光，評價平均螢光強度。
b未做圖2顯示C27(Ep173-特異的CTL克隆)對8種HLA-A24陽性癌細胞系和HLA-A24陰性細胞系作為靶細胞的胞毒性的評價結果。
所有細胞系表達Ep-CAM，除肺腺癌細胞系11-18，COLO320DM和A549以外。HLA-A2402基因如逆轉錄病毒被轉化至A549和QG56，命名為A549-A24和QG56-A24的轉化體也用作靶細胞。通過51Cr釋放分析，在各效應子∶靶之比(40∶1，20∶1，10∶1，5∶1)處，詳細說明胞毒性。K562為敏感於天然殺傷細胞的典型細胞系。
如圖5和表2所示，C27有效地施加毒性至肺癌細胞系PC9，LU99，LC-1/sq和LC99A；口腔鱗狀癌細胞系HSC-2；和既表達HLA-A24又表達Ep-CAM的胃癌細胞系MKN45。然而，C27未表明針對HLA-A24陽性Ep-CAM陰性細胞系(A549-A24和COLO320DM)，或HLA-A24陰性和Ep-CAM陽性細胞系，或Ep-CAM陰性細胞系(OG56，A549，MKN28)的毒性。當HLA-A2402基因導入HLA-A24陰性QG56細胞系(QG56-A24)時，C27殺傷靶細胞。對K562的細胞毒性是低的。
這些數據表明，Ep173-特異的CTL殺傷既表達HLA-A24又表達Ep-CAM的腫瘤細胞。
圖3B顯示抗-HLA-A24單克隆抗體對Ep173-特異的CTL克隆(C27)抗HLA-A2402陽性細胞系(PC9)的胞毒性的抑制作用。
C27對肺癌細胞系(HLA-A24陽性Ep-CAM陽性肺癌細胞系)PC9的胞毒性被特異於HLA-A24或I型分子(W6/32)的單克隆抗體封閉，但不被抗-HLA-A2單克隆抗體封閉。
8)冷靶抑制分析根據Arai等方法(Blood，972903-2907，2001)進行冷靶抑制分析。
T2-A24細胞與終濃度為1×105M的表位肽Ep173或EBV-LMP419溫育1小時。
數次洗滌後，所得物與2×104效應細胞溫育1小時，以生成肽脈衝的T2-A24細胞與靶細胞之比為40∶1，20∶1，10∶1，和5∶1。2×103個51Cr-標記的PC9細胞系添加至各孔中。
胞毒性的確定如上述第7項有關CTL分析中所述。
圖3C顯示冷靶抑制分析結果。
在圖3C中，橫坐標表示脈衝以Ep173(●)或對照EBV-LMP419(■)肽的T2-A24細胞(冷)與鎘標記的PC9細胞(熱)之數目比。縱坐標以百分比表示C27針對PC9的胞毒性。空心圓顯示沒有冷靶的胞毒性。
結果，針對PC9的C27-介導的胞毒性受到Ep173-脈衝的T2-A24細胞的特異性抑制，但未受到非相關肽的抑制。
因此，針對PC9的C27-介導的胞毒性被抗-HLA-A24單克隆抗體或Ep173-脈衝的冷靶細胞封閉。於是表明，CTL克隆對自發呈遞在腫瘤細胞表面上的Ep173具有優良的特異性。
實施例3肽Ep173特異的CTL克隆的性質，部分29)RT-PCR利用GenElute mRNA Miniprep試劑盒(Sigma產品)，從培育的細胞系中抽提全部RNA。基因特異的寡核苷酸引物通過Proligo(ProligoJapan產品)合成，用於Ep-CAM mRNA表達的評價。RT-PCR所用引物如下正向引物ATGGCGCCCCCGCAGGTCCT(SEQ ID NO8)反向引物TTATGCATTGAGTTCCCTATGCATCTCACC(SEQ IDNO9)
利用熱循環儀(Perkin-Elmer產品)，進行RT-PCR，PCR產物通過1.5％凝膠電泳和溴化乙錠顯色而分析。
PCR採用1次循環的94℃、5分鐘，30次循環的94℃、30秒，58℃、30秒和72℃、1分鐘，以及1次循環的72℃、7分鐘。
10)蛋白質印跡分析根據稍有修改的Schwartz等(J.Immunol，165768-778，2000)的步驟進行蛋白質印跡分析。更具體而言，細胞溶解於緩衝液(50mM Tris/鹽酸，pH 7.5，5mM氯化鎂，1mM EDTA，0.5％triton X-100，10μM亮抑酶肽，2.8μM抑胃酶肽，和0.85mM苯甲磺醯氟)中4℃下30分鐘。為了確定蛋白濃度，溶解的細胞上清液在280/260nm波長處定量測定。130μg的蛋白進一步添加至12％SDS-PAGE。蛋白被印跡在Immobilon-P膜(Millipore產品)上，並在4℃與含有100％低脂肪幹奶粉和0.1％Tween 20的PBS封閉過夜。
