在腫瘤中差異表達的基因產物及其用途的製作方法

2023-04-28 18:54:16 2

專利名稱：在腫瘤中差異表達的基因產物及其用途的製作方法
儘管有經典治療方法的充分使用，癌症仍然是導致死亡的原因之一。更新的治療概念的目標在於通過使用重組腫瘤疫苗和其它特異性方法如抗體療法將患者自身的免疫系統納入治療整體概念中。這種策略的成功先決條件是患者的免疫系統識別腫瘤特異性抗原或腫瘤相關抗原或表位，所述患者的免疫系統的效應物作用將被幹預性地增強。腫瘤細胞在生物學上具有與其非惡性的起源細胞本質上的差異。這些差異是由腫瘤發展過程中所獲得的遺傳改變而引起的，此外也導致在癌細胞中形成質和量上改變的分子結構。被患有腫瘤的宿主的特異性免疫系統識別的該類腫瘤相關結構是指腫瘤相關抗原。腫瘤相關抗原的特異性識別包括細胞機制和體液機制，所述機制是兩種功能上互聯的單位CD4+和CD8+T淋巴細胞分別識別在MHC(主要組織相容性複合物＝組織相容性抗原)II類或I類分子上呈遞的加工的抗原，而B淋巴細胞產生直接與未加工的抗原結合的循環抗體分子。腫瘤相關抗原可能的臨床治療上的重要性由如下事實產生，即免疫系統對癌細胞上抗原的識別導致細胞毒性效應子機制的開始，並能在存在輔助T細胞的情況下殺滅癌細胞(Pardoll，Nat.Med.4525-31，1998)。因此，腫瘤免疫學的中心目標是在分子上闡明這些結構。這些抗原的分子特性在很長時間裡都是難以解釋的。只有在適宜的克隆技術發展之後，系統性從腫瘤cDNA表達文庫中篩選腫瘤相關抗原才成為可能，其中通過分析細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的靶結構(van der Bruggen et al.，Science 2541643-7，1991)或通過使用循環自身抗體(Sahin et al.，Curr.opin.Immunol.9709-16，1997)作為探針的方法進行篩選。為實現該目標，從新鮮腫瘤組織中製備cDNA表達文庫並在適宜的系統中重組表達為蛋白質。將分離自患者的免疫效應物即具有腫瘤特異性溶解模式的CTL克隆或循環自身抗體用於克隆各抗原。
近年來，通過這些方法已經在多種腫瘤形成中闡明了多種抗原。此處，癌/睪丸抗原(CTA)類型具有很高的意義。CTA和編碼其的基因(癌/睪丸基因或CTG)由其特徵性表達模式而得以闡明[Tureci et al，MolMed Today.3342-9，1997]。在除睪丸和生殖細胞外的正常組織中未發現它們，但它們在系列人類惡性腫瘤中表達，而且它們不具有腫瘤類型特異性，但在來源非常不同的腫瘤體中具有不同的頻率(Chen Old，Cancer J.Sci.Am.516-7，1999)。在健康對照中也沒有發現抗CTA的血清反應，而僅在腫瘤患者發現所述血清反應。特別是由於其組織分布，該類抗原對於免疫治療方案具有特別的價值並已在目前的臨床患者研究中進行檢測(Marchand et al.，Int.J.Cancer 80219-30，1999；Knuth et al.，Cancer Chemother.Pharmacol.46S 46-51，2000)。
然而，用於鑑定抗原的上述經典方法使用來自通常已患有晚期癌的患者的免疫效應物(循環自身抗體或CTL克隆)作為探針。一系列數據顯示出腫瘤能導致例如T細胞的耐受和無反應性，那些能導致有效免疫識別的特異性就在疾病病程期間從免疫效應物庫中丟失。目前的患者研究尚未給出關於迄今發現和使用的腫瘤相關抗原的真實作用的任何可靠證據。因此，不能排除引起自體免疫應答的蛋白質是錯誤的靶結構。
本發明的目的是提供用於癌症診斷和治療的靶結構。
根據本發明，該目的通過權利要求的主題內容而實現。
根據本發明，實施用於鑑定和提供與腫瘤相關性表達的抗原和編碼其的核酸的策略。該策略基於如下事實，即事實上通常在成體組織中沉默的睪丸和由此生殖細胞特異性基因在腫瘤細胞中以異位和禁止模式被再次活化。首先，數據挖掘(Datamining)給出與所有已知睪丸特異性基因的儘可能完整的列表，隨後其可通過使用特異性RT-PCR的表達分析而評估其在腫瘤中的異常活化。數據挖掘是一種鑑定腫瘤相關基因的已知方法。然而，在傳統策略中，通常從腫瘤組織文庫中電子去除正常組織文庫的轉錄子，其中假定剩餘的基因是腫瘤特異性的(Schmitt etal.，Nucleic Acids Res.274251-60，1999；Vasmatzis et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.95300-4，1998.Scheurle et al.，Cancer Res.604037-43，2000)。
然而，本發明的概念(其已被證明更為成功)是基於將數據挖掘用於電子提取全部睪丸特異性基因和然後評估所述基因在腫瘤中的異位表達。
因此本發明一個方面涉及鑑定在腫瘤中差異表達的基因的策略。所述策略將公開序列文庫的數據挖掘(「in silico」)與隨後評估性實驗室試驗(「wet bench」)研究進行聯合。
根據本發明，基於兩個不同生物信息學文本的聯合策略能夠鑑定癌/睪丸(CT)基因類型的新成員。這些迄今已經被分類為具有純粹的睪丸特異性、生殖細胞特異性或精子特異性。這些基因在腫瘤細胞中被異常激活的發現使其被賦予了具有功能性含意的基本上新的特性。根據本發明，這些腫瘤相關基因及其和由其編碼的基因產物不依賴免疫原性作用而被鑑定和提供。
根據本發明鑑定的腫瘤相關抗原含有由一種核酸編碼的胺基酸序列，所述核酸選自(a)包括選自SEQ ID NO1-5、19-21、29、31-33、37、39、40、54-57、62、63、70、74、85-88、其部分或其衍生物的核酸序列的核酸，(b)在嚴謹條件下與(a)的核酸雜交的核酸，(c)關於(a)或(b)的核酸的簡併核酸，和(d)與(a)、(b)或(c)的核酸互補的核酸。在一個優選的實施方案中，根據本發明鑑定的腫瘤相關抗原含有由選自SEQ ID NO1-5、19-21、29、31-33、37、39、40、54-57、62、63、70、74、85-88的核酸所編碼的胺基酸序列。在另一優選的實施方案中，根據本發明鑑定的腫瘤相關抗原包括選自SEQ ID NO6-13、14-18、22-24、30、34-36、38、41、58-61、64、65、71、75、80-84、89-100、其部分或其衍生物的胺基酸序列。
本發明一般涉及將根據本發明鑑定的腫瘤相關抗原或其部分、其編碼核酸或定向抗所述編碼核酸的核酸或者定向抗根據本發明鑑定的腫瘤相關抗原或其部分的抗體用於治療和診斷的用途。該用途可涉及這些抗原、功能性片段、核酸、抗體等中的單個以及多個的組合，在一個實施方案中，還聯合其它用於診斷、治療和過程控制的腫瘤相關基因和抗原。
治療和/或診斷所針對的優選疾病是其中選擇性表達或異常表達一個或多個根據本發明鑑定的腫瘤相關抗原的疾病。
本發明還涉及與腫瘤細胞相關性表達的並由已知基因的改變性剪接(剪接變體)或由使用選擇性開放閱讀框而改變的翻譯來製備的核酸和基因產物。所述核酸包括根據序列表(SEQ ID NO2-5，20，21，31-33，54-57，85-88)的序列。而且，所述基因產物包括根據序列表(SEQ ID NO7-13、23、24、34-36、58-61、89-100)的序列。本發明的剪接變體可根據本發明用作腫瘤性疾病的診斷靶位和治療靶位。
可使用非常不同的機理製備剪接變體，例如-使用可變轉錄起始位點-使用附加外顯子-完全或不完全剪切掉單個或多個外顯子，-通過突變(缺失或新供體/受體序列的生成)改變的剪接調節序列，-內含子序列的不完全去除。
基因的改變的剪接會導致改變的轉錄本序列(剪接變體)。剪接變體的改變的序列區的翻譯會導致改變的蛋白質，該蛋白質在結構和功能上與原始蛋白質明顯不同。腫瘤相關剪接變體可生成腫瘤相關轉錄本和腫瘤相關蛋白質/抗原。這些可用作檢測腫瘤細胞和腫瘤治療性靶向的分子標記物。腫瘤細胞的檢測，例如在血液、血清、骨髓、唾液、支氣管灌洗液、身體分泌物和活檢組織中，可根據本發明例如在核酸提取後通過採用剪接變體特異性寡核苷酸的PCR擴增進行實施。根據本發明，所有序列依賴性檢測系統均適用於檢測。除PCR外，這些檢測系統是例如基因晶片/微陣列系統，Northern印跡、RNase保護測定(RDA)等。所有檢測系統的相同之處在於檢測基於與至少一個剪接變體特異性核酸序列的特異性雜交。然而，還可根據本發明通過識別由所述剪接變體編碼的特異性表位的抗體檢測腫瘤細胞。所述抗體可通過用具有對所述剪接變體特異性的肽進行免疫來製備。表位與優選在健康細胞中形成的基因產物的變體明顯不同的胺基酸特別適用於免疫。此處用抗體對腫瘤細胞的檢測可在分離自患者的樣品上或用靜脈內施用的抗體進行成像而進行實施。除可用於診斷外，含有新或改變的表位的剪接變體是免疫治療的令人感興趣的靶位。本發明的表位可用於靶向治療上有效的單克隆抗體或T淋巴細胞。在被動免疫治療中，在此繼承性地轉移識別剪接變體特異性表位的抗體或T淋巴細胞。如在其它抗原的情況下，還可通過採用標準技術(動物免疫、用於分離重組抗體的淘洗策略)並使用包括這些表位的多肽來製備抗體。或者，可將編碼包含所述表位的寡肽或多肽的核酸用於免疫。用於體外或體內產生表位特異性T淋巴細胞的多種技術是已知的並已經詳細描述於例如(Kessler JH，et al.2001，Sahin et al.，1997)中，並同樣是基於使用包含剪接變體特異性表位的寡肽或多肽或者編碼所述寡肽或多肽的核酸。包含剪接變體特異性表位的寡肽或多肽或者編碼所述多肽的核酸還可用作活性免疫治療(疫苗接種，疫苗治療)中的藥物有效物質。
一方面，本發明涉及這樣的藥物組合物，其含有識別根據本發明鑑定的腫瘤相關抗原並優選地對於表達或異常表達根據本發明鑑定的腫瘤相關抗原的細胞具有選擇性的試劑。在特定實施方案中，所述試劑可誘導細胞死亡、降低細胞生長、破壞細胞膜或分泌細胞因子，並優選具有腫瘤-抑制活性。在一個實施方案中，所述試劑是選擇性與編碼腫瘤相關抗原的核酸雜交的反義核酸。在另一個實施方案中，所述試劑是與腫瘤相關抗原選擇性結合的抗體，特別是與腫瘤相關抗原選擇性結合的補體激活的抗體。在另一個實施方案中，所述試劑包括多個試劑，其中每一試劑選擇性識別不同的腫瘤相關抗原，所述腫瘤相關抗原中至少一種是根據本發明鑑定的腫瘤相關抗原。識別無須直接與抑制所述抗原的活性或表達相伴隨。在本發明的該方面中，選擇性限於腫瘤的抗原優選作為用於恢復該特異性位點上的效應機理的標記物。在一個優選的實施方案中，所述試劑是識別HLA的上所述抗原並溶解用此方法標記的細胞的細胞毒性T淋巴細胞。在另一個實施方案中，所述試劑是與腫瘤相關抗原選擇性結合併由此恢復對所述細胞的天然或人工效應機理的抗體。在另一個實施方案中，所述試劑是能增強其它特異性識別所述抗原的細胞的效應物作用的T輔助淋巴細胞。
