日本人戊型肝炎病毒多核苷酸探針和引物,檢測晶片、試劑盒,以及檢測方法

2023-04-24 13:17:21

專利名稱：日本人戊型肝炎病毒多核苷酸探針和引物,檢測晶片、試劑盒,以及檢測方法
技術領域：
本發明涉及戊型肝炎病毒的新型檢測方法。本發明涉及為確立這種新型檢測方法中重要的由日本人身上分離出的新型戊型肝炎病毒株和新型的重症戊型肝炎株，以及來自它們的多核苷酸。
背景技術：
在感染患者的肝臟中增殖的戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus；以下記作「HEV」，不是由血液，而是隨糞便排洩出。因此，HEV的感染形式主要是經口感染。為此，水系汙染時常發生，有時也見到局部地區發生。由於這樣的感染形式，由HEV引發的戊型肝炎，主要是經常多發在亞洲和非洲等衛生環境惡劣區域。而在日本和歐美等發達國家內，這種HEV感染卻極少，偶而發現的大多是戊型肝炎案例，多見於在流行地渡假旅遊歸國的旅遊人員。因此，「戊型肝炎＝進口感染症」的想法已形成一般共識。
HEV，在1990年，由美國GenLabs公司的ライエス等，在世界上首次進行基因克隆，隨後，已明確合成HEV基因組的全鹼基序列。他們進行解析的HEV株是墨西哥株和緬甸株。後來，接著明確印度株、巴基斯坦株、尼泊爾、緬甸株、中國株和美國株等基因鹼基序列。然而，「日本株」的報導卻未見到。
以前診斷HEV感染採用以下方法。即，根據上述各種已知的HEV株鹼基序列，使用設定的引物進行PCR法檢測病毒基因的方法，和根據已知HEV株的胺基酸序列，將合成肽和表達蛋白質用作抗原，檢測與其相對抗體的方法等。
假如在檢查對象中存在與已知HEV株屬於不同系統的未知HEV株時，使用以前的技術，有可能檢測不出它的病毒。
發明公開本發明的目的是提供一種能廣泛檢測屬於多種系統HEV的方法。本發明的另一目的是提供一種為廣泛檢測屬於多種系統HEV的多核苷酸，和一種為確定被檢測HEV系統的多核苷酸。
本發明的另一目的是提供來自日本固有的新型HEV株的多核苷酸和來自新型HEV重症肝炎株的多核苷酸，以及由這些鹼基序列編碼的多肽。
本發明的另一目的是通過利用以上新型HEV的基因信息和以前公知的HEV基因信息，實現藥物設計的方法。
發明者們根據最初從日本人患者身上分離出的HEV株，即HEV Japan JRA1株、JKN-Sap株、JMY-Haw株、JKK-Sap株和JAK-Sai株，由重症肝炎病例分離出的新型HEV株的HEV Japan JSN-EH株，以及確定它們的病毒基因組的序列，完成了本發明。
根據本發明的第1種方案，提供的多核苷酸探針是為檢測戊型肝炎病毒多核苷酸的，至少含有8個核苷酸連續序列的多核苷酸探針，具有以下特徵(1)至少由8個核苷酸形成的連續序列，用於與上述戊型肝炎病毒的多核苷酸進行雜交，根據這種雜交檢測戊型肝炎病毒；(2)該至少8個核苷酸的連續序列是從序列號11、序列號44、序列號45、序列號46、序列號47和序列號48以及它們的互補鏈中選出的序列獲得的；根據本發明的第2種方案，提供的一對乃至數對的PCR用引物，是為將戊型肝炎病毒的多核苷酸進行擴增的1對乃至數對的PCR用引物，該1對乃至數對的PCT引物各自單獨含有至少8個核苷酸的連續序列，具有以下特徵；(1)至少由8個核苷酸形成的連續序列是用於與上述戊型肝炎病毒的多核苷酸進行雜交，根據這種雜交將戊型肝炎病毒的部分多核苷酸進行擴增的序列；(2)該至少8個核苷酸的連續序列是從序列號11、序列號44、序列號45、序列號46、序列號47和序列號48，以及它們的互補鏈中選出的序列獲得的。
根據本發明的第3種方案，提供檢測樣品中戊型肝炎病毒的存在的方法，包括如下步驟(1)由對象獲得樣品(2)使第1種方案中記載的多核苷酸探針與由上述(1)得到的樣品進行反應、(3)檢測由上述(2)反應生成的雙鏈、(4)從上述(3)的檢測結果，判斷上述樣品中是否存在戊型肝炎病毒。
根據本發明的第4種方案，提供檢測樣品中戊型肝炎病毒的存在的方法，包括如下步驟
(1)由對象獲得樣品、(2)將第2方案中記載的一對PCR用引物和聚合酶與由上述(1)得到的樣品，在適宜獲得擴增的條件下進行反應、(3)檢測由上述(2)反應得到的擴增產物存在、(4)由上述(3)的檢測結果，判斷上述樣品中是否存在戊型肝炎病毒。
根據本發明的第5種方案，提供確定樣品中戊型肝炎病毒基因型的方法，包括以下過程(1)使樣品與權利要求12記載的一對PCR用引物和聚合酶，在可適宜擴增的條件下進行反應、(2)確定由上述(1)反應得到的擴增產物長度，(3)由上述(2)的結果，判斷上述樣品中存在的戊型肝炎病毒的基因型。
根據本發明的第6種方案，提供具有第1種方案中記載多核苷酸探針的探針化驗試劑盒。
根據本發明的第7種方案，提供具有第2種方案中記載PCR用引物的探針化驗試劑盒。
根據本發明的第8種方案，提供固定了第1種方案中記載的多核苷酸探針的檢測鹼基序列用晶片。


圖1是戊型肝炎病毒株系統樹的示意圖。
圖2是HEV JRA1基因地圖的示意圖。
圖3A和圖3B是HEV JRA1的部分鹼基序列和墨西哥株的部分鹼基序列的比較示意圖。
圖4A和圖4B是繼圖3A和圖3B的HEV JRA1的部分鹼基序列和墨西哥株的部分鹼基序列的比較示意圖。
圖5A和圖5B是繼圖4A圖4B的HEV JRA1的部分鹼基序列和墨西哥株的部分鹼基序列的比較示意圖。
圖6是本發明方案的引物和探針示意圖。
圖7是HEV JSN-FN的部分鹼基序列和墨西哥株的部分鹼基序列的比較示意圖。
圖8是繼圖7，HEV JSN-FN的部分鹼基序列和墨西哥株的部分鹼基序列的比較示意圖。
圖9是繼圖8，HEV JSN-FN的部分鹼基序列和墨西哥株的部分鹼基序列的比較示意圖。
圖10是繼圖9，HEV JSN-FN的部分鹼基序列和墨西哥株的部分鹼基序列的比較示意圖。
圖11是繼圖10，HEV JSN-FN的部分鹼基序列和墨西哥株的部分鹼基序列的比較示意圖。
圖12是繼圖11，HEV JSN-FN的部分鹼基序列和墨西哥株的部分鹼基序列的比較示意圖。
圖13是各種HEV株的ORF區域比較示意圖。
圖14是HEV株的系統樹示意圖。
圖15是各種HEV株的ORF1序列比較示意圖。
圖16是繼圖15的各種HEV株的ORF1序列比較示意圖。
圖17是繼圖16的各種HEV株的ORF1序列比較示意圖。
圖18是繼圖17的各種HEV株的ORF1序列比較示意圖。
圖19是來自某患者血清樣品中存在的HEV的RNA，和肝功能檢查數值變化的示意圖。
圖20是對按照本發明方案使用引物所得非A、B、C急性肝炎患者的樣品，檢測HEV結果的示意圖。
圖21是根據本發明的方案，對某患者連續檢測HEV結果的示意圖。
圖22是根據本發明的方案，以電泳檢測擴增的HEV結果的示意圖。
圖23A到圖23E是探針的種類和HEV基因型和吸光度的關係示意圖。
實施發明的最佳方案I.用語本文中使用的「多核苷酸」術語，是為簡便起見對多核苷酸和寡核苷酸的總稱，所謂「多核苷酸」是指利用磷酸酯鍵將2個以上核苷結合形成的物質。在核苷中含有脫氧核苷和核糖核苷，但不限於這些。所謂「寡核苷酸」是指數個到數十個核苷的磷酸酯(即，核苷酸)用磷酸二酯鍵聚合的物質，包括寡核糖核苷酸和寡脫氧糖核苷酸，但不限於這些。本發明的方案的多核苷酸，可以是由HEV JRA1株分離的病毒基因組RNA，也可以是原本的DNA等。所謂本發明中的「多核苷酸」也指肽核酸、嗎啉代核酸、甲基磷酸酯核酸、S-寡核酸等人工合成核酸。
本文中使用的「多肽」術語，是表示由2個以上的胺基酸形成的肽、寡肽和蛋白質。並不限定這些，包括合成肽和表達蛋白質兩種，可以是只由胺基酸形成的單純蛋白質，也可以是含有除胺基酸以外的構成成分的複合蛋白質。
本文中使用的「對象」術語，雖然可以是包含人類、狗、貓、牛、山羊、豬、綿羊、及猴等任意的哺乳動物個體，但最好的對象是人類。
本文中使用的「樣品」術語，是指從生物個體上採取的血液、血清、淋巴液和組織等生物試樣。「樣品」也可以是根據需要，對生物試樣進行均化和提取等必要的任意前處理，得到的試樣。這種前處理，可由本領域人員根據作為對象的生物試樣適當選擇。
本文中使用的「可讀框」是指對多肽進行編碼的多核苷酸序列區域。該區域的意思是編碼序列的一部分或編碼序列的全部分。
