凡納濱對蝦諾達病毒現場快速檢測試劑盒及檢測方法

2023-04-28 21:05:41

專利名稱：凡納濱對蝦諾達病毒現場快速檢測試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發明屬於海洋生物病原檢測技術領域，具體涉及一種凡納濱對蝦諾達病毒 (Penaeus vannamei Nodavirus, PvNV)的現場快速高靈敏檢測試劑盒及其檢測方法。
背景技術：
凡納濱對蟲下諾達病毒(Penaeus vannamei nodavirus,PvNV)是一種無囊膜的RNA 病毒，呈二十面體狀，直徑約為22nm，其基因組由兩條單鏈RNA組成(其中RNA-I長3111bp， RNA-2長1183bp)；該病毒能引起凡納濱對蝦的肌肉壞死，對蝦感染該病毒後的症狀與感染了傳染性肌肉壞死病毒(Infectious Myonecrosis Virus, IMNV)後的症狀非常相似，主要表現為為病蝦尾部出現白色、不透明的病理損傷，組織病理學表現為骨骼肌肌肉呈多病灶壞死、血細胞纖維化，此外橫紋肌、淋巴器官及結締組織中可見嗜鹼性的胞漿包涵體；該病毒的感染可引起對蝦50%以上的死亡率。2004年在貝里斯首次發現該病毒；研究發現，發病區域的鳥類糞便、藤壺、紅樹林蟹、小型浮遊動物、食蚊魚、養殖凡納濱對蝦中均能檢測到該病毒。目前，除貝里斯外，其他國家和地區尚未見有該病毒存在的報導，2010年以來，我國南方多省連續出現養殖凡納濱對蝦大批死亡的情況，發病對蝦呈現「肌肉壞死和白濁」等症狀，具體病原尚未明確，不排除與PvNV有關。所以研究並建立PvNV的快速檢測預警技術， 加強蝦苗種和成蝦檢疫以及養殖水體環境的監測，對預防病毒感染，有效切斷病毒傳播，保障我國對蝦養殖業的健康持續發展就顯得尤為迫切和重要。目前，PvNV檢測還主要依賴於病理切片法、電鏡觀察法、抗體雜交法和RT-PCR檢測法。病理切片法不能直接對病毒進行檢測，只能利用發病的組織病理徵兆進行檢測，並且還局限於在實驗室內進行；電子顯微鏡技術雖然可以直接觀察到病毒粒子的存在，但其操作複雜、耗費時間長、準確性低；用抗體檢測法檢測PvNV雖然在速度上優於病理切片法， 但其靈敏度較低，在PvNV尚未引發感染或感染的極早期很難用抗體法檢測出來；PvNV的 RT-PCR檢測法，雖然克服了前面幾種方法的缺點，在實驗室條件下能實現對PvNV的相對快速、準確檢測，但由於常規的RT-PCR檢測需要昂貴的PCR儀、凝膠電泳和成像系統，使得 RT-PCR檢測法難以用於現場的快速檢測，這大大限制了 RT-PCR檢測方法在生產中的推廣應用。進行凡納濱對蝦諾達病毒早期檢測並採取預防措施是水產養殖中降低凡納濱對蝦諾達病毒流行風險、減少發病照成巨額經濟損失的有效手段，所以建立簡單、快速、高靈敏的檢查方法，並開發適於現場應用的凡納濱對蝦諾達病毒檢測試劑盒就尤為必要。

發明內容
本發明的目的是提供一種凡納濱對蝦諾達病毒現場快速檢測試劑盒及檢測方法， 即一種適於生產現場應用、快速、高靈敏度且易操作的凡納濱對蝦諾達病毒檢測方法，並將檢測方法標準化；同時將檢測試劑集中於規範的試劑盒中，使PvNV的檢測更準確、靈敏、快速、安全和方便，以克服現有技術的不足。