一方面，本發明涉及包含能夠抑制根據本發明鑑定的腫瘤相關抗原的表達或活性的試劑的藥物組合物。在一個優選的實施方案中，所述試劑是與編碼腫瘤相關抗原的核酸選擇性雜交的反義核酸。在另一個實施方案中，所述試劑是與腫瘤相關抗原選擇性結合的抗體。在另一個實施方案中，所述試劑包括多個試劑，其中每一試劑選擇性抑制不同的腫瘤相關抗原，所述腫瘤相關抗原中至少一種是根據本發明鑑定的腫瘤相關抗原。
本發明還涉及含有這樣的試劑的藥物組合物，即所述試劑在使用時能選擇性增加HLA分子和來自根據本發明鑑定的腫瘤相關抗原的肽表位間的複合物的量。在一個實施方案中，所述試劑包括一個或多個組分，該組分選自(i)腫瘤相關抗原或其部分，(ii)編碼所述腫瘤相關抗原或其部分的核酸，(iii)表達所述腫瘤相關抗原或其部分的宿主細胞，和(iv)分離得到的來自所述腫瘤相關抗原的肽表位和MHC分子間的複合物。在一個實施方案中，所述試劑包括多個試劑，其中每一試劑選擇性增加MHC分子和不同腫瘤相關抗原的肽表位間的複合物的量，這些腫瘤相關抗原中至少一種是根據本發明鑑定的腫瘤相關抗原。
本發明還涉及包括一個或多個組分的藥物組合物，所述組分選自(i)根據本發明鑑定的腫瘤相關抗原或其部分，(ii)編碼根據本發明鑑定的腫瘤相關抗原或其部分的核酸，(iii)與根據本發明鑑定的腫瘤相關抗原或其部分結合的抗體，(iv)與編碼根據本發明鑑定的腫瘤相關抗原的核酸特異性雜交的反義核酸，(v)表達根據本發明鑑定的腫瘤相關抗原或其部分的宿主細胞，和(vi)分離得到的根據本發明鑑定的腫瘤相關抗原或其部分與HLA分子間的複合物。
編碼根據本發明鑑定的腫瘤相關抗原或其部分的核酸在藥物組合物中可存在表達載體中並功能性地連於啟動子。
存在於本發明的藥物組合物中的宿主細胞可分泌腫瘤相關抗原或其部分，在表面表達腫瘤相關抗原，或其部分或者還可表達與所述腫瘤相關抗原或其部分結合的HLA分子。在一個實施方案中，宿主細胞內源性表達HLA分子。在另一個實施方案中，宿主細胞以重組方式表達HLA分子和/或腫瘤相關抗原或其部分。所述宿主細胞優選是非增殖性的。在一個優選的實施方案中，宿主細胞是抗原遞呈細胞，特別是樹突細胞、單核細胞或巨噬細胞。
存在於本發明的藥物組合物中的抗體可以是單克隆抗體。在其它實施方案中，抗體是嵌合抗體或人源化抗體，天然抗體的片段或合成抗體，其均可由組合技術製備。所述抗體可與治療上或診斷上有效的試劑偶聯。
存在於本發明的藥物組合物中的反義核酸可含有6-50、特別是10-30、15-30和20-30個連續核苷酸的序列，這些核苷酸來自編碼根據本發明鑑定的腫瘤相關抗原的核酸在其它實施方案中，由本發明的藥物組合物或直接提供或經由核酸表達提供的腫瘤相關抗原或其部分與細胞表面上的MHC分子結合，所述結合優選地導致細胞溶解反應和/或誘導細胞因子釋放。
本發明的藥物組合物可包括藥物學上可接受的載體和/或佐劑。佐劑可選自皂甙、GM-CSF、CpG核苷酸、RNA、細胞因子或趨化因子。本發明的藥物組合物優選用於治療特徵是選擇性表達或異常表達腫瘤相關抗原的疾病。在一個優選的實施方案中，所述疾病是癌症。
本發明還涉及治療或診斷疾病的方法，所述疾病的特徵在於表達或異常表達一個或多個腫瘤相關抗原。在一個實施方案中，所述治療包括施用本發明的藥物組合物。
一方面，本發明涉及診斷特徵是表達或異常表達根據本發明鑑定的腫瘤相關抗原的疾病的方法。該方法包括(i)檢測編碼腫瘤相關抗原的核酸或其部分，和/或(ii)檢測所述腫瘤相關抗原或其部分，和/或(iii)檢測針對腫瘤相關抗原或其部分的抗體，和/或(iv)在分離自患者的生物樣品中檢測具有對所述腫瘤相關抗原或其部分的特異性的細胞毒性T淋巴細胞或輔助T淋巴細胞。在特定實施方案中，檢測包括(i)將生物樣品與試劑接觸，所述試劑特異性地與所述編碼腫瘤相關抗原的核酸或其部分、與所述腫瘤相關抗原或其部分、與所述抗體或者與具有對所述腫瘤相關抗原或其部分特異性的細胞毒性T淋巴細胞或輔助T淋巴細胞結合，和(ii)檢測所述試劑和所述核酸或其部分、所述腫瘤相關抗原或其部分、所述抗體或者所述細胞毒性T淋巴細胞或輔助T淋巴細胞間的複合物的形成。在一個實施方案中，所述疾病的特徵在於表達或異常表達多個不同的腫瘤相關抗原，且檢測包括檢測多個編碼所述多個不同的腫瘤相關抗原或其部分的核酸，檢測多個不同的腫瘤相關抗原或其部分，檢測多個與所述多個不同的腫瘤相關抗原或其部分結合的抗體，或者檢測多個具有對所述多個不同腫瘤相關抗原特異性的細胞毒性T淋巴細胞或輔助T淋巴細胞。在另一個實施方案中，將分離自患者的生物樣品與可比較的正常生物樣品進行比較。
另一方面，本發明涉及一種確定特徵是表達或異常表達根據本發明鑑定的腫瘤相關抗原的疾病的消退、進行或發病的方法，所述方法包括監測來自患有所述疾病或疑為患有所述疾病的患者的樣品中選自下列的一個或多個參數(i)編碼腫瘤相關抗原的核酸或其部分的量，(ii)腫瘤相關抗原或其部分的量，(iii)與腫瘤相關抗原或其部分結合的抗體的量，和(iv)具有對所述腫瘤相關抗原或其部分和MHC分子間複合物特異性的細胞毒性T細胞或輔助T細胞的量。所述方法優選地包括在第一個樣品中於第一時間點和在另一樣品中於第二時間點測定所述參數，其中通過比較所述兩個樣品確定疾病的進程。在特定實施方案中，所述疾病的特徵在於表達或異常表達多個不同的腫瘤相關抗原且監測包括監測(i)編碼所述多個不同腫瘤相關抗原的多個核酸或其部分的量，和/或(ii)所述多個不同腫瘤相關抗原或其部分的量，和/或(iii)多個與所述多個不同腫瘤相關抗原或其部分結合的抗體的量，和/或(iv)多個具有對所述多個不同的腫瘤相關抗原或其部分和MHC分子間的複合物特異性的細胞毒性T細胞或輔助T細胞的量。
根據本發明，檢測核酸或其部分或者監測核酸或其部分的量可使用與所述核酸或其所述部分特異性雜交的多核苷酸探針來實施，或者通過選擇性擴增所述核酸或其所述部分來實施。在一個實施方案中，所述多核苷酸探針含有來自所述核酸的6-50特別是10-30、15-30和20-30個連續核苷酸的序列。
在特定實施方案中，要檢測的所述腫瘤相關抗原或其部分存在於細胞內或存在於細胞表面上。根據本發明，可以使用與所述腫瘤相關抗原或其部分特異性結合的抗體實施檢測腫瘤相關抗原或其部分或者監測腫瘤相關抗原或其部分的量。
在其它實施方案中，要檢測的所述腫瘤相關抗原或其部分存在於與MHC分子特別是HLA分子的複合物中。
根據本發明，可以使用與所述抗體特異性結合的蛋白質或肽實施檢測抗體或監測抗體的量。
根據本發明，細胞毒性T細胞或輔助T細胞的檢測或監測具有對抗原或其部分和MHC分子間複合物特異性的細胞毒性T細胞或輔助T細胞的量可使用呈遞所述抗原或其部分和MHC分子間複合物的細胞來實施。
用於檢測或監測的多核苷酸探針、抗體、蛋白質或肽或者細胞優選用可檢測的方式進行標記。在特定實施方案中，可檢測的標記物為放射性標記物或酶標記物。T淋巴細胞還可以通過檢測其增殖、其細胞因子生成和其由MHC和腫瘤相關抗原或其部分的複合物的特異性刺激所觸發的細胞毒性活性而進行檢測。T淋巴細胞的檢測還可以通過重組MHC分子或多個MHC分子的複合物來進行，這些MHC分子加載了來自一個或多個腫瘤相關抗原的各個免疫原性片段，並通過與特異性T細胞受體的接觸而鑑定特異性T淋巴細胞。
另一方面，本發明涉及治療、診斷或監測疾病的方法，所述疾病的特徵是表達或異常表達根據本發明鑑定的腫瘤相關抗原，所述方法包括施用與所述腫瘤相關抗原或其部分結合併與治療劑或診斷劑偶聯的抗體。所述抗體可以是單克隆抗體。在其它實施方案中，所述抗體是嵌合抗體或人源化抗體或天然抗體的片段。
本發明還涉及治療患有特徵是表達或異常表達根據本發明鑑定的腫瘤相關抗原的疾病的患者的方法，所述方法包括(i)從所述患者中分離含有免疫反應細胞的樣品，(ii)在適於生成抗所述腫瘤相關抗原或其部分的細胞毒性T細胞條件下將所述樣品與表達所述腫瘤相關抗原或其部分的宿主細胞接觸，和(iii)將細胞毒性T細胞以適於溶解表達腫瘤相關抗原或其部分的細胞的量導入患者。本發明同樣涉及克隆抗所述腫瘤相關抗原的細胞毒性T細胞的T細胞受體。所述受體可轉移至其它T細胞，該T細胞由此獲得所需特異性，並如可在(iii)時導入患者。
在一個實施方案中，所述宿主細胞內源性表達HLA分子。在另一個實施方案中，所述宿主細胞重組性表達HLA分子和/或所述腫瘤相關抗原或其部分。所述宿主細胞優選具有非增殖性。在一個優選的實施方案中，宿主細胞是抗原遞呈細胞，特別是樹突細胞、單核細胞或巨噬細胞。
另一方面，本發明涉及治療患有特徵是表達或異常表達腫瘤相關抗原的疾病的患者的方法，所述方法包括(i)鑑定編碼根據本發明鑑定的腫瘤相關抗原且由與所述疾病相關的細胞表達的核酸，(ii)用所述核酸或其部分轉染宿主細胞，(iii)培養轉染的宿主細胞從而表達所述核酸(其在獲得高轉染率時為非必須的)，和(iv)將所述宿主細胞或其提取物以適於提高對與所述疾病相關的患者細胞的免疫反應的量導入所述患者。該方法還包括鑑定呈遞所述腫瘤相關抗原或其部分的MHC分子，此處所述宿主細胞表達經鑑定的MHC分子並呈遞所述腫瘤相關抗原或其部分。所述免疫反應可包括B細胞反應或T細胞反應。而且，T細胞反應可包括生成具有與呈遞腫瘤相關抗原或其部分的所述宿主細胞或表達所述腫瘤相關抗原或其部分的患者細胞的特異性的細胞毒性T細胞和/或輔助T細胞。
本發明還涉及治療特徵是表達或異常表達根據本發明鑑定的腫瘤相關抗原的疾病的方法，所述方法包括(i)鑑定來自表達異常量腫瘤相關抗原的患者的細胞，(ii)分離所述細胞的樣品，(iii)培養所述細胞，和(iv)將所述細胞以適於引發對所述細胞的免疫反應的量導入患者。
優選地，根據本發明所使用的宿主細胞具有非增殖性或被賦予非增殖性。特徵是表達或異常表達腫瘤相關抗原的疾病特別是癌症。