本文中使用的「戊型肝炎病毒」術語是指通過消化道，以飲用水為媒介，主要發生在亞洲和非洲的流行性非甲非B型肝炎的主要成因病毒。是RNA病毒，分類於杯狀病毒科杯狀病毒屬。本說明書中的HEV術語，是總括表示屬於一般使用的分類基因型I、II、III和IV病毒的術語。根據本發明的方案時，可以對雖然屬於HEV但還沒有分離和/或鑑定株進行檢測和/或鑑定或分型。因此，此處使用的HEV術語中，也可含有未知HEV和可根據本發明的方案檢測和/或鑑定或分型的病毒。此處所說的「HEV」包括野生型、變異株、和HEV的近緣株等。特別是對序列號1中所示JRA1的5′端側約2500鹼基序列具有約50％以上，好的60％以上，更好65％以上同源性的株。
II.新型戊型肝炎病毒株本發明者們著眼於雖說在日本是稀少的，即使沒有海外旅遊經歷的人中也往往能見到的戊型肝炎發病，假設存在HEV日本固有株。在此假定下，對有些日本人急性肝炎患者試驗HEV的基因克隆。結果成功地分離出5株認為屬於新型系統的HEV株。
這些新型HEV株，本發明者們合計命名了5種株，即，HEV Japan JRA1株(Hepatitis E virus Japan JRA1、以下記作JRA1株、NCBI accessionno.AP003430)、HEV Japan JKN-Sap株(Hepatitis E virus、以下記作JKN-Sap株、NCBI accession no.AB074918)、HEV Japan JMY-Haw株(Hepatitis E virus.以下記作JMY-Haw株，NCBI accession no AB074920)、HEV Japan JKK-sap株(Hepatitis E virus.以下記作JKK-Sap株、NCBI accession no.AB074917)和HEV Japan JAK-Sai株(Hepatitis E virus，以下記作JAK-Sai株，NCBIaccession no.AB0714915)。各個病毒的來源，JKK-sap、JKN-Sap和JMY-Haw3株來自住在北海道的急性戊型肝炎患者，JAK-Sai株來自住在琦玉的急性戊型肝炎患者，JRA1株來自東京的患者。
本發明者們從重症肝炎病例分離出新型HEV株的HEV JSN-FH株(HepatitisE virus。以下記作JSN-FH株)。
將JRA1株的基因組RNA序列中可讀框1(以下記作ORF1)示於序列號1，全長示於序列號48。
JSN-FH株的基因組RNA序列除去5′端側的非編碼序列的一部分的準全長示於序列號11。JSN-FH株的基因組RNA序列的ORF1和ORF2編碼的胺基酸序列，分別示於序列號12和序列號13。
將JKN-Sap株、JMY-Haw株、JAK-Sai株和JKK-Sap株的基因組RNA序列的ORF1的部分，分別示於序列號16、序列號17、序列號20和序列號21。將JKN-Sap株、JMY-Haw株、JAK-Sai株和JKK-Sap株的基因組RNA序列全長，分別示於序列號44、序列號45(準全長)、序列號46(準全長)和47(準全長)。
2.HEV JRA1株(1)HEV JRA1株本發明者們將序列號1中記載的JRA1株的鹼基序列，和從世界各地得到的各種已知株比較中，如圖1記載的系統樹所示，確定屬於新型基因型。
與已知株的差異，在基因組5′端約2500鹼基中特別顯著。如圖2所示，在包括HEV-JRA1的一般戊型肝炎病毒基因型中，可讀框(以下縮寫為ORF)含有ORF1、ORF2和ORF3三個。在ORF1含有該5′端約5000鹼基。其下遊的基因組區域，即，在含有ORF2和ORF2區域的其他區域。與ORF1相比，株間的保守性相對較高。
該ORF1區域中5′端的約2500鹼基序列，示於下述序列表中序列號7的有關JRA1株的部分鹼基序列，與ライエス等專利中公開的鹼基序列中具有最高同源性的Mexico株(美國專利號5789559的SEQ IDNO-10、NCBI accession no.M74506、示於序列號49)進行比較，其鹼基序列的一致度在70％以下，兩者序列的比較示於圖3A，圖3B、圖4A、圖4B、圖5A和5B中。在圖3A、圖3B、圖4A、圖4B、圖5A和5B中，將上段中HEV-JRA1株的序列，與下段中Mexico株序列的一部分並列示出。其同源性在2432鹼基為69.9％。
因此，通過明確這種JRA1株的特異的新型序列，在以前沒有打算對其檢測，因此檢測也是很困難的JRA1株，可很容易地，而且正確地進行檢測。進而，關於以前難以檢測的其近緣株也能同樣進行檢測。根據這種新型戊型肝炎病毒株的新型基因組序列確定，本發明的方案中，以下作更詳細的說明。
(2)多核苷酸根據本發明的方案1時，提供在JRA1株中是特異的，而且具有新型序列的多核苷酸。例如，這樣的序列可以是由5138鹼基形成的序列號1的鹼基序列表示的多核苷酸。也可以是由該多核苷酸中任何區域的鹼基序列表示的多核苷酸片段。例如，可以是由2442鹼基形成的序列號7的鹼基序列表示的多核苷酸。還可以是這些序列的互補鏈，也可以是構成該多核苷酸和其互補鏈的多核苷酸一部分的多核苷酸片段。
上述的多核苷酸也可以是其中的1個或數個核苷酸缺失、置換、或附加修飾的多核苷酸。
根據本發明的方案1時，提供由具有序列號1～7中記載的鹼基序列或其互補鏈，或其任何片段的多核苷酸片段形成的引物和探針。這些引物和探針，例如，在檢測對象中用作為檢測HEV的各種擴增，例如用作PCR擴增等的引物，或者在所謂的DNA晶片中用作使用的探針。這時，該多核苷酸最好是10～30個核苷酸。多核苷酸片段的長度過長時，難以識別1個核苷酸的不同。多核苷酸的基本長度過短時，很難確定試樣中含有的多核苷酸鹼基序列。
例如，這樣的引物和探針，包括為總括地檢測HEV的引物和探針，及為有選擇地檢測HEV的各種基因型的引物和探針。
圖6中示出了JRA1株的鹼基序列信息的一部分與在與其相當部位中的已知株的鹼基序列信息進行比較的實例。通過對這樣的鹼基序列進行比較，可明確以下區域，即，為設定可用於總括地檢測HEV的引物和探針的高度保守區域，和為有選擇地檢測HEV的各種基因型的高度變異區域。
此處使用的所謂「高度保守區域」，是指HEV-JRA1株的鹼基序列和以前株的鹼基序列具有很高同源性的區域，例如，具有90％以上，好的95％以上，更好具有100％的同源性。此處使用的所謂「高度變異區域」是指在HEV-JRA1株中特異的鹼基序列，與以前株的序列同源性很低的區域，例如，只有80％以下，好的75％以下，更好70％以下同源性的區域。
圖6中示出了檢測全部HEV用的引物和探針的設定候補區域實例的從HEV-JRA1株的序列號1的111位到124倍，和與其相當的以前株的區域。例如，作為檢測全部HEV用的引物和探針，可將含有序列號2～5中記載的鹼基序列或其互補鏈的多核苷酸用作引物或探針，但是，可用作檢測全部HEV用的引物和探針的序列號1的區域，並不限定於此。
同樣，圖6中示出了有選擇的HEV檢測用引物和探針的設定候補區域實例的JRA1株的序列號1的353位到371位，和與其相當的以前株的區域。例如，作為有選擇的HEV檢測用引物和探針，可使用含有序列號1和7中記載的鹼基序列或其互補鏈的多核苷酸，例如含有序列號6或其互補鏈的多核苷酸作為引物或探針，但可用作有選擇的HEV檢測用引物和探針的序列號1和7的區域並不限定於此。
根據本發明的方案時，可提供將序列號1～7的多核苷酸或其片段作為其一部分含有的多核苷酸。這樣的多核苷酸可以是具有與從啟動子、增強子、上遊活化序列、沉默基因、上遊抑制序列、弱化子、Poly-A尾、核轉移信號、ISRE、耐藥物性因子、信號肽的基因、跨膜區域的基因、螢光素、綠色螢光蛋白質、藻青蛋白、含有辣根過氧化酶的標記蛋白質的基因等基因中至少選出1種的多核苷酸連接而組成的多核苷酸，也可以是含有其他任意鹼基序列的多核苷酸。
(3)多肽根據本發明的方案時，提供由序列號8中記載的胺基酸序列表示的多肽。發明者通過臨床的研究，證明該多肽是HEV-JRA1患者早期產生的多肽，對該多肽的抗體也是HEV-JRA1患者早期產生的抗體。因此，也可將該多肽和/或該抗體用作HEV-JRA1的檢測用標記。這樣的多肽和抗體可利用其自身公知的方法獲得。在這種多肽的片段和含其的多肽、以及序列號8中記載的胺基酸序列中，有1個或數個肽缺失、置換、或附加修飾的多肽也包括在本發明範圍內。
