用於卵巢癌的生物標記的製作方法
2023-04-25 04:50:16
專利名稱：用於卵巢癌的生物標記的製作方法
相關申請本發明主張2004年12月1日申請的美國臨時申請案第60/632,474號和2004年3月31日申請的美國臨時申請案第60/558,422號的專利權利，該兩案所揭示的內容以引用方式併入本文中。
技術領域：
本發明提供用於測量卵巢癌有重要意義的生物標記。該等生物標記可利用SELDI分析方法將患有卵巢癌病患的血清蛋白指紋圖譜與健康個體的血清蛋白指紋圖譜區分開來。本發明是與生物標記有關的系統及方法，其中所述的生物標記是可用於定性卵巢癌狀態。本發明也將所述的生物標記識別為已知的蛋白質。
背景技術：
在發達國家中，卵巢癌為最致命婦科惡性腫瘤的一者。僅在美國，每年大約有23,000名婦女診斷有該疾病，其中14,000名婦女死於該疾病。(請參閱Jamal，A.，et al.，CACancer J.Clin，2002；5223-47)。儘管癌症治療技術有很大進步，卵巢癌死亡率在過去二十年(Id.)實際上保持不變。由於診斷卵巢癌的階段越早、存活的可能性迅速升高，因此早期發現仍然是提高卵巢癌病人長期存活可能性的最重要因素。
由於晚期診斷出來的卵巢癌的預診斷性差、與經證實的診斷過程有關的高費用和高風險性、以及於一般民眾人口中相對低的普遍率，因而非常迫切需要一種可於一般民眾中用於篩檢卵巢癌的高靈敏度和高特異性的檢測方法。
適用於癌症早期發現和診斷的腫瘤標記的識別對於提高病人的臨床結果具有很大前景。對於病徵模糊或沒有病徵的病人或對於不可接受物理檢測的腫瘤來說尤為重要。雖然在早期發現上付出大量努力，但是目前還沒有一種花費低且有效的篩檢方法(請參閱Paley PJ.，Curr OpinOncol，2001；13(5)399-402)，而且診斷時患有癌症婦女體內的癌細胞通常都已擴散。(請參閱Ozols RF，et al.，Epithelial ovarian caner.InHoskins WJ，Perez CA，YoungRC，editors.Principles and Practice of GynecologicOncology.3rd ed.PhiladelphiaLippincott，Williams andWilkins；2000.p.981-1057)。
CA125是最具特徵的腫瘤標記，其在I階段卵巢癌中大約30至40％為陰性的，而且在許多良性腫瘤中它的數值水平比較高。(請參閱Meyer T，et al.，Br J Cancer，2000；82(9)1535-8；Buamah P.，J Surg Oncol，2000；75(4)264-5；Tuxen MK，et al.，Cancer Treat Rev，1995；21(3)215-45)。由於CA125的低靈敏度和特異性使得它用作為大眾基本篩檢工具以早期發現和診斷卵巢癌受阻。(請參閱MacDonald ND，et al.，Eur J Obstet GynecolReprod Biol，1999；82(2)155-7；Jacobs I，et al.，HumReprod，1989；4(1)1-12；Shih I-M，et al.，Tumor makers inovarian cancer.InDiamandis EP，Fritsche，H.，Lilja，H.，Chan，D.W.，and Schwartz，M.，editor.Tumor markersphysiology，pathobiology，technology and clinicalapplications.PhiladelphiaAACC Press；in press)。雖然盆骨超音波掃描以及最近的陰道超音波掃描已用於檢測高風險病人，但其兩者技術都不具足夠的靈敏度和特異性以應用於一般民眾。(請參閱MacDonald ND，et al.，同上)。最近在癌症模型的風險度縱向評估中(請參閱SkatesSJ，et al.，Cancer，1995；76(10Suppl)2004-10)將CA125與其它腫瘤標記一起使用(請參閱Woolas RP XF，et al.，J Natl CancerInst，1993；85(21)1748-51；Woolas RP，et al.，GynecolOncol，1995；59(1)111-6；Zhang Z，et al.，Gynecol Oncol，1999；73(1)56-61；Zhang Z，et al.，Use of Multiple Markersto Detect Stage I Epithelial Ovarian CancersNeuralNetwork Analysis Improves Performance.American Societyof Clinical Oncology 2001；Annual Meeting，Abstract)並且協同使用超音波掃描作為第二線試驗(請參閱Jacobs IDA，et al.，Br MedJ，1993；306(6884)1030-34；Menon U TA，etal.，British Journal of Obstetrics and Gynecology，2000；107(2)165-69)表明，在提高整體試驗特異性方面得到很好的結果，而特異性對於具相對低普遍性的疾病(例如卵巢癌)為關鍵性指針。
由於晚期卵巢癌令人失望的預診斷，普遍認為主治醫師將會接受積極預測值在至少10％的測試結果。(請參閱Bast，R.C.，et al.，Cancer Treatment and Research，2002；10761-97)。當擴展到更廣泛的範圍時，一般篩檢試驗將需要靈敏度大於70％且特異性達到99.6％。目前，沒有一者現有的血清學上的標記，例如CA125、CA72-4或M-CSF，單獨地執行上述的功效。(請參閱Bast，R.C.，et al.，Int JBiol Markers，1998；13179-87)。
因此，迫切需要單獨地或與其它標記或診斷型式組合的新穎血清學上的生物標記，以給予早期發現卵巢癌所需要的靈敏度和特異性。(請參閱Bast RC，et al.，Earlydetection of ovarian cancerpromise and reality.OvarianCancerISIS Medical Media Ltd.，Oxford，UK；2001.inpress)。如果沒有可接受的篩檢試驗，早期發現仍然是提高卵巢癌病人長期存活最關鍵因素。
因此需要一種可靠且準確測量病人卵巢癌狀態的方法，然後該測量結果可用於安排受驗者治療。
發明內容本發明提供敏感且快速的方法以及試劑盒，利用測量卵巢癌的生物標記來判斷卵巢癌狀態。測量病人這些生物標記是診斷醫師提供與人類癌症的可能性診斷或陰性診斷(亦即，正常的或無疾病的診斷)有關的信息。該等生物標記是以分子量及/或它們已知的蛋白質特性為特徵。藉由使用各種分離技術，例如與質譜連用的色譜分離法、利用固定化抗體或傳統免疫測定提取蛋白質的方法，生物標記可於一樣本的其它蛋白質中析出。在優選的實施例中，該析出方法包括表面強化雷射解吸/電離質譜技術(SELDI)，其中質譜儀探針的表面由能結合生物標記的吸收劑組成。
更詳而言之，依據下面三種物質所採取的方法發現三種生物標記並隨後得到確定(1)載脂蛋白A1(Apolipoprotein A1)(本文以」ApoA1」表示)，包括經修飾的ApoA1；(2)甲狀腺素運輸蛋白(transthyretin)，包括截斷型甲狀腺素運輸蛋白，(本文以」甲狀腺素運輸蛋白△N10」表示)，及經修飾的甲狀腺素運輸蛋白種類，以及(3)至少三種含有間-α-胰蛋白酶抑制因子重鏈H4的切割片段(本文以」IAIH4片段」表示)的其中一者。
本發明提供一種定性受驗者卵巢癌狀態的方法，該方法包括(a)測量取自該受驗者樣本中的至少一種生物標記，其中所述的生物標記選自由ApoA1、經修飾的ApoA1、甲狀腺素運輸蛋白△N10、天然甲狀腺素運輸蛋白、半胱氨醯化甲狀腺素運輸蛋白、磺化甲狀腺素運輸蛋白、CysGly修飾的甲狀腺素運輸蛋白、穀胱甘肽化甲狀腺素運輸蛋白、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2以及IAIH4片段No.3、及其組合物組成的組；以及(b)將測量結果與卵巢癌狀態相關聯。在某些方法中，測量步驟包括檢測樣本中是否存在所述的生物標記。而在其它方法中，測量步驟包括確定樣本中所述的標記的數量。在其它方法中，測量步驟包括評定樣本中所述的生物標記的類型。
本發明所述的方法還包括下列測量步驟提供受驗者血液樣本或血液衍生物樣本；用陰離子交換樹脂區分所述的樣本中的蛋白質，並收集含有ApoA1、經修飾的ApoA1、甲狀腺素運輸蛋白以及IAIH4片段的區分物；在包含有結合蛋白質生物標記的捕獲劑的基質表面上，從這些區分物中獲取ApoA1、經修飾的ApoA1、甲狀腺素運輸蛋白以及IAIH4片段。所述的血液衍生物是血清或血漿。在優選的實施例中，所述的基質是含有IMAC銅表面的SELDI探針，並且其中所述的蛋白質生物標記通過SELDI檢測。在其它實施例中，所述的基質是含有結合ApoA1、甲狀腺素運輸蛋白以及IAIH4片段的生物特性親和試劑的SELDI探針，而且所述的蛋白質生物標記通過SELDI檢測。在其它實施例中，所述的基質是含有結合ApoA1、甲狀腺素運輸蛋白以及IAIH4片段的生物特異性親和試劑的微量滴定盤，而且所述的蛋白質生物標記通過免疫測定方法檢測。
在某些實施例中，所述的方法進一步包括依據本發明方法確定的癌症狀態來安排受驗者治療。例如，如果採用本發明方法所得到的結果不確定或者有必要進一步確定癌症狀態時，主治醫師應該安排更多的試驗。或者，如果確定的狀態表明應當要動手術，主治醫師則可以為病人安排手術。否則，如果測試結果是陽性的，例如確定的狀態是晚期卵巢癌或狀態是急性卵巢癌，則無須採取更進一步的措施。又，如果結果顯示治療很成功，則無須進行進一步的安排試驗。
本發明也提供在安排受驗者治療後，重新測定至少一種生物標記的方法。在這些實施例中，依據獲得結果之後需要重複及/或修改安排受驗者治療的步驟。
術語「卵巢癌狀態」是指病人疾病的狀態。卵巢癌狀態的類型包括，但不僅限於，受驗者患癌風險、是否存在疾病、疾病階段以及疾病治療效果。其它狀態及各自狀態的程度在熟習技藝領域中為已熟知。
用於本發明方法的生物標記是選自由ApoA1、經修飾的ApoA1、甲狀腺素運輸蛋白△N10、天然甲狀腺素運輸蛋白、半胱氨醯化甲狀腺素運輸蛋白、磺化甲狀腺素運輸蛋白、CysGly修飾的甲狀腺素運輸蛋白、穀胱甘肽化甲狀腺素運輸蛋白、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2以及IAIH4片段No.3。在某些優選的實施例中，所述的方法進一步包括測量取自受驗者樣本中的至少一種已知生物標記(本文以」標記4」表示)，並將所述的至少一種標記4的測量結果以及ApoA1、甲狀腺素運輸蛋白以及IAIH4片段的測量結果與卵巢癌狀態相關聯。在某些實施例中，除測量選自由ApoA1、甲狀腺素運輸蛋白以及IAIH4片段的生物標記之外只測量一種標記4，而在另外一些實施例中則需測量多種標記4。
標記4包括已知的卵巢癌生物標記，例如，但不僅限於，CA125、CA125II、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA195、腫瘤相關胰蛋白酶抑制因子(TATI)、CEA、胎盤鹼性磷酸酯酶(PLAP)、抗原Sialyl TN、半乳糖轉化酶、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF，CSF-1)、溶血磷脂酸(LPA)、表皮生長因子受體細胞外區域110kD部分(p110E GFR)、組織激肽釋放酶，如激肽釋放酶6和激肽釋放酶10(NES-1)、絲氨酸蛋白水解酶(prostasin)、HE4、肌酸激酶(CKB)、LASA、HER-2/neu、尿促性腺激素肽(UGP)、Dianon NB 70/K、組織多肽抗原(TPA)、骨橋蛋白和觸珠蛋白以及這些標記的蛋白質變異體(如裂解形式、異構形式)。
在某些實施例中，所述的方法提供測量所有三種生物標記ApoA1、甲狀腺素運輸蛋白、及IAIH4片段(其中所述的ApoA1是選自由未經修飾的ApoA1以及經修飾的ApoA1組成的組；其中所述的甲狀腺素運輸蛋白是選自由甲狀腺素運輸蛋白△N10、天然甲狀腺素運輸蛋白、半胱氨醯化甲狀腺素運輸蛋白、磺化甲狀腺素運輸蛋白、CysGly修飾的甲狀腺素運輸蛋白、及穀胱甘肽化甲狀腺素運輸蛋白組成的組；以及其中所述的IAIH4片段是選自由IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2、以及IAIH4片段No.3組成的組)。在另外的實施例中，所述的方法提供測量兩種生物標記，ApoA1與甲狀腺素運輸蛋白(其中所述的ApoA1是選自由未經修飾的ApoA1以及經修飾的ApoA1組成的組；其中所述的甲狀腺素運輸蛋白是選自由甲狀腺素運輸蛋白△N10、天然甲狀腺素運輸蛋白、半胱氨醯化甲狀腺素運輸蛋白、磺化甲狀腺素運輸蛋白、CysGly經修飾的甲狀腺素運輸蛋白、穀胱甘肽化甲狀腺素運輸蛋白組成的組)。在優選的實施例中，所述的兩種生物標記是經修飾的ApoA1以及半胱氨醯化甲狀腺素運輸蛋白。在其它的實施例中，所述的方法提供測量ApoA1、經修飾的ApoA1、甲狀腺素運輸蛋白△N10、天然甲狀腺素運輸蛋白、半胱氨醯化甲狀腺素運輸蛋白、磺化甲狀腺素運輸蛋白、CysGly修飾的甲狀腺素運輸蛋白、穀胱甘肽化甲狀腺素運輸蛋白以及所有三種IAIH4片段。在一些實施例中，也要測量取自受驗者樣本中至少一種已知標記，即為標記4，並將所述的已知生物標記4的測量結果以及其它三種生物標記(ApoA1、甲狀腺素運輸蛋白、以及IAIH4片段)的測量結果與卵巢癌狀態相關聯。如前所述，在某些實施例中，測量的生物標記包括所有三種生物標記(ApoA1、甲狀腺素運輸蛋白、以及IAIH4片段，其中所述的ApoA1是選自由未經修飾的ApoA1以及經修飾的ApoA1組成的組；其中所述的甲狀腺素運輸蛋白是選自由甲狀腺素運輸蛋白△N10、天然甲狀腺素運輸蛋白、半胱氨醯化甲狀腺素運輸蛋白、磺化甲狀腺素運輸蛋白、CysGly修飾的甲狀腺素運輸蛋白、穀胱甘肽化甲狀腺素運輸蛋白組成的組；以及其中所述的IAIH4片段是選自由IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2、以及IAIH4片段No.3組成的組，或可能包括兩種或三種IAIH4片段)以及兩種或多種來自由指定為標記4組成的組的生物標記。
本發明也關於指定為標記I至XLVIII的生物標記。本發明的蛋白質標記可從幾個方面來表徵。尤其，一方面，這些標記是以本文詳列的情況下的分子量來表徵，特別是根據質譜分析法來判斷的分子量。另一方面，生物標記可由經質譜分析法得到的例如尺寸大小(包括面積)及/或標記的譜峰形狀來進行表徵，這些表徵方式還包括臨近光譜峰的靠近程度、臨近峰大小以及形狀等等。再一方面，生物標記還可以親和結合特徵為表徵，尤其能夠在特定環境下與IMAC銅吸收劑結合，然而也可使用例如鎳的其它金屬。在優選的實施例中，本發明的生物標記均可以分子量、質譜圖以及IMAC銅吸收劑結合來表徵。
至於本文所揭露的生物標記的質量，質譜儀器所測得的質量精確度被認為是在所揭露的質量數值的大約±0.15％之間。除此之外，對於儀器這種公認的精確度變動範圍，質譜分析方法的質量測定的解析範圍在大約400m/dm至1000m/dm內變動，其中m表示質量，dm表示質譜圖中半峰高的譜峰寬度。這些質量精確度和解析範圍均與質譜儀有關，而且在每個從標記I至XLVIII質量的揭露過程中，由於質譜儀的操作誤差，所以反應在上述使用「大約」這一術語上。值得注意的是，這裡所揭示的每種生物標記的質量精確度、解析範圍以及「大約」的意義也包括生物標記中由於受驗者的性別、基因型態和/或人種以及受驗者特定癌症或疾病起因或其所處的階段的不同帶來的變動。
本發明也提供一種定性受驗者卵巢癌狀態的方法，該方法包括(a)測量取自受驗者樣本中至少一種生物標記，其中所述的生物標記選自由標記I至XLVIII以及其結合物組成的組；以及(b)將測量結果與卵巢癌狀態相關聯。在某些方法中，測量步驟包括檢測樣本中是否存在生物標記。而在另一些方法中，測量步驟包括確定樣本中生物標記的數量。還有一些方法中，測量步驟包括評定樣本中生物標記的類型。
診斷測試的精確度用接收器操作特性曲線(ReceiverOperating Characteristic curve，ROC曲線)來表徵。ROC是繪製診斷試驗中的真陽性部分與假陽性部分之間可能存在的交點。ROC曲線顯示靈敏度與特異性之間的關係。也就是說，靈敏度的提高伴隨的是特異性的降低。曲線越靠近縱軸表示試驗越精確。相反，曲線越靠近ROC圖的45度對角線表示試驗越不精確。ROC曲線下的面積可用於測量試驗的精確度。試驗的精確度依試驗是否將受驗者很好地分為患有疾病或沒有患有疾病而定。曲線下的面積(這裡用」AUC」指代)為1表示的是成功的試驗，而AUC為0.5表示的是幾乎沒有用處的試驗。因此，本發明優選的生物標記和診斷方法的AUC要大於0.5，更好的是大於0.6，甚至大於0.7。
測量生物標記的優選方法包括使用生物晶片列陣。用於本發明中的生物晶片列陣包括蛋白質和核酸列陣。將至少一種生物標記固定於生物晶片列陣上，並經雷射離子化後檢測生物標記的分子量。例如，生物標記的分析方法是通過分析至少一種生物標記的分子量的闕值強度，其中該闕值強度對總離子電流做標準化換算。優選地，對數轉換可用於降低峰值強弱範圍以限制被檢測的生物標記的數量。
本發明的優選方法中，將生物標記的測量方法與卵巢癌狀態相關聯的步驟可通過軟體分類算法來進行。優選地，須在生物晶片列陣上採用固定化的受驗者樣本、且將該生物晶片列陣經雷射離子化來檢測用於表示質荷比的信號強度，從而獲得數據；並將數據轉換成計算器可讀形式；然後對於檢測出的信號、根據使用者輸入的參數將數據分類來進行分類演算，其中該信號是代表存在於卵巢癌病人而又很少出現在無癌症受驗者參照物中。
優選地，生物晶片表面是由例如固定化的鎳離子組成的陽離子或陰離子，或由陽離子和陰離子的混合物組成，或由至少一種抗體、單股或雙股線形核酸、蛋白質、多肽或多肽片段、胺基酸探針或噬菌體展示庫(phage displaylibraries)組成。
在其它優選方法中，採用雷射解吸/電離質譜技術測量至少一種生物標記，這種技術包括提供適用於質譜儀的探針，該探針上附著一層與受驗者樣本接觸的吸收劑；並且解吸和電離生物標記或探針上的生物標記，從而用質譜儀檢測去離/電離生物標記。
優選地，雷射解吸/電離質譜技術包括提供附著有吸收劑的基材；將受驗者的樣本與吸收劑接觸；將基材置於探針上，該探針是適用於質譜儀且附著有吸附劑；並且解吸和電離生物標記或探針上的生物標記，從而用質譜儀檢測去離/電離生物標記。
吸附劑可以是例如厭水的、親水的、離子的或金屬螯合物吸收劑，例如鎳或抗體、單股或雙股線形寡核甘酸、胺基酸、蛋白質、多肽或多肽片段。
本發明的方法可操作於遵從所述方法的任何類型的病人樣本(如血液、血清和血漿)。
在某些實施例中，需測量取自受驗者的樣本中的許多生物標記，其中該生物標記選自由ApoA1、經修飾的ApoA1、甲狀腺素運輸蛋白△N10、天然甲狀腺素運輸蛋白、半胱氨醯化甲狀腺素運輸蛋白、磺化甲狀腺素運輸蛋白、CysGly修飾的甲狀腺素運輸蛋白、穀胱甘肽化甲狀腺素運輸蛋白、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2以及IAIH4片段No.3、以及至少一種已知標記標記4組成的組。在其它優選實施例中，所述的生物標記包括選自由ApoA1、經修飾的ApoA1、甲狀腺素運輸蛋白△N10、天然甲狀腺素運輸蛋白、半胱氨醯化甲狀腺素運輸蛋白、磺化甲狀腺素運輸蛋白、CysGly修飾的甲狀腺素運輸蛋白、穀胱甘肽化甲狀腺素運輸蛋白、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2以及IAIH4片段No.3。生物標記的測量也包括測量至少一種標記4。優選地，所述的蛋白質生物標記通過SELDI法或免疫測定方法測定。
本發明也提供一種方法，其包括測量取自由受治療樣本中的至少一種生物標記，其中該生物標記是選自由ApoA1、經修飾的ApoA1、甲狀腺素運輸蛋白△N10、天然甲狀腺素運輸蛋白、半胱氨醯化甲狀腺素運輸蛋白、磺化甲狀腺素運輸蛋白、CysGly修飾的甲狀腺素運輸蛋白、穀胱甘肽化甲狀腺素運輸蛋白、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2以及IAIH4片段No.3，以及其組合物組成的組。在某些實施例中，所述的方法還包括測量ApoA1及/或至少一種已知的卵巢癌標記4，例如CA125、CAl25II、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA195、TATI、CEA、PLAP、抗原Sialyl TN、半乳糖轉移酶、M-CSF、CSF-1、LPA、p110EGFR、組織激肽釋放酶、prostasin、HE4、CKB、LASA、HER-2/neu、尿促性腺激素肽、Dianon NB 70/K、TPA、骨橋蛋白和觸珠蛋白以及這些標記的蛋白質變異體(如裂解形式、異構形式)。
本發明也提供一種試劑盒，所述的試劑盒包括(a)結合生物標記的捕獲試劑，其中所述的生物標記選白ApoA1、經修飾的ApoA1、甲狀腺素運輸蛋白△N10、天然甲狀腺素運輸蛋白、半胱氨醯化甲狀腺素運輸蛋白、磺化甲狀腺素運輸蛋白、CysGly修飾的甲狀腺素運輸蛋白、穀胱甘肽化甲狀腺素運輸蛋白、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2以及IAIH4片段No.3，以及其組合物，以及(b)包括至少一種生物標記的容器。在一實施例中，大多數生物標記包括ApoA1和甲狀腺素運輸蛋白，在其優選實施例中，ApoA1是經修飾的ApoA1，而甲狀腺素運輸蛋白是半胱氨醯化甲狀腺素運輸蛋白。在另一實施例中，大多數生物標記包括ApoA1、經修飾的ApoA1、甲狀腺素運輸蛋白△N10、天然甲狀腺素運輸蛋白、半胱氨醯化甲狀腺素運輸蛋白、磺化甲狀腺素運輸蛋白、CysGly修飾的甲狀腺素運輸蛋白、穀胱甘肽化甲狀腺素運輸蛋白、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2以及IAIH4片段No.3。而所述的捕獲試劑可以是任何類型的試劑，但是優選地試劑是SELDI探針。所述的捕獲試劑也可能結合其它已知生物標記，如標記4。在某些優選實施例中，試驗試劑盒還包括第二捕獲試劑，該第二捕獲試劑是結合第一捕獲試劑不結合的至少其中一種生物標記。