本發明還涉及一種核酸，所述核酸選自(a)包括選自SEQ ID NO2-5、20-21、31-33、39、54-57、62、63、85-88、其部分或其衍生物的核酸序列的核酸，(b)在嚴謹條件下與(a)的核酸雜交的核酸，(c)(a)或(b)的核酸的簡併核酸，和(d)與(a)、(b)或(c)的核酸互補的核酸。本發明還涉及一種核酸，所述核酸編碼包括選自SEQID NO7-13、14-18、23-24、34-36、58-61、64、65、89-100、其部分或其衍生物的胺基酸序列的蛋白質或多肽。
另一方面，本發明涉及本發明的核酸的啟動子序列。這些序列可優選在表達載體中功能性地連接於另外的基因，由此確保在適宜細胞中選擇性表達所述基因。
另一方面，本發明涉及包括本發明的核酸的重組核酸分子，特別是DNA或RNA分子。
本發明還涉及含有本發明的核酸或包括本發明的核酸的重組核酸分子的宿主細胞。
所述宿主細胞還可以含有編碼HLA分子的核酸。在一個實施方案中，所述宿主細胞內源性表達HLA分子。在另一個實施方案中，所述宿主細胞重組表達HLA分子和/或本發明的核酸或其部分。優選地，所述宿主細胞具有非增殖性。在一個優選的實施方案中，所述宿主細胞是抗原遞呈細胞，特別是樹突細胞、單核細胞或巨噬細胞。
在另一個實施方案中，本發明涉及寡核苷酸，該寡核苷酸與根據本發明鑑定的核酸雜交，並可用作基因探針或作為「反義」分子。以寡核苷酸引物或感受態樣品形式存在的核酸分子與根據本發明鑑定的核酸或其部分雜交，其可用於測定與所述根據本發明鑑定的核酸同源的核酸。PCR擴增、Southern和Northern雜交可用於測定同源核酸。雜交可在低嚴謹條件、更優選地在嚴謹條件和最優選地在高嚴謹條件下實施。根據本發明，術語「嚴謹條件」是指能夠允許多核苷酸間特異性雜交的條件。
另一方面，本發明涉及由核酸編碼的蛋白質或多肽，所述核酸選自(a)包括選自SEQ ID NO2-5、20-21、31-33、39、54-57、62、63、85-88、其部分或其衍生物的核酸序列的核酸，(b)在嚴謹條件下與(a)的核酸雜交的核酸，(c)(a)或(b)的核酸的簡併核酸，和(d)與(a)、(b)或(c)的核酸互補的核酸。在一個優選的實施方案中，本發明涉及包括選自SEQ ID NO7-13、14-18、23-24、34-36、58-61、64、65、89-100、其部分或其衍生物的胺基酸序列的蛋白質或多肽。
另一方面，本發明涉及根據本發明鑑定的腫瘤相關抗原的免疫原性片段。所述片段優選與人HLA受體或與人抗體結合。本發明的片段優選包括至少6特別是至少8、至少10、至少12、至少15、至少20、至少30或至少50個胺基酸的序列。
另一方面，本發明涉及與根據本發明鑑定的腫瘤相關抗原或其部分結合的試劑。在一個優選的實施方案中，所述試劑是抗體。在其它實施方案中，所述抗體是嵌合抗體、人源化抗體或用組合技術製備的抗體或抗體片段。而且，本發明涉及與(i)根據本發明鑑定的腫瘤相關抗原或其部分和(ii)結合根據本發明鑑定的腫瘤相關抗原或其部分的MHC分子所組成的複合物選擇性結合的抗體，所述抗體不單獨與(i)或(ii)結合。本發明的抗體可以是單克隆抗體。在其它實施方案中，所述抗體是嵌合抗體或人源化抗體或天然抗體的片段。
本發明還涉及一種與根據本發明鑑定的腫瘤相關抗原或者其部分結合的本發明的試劑或者本發明的抗體和治療劑或診斷劑之間的偶聯物。在一個實施方案中，所述治療劑或診斷劑是毒素。
另一方面，本發明涉及檢測根據本發明鑑定的腫瘤相關抗原的表達或異常表達的試劑盒，所述試劑盒包括用於檢測(i)編碼腫瘤相關抗原的核酸或其部分，(ii)腫瘤相關抗原或其部分，(iii)與腫瘤相關抗原或其部分結合的抗體，和/或(iv)具有對腫瘤相關抗原或其部分和MHC分子間複合物特異性的T細胞的試劑。在一個實施方案中，用於檢測所述核酸或其部分的所述試劑是用於選擇性擴增所述核酸的核酸分子，其包括，特別是所述核酸的6-50特別是10-30、15-30和20-30個連續核苷酸的序列。
發明詳述根據本發明描述了這樣的基因，即其在腫瘤細胞中選擇性或異常表達且為腫瘤相關抗原。
根據本發明，這些基因或其衍生物優選是用於治療方法的靶結構。在概念上，所述治療方法的目的在於抑制選擇性表達的腫瘤相關基因產物的活性。如果所述異常的各選擇性表達在功能上對於腫瘤發病機理具有重要性以及如果其抑制與相應細胞的選擇性損傷相伴隨，則其是有用的。其它治療思想將腫瘤相關抗原作為能恢復具有對腫瘤細胞潛在選擇性細胞損傷的效應機理的標記。此處，所述靶分子自身的功能與其在腫瘤形成中的作用是完全無關的。
核酸的「衍生物」根據本發明是指在所述核酸中存在單個或多個核苷酸置換、缺失和/或添加。而且，術語「衍生物」還包括在核苷酸鹼基、在糖上或在磷酸上的核酸化學衍生化。術語「衍生物」還包括含有非天然存在的核苷酸和核苷酸類似物的核酸。
根據本發明，核酸優選是脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。根據本發明的核酸包括基因組DNA、cDNA、mRNA、重組製備的和化學合成的分子。根據本發明，核酸可以單鏈或雙鏈和線性或共價環狀閉合分子存在。
根據本發明所述的核酸優選是已被分離的。根據本發明的術語「分離的核酸」是指核酸是(i)體外擴增的，例如通過多聚酶鏈式反應(PCR)，(ii)通過克隆重組製備的，(iii)純化的，例如通過剪切和凝膠電泳分離，或(iv)合成的，例如通過化學合成。分離的核酸是隨時可用於重組DNA技術操作的核酸。
如果兩個序列能夠彼此雜交並形成穩定雙鏈體，那麼這一種核酸與另一核酸互補的，雜交優選在適於多核苷酸間的特異性雜交的條件(嚴謹條件)下進行。嚴謹條件描述於，例如，Molecular CloningALaboratory Manual，J.Sambrook et al.，Editors，2nd Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989，或Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubelet al.，Editors，John Wiley Sons，Inc.，New York，嚴謹條件是指，例如，65℃下在雜交緩衝液(3.5×SSC，0.02％ Ficoll，0.02％聚乙烯吡咯烷酮，0.02％牛血清白蛋白，2.5mM NaH2PO4(pH7)，0.5％ SDS，2mM EDTA)中雜交。SSC是0.15M氯化鈉/0.15M檸檬酸鈉，pH7。雜交後，將已經轉移了DNA的膜在例如2×SSC中於室溫，然後在0.1-0.5×SSC/0.1×SDS於直至68℃的溫度下漂洗。
根據本發明，互補核酸含有至少40％特別是至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％和優選至少95％、至少98或至少99％的核苷酸同一性。
根據本發明，編碼腫瘤相關抗原的核酸可單獨或與其它核酸特別是異源核酸聯合存在。在優選的實施方案中，核酸功能性地連接於與所述核酸同源或異源的表達控制序列或調節序列。如果編碼序列和調節序列彼此共價連接，從而編碼序列的表達和轉錄處於調節序列的控制或影響之下，那麼稱它們為「功能性地」彼此連接。如果所述編碼序列將被翻譯為功能蛋白質，則在調節序列和編碼序列的功能性連接時所述調節序列的誘導導致所述編碼序列的轉錄，而不會導致騙碼序列中的移碼或編碼序列不能翻譯成蛋白質或肽。
根據本發明術語「表達控制序列」或「調節序列」包括啟動子、增強子和其它能夠調節基因表達的控制元件。在本發明特定實施方案中，該表達控制序列可被調節。調節序列的準確結構可由於物種或細胞類型不同而變化，但一般包括在轉錄和翻譯的起始中涉及的5』非轉錄和5』非翻譯序列，如TATA區、加帽序列、CAAT序列等。特別地，5』非轉錄調節序列包括含有用於功能性連接基因的轉錄控制的啟動子序列的啟動子區。調節序列還可以包括增強子序列或上遊激活子序列。
因此，在一方面，本說明書所述腫瘤相關抗原可與任何表達控制序列和啟動子聯合。然而在其它方面，根據本發明，本說明書所述腫瘤相關基因產物的啟動子可與其它基因聯合。這使得這些啟動子的選擇活性將得以使用。
根據本發明，核酸還可以存在於與另一核酸的組合中，所述另一核酸編碼能控制從宿主細胞中分泌所述核酸所編碼的蛋白質或多肽的多肽。根據本發明，核酸還可以存在於與另一核酸的組合中，所述另一核酸編碼能使所編碼的蛋白質或多肽錨定於宿主細胞的細胞膜上或區室化至所述細胞的特定細胞器中的多肽。
在一個優選的實施方案中，根據本發明，重組DNA分子是載體，並視情況使用啟動子，所述啟動子能控制核酸例如編碼本發明的腫瘤相關抗原的核酸的表達。此處使用的術語「載體」具有其一般的含義，其包括任何用於核酸而能將所述核酸例如導入原核和/或真核細胞並視情況整合入基因組中的媒介載體。該類載體優選在所述細胞中複製和/或表達。媒介載體可適於用在，例如電穿孔、微粒轟擊、脂質體施用、農桿菌輔助的轉化或通過DNA或RNA病毒的插入。載體包括質粒、噬菌粒或病毒基因組。
編碼根據本發明鑑定的腫瘤相關抗原的核酸可用於宿主細胞的轉染。此處核酸是指重組DNA和RNA。可通過DNA模板的體外轉錄製備重組RNA。而且，其可通過在使用前穩定化序列、加帽和多腺苷酸化而得以修飾的。根據本發明，術語「宿主細胞」涉及可用外源核酸轉化或轉染的任何細胞。根據本發明，術語「宿主細胞」包括原核細胞(例如大腸桿菌)或真核細胞(例如樹突細胞、B細胞、CHO細胞、COS細胞、K562細胞、酵母細胞和昆蟲細胞)。哺乳動物細胞如來自人、小鼠、倉鼠、豬、山羊、靈長類的細胞是特別優選的。細胞可來自多樣的組織類型和包括原代細胞和細胞系。具體實例包括角質化細胞、外周血白細胞、骨髓的幹細胞和胚胎幹細胞。在其它實施方案中，宿主細胞是抗原遞呈細胞，特別是樹突細胞、單核細胞或巨噬細胞。核酸可以以單拷貝或多拷貝的形式存在於宿主細胞，而在一個實施方案中，在宿主細胞中表達。
根據本發明，術語「表達」以其最一般的意義使用，並包括RNA的生成或RNA和蛋白質的生成。其還包括核酸的部分表達。而且，表達可以是瞬時或穩定實施的。哺乳動物細胞中優選的表達系統包括pcDNA3.1和pRc/CMV(Invitrogen，Carlsbad，CA)，其包含選擇性標記物如給予G418抗性的基因(由此能夠選擇穩定轉染的細胞系)和巨細胞病毒(CMV)的增強子-啟動子序列。