本發明利用針對PvNV的衣殼蛋白基因中保守區段設計的環介導等溫擴增4條特異引物、一種反轉錄酶和一種DNA聚合酶，無需單獨對目的核酸(RNA)進行反轉錄，在恆定溫度下保溫一段時間即可同步完成對目的核酸的反轉錄和擴增，實現對PvNV的快速和高靈敏檢測。同時本發明對FTA卡製備樣品核酸的標準步驟進行了優化，能有效縮短樣品製備時間。本發明的環介導等溫擴增引物，其序列如下上訪字引物 1 upper primer ISEQ ID NO 1 GCGTTCCCAATAACTAGACAAACCTTTTGACCGTATACTTGTTAAGCAA下訪字引物 1 downstream primer 1 SEQ ID NO 2 ATAAGTGGTTATCAGCTGTAGCCCTTTTTCAATATACATGACAAACTGACAG上遊引物2 upper primer2 SEQ ID NO 3 TCTACTAGTATCGTTACTCCAG下遊引物 2 downstream priemr 2 SEQ ID NO 4 GATCGTCGAGAGGATCAG 。本發明的檢測試劑盒包括(1)採樣管，用來盛放、研磨待檢樣品；(2)漂洗管，內裝蒸餾水；(3)核酸變性管，內裝TE緩衝液；(4)擴增檢測管，內裝擴增反應液和染料，擴增反應液組成成分如下擴增引物的上遊引物1和下遊引物1各1 2 μ M，擴增引物的上遊引物2和下遊引物2各0. 1
0.4「] ，(^1 、(1111\( ^13和(1013各0.8 2.OmMjMgCl2 4 10mM，Betaine (甜菜鹼)0. 6
1.2M, Tris-HCl 10 40mM，KCl 10 20mM，MgSO4 1 4mM，(NH4)2SO4 6 12mM，Triton X-1000. 05% 1. 0%，反轉錄酶1 20U，Bst DNA聚合酶2 20U ；染料可以選金屬離子與鈣黃綠素形成的配合物，也可以選核酸染料，只需其中一種即可；金屬離子與鈣黃綠素形成的配合物預混於擴增反應液中，核酸染料為分子生物學研究中常用的核酸染料，包括但不限於 SYBR Green、GelRed, GelGreen, GoldView 、GeneFinder 等，核酸染料預先粘附於擴增檢測管管壁內側上方或擴增檢測管蓋子內側；(5)陰性對照管，內裝無凡納濱對蝦諾達病毒核酸的FTA膜片；(6)陽性對照管，內裝吸附了凡納濱對蝦諾達病毒核酸的FTA膜片；(7)快速乾燥液，為親水性且易揮發的醇類物質；(8)分別封裝於無菌袋中的FTA膜片、研磨棒、牙籤和吸管。本發明的檢測試劑盒用於檢測水體、餌料中是否存在諾達病毒。用本發明上述檢測試劑盒檢測PvNV的方法，按下列步驟進行(1)取樣品組織約0. 02 1. Og置於採樣管中，用研磨棒將樣品組織磨碎至漿狀；(2)用研磨棒蘸取漿狀的樣品組織將FTA膜片充分潤溼；(3)吸取快速乾燥液滴於上述FTA膜片上，靜置1 20min ；(4)用牙籤將上述FTA膜片轉移到漂洗管內，震蕩漂洗管3 5min以洗滌FTA膜片；(5)再用牙籤將上述核酸變性管內的FTA膜片轉移到擴增檢測管內，將擴增檢測管置於55 65°C條件下保溫40 70min ；(6)將擴增檢測管上下反覆甩動l-3min ；(7)用力向下甩動擴增檢測管，使管內混有染料的擴增反應液集聚於擴增檢測管底部，用眼睛觀察反應液，如果反應液呈現綠色則表示該樣品的PvNV檢測結果為陽性，如果反應液呈現橙黃色則表示該樣品的PvNV檢測結果為陰性。在上述步驟中，從第(4)步開始應將作為陰性對照的無凡納濱對蝦諾達病毒核酸的FTA膜片、作為陽性對照的吸附了凡納濱對蝦諾達病毒核酸的FTA膜片，以及吸附了樣品核酸的FTA膜片一起處理，直至完成檢測。