利用Ep-CAM特異的單克隆抗體(LabVision產品)進行檢索，並利用過氧化物酶-結合的山羊抗小鼠IgG(Zymed產品)進行檢測。
利用ECL蛋白質印跡檢測系統(Amersham bio-science company產品)使蛋白顯色。
圖4顯示通過RT-PCR和蛋白質印跡分析，癌細胞系表達Ep-CAM的檢查結果。
15種癌細胞系中有12種(80％)明顯表達Ep-CAM。HLA-A24的表達利用抗-HLA-A24單克隆抗體通過間接免疫螢光測試而檢查。在檢查的15種癌細胞系中有10種細胞系顯示陽性HLA-A24表達。
正如上述實施例所示，本發明人已獲得了衍生自Ep-CAM的新型HLA-A2402-限制的表位。至少表位肽Ep173(RYQLDPKFI；SEQ IDNO1)能夠誘導CTL(包括特異於HLA-A2402/肽複合體的高親和性T-細胞受體)，由此，利用該肽免疫治療是可預期的。
工業實用性本發明的肽可合適的用作寬範圍的含有HLA-A2402的人癌的癌症疫苗。
序列表110大塚製藥株式會社(Otsuka Pharmaceutical Co.，Ltd.)愛知縣(Aichi Prefecture)120由HLA-A2402-限制的Ep-CAM-特異的CTL識別的表位/肽及其應用(epitope peptidewhich is recognized by HLA-A2402-restricted and Ep-CAM-specific CTL)130SCT063152-47150JP 2004-117521512004-01-2016011170PatentIn version 3.121012119212PRT213Artificial sequence220
223Ep-CAM epitope peptide candidate being capable of inducingHLA-A2402-restricted CTL4001Arg Tyr Gln Leu Asp Pro Lys Phe Ile1 5210221110212PRT213Artificial sequence220
223Ep-CAM epitope peptide candidate being capable of inducingHLA-A2402-restricted CTL4002Tyr Tyr Val Asp Glu Lys Ala Pro Glu Phe1 5 102103
2119212PRT213Artificial sequence220
223Ep-CAM epitope peptide candidate being capable of inducingHLA-A2402-restricted CTL4003Asn Tyr Lys Leu Ala Val Asn Cys Phe1 521042119212PRT213Artificial sequence220
223Ep-CAM epitope peptide candidate being capable of inducingHLA-A2402-restricted CTL4004Leu Tyr Glu Asn Asn Val Ile Thr Ile1 521052119212PRT213Artificial sequence220
223Ep-CAM epitope peptide candidate being capable of inducingHLA-A2402-restricted CTL4005Leu Phe His Ser Lys Lys Met Asp Leu1 5210621110212PRT
213Artificial sequence220
223Ep-CAM epitope peptide candidate being capable of inducingHLA-A2402-restricted CTL4006Lys Tyr Glu Lys Ala Glu Ile Lys Glu Met1 5 1021072119212PRT213Artificial sequence220