在本發明的HLA分子呈遞腫瘤相關抗原或其部分的情況中，表達載體還可包括編碼所述HLA分子的核酸序列。編碼HLA分子的核酸序列可與編碼腫瘤相關抗原或其部分的核酸存在於同一載體上，或者兩個核酸可存在於不同的表達載體上。在後面的情況中，可將該兩個表達載體共轉染至細胞中。如果宿主細胞既不表達腫瘤相關抗原或其部分也不表達HLA分子，則將編碼其的兩個核酸轉染至細胞中的相同表達載體或者不同表達載體上。如果所述細胞已經表達HLA分子，則可僅將編碼腫瘤相關抗原或其部分的核酸序列轉染至細胞中。
本發明還包括擴增編碼腫瘤相關抗原的核酸的試劑盒。所述試劑盒包括，例如，與編碼腫瘤相關抗原的核酸雜交的一對擴增引物。該引物優選包括所述核酸的6-50特別是10-30，15-30和20-30個連續核苷酸的序列，且是非重疊的，這是為了避免形成引物二聚體。引物之一將與編碼腫瘤相關抗原的核酸的一條鏈雜交，而另一引物將以能夠擴增編碼腫瘤相關抗原的核酸的排列方式與互補鏈雜交。
「反義」分子或「反義」核酸可用於調節特別是降低核酸的表達。術語「反義分子」或「反義核酸」根據本發明是指寡核苷酸，所述寡核苷酸是寡核糖核苷酸、寡脫氧核糖核苷酸、修飾的寡核糖核苷酸或修飾的寡脫氧核糖核苷酸，並且其在生理條件下與包括特定基因的DNA或與所述基因的mRNA雜交，從而抑制所述基因的轉錄和/或所述mRNA的翻譯。根據本發明，「反義分子」還包括含有與其天然啟動子反向的核酸或其部分的構建體。核酸或其部分的反義轉錄本可與天然存在的描述酶的mRNA形成雙鏈體並由此阻止mRNA的累積或mRNA翻譯為有活性的酶。另一個可能性是使用核酶從而滅活核酸。反義寡核苷酸根據本發明優選含有靶核酸的6-50特別是10-30、15-30和20-30個連續核苷酸的序列，並優選與靶核酸或其部分完全互補。
在優選的實施方案中，反義寡核苷酸與N-末端或5』上遊位點如翻譯起始位點、轉錄起始位點或啟動位點雜交。在其它實施方案中，反義寡核苷酸與3』端非翻譯區或mRNA剪接位點雜交。
在一個實施方案中，本發明的寡核苷酸由核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸或其組合構成。其中一個核苷酸的5』末端和另一核苷酸的3』末端通過磷酸二酯鍵彼此連接。這些寡核苷酸可以用常規方法合成或經重組製備。
在優選的實施方案中，本發明的寡核苷酸是「修飾的」寡核苷酸。此處，為了增加例如其穩定性或治療效果，寡核苷酸可用不減弱其結合靶位能力的非常不同的方式和方法進行修飾。根據本發明，術語「修飾的寡核苷酸」是指其中(i)其至少兩個核苷酸通過合成的核苷內鍵(即非磷酸二酯鍵的核苷內鍵)彼此連接和/或(ii)通常不存在於核酸中的化學基團與所述寡核苷酸共價相連的寡核苷酸。優選的合成的核苷內鍵是硫代磷酸酯、烷基磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸酯、烷基硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、乙醯胺(Acetamidate)、羧甲基酯和肽。
術語「修飾的寡核苷酸」還包括含有共價修飾的鹼基和/或糖的寡核苷酸。「修飾的寡核苷酸」包括，例如含有與除3』位羥基和5』位磷酸基外的低分子量有機基團共價結合的糖殘基的寡核苷酸。修飾的寡核苷酸可包括，例如2』-O-烷基化核糖殘基或替代核糖的其它糖，如阿拉伯糖。
優選地，分離根據本發明所述的蛋白質和多肽。術語「分離的蛋白質」或「分離的多肽」是指分離自其天然環境的蛋白質或多肽的。分離的蛋白質或多肽可處於基本上純化的狀態。術語「基本上純化的」是指蛋白質或多肽基本上不含在天然或體內與其伴隨的其它物質。
所述蛋白質和多肽例如可用於抗體製備，和在免疫學實驗或診斷實驗中使用，或者可用作治療劑。根據本發明所述的蛋白質和多肽可分離自生物樣品如組織或細胞勻漿，並還可在多樣的原核或真核表達系統中重組表達。
按照本發明的意思，蛋白質或多肽或者胺基酸序列的「衍生物」包括胺基酸插入變體、胺基酸缺失變體和/或胺基酸替換變體。
胺基酸插入變體包括氨基末端和/或羧基末端融合和在特定胺基酸序列中單個或多個胺基酸的插入。在胺基酸序列變體含有插入的情況下，一個或多個胺基酸殘基被插入至胺基酸序列的特定位點，雖然具有對所得產物進行適宜篩選的隨機插入也是可行的。胺基酸缺失變體的特徵在於從序列中除去一個或多個胺基酸。胺基酸替換變體的特徵在於在序列中除去至少一個殘基並在其位置插入另一殘基。修飾優選位於同源蛋白質或多肽間非保守的胺基酸序列中的位置上。優選用其他具有相似特性如疏水性、親水性、負電性、支鏈量等的胺基酸來替代胺基酸(保守性替換)。保守性替換，例如涉及一個胺基酸與下列和欲替換的胺基酸分為一組的另一胺基酸互換1.小脂肪族、非極性或微極性殘基Ala，Ser，Thr(Pro，Gly)2.帶負電的殘基及其醯胺Asn，Asp，Glu，Gln3.帶正電的殘基His，Arg，Lys4.大脂肪族、非極性殘基Met，Leu，Ile，Val(Cys)5.大芳香族殘基Phe，Tyr，Trp。
上面將三個殘基用括號標出，這是由於它們在蛋白質構造中的特殊作用。Gly是唯一沒有支鏈的殘基，因此其可以賦予鏈以彈性。Pro具有特殊的幾何學結構，其能很強地約束鏈。Cys可形成二硫鍵。
上述胺基酸變體可通過已知的肽合成技術例如通過「固相合成」(Merrifield，1964)和相似方法或者通過重組DNA操作法而很容易地製備。將替換突變導入含有已知或部分已知序列的DNA的預定位點中的技術是眾所周知的，例如包括M13誘變。用於製備含有替換、插入或缺失的蛋白質的DNA序列操作已經詳細描述於例如Sambrook et al.(1989)。
根據本發明，蛋白質或多肽的「衍生物」還包括與酶相關的任何分子，如糖、脂質和/或蛋白質或多肽的單個或多個替換、缺失和/或添加。術語「衍生物」還延伸至所述蛋白質或多肽的全部功能性化學等價物。
根據本發明，腫瘤相關抗原的部分或片段具有來源多肽的功能特性。所述功能特性包括與抗體相互作用、與其它多肽或蛋白質相互作用、選擇性結合核酸和酶活性。一個重要的特性是與HLA形成複合物並視情況產生免疫應答的能力。該免疫應答可基於刺激細胞毒性T細胞或輔助T細胞。本發明的腫瘤相關抗原的部分或片段優選包括所述腫瘤相關抗原的至少6特別是至少8、至少10、至少12、至少15、至少20、至少30或至少50個連續胺基酸的序列。
編碼腫瘤相關抗原的核酸的部分或片段根據本發明涉及至少編碼腫瘤相關抗原和/或編碼所述腫瘤相關抗原的部分或片段(如上述)的核酸的部分。
編碼腫瘤相關抗原的基因的分離和鑑定還能診斷特徵是表達一個或多個腫瘤相關抗原的疾病。這些方法包括測定一個或多個編碼腫瘤相關抗原的核酸，和/或測定所編碼的腫瘤相關抗原和/或來源於其的肽。所述核酸可採用包括通過多聚酶鏈式反應或與標記探針雜交的常規方法進行測定。腫瘤相關抗原或來源於其的肽可通過篩選與識別與所述抗原和/或所述肽有關的患者抗血清進行測定。其還可以通過篩選具有相應腫瘤相關抗原特異性的患者T細胞進行測定。
本發明還能使與本文所描述的腫瘤相關抗原結合的蛋白質得以分離，所述蛋白質包括所述腫瘤相關抗原的抗體和細胞結合配偶體。
根據本發明，特定實施方案包括提供源自腫瘤相關抗原的「顯型失活」多肽。顯型失活多肽是無活性的蛋白質變體，其通過與細胞器相互作用而抑制活性蛋白質與細胞器的相互作用中的活性蛋白質或與活性蛋白質競爭，由此降低所述活性蛋白質的作用。例如，與配體結合但不能產生任何對於配體結合響應的信號的顯型失活受體能降低所述配體的生物學效應。同樣地，通常與靶蛋白質相互作用但不會磷酸化靶蛋白質的顯型失活的無催化活性激酶能降低作為對細胞信號響應的所述靶蛋白質的磷酸化作用。同樣地，與基因控制區中啟動子位點結合但不增加所述基因轉錄的顯型失活轉錄因子可通過佔據了啟動子結合位點而不增加轉錄從而降低正常轉錄因子的作用。
顯型失活多肽在細胞中表達的結果會導致活性蛋白質功能降低。本領域技術人員可通過例如傳統誘變方法製備蛋白質顯型失活變體並評估該變體多肽的顯型失活效應。
本發明還包括例如與腫瘤相關抗原結合的多肽的物質。所述結合物質可用於例如檢測腫瘤相關抗原和腫瘤相關抗原與其結合配偶體的複合物的篩選實驗以及所述腫瘤相關抗原以及純化其與其結合配偶體的複合物。所述結合物還可用於抑制腫瘤相關抗原的活性，例如通過結合該抗原。
因此，本發明包括結合物質，例如能選擇性結合腫瘤相關抗原的抗體或抗體片段。抗體包括用常規方法製備的多克隆抗體和單克隆抗體。
已知，僅抗體分子的小部分(互補位)參與該抗體與其表位的結合(參照Clark，W.R.(1986)，The Experimental Foundations of ModernImmunology，Wiley Sons，Inc.，New York；Roitt，I.(1991)，Essential Immunology，7th Edition，Blackwell ScientificPublications，Oxford)。pFc』和Fc區是例如補體級聯反應的效應子但並不參與抗原結合。pFc』區被酶解去除的或者以無pFc』區製備的抗體稱為F(ab』)2片段，其帶有完整抗體的兩個抗原結合位點。同樣地，其Fc區被酶解去除的或者以無Fc區製備的抗體稱為Fab片段，其含有完整抗體分子的一個抗原結合位點。此外，包括抗體的共價結合的輕鏈和抗體的重鏈部分的Fab片段稱為Fd。Fd片段是抗體特異性的主要決定簇(單Fd片段可與直至十個不同的輕鏈相關，而不改變抗體的特異性)，且當分離時，Fd片段保留了結合表位的能力。
直接與抗原表位相互作用的，互補性決定區(CDR)和保持互補位三級結構的框架區(FR)位於抗體的抗原結合部中。重鏈的Fd片段和IgG免疫球蛋白的輕鏈都包含各由三個互補性決定區(CDR1～CDR3)隔開的四個框架區(FR1～FR4)。CDR，特別是CDR3區更特別是重鏈的CDR3區絕大多數是造成抗體特異性的原因。
已知哺乳動物抗體的非CDR區可被具有相同或其他特異性的抗體的相似區所替換，同時保留對原始抗體的表位的特異性。這使得可能形成所謂的「人源化」抗體，在該抗體中非人CDR與人FR和/或Fc/pFc』區共價連接以製備功能性抗體。
