一種菝葜皂苷元含量的elisa測定方法
2023-04-24 13:28:21 2
專利名稱：一種菝葜皂苷元含量的elisa測定方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測菝葜皂苷元(Sarsasapogenin，簡寫SAR)含量的方法，具體 說來就是用酶聯免疫的分析方法定量檢測藥材及相關樣品中SAR的含量，此方法特別適合 於大批量樣本中SAR含量的快速檢測。屬於酶聯免疫領域的一種新的快速檢測方法。
背景技術：
知母為百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge.的乾燥根莖。SAR為知 母中的代表性留體皂苷元，具有多種藥理活性，能提高記憶，抗抑鬱，抗腫瘤。由於SAR無紫外吸收，目前對其的檢測方法主要是比色法、薄層掃描法和高效液 相色譜-蒸發光散射檢測法(HPLC-ELSD)。這些方法靈敏度低，步驟繁瑣耗時，制約了該微 量成份的快速分析檢測，也制約了其在體內作用機理方面的深入研究。比色法檢測易受糖 類等物質的幹擾，誤差大，只能測定能被顯色劑顯色的總皂苷類成分，無法用於藥材鑑定、 中藥複方及生物樣品中該類化合物的測定；HPLC-ELSD對皂苷類的檢測前期處理程序復 雜，靈敏度較低，且需要樣品與雜質的分離，難以滿足該類成分吸收、代謝等研究；高效液相 色譜-紫外檢測器(HPLC-UV)方法採用末端吸收測定，幹擾大，不易獲得準確結果。因而目 前的檢測方法難以滿足該類成分在藥材、複方及體內過程中快速、微量特異性檢測的需求， 嚴重製約了含此活性成分藥物的質量控制、作用機理等方面的研究，至今國內外對這類化 合物吸收、代謝、分布及其作用機制研究鮮有報導。ELISA這種新的分析方法，具有靈敏、快速、樣品前處理簡單，利於批量測定的優 點。這種新的分析方法，不需要高效液相色譜、液質聯用等儀器分析中對樣品前處理的要 求，也不需高效液相分析中樣品與雜質分離。因而它的優勢是比HPLC-ELSD更加靈敏，省時 方便，尤其是在大批量樣品的分析中。建立SAR快速、微量特異性檢測方法，對於含有該活 性成分中藥及複方質量控制和臨床用藥監測、探索SAR作用機理及研究化學成分清晰、作 用機理明確的現代中藥具有重要的理論和現實意義。
發明內容
本發明要解決技術問題是為了克服現有分析技術的不足，提供一種靈敏、快速、 有效的檢出SAR的方法。本發明所解決的問題1.知母藥材中SAR含量的ELISA檢測方法。2.藥材中SAR的含量測定及生物樣本中微量測定。3.現有分析方法靈敏度低，步驟繁瑣的問題。實現本目的的方法載體蛋白與SAR偶聯形成的完全抗原用於免疫動物，另一種 載體蛋白與SAR偶聯形成的完全抗原用作固相抗原間接競爭酶聯免疫法測定藥材中SAR的含量。本發明SAR含量的ELISA測定方法，其特徵在於主要步驟如下
第一步、琥珀酸酐和SAR反應使SAR羧基化；第二步、採用活潑酯法將SAR琥珀醯衍生物與N，N' _ 二環己基碳醯亞胺，N-羥基 丁二醯亞胺，在N，N-二甲基甲醯胺中攪拌反應2-8小時，最後與10-50mg載體蛋白攪拌反 應4-48小時，生成免疫抗原；第三步、用免疫抗原免疫動物，獲得SAR的多克隆抗體；第四步、檢測抗體效價；第五步、建立間接競爭ELISA分析方法，用此方法檢測中藥材及相關樣品中SAR的含量。其中，第一步包括以下步驟A. SAR 10-200mg，琥珀酸酐 0. l_4g，吡啶 l_2mL 60_100°C水浴反應 4-10 小時；B.