本發明在試劑盒中匯集PvNV現場快速檢測所需的FTA膜片、TE緩衝液、擴增反應液、染料等試劑和研磨棒、牙籤、吸管等器材，使得PvNV的檢測能夠快速有序地進行，實現了檢測過程的程序化和標準化，使得操作規範、不易出錯；本發明依據優選的PvNV衣殼蛋白保守區序列所設計的擴增引物能有效檢測PvNV的所有毒株，而與其他病毒的衣殼蛋白又無同源性，檢測特異性非常好；採用醇類物質對取樣後的FTA膜片進行快速乾燥處理，使得樣品核酸的製備時間大大縮短；採用內置染料的方法，在反應結束後不用打開反應管即可直接對反應液進行染色，避免了打開反應管再添加染料使後續待檢樣品被擴增產物汙染而造成假陽性的結果，從而大大提高了該方法在檢測中應用的可靠性。。
具體實施例方式本發明依據優選的PvNV衣殼蛋白保守區序列所設計的擴增引物能有效檢測PvNV 的所有毒株，而與其他病毒的衣殼蛋白又無同源性，檢測特異性非常好。同時，為了進一步縮短檢測時間、消除檢測過程中可能發生的汙染、簡化檢測步驟，使檢測實驗能夠在養殖現場開展，本發明對PvNV的檢測方法進行了優化。在用FTA卡製備樣品核酸的標準步驟中， 需要將被樣品勻漿液潤溼的FTA膜片在室溫下乾燥至少一個小時，然後才能進行漂洗；本發明通過在被樣品勻漿液潤溼的FTA膜片上滴加親水性且易揮發的醇類物質(主要是叔醇、伯醇和仲醇)，使潤溼的FTA膜片在室溫條件下僅需幾分鐘即可完成乾燥過程，大大縮短了樣品核酸製備的時間。在利用等溫擴增方法檢測病原時，目前普遍採用擴增反應結束後向反應管中添加核酸染料以判斷檢測結果的方法；由於等溫擴增反應的產物量非常大， 這種打開反應管再添加核酸染料的方法極易導致後續待檢樣品被汙染而使檢測結果出現假陽性；有報導和專利採用在擴增反應試劑中添加尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)的方法消除汙染風險，但卻增加了成本；本發明通過在用於擴增反應的小管內預置染料的方法，可有效消除汙染風險，又不增加成本。本發明含有兩種方法將染料預置於擴增反應的小管， 其一是將金屬離子與鈣黃綠素形成的配合物(即染料)與擴增反應液預先混合，置於擴增反應小管內；其二是先將核酸染料粘附到擴增反應管的內側上方或蓋子內側，等擴增反應結束後再通過上下反覆震蕩使擴增反應液和核酸染料混合；這樣反應結束後無須打開擴增反應管就能完成擴增產物的染色，消除了打開擴增反應管再添加核酸染料過程中反應液可能濺出造成後續待檢樣品被汙染的風險。在用FTA卡製備樣品核酸的標準步驟中，需要用 Whatman公司(英國)專門的純化試劑反覆漂洗FTA膜片；本發明無需專門的純化試劑，採用普通的蒸餾水漂洗即可完成FTA膜片的純化，不僅簡化了檢測的操作步驟，還降低了實驗成本。為了使該檢測方法在生產現場具有更強的實用性，本發明在上述優化整個檢測方法的基礎上，將檢測PvNV病毒所需的試劑及器材進行了組裝、配套，使之標準化，形成了檢測試劑盒。以下通過實施例對本發明作進一步說明。實施例1本發明的檢測試劑盒由以下部件組成(可檢測4個樣品的包裝)(1)採樣管，4個，用來盛放、研磨待檢樣品；(2)漂洗管，6個，每個管內裝有Iml的蒸餾水；(3)核酸變性管，6個，每個管內裝有20μ L的TE緩衝液(含IOmM Tris-HCl和 ImM EDTA,ρΗ8· 0)；(4)擴增檢測管，6個，每個管內裝有24 μ L擴增反應液和1 μ L的染料，擴增反應液組成成分如下擴增引物的上遊引物1和下遊引物1各1. 6 μ Μ，擴增引物的上遊引物 2 和下遊引物 2 各 0. 