例如，WO 92/04381中公開了人源化鼠RSV抗體的製備和用途，所述抗體中至少部分鼠FR區被人源的FR區替換。該類抗體包括具有抗原結合能力的完整抗體的片段抗體，其通常稱為「嵌合」抗體。
本發明還提供了抗體的F(ab』)2、Fab、Fv和Fd片段，其中Fc和/或FR和/或CDR1和/或CDR2和/或輕鏈-CDR3區已被同源人或非人序列替換的嵌合抗體，其中FR和/或CDR1和/或CDR2和/或輕鏈-CDR3區已被同源人或非人序列替換的嵌合F(ab』)2片段抗體，其中FR和/或CDR1和/或CDR2和/或輕鏈-CDR3區已被同源人或非人序列替換的嵌合Fab片段抗體，和其中FR和/或CDR1和/或CDR2區已被同源人或非人序列替換的嵌合Fd片段抗體。本發明還包括所謂的「單鏈」抗體。
本發明還包括與腫瘤相關抗原特異性結合的多肽。例如通過以固定形式在溶液中簡單製備的或作為噬菌體展示文庫製備的簡併的肽文庫可提供這樣的多肽結合物質。同樣能夠用一個或多個胺基酸製備肽組合文庫。還可以製備肽和非肽性合成殘基的文庫。
噬菌體展示在鑑定本發明的結合肽中是特別有效的。就此而論，例如，製備呈遞長度為4～約80個胺基酸殘基的插入序列的噬菌體文庫(例如採用M13、fd或lambda噬菌體)。然後選擇帶有與腫瘤相關抗原結合的插入序列的噬菌體。該方法可通過再選擇與腫瘤相關抗原結合的噬菌體的多個循環而進行重複。重複操作導致帶有特定序列的噬菌體的濃縮。可實施DNA序列分析以便鑑定所表達的多肽的序列。與腫瘤相關抗原結合的序列的最小線性部分可被確定。酵母「雙雜交系統」也可用於鑑定結合腫瘤相關抗原的多肽。根據本發明所述的腫瘤相關抗原或其片段可用於篩選肽文庫，包括噬菌體呈現文庫，以鑑定和選擇腫瘤相關抗原的肽結合配偶體。這樣的分子例如可用於篩選實驗、純化方法，用於幹擾腫瘤相關抗原的功能以及用於其它本領域技術人員已知的目的。
上述抗體和其它結合分子可用於，例如，鑑定表達腫瘤相關抗原的組織。抗體還可以與特異性診斷物偶連以便顯示表達腫瘤相關抗原的細胞和組織。其還可以與治療上有效的物質偶連。診斷劑非限制性地包括硫酸鋇、碘西他酸、碘番酸、碘泊酸鈣、泛影酸鈉、泛影酸葡甲胺、甲泛葡胺、丁碘苄丁酸鈉，和放射診斷劑包括正電子發射體如氟-18和碳-11，γ發射體如碘-123、鎝-99m、碘-131和銦-111、用於核磁共振的核素如氟和釓。根據本發明，術語「治療上有效的物質」是指按需選擇性導向表達一個或多個腫瘤相關抗原的細胞的任何治療性分子，包括抗癌劑、放射性碘標記的化合物、毒素、細胞穩定藥或細胞溶解藥等，抗癌劑包括例如氨魯米特、硫唑嘌呤、硫酸博來黴素、白消安、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、順鉑、環磷醯胺、環孢菌素A、阿糖胞苷、達卡巴素、更生黴素、daunorubin、阿黴素、紫杉醇、依託泊苷、氟尿嘧啶、幹擾素-α、環己亞硝脲、巰嘌呤、甲氨蝶呤、米託坦、鹽酸丙卡巴肼、硫鳥嘌呤、硫酸長春鹼和硫酸長春新鹼。其它抗癌劑被公開於例如Goodman和Gilman，「The Pharmacological Basis of Therapeutics」，8th Edition，1990，McGraw-Hill，Inc.，特別是52章中(抗癌劑(PaulCalabresi和Bruce A.Chabner)。毒素可以是蛋白質如美州商陸抗病毒蛋白質，霍亂毒素、百日咳毒素、篦麻毒素、白樹毒素、相思豆毒素、白喉外毒素或假單胞菌外毒素。毒素殘基還可以是釋放高能量的放射性核素如鈷-60。
根據本發明術語「患者」是指人類，非人類靈長類或其它動物，特別是哺乳動物如奶牛、馬、豬、綿羊、山羊、狗、貓或齧齒動物如小鼠和大鼠。在特別優選的實施方案中，患者是人類。
根據本發明，術語「疾病」是指表達或異常表達腫瘤相關抗原的任何病理狀態。「異常表達」根據本發明是指與健康個體狀態相比表達改變，優選是增加。表達增加是指增加至少10％左右，特別是至少20％、至少50％或至少100％。在一個實施方案中，所述腫瘤相關抗原僅在患病個體的組織中表達，而在健康個體中的表達受抑制。所述疾病的一個實例是癌症，特別是精原細胞瘤、黑素瘤、畸胎瘤、神經膠質瘤、結腸直腸癌、乳癌、前列腺癌、子宮癌、卵巢癌和肺癌。
根據本發明，生物樣品可以是組織樣品和/或細胞樣品，並可採用常規方法如通過組織活檢，包括鑽取活組織檢查以及通過取血、支氣管抽取液、尿、糞便或其它體液的方法獲得，而用於本文描述的多種方法中。
根據本發明，術語「免疫反應細胞」是指能用適宜刺激將其成熟為免疫細胞(如B細胞，輔助T細胞，或細胞毒性T細胞)的細胞。免疫反應細胞包括CD34+造血幹細胞，未成熟的和成熟的T細胞和未成熟的和成熟的B細胞。如果需要生成識別腫瘤相關抗原的細胞毒性或輔助T細胞，則在適於生成、分化和/或選擇細胞毒性T細胞和輔助T細胞的條件下將該免疫反應細胞與表達腫瘤相關抗原的細胞接觸。當暴露於抗原時，T細胞前體細胞分化為細胞毒性T細胞，這與免疫系統的克隆選擇相似。
某些治療方法的基礎是患者免疫系統的反應，所述反應導致抗原呈遞細胞如呈遞一個或多個腫瘤相關抗原的癌細胞的溶解。就此而論，例如將具有對腫瘤相關抗原和MHC分子的複合物特異性的自體細胞毒性T淋巴細胞施用於患有細胞異常的患者。所述細胞毒性T淋巴細胞的體外製備方法是已知。WO-A-9633265中已經公開了T細胞分化方法的實例。通常，從所述患者提取含有細胞如血細胞的樣品，然後將該細胞與呈遞所述複合物並能導致細胞毒性T淋巴細胞增殖的細胞(例如樹突細胞)相接觸。所述靶細胞可以是轉染的細胞如CoS細胞。這些轉染的細胞在其表面呈遞所需複合物，並在與細胞毒性T淋巴細胞接觸時刺激後者的增殖。然後將克隆延展的自體細胞毒性T淋巴細胞施用於所述患者。
在另一選擇抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞的方法中，將MHC I類分子/肽複合物的螢光四聚物用於檢測細胞毒性T淋巴細胞的特異性克隆(Altman et al.，Science 27494-96，1996；Dunbar et al.，Curr.Biol.8413-416，1998)。可溶性MHC I類分子在存在β2微球蛋白和與所述I類分子結合的肽抗原的情況下在體外摺疊。純化該MHC/肽複合物，然後用生物素標記。通過將所述生物素化肽-MHC複合物與標記的抗生物素蛋白(例如藻紅蛋白)以4∶1的摩爾比率混合而形成四聚物。然後將四聚物與細胞毒性T淋巴細胞如外周血或淋巴結接觸。該四聚物與能識別肽抗原/MHC I類複合物的細胞毒性T淋巴細胞結合。與所述四聚物結合的細胞可通過用於分離反應性細胞毒性T淋巴細胞的螢光控制的細胞分選進行分選。然後可將所述分離的細胞毒性T淋巴細胞在體外增殖。
在稱為繼承性轉移的治療方法中(Greenberg，J.Immunol.136(5)1917，1986；Riddel et al.，Science 257238，1992；Lynchet al.，Eur.J.Immunol.211403-1410，1991；Kastetal.，Cell59603-614，1989)，將呈遞所需複合物的細胞(例如樹突細胞)與將治療的患者的細胞毒性T淋巴細胞組合，導致特異性細胞毒性T淋巴細胞的增殖。然後將增殖的細胞毒性T淋巴細胞施用於具有特徵為呈遞所述特異性複合物的特定異常細胞的細胞異常的患者。然後該細胞毒性T淋巴細胞溶解異常細胞，由此實現所需療效。
通常，在患者的T細胞庫中，僅具有對該類特異性複合物低親和力的T細胞可得以增殖，因為那些具有高親和力的細胞由於耐受性的形成而被去除。此處一個選擇性方法可以是T細胞受體自身的轉移。同樣地，為此將呈遞所述所需複合物的細胞(例如樹突細胞)與健康個體的細胞毒性T淋巴細胞組合。如果供體迄今沒有與特異性複合物機接觸，這導致具有高親和力的特異性細胞毒性T淋巴細胞的增殖。克隆這些增殖的特異性T淋巴細胞的高親和力T細胞受體，然後將其通過基因轉移例如使用逆病毒載體而任意轉導至其他患者的T細胞。然後採用這些遺傳改變的T淋巴細胞實施繼承性轉移(Stanislawski et al.，Nat Immunol.2962-70，2001；Kessels et al.，Nat Immunol.2957-61，2001)。
上述治療方面始於如下事實至少一些患者的異常細胞呈遞腫瘤相關抗原和HLA分子的複合物。所述細胞可按本身已知的方法鑑定。呈遞所述複合物的細胞一經鑑定，則可將它們與來自所述患者的包含細胞毒性T淋巴細胞的樣品組合。如果所述細胞毒性T淋巴細胞溶解呈遞所述複合物的細胞，即可推測呈遞了腫瘤相關抗原。
根據本發明可採用的治療形式不僅是繼承性轉移。細胞毒性T淋巴細胞實質上還可按本身已知的方法在體外生成。一種方法使用表達所述複合物的非增殖性的細胞。此處使用的細胞是那些通常表達所述複合物的細胞，如受輻射的腫瘤細胞或用對於所述複合物(即抗原肽和呈遞的HLA分子)的呈遞所需的一個或兩個基因轉染的細胞。可使用多種細胞類型。而且，可以使用帶有一個或兩個目標基因的載體。特別優選的是病毒載體或細菌載體。例如，編碼腫瘤相關抗原或其部分的核酸可功能性連接於控制所述腫瘤相關抗原或其片段在特定組織或細胞類型中的表達的啟動子和增強子序列。可將所述核酸裝配入表達載體。表達載體可以是可插入外源性核酸的無修飾的染色體外核酸、質粒或病毒基因組。還可將編碼腫瘤相關抗原的核酸插入逆轉錄病毒基因組，由此使得所述核酸整合至靶組織或靶細胞的基因組中。在這些系統中，微生物如痘苗病毒、痘病毒、單純皰疹病毒、逆轉錄病毒或腺病毒載體攜帶目標基因並事實上「感染」宿主細胞。另一優選的形式是以重組RNA的形式導入腫瘤相關抗原。它們可通過例如脂質體轉移或通過電穿孔導入細胞中。得到的細胞呈遞目標複合物並被自身細胞毒性T淋巴細胞識別，該細胞然後增殖。