若根據本方案，例如，在其自身上結合抗體用作檢測該抗體的抗體檢測用多肽時，若是合成肽，可含有由序列號8中含有的連續的15～50胺基酸殘基表示的多肽。若是表達蛋白，可含有序列號8中含有的連續的150～250胺基酸殘基表示的多肽。
3.HEV Japan JSN-FH株(1)HEV Japan JSN-FH株如上述，JSN-FH株是從重症肝炎病例分離出的新型HEV株。對重症肝炎和通常的急性肝炎，其治療方法完全不同。因此，若對重症肝炎早期進行診斷，例如，可在感染後立刻診斷，救活率會增高。然而，在重症肝炎患者中HEV病毒的表達量非常低。因此，在以前，幾乎沒有從重症肝炎患者分離出HEV的先例，況且，很難研究全長中的序列。儘管這種狀況，本發明者們還是成功地從重症肝炎患者分離出HEV，進而確定了該基因組的大概全長(或準全長)。
從重症肝炎患者分離出的HEV基因組，作為全體像也具有唯一的序列。對於由亞克隆得到的一個克隆也曾經報導過一次，認為是點突變(pointmutation)。該變異是在對核殼蛋白進行編碼的可讀框(ORF2)內產生終止密碼子的變異，通常的戊型肝炎病毒株的ORF2是將由編碼的660胺基酸形成的翻譯產物長度縮短成211胺基酸的變異。即，ORF2的第212號密碼子變成了TAA、TAG或TGA中的任何一個終止密碼子。
在B型肝炎的情況下，用對前核·核(Precore-core)區域進行編碼的翻譯產物以不是全長的變異株感染時，可知該患者形成重症肝炎的概率很高。
圖7～圖12中示出了JSN-FH株和墨西哥株(M74506)的鹼基序列比較。將上段中HEV JSN-FH株的序列與下段中墨西哥株(M74506)的序列並行示出。其同源性在2631鹼基為69.4％。
因此，通過明確這種JSN-FH株中特異的新型序列，在以前沒有打算對其檢測而且因此也很難進行檢測的JSV-FH株，可限容易地而且很正確地進行檢測。進而關於以前很難檢測的其近緣株同樣也能進行檢測。並暗示出在患者中檢測出JSN-FH株時，隨後就可能發展成重症肝炎。
(2)多核苷酸根據本發明的方案1時，提供了在JSN-FH株中是特異的，而且具有新型序列的多核苷酸。例如，這樣的序列可以是由7234鹼基形成的序列號11的鹼基序列表示的多核苷酸。也可以是由該多核苷酸中任何區域的鹼基序列表示的多核苷酸片段。例如，也可以是由238鹼基形成的序列號22的鹼基序列表示的多核苷酸。進而，也可以是這些序列的互補鏈，也可以是構成該多核苷酸和其互補鏈的多核苷酸一部分的多核苷酸片段。
特別是，作為用於檢測在其ORF2中是否是具有終止密碼子的株的多核苷酸，也可提供具有序列號9和10中記載鹼基序列的多核苷酸或其互補鏈，或具有其任何片段的多核苷酸片段。並由此也可提引物和探針。序列號9和10中記載的鹼基序列是JSN-FH株的ORF2的一部分序列。序列號9中記載的鹼基序列是可特異檢測出無終止密碼子株的序列。序列號10中記載的鹼基序列是可特異檢測出具有終止密碼子株的序列。含有為使含有該部分的鹼基擴增的鹼基序列的引物也在本發明範圍內。對由對象採取的試樣中所含核酸的ORF2中沒有以全長獲得翻譯產物的序列進行檢測，將其為基礎，檢測對象受ORF3中具有這種終止密碼子的病毒株進行感染，可診斷出感染早期就受到重症肝炎病毒感染。
上述的多核苷酸也可以是其中的1個或數個核苷酸缺失、置換、或附加修飾的多核苷酸。
進而，根據本發明的方案1時，提供由具有序列號11和22中記載鹼基序列或其互補鏈，或其任何片斷的多核苷酸片段形成的引物或探針。這些引物和探針，例如，可用檢測對象中檢測HEV的各種擴增，例如PCR擴增的引物，也可用作所謂DNA晶片中使用的探針。這時，該多核苷酸最好是10～30個核苷酸。當多核苷酸片段的長度過長時，很難識別1個核苷酸的不同。多核苷酸的基本長度過短時，很難確定試樣中所含多核苷酸的的鹼基序列。
根據本發明的方案時，提供將序列號11、22、9和10的多核苷酸或其片段作為其一部分含有的多核苷酸。這樣的多核苷酸可以是具有與從啟動子、增強子、上遊活化序列、沉默基因、上遊抑制序列、弱化子、Poly-A尾、核轉移信號、ISRE、耐藥物性因子、信號肽的基因、跨膜區域的基因、螢光素、綠色螢光蛋白質、藻青蛋白、含有辣根過氧化酶的標記蛋白質的基因等基因中至少選出1種的多核苷酸連接而組成的多核苷酸，也可以是含有其他任意鹼基序列的多核苷酸。
(3)多肽根據本發明的方案時，提供由序列號12和序列號13中記載的胺基酸序列表示的多胝。序列號12中記載的胺基酸序列是與JSN-FH株的基因組序列的ORF1區域相對應的序列。序列號13中記載的胺基酸序列是與JSN-FH株的基因組序列的ORF2區域相對應的序列。
也可將多肽和/或該抗體用作JSN-FH的檢測用標記。這樣的多肽和抗體可利用其自身公知的方法獲得。在這種多肽的片段和含該片段的多肽，及序列號12或序列號13中記載的胺基酸序列中，1個或數個肽缺失、置換或附加修飾的多肽也包含在本發明範圍內。
根據本方案，例如，在其自身上結合抗體，用作檢測該抗體的抗體檢測用多肽時，若是合成肽，可含有由序列號12或13中所含的連續的15～50胺基酸殘基表示的多肽。若是表達蛋白，可含有由序列號12或13中所含的連續的150～250胺基酸殘基表示的多肽。
由序列號12表示的ORF1是對複製病毒粒等所需要的各種酶蛋白進行編碼的區域。因此，不僅對序列號12的一級結構，對其二級結構和/或三級結構的數據，例如，可利用X射線衍射等其自身公知的方法獲得，也可將該數據作為基礎進行藥物設計。這種藥物設計自身和利用該藥物設計得到的藥劑也包含在發明範圍之內。
也可用其自身公知的方法進行製造來自由序列號13表示的ORF2的、縮短的核殼蛋白的特異抗體。若利用使用這種抗體的抗原抗體反應，用於從對象採取的樣品，可很容易地診斷HEV感染。
也可根據其自身公知的方法製作識別核殼蛋白的抗體的抗體。使用這樣的抗體，使用從對象採取的樣品，也能很容易地診斷HEV感染。
4.新型HEV株和以前的HEV株比較圖13表示對各種ORF位於基因組序列的什麼位置，在HEV緬甸B1株(M73218)、HEV墨西哥株(M74506)、HEV美國US-1株(AF060669)、HEV日本JRA1(AP003430)、基因型4，和HEV日本JSN-FH之間的比較結果。在各個株名後記在括號內的號是NCBI accession no.。本說明書中記載的各株名的「HEV」作了省略(例如，將HEV USA US-1株，記作「USA US-1株」)。
各株名的右鄰括號內示出的羅馬數字表示各株所屬的基因型。如圖13所示，JSN-FH株，在ORF2內存在終止編碼子TGA。
圖14中示出了將ORF1的326nt區域作為基礎，製作成含有本發明5種新型株的7種日本固有株和日本以外國家中見到的HEV株的系統樹(根據neighbor-joining method)。如其中所示，JMM-Sai分型在I型內，JKN-Sap、JHA-Sap和JMY-Haw分型在III型內，JSY-Sap、JKK-Sap和JAK-Sai分型在IV型內。
圖15～圖18中，關於ORF1區域的鹼基序列信息，為了比較本發明的方案1的日本固有株5種{Japan JRA1株(序列號15)，JKN-Sap株(序列號16)、JMY-Haw株(序列號17)、JKK-Sap株(序列號21)和JAK-Sai株(序列號20)}和來自重症肝炎患者的株(JSH-FH株，序列號22)、及以前公知的外國株{USAUS-1(AF060669、序列號18)、豬(Swine)HEV(AF082843、序列號19)、中國型4(AJ272108，序列號23)、緬甸B1(M73218、序列號24、中國維吾爾(ChinaUigh)(D11093、序列號25)、中國河北(M94177、序列號26)、中國新疆(D11092、序列號27)、尼泊爾(AF051830、序列號28)、印度FH株(X98292、序列號29)、巴基斯坦SAR55(M80581、序列號30、墨西哥(M74506、序列號31))並列示出。
從圖15～圖18中，示出了株名和株名右的括號內示出的NCBI auession no.在其右側示出了鹼基序列信息。記在序列左右的號，表示將轉錄開始部位取為1時各個核苷酸的號。將最上段的JRA1株作為標準，對於其他株的特定位置的鹼基種類與該位置的JRA1株的鹼基種類等同時，表示「.」，不同時，記下該鹼基的種類。在最下段，表示記住的數個配位中序列的保守性。即，特定位置所有株的序列相等時，最下段表示「*」，即使1個株不同時，表示為「.」。