反應後產物經過溶劑萃取，凝膠柱純化，得到白色粉末。所述第二步中，載體蛋白為牛血清白蛋白，羧基化後的SAR與牛血清白蛋白偶聯 產物作為免疫抗原。所述第二步中，載體蛋白為卵清白蛋白，羧基化後的SAR與卵清白蛋白偶聯產物 作為檢測抗原。本發明採用琥珀酸酐法將SAR衍生化成SAR琥珀醯酯，再採用活潑酯法與牛血清 白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)分別偶聯成完全抗原後免疫紐西蘭大耳兔，產生多克隆 抗體。以SAR偶聯OVA的作為包被抗原，SAR偶聯BSA的作為免疫抗原，間接ELISA法檢 測抗體的效價，間接競爭ELISA方法作為檢測樣品中SAR含量的方法。此ELISA分析方法 檢測的線性範圍為20 1311ng/mL。與其它結構類似的甾體皂苷元有一定程度的交叉反 應。SAR加樣回收實驗表明重複性好、準確度高、達到生物分析的要求。且此測定含量方法 與HPLC-ELSD具有良好的相關性。在本發明的第一方面，提供一種SAR完全抗原的合成方法。在本發明的第二方面，提供一種免疫球蛋白，其特徵在於，是一種能特異性結合 SAR的多克隆抗體，此免疫球蛋白來源於兔。在本發明的第三方面，提供了一種基於此多克隆抗體的ELISA檢測方法。在本發明的第四方面，提供了基於此SAR多克隆抗體的ELISA檢測方法的用途，它 被應用於含有SAR的樣品如中藥知母、大鼠血漿等樣品中SAR含量的測定。在本發明的基礎上，可製備成皂苷元ELISA檢測試劑盒，用於大批量樣本的快速、 簡便的檢測。本發明具有以下優點1.檢測的靈敏度高，所需樣品量少。2.檢測過程簡化，檢測時間短，尤其適合大批量樣品的同時檢測。3.儀器設備成本低，只需酶標儀，因此投入少、成本低。本發明可為質檢部門，加工生產企業提供大批量檢測藥材中SAR含量的方法。
圖1是大鼠灌胃SAR後血藥濃度隨時間變化曲線
具體實施例方式材料試劑琥珀酸酐(國藥集團化學試劑有限公司)，N，N' - 二環己基碳醯亞胺(簡 稱DCC)、N-羥基丁二醯亞胺(簡稱NHS)、弗氏不完全佐劑、弗氏完全佐劑均為Sigma產品， SAR(純度> 98%，購自蕪湖甙爾塔醫藥科技公司)，HRP標記羊抗兔IgG購自北京中杉金 橋，TMB為Amresco產品。甲醇為色譜純，N, N- 二甲基甲醯胺(簡稱DMF)購自江蘇永華精 細化學品有限公司。動物紐西蘭大耳兔購自南通大學實驗動物中心，SD大鼠購自揚州大學比較醫學 中心。菝葜皂苷元酶聯免疫分析方法的建立過程和檢測過程如下實施例1抗SAR多克隆抗體的製備1.完全抗原的合成(1) SAR與BSA偶聯產物的製備(用於免疫動物)SAR 50mg, 丁二酸酐lg，lml吡啶沸水浴回流8小時，產物用氯仿溶解，水萃取3次 (每次25mL)，收集合併氯仿層。再用活潑酯法將SAR琥珀醯衍生物(SAR-HS)分別和BSA 和OVA偶聯。具體方法為:SAR-HS 12mg, DCC 19mg, NHS 13mg, lml的DMF中室溫磁力攪拌 反應4小時。此反應產物加到含有30mgBSA的lOmlPBS中，室溫磁力攪拌反應過夜。反應 後的產物經雙蒸水4度透析72小時，凍幹即得SAR-HS-BSA的複合物。(2) SAR與OVA偶聯產物的製備(用作ELISA檢測抗原)SAR 50mg, 丁二酸酐lg，lml吡啶沸水浴回流8小時，產物用氯仿溶解，水萃取3次 (每次25mL)，收集合併氯仿層。再用活潑酯法將SAR-HS分別和BSA和OVA偶聯。