檢測鹼性鞘磷脂酶的分析方法以及用於該方法的試劑盒的製作方法

2023-04-28 07:03:31

專利名稱：檢測鹼性鞘磷脂酶的分析方法以及用於該方法的試劑盒的製作方法
檢測鹼性鞘磷脂酶的分析方法 以及用於該方法的試劑盒本案為分案申請，母案申請號為02825879.7 (國際申請號 PCT/IT02/00811 )，申請日為2002年12月19日，發明名稱為"檢測 鹼性鞘磷脂酶的分析方法以及用於該方法的試劑盒"。本發明涉及一種評估需要此種評估的患者糞便或生物學流體中的 鹼性鞘磷脂酶的分析方法。本發明還涉及用於該方法的試劑盒。更具體地，本發明方法是用於檢測鹼性鞘磷脂酶的體外螢光分析 方法，其中所述鹼性鞘磷脂酶(如下所述)是嚴重的病理狀態如結腸 癌及家族性腺瘤性息肉的標記物。鞘磷脂酶(鞘磷脂磷酸二酯酶，SMase)催化鞘磷脂水解為神經 醯胺及磷酸膽鹼。迄今為止，已經鑑定了三種不同的SMase (酸性、中性和鹼性), 它們以如下的幾種同工型存在-溶酶體酸性SMase ( A - SMase );-胞質Zn2 +依賴性酸性SMase;-膜中性鎂依賴性SMase ( N - SMase );-胞質鎂非依賴性N-SMase;和-鹼性SMase 。SMase顯示在許多生理和病理過程中起作用，包括內吞SM的
溶酶體水解、神經醯胺介導的細胞信號傳輸、動脈粥樣硬化形成、終 末分化、細胞周期抑制、細胞凋亡、炎症形成及調節真核生物應激反 應。與通常存在於細胞中分別充當溶酶體及膜固定酶的酸性和中性SMase相反，鹼性SMase顯示出組織和種屬差異性。對人而言，鹼性 SMase存在於腸黏膜和膽汁中。鹼性SMase首先產生於十二指腸，在 腸內具有較高的含量，特別是在空腸末端，並在結腸和直腸內含量很 高。該SMase的最佳鹼性pH值為9.0，並且是Mg2+非依賴性的、膽 鹽依賴性的和胰蛋白酶抗性的。鹼性SMase的病理學重要性最近才被認識到，由於以下原因促進 了某些研究的發展。首先，該酶可能負責主要存在於奶、蛋、肉和魚中的飲食鞘磷脂 的水解。其次，該酶可能調節膽固醇的吸收。第三，鹼性SMase在腸道中的存在以及其在結腸直腸癌中檢測到的選擇性降低說明該酶在腸道癌變中起作用，因為在生理條件下，該酶刺激細胞凋亡，保護腸黏膜免遭癌變。先前的研究表明，在生理條件下，鹼性SMase可被膽鹽從腸黏膜 解離進入腔內。然而，在病理條件下，由於膽鹽濃度反常的升高，被 膽鹽解離的鹼性SMase便超過了正常的酶生物合成，導致鹼性SMase 在黏膜中的低活性水平，及反常的糞便或生物學流體即膽汁中酶的排 洩的升高。因此，超過了正常的基礎值的過量鹼性SMase在糞便或生 物學流體中的排洩可作為結腸直腸癌變及家族性腺瘤性息肉的有價值的診斷標記物；因此，有需要獲得可靠的檢測方法以檢測可能處於前 述腸道病理狀態的患者糞便或生物學流體中的鹼性SMase。
另外， 一些細菌(如Streptococcus termophilus Lactobacilli)含 有高水平的SMase，對鹼性SMase的評估可以提供評估所述細菌數量 變化的方法，也就是說，用微生態調節劑或/和基於微生態調節劑的 產品治療後進行。
先前的評估鹼性SMase的方法是>5^知的。SMase的活性可以進行 體內確定，即用SM的放射性前體標記細胞，然後確定標記產物的水 平，或者也可以用放射性標記的SM或SM的顯色類似物、或中性SM 的著色或螢光衍生物進行體外確定。
這些已知的方法由於具有放射性而有潛在的危險，並且敏感度低 於螢光檢測而並不完全令人滿意。