這樣的新型株及其鹼基序列全在本發明範圍之內。
(2)多核苷酸根據本發明的方案1，在JKN-Sap、JMY-Haw、JKK-Sap和JAK-Sai株中，都是特異的，而且提供了具有新型序列的多核苷酸。例如，這樣的序列，可以是由表示JKN-Sap、JMY-Haw、JKK-Sap和JAK-Sai株的基因組序列的序列號44、序列號45、序列號46和序列號47的鹼基序列表示的多核苷酸。也可以是這些序列的互補鏈，也可以是構成該多核苷酸及其互補鏈多核苷酸一部分的多核苷酸片段。
也可以是由該多核苷酸任何區域的鹼基序列表示的多核苷酸片段。也可以是由對ORF1區域進行編碼的鹼基序列的序列號16、序列號17、序列號20和序列號21的鹼基序列表示的多核苷酸。也可以這些序列的互補鏈，也可以是構成該多核苷酸和其輔鏈多核苷酸一部分的多核苷酸片段。
例如，含有使含有序列號16、序列號17、序列號20和序列號21鹼基序列的鹼基擴增用的鹼基序列引物也是本發明範圍內的。
上述多核苷酸也可以是其中1個或數個肽缺失、置換或附加修飾的多核苷酸。
根據本發明的方案1時，可提供由具有序列號44、序列號45、序列號46和序列號47中記載的鹼基序列或其互補鏈、或具有其任何片段的多核苷酸片段形成的引物和探針。這些引物和探針，例如，可以用作檢測對象中為檢測HEV的各種擴增，如PCR擴增等的引物，或者用作所謂DNA晶片中使用的探針。這時，該多核苷酸最好是10～30個核苷酸。多核苷酸片段過長時，很難識別1個核苷酸的不同。基本上多核苷酸的長度過短時，很難確定試樣中所含多核苷酸的鹼基序列。
根據本發明的方案時，可提供將序列號44、序列號45、序列號46和序列號47，及序列號16、序列號17、序列號20和序列號21的多核苷酸或其片段作為其一部分含有的多核苷酸。這樣的多核苷酸可以是具有與從啟動子、增強子、上遊活化序列、沉默基因、上遊抑制序列、弱化子、Poly-A尾、核轉移信號、ISRE、耐藥物性因子、信號肽的基因、跨膜區域的基因、螢光素、綠色螢光蛋白質、藻青蛋白、含有辣根過氧化酶的標記蛋白質的基因等基因中至少選出1種的多核苷酸連接而組成的多核苷酸，也可以是含有其他任意鹼基序列的多核苷酸。
(3)多肽根據本發明的方案時，可提供由JKN-Sap、JMY-Haw、JKK-Sap和JAK-Sai株中特異的序列號44、序列號45、序列號46和序列號47、及序列號16、、17、20和21中記載的多核苷酸序列進行編碼的胺基酸序列表示的多肽。進而可提供由JKN-Sap、JMY-Haw、JKK-Sap和JAK-Sai株中表示各特異ORF1區域的胺基酸序列的序列號50、序列號52、序列號54和序列號56，和表示ORF2區域的胺基酸序列的序列號51、序列號53、序列號55和序列號57的胺基酸序列，表示的多肽和其片段。
來自ORF1區域編碼胺基酸序列的多肽，為了藥物設計可以利用。
來自ORF2區域編碼胺基酸序列的多肽，也可為了製作檢測各株的抗體使用，也可將其自身作為抗原進行檢測而使用。也可利用它製作疫苗。
若根據本方案，例如，在其自身上結合抗體用作檢測該抗體的抗體檢測用多肽時，若是合成肽，可含有由來自各個新型株的鹼基序列的0RF2區域表示的胺基酸序列，例如由序列號51、序列號53、序列號55或57中含有的連續的15～50胺基酸殘基表示的多肽。若是表達蛋白，可含有由序列號51、53、55或57中含有的連續的150～250胺基酸殘基表示的多肽。
也可將該多肽和/或該抗體用作HEV JKN-Sap、JMY-Haw、JKK-Sap和JAK-Sai檢測用標記。這樣的多肽和抗體可利用其自身公知的方法獲得。在這樣的多肽片斷和含該片段的多肽、及從序列號50～57中記載的胺基酸序列中，1個或數個核苷酸缺失、置換或附加修飾的多肽也包含在本發明範圍內。
根據本方案，例如，在其自身上結合抗體用作檢測該抗體的抗體檢測用多肽時，若是合成肽，可含有由序列號8中含有的連續的15～50胺基酸殘基表示的多肽。若是表達蛋白，可含有由序列號8中含有的連續的150～250胺基酸殘基表示的多肽。
5.檢測全部HEV用的引物和探針如上述，通過發現新型的HEV株對其序列特定，可提供對包括未知株的更廣泛的HEV能一次擴增的引物，即，萬能引物(即，檢測全部HEV用的引物)、和對包括未知株的更廣泛的HEV能一次檢測的探針(即，檢測全部HEV用的探針)。關於這樣的萬能引物以下進行說明。
圖15～圖18中，列出了屬於型I、II、III和IV的代表性HEV株的ORF1序列。表中株名右的括號內記號是NCBI accession no.。記在序列左右的號，表示將轉錄開始部位取為1時各個核苷酸的號。
所謂「萬能引物」或「萬能探針」是指含有可全部檢測未知株中所含HEV的鹼基序列核酸的多核苷酸片段。例如，這種萬能引物的鹼基序列，可從圖15～18所示序列中選擇。例如，這樣的序列最好是高度保守區域。
此處使用的所謂「高度保守區域」，表示HEV-JRA1株的鹼基序列與以前株的鹼基序列同源性很高的區域，例如，具有90％以上，好的95％以上，更好100％同源性的區域。
圖15～18中，示出了將JSN-FH株的鹼基序列信息的一部分與其相當部位中已知株的鹼基序列信息進行比較的實例。通過這種鹼基序列比較，可明確對全部檢測HEV設定引物和探針的有用的高度保守區域，和可選擇地檢測HEV的各種基因型的高度變異區域。
圖15～圖18中示出了檢測全部HEV用的引物和探針的設定候補區域實例。圖15中的(1)區域，即，HEV-JRA1株的序列號15的19位到37位、與其相當的以前株的區域；圖16中的(4)區域，即，HEV-JRA1株的序列號15的111位到127位，與其相當的以前株的區域；圖17中的(5)區域，即，HEV-JRA1株的序列號15的174位到181位，與其相當的以前株的區域；圖17中的(6)區域，即，HEV-JRA1株的序列號15的213位到220位，與其相當的以前株的區域，是高度保守區域的最好例。
全部HEV檢測用的引物，最好將具有圖15的(1)區域中所含序列的6鹼基到100鹼基、更好15鹼基到25鹼基的多核苷酸用作有義引物。與這種有義引物的同時，好的將具有圖15的(4)、(5)和/或(6)區域中所含序列的6鹼基到100鹼基、更好15鹼基到25鹼基的多核苷酸用作有義引物。
圖15和16的(7)區域，即，HEV JRA1株的序列號15的48位到100位，與其相當的以前株的區域，也可用作檢測全部HEV用的引物群。這時，(7)區域的全長序列，不一定全需要，可使用從(7)區域中選擇的6鹼基到25鹼基，最好15鹼基到22鹼基的連續序列。例如，全部HEV檢測用的最好引物實例，如下所示5′-gcagaccacrtatgtgktcg-3′(序列號32)、5′-ccacrtatgtggtcgaygcc-3′(序列號33)、5′-acmarctgscgrggytgcat-3′(序列號34)、5′-cgytgratwggrtgrttcca-3′(序列號35)、5′-tgktcgaygccatggaggc-3′ (序列號36)、5′-tgktcgaygccatggaggc-3′ (序列號37)、5′-aygccatggaggcccaycag-3′(序列號38)、5′-ckracyaccacagcattcgc-3′(序列號39)和5′-ggcckracyaccacagcatt-3′(序列號40)和。
此處，說明書中的「a」或「A」表示腺嘌呤，「c」或「C」表示胞嘧啶，「g」或「G」表示鳥嘌呤，「t」或「T」表示胸腺嘧啶、「r」或「R」表示G或A、「y」或「Y」表示T或U或U、「w」或「W」表示A或T或U。
這些檢測全部HEV用的引物組，例如，分成以下2個階段在解析中使用更好。例如，將上述序列號32和序列號33用作有義引物，進而，將序列號34和序列號35用作反義引物，在第1次擴增中使用。接著，將上述序列號36、序列號37和序列號38作為有義引物，進而，將序列號39和序列號40作反義引物，進而第2次擴增。這樣，可獲得來自廣泛未知HEV變異株的多核苷酸片段。進而將得到的擴增產物利用鹼基電泳等自身公知的方法進行解析。之後，對得到的多核苷酸片段進行分型。