本發明提供的試劑盒還包括(a)結合至少一種生物標記的第一捕獲試劑，其中所述的生物標記是選自ApoA1、經修飾的ApoA1、甲狀腺素運輸蛋白△N10、天然甲狀腺素運輸蛋白、半胱氨醯化甲狀腺素運輸蛋白、磺化甲狀腺素運輸蛋白、CysGly修飾的甲狀腺素運輸蛋白、穀胱甘肽化甲狀腺素運輸蛋白、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2以及IAIH4片段No.3，以及(b)結合至少一種所述的第一捕獲試劑不結合的生物標記的第二捕獲試劑。優選地，至少一種捕獲試劑是抗體。某些試劑盒也包括至少一種捕獲試劑黏附於或可黏附於其上的質譜探針。
本發明的某些試劑盒中，所述的捕獲試劑包括一種固定化的金屬螯合物(immobilized metalch elate，IMAC)。
本發明的某些試劑盒進一步包括衝洗溶液，衝洗後可選擇性地允許被結合的生物標記保留於所述的捕獲試劑上，而其它生物標記被衝洗下來。
本發明提供的試劑盒進一步包括(a)結合至少一種生物標記的第一捕獲試劑，其中所述的生物標記選自ApoA1、經修飾的ApoA1、甲狀腺素運輸蛋白△N10、天然甲狀腺素運輸蛋白、半胱氨醯化甲狀腺素運輸蛋白、磺化甲狀腺素運輸蛋白、CysGly修飾的甲狀腺素運輸蛋白、穀胱甘肽化甲狀腺素運輸蛋白、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2以及IAIH4片段No.3，以及(b)使用捕獲試劑檢測生物標記的說明書。在某些試劑盒中，該捕獲試劑包括抗體。而且，一些試劑盒進一步包括所述的捕獲試劑粘附於或可粘附於其上的MS探針。
一些試劑盒中，所述的捕獲試劑進一步包括IMAC。所述的試劑盒可能進一步包括衝洗溶液，衝洗後可選擇性地允許被結合的生物標記保留於所述的捕獲試劑上，而其它生物標記被衝洗下來。優選地，所述的試劑盒包括使用試劑盒檢測卵巢癌狀態的書面說明書，並且該說明書供以將試驗樣本與捕獲試劑接觸並檢測一種或多種被捕獲試劑捕獲到的生物標記。
試劑盒提供的捕獲試劑是抗體、單股或雙股線形寡核甘酸、胺基酸、蛋白質、多肽或多肽片段。
使用試劑盒獲得的至少一種蛋白質生物標記的測量方法是質譜分析法或例如酶聯免疫吸附測試(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)的免疫試驗法。
本發明進一步提供用於檢測卵巢癌的經純化的肽及/或產生用於進一步診斷試驗的抗體。經純化的蛋白質包括下列經純化的肽SEQIDNO1(IAIH4片段No.1)、SEQ IDNO2(IAIH4片段No.2)、SEQ ID NO3(IAIH4片段No.3)。本發明提供的經純化的肽進一步包括可檢測的標記。
本發明進一步提供一種製品，包括結合至少兩種生物標記的至少一種捕獲試劑，其中所述的生物標記選自ApoA1、經修飾的ApoA1、甲狀腺素運輸蛋白△N10、天然甲狀腺素運輸蛋白、半胱氨醯化甲狀腺素運輸蛋白、磺化甲狀腺素運輸蛋白、CysGly修飾的甲狀腺素運輸蛋白、穀胱甘肽化甲狀腺素運輸蛋白、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2以及IAIH4片段No.3。本發明所述的製品的其它實施例進一步包括結合其它已知的卵巢癌標記的捕獲試劑，所述的標記也就是標記4，例如，但不僅限於，CA125、CA125II、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA195、TATI、CEA、PLAP、抗原Sialyl TN、半乳糖轉移酶、M-CSF、CSF-1、LPA、p110EGFR、組織激肽釋放酶、prostasin、HE4、CKB、LASA、HER-2/neu、尿促性腺激素肽、Dianon NB 70/K、TPA、骨橋蛋白和觸珠蛋白以及這些標記的蛋白質變異體(如裂解形式、異構形式)。
本發明進一步包括一種系統，包括多種捕獲試劑，每種捕獲試劑結合至不同生物標記，其中所述的生物標記是選自ApoA1、經修飾的ApoA1、甲狀腺素運輸蛋白△N10、天然甲狀腺素運輸蛋白、半胱氨醯化甲狀腺素運輸蛋白、磺化甲狀腺素運輸蛋白、CysGly修飾的甲狀腺素運輸蛋白、穀胱甘肽化甲狀腺素運輸蛋白、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2以及IAIH4片段No.3以及至少一種標記4。
本發明進一步提供一種篩選試驗，包括(a)將激肽釋放酶與激肽釋放酶底物以及測試試劑接觸，以及(b)判斷所述的測試試劑是否調節所述的激肽釋放酶活性。在這樣一種試驗中，所述的底物是間-α-胰蛋白酶抑制因子重鏈H4前體。其中，優選地是所述的激肽釋放酶將所述的底物切割成IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2或IAIH4片段No.3。
在另外的實施例中，非介入性藥物影像技術(如經陰道超聲波(transvaginal ultrasound)技術、正電子發射斷層成像(positronemisson tomography，PET)技術或單電子發射型計算機斷層掃描(emission computerizedtomography，SPECT)影像技術)對於發現癌症、冠狀動脈疾病以及腦部疾病尤為有用。超聲都卜勒血流影像、PET影像以及SPECT影像顯示器官和組織的化學功能，而其它影像技術——如X射線(X-ray)、CT和MRI(核磁共振檢查)——主要顯示的是結構。採用超聲波血流影像、PET影像以及SPECT影像逐漸成為檢查和監視例如卵巢癌的疾病發展狀態的有用方法。
在PET和SPECT影像應用的裝置中可採用本文所揭示的縮氨酸生物標記或其片段。用適當的示蹤劑殘基為PET或SPECT成像裝置進行表面經修飾後，與腫瘤蛋白質相互作用的縮氨酸生物標記可用於卵巢癌病人體內生物標記的成像。
以下將描述本發明的其它方面。
圖標簡單說明第1圖，是表示生物標記發現集合中樣本的假凝膠質譜圖，其中顯示位於12828和28043(組分pH4，IMAC-Cu列陣)，以及3272(組分pH9，IMAC-Cu列陣)的m/z的峰值。
第2(A)、(B)、(C)和(D)圖，是表示CA125與三種指定的生物標記之間比較接收器操作特性(ROC)曲線。
第2(E)、(F)、(G)和(H)圖，是表示CA125與兩種多變量預測模型的接收器操作特性(ROC)曲線。
第3(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)和(h)圖，是表示病人體內和健康參照物體內的三種指定的生物標記和CA125分別在生物標記發現集合和獨立確認集合中的分布散點圖(泳道a-h)。
第3(i)、(j)、(k)和(l)圖，是表示病人體內和健康參照物體內的兩種多變量預測模型分別在生物標記發現集合和獨立確認集合中的分布散點圖。
第4圖，是表示用於表徵生物標記的分類算法圖表。
第5圖，是表示發現在卵巢癌樣本中不同的IAIH4片段的質譜圖。峰3276.7代表IAIH4片段No.1(SEQ IDNO1)。峰3031.3代表IAIH4片段No.2(SEQ ID NO2)。峰2884代表IAIH4片段No.3(SEQ ID NO3)。圖中的表格是表示，以不帶有癌症樣本為參照物，卵巢癌中自天然IAIH4片段(IAIH4片段No.1；即表格中的「Orig」)開始的八段的峰值pvalue。表格中，NS代表忽略不計。「-MN」代表來自IAIH4片段No.1序列的以N為端點的M到N的截斷，同樣也可來自SEQ ID NO2(IAIH4片段No.2)。「-MNF」表示來自IAIH4片段No.1序列的以N為端點的M到N、N到F的截斷，同樣也可來自SEQ ID NO3(IAIH4片段No.3)。表格中其餘截斷是帶有從天然IAIH4片段No.1序列移去指定胺基酸殘基。
第6圖，是表示未經修飾的(unmodified)、半胱氨醯化(cysteinylated)、穀胱甘肽化(glutathionylated)以及截斷形式的甲狀腺素運輸蛋白分別通過免疫法和色譜分析法發現的質譜圖。
第7圖，是表示患有卵巢癌病人體內發現各種形式的甲狀腺素運輸蛋白與其它癌症病人和參照病人比較得到的結果。
第8圖，是表示甲狀腺素運輸蛋白經還原反應和烷基化反應的後質譜圖中峰的變化，表明甲狀腺素運輸蛋白達成半胱氨醯化。
第9圖，是表示在Q10 ProteinChip Array上甲狀腺素運輸蛋白鑑定的代表性譜圖。其中五種形式的甲狀腺素運輸蛋白都已包括在內未經經修飾的(unmodified)、磺化(sulfonated)、半胱氨醯化(cysteinylated)、經CysGly修飾的、穀胱甘肽化(glutathionylated)。除此之外，還可發現其截斷形式transthyretin△N10；它以很低的濃度(～2％)的半胱氨醯化(cysteinylated)形式出現。
第10圖，是表示各種形式的甲狀腺素運輸蛋白與峰強度之間的線性關係圖。
第11圖，是表示手術後甲狀腺素運輸蛋白和載脂蛋白(ApolipoproteinA1)的變化情況。對每個病人在術前和術後使用基於五種形式的甲狀腺素運輸蛋白和載脂蛋白(Apolipoprotein A1)設計的計算器得出指數數值。比較術前和術後的指數數值點圖發現，對於大部分病人，術後該數值升高。而且A.對於早期卵巢癌患者，該數值提高31/42(73.8％)；B.對於晚期卵巢癌患者，該數值提高62/79(78.5％)。
第12圖，適用於表示該指數數值可用於監視病人情況。圖中是表示治療過程中指數數值如何變化的一實施例。對於這個病人，該指數數值在術前很低，在術後有所升高。直到1996年10月該數值都一直保持高水平。表明病人在那一時期疾病得到好轉。
第13圖，是表示在Q10 ProteinChip Array上各形式的甲狀腺素運輸蛋白和載脂蛋白產生的峰強度的散點圖。對於各種形式的甲狀腺素運輸蛋白的兩組t-試驗值如下所示未經修飾的，0.0076；經磺化的(sulfonated)，0.0052；經半胱氨醯化的(cysteinylated)，0.0104；經CysGly修飾的，0.0026；經穀胱甘肽化的(glutathionylated)，0.0047。對於載脂蛋白(Apolip oproteinA1)的兩組t-試驗值為0.0009。
第14圖，是表示採用最近鄰居分析方法得到的指數數值。該模型包括六種形式的甲狀腺素運輸蛋白和載脂蛋白(Apolipoprotein A1)產生的峰強度，無論是包括年齡因素還是不包括年齡因素。使用的最近鄰居分析方法是用於計算每種樣本是為參照物、良性腫瘤或癌症之後事概率。計算公式為p(良性腫瘤/生物標記)+2*p(癌症/生物標記)。0分表示該樣本歸為參照物，2分表示該樣本歸為癌症，中間分數中越接近2分，越有可能是癌症。
第15圖，是表示在IMA C30 Cu列陣(PBSIIc)上ApoA1峰的質譜圖。
第16圖，是表示在IMAC30Cu列陣(PBS4000)上ApoA1峰的質譜圖。
術語定義除非另有定義，本文使用的所有技術和學術術語的意義為熟知技藝領域者所習知。下面的參考文獻為熟知技藝者提供一些本發明所使用的術語的一般定義辛格頓(Singleton)等人著，微生物學與分子生物學辭典(Dictionary of Microbiology and Molecular Biology)(第二版，1994))；沃克(Walker)編著，劍橋科學與技術辭典(The Cambridge Dictionary of Science and Technology)(1988年)；裡傑(R.Rieger)等人編著，遺傳學辭典(TheGlossary of Genetics)，第5版，Springer Verlag出版(1991年)；以及哈樂與馬漢(Hale Marhan)著，哈珀科林斯生物學辭典(The Harper Collins Dictionary of Biology)(1991年)。若沒有其它特別說明，本發明使用的術語意義闡述如下。
「氣相離子光譜測定儀」是指一種可檢測氣相離子的儀器。氣相離子光譜測定儀包括離子源以提供氣相離子。例如，氣相離子光譜測定儀包括質譜儀、離子移動光譜儀以及總離子流檢測器。「氣相離子光譜測定法」是指利用氣相離子光譜測定儀來檢測氣相離子的方法。
「質譜儀」是指可測量代表氣相離子質荷比的參數的氣相離子光譜測定儀。質譜儀通常包括離子源和質量分析儀。例如，質譜儀包括飛行時間質譜儀、磁質譜儀、四極柱濾質器、離子阱分析儀、離子繞行共振質譜儀、靜電扇形分析儀以及其混合使用。「質譜分析法」是指利用質譜儀來檢測氣相離子方法。
「雷射解吸質譜儀」是指利用雷射能量解吸、揮發及電離分析物的質譜儀。
「多重質譜儀」是指任何能夠鑑別或測量兩個連續階段的基於m/z包括混合離子在內的離子的質譜儀。該術語包括帶有兩個質量分析儀、能夠鑑別或測量兩個連續階段的基於m/z的多重空間離子的質譜儀。該術語還包括帶有單個質量分析儀、能夠鑑別或測量兩個連續階段的基於m/z的多重時間離子的質譜儀。所述術語明顯就包括了Qq-TOF質譜儀、離子阱質譜儀、離子阱-TOF質譜儀、TOF-TOF質譜儀、傅立葉變換離子繞行共振質譜儀、靜電扇形-磁扇形質譜儀，以及它們的混合運用。
「質量分析儀」是指包括可測量代表氣相離子質荷比的參數的質譜儀的組件部分。在飛行時間質譜儀中，質量分析儀是包括離子光學組件、飛行試管以及以離子檢測器。
「離子源」是指可用來提供氣相離子的氣相離子光譜測定儀的組件部分。在一實施例中，離子源經過解吸/電離過程來提供離子。這類實施例通常包括探針接口，該接口令探針可檢測到電離能量源(如雷射解吸/電離源)，並同時在大氣壓或低於大氣壓情況下與氣相離子光譜測定儀的檢測器進行通訊。
用於解吸/電離固相分析物的電離能量的形式包括例如(1)雷射能量；(2)高速運行的原子(用在高速運行原子的轟擊)；(3)經放射性原子核的β衰退產生的高能量粒子(用在血漿解吸)；以及(4)產生二次離子的主離子(用在二次離子質譜儀)。用於固相分析物的電離能量的優選形式是雷射(用在雷射解吸/電離中)，尤其是氮雷射、Nd-Yag雷射及其它脈衝雷射源。「能流」是指傳遞每單位面積被偵測的影像需要的能量。高能流的源頭，例如雷射，將傳遞大約1mJ/mm2至50mJ/mm2。具體來說，將樣本置於探針表面上，探針與充滿有電離能量的探針藉口電性結合。該能量將分析物分子自表面解吸到氣相中去並電離這些處於氣相中的離子。
用於分析物的其它形式的電離能量包括，例如(1)可電離氣相中性物質的電子；(2)強電場，以誘導氣相、固相或液相中性物質發生電離；以及(3)對中性化學物質施以電離粒子或電場以誘導氣相、固相或液相中性物質發生化學電離的源頭。
「固體支撐物」是指可以本身帶有或塗敷有捕獲試劑的固態物質。該固體支撐物的例子包括探針、微量滴定盤和色譜分析樹脂。
本發明全文提到的「探針」是指適用於經氣相離子光譜測定儀(如質譜儀)的探針接口結合作用後令分析物充有電離能量並傳送到氣相離子光譜儀(如質譜儀)中去的裝置。該「探針」通常包括由樣本組成的固體基材(可以是柔韌的，也可以是堅硬的)，該樣本呈現給分析物的表面將暴露於電離能量的源頭。
「表面強化雷射解吸/電離」或「SELDI」是指在解吸/電離氣相離子光譜測定法(如質譜分析法)的其中一種方法，在這種方法中，在SELDI探針的表面捕獲分析物，而SELDI探針是與氣相離子光譜測定儀(如質譜儀)的探針接口電性結合。在「SELDI質譜」中，該氣相離子光譜測定儀是質譜儀。SELDI技術在例如美國專利US5719060(由Hutchens和Yip申請)和美國專利US6225047(由Hutchens和Yip申請)都有描述。
「表面強化親和性捕獲」或「SEAC」包括使用表面有吸附作用的探針(「SEAC探針」)的SELDI方法。「吸附表面」是指塗覆有吸附劑(也稱之為「捕獲試劑」或「親和試劑」)的表面。吸附劑是任何可以結合分析物(如目標靶向物多肽或核酸)的材料。「色譜吸附劑」是指特別用於色譜法的材料。例如，該色譜吸附劑包括離子交換材料、金屬螯合物(如次氨基乙酸、亞氨基二乙酸)、固定化金屬螯合物、厭水吸附劑、親水吸附劑、染料、單生物分子(如核甘酸、胺基酸、單分子葡萄糖和脂肪酸)以及混合形式吸附劑(如厭水吸引/靜電排斥吸附劑)。「生物特性吸附劑」是指包括例如核酸分子(如寡核甘酸)、多肽、多糖、脂質、類固醇或它們的軛合物(如糖蛋白、脂蛋白、糖脂、核酸(如DNA)-蛋白質軛合物)這些生物分子的吸附劑。在某些實施例中，該生物特性吸附劑可以是大分子結構，例如多蛋白複合體、生物細胞膜或病毒。生物特性吸附劑的例子還包括抗體、受體蛋白質以及核酸。生物特性吸附劑對於一種靶向分析物來說，比色譜吸附劑有更高的特異性。在美國專利US6225047(Hutchens and Yip，「Use ofretentate chromatography to generate difference maps，」May 1，2001)還可發現用於SELDI的吸附劑。
在一些實施例中，SEAC探針提供的表面具有預活化功能，可經修飾後成為可供選擇的吸附劑。例如，某些探針中含有能夠通過共價鍵結合生物分子的活性部分。環氧化物和碳化二亞胺這類活性物質可共價結合例如抗體或細胞受體的生物特性吸收劑。
「吸收」是指分析物以非共價結合方式結合到吸收劑或捕獲劑的過程，且該過程是可檢測到的。
「表面強化淨解吸(Surface-Enhanced NeatDesorption)」或「SEND」是使用表面化學結合有能量吸附分子的探針(稱為「SEND探針」)的SELDI方法。「能量吸附分子(Energy absorbing molecules)」(「EAM」)是指能夠從雷射解吸/電離源吸收能量並且與其接觸的分析物分子發生解吸和電離的分子。該術語包括用於MALDI的分子，有時候指的是「基質」，具體來說包括肉桂酸衍生物、芥子酸(「SPA」)、氰基-羥基-肉桂酸(「CHCA」)以及二羥基苯甲酸、4-羥基-3-甲氧基肉桂酸、羥基乙酮衍生物等等。還包括用在SELDI中的能量吸附分子EAM。還可在美國專利號US5719060和於2002年9月4日申請的美國專利申請號US60/408255(Kitagawa，「Monomers AndPolymers Having Energy Absorbing Moieties Of Use InDesorption/Ionization Of Analytes」)這兩個專利文件中見到有描述SEND。
「表面強化光敏附著和釋放(Surface-EnhancedPhotolabile Attachment and Release)」或「SEPAR」是指使用表面附著有可共價結合分析物並且經光照(如雷射光照)後不耐光共價鍵斷裂而釋放出該分析物的探針的SELDI方法。在美國專利US5719060中可見到對SEPAR進一步描述。
「洗脫劑」或「清洗液」是指試劑，尤指溶液，其用於影響或改變分析物吸附到吸收劑表面的吸附能力及/或從該表面移去未參與結合的材料。洗脫劑的洗脫性能依pH值、離子強度、厭水性、水分子構造破壞程度(chaotropism)程度、清洗劑強度和溫度而定。
「分析物」是指希望檢測到的任何樣本組分。既可以是樣本中單一組分也可以是多個組分。
吸收到親和捕獲性探針的吸附表面上樣本的「多樣性」是指吸收到的蛋白質種類各種各樣。
「分子結合對」和「特異性結合對」是指分子對，尤指具有特異性結合性質的生物分子對。若無其它限制，分子結合對包括受體和配位體、抗體和抗原、生物素蛋白和抗生物素蛋白、生物素蛋白和鏈球菌抗生物素蛋白。
「檢測」是指記錄連續變化參數的變化過程。
「生物晶片」是指平面黏附有吸附劑的固體基材。有時，生物晶片的表面由數個可尋址位置組成，每個可尋址位置結合有吸附劑。生物晶片還可適用於與探針接口電性結合，這樣就具有探針的功能。
「蛋白質生物晶片」是指用於捕獲多肽的生物晶片。在本領域內已揭示了一些蛋白質生物晶片。例如，由Ciphergen Biosystems公司(Fremont，CA)、PackardBioScience Company(Meriden CT)、Zyomyx公司(Harward，CA)和Phylos公司(Lexington，MA)生產的蛋白質生物晶片。這些蛋白質生物晶片在下面幾個專利授權文件或專利申請文件中有闡述美國專利US6225047(Hutchens and Yip，「Use of retentate chromatography togenerate difference maps，」May 1，2001)；國際專利WO99/51773(Kuimelis and Wagner，「Addres sable proteinarrays，」October 14，1999)；美國專利US6329209(Wagneret al.，「Arrays of protein-capture agents and methods of usethereof，」December 11，2001)以及國際專利WO00/56934(Englert et al.，「Continuous porous matrix arrays，」September 28，2000)。
由Ciphergen Biosystems公司生產的蛋白質生物晶片包括表面於可尋址位置上附著有色譜或生物特性的吸附劑。該公司的產品品牌Ciphergen ProteinChip列陣包括NP20、H4、H50、SAX-2、WCX-2、CM-10、IMAC-3、IMAC-30、LSAX-30、LWCX-30、IMAC-40、PS-20和PG-20型號。這些蛋白質生物晶片是條狀鋁質基材。條狀表面塗覆有二氧化矽物質。
以NP-20生物晶片為例，二氧化矽是作為捕獲親水性蛋白質的親水性吸收劑來使用。
H4、H50、SAX-2、Q-10、WCX-2、CM-10、IMAC-3、IMAC-30、PS-10和PS-20生物晶片還包括以水凝膠形式存在的經功能化且經交聯的聚合物，該聚合物以物理方式附著在生物晶片表面上或通過矽烷以共價鍵化學結合方式附著在生物晶片表面上。H4生物晶片含有異丙基官能團以供厭水結合。H50生物晶片含有壬基苯氧基-聚乙二醇異丁烯酸酯以供憎水結合。SAX-2生物晶片含有季銨鹽官能團以供陰離子交換。WCX-2和CM-10生物晶片含有羧酸鹽官能團以供陽離子交換。IMAC-3和IMAC-30生物晶片含有可通過螯合作用吸收過渡金屬離子(如Cu2+和Ni2+)的次氨基乙酸官能團。這些固定化金屬離子可通過協同結合作用吸收縮氨酸和蛋白質。PS-10生物晶片含有可與蛋白質上的官能團反應以供共價鍵結合的carboimidizole官能團。PS-10生物晶片含有的環氧功能基團會與蛋白質發生共價鍵結合反應。PS系列生物晶片對於將生物特性吸收劑(如抗體、受體、凝集素、肝素、蛋白質A、生物素/鏈球菌抗生物素等等)結合到晶片表面是很有用處的，在晶片表面上這些吸附劑自樣本特異性地捕獲分析物。PG-20生物晶片是將蛋白質G附著在PS-20晶片上的生物晶片。LSAX-30(陰離子交換)、LWCX-30(陽離子交換)以及IMAC-40(金屬鰲合物)生物晶片的表面含有功能性乳膠粒子。這些生物晶片在以下專利中有進一步描述國際專利WO00/66265(Rich et al.，「Probes for a Gas Phase IonSpectrometer，」November 9，2000)；國際專利WO00/67293(Beecher et al.，「Sample Holder with Hydrophobic Coatingfor Gas Phase Mass Spectrometer，」November 9，2000)；美國專利US20030032043A1(Pohl and Papanu，「Latex BasedAdsorbent Chip，」July 16，2002)以及美國專利US60/350110(Um et al.，「Hydrophobic Surface Chip，」November 8，2001)。