2 μ M，dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP 各 1. 4mM, MgCl2 8mM, Betaine (甜菜鹼)1· 2M，Tris-HCl 20mM, KCl IOmM, MgS042mM, (NH4)2SO4 IOmM, Triton X-1000.1%，反轉錄酶5U，Bst DNA聚合酶8U ；染料為50 μ M鈣黃綠素和氯化錳形成的配合物；(5)陰性對照管，1個，內裝無凡納濱對蝦諾達病毒核酸的FTA膜片；(6)陽性對照管，1個，內裝吸附了凡納濱對蝦諾達病毒核酸的FTA膜片；(7)快速乾燥液，1管，內裝500 μ L無水乙醇；(S)FTA膜片(4片)、研磨棒(4個)、牙籤(6個)和吸管(1個)分別封裝於無菌袋中；(9)包裝盒(1個)，內裝一塊有多個小孔的海綿塊，海綿塊上有小孔4X6個；(10)使用說明書，1份。實施例2本發明的檢測試劑盒也可由以下部件組成(可檢測4個樣品的包裝)(1)採樣管，4個，用來盛放、研磨待檢樣品；(2)漂洗管，6個，每個管內裝有Iml的蒸餾水；(3)核酸變性管，6個，每個管內裝有20μ L的TE緩衝液(含IOmM Tris-HCl和 ImM EDTA,ρΗ8· 0)；(4)擴增檢測管，6個，每個管內裝有25 μ L擴增反應液和IyL的核酸染料，擴增反應液組成成分如下擴增引物的上遊引物1和下遊引物1各1. 6 μ Μ，擴增引物的上遊引物 2 和下遊引物 2 各 0. 2 μ M，dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP 各 1. 4mM, MgCl2 8mM, Betaine (甜菜鹼)1· 2M，Tris-HCl 20mM, KCl IOmM, MgSO4 2mM, (NH4)2SO4 1 OmM, Triton X-1000.1%，反轉錄酶5U，Bst DNA聚合酶8U ；核酸染料1 μ L，成分為稀釋10倍的GeneFinder ，且核酸染料已粘附固定於擴增檢測管的管蓋內側。(5)陰性對照管，1個，內裝無凡納濱對蝦諾達病毒核酸的FTA膜片；(6)陽性對照管，1個，內裝吸附了凡納濱對蝦諾達病毒核酸的FTA膜片；(7)快速乾燥液，1管，內裝500 μ L無水乙醇；(S)FTA膜片(4片)、研磨棒(4個)、牙籤(6個)和吸管(1個)分別封裝於無菌袋中；(9)包裝盒(1個)，內裝一塊有多個小孔的海綿塊，海綿塊上有小孔4X6個；(10)使用說明書，1份。實施例3使用本發明的檢測試劑盒檢測凡納濱對蝦諾達病毒的方法
(1)取樣品組織約0. Ig置於採樣管中，用研磨棒快速將樣品磨碎至漿狀；(2)用研磨棒蘸取漿狀的樣品將FTA膜片充分潤溼；(3)吸取快速乾燥液滴於上述FTA膜片上，將FTA膜片室溫靜置IOmin ；(4)用牙籤將上述FTA膜片轉移到漂洗管內，將漂洗管劇烈震蕩3min ；(5)再用牙籤將上述核酸變性管內的FTA膜片轉移到擴增檢測管內，57°C保溫 60min ；(6)將擴增檢測管上下反覆甩動2min ；(7)然後用力向下甩動擴增檢測管，用眼睛觀察擴增反應液，如果呈現綠色則表示該樣品的PvNV檢測結果為陽性，如果呈現橙黃色則表示該樣品的PvNV檢測結果為陰性。在上述步驟中從第4步開始，應將無凡納濱對蝦諾達病毒核酸的FTA膜片、吸附了凡納濱對蝦諾達病毒核酸的FTA膜片和吸附了樣品核酸的FTA膜片一起處理，直至完成檢測反應，分別用作檢測的陰性和陽性對照。