將上述序列用作探針時，檢測全部HEV用探針，可以將從該序列含有圖15的(1)區域內所含連續的序列的6個鹼基到100個鹼基，更好從12個鹼基到25個鹼基的多核苷酸作用探針。同樣也可將從該序列含有圖15的(4)、(5)和/或(6)區域所含連續序列的6鹼基到100鹼基，更好從12鹼基到25鹼基的多核苷酸用作探針。
雖然以上示出了檢測全部HEV用的引物實例，但並不僅限於此。
6.分型用的核苷酸序列如上所述，若選擇高度保守區域序列，可得到檢測全部HEV用引物和探針，利用它可檢測全部的病毒。對其，另一方面，若選擇高度變異區域的序列，可得到有選擇的HEV檢測用引物和探針。進而通過使用這樣的序列，可有選擇地檢測和/或鑑定病毒。
此處使用的所謂「高度變異區域」，表示在HEV JRA1株中特異的鹼基序列中，與以前株的序列同源性很低，例如，只有80％以下，好的75％以下，更好70％以下同源性的區域。
圖15、16、17和18中示出了有選擇的HEV檢測用引物和探針的設定候補形成區域實例。例如，圖15的(2)區域，即，HEV-JRA1株的序列號15的52位到69位，與其相當的以前株的區域；圖16中(3)區域，即，HEV-JRA1株的序列號15的77位到95位，與其相當的以前株的區域，都是高度變異區域的最好實例。
例如，圖15的(2)區域是根據基因型其鹼基序列改變的區域。進而，該(2)區域，每個基因型分成3部分。即，將圖中付與「III」記號的部分中含有的株為III型，付與「IV」的部分為IV型，付與「I，II」的部分是包括I型和II型的部分。對於圖16的(3)區域也一樣。每個這樣的基因型，利用不同的特定部位的鹼基種類，可進行對要解析的HEV分型。
將上述序列用作探針時，可選擇的HEV檢測用探針，可將從該序列中含有圖15的(2)區域的連續序列6鹼基到100鹼基，更好從12鹼基到25鹼基的多核苷酸用作探針。同樣，也可將從該序列中含有圖16的(3)區域的連續序列的6鹼基到100鹼基，更好12鹼基到25鹼基的多核苷酸用作探針。
在將上述序列用作引物時，可選擇的HEV檢測用引物，可將從該序列含有圖15的(2)區域所含的連續序列的6鹼基到100鹼基，更好從12鹼基到25鹼基的多核苷酸用作引物。同樣，也可將從該序列含有圖16的(3)區域所含的連續序列的6鹼基到100鹼基，更好從12鹼基到25鹼基的多核苷酸用作引物。或者，選擇可對至少含有圖15的(2)區域和/或圖16的(3)區域的多核苷酸進行擴增的引物。
5.HEV病毒檢測方法根據本發明的另一方案時，本發明提供了試樣中HEV病毒的檢測方法。
此處使用的所謂「試樣」是指從生物體採取的血液、血清、淋巴液和組織等，從糞便和尿等排洩物的生物試樣，以及從河流和地下水等環境中採取的水和土等環境試樣的未處理試樣，根據需要，進行均勻和提取等必要的任意前處理的。這樣的前處理，由技術人員根據成為對象的試樣進行選擇。
根據本發明的方案時，HEV病毒檢測方法使用上述的引物，可根據利用其自身公知的擴增反應，例如利用聚合酶鏈反應(一般稱作PCR，以下記作PCR)的方法進行。例如，典型的是逆轉錄PCR、逆轉錄nested PCR，或其變法，例如，反PCR、5′RACE、3′RACE。
例如，這樣的檢測方法可按如下進行。首先，向含有戊型肝炎病毒基因組的試樣中混合所要求的引物，在適宜PCR條件下，例如，設定溫度變化的條件，95℃4分鐘之後連續進行30個循環{95℃30秒、55℃30秒、72℃45秒}，然後在最後，以72℃7分鐘進行PCR反應。接著，將產物利用電泳、DNA晶片等方法進行解析，通過檢測來自戊型肝炎病毒的基因組片段，可檢測出戊型肝炎病毒。例如，若是電泳，通過研究有無來自HEV基因組的條帶，可檢測出來自戊型肝炎病毒的基因組片段。
根據本發明的再一個方案時，HEV病毒檢測方法可按如下方法進行，即，使用上述探針，利用其自身公知的雜交反應的檢測方法。這時，也可利用所要求的標記物質對該探針進行標記。
通過使用上述的檢測全部HEV用引物和探針，可檢測全部的病毒，通過使用可選擇的HEV檢測用引物和探針，可有選擇地檢測病毒。
例如，通過組合使用了高度保守區域的檢測體系，能提高HEV感染的診斷精度。另一方面，使用了高度變異區域的基因型特異檢測體系也可有助於感染途徑的解明和流行病學研究。也可用來檢測輸血用血液中的該病毒。還可用來檢測來自環境試樣中的該病毒。
根據本發明的方案時，該病毒的檢測，不僅達到上述核酸的水平，而且也能達到胺基酸的水平。例如，以序列號8等表示的胺基酸序列，和上述多核苷酸一樣，可用作HEV存在的標記物。例如，為了全部診斷包括人類在內的生物中的該病毒感染，為了特異診斷基因型等，都可使用。同樣，上述的任何氨基序列也可用於這樣的目的。
根據上述的本發明的來自HEV-JRA1的基因和多核苷酸是新型物質，使用這些多核苷酸或根據它製作的多肽和抗體來檢測HEV的方法，在檢測試樣中的病毒基因組和病毒抗體等方面，具有高於以往技術的實用性。下述列舉實施例具體示出本發明的實用性。
為了提高HEV的檢測方法和HEV感染的診斷技術，最好使這種新株的基因鹼基在序列信息反映在檢測體系和診斷體系內。
8.鹼基序列檢測用晶片根據本發明的方案時，可提供具有上述多核苷酸的鹼基序列檢測用晶片。例如，這些是螢光檢測用DNA晶片和電流檢測型DNA晶片等，但不限於這些。通過使用將上述多核苷酸或其互補鏈作為探針配置的鹼基序列檢測用晶片，進行病毒檢測，檢測方法既簡便又有效。鹼基序列檢測用晶片可按以下順序製作。
(a)螢光檢測用鹼基序列檢測用晶片的製作根據上述本發明的方案，將多核苷酸或具有其一部分序列的多核苷酸、或具有與這些序列互補的序列的多核苷酸固定在基板上。基板，例如可使用玻璃基板和矽基板等以前使用的任何基板。固定方法，可使用點測位儀(Spotter)等方法，使用一般的半導體技術的方法等，使用本技術領域人員公知的方法，進行固定。
(b)電流檢測型鹼基序列檢測用晶片的製作根據上述本發明的方案，將多核苷酸或具有其一部分序列的多核苷酸、或具有與這些序列互補助序列的多核苷酸，通過共價鍵、離子鍵、物理吸附或化學吸附等，固定在基板上，如電極基板上。電流檢測型DNA晶片的實例，是平成8年10月24日註冊的特許號第2573443號中的基因檢測裝置，但不限於此。本發明引用該文獻作為本發明的一部分。
根據本發明的方案，使用具有多核苷酸類的探針和基因序列檢測用晶片，進行病毒檢測，可既簡便又有效地進行其檢測。
9.蛋白質晶片根據本發明的方案1時，可提供能簡便實施上述檢測方法的蛋白質晶片。這種蛋白質晶片，是將識別上述多肽的抗體作為探針而配置的。利用這種蛋白質晶片，可簡便有效地檢測試樣中的HEV。對於蛋白質晶片，有螢光檢測用蛋白質晶片(一般也稱作螢光色素型蛋白質晶片)、和電流檢測型蛋白質晶片(一般也稱作電位型蛋白質晶片)等，並不限於此。以下示出了其製作順序實例。
(a)螢光檢測用蛋白質晶片的製作預先製備該多肽的單克隆抗體，將其固定在基板上。基板，例如可以是玻璃基板和矽基板等以前使用的任何基板。固定方法，使用點測位儀等方法等、利用一般的半導體技術的方法等，也可選擇其自身公知的任何方法。為進行檢測的標記物，可使用螢光物質、放射性同位素和色素等。
(b)電流檢測型蛋白質晶片的製作預先製作多肽的單克隆抗體，將其相對於一般電流檢測型DNA晶片用的基板，進行固定制造。
根據本發明的方案，若使用具有上述抗體的蛋白質晶片進行病毒檢測，該檢測可簡便有效進行。
改變上述抗體，製作將上述多肽固定在基板上的晶片，用該晶片，也可用於對該多肽進行檢測的抗體。
10.診斷體系使用根據上述的本發明形態的新型HEV株及多核苷酸和多肽，可診斷對象是否感染了HEV，和/或感染的是那一基因型，和/或對象是否感染了重症HEV。
這樣的診斷方法，例如，首先，用其自身公知的方法從對象採取樣品根據需要進行樣品精製和核酸擴增，進行精製得到核酸試樣。接著，使用根照本發明的多肽，例如，通過檢測有無標記的序列的擴增，檢測有無雜交，可進行最終目的診斷。將根據上述本發明的多肽用作抗體檢測用多肽，通過利用抗原抗體反應，進行最終目的診斷。
11.預防用疫苗根據本發明的方案1，可提供對HEV的疫苗。這樣的疫苗，可用來自含有對根據本發明新型HEV病毒鹼基序列進行編碼的核酸的來自HCV的免疫原性多肽的1種或多種的多肽進行調製。例如，可使用上述任何新型株的ORF2區域的多肽。製造含有免疫原性多肽的疫苗，可使用其自身公知的任何方法。