分析物被捕獲到生物晶片上之後，它們可由許多檢測方法檢測到，這些方法包括氣相離子光譜分析法、光學方法、電化學分析法、原子顯微鏡法和無線頻率分析法。這裡將採用氣相離子光譜分析法。尤為感興趣的是質譜分析方法、尤其SELDI方法的使用。光學方法包括，例如，檢測螢光、發光、化學螢光、吸光率、反射比、透光度、雙折射率或折射率的方法(如表面電漿共振法、橢偏術、共鳴鏡法、光柵耦合器波導方法或幹涉量度分析法)。光學方法還包括顯微鏡法(共焦或不共焦)、呈像方法和非呈像方法。不同形式的免疫試驗法(如酶聯免疫吸附測試法ELISA)是檢測被捕獲在固態物質上的分析物的比較流行的方法之一者。電化學分析法包括伏安法和電流分析法。無線頻率分析法包括多極共振光譜分析法。
「測量」術語的意思是包括檢測樣本中是否存在生物標記、樣本中生物標記的數量及/或評定生物標記類型在內的方法。測量可以由本領域內熟知的方法完成，而且這些方法將會在下面有進一步描述，其包括(但不僅限於)SELDI法和免疫試驗法。可用於發現並測量本文所述的至少一種生物標記的任何方法都是適合的方法。這些方法包括，但不僅限於，質譜分析法(如雷射解吸/電離質譜分析法)、螢光分析法(如三明治式免疫分析法)、表面電漿共振法、橢偏術以及原子顯微鏡分析方法。
「差異呈現」是指取自患有癌症病人樣本中的生物標記呈現的數量及/或頻率較參照物的差異。例如，IAIH4片段與參照物樣本相比，呈現於患有卵巢癌病人樣本中的水平提高。相反，所述的ApoA1和甲狀腺素運輸蛋白與參照物樣本相比，呈現於患有卵巢癌病人樣本中的水平降低。而且，生物標記也可以是，與參照物樣本相比、呈現於患有卵巢癌病人樣本中頻率更高或更低兩種情況都有的多肽。生物標記在數量、頻率或兩者兼有的方面有差異呈現的現象。
如果兩個樣本中其中一種樣本中的多肽的數量與另一種樣本中的多肽有明顯差異時，則稱多肽是差異呈現。例如，如果兩個樣本中其中一種樣本的多肽比另一種樣本的多肽呈現數量多至少大約120％、至少大約130％、至少大約150％、至少大約180％、至少大約200％、至少大約300％、至少大約500％、至少大約700％、至少大約900％或至少大約1000％，或者如果在其中一種樣本中可發現而在另一種樣本中不可發現，則稱多肽是差異呈現。
除此之外，如果兩組樣本中其中發現患有卵巢癌病人的一組樣本中的多肽的頻率與另一組參照樣本中的多肽的頻率明顯更高或更低時，則稱多肽是差異呈現。例如，如果兩組樣本中其中一組樣本的多肽比另一組樣本的多肽發現頻率高於或低於至少大約120％、至少大約130％、至少大約150％、至少大約180％、至少大約200％、至少大約300％、至少大約500％、至少大約700％、至少大約900％或至少大約1000％，則稱多肽是差異呈現。
「診斷」是指確定是否呈現例如卵巢癌這類病理狀況或確定這類病理狀況的性質。各種診斷方法的靈敏度和特異性都有所不同。診斷試驗的「靈敏度」是測試出陽性的疾病個體的百分數(「真陽性」的百分數)。未被試驗發現的疾病個體是「假陰性」。未患疾病的受驗者若在試驗中測試出陰性，則稱為「真陰性」。診斷試驗的「特異性」是指假陽性比率的倒數，其中「假陽性」比率被定義為測試出陽性的未患病的比率。如果特定診斷方法可能沒有提供狀況的確定診斷結果，但只要能幫助診斷做出有意義的指示，那麼這種方法就已很滿意了。
生物標記的「試驗量」是指呈現在被測試的樣本中該生物標記的數量。試驗量可以是絕對量(如μg/ml)，也可以是相對量(如信號的相對強度)。
生物標記的「診斷量」是指診斷出卵巢癌的受體樣本中該生物標記的數量。診斷量可以是絕對量(如μg/ml)，也可以是相對量(如信號的相對強度)。
生物標記的「參照量」可以是將與生物標記的試驗量作對比的任何數量或數量範圍。例如，生物標記的參照量可以是未患有卵巢癌人體內生物標記的數量。參照量可以是絕對量(如μg/ml)，也可以是相對量(如信號的相對強度)。
「抗體」是指多肽配位體，該配位體實質上經過一種或多種免疫球蛋白基因或其片段編碼，該基因專門結合和識別抗原物質的表位(如抗原)。被識別的免疫球蛋白基因包括kappa(κ)和lambda(λ)輕鏈恆定區基因，α、γ、μ、δ、ε重鏈恆定區基因， 以及多種免疫球蛋白可變區基因。抗體的存在形式例如包括以完整的免疫球蛋白的形式或以經不同肽酶消化而產生的各種特徵片段的形式。例如Fab』和F(ab)』2片段。所述的「抗體」還包括整個抗體經修飾後產生的抗體片段或那些重新運用重組DNA方法合成的抗體片段。還包括多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體或單株抗體。Fc區抗體是指包含至少一種重鏈恆定區(如CH1、CH2、CH3)的那一部分免疫球蛋白重鏈，而不包括重鏈可變區部分。
「指導受體治療」是指接下去指導臨床醫師或主治醫師判斷卵巢癌狀態的行為。例如，如果採用本發明的方法得到的結果是不確定的，或者存在還需要對狀態進行確認的情況，主治醫師可能就會要求安排更多的測試。除此之外，如果狀態表明進行手術是恰當的，主治醫師就會安排病人動手術。再者，如果狀態是否定的，如晚期卵巢癌，或如果狀態表明是急性的，那麼就不需要採取進一步的行動。而且，如果結果表明治療是成功的話，那麼這種指導也將不需要了。
具體實施方式本發明提供的生物標記是通過對比來自診斷有卵巢癌病人的蛋白質指紋譜圖和來自不患有已知腫瘤疾病病人的蛋白質指紋譜圖、採用ProteinChipBiomarker System(由Ciphergen Biosystems，Inc.，Fremont，CA提供)而得到。並對這些生物標記以及其它已知卵巢癌標記一起單獨或多元可預測性模式進行評價。尤其，實驗表明這些生物標記(單獨使用或最好結合這些生物標記中其它生物標記使用或結合其它診斷試驗方法)提供一種判斷受體中卵巢癌狀態的新穎方法。
將生物信息工具有效運用到高產量蛋白質構型判定上提供了一種篩選癌症標記的有用方法。簡言之，本發明使用的系統運用SELDI(表面強化雷射解吸/電離，SurfaceEnhanced Laser Desorption/Ionization)技術並利用ProteinChipArray色譜儀對樣本進行測試。結合到該列陣的蛋白質在ProteinChipReader(一種飛行時間質譜儀)中讀取。
生物標記(或稱為「標記」)是一種有機生物分子，該生物分子區別呈現在取自一種顯型狀態(如患有疾病)受體的樣本中和取自另一種顯型狀態(如不患有疾病)受體的樣本中。如果經統計計算顯示不同群組中的生物標記的平均表達水平有明顯差別，則表示生物標記在不同顯型狀態之間是區別呈現的。用於統計學意義的普通測試方法包括t-試驗、ANOVA、Kruskal-Wallis、Wilcoxon、Mann-Whitney和優勢率。單獨使用或結合使用生物標記提供測量受體是屬於一種顯型狀態還是其它一種顯型狀態這種具有相對風險的方法。因此，它們作為標記對於藥物(治療診斷學上)和藥物毒性在疾病(診斷)、治療有效性的判斷上是很有用的。
本發明基於蛋白質標記在患有卵巢癌病人的樣本中與在參照受體的樣本中是區別呈現發現，並將該發現運用在用於判斷卵巢癌狀態的方法和儀器中。這些蛋白質標記在取自卵巢癌病人的樣本中被發現的水平不用於取自人體癌症不可發現到的婦女體內的樣本中。如此一來，與參照物對照，在測試樣本中發現到的至少一種標記的數量，或者在測試樣本中是否存在至少一種標記，對判斷病人卵巢癌狀態提供非常有用的信息。
I.生物標記的描述A.載脂蛋白APOLIPOPROTEIN A1用於本發明所述方法的標記的其中一種實施例是載脂蛋白A1，這裡用「ApoA1」指代。ApoA1可通過質譜分析法在m/z為28043峰位置處(標記XXIV)識別出來。所述的標記的質量在按照SELDI質譜技術所測定的規定數值得0.15％範圍內都被認為是準確的。相應地，還可在28055m/z峰位置處識別出ApoA1。
ApoA1按照所述方法的程序通過分餾血液來發現，然後施以IMAC晶片、由SELDI方法測定。經純化的蛋白質經胰蛋白酶消化後視作載脂蛋白A1。在下面的實施例中將界定分離和確定ApoA1的操作程序。在患有某一階段的卵巢癌病人體內ApoA1的數量會下降。因此，與正常狀態的參照物相比，缺乏ApoA1或ApoA1的數量在統計學意義上下降都是與卵巢癌狀態有關。統計學意義上下降是在本領域內都已知的概念，例如p值低於0.05。
本發明的優選方法包括使用ApoA1的經修飾後的形式。經修飾的ApoA1可能包括轉譯後加成各種不同的化學基團，例如糖基化、脂化、半胱氨醯化以及穀胱甘肽化的基團。
經修飾的ApoA1尤為優選實施例是峰位置處於29977.4處(標記XXV)的ApoA1。經修飾的ApoA1峰是上述ApoA1質譜峰上的肩峰。其它優選的經修飾的ApoA1形式是峰位置處於m/z為28262、28472、28692、28844以及29031處。第15圖和第16圖是表示經修飾的ApoA1生物標記的封位置的質譜圖。
B.甲狀腺素運輸蛋白(transthyretin)可用於本發明方法的標記的另一實施例包括前白蛋白形式，這裡以」甲狀腺素運輸蛋白△N10」指代。甲狀腺素運輸蛋白△N10可通過質譜分析法在m/z為12870.9峰位置處識別出來。甲狀腺素運輸蛋白△N10按照所述方法的程序通過分餾血液來發現，然後施以IMAC晶片、由SELDI方法測定。通過免疫沉澱法和串聯質譜分析法分析後，發現提純的蛋白質截去以N為端點的十個胺基酸之前白蛋白截斷形式(這裡以」甲狀腺素運輸蛋白△N10」指代)。在下面的實施例中將界定分離和確定甲狀腺素運輸蛋白△N10的操作程序。在患有某一階段的卵巢癌病人體內甲狀腺素運輸蛋白△N10的數量會下調。因此，與正常狀態的參照物相比，缺乏甲狀腺素運輸蛋白△N10或甲狀腺素運輸蛋白△N10的數量在統計學意義上下降都是與卵巢癌狀態有關。
所述的本發明中採用甲狀腺素運輸蛋白△N10。然而，天然甲狀腺素運輸蛋白(理論質量為13761或13767道爾頓)也同樣適用於本發明中。除此之外，本發明的優選方法包括使用甲狀腺素運輸蛋白的經修飾的形式。其中包括轉譯後加成各種不同的化學基團，例如糖基化、脂化、半胱氨醯化、磺化、CysGly經修飾的以及穀胱甘肽化的基團。
經修飾的甲狀腺素運輸蛋白尤為優選實施例是半胱氨醯化甲狀腺素運輸蛋白(峰位置處於m/z為13890.8或13888道爾頓)。第8圖是表示甲狀腺素運輸蛋白經還原反應和烷基化反應之後質譜圖中峰的變化，表明甲狀腺素運輸蛋白達成半胱氨醯化。經修飾的甲狀腺素運輸蛋白的另一尤為優選實施例是穀胱甘肽化甲狀腺素運輸蛋白(峰位置處於m/z為14086.9或14093道爾頓)。經修飾的甲狀腺素運輸蛋白的另一優選實施例是磺化甲狀腺素運輸蛋白(峰位置處於m/z為13850道爾頓)。經修飾的甲狀腺素運輸蛋白的還一優選實施例是CysGly修飾的甲狀腺素運輸蛋白(峰位置處於m/z為13944道爾頓)。
第6圖是表示截斷形式(甲狀腺素運輸蛋白△N10)、未經修飾的、半胱氨醯化以及穀胱甘肽化的甲狀腺素運輸蛋白的相對峰的大小。如第7圖所示，與其它癌症及不患癌症的參照物相比，患有卵巢癌病人體內截斷形式(甲狀腺素運輸蛋白△N10)、未經修飾的、半胱氨醯化以及穀胱甘肽化的甲狀腺素運輸蛋白均降低(p＜0.001)。
C.IAIH4片段可用於本發明方法的標記的另一實施例世間-α-胰蛋白酶抑制因子重鏈H4的裂解片段，這裡用」IAIH4片段」、「ITIH4片段」及/或PK120片段指代。在一優選實施例中，IAIH4片段是選自IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2以及IAIH4片段No.3。在一更佳實施例中，「IAIH4片段」這一類術語包括IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2以及IAIH4片段No.3的任意一者。
IAIH4片段No.1可通過質譜分析法在m/z為12870.9峰位置處識別出來。IAIH4片段No.1按照所述方法的程序通過分餾血液來發現，然後施以IMAC晶片、由SELDI方法測定。該譜峰是自卵巢癌病人血清、經一系列色層分析分離技術純化得到的。其序列確定為MNFRPGVLSSRQLGLPGPPDVPDHAAYHPF(SEQ IDNO1)，是人類間-α-胰蛋白酶抑制因子片段具660-689個胺基酸長度，即重鏈H4(用IAIH4、ITIH4或PK120指代)。該結果是以胃蛋白酶消化該標記後分析其產物而確定的。在患有某一階段的卵巢癌病人體內，IAIH4片段No.1數量會上調。因此，與正常參照物對比，IAIH4片段No.1的出現或IAIH4片段No.1數量上升都將與卵巢癌狀態進行關聯。
用抗體對IAIH4進行SELDI免疫試驗，其結果可用於確定某一階段卵巢癌中數量上升的IAIH4片段。已通過此方法確定了幾個這樣的片段，其中兩個通過統計方法顯示卵巢癌與非卵巢癌之間存在明顯差異(請參閱第5圖)。IAIH4片段No.2的序列確定為FRPGVLSSRQLGLPGPPDVPDHAAYHPF(SEQ ID NO2)，其包括了IAIH4片段No.1中除前面兩個胺基酸殘基的所有胺基酸殘基。IAIH4片段No.2是通過質譜分析法在m/z為3031峰位置處識別出來的。IAIH4片段No.3的序列確定為RPGVLSSRQLGLPGPPDVPDHAAYHPF(SEQ IDNO3)，其包括了IAIH4片段No.1中除前面三個胺基酸殘基的所有胺基酸殘基。IAIH4片段No.3是通過質譜分析法在m/z為2884峰位置處識別出來的。正如IAIH4片段No.1那樣，患有某一階段卵巢癌病人體內IAIH4片段No.1及No.2數量會上調。因此，與正常參照物對比，IAIH4 No.1或No.2片段的出現或IAIH4 No.1或No.2片段數量上升都將與卵巢癌狀態進行關聯。
除此之外，本發明的優選方法還包括使用IAIH4片段的經修飾的形式。其包括轉譯後加成各種不同的化學基團，例如糖基化、脂化、半胱氨醯化以及穀胱甘肽化的基團。
D.其它被發現的卵巢癌標記於pH4與pH9衝提出的區分物種，亦確認出其它與卵巢癌疾病狀態有關的生物標記。於pH4區分物中，與該些生物標記相對應的蛋白質或蛋白質片段，是以於SELDI蛋白質晶片/質譜中的譜峰強度代表，該些生物標記中心分子量如下數值數據組1
數據組2
於pH9區分物中，與該些生物標記相對應的蛋白質或蛋白質片段，是以於SELDI蛋白質晶片/質譜中的譜峰強度代表，該些生物標記中心分子量如下數值
數據組3
標記I至XLVIII生物標記的質量在由SELDI質譜儀測得的規定數值的0.15％範圍內都被認為是精確的。
如上所述，標記I至XLVIII還可用與吸收劑的親和力為表徵，尤其是在下面會講述到的「蛋白質晶片分析方法的實施例的一般性評價」指定的條件下與固定化鰲合物(IMAC)-Cu基材表面結合能力。
E.已知卵巢癌標記本發明的某些實施例也採用已知卵巢癌生物標記結合使用至少一種選自由ApoA1、甲狀腺素運輸蛋白、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2以及IAIH4片段No.3的標記的方式。這裡「標記4」是用以指代已知卵巢癌標記。用作「標記4」的標記包括(但不僅限於)CA125、CA125II、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA195、TATI、CEA、PLAP、抗原Sialyl TN、半乳糖轉移酶、M-CSF、CSF-1、LPA、p110EGFR、組織激肽釋放酶、prostasin、HE4、CKB、LASA、HER-2/neu、尿促性腺激素肽、Dianon NB 70/K、TPA、骨橋蛋白和觸珠蛋白以及這些標記的蛋白質變異體(如裂解形式、異構形式)。
與正常受驗者對比，血液中這些標記的數值水平存在差別，基於這一事實，這些標記對於診斷卵巢癌是很有用的。例如，已知CA125在卵巢癌婦女血液中會提高。類似地，已知CA19-9、CA72-4、CA195、TATI、抑制素(inhibin)、PLAP及其它在卵巢癌婦女血液中亦會提高。在本發明的某些優選實施例所採用的方法中，至少一種已知標記(標記4)與至少一種選自ApoA1、甲狀腺素運輸蛋白、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2以及IAIH4片段No.3的標記結合使用。
F.生物標記的經修飾的形式的使用試驗發現，蛋白質經常以各和不同的形式存在於樣本中，而它們的質量均不同。這些形式經轉譯前後的經修飾的而得。轉譯前經修飾的形式包括等位變體、切片變體以及RNA編輯形式。轉譯後經修飾的形式包括經截斷、蛋白水解裂片(如母蛋白質的片段)、糖基化、脂化、半胱氨醯化以及穀胱甘肽化、磷酸化、異戊二烯基化、醯胺化、乙醯化、甲基化、硫酸化、磺化、羥基化、十四烷醯化、法尼基化(farnesylation)、氧化、泛素華化(ubiqutination)的形式。包括指定蛋白質及其所有經修飾的形式在內的蛋白質集合本文用「蛋白質群」來指代。特異性蛋白質的所有經修飾的形式的集合(不包括指定蛋白質本身)本文用「經修飾的蛋白質群」來指代。本發明的任何生物標記的經修飾的形式也都可以用作生物標記。在某些情況下，經修飾的形式比本文提出的指定形式顯示出更強的診斷能力。
經修飾的生物標記最初可經任何能夠從生物標記中發現並識別經修飾的生物標記的方法發現。初步發現的優選方法包括起初採用諸如生物特異性捕獲試劑來捕獲生物標記及經修飾的生物標記，然後通過質譜儀檢測被捕獲到的蛋白質分子。詳而言之，捕獲蛋白質所使用到的生物特異性捕獲試劑包括可識別生物標記及經修飾的生物標記的抗體、寡核甘酸配基或親和體。而且這種方法還捕獲了蛋白質相互作用物，該蛋白質相互作用物結合了蛋白質或可經抗體識別出來，而且本身可以是生物標記。優選地，生物特異性捕獲試劑與固態物質結合。然後，採用SELDI質譜技術檢測被捕獲到的蛋白質，或從捕獲試劑洗提蛋白質後，採用傳統的MALDI或SELDI技術檢測被洗提的蛋白質。由於質譜分析法可以區別並量化基於質量差異的經修飾的蛋白質，而無須作標籤，這樣使用質譜分析法就尤其吸引人。
優選地，生物特異性捕獲試劑被結合到諸如珠粒、平皿、薄膜、或晶片這類固態物質上。本技術領域內之人士已熟知如何將諸如抗體這類生物標記結合到固態物質上的方法。例如，可採用具有雙官能團的結合試劑，或者該固態物質可經諸如環氧化物或碳化二亞胺這類活性基團衍生而得，當這種固態物質與分子接觸時即可發生結合。生物特異性捕獲試劑可在同一位置與各種不同的靶向蛋白質混合，或者也可以在不同身體或可尋址的位置結合到固態物質上去。例如，可用經衍生的珠粒填充複數個色譜柱中，每個色譜柱只能捕獲單種蛋白質群。或者，可用各種不同的經捕獲試劑衍生而來的珠粒填充單個色譜柱，這樣在單個位置處就捕獲了所有分析物。相應地，諸如採用Luminex儀器(由Austin，TX提供)的xMAP技術這類經抗體衍生而來的以珠粒為載體的技術可用於檢測蛋白質群。然而，生物特異性捕獲試劑必須是特異性地針對蛋白質群中各個成員，以區分它們。
在另一實施例中，生物晶片表面既可在同一位置處、也可在不同身體可尋址的位置處經捕獲試劑捕獲蛋白質群衍生而得。在不同的可尋址的位置處捕獲不同蛋白質群的一個優點是使分析過程變得簡化。
識別經修飾的蛋白質並與有相關聯的臨床參數相關聯的後，該經修飾的蛋白質可在本發明所述的任一方法中用作生物標記。從這一點講，通過包括親和捕獲後採用質譜分析法、或特異性針對經修飾的蛋白質的傳統免疫試驗法在內的任意指定檢測方法即可完成對經修飾的蛋白質的檢測。免疫試驗法要求諸如抗體的生物特異性捕獲試劑去捕獲分析物。而且，該試驗方法必須要被設計為特異性區分蛋白質和經修飾的蛋白質。例如，可通過三明治試驗法來達成這一目的，在該方法中，一種抗體捕獲多於一種形式的蛋白質，而且清楚地區分抗體、特異性地結合以及提供各種形式蛋白質的檢測。還可通過對動物用生物分子免疫來製得抗體。本發明採用的傳統免疫試驗法包括諸如ELISA或基於螢光的免疫試驗法以及其它酶免疫試驗法在內的三明治免疫試驗法。
II.測試樣本A.受驗者類型樣本從想要確定卵巢癌狀態的婦女受驗者體內採集而得。這些受驗者可能是根據她們的家族史已經確診為患有高危卵巢癌的婦女。而其它患有卵巢癌的婦女測試將用於判斷治療效果。而且，還包括接受作為例行檢查一部分的測試的健康婦女，或是建立生物標記的基線資料庫。樣本可能是從已經確診為患有卵巢癌且接受了消除或緩解癌症的婦女體內採集而得。
B.樣本類型及樣本製備可以用各種不同的生物樣本類型來測試標記。樣本優選地是生物液體樣本。例如，可用於本發明的生物液體樣本包括血液、血清、血漿、陰道分泌物、尿液、淚液、唾液等等。由於所有標記都是在血清中發現的，所以血清是本發明實施例中優選樣本來源。
若需要，對樣本進行製備以增加標記可檢出率。例如，為了增加標記可檢出率，取自受驗者體內的血清樣本最好通過如汽巴克隆(Cibacron)藍色瓊脂糖色層分析與單股DNA親和性色層分析、陰離子交換樹脂、親和性色層分析(如與抗體)以及類似者的方法進行區分。區分方法視所用檢測方法而定。任何能增加感興趣蛋白質的方法都可以被採用。是否進行樣本製備，如前區分，是可加以選擇的，根據所使用的檢測方法的不同，樣本可能不需要製備成有利於增加標記的可檢出率。例如，如果使用專門結合標記的抗體來檢測樣本中的標記，那麼就無需製備樣本了。
典型地，樣本製備過程包括樣本區分以及收集用於探測是否含有生物標記的區分物。前區分方法包括例如，尺寸排斥色層分析法、離子交換色層分析法、甘肅色層分析法、親和性色層分析法、連續萃取法、凝膠電泳法與液相色層分析法。檢測前分析物亦可能會經過經修飾的。例如，分析前自血液中除去如白蛋白這類高數量蛋白質是有用的。區分方法舉例於PCT/US03/00531(已引入此全文以供參考)中有說明。