具體方 法為SAR-HS 12mg, DCC 19mg, NHS 13mg, lml的DMF中室溫磁力攪拌反應4小時。此反應 產物加到含有23mg0VA的lOmlPBS中，室溫磁力攪拌反應過夜。反應後的產物經雙蒸水4°C 透析72小時，凍幹即得SAR-HS-BSA的複合物。2.多克隆抗體的製備紐西蘭大耳兔，皮下多點注射lmg SAR-HS-BSA和弗氏完全佐劑混合後的乳劑。此 後的加強免疫劑量同上，注射SAR-HS-BSA和弗氏不完全佐劑混合後的乳劑。加強免疫後的 第10天取血測效價。6次免疫後，收集兔血清。3.抗體效價的檢測採用間接ELISA方法1)包被抗原包被酶聯板，4°C過夜。2)棄去板中液體，PBST洗3遍後，封閉液封閉1小時。3)棄去板中液體，PBST洗3遍後，加入從1 1000開始倍比稀釋的抗血清，37度 反應2小時。4)棄去板中液體，PBST洗3遍後，加入HRP標記的羊抗小鼠IgG，37度反應1小 時。5)棄去板中液體，PBST洗3遍後，加底物溶液，37度避光顯色20分鐘。6) 2M H2S04終止反應。酶標儀450nm讀數。根據抗體效價判定原則陽性(P)，陰性(N)，P/N > 2. 1，P-N > 0. 2，6免後抗體效價達到32000。實施例2間接競爭ELISA分析方法的建立1. ELISA檢測線性範圍的確定1)包被抗原包被酶聯板，4°C過夜。2)棄去板中液體，PBST洗3遍後，封閉液封閉1小時。3)棄去板中液體，PBST洗3遍後，同時加入SAR標準品配成的5000ng/mL, lOOOng/ mL，500ng/mL, lOOng/mL, 50ng/mL, lOng/mL, 5ng/mL 的各濃度梯度溶液和 SAR 多克隆抗體， 37度反應2小時。4)棄去板中液體，PBST洗3遍後，加入HRP標記的羊抗兔IgG，37度反應1小時。5)棄去板中液體，PBST洗3遍後，加底物溶液，37度避光顯色20分鐘。6) 2M H2S04終止反應。酶標儀450nm讀數。加入競爭藥物SAR時的吸光值為B，不加SAR的吸光值為By B/B0為縱坐標，競爭 藥物濃度的對數值為橫坐標，得到競爭抑制曲線。以lnGB/B^/d-B/Bj)為縱坐標，競爭 藥物濃度的對數值為橫坐標作圖，得到直線方程y = -1. 5337x+3. 3954，在20 1311ng/ mL範圍內線性良好，R2 = 0. 9868。2.多克隆抗體特異性分析按上述3中的方法，將第3步反應的各濃度的SAR標準品替換成其它結構類似的 標準品，其它步驟同上。抗體的交叉反應測定結果如下表1菝葜皂苷元多克隆抗體交叉反應實驗 3. ELISA檢測方法與HPLC-ELSD檢測方法的相關性色譜條件採用Diamonsil 柱(250X4. 6mm，5ii) ；Shimadzu LC-10A型高效液相色 譜儀；Alltech 2000ES型蒸發光檢測器。甲醇-水(95 5)為流動相；流速為l.OmL/min;漂移管溫度63 °C ；載氣流 速1. 7L/min。對照品溶液稀釋成濃度為 100 u g/mL, 150 u g/mL, 200 u g/mL, 250 u g/mL 300 u g/mL, 350 u g/mL的溶液，用HPLC-ELSD測定，此各濃度溶液稀釋500倍後，用ELISA測 定，考察ELSD測定值和ELISA測定值之間的相關性。各濃度梯度樣品ELISA測定結果與ELSD的測定結果基本一致，具有相關性，相關性方程為 y = 1. 0108x-ll. 711，R2 = 0. 9853。