本發明的一個目的是提供可靠的、不昂貴的檢測可能患有結腸直 腸癌及家族性腺瘤性息肉、或膽囊或肝臟疾病的患者糞便或生物學流 體中的鹼性SMase的方法，該方法克服了已知方法的缺陷。
本發明進一步的目的是提供用於上述檢測方法的檢測試劑盒。
本發明的另一個目的是評估在不同的健康條件下，或疾病之後或 用藥物或微生態調節劑或食物補充劑治療後的細菌繁殖情況。
附圖簡述
圖l表示應用螢光檢測法檢測鞘磷脂酶，每個反應物包括所示量 的特定檢測緩衝液中的細菌鞘砩脂酶。反應物在37t:孵育一小時，用 螢光微板讀取器測定螢光。在530nm波長下激發，並在5卯nm波長 下檢測焚光。
本發明的間接螢光分析方法是基於以下順序的反應。
在存在於糞便或其它生物學流體中的鹼性SMase的作用下，鞘磷 脂水解為神經醯胺和磷酸膽鹼，在鹼性磷酸酶的作用下，磷酸膽鹼水解產生膽鹼。在膽鹼氣化酶的存在下，膽鹼生成過氣化氫(H202). 在辣根過氧化物酶的存在下，過氧化氫與10-乙醯基-3，7-二羥基吩
噁嗪(H202的靈敏的螢光探針)(以下稱為"Amplex Red試劑，，)發生 反應，產生高螢光物質試卣靈。螢光是用螢光計數微板螢光儀，在 530-560nm下激發，並在590nm下檢測的。根據前述的反應順序和螢光檢測方法，本發明的用於檢測糞便中 的鹼性SMase的檢測方法包括以下步驟。然而，對於本領域普通技術 人員來說，很明顯本方法可以容易地進行一些常規改變而應用於生物 學流體，如膽汁。1) 收集患者的糞便樣品並乾燥；2) 稱取大約3-4克乾燥樣品，並懸浮於20ml包含0.25M蔗糖、 0.15M的KC1、 50mM的KH2P04的勻漿緩衝液中，pH值7.4;3) 在+4。C, 4000rpm下離心樣品60分鐘；4) 回收上清液，再在+4。C， 4000rpm下離心15分鐘；5) 應用Pierce Protein Assay,使用牛血清白蛋白作標準參照，測 定上清液中的蛋白含量，對於每個樣品，所用的蛋白濃度在"mg/ml -40mg/ml之間，每孑L吸入25jil樣品；6) 每25jil樣品加入65nl包含50mM Tris/HCl、 2 mM EDTA、 0.15M NaCl的pH值9.0的緩沖液和10^1 29fiM的鞘磷脂，並加入3mM 濃度的膽鹽(TC、 TDC、 GC、 GCDC);7) 在37。C下孵育1小時；8) 吸量每種標準參照物各lOOjil和10fU鞘磷脂(29jiM )，如樣品 一樣在37。C下孵育1小時；9) 1小時後，加入lOOfil包含50 mM Tris/HCl(pH7.4)、 10mM |3畫 磷酸甘油、750fiM ATP、 5 mM EDTA、 5 mM EGTA、 IOOjiM的Amplex Red、 8U/ml鹼性磷酸酶、0.2U/ml膽鹼氧化酶、2U/ml辣根過氧化酶的反應緩衝液；10) 避光在37。C下孵育1小時或更長；11) 使用範圍在530 - 560nm的激發光源和螢光微板讀取器在
590nm檢測發射螢光；12)對每一個值，通過減去非鞘磷脂酶對照值來校正背景螢光。本發明還涉及根據前述的檢測方法用於檢測患者糞便或生物學流 體中的鹼性鞘磷脂酶的檢測試劑盒，其中包含分別含有以下試劑樣品 的測試管a) 將被存在於糞便或生物學流體中的鹼性鞘磷脂酶水解以生成 磷酸膽鹼的神經鞘磷脂；b) 用於催化磷酸膽鹼水解成膽鹼的鹼性磷酸酶；c) 用於氧化膽鹼至過氧化氫的膽鹼氧化酶；d) 用於輔助過氧化氫反應的辣根過氧化物酶；e) Ampler Red試劑(10-乙醯基-3,7-二羥基吩噍嗪)，用於得到熒 光化合物試卣靈，其螢光為存在於糞便或生物學流體中的鹼性SMase 的標i己；以及f) 用作標準濃度的凍幹的細菌鞘磷脂酶。為了本發明的分析方法的適當應用，除上述的試劑盒成分外，以 下的材料和設備也是需要的蔗糖；氯化鉀(KC1); 磷酸二氫鉀(KH2P04); Trizma base^ EDTA; 氯化鈉；牛磺膽酸(TC);牛磺脫氧膽酸(Taurodeoxycholate) ( TDC ); 甘氨膽酸(GC);