12.藥物設計來自上述新型HEV的基因信息，可用於抗病毒劑的開發和改進。例如，使用一般稱作「宿主基因組藥物從頭設計」的其自身公知的藥物設計法，可按以下方法進行。
(1)利用表達蛋白質的X射線晶體解析和/或NMR解析，實際測量對HEV基因組的ORF1進行編碼的多個酶蛋白質的三維結構。或者，只根據胺基酸序列信息，在計算機上進行模擬得到酶蛋白質的三維結構。以這些信息為基礎探索可成為藥物靶點的區域(以下記作「受體區域」)的候補。
(2)將以下化合物(以下記作「配體」)各自的三維結構輸入計算機，即，已判明抑制HEV ORF1蛋白質酶活性的藥物，已合成但抑制效果仍不清楚的化合物、已知結構式仍未合成的化合物，和具有新型結構式的虛構化合物。
(3)使用上述(2)的計算機，通過進行三維的擬合解析，確定上述(1)中得到的受體區域候補和上述(2)中得到的配體，是否能發生三維結合。由此選擇與受體區域的有效組合。或者，為具有更有效的擬合狀態，利用計算機對配體側的分子進行模擬改造。
(4)利用上述(3)的步驟獲得(即由上述步驟選擇或改造的)的配體，得到有效抑制或阻止HEV增殖的抗病毒劑。
HEV是富有多樣性的病毒。因此，為了對這種HEV全部株(或者，儘可能多的株)開發和/或改進能發揮等同有效性的抗病毒劑，必須獲得現存全部(或儘可能多的)HEV株的鹼基序列信息。根據上述的本發明一個側面，對於獲得這種鹼基序列信息，可提供有利的效果。
這樣的利用，對來自上述任何新型HEV的任何ORF1都可進行。根據這樣的方法獲得的藥物也包含在本發明範圍之內。
13.檢測試劑盒本發明還可提一套適宜的試劑盒，根據使用目的，將上述本發明任何形態的多核苷酸、多核苷酸片段、多核苷酸探針、多核苷酸引物、多肽、抗原和抗體，以適當的試劑盒提供。例如，多核苷酸和多核苷酸等，為了製造鹼基序列檢測用晶片，也可將基板和/或各種試劑和/或標記物質等組合，形成一套試劑盒。也可將多核苷酸探針與反應容器和/或緩衝液用鹽類和/或其他必要的試劑等組合形成一套試劑盒。例如，在多核苷酸引物時，與反應容器和/或緩衝液用鹽類和/或其他必要的試劑，如聚合酶和/或底物等組合形成一套試劑盒。然而根據本發明提供的試劑盒並不僅限於上述組合，根據需要可提供種種用劑和組合的試劑盒。對於使用目的也不僅限於此，也可形成對上述任何目的的試劑盒。這樣的試劑盒也包含在本發明範圍之內。
以下雖然記載了有關的根據本發明的HEV基因組的檢測實例，這種記載僅僅是以例示為目的，並不對本發明範圍構成限制。
例1，利用RT-PCR法檢測HEV基因組RNA1.引物在本例的RT-PCR中，使用具有從來自序列表中序列號1或2記載HEV-JRA1的鹼基序列中選出具有下述鹼基序列的4種寡核苷酸引物#HE5-1(5′-TCGATGCCATGGAGGCCCA-3′)(有義，與序列表1的nt19-37對應)(下線部相當於序列表中序列號2)#HE5-2(5′-GCCYTKGCGAATGCTGTGG-3′)(有義，與序列表1的nt105-123對應)(Y＝C或T；K＝G或T)(下線部相當於序列表中序列號3)#HE5-3(5′-TCRAARCAGTARGTGCGGTC-3′)(反義，與序列表1的nt450-469對應)(R＝A或G；)(下線部相當於序列表中序列號4)#HE5-4(5′-CATAGCCTCSGCRACATCAG-3′)(反義，與序列表1的nt541-560對應)(S＝G或C；R＝A或G)(下線部相當於序列表中序列號5)2.檢測方法首先，從來自患者的50μL血清用SMITEST EX RD(Genome ScienceLaboratories)提取核酸。對於該核酸添加反義引物#HE5-4，通過在聚合酶MMLV-RT(Stratagene)的存在下，37℃下反應30分鐘，進行cDNA合成(即，從RNA向DNA的逆轉錄反應)。
接著，對合成的cDNA，用上述4種引物和Fast Start Tag DNA Polymerase(Roche公司)進行nested PCR。溫度變化的條件設定，在95℃4分鐘之後連續30個循環{95℃30秒、55℃30秒、72℃45秒}，最後72℃7分鐘。使用瓊脂糖凝膠，對PCR反應產物進行電泳，研究有無365bp長度的來自HEV基因組的帶。
3.結果和討論圖7所示是對從日本人急性肝炎患者經時採取的血清樣品，利用上述方法檢測HEV基因組RNA的結果。圖7圖中示出了以肝炎過程為象徵的肝功能檢測數值的變化。圖中縮寫如下，AST表示天冬氨酸轉氨酶，ALT表示丙氨酸轉氨酶，Total bilirubin表示總膽紅素。圖7的照片表示與該圖對應時刻從該患者得到的血清中獲得PCR產物的電泳結果(即，RT-PCR利用逆轉錄聚合酶鏈反應法)。橫軸為入院後的天數。
在該病例中，如圖7，從發病初期在連續27天以上在血清中連續檢測HEV RNA。這是覆蓋以前常識的新見解。因為，可以認為在以前的常識中，從HEV RNA出現在血液中到AST、ALT和Total bilirubin達到峰值的時間極短(Purcell，R.H.In FieldsVirology，eds.Fields，B.N.，Knipe，D.M，Howley，P.M.Lippincott-Raven，Philadelphia，1996，3rd Ed.，Vol.2，pp.2831-2843)。這樣的結果暗示出得到根據本發明可以構建的靈敏度極高的HEV基因組RNA的檢測體系，進而，暗示出使用這樣的檢測體系所解析的臨床數據，對於有關HEV感染理論的理解會帶來更深遠的效果，具有相當的實用性。
例2，新型HEV株的分離對7例急性戊型肝炎患者進行試驗。分離出的JHA-Sap、JKK-Sap、JKN-Sap、JMY-Haw和JSY-Sap5個實例是住在北海道的患者，分離出的JAK-Sai和JMM-Sai2個實例是住在琦玉縣的患者。各個患者的病症，就時間和場所兩方面與其他患者無關連性，與局部地區流行也無關連。6例患者最近未出國旅行。只有分離出JMY-Haw的患者，該患者在患病症的1個月前去夏威夷旅行過。來自患者的血清樣品，在急性期採取，到進行病毒學解析，保持在-20℃以下凍結。
HEV序列，按照高橋等人的方法(Takahashi K，Iwata K，Watanabe N，etal.Virology 2001；2879-12)，在該方法中加進了若干改進。核酸樣品是使用市售核酸提取用試劑盒(SMITEST EX-RD；Genome Science Laboritories)從25ml血清中提取的。用莫洛尼小鼠白血病病毒逆轉錄酶(stratagene社制)在37℃30分鐘內合成第1股cNDA。作為反義引物，使用HE5-4(5′-CATAGCCTCSGCRACATCAG-3′；NT541-560)和HE5-5(5′-CATYGCCTCSGCAACATCGG-3′；nt541-560；各個核苷酸的位置相當於HEV-JRA1株的該位置核苷酸)的混合物。接著，對cDNA，進行nested聚合酶連鎖反應(以下記作PCR)。為了第1輪PCR，使用Fast Start Tag DNA Polymerase(Roche公司)、外側有義引物HE5-1(5′-TCGATGCCATGGAGGCCCA-3′；nt19-37)、和外側反義引物HE5-4/HE5-5(序列參照上述)的混合物。接著，為了第2輪PCR，使用內側有義引物HE5-2(5′-GCCYTKGCGAATGCTGTGG-3′；nt105-123)、內側反義引物HE5-3(5′-TCRAARCAGTARGTGCGGTC-3′；nt450-569)、和HE5-6(5′-TYAAAACAGTAGGTTCGATC-3′；nt450-469)的混合物，溫度變化的條件設定是在95℃4分鐘之後連續30個循環{95℃30秒、55℃30秒、72℃45秒}，最後是72℃7分鐘。
據此，對326-nt區域從HEV染色體的ORF1進行擴增。接著使用DyeTerminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit(PerKin-Elmer AppliedBiosystems社)和373A DNA測序儀(Applied Biosystem公司)，進行測序。