優選地，樣本是以陰離子交換樹脂進行前區分。陰離子交換色層分析法允許粗略地依照它們電荷特性進行樣本中蛋白質前區分。例如，採用Q陰離子交換樹脂(如Biosepra公司的QHyperDF)，而且樣本能用具不同pH值得洗提液連續衝提。陰離子交換色層分析法允許樣本中具更多負電荷的生物分子從其它類型生物分子分離出來。以高pH洗提液衝提的蛋白質可能是弱負電荷，而以低pH洗提液衝提的區分物中蛋白質可能是強負電荷。因此，除降低樣本多樣性外，陰離子交換色層分析法是依照它們結合的特性將蛋白質分離的。
在優選實施例中，血清樣本是以陰離子色層分析法做區分。高數量蛋白質對較低數量蛋白質訊號的抑制是對SELDI質譜法重要的挑戰。樣本區分降低了每一區分物組成的多樣性。這種方法也可用於試圖將高數量蛋白質分離至一區分物中，從而降低對較低數量蛋白質的訊號抑制。陰離子交換區分通過等電點(pl)分離蛋白質。蛋白質是由具兩性電荷胺基酸組成，蛋白質電荷受其曝露環境的pH而改變。蛋白質等電點是指蛋白質無淨電荷處的pH值。當環境的pH等於蛋白質等電點時，則認為蛋白質為在中性。當pH高於蛋白質等電點時，則認為該蛋白質具淨負電荷。當環境pH低於蛋白質等電點時，則認為該蛋白質具淨正電荷。血清樣本是依照以下實施例提出的操作步驟做區分，以獲得本發明所述的標記。
蛋白質為陰離子交換樹脂捕獲後，以一系列於pH9、pH7、pH5、pH4、pH3清洗方式衝提。通過三個區分物(pH9、pH4及有機溶劑)的圖形數據的單一化最大分離性分析(Unified Maximum Separability Analysis，UMSA)方法發現一組三種潛在生物標記。pH4區分物於m/z12828與28043這兩個譜峰，在癌症組群中皆向下調整；第三個標記是pH9流洗出的區分物中，位於m/z3272的譜峰，其譜峰強度於癌症組群眾向上調整。所有區分物皆結合至固定化金屬親和性色層分析列陣，該列陣具銅離子電荷(IMAC3-Cu)(請參閱第1圖中的光譜圖)。
樣本中生物分子也能經高解析電泳分離，如一維或二維凝膠電泳。含有標記的區分物能通過氣相離子光譜法分離並進一步分析。優選地，可採用二維凝膠電泳產生包括至少一種標記的二維生物分子點列陣。請參閱如Jungblut Thided，Mass Spectr.Rev.16145-162(1997)。
二維凝膠電泳可通過使用本領域技術已知方法來實施。例如見德意志(Deutscher)編著，酶學方法(MethodsIn Enzymology)第182卷。典型地，樣本中生物分子是以猶如等電聚焦方式分離，此方式中樣本中生物分子以pH梯度分離，直至生物分子達到淨電荷為零(亦即等電點)為止。這第一個分離步驟產生了一維生物分子列陣。該一維列陣中生物分子進一步與第一個分離步驟所用技術通常有所區別的技術進行分離。例如，於第二維中， 以等電聚焦方式分離的生物分子復採用聚丙烯醯胺膠體進行分離，諸如在十二烷基硫酸鈉(SDS-PAGE)存在下的聚丙烯醯胺凝膠電泳法。SDS-PAGE凝膠允許基於生物分子的分子量進行進一步分離。典型地，二維凝膠電泳能在複合混合物中化學性分離分子量範圍1000至200000道爾頓的不同生物分子。該些凝膠的等電點範圍約3-10(屬於寬範圍凝膠)。
二維列陣中的生物分子能以本技術領域內熟知的適合方法進行檢測。例如，將凝膠中生物分子做標記或染色(如考馬斯藍或銀染色)。如果凝膠電泳法產生相等於本發明的至少一種標記分子量的色點，則該色點可通過氣相離子光譜法做進一步分析。或者，可通過施加一電場將含有生物分子的凝膠轉移至鈍化膜上。然後膜上約相等於該標記分子量的色點可通過氣相離子光譜法進行分析。在氣相離子光譜法中，色點可通過任何適合技術，諸如本文所述的MALDI或SELDI(例如使用ProteinChip列陣)進行分析。
進行氣相離子光譜法分析前，還需要將色點中生物分子用諸如蛋白酶(如胰蛋白酶)的切割劑切割成較小片斷。生物分子被切割成這樣小的片段以供色點中該生物分子的質量指紋，若需要，該指紋能用於判別標記。
高效液相層析法(HPLC)也可基於生物分子不同的物理性質如極性、電荷及大小，將分離樣本中生物分子混合物分離。HPLC儀器通常由流動相儲罐、泵、注射器、分離柱及檢測器組成。樣本中生物分子通過注射等分試樣至分離柱而進行分離。混合物中不同的生物分子，由於在分離柱中移動相與固定相間分布行為的差異，是以不同速度通過分離柱。故能收集相等於至少一種標記的分子量及/或物理性質的區分物。區分物可通過氣相離子光譜法檢測標記而加以分析。例如，色點可通過如此處所述的MALDI或SELDI(例如使用ProteinChip列陣)進行分析。
或可供選擇地，標記在分析之前先經經修飾的以提高其解析力或判別力。例如，標記在分析前經蛋白質分解消化。任何蛋白酶都適用。可能將標記切割成不連續數目片斷的蛋白酶，諸如胰蛋白酶，特別有用。消化產生的片段可作為標記指紋，這樣使得間接檢測該標記成為可能。當有類似分子量的標記也許會與還未確認的標記混淆時，標記指紋尤為有用。而且，蛋白質分解片斷對高分子量標記也有用處，因為較小標記較易通過質譜法解析。在另一實施例中，生物分子可經經修飾的以提高檢測解析力。例如，可用神經胺糖酸酶(neuraminidase)自糖蛋白移除末端唾液酸(sialicacid)殘基，以改善對陰離子吸附劑(如陽離子交換ProteinChip列陣)的結合作用，以及改善檢測解析力。另一實施例中，標記可通過黏附特異性結合分子標記，又可識別標記的特定分子量標記進行經修飾的。或可選擇地，檢測該經經修飾的的標記後，該標記還可通過匹配蛋白質資料庫(如SwissProt)中經修飾的標記的物理和化學特徵來進一步得到確定。
III.標記捕獲最好用可被固定至固體支撐物(諸如本文所述的任何生物晶片、多格微滴定盤或樹脂)的捕獲劑來捕獲生物標記。尤其本發明的生物標記是用SELDI蛋白質生物晶片捕獲。捕獲是發生於色層分析表面或生物特異性表面。任何包括反應性表面的SELDI蛋白質生物晶片皆可用於捕獲與檢測本發明的生物標記。然而，本發明的生物標記是結合至固定化金屬螯合物上。IMAC-3和IMAC-30生物晶片，其次氨基乙酸官能團可通過螯合作用吸收過渡金屬離子(如Cu2+和Ni2+)，是本發明用於捕獲生物標記的優選SELDI生物晶片。任何包括反應性表面的SELDI蛋白質生物晶片皆可用於捕獲和檢測本發明的生物標記。這些生物晶片能以特異性捕獲生物標記的抗體進行衍生，或者以結合免疫球蛋白的蛋白質A或蛋白質G捕獲劑進行衍生。然後生物標記可為適用特異性抗體的溶液捕獲，同時該該已捕獲的標記通過由捕獲劑自生物晶片上分離出來。
通常，含有諸如血清的生物標記樣本是放置於生物晶片的活性表面上，以俾使有充分時間進行結合。然後，未結合的分子用適合的衝提劑諸如磷酸鹽緩衝液自該表面衝提出來。通常，該衝提劑離子力越強，則該蛋白質必須結合得越緊，俾使衝提後蛋白質仍留在該表面上。此時滯留的蛋白質生物標記能以適合的方式進行檢測。
IV.標記檢測與測定一旦諸如生物晶片或抗體的基質捕獲到標記，則可用任何適合方法測定樣本中的標記。例如，可能各種方法包括例如氣相離子光譜法、光學法、電化學法、原子力顯微鏡法以及射頻法檢測及/或測定標記。使用這些方法可檢測至少一種標記。
A.SELDI一種檢測及/或測定生物標記的優選方法是使用質譜法，尤其是″表面強化雷射解吸/電離″或″SELDI″。SELDI是指在解吸/電離氣相離子光譜測定法(如質譜分析法)的其中一種方法，在這種方法中，在SELDI探針的表面捕獲分析物，而SELDI探針是與氣相離子光譜測定儀(如質譜儀)的探針接口電性結合。在「SELDI質譜」中，該氣相離子光譜測定儀是質譜儀。以上使較詳細地敘述SELDI技術。ApoA1、六種形式的經修飾的ApoA1、甲狀腺素運輸蛋白△N10、天然甲狀腺素運輸蛋白、半胱氨醯化甲狀腺素運輸蛋白、磺化甲狀腺素運輸蛋白、CysGly修飾的甲狀腺素運輸蛋白、穀胱甘肽化甲狀腺素運輸蛋白、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2以及IAIH4片段No.3的檢出譜峰分別位於m/z約28043(或28055)；m/z約29977.4，28262，28473，28692，28844，29031；m/z約12870.9，m/z約13761或13767；m/z約13890.8或13888；m/z約13850；m/z約13944；m/z約14086.9或14093；m/z約3272；m/z約3031；以及m/z約2884。
B.免疫試驗法在另一實施例中，可採用免疫試驗法進行檢測和分析樣本中的標記。該方法包括(a)提供特異性結合標記的抗體；(b)將樣本與抗體接觸；以及(c)檢測樣本中結合有標記的抗體複合體是否存在。
免疫試驗法是一種用抗體特異性結合抗原(如標記)的測試方法。其特徵是使用特定抗體特異性結合特性，進行抗原的分離、定標及/或定量。當涉及蛋白質或肽時，″特異性(或選擇性)結合″至抗體或″具特異性(或選擇性)免疫反應性″術語，是指於蛋白質與其它生物分子的異種分布中決定該蛋白質存在的結合反應。因此，自指定的免疫試驗法條件下，特定的抗體至少結合特定蛋白質兩次，且對樣本中其它蛋白質無顯著量地充分結合。與抗體在這種條件下特異性結合需要選擇專門針對特定蛋白質的抗體。例如，選擇自特定物種如大白鼠、老鼠或人類的標記培養的多株抗體，以得到那些只對該標記並不對其它蛋白質(除該標記的多晶變異體和對偶基因外)具特異性免疫反應性的多株抗體。這一選擇可能需要通過排除與其它物種中標記分子進行交互反應的抗體而獲得。
通過使用經純化當標記或其核酸序列，特異性結合標記的抗體可採用各種本技術領域已知的適合方法製備。如，請參閱科立根(Coligan)著，免疫學現代檔案(CurrentProtocols in immunology)(1991)；哈洛與蓮(Harlow Lane)著，抗體實驗室手冊(AntibodiesA LaboratoryManual)(1988)；高丁(Goding)著，單株抗體原理與應用(Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice)，第二版(1986)；以及科勒與密爾斯丹(Kohler Milstein)，Nature256495-497(1975)。這樣的技術包括，但不僅限於此，通過選擇噬菌體或類似媒介物中重組抗體資料中的抗體，以進行抗體的製備，以及通過免疫兔或免疫老鼠的方法製備多株與單株抗體(如，請參閱Huse等人，Science2461275-1281(1989)；Ward等人，Nature341544-546(1989))。典型來說，特異性或選擇性反應將至少高於背景訊號或噪聲兩倍，而更典型地則為高於背景訊號10至100倍。
通常，自受驗者處得到的樣本可與特異性結合標記的抗體相接觸。或可供選擇地，抗體在與樣本接觸前，能被固定至固體支撐物上，以利於衝提與單離該化合物。固體支撐物包括例如微滴定盤、棒、珠或微珠形式的玻璃或塑料。抗體亦能黏附於以上所述的探針基質或ProteinChip列陣。樣本以取自受驗者的生物學液體樣本為宜。生物學液體樣本舉例包括血液、血清、血漿、乳頭分泌物、尿液、淚液、唾液等。在優選實施例中，該生物學液體是由血清組成。樣本接觸抗體之前，可用適當衝洗劑稀釋樣本。
用抗體培養樣本後，清洗該混合物，這樣就可以檢測形成地抗體-標記化合物。此檢測可通過檢測試劑培養該已被清洗的混合物來完成。此檢測試劑可以是例如以可檢測標記標識的第二抗體。可檢測標識舉例包括磁珠(如DYNABEADSTM)、螢光染料、放射性標記、酶(如山葵過氧化酶、鹼性磷酸酶及其它ELISA常用酶)，以及諸如膠體金、有色玻璃或塑料珠的比色標記。或者，樣本中的標記是以間接方法測定，其中，例如具標記的第二抗體被用作檢測被結合的標記-特異性抗體，及/或競爭或抑制方法中，例如，結合至該標記的明顯抗原決定基的單株抗體是與該混合物同時培養的。
測定抗體-標記化合物數量或存在與否的方法包括，例如，螢光、發光、化學發光、吸收率、反射率、透光率、雙折射率或折光指數的檢測(如表面電漿共振、橢偏術、共鳴鏡法、光柵耦合器波導方法或幹涉量度分析法)。光學方法還包括顯微鏡法(共焦或不共焦)、呈像方法和非呈像方法。電化學分析法包括伏安法和電流分析法。無線頻率分析法包括多極共振光譜分析法。施行該些分析方法軾本技術領域已知者。有用的分析方法包括，例如，諸如酶聯免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、放射免疫分析法(radioimmune assay，RIA)、西方墨點分析法(Western blot assay)或長條墨點分析法(slotblotassay)的酶免疫分析法(enzyme immune assay，EIA)。該些方法於下列文獻中亦有說明，例如，細胞生物學方法細胞生物學中抗體(Methodsin Cell BiologyAntibodies in Cell Biology)，第37卷(阿塞(Asai)編著，1993)；基礎與臨床免疫學(Basic and ClinicalImmunology)(史提特斯與特爾(Stites Terr)編著，第7版，1991)；以及哈洛與蓮的著作(前面已述)。
整個分析方法中，於每一試劑相結合後需要進行培養及/或清洗步驟。培養步驟自約5秒至幾個小時變化，最好自約5分種至約24個小時。然而，培養時間將視分析方法類型、標記、溶液體積濃度等而定。雖然分析方法可於一溫度範圍如10℃至40℃下施行，但通常該分析方法將於常溫下進行。
免疫分析法可用於判斷樣本種標記存在與否，以及樣本種標記的量。抗體-標記化合物的量可通過與標準物對比而定。標準物是如已知化合物或已知存在於樣本種的另一種蛋白質。如上所述，標記的試驗量無須以絕對單位測定，只要該測定單位可與參照組對比即可。
檢測樣本中該些標記的方法有很多應用。例如，至少一種標記可用於幫助人類癌症診斷或預後的測定。另一實施例中，標記檢測的方法可用於監測受驗者對癌症治療的反應。在一實施例中，檢測標記的方法可用於分析與確認體內或體外調節這些標記表現的化合物。在優選實施例中，生物標記適用於區別腫瘤進程的不同階段，以俾於幫助確定適當的療法以及判斷該腫瘤轉移程度。
V.數據分析當例如使用質譜法測定樣本時，即產生數據，該數據隨後通過計算器軟體程序分析。通常，該軟體是包括可將質譜儀訊號轉換成計算器可讀形式的編碼。該軟體還包括能將算法運用於判斷訊號是否代表訊號中對應於本發明標記或其它有用標記的″譜峰″位置的訊號分析的編碼。該軟體還包括執行比較來自試驗樣本的訊號與″正常″及人類癌症的典型訊號特徵以及確定這兩種訊號間符合程度的算法的編碼。該軟體還包括指示試驗樣本最接近哪個特徵的編碼，從而提供可能性診斷。
本發明的優選實施例中，需要測定多種生物標記。使用多種生物標記可提高試驗預測值得準確度，以及於診斷、毒物學、病人狀態及病人監控方面提供較大用處。稱為″圖案識別(pattern recognition)″的過程大大改善了對預測性藥物的臨床蛋白體的靈敏度與特異性，其中該過程是檢測由多種生物標記形成的圖案。臨床樣本數據(例如以SELDI方法測得的)的細微差異顯示蛋白質表現的某些圖案可預測諸如一些疾病存在與否、癌症進程特定狀態、或是藥物治療正向或逆向反應之類的表現型。
質譜法產生的數據是由通過如上所述的離子檢測器檢測離子開始的。離子撞擊檢測器，產生由高速時間列陣記錄器所數位化的電能，該記錄器是數位化地捕獲仿真訊號。塞弗吉蛋白質晶片(Ciphergen′s ProteinChip)系統採用摹擬對數字轉換器(ADC)來完成此動作。ADC將檢測器輸出於固定寬度時間間隔整合成與時間有關的箱型訊號。該時間間隔典型地為一至四納秒(nanosecond)長。再者，最後分析的飛行時間光譜，典型地並不代表來自對樣本離子化能量的單一脈衝訊號，而是來自許多脈衝訊號的總和。這樣就能降低噪音，增加動態範圍。該飛行時間數據隨後進行數據處理。在塞弗吉蛋白質晶片軟體中，典型數據處理包括TOF對M/Z轉換、基線扣除、高頻噪聲過濾。
TOF對M/Z轉換包括將飛行時間轉換成質荷比(M/Z)的算法運用。在此步驟中，訊號從時間相關轉換成質量相關。亦即，將每一飛行時間轉換成質量對電荷比，即M/Z。校正是做內或外校正。於內校正，被分析的樣本包涵至少一種已知M/Z分析物。位於代表這些質量分析物的飛行時間的訊號峰被指定為該已知M/Z。基於這些指定M/Z比值，計算轉換飛行時間為M/Z數學函數的參數。於外校正，將飛行時間轉換為M/Z的函數，諸如以先前內校正造出的函數，以未使用內校正物方式應用至飛行時間光譜上。
基線扣除是通過消除會干擾光譜的假的、可重複顯現的儀器偏移量，來改善數據定量。其包括使用導入諸如峰寬的參數的算法以計算光譜基線，然後自質譜中扣除該基線。
高頻噪聲訊號是通過平滑函數除去的。典型平滑函數是對每一時間相關箱型訊號應用移動平均函數。於改善版中，移動平均過濾器是可變寬度數字過濾器，於該過濾器中，過濾器帶寬是隨著諸如譜峰帶寬的函數而改變，通常隨飛行時間增加而變寬。例如見2000年11月23日申請的國際專利WO00/70648(Gavin et al.，「Variable WidthDigital Filter for Time-of-flight Mass Spectrometry」)。
分析通常包括代表來自分析物訊號的光譜譜峰確認。當然，譜峰的選定可通過肉眼來完成。然而，塞弗吉蛋白質晶片軟體中一部分程序亦可用於自動檢測譜峰。通常，該程序的功能是識別具訊號對噪聲比大於選定闕值的訊號，並對該譜峰訊號中央的譜峰質量做標記。在一有用的應用中，比較許多光譜，以確認出現在某些選定比例的質譜中的相同譜峰。該軟體的一個版本是將出現於特定質量範圍內不同光譜的所有譜峰聚集成群，並對靠近該質量(M/Z)群的中點的譜峰指定質量(M/Z)。
來自至少一個光譜的譜峰數據，通過例如製做電子表格來進行進一步分析，在該電子表格中，電子表格每一行代表一特定質譜，每一列代表由質量定義光譜中的譜峰，且每一單元格包含特定光譜中該譜峰強度。各種統計或圖案辨認方法都可應用於數據上。
在一實施例中，塞弗吉生物標記式樣TM軟體(Ciphergen′s Biomarker PatternsTMSoftware)用於檢測產生的光譜式樣。採用分類模型的式樣辨認處理對數據進行分類。通常，該光譜將代表來自至少兩種不同組群(使用分類算法來尋找)的樣本。例如，該組群是病理學的對非病理學的(如癌症對非癌症)、藥物反應對非藥物反應、毒性反應對非毒性反應、疾病狀態進步者對疾病狀態非進步者、有表現型情況對無表現型情況。
本發明實施態樣中產生的光譜可用分類模型的式樣辨識處理分類。在一些實施例中，源自使用諸如″已知樣本″的樣本產生的光譜(如飛行時間光譜的質量光譜)的數據可用於″訓練″分類模型。″已知樣本″是事先分類(如癌症或非癌症)的樣本。來自該光譜且用於形成分類模型的數據被稱未″訓練數據組″。一經訓練，該分類模型可識別來自用未知樣本產生的光譜的數據類型。然後分類模型可用於將未知樣本分類。例如，造預測特定生物學樣本是否與某一生物學狀況(如疾病對非疾病)相關時，分類模型是很有用的。
用於形成分類模型的訓練數據組應包括天然數據或預處理數據。造一些實施例中，天然數據可直接從飛行時間光譜或質譜得到，然後以任何適當方式進行選擇性″預處理″。例如，可選擇大於預定訊號對噪聲比的訊號，以便於選擇光譜中譜峰子集，而不是選擇光譜中所有譜峰。在另一實施例中，在普通數值(如飛行時間數值或質量對電荷比數值)的預定數目譜峰″群組″可用於選擇譜峰。舉例來說，如果給定質量對電荷比的譜峰少於質譜群組中該質譜的50％，那麼該質量對電荷比的譜峰可自訓練數據組中省略。諸如這些的預處理步驟可用於減少用於訓練分類模型數據的數量。
分類模型可用任何適當且試圖將數據主體基於數據中呈現的目標參數而分隔成組的統計分類(或″學習″)方法來形成。分類方法可以是監督式或非監督式。監督式與非監督式分類處理例子於Jain著作″統計式樣識別回顧(Statistical Pattern RecognitinA Review)″，類型分析的IEEE處理與機械智能，第22卷，1期，2000年1月中有說明，此處以其完整資料引用作為參考。
於監督式分類中，含有已知種類例子的訓練數據是呈現於學習機制中，即學習多於一組定義每一已知類別的關係。然後新數據被應用於該學習機制中，該學習機制然後用學到的關係分類新數據。監督式分類處理舉例包括線性回歸處理(如多重線性回歸(multiple linearre gression，MLR)、部份最小平方回歸(partial least squaresreg ression，PLS)與主成分回歸(principle components regression，PCR))、二元決策樹(binary decisi on trees)(如遞歸分布處理(recursive portioning processs)，如分類及回歸樹(CART))、類神經網絡(artificial neural networks)如倒傳遞網絡(backpropagation networks)、辨別分析(如貝斯分類器(Bayesian classifier)或費舍分析(Fisheranalysis))、邏輯分類器以及支持向量分類器(supportvector classifier)(支持向量機(support vector machine))。
優選監督式分類方法是遞歸分布處理。遞歸分布處理使用遞歸分布樹分類來自未知樣本的光譜。關於遞歸分布處理進一步詳細內容在美國專利US20020138208A1(Paulse et al.，「分析質譜方法(Method for analyzing massspectra)，」2002年9月26日)中有提供。
在其它實施例中，製做出的分類模型可用非監督式學習方法形成。非監督式分類試圖以訓練數據組中的相似性為基礎學習分類，其中無須預先分類來自訓練數據組的光譜。非監督式學習方法包括群集分析。群集分析是試圖將數據分成理想上應有彼此非常相似而又對其它群集成員非常不相似的″群集″或群組。相似性是用一些測量數據組間距離的距離尺度來測定，並且將彼此靠近的數據組集合起來。群集技術包括MacQueen K-平均值算法與Kohonen自我組織網絡(SelfOrganizing Map)算法。
主張學習算法用於分類生物學訊息在例如國際專利WO01/31580(Barnhill等人，″確認生物學系統中式樣的方法與裝置及其使用方法(Methods and devices foridentifying patterns in biological systems and methods ofuse thereof)″，2001年5月3日)；美國專利US2002/0193950A1(Gavin等人，″質譜方法或分析(Method or analyzing mass spectra)″，2002年12月19日)；美國專利US2003/0004402A1(Hitt等人，″以自生物學數據隱藏式樣為基礎的生物學轉臺間識別處理(Process for discriminating between biological statesbased on hidden patterns from biological data)″，2003年1月2日)；以及美國專利US2003/0055615A1(張與張，″處理生物學表現數據的系統與方法(Systems andmethods for processing biological expression data)″，2003年3月20日)。