實施例3中藥知母中SAR含量的ELISA測定1.知母藥材處理方法取知母藥材，粉碎，過60目篩，精密稱取藥材粉末0. Sg，置具塞錐形瓶中，加入甲 醇25mL，靜置過夜，超聲處理40min，過濾，精密量取續濾液10mL，加入10%鹽酸加熱回流2 小時，提取液加入40% NaOH中和。氯仿萃取兩次，每次30mL。合併氯仿層，回收溶劑，殘渣 用甲醇溶解定容至2mL。2.重複性試驗精密稱取知母藥材粉末0. 5g，平行6份，按知母藥材處理方法製備供試品溶液，間 接競爭ELISA法測定含量，計算6份藥材含量之間的RSD值。同一來源知母樣品6份，測得 SAR 含量為 0. 6%, RSD 值為 3. 7%03.加樣回收試驗精密稱取知母藥材粉末0. 25g，平行9份，置具塞錐形瓶中，精密加入SAR標準品 0. 9mg、l. 5mg、2. lmg,製備供試品溶液，間接競爭ELISA方法測定含量，計算回收率和日內 精密度。同時精密稱取知母藥材粉末0.25g，連續3天精密加入0.9mg SAR，測定含量，計算 日間變異係數。表2ELISA測定SAR加樣回收率(n = 3) a SAR測量值為3份樣品的平均值士 SD ；b相對標準偏差；c加樣回收率計算公式回收率(％ )=(測定值-1.5)/添加量X 1004.知母藥材中SAR含量測定不同產地知母藥材樣品處理方法如上所述，各樣品溶液用ELISA方法和ELSD方法 同時測定。間接競爭ELISA測定含量步驟如下1)包被抗原包被酶聯板，4°C過夜。2)棄去板中液體，PBST洗3遍後，封閉液封閉1小時。3)棄去板中液體，PBST洗3遍後，同時加入SAR標準品配成的標曲各濃度梯度溶 液，適當稀釋的待測樣品和SAR多克隆抗體，37度反應2小時。4)棄去板中液體，PBST洗3遍後，加入HRP標記的羊抗兔IgG，37度反應1小時。5)棄去板中液體，PBST洗3遍後，加底物溶液，37度避光顯色20分鐘。6) 2M H2S04終止反應。酶標儀450nm讀數。每份樣品檢測3次取平均值，根據樣品稀釋倍數和0D值，由標準曲線計算出樣品 的含量。每塊96孔板，可同時檢測20份以上的樣品。測定結果如下表
表3ELISA和HPLC-ELSD方法測定不同產地知母藥材中SAR含量(又士SD) 實施例4大鼠血漿中SAR含量測定1.血漿標曲的建立10 PL不同濃度的SAR標準品溶液加入到大鼠空白血清中，渦旋儀上渦旋混合 20s,配成 5000ng/mL，1000ng/mL, 500ng/mL, 100ng/mL, 50ng/mL, lOng/mL 的血漿標曲溶液。 血漿標曲的ELISA建立步驟1)包被抗原包被酶聯板，4°C過夜。2)棄去板中液體，PBST洗3遍後，封閉液封閉1小時。3)棄去板中液體，PBST洗3遍後，同時加入SAR標準品配成的血漿標曲各濃度梯 度溶液和SAR多克隆抗體，37度反應2小時。4)棄去板中液體，PBST洗3遍後，加入HRP標記的羊抗兔IgG，37度反應1小時。5)棄去板中液體，PBST洗3遍後，加底物溶液，37度避光顯色20分鐘。6) 2M H2S04終止反應。酶標儀450nm讀數。以血漿中加入競爭藥物SAR時的吸光值為B，不加SAR的吸光值為By B/B0為縱 坐標，競爭藥物濃度的對數值為橫坐標，得到競爭抑制曲線。以lnGB/B^/d-B/Bj)為 縱坐標，競爭藥物濃度的對數值為橫坐標作圖，得到直線方程y = -1. 1097x+1.8125，在 2. 4-763ng/mL 範圍內線性良好，R2 = 0. 9879。2.