將這些從來自日本人分離株得到的序列與從各種國藉患者得到的分離株的序列進行比較。比較中，使用計算機軟體GENETYX-MAC version 10.1(SoftwareDevelopment社)。
圖14表示上述的比較結果。將其與326-ntORF1序列比較時，7個日本固有株，分成大的3個組。JMM-Sai序列與其他6個分離株具有73.0％到75.7％的同源性。JKN-Sap、JHA-Sap和JMY-Haw在組內具有95.4％～98.8％的同源性，其他組的分離株只有73.0％～79.1％的同源性。JSY-Sap、JKK-Sap和JAK-Sai相互具有89.0％～99.7％的同源性，對於其他4個株，只有74.8％～72.8％的同源性典型的JRA1株的全長基因組對這些分離株也只有不足90％的同源性。
例3，HEV的全部檢測首先，從數名患者採血。從來自各患者50μL血清的SMITEST EX RD(GenomeScience Latoratories)中提取核酸。對這些核酸，作為有義引物添加5′-gcagaccacrtatgtgktcg-3′(序列號32)和5′-ccacrtatgtggtcgaygcc-3′(序列號33)，和作為反義引物添加5′-acmarctgscgrggytgcat-3′(序列號34)和5′-cgytgratwggrtgrttcca-3′(序列號35)。將這些在聚合酶MMLV-RT(stratagene)的存在下，在37℃反應30分鐘，進行cDNA合成(即，從RNA向DNA的逆轉錄反應)。
對於合成的各個cDNA，具有作為有義引物的5′-tgktcgaygccatggaggc-3′(序列號36)、5′-tgktcgaygccatggaggc-3′(序列號37)和5′-aygccatggaggcccaycag-3′(序列號38)、和作為反義引物的5′-ckracyaccacagcattcgc-3′(序列號39)和5′-ggcckracyaccacagcatt-3′(序列號40)，使用Fast Start Tag DNA Polymerase(Roche社)進行nested PCR。溫度變化的條件設定是在95℃4分鐘後連續30次循環{95℃30秒、55℃30秒、72℃45秒}，最後是72℃7分鐘。PCR反應產物，用瓊脂糖凝膠進行電泳。
結果，利用如上述本例的方法，對37例中8例得到擴增產物。關於利用電泳得到帶的8例，將得到帶模擬示於圖22。如圖22所示，於不同的位置觀察各樣品得到的帶。由此暗示出進行幾種組合這8個例使用的數種引物，對樣品中的HEV基因組都起作用，可進行擴增。即，暗示出從HEV陽性患者檢測出的HEV基因型不同。
對於非甲乙丙型急性肝炎患者37例樣品，分別進行擴增反應。將擴增結果，利用以前方法獲得的結果和利用本例方法得到的結果，匯總示於圖20。圖20中「採血日」的項目，示出了從各患者採血的日期，其右鄰的羅馬字母是患者名字的首字母。圖中「Sample No」是院內通用的樣品號。圖中「以前」的項目表示用以前的引物擴增時，有無HEV病毒的檢出，「本例」的項目表示利用本例方法有無HEV的檢出。在這些試驗中，檢測出HEV時，記作「+」，沒有檢測出時，記作「-」。如圖20所示，在用以前的引物進行同樣擴增和電泳時，關於沒有檢測出的病毒株，利用本例方法可檢測出。
例4對1個患者的追蹤調查關於患有急性戊型肝炎的患者，不斷地測定其血液中存在的病毒。測定方法，使用根據上述例3中示出的方法的按照本發明形態的方法，和例3中示出的以前方法。結果示於圖21。圖中最左側的項目表示採血日。其右鄰的數字是該患者入院日開始的天數。圖中「Sample No」是院內通用的樣品號。圖中「以前」的項目表示使用以前的引物擴增時有無檢測出HEV病毒，「本例」的項目表示利用本例的方法有無檢測出HEV。在這些試驗中，檢測出HEV時記作「+」，未檢測出時記作「-」。
根據本發明的方案，使用引物時的一方，可檢測出比利用以前的方法檢測出更少的病毒。
例5，HEV的分型以下使用如下探針固定化板，對例3中得到的各個擴增產物進行分型。
(1)探針固定化板在市售的微型滴定板的孔中，分別將53mer的探針(5′-aaggctcctggcrtyactactgcyatwgagcaggcwgctctrgcwgcggccaa-3′)、HEV-I，II用探針(5′-ctcctggcatcactactgc-3′)和HEV-III用探針(5′-ctcctggcattactactgc-3′)、HEV-IV用探針(5′-ctcctggcgtcactactg-3′)形成固相。
(2)利用雜交分析進行分型對於上述(1)中準備的探針固定化板，添加例3中得到的各個擴增產物，進行雜交。接著測定各個孔的吸光度(O.D)。
結果示於圖23A～圖23E。圖23A的圖、圖23B的圖、圖23C的圖、圖23D的圖和圖23E的圖，分別示出了對具有不同基因型的HEV，即JRA1株、JKN-Sap株、JKK-Sap株、JKK-Sap株、JAK-Sai株、JMM-Sai株進行分型的結果。各圖的橫軸，從左開始依次是HEV-I、II固相孔、HEV-III固相孔、HEV-IV(54mer引物)固相孔。基因型III的情況，只由HEV-III用探針形成固相孔的O.D高於其他的孔。基因型IV的情況，只用HEV-IV用探針形成固相孔的O.D高於其他的孔。基因型I的情況，V-I，II固相孔的O.D高於其他的孔。將這些指標作為基礎，使用該探針對患者血清中的病毒進行分型。其結果示於圖20中的「genotype」項目內。如從該結果知道的那樣，可以證明，使用按照本發明形態的探針，能很容易地對從患者採取的HEV進行分型。
此處引用的文獻，其全部內容引入本說明書內。
進一步的利益和變更，本技術領域中的人員是很容易想到的。因此，其更寬範圍內，本發明不受此處示出且記載的詳細和代表形態所限定。因此，在不脫離由權利要求範圍和它們的等同物所限定的全體發明思想的精神和範圍下，下進行種種變更。
序列表序列表110株式會社東芝120日本人戊型肝炎病毒多核苷酸探針和引物，檢測晶片、試劑盒，以及檢測方法13002S0741P140PCT/JP02/063651412002-6-25150JP2001-1918371512001-6-251605721012115138212DNA213戊型肝炎病毒JRA14001ggcagaccac gtatgtggtc gatgccatgg aggcccacca gttcattaag gctcctggca 60ttactactgc catagagcag gctgctctgg ctgcggccaa ctccgccttg gcgaatgctg 120tggtggttcg gccgtttttg tctcgcgtac aaaccgagat ccttattaat ttgatgcaac 180cccggcagtt ggttttccgc cctgaggtgc tttggaacca tcctattcag agggttatac 240acaatgaatt agaacagtac tgccgggccc gggccggtcg ttgcctggag attggggctc 300atccaagatc tattaatgat aaccccaatg ttttgcaccg gtgttttctc aggccggtcg 360gtagggacgt ccagcgctgg tattctgccc ccacccgcgg ccctgcagcc aactgccgcc 420gctctgcatt gcgtggcctc ccccctgtcg accgcactta ctgttttgat ggattttcca 480gttgtgcttt cgccgcagag accggcgtgg ccctttactc tctacatgac ctttggccag 540ctgatgttgc ggaggctatg gcccgccatg gaatgacacg tctttatgct gcactccacc 600tccctcccga ggtgttgtta ccacccggta cttaccacac aacctcgtat cttctgatcc 660atgacggcaa ccgtgctgtt gtgacttatg aaggtgatac tagtgcaggt tacaaccatg 