詳而言之，為得到生物標記ApoA1、甲狀腺素運輸蛋白以及IAIH4片段，將癌症病人與健康參照物的樣本譜峰強度數據當作″發現組″。將該數據合併並隨意分成訓練組與試驗組，用單一最大分離分析(Unified MaximumSeparability Analysis，USMA)分類器的非線性版建立並試驗多變量預測模型。USMA分類器詳細內容於美國專利US2003/0055615A1中有敘述。
通常，自上面部分IV產生的數據是被放入診斷算法(亦即如上所述的分類算法)中。以學習算法為基礎，然後產生分類算法。該過程包括發展能夠產生分類算法的算法。本發明的方法是基於統計樣本計算，通過增加足夠數目的一些卵巢癌與正常樣本產生更精確的分類算法。在學習算法中，該樣本是作為數據訓練組。
該分類的產生，亦即診斷、演算，是依賴於用於分析樣本亦即產生前述部分IV得到的數據的分析操作。用於檢測及/或測定標記(如步驟IV)的操作步驟務必與用於獲得發展該分類演算的數據相同。必須在整個訓練和分類系統中保持不變的測試分析條件包括晶片類型與質譜儀參數，以及一般樣本製備與試驗操作步驟。如果檢測及標記/或測定標記(如步驟IV)的操作步驟改變了，則該學習演算與分類演算也必須改變。類似地，如果學習演算與分類演算改變，則檢測及標記/或測定標記(如步驟IV)的操作步驟也必須改變，俾使與用於產生分類演算的操作步驟一致。發展新的分類演算模型需要引入足夠數目的卵巢癌與正常樣本，以新的檢測操作步驟為基礎發展新的訓練數據組，用該數據產生新的分類演算，最後用多點(multi-site)研究驗證該分類演算。
分類模型可在任何適當的數字計算器上建立並使用。適當的數字計算器包括使用任何標準或特殊作業系統如Unix、Windows TM或LinuxTM基本作業系統的微、迷你或大型計算器。所使用的數字計算器在實體上可能與用於製造有興趣光譜的質譜儀分開，也可能與質譜儀連用。如果數字計算器與質譜儀是分開的，則數據必須通過一些其它方式(不管人工或自動化)輸入計算器中。
依照本發明實施例的訓練數據組與分類模型可通過數字計算器執行的計算器代碼使其具體化。該計算器代碼可存放於任何適當的計算器可讀媒介包括光碟或磁碟、棒、磁帶等，並能以任何適當計算器程序語言包括C、C++、visual basic等寫成。
VI.優選實施例在優選實施例中，自病人體內收集血清樣本，然後採用上述說明的陰離子交換樹脂區分。用IMAC銅蛋白質晶片列陣捕獲樣本中生物標記。在這一測試中能檢測到ApoA1、經修飾的ApoA1、甲狀腺素運輸蛋白△N10、天然甲狀腺素運輸蛋白、半胱氨醯化甲狀腺素運輸蛋白、磺化甲狀腺素運輸蛋白、CysGly修飾的甲狀腺素運輸蛋白、穀胱甘肽化甲狀腺素運輸蛋白、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2以及IAIH4片段No.3。然後將結果輸入計算器系統中，該系統包含有的算法是以與用於學習演算與分類演算來進行初始判斷生物標記的相同參數進行設計。該算法基於接受到的與每個生物標記都相關的數據而產生診斷。
在尤其優選實施例中，也要檢測CA125II生物標記的數量，而且也是通過使用諸如免疫分析法的已知方法或使用SELDI蛋白質晶片列陣來進行檢測的。在這些實施例中，CA125II標記結果亦是輸入至計算器演算中，用於準備診斷。基於ApoA1、甲狀腺素運輸蛋白△N10、IAIH4片段No.1以及CA125II這四種生物標記的檢測的診斷試驗，至少有約80％的特異性。
通過用生物標記發展的分類演算檢查自SELDI試驗產生的數據來判定診斷。該分類演算是依賴於用於檢測該生物標記自懷疑試驗操作步驟的特點。這些特點包括例如，樣本製備、晶片類型以及質譜儀參數。如果該試驗參數有改變，則該演算必須改變。同樣地，如果該演算改變，則該試驗操作步驟亦必須改變。
另一實施例中，自病人體內收集血清樣本。採用上述說明的抗體蛋白質晶片列陣來捕獲生物標記。用生物特異性SELDI測試系統來檢測該標記。在這一測試中能檢測到ApoA1、經修飾的ApoA1、甲狀腺素運輸蛋白△N10、天然甲狀腺素運輸蛋白、半胱氨醯化甲狀腺素運輸蛋白、磺化甲狀腺素運輸蛋白、CysGly修飾的甲狀腺素運輸蛋白、穀胱甘肽化甲狀腺素運輸蛋白、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2以及IAIH4片段No.3。然後將結果輸入計算器系統中，該系統包含有的算法是以與用於學習演算與分類演算來進行初始判斷生物標記的相同參數進行設計。該算法基於接受到的與每個生物標記都相關的數據而產生診斷。
在其它優選實施例中，以非SELDI方式捕獲與試驗標記。於一實施例中，自病人體內收集血清樣本。採用其它已知方法如抗體對標記在基質上捕獲生物標記。用本技術領域內已知方法如光學法與折射指數法來檢測該標記。光學法實例包括例如ELISA的螢光檢測。折射指數法實例包括表面電漿共振。然後對標記結果進行演算，該演算可能需要亦可能不需要人工智慧。該算法基於接受到的與每個生物標記都相關的數據而產生診斷。
上述任何方法中，自樣本獲得的數據可直接自該檢測方法輸入至具診斷演算的計算器中。或者，獲得的數據以人工方式，或通過自動化方式，輸入至具診斷演算的個別計算器中。
VII.受驗者診斷及卵巢癌狀態的確定任何生物標記各自對卵巢癌狀態的確定都有幫助。首先，在受驗者樣本中使用此處所述的方法，如先在SELDI生物晶片上捕獲然後用質譜法檢測，來測定被選擇的生物標記。然後，用該測量結果與以區別卵巢癌狀態與非癌症狀態的診斷量或參照組相比較。該診斷量將反應這樣的訊息與非癌症狀態比較，癌症狀態中個別生物標記是上調或下調。如本技術領域內所習知的，該使用的特定診斷量須加以調節以提高診斷分析法(是依照診斷醫師喜好採用)的靈敏度與特異性。這樣，與該診斷量對照的試驗量便顯示出卵巢癌狀態。
當各自生物標記是為有用的診斷標記時，發現生物標記組合提供了比單一生物標記更大的預測價值。尤其，樣本中多個標記的檢測提高了真陽性與真陰性診斷的百分比，並會降低假陽性或假陰性診斷的百分比。如此一來，本發明的優選方法是測定多於一個的生物標記。例如，本發明方法ROC分析中，其AUC大於0.50，更佳方法的AUC大於0.60，而更優方法的AUC大於0.70。特優方法AUC大於0.70，而最佳方法AU C大於0.80。
再者，使用本發明三個優選標記與諸如CA125的標記4組合在一起進行測定的方法大大改善了該CA125的診斷效果，提供AUC大於0.50的試驗，AUC大於0.60的優選試驗，AUC大於0.70的更優選試驗。
為了使用組合生物標記，邏輯回歸演算是有用的。UMSA演算對於自試驗數據產生診斷演算尤為有用。該演算於下列文獻中有揭露Z.Zhang等人，將分類分離分析方法應用於微列陣數據中(Applying classificationseparability analysis to microarray data)；Lin SM，JohnsonKF編著，微列陣數據分析方法(Methods of Microarray dataanalysis)CAMDA』00報告，波士頓Kluwer學術出版社，2001125-136；以及Z.Zhang等人，釣魚探險-從表現圖譜概略萃取式樣的監督式方法(Fishing Expedition-aSupervised Approach to Extract Patterns from aCompendium of Expression Profiles；Lin SM，Johnson KF編著，微列陣數據分析方法IICAMDA』01報告，波士頓Kluwer學術出版社，2002。
學習演算將產生多變量分類(診斷)演算，並調成操作者期望的特定特異性與靈敏度。然後該分類演算可用於確定卵巢癌狀態。該方法還包括測定受驗者樣本中被選定的生物標記(如ApoA1、經修飾的ApoA1、甲狀腺素運輸蛋白△N10、天然甲狀腺素運輸蛋白、半胱氨醯化甲狀腺素運輸蛋白、磺化甲狀腺素運輸蛋白、CysGly修飾的甲狀腺素運輸蛋白、穀胱甘肽化甲狀腺素運輸蛋白、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2以及IAIH4片段No.3)。這些測量提供給分類演算。該分類演算產生指示卵巢癌狀態的指示器分數。
在一些實施例中，在未對標記定量的情況下，少量出現標記或不出現標記是有用的，而且可以與卵巢癌的可能性診斷相關聯。例如，卵巢癌病人中檢測到IAIH4片段的頻率比正常受驗者高。同樣地，例如，卵巢癌病人中檢測到生物標記ApoA1與甲狀腺素運輸蛋白的頻率比正常受驗者低。因此，分別檢測到受驗者被發現存在或不存在表明該受驗者有患卵巢癌的較高可能性。
其它實施例中，標記的測量包括定量標記，以關聯標記檢測結果與卵巢癌的可能性診斷。因此，如果受驗者體內被檢測到的標記數量與參照組數量比較有差異(亦即比參照組高或低，視該標記而定)，則該受驗者有患卵巢癌的較高可能性。
該關聯性需要考慮比較樣本中該(些)標記量與該(些)標記參照量(該(些)標記向上或向下調節)(例如，正常者無法檢測到癌症)。參照量可以是例如為未檢測到癌症的正常受驗者的可比樣本中出現標記量的平均或中位數。該參照量是在該試驗量測定相同或實質上類似的實驗條件下測定的。該相關性須考慮試驗樣本中該標記存在與否，以及參照組中該相同標記檢測頻率。該相關性須考慮這兩者因素以助於確定卵巢癌狀態。
在某些評定卵巢癌狀態的方法實施例中，該方法還包括基於該狀態的指導受驗者治療。如前所述，這種指導描述的是醫師或臨床醫師在對確定卵巢癌狀態之後採取的行動。例如，如果本發明方法的結果無法下結論或有理由認為確認狀態是必須的，則醫師必須安排更多試驗。或者，如果該狀態表明動手術是適當的，則醫師必須安排病人動手術。其它舉例，病人必須接受化學治療或放射性療法，以替代或輔助手術療法。同樣地，如果該結果是負面的，例如該狀態顯示卵巢癌晚期或如果該狀態為急性，則無須採取進一步動作。再者，如果該結果顯示已成功治癒，則無須進一步安排了。
本發明還提供受驗者安排治療方法後再次測定生物標記(或生物標記的特定組合)的方法。在這些例子中，該方法是用於監視癌症狀態，例如對癌症治療的反應、疾病減緩或疾病進展程度由於這些方法容易操作以及缺乏侵入性，因此病人接受每一治療後，可重複使用這些方法。這樣就允許醫師監視治療過程的效果。如果結果顯示治療無效，則處理過程應做相應變化。這使得醫師可以彈性選擇治療方法。
另一實施例中，用於檢測標記的方法可被用於分析及識別調節體內或體外該些標記表現的化合物。
本發明的方法亦有其它應用。例如，該標記可用於篩選調節體內或體外標記表現的化合物，其中該化合物反過來對治療或避免病人卵巢癌很有用處。另一實施例中，該標記可用於監測對卵巢癌治療的反應。又一實施例中，該標記可用於遺傳研究以決定是否該受驗者有發展成卵巢癌的風險。例如，某些標記可能在基因上是相關聯的。這可以通過例如分析患有卵巢癌家族病史的卵巢癌病人群樣本而定。該結果然後可與例如自無卵巢癌家族病史的卵巢癌病人得到的數據加以比較。基因上相關聯的標記可作為判斷有卵巢癌家族病史的受驗者是否有卵巢癌傾向的工具。
本發明的另外一些實施例是有關於將分析結果或診斷結果或兩者傳達給技術專家、醫師或病人。在某些實施例中，計算器被用作將分析結果或診斷結果或兩者傳達給相關群體如醫師及其病人的工具。在一些實施例中，做試驗或分析出試驗結果所在的國家或司法系統與將該試驗結果或診斷結果被傳達給的國家或司法系統會不同。
本發明的優選實施例中，基於在試驗受驗者中是否存在本發明的任何生物標記的診斷結果一旦獲得就應儘快傳達給該受驗者。該診斷結果可能是通過受驗者的治療醫師傳達給該受驗者。或者，該診斷結果是通過郵件發送給試驗受驗者或通過電話傳達給受驗者。計算器可用於通過郵件或電話傳達診斷結果。在某些實施例中，含有診斷測試結果的訊息被產生並使用計算器硬體與軟體結合自動傳遞給熟悉通訊技術的受驗者。一健康導向的通訊系統的例子在美國專利US6283761中有描述；然而，本發明並不僅限於利用這種特殊通訊系統。在本發明的方法的某些實施例中，所有或一些方法步驟，包括樣本的分析、疾病的診斷以及測試結果或診斷結果的傳達可在不同(如國外)司法系統進行。
VIII.試劑盒在又一實施方面中，本發明提供用於評定卵巢癌狀態的試劑盒，其中該試劑盒可用於測定本發明標記。例如，該試劑盒可用於測定任何至少一種此處所述的標記，該標記在卵巢癌病人者與正常受驗者樣本中出現有差異。本發明的試劑盒有許多應用。例如，該試劑盒可用作區別受驗者是否有卵巢癌或有陰性診斷，這樣讓醫師或臨床醫師診斷是否存在癌症。在另一實施例中，該試劑盒可用於確認體內或體外調節卵巢癌動物模型中至少一種標記表現的化合物。
因此本發明提供的試劑盒包括(a)結合選自ApoA1、經修飾的ApoA1、甲狀腺素運輸蛋白△N10、天然甲狀腺素運輸蛋白、半胱氨醯化甲狀腺素運輸蛋白、磺化甲狀腺素運輸蛋白、CysGly修飾的甲狀腺素運輸蛋白、穀胱甘肽化甲狀腺素運輸蛋白、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2以及IAIH4片段NO.3，及其結合物的生物標記的捕獲試劑；以及(b)包括至少一種生物標記的容器。在優選試劑盒中，該捕獲試劑結合多種生物標記。該捕獲試劑也可能結合至少一種已知生物標記，標記4，如CA125。在某些優選實施例中，試驗試劑盒還包括第二捕獲試劑，所述的第二捕獲試劑是結合第一捕獲試劑不結合的至少一種生物標記。
本發明提供的試劑盒還包括(a)結合至少一種生物標記的第一捕獲試劑，其中所述的生物標記是選自ApoA1、經修飾的ApoA1、甲狀腺素運輸蛋白△N10、天然甲狀腺素運輸蛋白、半胱氨醯化甲狀腺素運輸蛋白、磺化甲狀腺素運輸蛋白、CysGly修飾的甲狀腺素運輸蛋白、穀胱甘肽化甲狀腺素運輸蛋白、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2以及IAIH4片段No.3，以及(b)結合至少一種所述的第一捕獲試劑不結合的生物標記的第二捕獲試劑。優選地，至少一種所述的捕獲試劑是抗體。某些試劑盒進一步包括至少一種捕獲試劑粘附於或可粘附於其上的MS探針。
所述的捕獲試劑可以為任何類型的試劑，以SELDI探針為宜。本發明的某些試劑盒中，所述的捕獲試劑包括IMAC。
本發明提供的試劑盒進一步包括(a)結合至少一種生物標記的第一捕獲試劑，其中所述的生物標記是選自ApoA1、經修飾的ApoA1、甲狀腺素運輸蛋白△N10、天然甲狀腺素運輸蛋白、半胱氨醯化甲狀腺素運輸蛋白、磺化甲狀腺素運輸蛋白、CysGly修飾的甲狀腺素運輸蛋白、穀胱甘肽化甲狀腺素運輸蛋白、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2以及IAIH4片段No.3，以及(b)使用捕獲試劑檢測生物標記的說明書。在某些試劑盒中，該捕獲試劑包括抗體。而且，一些試劑盒進一步包括所述的捕獲試劑粘附於或可粘附於其上的MS探針。一些試劑盒中，所述的捕獲試劑進一步包括IMAC。該三種經確認的標記中每一種，本文是結合至IMAC ProteinChip列陣。因此，本發明的優選實施例包括早期監測卵巢癌的高產量試驗，該試驗分析IMAC ProteinChip列陣上病人樣本中該三種分析物，以及傳統CA-125ELISA(或該CA-125ELISA被轉移至該ProteinChip列陣平臺)。
在其它實施例中，本文所述的試劑盒包括至少一種結合至少一種選自標記I至XLVIII的捕獲試劑。
本發明的某些試劑盒進一步包括衝洗溶液，或洗提液，其中所述的試劑盒進一步包括衝洗溶液，衝洗後可選擇性地允許被結合的生物標記保留於所述的捕獲試劑上，而其它生物標記被衝洗下來。或者，該試劑盒含有製備該衝洗溶液的說明書，其中吸附劑與衝洗溶液的組合允許使用氣相離子光譜法測定該些標記。
優選地，該試劑盒包括用於監測癌症的試劑盒的使用方法的書面說明書，並提供測試樣本與捕獲試劑接觸及監測至少一種保留在該捕獲試劑中的生物標記的操作說明。例如，試劑盒應該具有標準操作說明，以告知消費者在血清樣本接觸捕獲試劑後如何清洗捕獲試劑(如探針)。另一實施例中，試劑盒應具用於前區分樣本的指示，以降低該樣本中蛋白質的多樣性。另一例中，試劑盒應具自動化該區分步驟或其它程序的說明書。
該些試劑盒可自上述說明的物質製備，而前述討論的這些物質(如探針基質、捕獲試劑、吸附劑、衝洗溶液等)是完全可應用至這部分，故將不再重複敘述。
在另一實施例中，該試劑盒還包括附著有吸附劑(如有吸附劑功能的顆粒)的第一基質，以及該第一基質能置其上以形成探針的第二基質，其中該探針是可移動可插入至氣相離子光譜儀中。其它實施例中，該試劑盒包括單一基質，該基質是為可移動可插入於該基質上的具吸附劑的探針形式。又另一些實施例中，該試劑盒還包括前區分自旋柱(如汽巴克隆(Cibacron)藍色瓊脂糖柱、抗HAS瓊脂糖柱、K-30尺寸排除柱、Q-陰離子交換自旋柱、單股DNA柱、lectin柱等)。
在另一實施例中，試劑盒包括(a)特異性結合標記的抗體；以及(b)檢測劑。該試劑盒可自上述物質製備，且前述有關該物質(如抗體、檢測劑、固定化支撐物等)的討論是完全可應用於這部分，因此將不再重複說明。可供選擇地，該試劑盒還包括前區分自旋柱。在一些實施例中，該試劑盒還包括以卷標或獨立插件形式出現的適當操作參數的說明書。
可供選擇地，該試劑盒還包括標準或參照訊息，以便測試樣本能與參照訊息對比，以判斷樣本中被檢測的標記的試驗量是否與診斷卵巢癌的診斷量一致。
本發明進一步提供一種製品，包括結合至少兩種生物標記的至少一種捕獲試劑，所述的捕獲試劑選自ApoA1、經修飾的ApoA1、甲狀腺素運輸蛋白△N10、天然甲狀腺素運輸蛋白、半胱氨醯化甲狀腺素運輸蛋白、磺化甲狀腺素運輸蛋白、CysGly修飾的甲狀腺素運輸蛋白、穀胱甘肽化甲狀腺素運輸蛋白、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2以及IAIH4片段No.3。本發明所述的製品例子包括，但不僅限於，ProteinChip列陣、探針、微滴定盤、珠、試管、微量試管以及任何其它捕獲試劑可附著其上的固態物質。本發明製品的其它實施例還包括結合其它已知卵巢癌標記，即標記4，的捕獲試劑。所述的製品的一實施例中，用於實施例的ProteinChip列陣將具捕獲ApoA1、經修飾的ApoA1、甲狀腺素運輸蛋白△N10、天然甲狀腺素運輸蛋白、半胱氨醯化甲狀腺素運輸蛋白、磺化甲狀腺素運輸蛋白、CysGly修飾的甲狀腺素運輸蛋白、穀胱甘肽化甲狀腺素運輸蛋白、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2以及IAIH4段No.3以及標記4的吸附劑。在尤佳實施例中，標記4是CA125。在另一實施例中，微滴定盤將具可結合ApoA1、經修飾的ApoA1、甲狀腺素運輸蛋白△N10、天然甲狀腺素運輸蛋白、半胱氨醯化甲狀腺素運輸蛋白、磺化甲狀腺素運輸蛋白、CysGly修飾的甲狀腺素運輸蛋白、穀胱甘肽化甲狀腺素運輸蛋白、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2及/或IAIH4片段No.3以及標記4的抗體。這些是該些製品的一些實施例。具本技術領域內一般技能者將根據此處所述的方法很容易地就可以製造出其它這類製品。
本發明進一步提供一種系統，包含多種捕獲試劑，每種捕獲試劑結合至不同生物標記，其中所述的生物標記選自ApoA1、經修飾的ApoA1、甲狀腺素運輸蛋白△N10、天然甲狀腺素運輸蛋白、半胱氨醯化甲狀腺素運輸蛋白、磺化甲狀腺素運輸蛋白、CysGly修飾的甲狀腺素運輸蛋白、穀胱甘肽化甲狀腺素運輸蛋白、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2及/或IAIH4片段No.3以及至少一種適於標記4種類的標記。這一系統的實施例包括，但不僅限於，一組ProteinChip列陣，該ProteinChip列陣組包括結合有至少一種生物標記的吸附劑，所述的生物標記是選自ApoA1、經修飾的ApoA1、甲狀腺素運輸蛋白△N10、天然甲狀腺素運輸蛋白、半胱氨醯化甲狀腺素運輸蛋白、磺化甲狀腺素運輸蛋白、CysGly修飾的甲狀腺素運輸蛋白、穀胱甘肽化甲狀腺素運輸蛋白、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2及/或IAIH4片段No.3。所述的系統類型中，每種所述的生物標記具有一種ProteinChip列陣。或者，可供選擇地，多個標記具有一種ProteinChip列陣，其中所述的標記選自ApoA1、經修飾的ApoA1、甲狀腺素運輸蛋白△N10、天然甲狀腺素運輸蛋白、半胱氨醯化甲狀腺素運輸蛋白、磺化甲狀腺素運輸蛋白、CysGly修飾的甲狀腺素運輸蛋白、穀胱甘肽化甲狀腺素運輸蛋白、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2及/或IAIH4片段No.3以及用作CA125的第ProteinChip列陣。其它系統的實施例包括那些捕獲試劑是各自獨立或成群地含有對每一種生物標記都有一種抗體的試管。具本技術領域內一般技能者將根據此處所述的方法很容易地就可以製造出其它這類製品。
本發明進一步提供一種篩檢試驗，包括(a)將激肽釋放酶與激肽釋放酶底物以及測試試劑接觸，以及(b)判判斷所述的測試試劑是否調節所述的激肽釋放酶活性。在這樣一種測試中，所述的底物是間-α-胰蛋白酶抑制因子重鏈H4前體。正如下面將要討論的，業已發現數種激肽釋放酶在卵巢癌中存在調節障礙問題(dys-regulated)(在Diamandis2002中有評論)。這樣，判斷了激肽釋放酶的活性就顯示了卵巢癌狀態。在這種方法中，判斷測試試劑是否起到調節激肽釋放酶活性的作用的步驟包括測定是否存在IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2及/或IAIH4片段No.3或它們的數量。上述說明測定IAIH4片段的方法可用於該篩選方法中。
IX.篩選分析中用於識別卵巢癌的生物標記本發明的方法還有其它應用。例如，生物標記可用於篩選可調節體內或體外生物標記的表達的化合物，這使得化合物反過來對治療或阻止病人體內的卵巢癌是有用的。在另一實施例中，生物標記可用於監測對卵巢癌治療的反應。在又另一實施例中，生物標記可用於遺傳研究以決定是否該受驗者有發展成卵巢癌的風險。