結果發現，本發明設計的環介導等溫擴增引物可以準確的檢測帶有凡納濱對蝦諾達病毒核酸的陽性樣品，在實際檢測中沒有出現假陽性和假陰性的結果。實施例4使用本發明試劑盒檢測餌料中病毒存在情況使用實施例1或實施例2中的檢測試劑盒，按下列步驟進行(1)取凡納濱對蝦鮮餌料約0. Ig置於採樣管中，用研磨棒快速將樣品磨碎至漿狀；(2)用研磨棒蘸取漿狀的樣品將FTA膜片充分潤溼；(3)吸取快速乾燥液滴於上述FTA膜片上，將FTA膜片室溫靜置IOmin ；(4)用牙籤將上述FTA膜片轉移到漂洗管內，將漂洗管劇烈震蕩3min ；(5)再用牙籤將上述核酸變性管內的FTA膜片轉移到擴增檢測管內，57°C保溫 60min ；(6)將擴增檢測管上下反覆甩動2min ；(7)然後用力向下甩動擴增檢測管，用眼睛觀察擴增反應液，如果呈現綠色則表示該樣品的PvNV檢測結果為陽性，如果呈現橙黃色則表示該樣品的PvNV檢測結果為陰性。在上述步驟中從第4步開始，應將無凡納濱對蝦諾達病毒核酸的FTA膜片、吸附了凡納濱對蝦諾達病毒核酸的FTA膜片和吸附了樣品核酸的FTA膜片一起處理，直至完成檢測反應，分別用作檢測的陰性和陽性對照。實施例5利用Whatman-FTA卡標準核酸製備方法和本發明快速核酸製備方法製備蝦病毒核酸為了驗證本發明中快速核酸製備方法製備核酸的效果，分別利用Whatman-FTA卡標準核酸製備方法和本發明快速核酸製備方法分別從感染PvNV的蝦中製備病毒核酸。
首先利用Whatman-FTA卡標準核酸製備方法製備病毒核酸(1)取約10-20毫克的蝦附肢放入1. 5mL離心管中，加入100 μ L份PBS緩衝液，用研磨棒將附肢研磨成漿狀；(2)用吸液管將研磨的組織勻漿液加到FTA卡的樣品圓圈內，大約每個圓圈加 25μ L (3)將加好樣品的FTA卡室溫放置乾燥至少一個小時；
(4)用一個鑽取工具從所上述乾燥後的FTA卡上取下直徑約2. Omm的圓片，放進 1. 5mL離心管中；(5)在上述離心管中加入200 μ L PTA純化試劑(Whatman產品編號WG120204)，
靜置5分鐘；(6)用吸液管將離心管內的PTA純化試劑全部吸出；(7)重複步驟(5)——(6)兩次；(8)在上述離心管中加入 200μ L TE 緩衝液(IOmM Tris-NCl,0. ImM EDTA, ρΗ 8. 0)，靜置5分鐘；(9)用吸液管將離心管內的TE緩衝液全部吸出；(10)重複步驟⑶——(9)兩次；(11)將上述離心管內的圓片在室溫下乾燥大約一個小時，圓片即可用於核酸的擴增了。利用本發明中快速核酸製備方法按下面的步驟製備蝦病毒核酸(1)取約10-20毫克的蝦附肢放入1. 5mL離心管中，用研磨棒將蝦附肢研磨成漿狀；(2)用吸液管將研磨的組織勻漿液加到3個FTA卡的樣品圓圈內，大約每個圓圈加 5 μ L ；(3)將3個FTA卡上分別滴加100 μ L甲醇、無水乙醇和異丙醇，室溫放置3 5分鐘；(4)用一個鑽取工具從所上述3個PTA卡上分別取下直徑約2. Omm的圓片放進 1. 5mL離心管中；(5)在上述離心管中加入800 μ L滅菌水，劇烈震蕩3分鐘；(6)取出離心管內的圓片即可用於核酸的擴增了。從上述過程中可以看出，採用Whatman-PTA卡標準核酸製備方法大約需要2個多小時才能完成核酸製備，而採樣本發明的快速核酸製備方法大約只需要6 10分鐘就可以完成核酸製備；所以與Whatman-FTA卡標準核酸製備方法相比，本發明的快速核酸製備方法具有操作簡單、快速的優點。