血漿加樣回收實驗200iiL空白大鼠血漿中，添加lOiiL的SAR標準品，使配成終濃度為500ng/mL， 100ng/mL，10ng/mL的血漿樣品溶液。採用間接競爭ELISA方法測定。此各濃度樣品連續3 天測定。計算日內日間精密度以及回收率。結果如表4所示表4ELISA測定大鼠血漿中SAR含量的精密度和準確度 a測定值=平均值士 SD(n = 6)b回收率=SAR測定值/SAR添加量X100%c變異係數3.大鼠灌胃SAR後血漿中SAR含量測定SD大鼠6隻，提前12小時禁食，口服灌胃SAR100mg/kg,分別於給藥後0.5,1,2,4, 6，8，10，12，24，48，72h取血。血漿樣本8000rpm離心10分鐘，上層血清_20°C保存。採用 上述間接競爭ELISA方法測定血藥濃度，計算的藥代動力學參數如表5所示，血藥濃度隨時 間變化見附圖。表5大鼠灌胃SAR100mg/kg後藥代動力學參數
權利要求
一種菝葜皂苷元含量的酶聯免疫(ELISA)測定方法，其特徵在於主要步驟如下第一步、琥珀酸酐和菝葜皂苷元反應使菝葜皂苷元羧基化；第二步、採用活潑酯法將菝葜皂苷元琥珀醯衍生物與N，N′-二環己基碳醯亞胺，N-羥基丁二醯亞胺，在N，N-二甲基甲醯胺中攪拌反應2-8小時，最後與10-50mg載體蛋白攪拌反應4-48小時，生成免疫抗原；第三步、用免疫抗原免疫動物，獲得抗菝葜皂苷元的多克隆抗體；第四步、檢測抗體效價；第五步、建立間接競爭ELISA分析方法，用此方法檢測中藥材及相關樣品中菝葜皂苷元的含量。
2.根據權利要求1所述的菝葜皂苷元含量的ELISA測定方法，其特徵是所述第一步 包括以下步驟A.菝葜皂苷元10-200mg，琥珀酸酐0.l_4g，吡啶l_2mL，60_100°C水浴反應4_10小時；B.反應後產物經過溶劑萃取，凝膠柱純化，得到白色粉末。
3.根據權利要求2所述的菝葜皂苷元含量的ELISA測定方法，其特徵是所述第二步 中，載體蛋白為牛血清白蛋白，羧基化後的菝葜皂苷元與牛血清白蛋白偶聯產物作為免疫 抗原。
4.根據權利要求2所述的菝葜皂苷元含量的ELISA測定方法，其特徵是所述第二步 中，載體蛋白為卵清白蛋白，羧基化後的菝葜皂苷元與卵清白蛋白偶聯產物作為檢測抗原。
5.根據權利要求1所述的菝葜皂苷元含量的ELISA測定方法，其特徵是其檢測過程 是包被酶標板，封閉酶標板，酶標板中加入待測藥物和抗體，加入酶標二抗，底物顯色，終止 反應測定吸光值包含有能特異性識別菝葜皂苷元的免疫球蛋白。
6.根據權利要求5所述的菝葜皂苷元含量的ELISA測定方法，其特徵是所述免疫球 蛋白來自兔。
7.根據權利要求1所述的菝葜皂苷元含量的ELISA測定方法，其特徵是第五步所述 的分析方法為間接競爭ELISA。
全文摘要
本發明公開了檢測菝葜皂苷元含量的酶聯免疫分析方法，涉及菝葜皂苷元抗體的製備，酶聯免疫分析方法的建立及其在含有菝葜皂苷元中藥材或相關樣品含量測定中的應用。本發明用與載體蛋白偶聯的菝葜皂苷元作為完全抗原，獲得針對抗菝葜皂苷元的抗體，並且用於藥材及相關樣品中菝葜皂苷元含量的測定。目的是提供一種新的菝葜皂苷元檢測分析方法。本分析方法靈敏度高，樣品前處理簡單，測定過程簡便，快速，適合於研究單位，檢驗部門，貿易大批量樣品分析檢測的需要。
文檔編號G01N33/566GK101852801SQ20101017182
公開日2010年10月6日 申請日期2010年5月14日 優先權日2010年5月14日
發明者餘伯陽, 劉吉華, 王晶 申請人:中國藥科大學