因此，例如，本發明的試劑盒可包括含有厭水性能的固體底物，比如蛋白質生物晶片(如塞弗吉蛋白質晶片列陣)以及用於衝洗該底物的緩衝劑，還包括用於測量晶片上本發明的生物標記以及利用這些測量結果來診斷卵巢癌的操作步驟的說明書。
適用於治療試驗的化合物最初可通過確認與至少一種本文所列舉的生物標記相互作用的化合物而被篩選出來。例如，篩選過程包括重組地表達本發明的生物標記、提純該生物標記以及將該生物標記固定於基質上。然後測試用的化合物與基質接觸，尤其在水性環境下，測定該測試用的化合物與該生物標記間的相互作用，例如通過測量以鹽濃度為性能的洗提率。某些蛋白質可識別並切割至少一種本發明的生物標記，其中可通過在標準分析中監測至少一種生物標記的切片，例如通過蛋白質的凝膠電泳分析方法，來檢測該蛋白質。
在有關實施例中，還測定了測試用的化合物能夠抑制本發明的至少一種生物標記的能力。本技術領域內的其中一個技藝是確認用於測定特定生物標記作用的技術將依該生物標記的功能與性質變化而變化。例如，分析生物標記的酶促作用，以供找到一適合基質以及該基質和反應物的表相可以很容易就被測量出來。潛在有治療作用的測試化合物抑制或促進指定生物標記的作用的能力可通過測量存在或不存在該測試化合物下的催化效率而被確定下來。測試化合物幹擾非酶促(如結構)機能或本發明的其中一種生物標記的作用的能力亦可被測量出來。例如，可通過存在或不存在測試化合物下分光鏡檢查來監測自組裝多重蛋白質，其中該多重蛋白質是包含本發明的一種生物標記。或者，如果該生物標記是轉錄非酶增強子，則具幹擾該生物標記促進轉錄能力的測試化合物可通過測量存在或不存在該測試化合物下體內或體外的依賴於生物標記的轉錄水平而被確定。
將能夠調節本發明的任何生物標記的測試化合物投入到患有卵巢癌或其它癌症病人或有發展成為卵巢癌或其它癌症風險的病人體內。例如，如果體內特定生物標記阻止卵巢癌蛋白質的堆積，則投入可提高特定生物標記作用的測試化合物可降低病人體內卵巢癌發病風險。相反，如果具增強作用的生物標記是促發卵巢癌的至少一部分原因，則投入可降低特定生物標記作用的測試化合物可降低病人體內卵巢癌發病風險。
在其它方面的實施例種，本發明提供一種用於確定化合物是否對治療與經修飾的IAIH4的數量升高有關的諸如卵巢癌這樣的紊亂有用的方法。例如，在一實施例中，細胞提取或表達庫可被篩選為促進全長IAIH4切割成截斷形式的IAIH4的化合物。在這種篩選分析的一實施例中，可通過將螢光基團黏附到IAIH4上來檢測IAIH4的切割行為，其中當IAIH4沒在切割時，IAIH4是保持熄滅的，而當該蛋白質被切割時，IAIH4則發出螢光。或者可供選擇地，全長IAIH4經修飾的以致於使得胺基酸x和y之間的醯胺鍵不可斷裂，這種經修飾的IAIH4可被用於選擇性地結合或″捕獲″在體內分裂全長IAIH4處的細胞蛋白酶。篩選和確定蛋白酶及其靶向物在科學性文獻中已被完整記錄成冊，如Lopez-Ottin等人編著(Nature Reviews，3509-519(2002))。
在另一實施例中，本發明提供一種用於治療或減緩諸如卵巢癌疾病的進展或發病可能性的方法，該方法伴隨著截斷IAIH4數量的升高。例如，在至少一種分裂全長IAIH4的蛋白質被確定後，組合庫可被篩選成為具抑制經確定的蛋白質分裂作用的化合物。用於該些化合物的篩選化學庫的方法在本技術領域內已熟知。請參閱例如Lopez-Ottin等人編著(2002)。或者可供選擇地，可基於IAIH4的結構智能設計抑制作用的化合物。
全長IAIH4被認為是結合到並抑制血漿舒血管素。(請參考Pu XP等人著，Biochim Biophys Acta1994；1208338-43；Nishimura H等人著，FEBS Lerr 1995；357207-11)。以N為端點的IAIH4的截斷產物被認為可減少IAIH4的蛋白酶的抑制作用。請參閱，例如，Abrahamson等人著(Biochem.J.273621-626(1991))。化合物將全長IAIH4的官能團引入至截斷IAIH4，因此很可能在治療過程如卵巢癌的治療過程中有用處，這與IAIH4的截斷形式有關。因此，在進一步的實施例中，本發明提供用於確定可提高截斷IAIH4對於其靶向蛋白酶的親和性的化合物。例如，針對化合物將全長IAIH4的蛋白酶抑制作用引入至截斷IAIH4的能力對化合物進行篩選。然後，能夠調節IAIH4的抑制作用或與IAIH4相互作用的分子作用的測試化合物可在體內針對化合物在受驗者體內緩解或阻止卵巢癌發展的能力進行試驗。
在臨床水平上講，篩選測試化合物的步驟包括在受驗者被曝露於測試化合物前後，自測試受驗者取得樣本。可測量並分析本發明的至少一種生物標記的樣本的數量，以確定生物標記的數量是否在曝露於測試化合物後有改變。正如此處所述的，該樣本可通過質譜分析法進行分析，或者該樣本可通過本技術領域內已知的任何適當的方法進行分析。例如，可直接通過使用無線或螢光標識的抗體的西方墨點分析法測量本發明的至少一種生物標記的數量，其中該抗體是特異性結合至該生物標記。可供選擇地，可測量編碼至少一種生物標記的mRNA的數量變化，並且該變化與指定測試化合物投入至受驗者有關。在進一步的實施例中，可用體外方法和材料測量至少一種生物標記的表達的數量變化。已用測試化合物處理的受驗者將被例行檢查由治療方法產生的任何生理效果。尤其，該測試化合物被評定其是否降低受驗者體內患疾病的可能性。可供選擇地，如果該測試化合物被投入至先前被診斷患有卵巢癌的受驗者，則該測試化合物被篩選其緩解或阻止疾病發展的能力。
X.產生分類演算及診斷結果的方法數據組可通過多重分類演算進行分析。一些分類演算提供分散的分類規則；其它分類演算提供某一結果(組群)的可能性評估。在後面的例子中，判定(診斷)結果是基於最高可能性組群做出的。例如，考慮這三組問題健康組、良性組以及患癌組。假定購建分類演算(如最近鄰居分析方法)，將其應用於樣本A中，且該樣本為健康的可能性為0，為良性的可能性為33％，為患癌的可能性為67％。則樣本A被診斷為患有癌症。然而，這種方法沒有考慮診斷過程中任何″模糊度″問題，即存在該樣本為良性的一定可能性。因此，該診斷結果與健康或良性的可能性為0而患癌的可能性為1的樣本B相同。
我們提出購建一源自每一組群分配的可能性的指數。該指數以任何計算器可執行的邏輯方法購建；在這一例子，我們創造該三種可能性的單一線性組合，即I＝0*p(參照)+1*p(良性)+2*p(患癌)成為參照的可能性為1的樣本的數值為0，成為良性的可能性為1的樣本的數值為1，以及成為患癌的可能性為1的樣本的數值為2。因此臨床判定結果可基於該指數做出。指數為0的人不會有患癌症的風險，而指數為2的人患有癌症的風險很高。指數處於中間的人患癌風險不定，隨著指數升高風險越高。
我們將這一方法應用於一組來自Mayo Clinic的180個樣本中。我們基於該五種甲狀腺素運輸蛋白(transthyretin)形式以及一種載脂蛋白A1(apolipoproteinA1)形式產生最近鄰居分類演算，在考慮及不考慮年齡的情況下。當年齡不包括在該模型中時，接下來的圖標中指數數值作為組群的功能繪於圖中。
數值為0的個體實際上沒有患基於這些標記的卵巢癌的風險，而數值為2的個體患卵巢癌的風險最高。
提供以下例子作為舉例說明，但並不僅限於此。當提供特定例子時，以上描述是說明性的，而不是限制性的。先前說明的實施例的任何至少一個特徵可與本發明中任何其它實施例的至少一個特徵以任何方式結合。而且，本發明的一些變動對具本技術的技能者於評論該特定性時，將變得很明顯。因此，本發明的範圍應該不是根據上述說明來確定的，而是應用根據附加的專利申請範圍以及與它們同等的全部範圍來確定。
本申請中引用的所有發表文獻及專利文件是以完整資料方式引用以供參考，對所有目的皆相同，如同每個獨立發表文獻或專利文件被單獨表示一樣。申請人在將各種參考文獻引用於該文件中時，申請人並不承認任何特定參考文獻是他們發明的″先前技術″。
實施例材料與方法樣本蛋白質體圖形數據是自503個在葛洛寧恩大學醫院(荷蘭葛洛寧恩)、杜克大學藥學中心(北卡羅萊納州杜爾漢)、婦女皇家醫院(澳大利亞雪梨)以及MD安德生癌症中心(德克薩斯州休斯頓)收集的血清樣本獲得的。該卵巢癌群組由65位侵入性上皮卵巢癌I/II期病人與88位侵入性上皮卵巢癌III/IV期病人、28位臨界腫瘤病人以及14位復發性疾病病人組成。該癌症案例是由病理學家以國際婦產科聯(International Federation of Gynecologists andObstetricians，FIGO)標準為依據所做的適當分期。65位侵入性上皮卵巢癌I/II期病人中，20位是漿液性卵巢癌，17位是黏液性卵巢癌，15位是子宮內膜狀卵巢癌，8位是透明細胞卵巢癌，1位是癌肉瘤卵巢癌，以及4位是混合上皮卵巢癌。該樣本亦包括166位診斷位良性盆腔囊瘤以及142位健康參照物。研究分布的特性與基本描述性統計，包括年齡與CA125數量，列於表1。
所有病人樣本是於手術或治療前收集，且健康志願者樣本是有機構驗證收集而來的。該血液樣本可以凝結，而血清是即可分離處理。所有樣本存放於-70℃，並於分析前立即解凍。所有病人CA125數量可從先前研究中使用CA125II放射性免疫分析法試劑盒(Centocor)而得到。
除503個用於蛋白質體圖譜樣品外，尚有142個收集自約翰霍普金藥學研究所、用於常規臨床實驗室試驗的建檔血清樣品，作為該經確認的生物標記(免疫分析試驗可得到)數量試驗用。該些樣本中，41個是來自卵巢癌晚期病人以及41個是來自健康婦女。剩餘的60個樣本由具乳癌、結腸癌及前列腺癌這三組病人中每組20個組成，且用於試驗該經確認的生物標記的腫瘤位置特異性(列於表3)。所有樣本於收集後2至4小時內處理，然後存放於2至8℃不超過48小時，接著於-70℃下進行冷凍。CA125II分析亦使用二位置免疫酶分析法(two-siteimmunoenzymometric assay)於Tosoh AIA-600II分析儀(Tosoh Medics公司提供)進行。
實施例1蛋白質表現圖譜血清區分血清樣本於冰上解凍，然後以20000g轉速離心10分種以除去沉澱。20ul血清與變性緩衝液(U9∶9M尿素、2％CHAPS、50mMTris pH9.0)混合，並於4℃下振蕩20分種。對每一樣本，180ul Hyper Q DF陰離子交換樹脂於200ul U1緩衝液(U9於50mM Tris pH9.0中稀釋成1∶9)中平衡三次。該變性血清加於樹脂中，並允許進行30分種結合反應。然後收集未經結合的物質，接著將含有0.1％OGP的100ul 50mM Tris 9.0加至樹脂中。收集該洗提液並與該未經結合的物質(流體；區分物1)混合。然後以pH梯度(每一100ul pH7、5、4、3衝提緩衝水溶液以及有機溶劑使用兩次)衝提以收集各個區分物。這將得到總共六個區分物。區分是以Biomek2000自動液體收集器(Beckman公司提供)與微型混合振蕩器(DPC)進行的。參照混合人類血清的樣本(Intergen公司提供)以相同方式處理以監控分析結果。
A.用於蛋白質表達圖譜的材料Beckman Biomek 2000自動化工作站Q Hyper DF陶瓷陰離子交換樹脂(法國Biosepra公司提供)96格v型底微量盤96格LP尼龍羥基(LoProdyne)薄膜過濾盤(SilentScreen，Nalge Nunc)平衡緩衝液-50mM Tris-HCl pH9.0U9-9M尿素，2.0％CHAPS，50mM Tris-HCl pH9.0；Ul-1M尿素，0.22％C HAPS，50mM Tris-HCl pH9.0緩衝液-100mM醋酸鈉，0.1％OGP pH4.0；pH3.0緩衝液-50mM檸檬酸鈉，0.1％OGP pH3.0；有機緩衝液-33.3％異丙醇/16.67％乙氫/0.5％三氟乙酸(TFA)B.操作程序血清變性以20ul移液管將血清至96格v型底微量盤中.加入30ulU9至每格含有血清中。然後用盤密封膜密封。當樹脂進行時，將此盤中血清於4℃振蕩至少20分種。
樹脂平衡以三倍於50mM Tris-HCl pH9.0充填體積量清洗樹脂五次。此操作可在50ml離心管中進行。通過加入等量體積的50mM Tris-HCl pH9.0至樹脂中以製成50/50樹脂泥。然後將180ul 50/50樹脂泥加至96格過濾盤每格中。規律地(每次加二或三格)振蕩含有樹脂泥的試管以確保樹脂對緩衝液的固定組成比例。然後將該緩衝液過濾後加入200ul U1，接著再過濾一次。以該相同方式再操作兩次以上。
樣本應用與培養下一步驟是將血清結合至樹脂上。該操作中第一步為以50ul移液管將每一樣本移至相對應的過濾盤格中。接著加50ul U1至該樣本盤每格中並混合五次。然後自該樣本盤每格中吸取50ul至相應的過濾盤格中。於4℃振蕩30分種。
下一步驟是收集該區分物。將96格v型底微量盤置於該過濾盤下方。然後收集通過該過濾盤的濾液。接著將100ul清洗緩衝液1加至該過濾盤每格中後，於室溫振蕩10分種。區分物1含有該流通過與pH9洗脫物。下一步將100ul清洗緩衝液2加至該過濾盤每格中後，於室溫振蕩10分種。將乾淨的v型底微量盤置於該過濾盤下方，然後收集區分物2。接著將100ul清洗緩衝液2加至該過濾盤每格中後，於室溫振蕩10分種。在該96格v型底微量盤收集區分物2的殘留物。區分物2含有pH7的洗脫物。將100ul清洗緩衝液3加至該過濾盤每格中後，於室溫振蕩10分種。將乾淨的v型底微量盤置於該過濾盤下方，然後收集區分物3。接著將100ul清洗緩衝液3加至該過濾盤每格中後，於室溫振蕩10分種。在該96格v型底微量盤收集區分物3的殘餘物。區分物3含有pH5的洗脫物。將乾淨的v型底微量盤置於該過濾盤下方，然後收集區分物4。接著將100ul清洗緩衝液4加至該過濾盤每格中後，於室溫振蕩10分種。在該96格v型底微量盤收集區分物4的殘餘物。區分物4含有pH4的洗脫物。接著將100ul清洗緩衝液5加至該過濾盤每格中後，於室溫下振蕩10分鐘。在該96格v型底微量盤收集區分物5的殘留物。區分物5含有pH3的洗脫物。接著將100ul清洗緩衝液6加至該過濾盤每格中後，於室溫振蕩10分種。將乾淨的v型底微量盤置於該過濾盤下方，然後收集區分物6。將100ul清洗緩衝液6加至該過濾盤每格中後，於室溫下再次振蕩10分鐘。收集區分物6的殘留物。區分物6含有該有機溶劑的洗脫物。
冷凍該些區分物以備晶片結合操作。
列陣結合將10ul每一區分物與90ul結合緩衝液混合，並分三份結合至IMAC、SAX、H50以及W CX蛋白質晶片列陣(塞弗吉公司提供的Biosystem)上。對於IMAC，結合緩衝液是含有500mM NaCl的100mM pH7.0磷酸鈉溶液；對於SAX，結合緩衝液是100mM pH7.0磷酸鈉溶液；對於H50，結合緩衝液是50％乙氰水溶液；對於WCX，結合緩衝液是100mM pH4.0醋酸鈉溶液。在室溫下發生結合反應30分種。然後晶片用結合緩衝液清洗三次，再用蒸餾水清洗兩次。使用介質為芥子酸(sinapinic acid)。
數據採集與分析對於兩種SELDI分析方法，所有列陣通過Ciphergen PBS II ProteinChip列陣讀取機、時間延滯聚焦、線性、雷射解吸/電離飛行時間質譜儀進行讀寫。所有光譜以正離子模式獲得。時間延滯聚焦對於肽的延滯時間為400ns，而對於蛋白質是1900ns。用3kV離子萃取脈衝萃取離子，並以20kV加速電壓加速至最終速度。該系統使用重複速率為每秒2至5脈衝變化的脈衝氮雷射。典型雷射通量變化範圍為30-150uJ/mm2。自動化分析操作被用於控制大部分樣本分析中數據採集過程。每一光譜平均至少100次雷射瞄準，並以已知肽或蛋白質混合物進行外校正。每周都要用胰島素與免疫球蛋白對儀器進行檢查以確保功能的穩定性。每個晶片以兩種雷射能量(高能與低能)讀取。光譜的基線用8倍於適合寬度的設定扣除以得到外校正，然後標準化至總離子流(排除介質區)。
實施例2統計分析生物標記的發現從SELDI光譜中選擇M/Z2kD-50kD的質量範圍內合格的質量譜峰(S/N＞5，群集質量窗口在0.3％)。為了獲得更多有關光譜範圍內數據變化的連續性，在進一步分析前對譜峰強度進行對數轉換。採用單一化最大分離性分析(Unified Maximum SeparabilityAnalysis，UMSA)算法對來自杜克大學藥學中心(Can＝36，HCn＝47)和葛洛寧恩大學醫院(Can＝20，HCn＝30)的早期上皮卵巢癌病人和健康參照物進行分析，該UMSA算法是第一次用於微列陣數據分析，隨後用於蛋白質表達數據分析(ProPeak，3Z Informatics)。(請參閱Li J，Clin Chem2002；481296-304；Rai AJ，et al.，Zhang Z，et al.，ArchPathol Lab Med2002；1261518-26；Z.Zhang等人，將分類分離分析方法應用於微列陣數據中(Applyingclassification separability analysis to microarray data)；LinSM，Johnson KF編著，微列陣數據分析方法(Methods ofMicroarray data analysis)CAMDA』00報告，波士頓Kluwer學術出版社，2001125-136；以及Z.Zhang等人，釣魚探險-從表現圖譜概略萃取式樣的監督式方法(Fishing Expedition-a Supervised Approach to ExtractPatterns from a Compendium of Expression Profiles；LinSM，Johnson KF編著，微列陣數據分析方法IICAMDA』01報告，波士頓Kluwer學術出版社，2002)。
為了降低在選擇譜峰中出現數據誤差或人為現象的可能性，自兩處獲得的數據採取獨立分析的方法。自舉法重抽樣技術被用於選擇對區分早期卵巢癌和健康參照物有顯著且連續貢獻的譜峰。在每一自舉法運行過程中，隨機選擇固定百分比的癌症及對照組樣本進行取代分析。各個譜峰依照它們對UMSA分類器線性解釋中的貢獻度進行排序。每一譜峰順序的平均數及標準偏差是以多次(20至40次)運行來估算。選擇具高平均數順序及小標準偏差的譜峰，以形成候選譜峰的短小名單。自兩處獲得的結果然後進行交叉對比，以決定最後一組具一致性表現式樣的譜峰作為一組潛在生物標記。
多變量預測模型為了建立多變量預測模型，將兩處獲得的數據進行組合，然後將其隨機分成訓練組及試驗組。首先用試驗組對潛在生物標記組的性能及建立的預測模型進行評估，最後用自剩餘兩處未參與生物標記發現及模型建立過程的獨立數據進行驗證。用於評估的統計方法包括靈敏度及特異性的估計，以及接收器操作特性曲線(ROC)分析。
實施例3生物標記的純化對於所有標記，先採用用於蛋白質表現圖譜化的陰離子交換操作步驟區分血清。對於每一純化步驟，在NP20或IMAC-銅蛋白質晶片列陣上檢測區分物。
28kD標記的純化將1ml陰離子交換分離的pH4區分物加至500ul的RPC PolyBio10-15(BioSepra公司提供)中，並於4℃下培養1小時。收集含有乙氰(acetonitrile，CAN)的數量逐漸增加的0.1％三氟乙酸(trifluoroaceticacid，TFA)的區分物。75％乙氰/0.1％三氟乙酸的區分物用真空離心乾燥機(speed-vac)乾燥，然後於100ul不含二硫蘇糖醇(1，4-dithiothreitol，DTT)的SDS-三(羥甲基)甲基甘氨酸(SDS-tricine)上樣緩衝液中復水。將40ul樣本加至16％三(羥甲基)甲基甘氨酸(tricine)凝膠上，並以100mV電壓運行4小時。用膠體藍試劑盒(Pierce公司提供)將凝膠去色，並將該28kD標記刮取下來。
12.8kDa標記的純化將10ml陰離子交換分離的pH4區分物用1M pH11 Tris-HCl溶液調整pH至7.5，然後加至10ml MEP微珠(BioSepra公司提供)上，其中MEP微珠使用前先用20ml pH7.2磷酸鹽緩衝液(PBS)清洗三次。於4℃搖晃30分種後得到含有該譜峰的洗提區分物。因為該區分物含有大量白蛋白，因此需進行白蛋白免疫消耗試驗(immunodepletion)。蛋白質-A微珠先以含有0.1％triton-100接口活性劑的1.5ml PBS清洗三次，接著以1.5ml PBS清洗三次.然後將4ml抗人類血清白蛋白(anti-human serum albumin，anti-HAS)抗體(ICN公司提供)加至1.5ml蛋白質-A微珠中，並耦合過夜。耦合的微珠以1ml含有0.1％triton-100的PBS清洗三次，然後以1mlPBS清洗三次。接著將經過MEP管柱的洗提流出物加至微珠中，並於4℃培養1小時。以3000rc f轉速旋轉1分種後得到該洗提流出物。將經過蛋白質-A-抗HAS抗體管柱的洗提區分物加至含有1.5ml RPC PolyBio10-15樹脂(Bio Sepra公司提供)的旋轉柱中，其中RPC PolyBio10-15樹脂是先用1.5ml0.1％TFA清洗四次。於4℃下搖晃培養40分種後，以3000rcf轉速旋轉移除該洗提區分物，並以0.8ml0.1％TFA清洗該微珠。收集含有乙氰數量逐漸增加的0.1％TFA的區分物。75％乙氰/0.1％TFA的區分物用真空離心乾燥機乾燥，然後於100ul不含DTT的SDS-tricine上樣緩衝液中復水。將40ul樣本加至16％tricine凝膠上，並以100mV電壓運行4小時。用膠體藍試劑盒(Pierce公司提供)將凝膠去色，並將該12.8kDa標記刮取下來。
3272D生物標記的純化將1ml陰離子交換分離的洗提區分物加至125ul(250ul 50％泥狀物)與硫酸銅耦合的IMAC纖維素(Biosepra公司提供)中，並於4℃下培養1小時。然後微珠用梯度逐步增加的咪唑(imidazole)(含有500mM NaCl的100mM pH7 NaPO4溶液中，溶有250ul的20mM、50mM、100mM、150mM及200mM咪唑)方式清洗。將200ul含有生物標記(50至150mM咪唑)的區分物加至C18管柱上(ANSYS技術公司提供，Metachempolaris C18-A5U)，並以1ml/min流速的0.1％TFA衝洗5分種，接著以1ml/min流速的0％至9％乙氰(ACN)梯度0.1％TFA溶液清洗10分種。然後以1ml/min流速的9％CAN至45％ CAN線性梯度0.1％TFA溶液清洗30分種。收集1ml等分試樣以及於第38個區分物(該區分物的CAN濃度為34.2％)中清洗的標記。