實施例6Whatman-PTA卡標準核酸製備方法和本發明快速核酸製備方法製備蝦病毒核酸的效果對比用實施例5中Whatman-FTA卡標準核酸製備方法和本發明快速核酸製備方法製備的蝦病毒核酸分別作為模板，進行等溫擴增反應，每個擴增反應中含25 μ L擴增反應液，擴增反應液組成成分如下擴增引物的上遊引物1和下遊引物1各1. 5 μ Μ，擴增引物的上遊引物2和下遊引物2各0.3「] ，(^1 、(1111\( ^13和(1013各1. 5mM,MgCl2 7mM, Betaine (甜菜鹼)1·3Μ，Tris-HCl 20mM, KCl IOmM, MgSO4 2mM, (NH4)2SO4 IOmM, Triton X-1000. 1%, 反轉錄酶2U，Bst DNA聚合酶8U ；等溫擴增反應條件為58°C保溫60分鐘，然後90°C保持 5分鐘；最後將每個反應管中的擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析。結果發現，利用本發明快速核酸製備方法(製備核酸過程中採用了甲醇、無水乙醇和異丙醇等揮發性醇類作為快速乾燥液)製備的核酸均可以有效用作等溫擴增反應的模板，並且擴增效果略好於採用 Whatman-FTA卡標準核酸製備方法製備的核酸的擴增效果。
綜上所述，本發明檢測試劑盒及其檢測方法不僅可以應用於蝦組織樣品中PvNV 的檢測，還可應用於蝦餌料、養殖水體中PvNV的檢測。本發明中所述的PTA膜片是英國Whatman公司用來製備核酸的FTA卡片；將FTA 卡片裁切成尺度為長X寬不小於1毫米Xl毫米的紙片或打孔成直徑不小於1毫米的紙片即可製成FTA膜片。本發明的試劑盒所使用的試劑和材料引物由上海生物工程有限責任公司合成； 乙二胺四乙酸二鈉、三羥甲基氨基甲烷、dNTP、甜菜鹼(Betaine)、dATP、dGTP、d6TP和dTTP、 KCUMgSO4, (NH4)2SO4, MgCl2, Triton X-100購自上海生物工程有限責任公司；無水乙醇、甲醇、異丙醇、鈣黃綠素、氯化錳等購自國藥集團化學試劑北京有限公司；等溫擴增用的Bst DNA聚合酶、反轉錄酶等購自NEB公司；核酸染料GeneFinder 購自廈門百維信生物科技有限公司。本發明將目的核酸(RNA)的反轉錄和擴增結合起來同步進行，節省了時間，僅需 1. 5 2小時就可完成PvNV的檢測；並且檢測過程無需昂貴的儀器設備如離心機、PCR儀和凝膠成像系統，僅需水浴鍋或金屬浴甚至更簡單的保溫裝置即可；而且檢測結果非常容易判別；與PvNV已有檢測技術相比，本發明的檢測方法成本非常低，整個過程不涉及有毒試劑，對操作人員和環境都非常安全，並且檢測靈敏度極高，可以替代凡納濱對蝦諾達病毒之前的相關檢測方法如病理切片法、電鏡觀察法、抗體檢測法和RT-PCR檢測法；本發明的檢測試劑盒不僅可在實驗室內使用，也可在野外的生產現場使用，對加強PvNV的流行病學監測和疾病防控意義重大，具有很高的推廣應用價值。
權利要求
1.用於檢測凡納濱對蝦諾達病毒的環介導等溫擴增引物，其引物序列分別為SEQID NO :1 4。