720acgtttccat 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gaccccagag tgctcgtctt tgatgagtca gtgccctgcc 1380gctgtaggac tttcttaaag aaggttgcgg gtaaattctg ttgcttcatg cggtggttag 1440ggcaggagtg tacttgtttc ttagaaccag ctgagggctt agttggcgat caaggccatg 1500ataatgaggc ttatgagggt tctgaggttg accaggccga gcctgtacac cttgatgtgt 1560cggggaccta tgctgtccac gggcaccagc ttgaggccct ctacagggca ctcaacattc 1620cacacgatat tgctgctcga gctgcccgat taacggctac tgttgagctc gctgcaggcc 1680ccgaccgtct ggagtgccgc accgtgctcg ggaacaagac tttccggacg acggtgactg 1740atggcgccca tctagaagcg aacggccctg agcaatatgt tctgtcgttc gatgcctccc 1800gccagtctat gggggccggg tcccatagcc tcacttacga gcttacaccc gccggcttgc 1860aggttaagat ctcatctaat ggcctagact gcactgccgt attcccccct ggtggcgccc 1920ctagcgcgcc gccgggggag gtggcggctt tttgcagcgc cctctacagg tataacagat 1980tcacccagcg gcattcgctg accggcggtt tgtggctaca tcccgagggg ttgctaggcg 2040ttttcccccc tttttcccct gggcacattt gggagtctgc caaccccttc tgcggtgagg 2100gtaccttgta tactcgcacc tggtctacat ctggtttttc tagtgacttt tcccctcctg 2160aggcggccgc ccctgcaccg gctgccgccc 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權利要求
1.一種多核苷酸探針，含有用於檢測戊型肝炎病毒的多核苷酸的至少8個核苷酸的連續序列，其特徵是(1)該至少8個核苷酸形成的連續序列是，與上述戊型肝炎病毒的多核苷酸進行雜交，用於通過這種雜交檢測戊型肝炎病毒的序列，(2)該至少8個核苷酸的連續序列，可由序列號11、序列號44、序列號45、序列號46、序列號47和序列號48中記載的鹼基序列及它們的互補鏈中選出的序列中獲得。
2.根據權利要求1記載的多核苷酸探針，其特徵是上述至少8個核苷酸的連續序列是由對HCV的非結構蛋白和核殼蛋白進行編碼的核苷酸序列或其序列的互補鏈中獲得。
3.具有權利要求1記載的多核苷酸探針的探針檢驗試劑盒。
4.根據權利要求1記載的多核苷酸探針，其特徵是至少8個核苷酸的連續序列，是從序列號15的19位到37位，序列號15的52位到69位、序列號15的77位到95位、序列號15的111位到127位、序列號15的174位到181位、序列號15的213位到220位、序列號15的48位到100位，及它們的互補序列中選出。
5.根據權利要求1記載的多核苷酸探針，其特徵是上述戊型肝炎病毒是重症戊型肝炎引發性，上述(2)中選出的至少8個核苷酸的連續序列，可從序列號11中記載的鹼基序列獲得。
6.根據權利要求1記載的多核苷酸探針，其特徵是上述戊型肝炎病毒是重症戊型肝炎，上述(2)中選出的上述至少8個核苷酸的連續序列是從序列號9和序列號10中選擇的。
7.一種檢測樣品中戊型肝炎病毒存在的方法，其特徵是包括如下步驟(1)由對象獲得樣品，(2)將上述(1)得到的樣品與權利要求1記載的多核苷酸探針進行反應、(3)檢測由上述(2)反應生成的雙鏈，(4)從上述(3)的檢測結果，判定上述樣品中是否存在戊型肝炎病毒。
8.一種檢測樣品中存在重症戊型肝炎病毒的方法，其特徵是包括如下步驟(1)由對象獲得樣品，(2)將上述(1)得到的樣品和權利要求6中記載的多核苷酸探針進行反應、(3)檢測由上述(2)反應生成的雙鏈，(4)從上述(3)的檢測結果，判定上述樣品中是否存在戊型肝炎病毒。
9.一種確定樣品中戊型肝炎病毒基因型的方法，其特徵是具有如下步驟(1)使樣品與權利要求1記載的多核苷酸探針反應，(2)檢測由上述(1)反應生成的雙鏈，(3)從上述(2)的檢測結果，判定上述樣品中存在戊型肝炎病毒的基因型。
10.將權利要求1記載的多核苷酸探針固定化的鹼基序列檢測用晶片。
11.將權利要求6記載的多核苷酸探針固定化的鹼基序列檢測用晶片。
12.一種1對至數對PCR用引物，是用於對戊型肝炎病毒的多核苷酸進行擴增的1對至數對PCR用引物，該1對至數對PCR引物各自獨立，至少具有8個核苷酸的連續序列，其特徵如下(1)由該至少8個核苷酸形成的連續序列是與上述戊型肝炎病毒的多核苷酸進行雜交，用於通過這種雜交，對戊型肝炎病毒的多核苷酸的一部分進行擴增的序列，(2)該至少8個核苷酸連續的序列是從序列號11、序列號44、序列號45、序列號46、序列號47和序列號48及它們的互補鏈中選出的序列中獲得。
13.根據權利要求12記載的1對至數對PCR用引物，其特徵是上述至少8個核苷酸連續序列是從HCV的核殼蛋白進行編碼的核苷酸序列或其序列的互補鏈中獲得。
14.具有權利要求12中記載1對至數對的PCR用引物的PCR檢驗試劑盒。
15.根據權利要求12記載的1對至數對PCR用引物，其特徵是上述至少8個核苷酸的連續序列是從序列號15的19位到37位、序列號15的52位到69位、序列號15的77位到95位、序列號15的111位到127位、序列號15的174位到181位、序列號15的213位到220位，序列號15的48位到100位、及它們的互補序列中選出的。
16.根據權利要求12記載的1對至數對PCR用引物，其特徵是上述戊型肝炎病毒是重症戊型肝炎，上述(2)中選擇的至少8個核苷酸的連續序列是從序列號11記載的鹼基序列中獲得的。
17.根據權利要求12記載的1對至數對的PCR用引物，其特徵是上述戊型肝炎病毒是重症戊型肝炎，上述(2)中選擇的至少8個核苷酸的連續序列，是從序列號9和序列號10中選出的。
18.一種檢測樣品中戊型肝炎病毒存在的方法，其特徵是包括以下步驟(1)由對象獲得樣品，(2)在獲得適當擴增的條件下，使由上述(1)得到的樣品、權利要求12記載的一對至數對的PCR用引物和聚合酶進行反應，(3)檢測由上述(2)反應得到的擴增產物的存在，(4)從上述(3)的檢測結果，判定上述樣品中是否存在戊型肝炎病毒。
19.一種檢測樣品中重症戊型肝炎病毒存在的方法，其特徵是包括以下步驟(1)由對象獲得樣品，(2)在獲得適當擴增的條件下，使由上述(1)得到的樣品、權利要求17記載的1對至數對的PCR用引物和聚合酶進行反應，(3)檢測由上述(2)反應得到的擴增產物的存在，(4)從上述(3)的檢測結果，判定上述樣品中是否存在戊型肝炎病毒。
20.一種確定樣品中戊型肝炎病毒基因型的方法，其特徵是(1)在獲得適當擴增的條件下，使樣品和權利要求12記載的一對PCR用引物和聚合酶進行反應(2)確定由上述(1)反應獲得的擴增產物長度(3)由上述(2)的結果，判定上述樣品中存在戊型肝炎病毒的基因型。
全文摘要
一種多核苷酸探針，其特徵是用於檢測戊型肝炎病毒的多核苷酸的至少含有8個核苷酸連續序列的多核苷酸探針，至少由8個核苷酸形成的連續序列是與上述戊型肝炎病毒的多核苷酸進行雜交，由此檢測戊型肝炎病毒的序列。
文檔編號C07H21/04GK1455814SQ02800130
公開日2003年11月12日 申請日期2002年6月25日 優先權日2001年6月25日
發明者高橋和明, 三代俊治, 太田裕彥, 橋本美智惠, 前久保博士 申請人:株式會社東芝