實施例4生物標記的確認已純化的蛋白質用胰蛋白酶切片，然後胰蛋白酶解片段用蛋白質晶片讀取機分析。每一光譜範圍是至少250個雷射瞄射點的平均，並用已知肽混合物做外校正，或用胰蛋白酶自溶及基質譜峰做內校正。譜峰質量是符合ProFound檢索的肽拼圖位置(在線提供)。蛋白質序列是使用美國國立生物技術信息中心(National Center forBiotechnology Information，NCBI)資料庫進行修補。這些資料庫匹配度的確認是使用配備蛋白質晶片列陣接口(Ciphergen公司提供)的PESciex QStar(加拿大Concord公司提供)進行的。對於MS/MS實驗，光譜範圍是從配備塞弗吉PCI1000蛋白質晶片列陣接口的Sciex Qstar(加拿大Concord公司提供)串聯四極杆-飛行時間質譜儀獲得。離子是使用脈衝氮雷射(Laser Science VSL 337NDS，Franklin，MA，USA)以每秒30個脈衝(傳遞平均130uJ/mm2脈衝通量)產生的。壓力為10mtorr的氮氣用於已形成離子的碰撞冷卻，以及所有低能碰撞引發解離(collision-induced dissociation，CID)試驗。通常應用的碰撞能遵循50eV/kD規則。對於MS及MS/MS模式，系統使用已知肽混合物進行外校正.通過加州大學舊金山分校(University of California，San Francisco，UCSF)ProteinProspector MS-Tag程序(在線提供；請參閱ClauserK.R.et al.(1999)Anal.l Chem.712871)來進行蛋白質的確認。用下列數值來執行MS-Tag資料庫搜索智人(Homosapiens)、胰蛋白酶切片(允許兩個切割被遺漏)、經以胺甲硫胺基甲基化(carbamidomethylation)經修飾的的半胱胺酸、母峰及片段離子質量容許量50ppm以及NCBI或Swiss-Prot資料庫。
這些確認是通過EIA或使用基於免疫分析發的蛋白質晶片列陣進行的。
雖然這些蛋白質通常已被表徵為急性期反應物，但在用免疫分析法做初步研究時，應當注意的是，載脂蛋白A 1(apolipoproteinA1)的數量於乳癌或結腸癌中為被發現有改變，且前白蛋白的數量於乳癌或前列腺癌病人中亦未被發現有改變。
甲狀腺素運輸蛋白是陰性急性期蛋白質，先前已有報導說，在上皮卵巢癌病人中，其數量會降低。(請參閱Mahlck CG，et al.，Gynecol Obstet Invest，1994；37135-40)。甲狀腺素運輸蛋白是血清甲狀腺素及三碘甲狀腺素主要載體，並通過與視黃醇結合蛋白質間的相互作用來幫助運送視黃醇。缺乏甲狀腺素運輸蛋白表達的轉基因鼠，其視黃醇和視黃醇結合蛋白質的數量非常低(請參閱van Bennekum AM，et al.，J.Biol Chem2001；2761107-13)，且數量降低的視黃醇結合蛋白質以及細胞視黃醇結合蛋白質已顯示與卵巢上皮細胞惡性轉形的速率增加有關(請參閱van Bennekum AM，et al.，J.BiolChem2001；2761107-13；Roberts D，et al.，DNA Cell Biol2002；2111-9)。此外，有報導說，通過寡核甘酸列陣分析，細胞視黃醇結合蛋白質的數量在卵巢癌中有改變。
產生m/z3272生物標記的IAIH4的羧基部分已顯示是血漿舒血管素的基質。(請參閱Pu XP，et al.，BiochimBiophys Acta1994；1208338-43；Nishimura H，et al.，FEBS Lett1995；357207-11)。舒血管素蛋白酶包括血漿舒血管素及組織舒血管素，具有重疊基質特異性。(請參閱Diamandis EP，et al.，Clin Chem2002；481198-205)。組織舒血管素是屬於龐大的復基因族(multigene family)，該復基因族還包括前列腺特異性抗原(PSA；hK3)，其是為前列腺癌的腫瘤標記。在卵巢癌中已發現數種組織舒血管素有不正常調節現象，其包括hK4、hK5、hK7、hK8及hK9(請參閱Yousef GM，et al.，Minerva Endocrinol 2002；27157-66)。
甲狀腺素運輸蛋白△N10及IAIH4片段是成熟蛋白質的截斷產物。這些標記是由至少一種蛋白酶切割而成的產物，該蛋白酶包括血漿舒血管素、組織舒血管素、金屬蛋白酶基質或prostatin(一種似胰蛋白酶的絲胺酸(serine)蛋白酶，近期有報導說其在卵巢癌病例中會增加)。(請參閱Mok SC，et al.，J Natl Cancer Inst 2001；931458-64)。產生這些標記的蛋白酶亦可作為可與標記1至4組合以俾於對預測模型賦予更高靈敏度及特異性的標記使用。
實施例5個別生物標記的識別能力在發現組中，早期卵巢癌病人與健康參照物之間，三種生物標記的表達水平經統計計算發現存在顯著差異(對m/z12828及m/z 28043標記，P＜0.000001；對m/z3272標記，P＜0.003，對m/z 303標記，P＜0.04，以及對m/z 2884標記，P＜0.005)(請見表1)。
第2圖(窗格A-D)是通過對來自早期卵巢癌和健康參照物的數據，採用接受器操作特性(ROC)曲線分析的三種個別生物標記與CA125的區分能力進行比較。對於窗格A-D各代表1CA125，2m/z 12.8kD，3m/z 28kD，4m/z 3272D。CA125與m/z 12828於發現組及驗證組二者中表現相當，而其它兩種標記於一組或兩組數據組中，比CA125有較小曲線下面積(area-under-curve，AUC)。然而，該三種生物標記和CA125中，經估算的相關性低(數據未顯示)，表示它們有彼此互補的可能性，並且多變量分析法可能優於CA125的單一分析方法。
由於健康參照物中的樣本有27％是來自年齡至少在50歲的婦女，相比之下，早期卵巢癌組群(P＜0.000001)的樣本則有61％是來自年齡至少在50歲的婦女，因此值得關心的是，這些標記可能反應了與年齡有關的變化。然而，經確認的生物標記在兩組年齡組群間無顯著差異，或者，與CA125的數量相比，這些生物標記的數量存在差異(請見表1)。先前基於人口的研究已顯示，載脂蛋白A1的數量實際上隨著年齡增長略微增加(請參閱Jungner，etal.，Clin Chem 1998；441641-9；Bachorik PS，et al.，ClinChem1997；432364-78)。
實施例6多變量預測模型用非線性UMSA分類器建立兩個多變量預測模型。第一個模型僅用該三個生物標記作為它的輸入，第二個模型用該三個生物標記隨同CA125一起。第2圖中的窗格E-H是採用ROC分析法將該兩個模型的所有診斷結果與CA125的診斷結果進行比較。對於窗格E-H各代表○CA125，□使用該三種生物標記的多變量模型，△使用該三種生物標記與CA125的多變量模型。在訓練數據組中，截止值為0.5使得靈敏度與特異性的總和接近最大化。以該截止值，將模型應用於試驗組數據及獨立驗證組數據(請見表2)。對於獨立驗證組中健康參照物和I/II期侵入性卵巢癌之間的區別，使用該三種生物標記和CA125的多變量模型在靈敏度為82.6％(95％置信區間(CI)61.2至95.1％)時，其特異性為93.7％(84.5-98.2％)。相比之下，CA125在截止值為11U/mL其靈敏度相同(82.6％)，而其特異性卻只有52.4％(39.4-65.1％)。表2還包括獨立驗證組中，良性狀態、晚期侵入性癌症或邊緣腫瘤的病人的結果。
第3圖繪製了CA125、該三種生物標記的分布圖案，以及該兩種模型對所有診斷組群中的樣本的輸出結果。Y軸是對所有三種生物標記以線性刻度表示的相對強度；對CA125以對數比例表示的血清數量；對兩種模型，0(最低患癌風險)與1(最高患癌風險)間的連續數值。樣本組群包括A)健康參照物，B)良性，C)I/II期侵入性癌，D)HI/IV期侵入性癌，E)復發者，F)I/II期邊緣腫瘤。生物標記發現組中兩個IIIc侵入性病例和獨立驗證組中三個III/IV期邊緣腫瘤未繪製出來。
應注意的是，除m/z 3272外，其它兩種生物標記和兩種預測模型具有良性病例中檢測I/II期侵入性癌的適度能力(對m/z12828及28043，P分別為0.004及0.001；對無CA125及有CA125的模型，P分別為0.003及0.0001)。
實施例7用免疫分析法獨立驗證以微滴定盤格式(美國Wako Chemical公司提供)使用濁度免疫分析法(turbidimetric immunoassay)對142個已歸檔的樣品進行載脂蛋白A1分析，對於甲狀腺素運輸蛋白△N10的分析是在Dimension RxL儀器(Dade-Behring公司提供)上使用顆粒強化濁度免疫分析法進行(請見表3)。
與41位健康參照物比較，在41位晚期卵巢癌病人中，CA125的血清數量上調，而載脂蛋白A1與甲狀腺素運輸蛋白△N10的數量下調(P分別為0.001895、0.000151、0.000006)。健康參照物的平均血清載脂蛋白A1的數量，與乳癌或結腸直腸癌病人的平均血清載脂蛋白A1的數量相比，無顯著差異(P分別為0.844163、0.330148)，與前列腺癌病人相比只有略微差異(P為0.043676)。結腸直腸癌病人(P為0.006889)中，平均血清甲狀腺素運輸蛋白△N10的數量下調程度比卵巢癌病人小。健康參照物與乳癌或前列腺癌病人中，平均血清甲狀腺素運輸蛋白△N10的數量無顯著差異(P分別為0.928519、0.546918)。
實施例8分類演算於第4圖中以圖標方式敘述了分類演算，模塊1至3是以UMSA學習算法訓練。然而，最後的分類器模塊具有如一般支持向量機(support vector machine，SVM)分類器一樣的數學形式。
UMSA分類器模塊1CA125nm＝log(CA125+0.01)m/z 12.9Knm＝(m/z 12828-61.103)/239.031m/z28Knm＝(m/z28043-61.3043)/238.9799m/z3272nm＝log(m/z3272+0.01)log自然對數核心函數多項式＜X(，i)，X(，j)＞)^3.0支持向量及係數
UMSA分類器模塊2CA125nm＝log(CA125+0.01)m/z 12.9Knm＝(m/z 12828-0.345)/0.1114m/z28Knm＝(m/z28043-0.4834)/0.2792m/z 3272nm＝log(m/z 3272+0.01)log自然對數核心函數exp(-|X(，i)-X(，j)|^2/(2*(1.0)^2))支持向量及係數
UMSA分類器模塊3核心函數多項式＜X(，i)，X(，j)＞)^2.0X1＝exp(模塊1輸出)/(1+exp(模塊1輸出))X2＝模塊2輸出支持向量及係數
後處理
其它模塊輸出＝exp(Y/2)/(1+exp(Y/2))本發明詳細說明了包括優選實施例在內的描述。然而，任何熟知此項技藝的人士可運用本發明的揭示下，對本發明進行修飾及/或改進，其仍涵蓋於如下列所提申請專利範圍的本發明範疇及精深內。
本申請中所引用的所有出版發表物及專利文件，對所有目的適用範圍均相同，是以完整參考資料方式引用，如同單獨地代表每一個單獨的出版發表物及專利文件一樣。引用本文件中各種參考資料時，申請人並不承認任何特定的參考資料是對他們發明的″先前技術″。
實施例9用於早期卵巢癌的標記的確認及與治療方法的關聯病人該研究包括25位忠良性卵巢癌的婦女、53位患早期(I，IIa期)卵巢癌的婦女、116位患晚期卵巢癌的婦女以及73位健康參照物，這些均取自位於葛洛寧恩和魯文的兩家醫院。該些樣本的組織學下一級類型包括95位是漿液性卵巢癌，29位是黏液性卵巢癌，16位是子宮內膜狀卵巢癌，11位是透明細胞卵巢癌，17位是癌肉瘤卵巢癌，以及1位是混合上皮卵巢癌。沒有患邊緣腫瘤的病人。患早期癌症的婦女平均年齡在51.8歲，晚期癌是58.8，良性癌是47歲，以及健康參照物是58歲。
色譜ProteinChip列陣用7.5ul9M尿素/2％CHAPS/50mM TrisHCl混合溶液變性5ul血清。經變性的血清在生物晶片結合緩衝液(對於IMAC30列陣50mM磷酸鈉溶液，250mM NaCl溶液，pH6.0；對於Q10列陣10mM磷酸鈉緩衝液，pH7.0)中稀釋。經稀釋的血清在IMAC30列陣或Q10蛋白質晶片列陣上培養兩個小時。先用結合緩衝液、然後用水清洗該些列陣，然後簡單地置於空氣中乾燥。加入芥子酸，在4000系列蛋白質讀取器中讀取該些列陣。
數據分析對質量外校正質譜，利用總離子流對強度進行內部標準化，基線扣除。手動選擇譜峰並記錄峰強度。用t-試驗以及支持向量機(support vector machine)分析數據。
第9圖描述了具代表性的於Q10蛋白質晶片列陣上甲狀腺素運輸蛋白試驗的譜圖。需注意的是，解析出五種形式的甲狀腺素運輸蛋白未經經修飾的的、經磺化的、經半胱氨醯化的、經CysGly經修飾的的、經穀胱甘肽化的。除此之外，還可發現截斷形式的甲狀腺素運輸蛋白(△N10)；以比經半胱氨醯化的甲狀腺素運輸蛋白還要低的水平(～2％)出現。
該試驗可通過使用蛋白質標準進行絕對量化以用於校正。第10圖顯示了，對不同形式的甲狀腺素運輸蛋白的水平，相應的線性譜峰強度。
從表4可以看出，甲狀腺素運輸蛋白與載脂蛋白A1的水平在卵巢癌病人中下降。兩組t-試驗表明，五種形式甲狀腺素運輸蛋白與載脂蛋白A1的水平在患有早期或晚期卵巢癌病人中均會下降。需注意的是，該些甲狀腺素運輸蛋白形式的水平在晚期病人中下降更加明顯。
從表5可以看出，術後，甲狀腺素運輸蛋白與載脂蛋白A1的水平上升。盒須圖(box-and-whiskerplots)表明，甲狀腺素運輸蛋白與載脂蛋白A1的水平於術後均回復到參照物水平。成對t-試驗結果表明，該效應於統計上是有重要意義的。一些形式的甲狀腺素運輸蛋白表現出比其它形式更大的響應。
正如第11圖中所示，各形式甲狀腺素運輸蛋白與載脂蛋白A1的組合會隨著手術的進行而改變。支持向量機(support vector machine)的運算是基於五種形式甲狀腺素運輸蛋白與載脂蛋白A1建立的，被用於在術前和術後對於每個病人產生出一指數。術前水平與術後水平間比較得到的一組指數圖揭示了，對於大多數病人，術後該指數會提高。在31/42(73.8％)早期卵巢癌病人中，該指數提高。正如第12圖所示，該指數可用於監測病人情況，是該指數在治療過程中如何變化的一舉例。對於這個病人，該指數在術前很低，而在術後升高。直到1996年10月，水平一直保持很高。表明該病人在此時疾病狀況好轉。
實施例10於一案例對照研究中標記的驗證病人該研究包括45位患有上皮卵巢癌病人的婦女，71位良性卵巢癌病人，122位患有消化疾病的婦女。我們排除了一例兒科良性損害以及多於一次融解和凍結的樣本。用於參照物的樣本儲存時間比案例以及良性疾病樣本的儲存時間長(即用於參照物的儲存時間為21年，而用於案例及良性的儲存時間為17年)。為使於發現譜峰中產生的偏差(與儲存時間有關)最小化，我們限制了對於在1983-1989年期間收集的樣本的標記數據的主要分析。這裡表示的數據因此是基於42個卵巢癌病例，65位忠良性疾病的婦女，以及76個參照物。
色譜ProteinChip列陣用7.5ul 9M尿素/2％CHAPS/50mM TrisHCl混合溶液變性5ul血清。經變性的血清在生物晶片結合緩衝液(對於IMAC30列陣50mM磷酸鈉溶液，250mM NaCl溶液，pH6.0；對於Q10列陣10mM磷酸鈉緩衝液，pH7.0)中稀釋。經稀釋的血清在IMAC30列陣或Q10蛋白質晶片列陣上培養兩個小時。先用結合緩衝液、然後用水清洗該些列陣，然後簡單地置於空氣中乾燥。加入芥子酸，在4000系列蛋白質讀取器中讀取該些列陣。
數據分析對質量外校正質譜，利用總離子流對強度進行內部標準化，基線扣除。手動選擇譜峰並記錄峰強度。用費舍精確試驗(Fisher exact tests)比較人口統計特性。用t-試驗評估兩組間峰高的區別。用線性和二次判別分析方法以及最近鄰居分析方法建立分類器。用交叉驗證程序評估分類中產生的誤差率。
第13圖，是表示在Q10 ProteinChip Array上各形式的甲狀腺素運輸蛋白和載脂蛋白A1產生的峰強度的散點圖。對於各種形式的甲狀腺素運輸蛋白的兩組t-試驗值如下所示未經經修飾的的，0.0076；經磺化的，0.0052；經半胱氨醯化的，0.0104；經CysGly經修飾的的，0.0026；經穀胱甘肽化的，0.0047。對於載脂蛋白A1的兩組t-試驗值為0.0009。
第14圖，是表示採用最近鄰居分析方法得到的指數數值。該模型包括六種形式的甲狀腺素運輸蛋白和載脂蛋白A1產生的峰強度，無論是包括年齡因素還是不包括年齡因素。使用的最近鄰居分析方法是用於計算每種樣本是為參照物、良性腫瘤或癌症的後事概率。計算公式為p(良性腫瘤/生物標記)+2*p(癌症/生物標記)。0分表示該樣本歸為參照物，2分表示該樣本歸為癌症，中間分數中越接近2分，越有可能是癌症。
序列表110約瀚·霍普金斯大學賽弗吉生物系統公司120用於卵巢癌的生物標記13061154-PCT15060/632,4741512004-12-0115060/558,4221512004-03-311603170PatentIn version 3.3210121130212PRT213人4001Met Asn Phe Arg Pro Gly Val Leu Ser Ser Arg Gln Leu Gly Leu Pro1 5 10 15Gly Pro Pro Asp Val Pro Asp His Ala Ala Tyr His Pro Phe20 25 30210221128212PRT213人4002Phe Arg Pro Gly Val Leu Ser Ser Arg Gln Leu Gly Leu Pro Gly Pro1 5 10 15Pro Asp Val Pro Asp His Ala Ala Tyr His Pro Phe20 25
210321127212PRT213人4003Arg Pro Gly Val Leu Ser Ser Arg Gln Leu Gly Leu Pro Gly Pro Pro1 5 10 15Asp Val Pro Asp His Ala Ala Tyr His Pro Phe20 2權利要求
1.一種定性受驗者卵巢癌狀態的方法，包括(a)測量取自受驗者樣本中的至少一種生物標記，其中所述的生物標記選自由Apo A1、經修飾的Apo A1、甲狀腺素運輸蛋白△N10、天然甲狀腺素運輸蛋白、半胱氨醯化甲狀腺素運輸蛋白、磺化甲狀腺素運輸蛋白、CysGly修飾的甲狀腺素運輸蛋白、穀胱甘肽化甲狀腺素運輸蛋白、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2以及IAIH4片段No.3及其組合物組成的組，以及(b)將測量結果與卵巢癌狀態相關聯。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述的方法進一步包括(c)根據卵巢癌狀態，安排受驗者治療。
3.如權利要求2所述的方法，其中所述的安排受驗者治療包括要求更多試驗、動手術、以及不採取進一步措施。
4.如權利要求2所述的方法，其中所述的方法進一步包括(d)安排受驗者治療後，測定至少一種生物標記。
5.如權利要求1所述的方法，其中所述的卵巢癌狀態選自由受驗者患癌風險、是否存在疾病、疾病階段以及疾病治療效果組成的組。
6.如權利要求5所述的方法，其中所述的方法進一步包括測量取自受驗者樣本中的至少一種已知生物標記(標記4)，並將所述的已知生物標記的測量結果以及Apo A1、經修飾的Apo A1、甲狀腺素運輸蛋白△N10、天然甲狀腺素運輸蛋白、半胱氨醯化甲狀腺素運輸蛋白、磺化甲狀腺素運輸蛋白、Cys Gly修飾的甲狀腺素運輸蛋白、穀胱甘肽化甲狀腺素運輸蛋白、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2、或IAIH4片段No.3的測量結果與卵巢癌狀態相關聯。
7.如權利要求6所述的方法，其中所述的已知生物標記選自CA125、CA125II、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA195、腫瘤相關胰蛋白酶抑制因子(TATI)、CEA、胎盤鹼性磷酸酯酶(PLAP)、抗原Sialyl TN、半乳糖轉移酶、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF，CSF-1)、溶血磷脂酸(LPA)、表皮生長因子受體細胞外區域110 kD部分(p110E GFR)、組織激肽釋放酶，如激肽釋放酶6和激肽釋放酶10(NE S-1)、prostasin、HE4、肌酸激酶(CKB)、LASA、HER-2/neu、尿促性腺激素肽(UGP)、Dianon NB70/K、組織多肽抗原(TPA)、骨橋蛋白和觸珠蛋白以及這些標記的蛋白質變異體(如裂解形式、異構形式)。
8.如權利要求1所述的方法，包括測量Apo A1以及甲狀腺素運輸蛋白的步驟，其中所述的Apo A1選自由未經修飾的Apo A1以及經修飾的Apo A1組成的組，其中所述的甲狀腺素運輸蛋白選自由甲狀腺素運輸蛋白△N10、天然甲狀腺素運輸蛋白、半胱氨醯化甲狀腺素運輸蛋白、磺化甲狀腺素運輸蛋白、Cys Gly修飾的甲狀腺素運輸蛋白以及穀胱甘肽化甲狀腺素運輸蛋白組成的組。
9.如權利要求8所述的方法，其中所述的Apo A1是經修飾的Apo A1，且所述的甲狀腺素運輸蛋白是半胱氨醯化甲狀腺素運輸蛋白。
10.如權利要求1所述的方法，所述的方法包括測量Apo A1、甲狀腺素運輸蛋白以及IAIH4片段的步驟，其中所述的Apo A1選自由未經修飾的Apo A1以及經修飾的Apo A1組成的組，其中所述的甲狀腺素運輸蛋白選自由甲狀腺素運輸蛋白△N10、天然甲狀腺素運輸蛋白、半胱氨醯化甲狀腺素運輸蛋白、磺化甲狀腺素運輸蛋白、Cys Gly修飾的甲狀腺素運輸蛋白以及穀胱甘肽化甲狀腺素運輸蛋白組成的組，其中所述的IAIH4片段選自由IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2、以及IAIH4片段No.3組成的組。
11.如權利要求1所述的方法，包括測量Apo A1、經修飾的Apo A1、甲狀腺素運輸蛋白△N10、天然甲狀腺素運輸蛋白、半胱氨醯化甲狀腺素運輸蛋白、磺化甲狀腺素運輸蛋白、Cys Gly修飾的甲狀腺素運輸蛋白、穀胱甘肽化甲狀腺素運輸蛋白、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2、以及IAIH4片段No.3。
12.如權利要求8至12中任一項所述的方法，其中所述的方法進一步包括測量取自受驗者樣本中的一種已知生物標記，並將所述的已知生物標記的測量結果以及ApoA1、甲狀腺素運輸蛋白△N10以及IAIH4片段的測量結果與卵巢癌狀態相關聯。