2.—種凡納濱對蝦諾達病毒現場快速高靈敏檢測試劑盒，其特徵是該檢測試劑盒包括(1)採樣管，用來盛放、研磨待檢樣品；(2)漂洗管，內裝蒸餾水；(3)核酸變性管，內裝TE緩衝液；(4)擴增檢測管，內裝擴增反應液和染料，擴增反應液由以下組份組成擴增引物的上遊引物1和下遊引物1各1 2 μ M，擴增引物的上遊引物2和下遊引物2各0. 1 0. 4 μ M， dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP 各 0. 8 2. OmM, MgCl2 4 10mM，甜菜鹼 0. 6 1. 2M, Tris-HCl 10 40mM，KCl 10 20mM，MgS04 1 4mM，(NH4) 2S04 6 12mM，Triton X-100 0· 05% 1. 0%，反轉錄酶1 20U，具有鏈置換活性的DNA聚合酶2 20U ；(5)陰性對照管，內裝無凡納濱對蝦諾達病毒核酸的FTA膜片；(6)陽性對照管，內裝吸附了凡納濱對蝦諾達病毒核酸的FTA膜片；(7)快速乾燥液；(8)分別封裝於無菌袋中的FTA膜片、研磨棒、牙籤和吸管；其中上遊引物1、下遊引物1、上遊引物2和下遊引物2的序列分別為SEQ ID N0:1 4。
3.如權利要求2所述的檢測試劑盒，其特徵在於上述染料為鈣黃綠素。
4.如權利要求2所述的檢測試劑盒，其特徵在於上述染料為分子生物學中應用的核酸染料。
5.如權利要求4所述的檢測試劑盒，其特徵在於上述的分子生物學中應用的核酸染料
6.如權利要求2所述的檢測試劑盒，其特徵在於所述的快速乾燥液是親水性且易揮發的醇類物質。
7.如權利要求2所述的檢測試劑盒，其特徵在於上述擴增檢測管內的染料與擴增反應液混合或粘附於擴增檢測管內。
8.如權利要求2所述的檢測試劑盒，其特徵在於所述的FTA膜片是由英國Whatman公司用來製備核酸的FTA卡片裁切成的尺度不小於1平方毫米的紙片。
9.權利要求2所述的試劑盒用於養殖水體或餌料中諾達病毒的檢測。
10.權利要求9所述的諾達病毒的檢測，其特徵在於該方法包括下列步驟(1)取凡納濱對蝦鮮活餌料約0.Ig置於採樣管中，快速將樣品磨碎至漿狀；(2)用研磨棒蘸取漿狀的樣品將FTA膜片充分潤溼；(3)吸取快速乾燥液滴於上述FTA膜片上，靜置1 20min；(4)用牙籤將上述FTA膜片轉移到漂洗管內，震蕩漂洗管3 5min以洗滌FTA膜片；(5)再用牙籤將上述核酸變性管內的FTA膜片轉移到擴增檢測管內，將擴增檢測管置於55 65 °C條件下保溫40 70min ；(6)將擴增檢測管上下反覆甩動l-3min；(7)向下甩動擴增檢測管，直接觀察擴增反應液顏色，如果擴增反應液呈現綠色則表示該樣品的凡納濱對蝦諾達病毒檢測結果為陽性，如果擴增反應液呈現橙黃色則表示該樣品的凡納濱對蝦諾達病毒檢測結果為陰性。
全文摘要
本發明涉及一種凡納濱對蝦諾達病毒的快速高靈敏檢測試劑盒及檢測方法。本發明的檢測試劑盒包括採樣管、內裝蒸餾水的漂洗管、內裝TE緩衝液的核酸變性管、內裝擴增反應液和染料的擴增檢測管、陰性對照管、陽性對照管、FTA膜片及其快速乾燥液等。本發明的檢測方法具有比RT-PCR檢測方法更高的特異性、靈敏性和便捷性，並且成本低，使用方便，檢測更準確、快速、靈敏度極高，且對人和環境都非常安全，可以替代已有的相關檢測方法。本發明的檢測試劑盒和檢測方法不僅可在室內的實驗室使用，也可在野外的生產現場使用，對於加強凡納濱對蝦諾達病毒監測、防止其大規模爆發流行意義重大，具有很高的推廣應用價值。
文檔編號C12N15/11GK102329894SQ201110300050
公開日2012年1月25日 申請日期2011年10月9日 優先權日2011年10月9日
發明者劉莉, 張慶利, 楊冰, 王勤濤, 黃倢 申請人:中國水產科學研究院黃海水產研究所