腫瘤相關抗原或其片段與佐劑的組合可獲得相似效果，以便能使在體內整合至抗原遞呈細胞。所述腫瘤相關抗原或其片段表現為蛋白質、DNA(例如在載體內)或RNA。處理所述腫瘤相關抗原以便生成HLA分子的肽配偶體，而其片段可無須進一步的處理而被呈遞。如果這些能結合HLA分子，則後者是特殊情況。完全抗原在體內由樹突細胞進行處理的施用方式是優選的，因為其還能產生有效免疫反應所需的輔助T細胞反應(Ossendorp et al.，Immunol Lett.7475-9，2000；Ossendorpet al.，J.Exp.Med.187693-702，1998)。通常，可通過例如皮內注射將有效量的腫瘤相關抗原施用於患者。此外，注射還可通過結內注射至淋巴結(Maloy et al.，Proc Natl Acad Sci USA 983299-303，2001)。還可以與促進攝入至樹突細胞的試劑組合實施。體內優選的腫瘤相關抗原包括與多個癌症患者的異源癌抗血清或T細胞反應的抗原。此外，特別令人感興趣的是那些先前對其不存在自身免疫應答的腫瘤相關抗原。可以可檢測的方式誘導能溶解腫瘤的抗這些腫瘤相關抗原的免疫應答(Keogh et al.，J.Immunol.167787-96，2001；Appellaet al.，Biomed Pept Proteins Nucleic Acids 1177-84，1995；Wentworth et al.，Mol Immunol.32603-12，1995)。
根據本發明所描述的藥物組合物還可用作用於免疫接種的疫苗。根據本發明，術語「免疫接種」或「接種疫苗」是指針對抗原的免疫反應的增加或激活。通過使用腫瘤相關抗原或其編碼核酸能將動物模型用於檢測對癌的免疫效果。例如，可將人類癌細胞導入小鼠中從而生成腫瘤，然後施用編碼腫瘤相關抗原的一個或多個核酸。對癌細胞的效果(例如腫瘤大小的減小)可作為檢測核酸免疫效力而進行檢測。
作為用於免疫的組合物的部分，將一個或多個腫瘤相關抗原或其刺激性片段與一個或多個佐劑一起施用以誘導免疫應答或增加免疫應答。佐劑是一種摻入所述抗原或與後者一起施用並能增強免疫應答的物質。佐劑可通過提供抗原庫(細胞外或巨噬細胞內)、激活巨噬細胞和刺激特定的淋巴細胞而增強免疫反應。佐劑是已知的，並以非限制性的方式包括單磷醯脂A(MPL，SmithKline Beecham)、皂苷如QS21(SmithKlineBeecham)、DQS21(SmithKline Beecham；WO 96/33739)、QS7、QS17、QS18和QS-L1(So et al.，Mol.Cells 7178-186，1997)、不完全弗氏佐劑、完全弗氏佐劑、維生素E、montanide、明礬、CpG寡核苷酸(參照Kreig et al.，Nature 374546-9，1995)和用生物可降解的油如鯊烯和/或生育酚製備的多種油包水乳液。優選地，將所述肽以與DQS21/MPL混合物的形式施用。DQS21與MPL的比率一般為約1∶10～10∶1，優選約1∶5～5∶1而特別是約1∶1。在施用於人時，疫苗製劑通常包含約1μg～約100μg的DQS21和MPL。
刺激患者免疫反應的其它物質也是可以施用的。例如，由於其對淋巴細胞的調節活性，在疫苗接種中使用細胞因子是可行的。所述細胞因子包括，例如顯示出增加疫苗的保護性效果的白介素-12(IL-12)(參照Science 2681432-1434，1995)，GM-CSF和IL-18。
能增強免疫應答並因此可用於疫苗接種的化合物數量很多。所述化合物包括以蛋白質或核酸形式提供的共刺激分子。所述共刺激分子的實例是在樹突細胞(DC)上表達的並與T細胞上表達的CD28分子相互作用的B7-1和B7-2(分別CD80或CD86)。該相互作用提供了對抗原/MHC/TCR-刺激的(信號1)T細胞的共刺激(信號2)，由此增強了所述T細胞的增殖和效應子作用。B7還與T細胞上的CTLA4(CD152)相互作用，關於CTLA4和B7配體的研究證實了B7-CTLA4相互作用能增強抗腫瘤免疫性和CTL的增殖(Zheng，P.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(11)6284-6289(1998))。
B7通常不在腫瘤細胞上表達，因此這些不是對於T細胞的有效的抗原遞呈細胞(APC)。誘導B7表達將能使腫瘤細胞更有效地刺激細胞毒性T淋巴細胞的增殖和效應子作用。通過B7/IL-6/IL-12聯合的共刺激揭示了在T細胞群中IFN-γ和Th1-細胞因子分布的誘導，這導致進一步增強T細胞活性(Gajewski et al.，J.Immunol.1545637-5648(1995))。
細胞毒性T淋巴細胞的完全激活和完全效應子功能需要通過所述輔助T細胞上的CD40配體和由樹突細胞表達的CD40分子間的相互作用的輔助T細胞的參與(Ridge et al.，Nature 393474(1998)，Bennettet al.，Nature 393478(1998)，Schnberger et al.，Nature 393480(1998))。該共刺激信號的機制可能涉及通過樹突細胞(抗原呈遞細胞)的B7和相關IL-6/IL12的生成的增加。因此CD40-CD40L相互作用補充了信號1(抗原/MHC-TCR)和信號2(B7-CD28)的相互作用。
抗-CD40抗體用於刺激樹突細胞的用途預期能直接增強對通常處於炎性應答範圍之外或非專一性抗原遞呈細胞(腫瘤細胞)呈遞的腫瘤抗原的響應。在這些情況下，T輔助和B7-共刺激信號未被提供。該機制可用於和基於抗原刺激的樹突細胞的治療有關的情況，或在已知的TRA前體細胞中尚未確定T輔助表位的情況。
本發明還提供了核酸，多肽或肽的施用方法。多肽和肽可採用本身已知的方式施用。在一個實施方案中，採用體外施用核酸，即通過從患者分離細胞，對所述細胞進行遺傳學改變以便摻入腫瘤相關抗原，然後將改變的細胞再導入至該患者。其一般包括在體外將基因的功能性拷貝導入患者的細胞中和再將遺傳學改變的細胞導入患者。基因的功能性拷貝處於能使該基因在遺傳學改變的細胞中表達的調控元件的功能控制下。轉染和轉導方法是本領域技術人員已知的。本發明還提供了通過使用載體如病毒和靶受控脂質體而在體內施用核酸的方法。
在一個優選的實施方案中，用於施用編碼腫瘤相關抗原的核酸的病毒載體選自腺病毒、腺伴隨病毒、痘病毒，包括痘苗病毒和減毒痘病毒、塞姆利基森林病毒、逆轉錄病毒、辛德比斯病毒和Ty病毒樣顆粒。腺病毒和逆轉錄病毒是特別優選的。所述逆轉錄病毒通常是複製缺陷型的(即它們不能產生感染性顆粒)。
可使用多種方法將核酸根據本發明在體外或體內導入細胞。該類方法包括核酸CaPO4沉澱物的轉染、與DEAE的轉染相關的核酸的傳染、上述含有目標核酸的病毒的轉染或感染、脂質體介導的轉染等。在特定實施方案中，優選的是將所述核酸導入特定細胞。在所述實施方案中，用於將核酸施用於細胞的載體(例如逆轉錄病毒或脂質體)可含有結合的靶控制分子。例如，分子如具有對靶細胞上的表面膜蛋白質特異性的抗體或針對靶細胞上受體的配體可被摻入或附於核酸載體。優選的抗體包括與腫瘤相關抗原選擇性結合的抗體。如果需要通過脂質體施用核酸，可將與內吞作用相關的表面膜蛋白質結合的蛋白質摻入脂質體配劑中，以便獲得靶位控制和/或攝取。所述蛋白質包括衣殼蛋白或其具有對特定細胞類型特異性的片段、抗被攝入的蛋白質的抗體，定位細胞內位點的蛋白質等。
本發明的治療組合物可以藥物學上適用的製劑進行施用。所述製劑通常含有藥物學上適用濃度的鹽、緩衝物質、防腐劑、載體、補充性免疫增強劑如佐劑、CpG和細胞因子，和視情況含有其它治療有效物質。
本發明的治療有效物質可通過任何常規途徑，包括通過注射或輸注的方法進行施用。可採用例如口服、靜脈內、腹膜內、肌內、皮下或經皮膚的方式進行施用。優選地，抗體可通過肺氣霧劑的方法進行治療施用。反義核酸優選通過緩慢靜脈注射的方法進行施用。
本發明的組合物以有效劑量施用。「有效劑量」是指單獨或與另外劑量一同獲得預期反應或預期效果的量。在治療特徵是表達一個或多個腫瘤相關抗原的特定疾病和特定症狀的情況下，所需反應涉及抑制所述疾病的病程。其包括減慢疾病的進展，特別是，阻斷疾病的進展。在治療疾病或症狀中的所需反應還可以是延緩或阻止所述疾病或所述症狀的發病。
本發明的組合物的有效劑量取決於要治療的症狀、疾病的嚴重程度、患者的個體參數(包括年齡、生理條件、身體大小和體重)、治療持續時間、伴隨治療的類型(如果存在)、特異性的施藥途徑和相似因素。
本發明的藥物組合物優選是無菌的，並且包含有效劑量的治療活性物質以產生所需反應或所需效應。
本發明的組合物的施用劑量可依賴於多種參數如施用方式、患者狀況，施用所需周期等。在施用起始劑量對患者的反應不足的情況下，可使用更高的劑量(或通過其他的、更局部化的施用途徑獲得的效用更高的劑量)。
通常，製備和施用劑量為1ng～1mg，優選10ng～100μg的腫瘤相關抗原，用以治療或者產生或增加免疫應答。如果需要施用編碼腫瘤相關抗原的核酸(DNA和RNA)，製備和施用的劑量為1ng～0.1mg。
本發明的藥物組合物通常以藥物學上適用的量和以藥物學上適用的組合物進行施用。術語「藥物學上適合的」是指不與藥物組合物的活性成分的作用發生相互作用的無毒物質。該類製劑通常可含有鹽、緩衝物質、防腐劑、載體，和視情況含有其它治療上有效的化合物。當在藥物中使用時，所述鹽應是藥物學上適宜的。然而，非藥物學上適用的鹽也可用於製備其藥物學上適用的鹽，這也包括於本發明中。該類藥理學和藥物學上適用的鹽包括以非限制性方式從下列酸製備的鹽鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、馬來酸、乙酸、水楊酸、檸檬酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸等。藥物學上適用的鹽還可以製備為鹼金屬鹽或鹼土金屬鹽，如鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽。
本發明的藥物組合物可包括藥物學上可接受的載體。根據本發明，術語「藥物學上適用的載體」是指適用於施用給人類的一個或多個相容性的固體或液體填充料、稀釋劑或包封物。術語「載體」是指具有天然或合成性質的有機或無機成分，活性成分在其中進行聯合從而利於施用。本發明的藥物組合物的組分通常不發生基本上會減弱所需的藥物學功效的相互作用。
本發明的藥物組合物可包含適用的緩衝物如乙酸鹽、檸檬酸鹽、硼酸鹽和磷酸鹽。
所述藥物組合物視情況還可包含適用的防腐劑如氯化苯甲烴銨(Benzalkonium chlorid)、三氯甲基叔丁醇、對羥基苯甲酸酯和乙基汞硫代水楊酸鈉。
所述藥物組合物通常以統一劑型提供並可用實際已知的方法製備。本發明的藥物組合物可以是如下劑型，例如膠囊、片劑、錠劑、混懸劑、糖漿劑、酏劑或乳液劑型。