13.如權利要求12所述的方法，其中所述的已知生物標記選自CA125、CA125II、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA195、TATI、CEA、PLAP、抗原Sialyl TN、半乳糖轉移酶、M-CSF、CSF-1、LPA、p110EGFR、組織激肽釋放酶、prostasin、HE4、CKB、LASA、HER-2/neu、尿促性腺激素肽、Dianon NB 70/K、TPA、骨橋蛋白和觸珠蛋白以及這些標記的蛋白質變異體(如裂解形式、異構形式)。
14.如權利要求8至13中任一項所述的方法，其中測量步驟包括(a)提供受驗者血液樣本或血液衍生物樣本；(b)用陰離子交換樹脂區分所述的樣本中的蛋白質，並收集含有Apo A1、經修飾的Apo A1、甲狀腺素運輸蛋白以及IAIH4片段的區分物；以及(c)在包含有結合蛋白質生物標記的捕獲劑的基質表面上，從這些區分物中獲取Apo A1、經修飾的ApoA1、甲狀腺素運輸蛋白以及IAIH4片段。
15.如權利要求14所述的方法，其中所述的基質是含有IMAC銅表面的SELDI探針，並且其中所述的蛋白質生物標記通過SELDI檢測。
16.如權利要求14所述的方法，其中所述的基質是含有結合Apo A1、甲狀腺素運輸蛋白以及IAIH4片段的生物特性親和試劑的SELDI探針，並且所述的蛋白質生物標記通過SELDI檢測。
17.如權利要求14所述的方法，其中所述的基質是含有結合Apo A1、甲狀腺素運輸蛋白以及IAIH4片段的生物特異性親和試劑的微量滴定盤，而且所述的蛋白質生物標記通過免疫測定方法檢測。
18.如權利要求1所述的方法，其中測量選自檢測是否存在所述的生物標記、確定所述的標記的數量、以及評定所述的生物標記的類型。
19.如權利要求1所述的方法，其中至少一種生物標記是以生物晶片列陣測定。
20.如權利要求19所述的方法，其中所述的生物晶片列陣是蛋白質晶片列陣。
21.如權利要求19所述的方法，其中所述的生物晶片列陣是核酸列陣。
22.如權利要求19所述的方法，其中至少一種生物標記是被固定於生物晶片列陣上。
23.如權利要求1所述的方法，其中所述的蛋白質生物標記是通過SELDI測定。
24.如權利要求1所述的方法，其中所述的蛋白質生物標記是通過免疫測定方法測定。
25.如權利要求1所述的方法，其中所述的關聯通過軟體分類算法進行。
26.如權利要求1所述的方法，其中所述的樣本選自血液、血清或血漿。
27.一種方法，包括(a)測定取自受驗者樣本中的多種生物標記，其中所述的生物標記選自由Apo A1、經修飾的Apo A1、甲狀腺素運輸蛋白△N10、天然甲狀腺素運輸蛋白、半胱氨醯化甲狀腺素運輸蛋白、磺化甲狀腺素運輸蛋白、Cys Gly修飾的甲狀腺素運輸蛋白、穀胱甘肽化甲狀腺素運輸蛋白、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2以及IAIH4片段No.3組成的組。
28.如權利要求27所述的方法，其中所述的多種包括Apo A1以及甲狀腺素運輸蛋白，其中Apo A1選自由未經修飾的Apo A1以及經修飾的Apo A1組成的組，其中甲狀腺素運輸蛋白選自由甲狀腺素運輸蛋白△N10、天然甲狀腺素運輸蛋白、半胱氨醯化甲狀腺素運輸蛋白、磺化甲狀腺素運輸蛋白、Cys Gly修飾的甲狀腺素運輸蛋白以及穀胱甘肽化甲狀腺素運輸蛋白組成的組。
29.如權利要求27所述的方法，其中所述的多種包括Apo A1、甲狀腺素運輸蛋白以及IAIH4片段，其中甲狀腺素運輸蛋白選自由甲狀腺素運輸蛋白△N10、天然甲狀腺素運輸蛋白、半胱氨醯化甲狀腺素運輸蛋白、磺化甲狀腺素運輸蛋白、Cys Gly修飾的甲狀腺素運輸蛋白以及穀胱甘肽化甲狀腺素運輸蛋白組成的組，以及其中IAIH4片段選自由IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2、以及IAIH4片段No.3組成的組。
30.如權利要求27至29任一項所述的方法，其中所述的方法進一步包括測定至少一種已知生物標記。
31.如權利要求30所述的方法，其中所述的已知生物標記選自CA125、CA125II、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA195、TATI、CEA、PLAP、抗原Sialyl TN、半乳糖轉移酶、M-CSF、CSF-1、LPA、p110EGFR、組織激肽釋放酶、prostasin、HE4、CKB、LASA、HER-2/neu、尿促性腺激素肽、Dianon NB 70/K、TPA、骨橋蛋白和觸珠蛋白以及這些標記的蛋白質變異體(如裂解形式、異構形式)。
32.如權利要求27至31中任一項所述的方法，其中所述的蛋白質生物標記通過S ELDI或免疫測定方法測定。
33.如權利要求27至32中任一項所述的方法，其中所述的樣本選自血液、血清或血漿。
34.一種方法，包括測定取自受驗者樣本中的至少一種生物標記，其中所述的生物標記選自由甲狀腺素運輸蛋白△N10、天然甲狀腺素運輸蛋白、半胱氨醯化甲狀腺素運輸蛋白、磺化甲狀腺素運輸蛋白、Cys Gly修飾的甲狀腺素運輸蛋白、穀胱甘肽化甲狀腺素運輸蛋白、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2、IAIH4片段No.3及其組合物組成的組。
35.如權利要求34所述的方法，其中所述的方法進一步包括測定Apo A1。
36.如權利要求35所述的方法，其中Apo A1經修飾的Apo A1。
37.如權利要求34至36中任一項所述的方法，其中所述的方法進一步包括測定至少一種已知生物標記。
38.如權利要求37所述的方法，其中所述的已知生物標記選自CA125、CA125II、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA195、TATI、CEA、PLAP、抗原Sialyl TN、半乳糖轉移酶、M-CSF、CSF-1、LPA、p110EGFR、組織激肽釋放酶、prostasin、HE4、CKB、LASA、HER-2/neu、尿促性腺激素肽、Dianon NB 70/K、TPA、骨橋蛋白和觸珠蛋白以及這些標記的蛋白質變異體(如裂解形式、異構形式)。
39.如權利要求34至38中任一項所述的方法，其中所述的蛋白質生物標記是通過SELDI或免疫測定方法測定的。
40.如權利要求34至39中任一項所述的方法，其中所述的樣本選自血液、血清或血漿。
41.一種試劑盒，包括(a)結合生物標記的捕獲試劑，其中所述的生物標記選自Apo A1、經修飾的Apo A1、甲狀腺素運輸蛋白△N10、天然甲狀腺素運輸蛋白、半胱氨醯化甲狀腺素運輸蛋白、磺化甲狀腺素運輸蛋白、Cys Gly修飾的甲狀腺素運輸蛋白、穀胱甘肽化甲狀腺素運輸蛋白、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2以及IAIH4片段No.3，以及其組合物，以及(b)包括至少一種生物標記的容器。
42.如權利要求41所述的試劑盒，其中所述的捕獲試劑結合多個生物標記。
43.如權利要求41至42中任一項所述的試劑盒，其中所述的捕獲試劑是SELDI探針。
44.如權利要求41至43中任一項所述的試劑盒，其中所述的試劑盒進一步包括結合CA125的捕獲試劑。
45.如權利要求41至44中任一項所述的試劑盒，其中所述的試劑盒進一步包括結合第一捕獲試劑不結合的一種生物標記的第二捕獲試劑。
46.一種試劑盒，包括(a)結合至少一種生物標記的第一捕獲試劑，其中所述的生物標記選自Apo A1、經修飾的Apo A1、甲狀腺素運輸蛋白△N10、天然甲狀腺素運輸蛋白、半胱氨醯化甲狀腺素運輸蛋白、穀胱甘肽化甲狀腺素運輸蛋白、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2以及IAIH4片段No.3；以及(b)結合至少一種所述的第一捕獲試劑不結合的生物標記的第二捕獲試劑。
47.如權利要求46所述的試劑盒，其中至少一種捕獲試劑是抗體。
48.如權利要求46至47中任一項所述的試劑盒，其中所述的試劑盒進一步包括至少一種捕獲試劑粘附於或可粘附於其上的MS探針。
49.如權利要求46至48中任一項所述的試劑盒，其中所述的捕獲試劑是固定化的金屬螯合物。
50.如權利要求46至49中任一項所述的試劑盒，其中所述的試劑盒進一步包括衝洗溶液，衝洗後可選擇性地允許被結合的生物標記保留於所述的捕獲試劑上，而其它生物標記被衝洗下來。
51.一種試劑盒，包括(a)結合至少一種生物標記的第一捕獲試劑，其中所述的生物標記選自Apo A1、經修飾的Apo A1、甲狀腺素運輸蛋白△N10、天然甲狀腺素運輸蛋白、半胱氨醯化甲狀腺素運輸蛋白、磺化甲狀腺素運輸蛋白、Cys Gly修飾的甲狀腺素運輸蛋白、穀胱甘肽化甲狀腺素運輸蛋白、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2以及IAIH4片段No.3；以及(b)使用捕獲試劑檢測生物標記的說明書。
52.如權利要求51所述的試劑盒，其中所述的捕獲試劑是抗體。
53.如權利要求51至52中任一項所述的試劑盒，其中所述的試劑盒進一步包括所述的捕獲試劑粘附於或可粘附於其上的MS探針。
54.如權利要求51至53中任一項所述的試劑盒，其中所述的捕獲試劑是固定化的金屬螯合物。
55.如權利要求51至54中任一項所述的試劑盒，其中所述的試劑盒進一步包括衝洗溶液，衝洗後可選擇性地允許被結合的生物標記保留於所述的捕獲試劑上，而其它生物標記被衝洗下來。
56.如權利要求51至55中任一項所述的試劑盒，其中所述的試劑盒進一步包括使用試劑盒檢測癌症的書面說明書。
57.如權利要求56所述的試劑盒，其中所述的說明書適用於將測試樣本與所述的捕獲試劑接觸並檢測一種或多種被捕獲試劑捕獲到的生物標記。
58.一種經純化的肽，其選自由SEQ ID NO1(IAIH4片段No.1)、SEQ ID NO2(IAIH4片段No.2)和SEQ IDNO3(IAIH4片段No.3)組成的組。
59.如權利要求58所述的肽，其中所述的肽進一步包括可檢測的標誌。
60.一種製品，包括(a)結合至少兩種生物標記的至少一種捕獲試劑，其中所述的生物標記選自Apo A1、經修飾的Apo A1、甲狀腺素運輸蛋白△N10、天然甲狀腺素運輸蛋白、半胱氨醯化甲狀腺素運輸蛋白、磺化甲狀腺素運輸蛋白、Cys Gly修飾的甲狀腺素運輸蛋白、穀胱甘肽化甲狀腺素運輸蛋白、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2以及IAIH4片段No.3。
61.如權利要求60所述的製品，其中所述的生物標記是Apo A1和甲狀腺素運輸蛋白，其中所述的Apo A1選自由未經修飾的Apo A1以及經修飾的Apo A1組成的組，其中所述的甲狀腺素運輸蛋白選自由甲狀腺素運輸蛋白△N10、天然甲狀腺素運輸蛋白、半胱氨醯化甲狀腺素運輸蛋白、磺化甲狀腺素運輸蛋白、Cys Gly修飾的甲狀腺素運輸蛋白以及穀胱甘肽化甲狀腺素運輸蛋白組成的組。
62.如權利要求60所述的製品，其中所述的生物標記是Apo A1、甲狀腺素運輸蛋白以及IAIH4片段，其中所述的甲狀腺素運輸蛋白選自由甲狀腺素運輸蛋白△N10、天然甲狀腺素運輸蛋白、半胱氨醯化甲狀腺素運輸蛋白、磺化甲狀腺素運輸蛋白、Cys Gly修飾的甲狀腺素運輸蛋白以及穀胱甘肽化甲狀腺素運輸蛋白組成的組，其中所述的IAIH4片段選自由IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2、以及IAIH4片段No.3組成的組。
63.如權利要求60至62中任一項所述的製品，其中所述的製品進一步包括結合至少一種已知生物標記的捕獲試劑。
64.如權利要求63所述的製品，其中所述的已知生物標記選自CA125、CA125II、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA195、TATI、CEA、PLAP、抗原Sialyl TN、半乳糖轉移酶、M-CSF、CSF-1、LPA、p110E GFR、組織激肽釋放酶、prostasin、HE4、CKB、LASA、HER-2/neu、尿促性腺激素肽、Dianon NB 70/K、TPA、骨橋蛋白和觸珠蛋白以及這些標記的蛋白質變異體(如裂解形式、異構形式)。
65.一種系統，包括(a)多種捕獲試劑，每種捕獲試劑結合至不同生物標記，其中所述的生物標記選自Apo A1、經修飾的Apo A1、甲狀腺素運輸蛋白△N10、天然甲狀腺素運輸蛋白、半胱氨醯化甲狀腺素運輸蛋白、磺化甲狀腺素運輸蛋白、Cys Gly修飾的甲狀腺素運輸蛋白、穀胱甘肽化甲狀腺素運輸蛋白、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2、IAIH4片段No.3以及CA125。
66.一種篩選試驗，包括(a)將激肽釋放酶與激肽釋放酶底物以及測試試劑接觸，以及(b)判斷所述的測試試劑是否調節所述的激肽釋放酶活性。
67.如權利要求66所述的試驗，其中所述的底物是間-α-胰蛋白酶抑制因子重鏈H4前體。
68.如權利要求66所述的試驗，其中所述的激肽釋放酶將所述的底物切割成IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2或IAIH4片段No.3。
69.如權利要求66所述的試驗，其中所述的判斷步驟進一步包括測定生物標記IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2或IAIH4片段No.3。
70.如權利要求69所述的試驗，其中所述的蛋白質生物標記是通過SELDI測定的。
71.如權利要求69所述的試驗，其中所述的蛋白質生物標記是通過免疫測定方法測定的。
72.一種定性受驗者卵巢癌狀態的方法，包括(a)測定取自受驗者樣本中的至少一種生物標記，其中所述的生物標記選自由標記I至XLVIII及其組成物組成的組，以及(b)將所述的測定結果與卵巢癌狀態相關聯。
73.如權利要求72所述的方法，其中所述的方法進一步包括(c)根據所述的狀態，安排受驗者治療。
74.如權利要求73所述的方法，其中所述的安排受驗者治療包括要求更多試驗、動手術、以及不採取進一步措施。
75.如權利要求73所述的方法，其中所述的方法進一步包括(d)安排受驗者治療後，測定至少一種生物標記。
76.如權利要求72所述的方法，其中所述的卵巢癌狀態選自由受驗者患癌風險、是否存在疾病、疾病階段以及疾病治療效果組成的組。
77.如權利要求72至77中任一項所述的方法，其中所述的方法進一步包括測定取自受驗者樣本中的至少一種已知生物標記，並將至少一種己知生物標記的測定結果以及由標記I至XLVIII組成的組中的至少一種標記的測定結果與卵巢癌狀態相關聯。
78.如權利要求77所述的方法，其中所述的己知生物標記選自Apo A1、甲狀腺素運輸蛋白、IAIH4片段、CA125、CA125II、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA195、TATI、CEA、PLAP、抗原Sialyl TN、半乳糖轉移酶、M-CSF、CSF-1、LPA、p110EGFR、組織激肽釋放酶、prostasin、HE4、CKB、LASA、HER-2/neu、尿促性腺激素肽、Dianon NB 70/K、TPA、骨橋蛋白和觸珠蛋白以及這些標記的蛋白質變異體(如裂解形式、異構形式)。
79.如權利要求72至78中任一項所述的方法，其中測量包括(a)提供受驗者血液樣本或血液衍生物樣本；(b)用陰離子交換樹脂區分所述的樣本中的蛋白質，並收集含有任何選自由標記I至XLVIII組成的組的生物標記的區分物；以及(c)在含有結合蛋白質生物標記的捕獲劑的基質表面上，從這些區分物中獲取生物標記。
80.如權利要求79所述的方法，其中所述的基質是包括IMAC銅表面的SELDI探針，並且蛋白質生物標記通過SELDI檢測。
81.如權利要求79所述的方法，其中所述的基質是含有結合任何選自由標記I至XLVIII組成的組的生物標記的生物特異性親和試劑的SELDI探針，並且蛋白質生物標記是通過SELDI檢測的。
82.如權利要求72至81中任一項所述的方法，其中所述的方法還包括在取自受驗者的樣本中測定至少一種選自Apo A1、經修飾的Apo A1、甲狀腺素運輸蛋白△N10、天然甲狀腺素運輸蛋白、半胱氨醯化甲狀腺素運輸蛋白、磺化甲狀腺素運輸蛋白、Cys Gly修飾的甲狀腺素運輸蛋白、穀胱甘肽化甲狀腺素運輸蛋白、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2、IAIH4片段No.3的生物標記，並將生物標記的測定結果以及由標記I至XLVIII組成的組中的至少一種生物標記的測定結果與卵巢癌狀態相關聯。
83.一種軟體產品，包括a.輸入代表樣本屬性資料的編碼，所述的資料包括樣本中至少一種生物標記的測定結果，其中所述的生物標記選自由Apo A1、經修飾的Apo A1、甲狀腺素運輸蛋白△N10、天然甲狀腺素運輸蛋白、半胱氨醯化甲狀腺素運輸蛋白、磺化甲狀腺素運輸蛋白、Cys Gly修飾的甲狀腺素運輸蛋白、穀胱甘肽化甲狀腺素運輸蛋白、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2和IAIH4片段No.3組成的組；以及b.進行分類運算的編碼，其根據所述的測定結果將樣本的卵巢癌狀態分類。
84.如權利要求83所述的軟體產品，其中所述的分類運算根據選自由Apo A1、經修飾的Apo A1、甲狀腺素運輸蛋白△N10、天然甲狀腺素運輸蛋白、半胱氨醯化甲狀腺素運輸蛋白、磺化甲狀腺素運輸蛋白、Cys Gly修飾的甲狀腺素運輸蛋白、穀胱甘肽化甲狀腺素運輸蛋白、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2、IAIH4片段No.3組成的組的生物標記的測定結果分類所述的樣本的卵巢癌狀態。
85.如權利要求83所述的軟體產品，其中所述的分類運算根據Apo A1以及甲狀腺素運輸蛋白兩者的測定結果分類樣本的卵巢癌狀態，其中所述的Apo A1選自由未經修飾的Apo A1組成的組，以及所述的甲狀腺素運輸蛋白選自由甲狀腺素運輸蛋白△N10、天然甲狀腺素運輸蛋白、半胱氨醯化甲狀腺素運輸蛋白、磺化甲狀腺素運輸蛋白、Cys Gly修飾的甲狀腺素運輸蛋白、穀胱甘肽化甲狀腺素運輸蛋白組成的組。
86.如權利要求83所述的軟體產品，其中所述的分類運算根據Apo A1、甲狀腺素運輸蛋白以及IAIH4片段三者的測定結果分類樣本的卵巢癌狀態，其中所述的Apo A1選自由未經修飾的Apo A1組成的組，所述的甲狀腺素運輸蛋白選自由甲狀腺素運輸蛋白△N10、天然甲狀腺素運輸蛋白、半胱氨醯化甲狀腺素運輸蛋白、磺化甲狀腺素運輸蛋白、Cys Gly修飾的甲狀腺素運輸蛋白、穀胱甘肽化甲狀腺素運輸蛋白組成的組，以及其中所述的IAIH4片段選自由IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2、IAIH4片段No.3組成的組。
87.如權利要求83至86中任一項所述的軟體產品，其中所述的分類運算根據一種已知生物標記的測定結果分類樣本的卵巢癌狀態。
88.如權利要求87所述的軟體產品，其中所述的已知生物標記選自由Apo A1、甲狀腺素運輸蛋白△N10、IAIH4片段、CA125、CA125II、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA195、TATI、CEA、PLAP、抗原Sialyl TN、半乳糖轉移酶、M-CSF、CSF-1、LPA、p110E GFR、組織激肽釋放酶、prostasin、HE4、CKB、LASA、HER-2/neu、尿促性腺激素肽、DianonNB 70/K、TPA、骨橋蛋白和觸珠蛋白以及這些標記的蛋白質變異體(如裂解形式、異構形式)組成的組。
89.一種方法，包括通過質譜分析法或免疫測定方法檢測選自由Apo A1、經修飾的Apo A1、甲狀腺素運輸蛋白△N10、天然甲狀腺素運輸蛋白、半胱氨醯化甲狀腺素運輸蛋白、磺化甲狀腺素運輸蛋白、Cys Gly修飾的甲狀腺素運輸蛋白、穀胱甘肽化甲狀腺素運輸蛋白、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2、IAIH4片段No.3組成的組的生物標記。
90.一種方法，包括告知受驗者根據取自受驗者樣本中生物標記的關聯性判斷的有關卵巢癌狀態的診斷結果，其中所述的生物標記選自由Apo A1、經修飾的Apo A1、甲狀腺素運輸蛋白△N10、天然甲狀腺素運輸蛋白、半胱氨醯化甲狀腺素運輸蛋白、磺化甲狀腺素運輸蛋白、Cys Gly修飾的甲狀腺素運輸蛋白、穀胱甘肽化甲狀腺素運輸蛋白、I AIH4片段No.1、IAIH4片段No.2、IAIH4片段No.3組成的組。
91.如權利要求90所述的方法，其中所述的診斷結果是通過一種計算機生成的媒介告知受驗者的。
92.一種用於識別與IAIH4相互作用的化合物的方法，其中所述的方法包括a)將IAIH4與測試化合物接觸；以及b)判斷所述的測試化合物是否與IAIH4相互反應。
93.一種用於識別與IAIH4相互作用的化合物的方法，其中所述的方法包括a)將IAIH4與測試化合物接觸；以及b)判斷所述的測試化合物是否與IAIH4相互反應。
94.一種用於調節細胞中IAIH4濃度的方法，其中所述的方法包括a)將所述細胞與一種蛋白酶抑制因子接觸，其中所述的蛋白酶抑制因子阻止IAIH4裂解。
95.一種治療受驗者疾病的方法，其中所述的方法包括向受驗者投入治療上有效劑量的調節裂解IAIH4的蛋白酶的表達或活性的化合物。
96.一種方法，包括a)賦予資料組被分成至少兩組的概率；以及b)確定資料組的指數，其中所述的指數是每一所述的概率的函數。
97.如權利要求96所述的方法，其中所述的資料組包括至少一種或多種選自由多種生物標記、臨床歷史、基因型以及實驗室試驗組成的組的測定結果。
98.如權利要求96所述的方法，其中所述的函數是每一所述的概率的函數的總和。
99.如權利要求96所述的方法，其中所述的概率選自由相對危險度、比值比以及危險比組成的組。
全文摘要
本發明是關於一種定性受驗者卵巢癌狀態的方法，包括(a)測量取自受驗者樣本中的至少一種生物標記，以及(b)將測量結果與卵巢癌狀態相關聯。本發明進一步關於用於定性受驗者卵巢癌狀態的試劑盒。
文檔編號C12Q1/00GK101023349SQ200580017610
公開日2007年8月22日 申請日期2005年3月31日 優先權日2004年3月31日
發明者D·W·陳, Z·張, E·馮 申請人:約翰·霍普金斯大學, 賽弗吉生物系統公司