羥鵝脫氧膽酸(GCDC);P-磷酸甘油；ATP 二鈉鹽；EGTA;BCA Protein Assay Reagent;牛血清白蛋白；冷凍離心才幾；能夠在550-562nm下檢測的微板讀數器，和螢光計數微板螢光儀。 為完成SMase活性的定量，將進行以下的檢測。 標準曲線的製作試劑盒中有標準的SMase製品，該製品由含有在pH9起作用的 SMase的細菌提取物組成。進行以下操作。製作SMase校準曲線稀釋標準濃縮液，得到一系列稀釋液。用lml檢測緩衝液(pH值9.0)重構SMase標準液，得到96mU/ml 的貯備溶液。吸量0.500ml的檢測緩沖液於每管中。應用貯備溶液得到一系列 稀釋液。下一次轉移前將每管完全混和。未稀釋的標準液作高濃度標 準(96mU/ml)，標準曲線包括以下濃度值(mU/ml): 96-48-24-12-6-3。 緩沖液作為0濃度標準(0 mU/ml )。典型標準曲線在附

圖1中的標準曲線僅用作示範。對每一個測試樣品都要製作
標準曲線。計算結果求算每一標準品和樣品的兩次讀數的平均值，並減去零濃度標準 的螢光平均值。繪製標準品的焚光對標準品活性(mU/ml)的最佳曲線。為了確 定每一樣品的SMase活性，首先找到y-軸上的螢光值，再水平延伸至 標準曲線上。在交點處垂直延伸至x-軸，可讀取相應的SMase活性。所述的方法可以體外檢測SMase的活性；已經發展了用於檢測有 機樣品中的鹼性SMase的方法。為特異性檢測鹼性SMase，該方法應用檢測酸性和中性SMase活 性的條件。實際為-勻漿緩衝液處於中性pH值，但沒有蛋白酶和磷酸酶抑制劑從 而可以排除中性SMase，因為後者對蛋白酶和磷酸酶的活性敏感並因 此被這些酶抑制；-在勻漿緩沖液中沒有MgCl2，從而阻斷了 Mg依賴性中性 SMase的活性；-反應緩衝液包含P-磷酸甘油和ATP以防止酸性SMase在中性 pH值具有過多活性，在該緩沖液中，EDTA和EGTA均以高濃度存 在，以抑制中性SMase。
權利要求
1.一種檢測患者糞便中的鹼性鞘磷脂酶的方法，包括以下步驟1)收集患者的糞便樣品並使其乾燥；2)稱取大約3-4克乾燥樣品，並懸浮於20ml包含0.25M蔗糖、0.15M的KCl、50mM的KH2PO4並且pH值為7.4的勻漿緩衝液中；3)在+4℃，4000rpm下離心樣品60分鐘；4)回收上清液，再在+4℃，4000rpm下離心15分鐘；5)應用Pierce Protein Assay測定上清液中的蛋白含量，使用牛血清白蛋白作為標準參照，對於每個樣品，所用的蛋白濃度在32mg/ml-40mg/ml之間，吸取25μl各樣品至孔中；6)向各25μl樣品加入65μl包含50mM Tris/HCl、2mM EDTA、0.15M NaCl的pH值為9.0的檢測緩衝液和10μl 29μM的鞘磷脂，並向檢測緩衝液中加入3mM濃度的膽鹽(TC、TDC、GC、GCDC)；7)在37℃下孵育1小時；8)吸取每種冷凍乾燥的細菌鞘磷脂酶標準參照100μl和10μl神經鞘磷脂(29μM)，與樣品一樣在37℃下孵育1小時；9)1小時後，加入100μl包含50mM的pH值為7.4的Tris/HCl、10mM β-磷酸甘油、750μM ATP、5mM EDTA、5mM EGTA、100μM的Amplex Red、8U/ml鹼性磷酸酶、0.2U/ml膽鹼氧化酶、2U/ml辣根過氧化酶的反應緩衝液；10)在避光條件下於37℃孵育反應物1小時或更長時間；11)用螢光微板讀取器檢測螢光，其中激發波長為530-560nm，並在590nm處檢測發射光；12)對每一個值，通過減去非鞘磷脂酶對照的值來對背景螢光進行校正。