適用於胃腸外給藥的組合物通常含有有效物質的無菌水性或非水性製劑，其優選是與受者血液等滲的。適用的載體和溶劑的實例是林格液和等滲氯化鈉溶液。另外，通常將無菌的、不揮發的油用作溶液或懸浮介質。
下述附圖
和實施例用於詳細地描述本發明，它們僅用於例證的目的而並非意在限制。根據說明書和實施例，本領域技術人員可獲得同樣包括於本發明的其它實施方案。
附圖簡介圖.1圖解說明eCT的克隆。該策略包括在資料庫中鑑定候補基因(GOI＝「目標基因」)並通過RT-PCR的方法檢測所述基因。
圖.2LDH C的剪接。選擇性剪接結果導致外顯子3(SEQ ID NO2)、兩個外顯子3和4(SEQ ID NO3)、外顯子3、6和7(SEQ ID NO4)或外顯子7(SEQ ID NO5)的缺失。ORF＝開放閱讀框架，aa＝胺基酸。
圖.3可能的LDH-C蛋白質的比對。SEQ ID NO8和SEQ ID NO10是原型蛋白質(SEQ ID NO6)的截斷部分。SEQ ID NO7、SEQ IDNO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12和SEQ ID NO13的蛋白質序列為另外改變的，並僅包含腫瘤特異性表位(以粗體字顯示)。催化中心用方框顯示。
圖.4採用實時PCR在多種組織中定量LDH C。在除睪丸以外的正常組織中未檢測到轉錄本，但在腫瘤中檢測到顯著性表達水平。
圖.5TPTE變體的外顯子組合物。根據本發明，鑑定在睪丸組織和腫瘤中表達且具有移碼和由此改變的序列區的剪接變體(SEQ ID NO20、SEQ ID NO21、SEQ ID NO54、SEQ ID NO55、SEQ ID NO56、SEQ ID NO57)。
圖.6可能的TPTE蛋白質的比對。選擇性剪接結果導致所編碼的蛋白質的改變，基本上保留閱讀框。用粗體字顯示推定的跨膜區，催化區用方框顯示。
圖.7TSBP變體在核苷酸水平的比對。根據本發明發現的TSBP變體的核苷酸序列(SEQ ID NO31，SEQ ID NO32，SEQ ID NO33)中與已知序列(NM_006781，SEQ ID NO29)的差異用粗體字顯示。
圖.8TSBP變體在蛋白質水平的比對。在由本發明發現的TSBP變體(SEQ ID NO34、SEQ ID NO35、SEQ ID NO36)所編碼的蛋白質中，移碼導致與前述蛋白質(SEQ ID NO30，NM_006781)的實質性差異，並用粗體字顯示。
圖.9MS4A12的RT-PCR。所檢測的組織中僅在睪丸、結腸和結腸直腸癌(結腸癌)中檢測到表達。在所示6個肝組織樣品的其一中，MS4A12檢測陽性，因為該樣品已經發生結腸癌轉移浸潤。稍後的實驗也證實了結腸癌轉移中的明顯表達。
圖.10BRCO1的RT-PCR。與在正常乳腺組織中的表達相比，BRCO1在乳腺腫瘤中明顯過表達。
圖.11MORC、TPX1、LDHC、SGY-1的RT-PCR。多種正常組織的研究顯示表達僅存在於睪丸中(1皮膚，2小腸，3結腸，4肝，5肺，6胃，7乳腺，8腎，9卵巢，10前列腺，11甲狀腺，12白細胞，13胸腺，14陰性對照，15睪丸)。腫瘤的研究(1-17肺腫瘤，18-29黑素瘤，30陰性對照，31睪丸)顯示在所述腫瘤中的各eCT以不同頻率的異位表達。
圖.12LDHC在MCF-7乳癌細胞系中的線粒體定位。用LDHC表達質粒瞬時轉染MCF-7細胞。用LDHC特異性抗體檢測抗原，其顯示出明顯的與線粒體呼吸鏈酶細胞色素C氧化酶的共區域化。
圖.13TPTE的預測拓撲學和在MCF-7細胞的細胞表面上的亞細胞定位左側的圖描述了4個推測的TPTE跨膜區(箭頭)。用TPTE表達質粒瞬時轉染MCF-7細胞。採用TPTE特異性抗體檢測抗原並顯示出與位於細胞表面上的MHC I分子的明顯的共區域化。
圖.14MS4A12在細胞膜上的定位。
用GFP-標記的MS4A12構建體瞬時轉染腫瘤細胞，其在共聚焦免疫螢光顯微技術中顯示出與質膜標記物的完全共區域化。
實施例材料和方法術語「in silico」、「電子的」和「虛擬克隆」僅指使用基於資料庫的方法，其還可用於模擬實驗室實驗方法。
除非另有描述，全部其它術語和表述均使用能被本領域技術人員理解的含義。所述技術和方法用本身已知的方法實施，並已經描述於例如Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，2ndEdition(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.。包括使用試劑盒和試劑的全部方法按廠商的說明實施。
用於確定eCT(電子克隆的癌/睪丸基因)的基於數據挖掘的策略將兩個名為GenBank關鍵詞檢索和cDNAxProfiler的in silico策略進行組合(圖.1)。使用NCBI的ENTREZ檢索和返回系統(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez)，對被評述為在睪丸組織中特異性表達的候補基因實施GenBank檢索(Wheeler et al.，Nucleic AcidsResearch 2810-14，2000)。
實施關鍵詞為「睪丸特異性基因」、「精子特異性基因」、「精原細胞特異性基因」的查詢，從資料庫中提取候補基因(GOI，目標基因)。通過對生物體使用「人類」和對分子類型使用「mRNA」進行限制，從而將所述檢索僅限於這些資料庫的完整信息的部分。
所發現的GOI的列表通過確定相同序列的不同名稱從而消除冗餘來進行調整。
由關鍵詞檢索獲得的全部候補基因再次通過「電子Northern」(eNorthen)法研究其組織分布。eNorthern基於將GOI序列對於EST(已表達序列標誌)資料庫進行比對(Adams et al.，Science 2521651，1991)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)。每個與輸入的GOI同源而出現的EST的組織來源可被確定，並以這種方式通過將全部EST相加而生成GOI組織分布的初步評估。僅對與來自除胎盤和胎兒外的非睪丸正常組織的EST不同源的那些GOI實施進一步的試驗。該評估還能考慮到了公開領域中存在的被錯誤評述的cDNA文庫(Scheurleet al.，Cancer Res.604037-4043，2000)(www.fau.edu/cmbb/publications/cancergenes6.htm)。
所使用第二個數據挖掘方法是NCBI的癌症基因組剖析計劃(CancerGenome Anatomy Project)的cDNA xProfiler(http://cgap.nci.nih.gov/Tissues/xProfiler)(Hillier et al.，Genome Research 6807-828，1996；Pennisi，Science 2761023-1024，1997)。所述方法能使存在於資料庫中的轉錄組庫通過邏輯運算符進行彼此關聯。我們定義了將從睪丸中製備的所有表達文庫分配至其中的A庫，其中排除了混合文庫。將從除睪丸、卵巢或胎兒組織以外的正常組織中製備的全部cDNA文庫分配至B庫。通常，不依賴於基本製備方法而獨立使用全部cDNA文庫，但僅承認那些大小＞1000的。採用BUT NOT運算符從A庫中在數字上減去B庫。採用該方法建立的GOI組液用於eNOrthern研究，並通過文獻檢索加以確認。
該聯合的數據挖掘包括公開領域中的全部約13,000全長基因，並從這些基因中預測出總數是140的具有潛在睪丸特異性表達的基因。在這些基因中存在25個先前已知的CT基因類基因，這證實了我們的策略的功效。
通過特異性RT-PCR首先在正常組織中評估所有其它基因。所有已被證實在非睪丸正常組織中表達的GOI被認為是假陽性，並從進一步的研究中排除。餘下的基因在最多樣的腫瘤組織的大平板上進行試驗。下述抗原在此被證實在腫瘤細胞中異位激活。
提取RNA，製備聚d(T)引物啟動的cDNA和RT-PCR分析使用異硫氰酸胍作為促溶劑從自然組織材料中提取總RNA(Chomczynski Sacchi，Anal.Biochem.162156-9，1987)。在用酸性苯酚提取並用異丙醇沉澱後，將所述RNA溶解於DEPC處理的水中。
採用Superscript II(Invitrogen)並根據廠商說明在20μl反應混合物中使用2-4μg總RNA實施第一鏈cDNA合成。所使用的引物是dT(18)寡核苷酸。通過在30個循環PCR中p53的擴增來檢測cDNA的完整性和質量(有義CGTGAGCGCTTCGAGATGTTCCG，反義CCTAACCAGCTGCCCAACTGTAG，雜交溫度為67℃)。
從多種正常組織和腫瘤體中製備第一鏈cDNA庫在30μl反應混合物中擴增0.5μl這些cDNA用於表達研究，其中使用GOI特異性引物(如下)和1U HotStarTaq DNA聚合酶(Qiagen)。每個反應混合液包含0.3mM dNTP，0.3M各引物和3μl 10×反應緩衝液。
選擇引物以便使其位於兩個不同的外顯子中，並通過用非逆轉錄的DNA作為模板進行檢測來證實消除了由汙染性基因組DNA所帶來地幹擾，所述汙染性基因組DNA是假陽性結果的原因。在95℃保持15分鐘以激活HotStarTaq DNA聚合酶後，實施35個PCR循環(94℃1分鐘，各自特定的雜交溫度1分鐘，72℃ 2分鐘和72℃最終延長6分鐘)。
將20μl該反應物在用溴化乙錠染色的瓊脂糖凝膠上分離並進行分析。
將下列引物用於相應抗原在所述雜交溫度的表達分析。
LDH-C(67℃)有義TGCCGTAGGCATGGCTTGTGC，反義CAACATCTGAGACACCATTCCTPTE(64℃)有義TGGATGTCACTCTCATCCTTG，反義CCATAGTTCCTGTTCTATCTGTSBP(63℃)有義TCTAGCACTGTCTCGATCAAG，反義TGTCCTCTTGGTACATCTGACMS4A12(66℃)有義CTGTGTCAGCATCCAAGGAGC，反義TTCACCTTTGCCAGCATGTAGBRCO1(60℃)有義CTTGCTCTGAGTCATCAGATG，反義CACAGAATATGAGCCATACAGTPX1(65℃)有義TTTTGTCTATGGTGTAGGACC，反義GGAATGGCAATGATGTTACAG製備隨機六鹼基引物啟動的cDNA和定量實時PCR採用實時PCR的方法定量LDHC表達。