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223Ep-CAM epitope peptide candidate being capable of inducingHLA-A0201-restricted CTL40012Tyr Gln Leu Asp Pro Lys Phe Ile Thr Ser Ile1 5 10
權利要求
1.下列(1)-(4)任一項的肽(1)基本上由SEQ ID NO1所示的胺基酸序列組成的肽；(2)基本上由SEQ ID NO2所示的胺基酸序列組成的肽；(3)基本上由通過添加，缺失或替換一個或多個胺基酸而衍生自SEQ ID NO1所示胺基酸序列的胺基酸序列組成的突變肽，所述肽能夠與HLA-A2402分子形成複合體而被HLA-A2402-限制的胞毒T淋巴細胞識別或誘導這種淋巴細胞；(4)基本上由通過添加，缺失或替換一個或多個胺基酸而衍生自SEQ ID NO2所示胺基酸序列的胺基酸序列組成的突變肽，所述肽能夠與HLA-A2402分子形成複合體而被HLA-A2402-限制的胞毒T淋巴細胞識別或誘導這種淋巴細胞。
2.下列(1)或(2)的肽(1)基本上由SEQ ID NO1所示胺基酸序列組成的肽；(2)基本上由SEQ ID NO2所示胺基酸序列組成的肽。
3.包含權利要求1或2的肽作為活性成分的癌症疫苗。
4.權利要求3的癌症疫苗，其中癌症為上皮癌。
5.權利要求3或4的癌症疫苗，其中癌症選自大腸癌，肺癌，乳腺癌，胃癌，口腔癌，胰腺癌，食道癌，鼻咽癌，子宮癌，前列腺癌，和膽囊癌。
6.權利要求3-5任一項的癌症疫苗，其用於治療具有HLA-A2402作為白細胞抗原的人。
7.包含權利要求1或2的肽作為活性成分的胞毒T淋巴細胞誘導劑。
8.權利要求7的胞毒T淋巴細胞誘導劑，其用於治療具有HLA-A2402作為白細胞抗原的人。
9.下列(5)-(8)任一項的多核苷酸(5)基本上由SEQ ID NO10所示鹼基序列組成的多核苷酸；(6)基本上由SEQ ID NO11所示鹼基序列組成的多核苷酸；(7)在嚴格條件下與由SEQ ID NO10所示鹼基序列組成的多核苷酸雜交的突變多核苷酸，其編碼的肽能夠與HLA-A2402分子形成複合體而被HLA-A2402-限制的胞毒T淋巴細胞識別或誘導這種淋巴細胞；(8)在嚴格條件下與由SEQ ID NO11所示鹼基序列組成的多核苷酸雜交的突變多核苷酸，其編碼的肽能夠與HLA-A2402分子形成複合體而被HLA-A2402-限制的胞毒T淋巴細胞識別或誘導這種淋巴細胞。
10.上皮癌的基因治療藥物，包含權利要求9的多核苷酸作為活性成分。
11.重組載體，包含權利要求9的多核苷酸。
12.轉化體，其中導入權利要求11的重組載體。
13.權利要求1或2的肽的製備方法，包括培育權利要求12的轉化體，以及從培養物中收集權利要求1或2的肽的步驟。
14.抗原呈遞細胞，其脈衝以權利要求1或2的肽。
15.癌症疫苗，包含權利要求14的抗原呈遞細胞作為活性成分。
16.權利要求15的癌症疫苗，其中癌症為上皮癌。
17.權利要求15或16的癌症疫苗，其中癌症選自大腸癌，肺癌，乳腺癌，胃癌，口腔癌，胰腺癌，食道癌，鼻咽癌，子宮癌，前列腺癌，和膽囊癌。
18.權利要求15-17任一項的癌症疫苗，其用於治療具有HLA-A2402作為白細胞抗原的人。
19.胞毒T淋巴細胞誘導劑，包括權利要求14的抗原呈遞細胞作為活性成分。
20.權利要求19的胞毒T淋巴細胞誘導劑，其用於治療具有HLA-A2402作為白細胞抗原的人。
21.主要組織相容性抗原複合體，包含主要組織相容性抗原，和權利要求1或2的肽，或者存在於權利要求14的抗原呈遞細胞上的腫瘤抗原表位肽。
22.權利要求21的主要組織相容性抗原複合體，包括HLA-A2402分子，β2-微球蛋白，和權利要求1或2的肽，或者存在於權利要求14的抗原呈遞細胞上的腫瘤抗原表位肽。
23.癌症疫苗，包括權利要求21或22的主要組織相容性抗原複合體作為活性成分。
24.權利要求23的癌症疫苗，其中癌症為上皮癌。
25.權利要求23或24的癌症疫苗，其中癌症選自大腸癌，肺癌，乳腺癌，胃癌，口腔癌，胰腺癌，食道癌，鼻咽癌，子宮癌，前列腺癌，和膽囊癌。
26.權利要求23-25任一項的癌症疫苗，其用於治療具有HLA-A2402作為白細胞抗原的人。
27.胞毒T淋巴細胞誘導劑，包括權利要求21或22的主要組織相容性抗原複合體作為活性成分。
28.權利要求27的胞毒T淋巴細胞誘導劑，其用於治療具有HLA-A2402作為白細胞抗原的人。