2. 權利要求l的方法，其應用於生物學流體。
3. —種檢測患者糞便或生物學流體中的鹼性鞘磷脂酶的試劑盒， 其中含有分別包含以下試劑樣品的檢測管 a) 將被存在於糞便或生物學流體中的鹼性鞘磷脂酶水解以生成 磷酸膽鹼的鞘磷脂；b) 用於催化磷酸膽鹼水解成膽鹼的鹼性磷酸酶；c) 用於氧化膽鹼至過氧化氫的膽鹼氧化酶；d) 用於輔助過氧化氫反應的辣根過氧化物酶；e) Ampler Red試劑(10-乙醯基-3，7-二羥基吩鳴"秦)，用於得到熒 光化合物試卣靈，其焚光為存在於糞便或生物學流體中的鹼性SMase 的才示i己；以及f) 用作標準濃;l的凍幹的細菌鞘磷脂酶。
4. 一種檢測來自患者的生物學材料中的鹼性鞘磷脂酶的方法，包 括以下步驟1) 收集生物學材料樣品；2) 懸浮樣品於包含0.24-0.26M蔗糖、0.14 - 0.16M的KCl、 45 -55mM的KH2P04的勻漿緩沖液中，該緩沖液的pH值調節至約7.4;3) 至少離心樣品一次，回收上清液；4) 測量上清液的蛋白含量；5) 向上清液樣品中加入包含44- 55mM Tris/HCl、 1.9 - 2.2 mM EDTA、 0.14-0.16M NaCl並且pH值為8.9-9.1的檢測緩衝液和 28-30nM的鞘磷脂以及含有濃度為2.9-3.1mM的膽鹽(TC、 TDC、 GC、 GCDC)的檢測緩衝液；6) 在大約37。C下孵育檢測混和物大約1小時；7) 步驟6)的樣品與28-31jiM的鞘磷脂混和，在約WC下孵育 約1小時；8) 加入包含pH7.3-7.5的45- 55 mM Tris/HCl、 9一llmM卩-磷酸甘油、745- 755nMATP、 4 - 6 mM EDTA、 4 - 6 mM EGTA、 95 -105jiM的Amplex Red試劑、7 - 9U/ml鹼性磷酸酶、0.1 - 0.3U/ml 膽鹼氧化酶和1.5 - 2.5U/ml辣根過氧化酶的反應緩衝液；9) 在避光條件下於約37。C下孵育所述反應混和物至少1小時；10) 檢測螢光，使用530-560nm的激發光，並在約590n'm下檢測發射光。
5. 權利要求4的方法，其中對每一個樣品，通過減去非鞘磷脂酶 對照的值使螢光讀數對背景螢光進行校正。
6. 權利要求4或5中的方法，其中蛋白含量是通過Pierce Protein Assay檢測的。
7. —種檢測患者生物學樣品中鹼性鞘磷脂酶的試劑盒，其中包括a) 鞘磷脂；b) 鹼性磷酸酶；c) 膽鹼氧化酶；d) 辣根過氧化物酶；e) Ampler Red試劑；f) 凍幹的細菌鞘礴脂酶。
8. —種檢測鹼性鞘磷脂酶的方法，其基本如此處參照附圖的描述。
9. 一種檢測鹼性鞘磷脂酶的試劑盒，其基本如此處參照附圖的描述，
全文摘要
本發明披露了一種螢光分析方法及用於該方法的檢測試劑盒，該方法用於檢測需要此種檢測的患者糞便中的鹼性鞘磷脂酶(SMase)，因為鹼性SMase是重症病理狀態，如結腸癌，的標記物。
文檔編號C12Q1/44GK101126716SQ200710147169
公開日2008年2月20日 申請日期2002年12月19日 優先權日2001年12月21日
發明者西蒙 C·德 申請人:艾蒂爾藥物有限公司