29.主要組織相容性抗原複合體四聚體，包括主要組織相容性抗原，和權利要求1或2的肽，或者存在於權利要求14的抗原呈遞細胞上的腫瘤抗原表位肽。
30.利用一種或多種下列(a)-(d)物質，通過刺激外周血淋巴細胞獲得的胞毒T淋巴細胞(a)權利要求1或2的肽；(b)權利要求14的抗原呈遞細胞；(c)權利要求21或22的主要組織相容性抗原複合體；(d)權利要求29的主要組織相容性抗原複合體四聚體。
31.權利要求30的胞毒T淋巴細胞，其是通過下列步驟獲得的利用權利要求30限定的一種或多種(a)-(d)物質，通過刺激外周血淋巴細胞，在主要組織相容性抗原複合體和/或其四聚體與胞毒T淋巴細胞之間形成複合體，並從複合體中分離胞毒T淋巴細胞。
32.被動免疫治療藥物，包括權利要求30或31的胞毒T淋巴細胞作為活性成分。
33.權利要求32的被動免疫治療藥物，其中癌症為上皮癌。
34.權利要求32或33的被動免疫治療藥物，其中癌症選自大腸癌，肺癌，乳腺癌，胃癌，口腔癌，胰腺癌，食道癌，鼻咽癌，子宮癌，前列腺癌，和膽囊癌。
35.權利要求32-34任一項的被動免疫治療藥物，其用於治療具有HLA-A2402作為白細胞抗原的人。
36.定量外周血中HLA-A2402-限制的胞毒T淋巴細胞的方法，其包括下列步驟使一種或多種下列(a)-(d)物質作用於外周血(a)權利要求1或2的肽；(b)權利要求14的抗原呈遞細胞；(c)權利要求21或22的主要組織相容性抗原複合體；(d)權利要求29的主要組織相容性抗原複合體四聚體，以及定量外周血中的胞毒T淋巴細胞或者由這樣的胞毒淋巴細胞產生的細胞因子。
37.癌症治療和/或改善方法，包括給具有HLA-A2402作為白細胞抗原的人施用一種或多種下列(a)-(d)物質(a)權利要求1或2的肽；(b)權利要求14的抗原呈遞細胞；(c)權利要求21或22的主要組織相容性抗原複合體；(d)權利要求29的主要組織相容性抗原複合體四聚體。
38.癌症治療和/或改善方法，包括下列步驟從具有HLA-A2402作為白細胞抗原的人患者的外周血中收集單核細胞部分，採用一種或多種下列(a)-(d)物質培養單核細胞部分(a)權利要求1或2的肽；(b)權利要求14的抗原呈遞細胞；(c)權利要求21或22的主要組織相容性抗原複合體；(d)權利要求29的主要組織相容性抗原複合體四聚體，以及將其中的胞毒T淋巴細胞被誘導和/或激活的單核細胞部分返回至患者血液。
39.誘導胞毒T淋巴細胞的方法，包括給具有HLA-A2402作為白細胞抗原的人施用一種或多種下列(a)-(d)物質(a)權利要求1或2的肽；(b)權利要求14的抗原呈遞細胞；(c)權利要求21或22的主要組織相容性抗原複合體；(d)權利要求29的主要組織相容性抗原複合體四聚體。
40.癌症治療或改善方法，包括給具有HLA-A2402作為白細胞抗原的人施用權利要求30或31的胞毒T淋巴細胞。
41.權利要求21的主要組織相容性抗原複合體四聚體，其中四聚體為包括HLA-A2402分子，β2-微球蛋白，和權利要求1或2的肽，或者存在於權利要求14的抗原呈遞細胞上的腫瘤抗原表位肽的複合體。
42.癌症疫苗，包括權利要求41的主要組織相容性抗原複合體四聚體作為活性成分。
43.權利要求42的癌症疫苗，其中癌症為上皮癌。
44.權利要求42或43的癌症疫苗，其中癌症選自大腸癌，肺癌，乳腺癌，胃癌，口腔癌，胰腺癌，食道癌，鼻咽癌，子宮癌，前列腺癌，和膽囊癌。
45.權利要求42-44任一項的癌症疫苗，其用於治療具有HLA-A2402作為白細胞抗原的人。
46.胞毒T淋巴細胞誘導劑，包括權利要求41的主要組織相容性抗原複合體四聚體。
47.權利要求46的胞毒T淋巴細胞誘導劑，其用於治療具有HLA-A2402作為白細胞抗原的人。
全文摘要
本發明公開了基本上由SEQ ID NO1或2所示的胺基酸序列組成的肽；以及基本上由通過添加，缺失或替換一個或多個胺基酸而衍生自SEQ ID NO1或2所示胺基酸序列的胺基酸序列組成的突變肽，所述肽能夠與HLA－A2402分子形成複合體而被HLA－A2402－限制的胞毒T淋巴細胞識別或誘導這種淋巴細胞。這樣的肽可用作具有HLA－A2402的上皮癌患者的癌症疫苗。
文檔編號C12N5/06GK1910284SQ20058000280
公開日2007年2月7日 申請日期2005年1月19日 優先權日2004年1月20日
發明者葛島清隆 申請人:愛知縣, 大塚製藥株式會社