採用ABI PRISM序列檢測系統(PE Biosystems，USA)的定量實時PCR的原理是利用Taq DNA聚合酶的5』-3』外切酶活性並通過螢光報告染料的釋放而直接且特異性地檢測PCR產物。除有義和反義引物外，所述PCR採用與PCR產物序列雜交的雙螢光標記的探針(TaqMan探針)。該探針的5』用報告染料(例如FAM)標記而在3』用淬滅染料(例如TAMRA)標記。如果探針是完整的，報告染料向淬滅染料的空間接近抑制報告染料螢光的發射。如果探針與PCR產物在PCR過程中雜交，所述探針被TaqDNA聚合酶的5』-3』外切酶活性剪切從而去除了對報告染料螢光的抑制。報告染料螢光的增加作為靶擴增的結果而在每個PCR循環後檢測並用於定量。靶基因的表達進行絕對定量，或相對於在進行試驗的組織中穩定表達的對照基因的表達進行定量。將所述樣品作為所謂的「管家」基因而標準化為18s RNA後，採用ΔΔ-Ct法(PE Biosystems，USA)計算LDHC表達。該反應在雙份混合液中進行並成雙測定。使用高容量cDMA庫試劑合(PE Biosystems，USA)和6鹼基引物並根據廠商說明合成cDNA。在各情況中，將5μl稀釋的cDNA用於總體積為25μl的PCR有義引物(GGTGTCACTTCTGTGCCTTCCT)300nM；反義引物(CGGCACCAGTTCCAACAATAG)300nM；TaqMan探針(CAAAGGTTCTCCAAATGT)250nM；有義引物18s RNA 50nM；反義引物18s RNA 50nM；18s RNA樣品250nM；12.5μl TaqMan UniversalPCR Master Mix；初始變性95℃(10分鐘)；95℃(15秒)；60℃(1分鐘)；40個循環。通過超出外顯子1和外顯子2的範圍之外的128bp產物的擴增而將所述全部LDHC剪接變體均包括於定量中。
克隆和序列分析採用普通方法克隆全長基因或基因片段。通過採用校正聚合酶pfu(Stratagene)擴增相應抗原以確定所述序列。在PCR結束後，用HotStarTaq DNA聚合酶的方法將腺苷連接至擴增子的末端以便按照廠商說明將片段克隆至TOPO-TA載體。採用商業測序。採用一般預測程序和算法分析序列。
實施例1新腫瘤抗原LDH C的鑑定LDH C(SEQ ID NO1)和其翻譯產物(SEQ ID NO6)已被描述為乳酸脫氫酶家族的睪丸特異性同工酶。在GenBank中以登錄號NM_017448公開了該序列。該酶形成分子量為140kDa的同源四聚體(Goldberg，E.et al.，Contraception 64(2)93-8，2001；Cookeret al.，Biol.Reprod.48(6)1309-19，1993；Gupta，G.S.，Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.34(6)361-85，1999)。
採用RT-PCR試驗進行表達分析，其中使用引物對(5』-TGCCGTAGGCATGGCTTGTGC-3』，5』-CAACATCTGAGACACCATTCC-3』)，所述引物對不會交叉擴增相關的和遍在表達的同工酶LDH A和LDH B，且以先前被描述為具有睪丸特異性的LDH C原型序列NM_017448為基礎，RT-PCR證實了根據本發明在全部受試的正常組織中無表達，而證明了在於腫瘤的情況下獲取的體細胞中消除了該抗原的嚴謹的轉錄抑制；參照表1。正如關於CT基因的經典描述，LDH C在很多腫瘤體中表達。
表1.LDHC在腫瘤中的表達
採用上述PCR引物，擴增產物的預期大小是824bp。然而，根據本發明，在腫瘤中觀察到多個額外條帶的擴增，而在睪丸中則未觀測到。由於這表示存在著選擇性剪接變體，故採用LDH-C特異性引物(5』-TAGCGCCTCAACTGTCGTTGG-3』，5』-CAACATCTGAGACACCATTCC-3』)擴增完整開放閱讀框，並對獨立全長克隆進行測序。所述LDH C序列的原型ORF(SEQ ID NO1)和染色體11上的基因組序列的比對分析證實其它剪接變體(SEQ ID NO2-5)。選擇性剪接結果導致外顯子3(SEQID NO2)、兩個外顯子3和4(SEQ ID NO3)、外顯子3、6和7(SEQ ID NO4)或外顯子7(SEQ ID NO5)的缺失(參照圖.2)。
這些新剪接變體僅在腫瘤中產生，而不在睪丸中產生。選擇性剪接引起閱讀框的改變，從而導致編碼SEQ ID NO7-13中所示胺基酸序列的新的可能ORF(SEQ ID NO7的ORFSEQ ID NO2或SEQ ID NO4的59-214位核苷酸；SEQ ID NO8的ORFSEQ ID NO2的289-939位核苷酸；SEQ ID NO9的ORFSEQ ID NO3的59-196位核苷酸；SEQ ID NO10的ORFSEQ ID NO3的535-765位核苷酸；SEQID NO11的ORFSEQ ID NO4的289-618位核苷酸；SEQ ID NO12的ORFSEQ ID NO4的497-697位核苷酸；SEQ ID NO13的ORFSEQ ID NO5的59-784位核苷酸)(圖.2，3)。除過早終止外，使用選擇性起始密碼子也是可行的，因此所編碼的蛋白質可能同時在N-末端和C-末端被截斷。
SEQ ID NO8和SEQ ID NO10顯示了原型蛋白質的截斷部分，SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12和SEQID NO13的蛋白質序列也被改變，並僅包含腫瘤特異性表位(圖.3中粗體字顯示)。能導致腫瘤特異性表位的肽區如下述(由移碼形成的嚴格的腫瘤特異性部分用下劃線標出)SEQ ID NO14GAVGMACAISILLKITVYLQTPE(來自SEQ ID NO7)SEQ ID NO15GAVGMACAISILLKWIF(來自SEQ ID NO9)SEQ ID NO16GWIIGEHGDSSGIIWNKRRTLSQYPLCLGAEWCLRCCEN(來自SEQ ID NO11)SEQ ID NO17MVGLLENMVILVGLYGIKEELFL(來自SEQ ID NO12)SEQ ID NO18EHWKNIHKQVIQRDYME(來自SEQ ID NO13)這些區可潛在地包含能被T淋巴細胞在MHC I或MHC II分子上所識別並導致嚴格的腫瘤特異性反應的表位。
並非所有預測的蛋白質都具有用於丙酮酸至乳酸的NADH依賴性代謝的催化性乳酸脫氫酶結構域，所述代謝是無氧糖酵解的最後一步。該結構域(圖.3中用方框標出)應對於作為乳酸脫氫酶的酶功能是必需的。進一步的分析，例如採用算法如TMpred和pSORT(Nakai Kanehisa，1992)，預測了推定蛋白質的不同亞細胞定位。
根據本發明，表達水平通過使用特異性引物-樣品組的實時PCR進行定量。擴增子存在於外顯子1和外顯子2間的連接處並由此檢測全部變體(SEQ ID NO1-5)。這些試驗也未在除睪丸外的正常組織中檢測到任何轉錄本。它們證實了在腫瘤中顯著的表達水平(圖.4)。
根據本發明通過從最遠N-末端區MSTVKEQLIEKLIEDDENSQ(SEQ IDNO80)選擇肽而製備LDHC特異性多克隆抗體。藉助於該肽在兔子中製備LDHC特異性抗體。對蛋白質表達的後續試驗證實了LDHC在睪丸和多種腫瘤中的選擇性表達。另外，按照本發明的免疫組織化學試驗揭示了LDHC和細胞色素C氧化酶在線粒體中的顯著的共區域化。這顯示出LDHC在腫瘤的呼吸鏈中發揮重要作用。
實施例2新腫瘤抗原TPTE的鑑定TPTE轉錄本序列(SEQ ID NO19)和其翻譯產物序列(SEQ ID NO22)已公開於GenBank中，其登錄號為NM_013315(Walker，S.M.etal.，Biochem.J.360(Pt 2)277-83，2001；Guipponi M.et al.，Hum.Genet.107(2)127-31，2000；Chen H.et al.，Hum.Genet.105(5)399-409，1999)。TPTE已被描述為編碼可能的跨膜酪氨酸磷酸酶的基因，其睪丸特異性表達位於染色體21、13、15、22和Y的著絲粒周圍區域(Chen，H.et al.，Hum.Genet.105399-409，1999)。按照本發明的對比研究還揭示了染色體3和7上的同源基因組序列。
根據本發明，根據TPTE序列(SEQ ID NO19)製備PCR引物(5』-TGGATGTCACTCTCATCCTTG-3』和5』-CCATAGTTCCTGTTCTATCTG-3』)並用於多種人類組織中的RT-PCR分析(95℃15分鐘；94℃1分鐘；63℃1分鐘；72℃1分鐘；35個循環)。正常組織中表達的發現僅限於睪丸中。如對其它eCT所述，根據本發明TPTE變體顯示出在多種腫瘤組織中被異位激活；參照表2。根據本發明，鑑定了在睪丸組織和腫瘤中表達的且具有移碼並因此具有改變的序列區的其它TPTE剪接變體(SEQID NO20、SEQ ID NO21、SEQ ID NO54、SEQ ID NO55、SEQ IDNO56、SEQ ID NO57)(圖.5)。
表2.TPTE在腫瘤中的表達
TPTE基因組序列包括24個外顯子(登錄號NT_029430)。SEQ IDNO19中所描述的轉錄本包括所有這些外顯子。SEQ ID NO20中所描述的剪接變體通過剪除外顯子7製備。SEQ ID NO21中所描述的剪接變體顯示了外顯子15下遊內含子的部分摻入。如變體SEQ ID NO54、SEQ ID NO55、SEQ ID NO56、SEQ ID NO57所示，還可能選擇性地剪接掉外顯子18、19、20和21。
這些選擇性剪接結果導致所編碼蛋白質的改變，而基本上保留了閱讀框(圖.6)。例如，由SEQ ID NO20中所述序列編碼的翻譯產物(SEQID NO23)與SEQ ID NO22中所述序列相比缺失了13個胺基酸。由SEQ ID NO21中所述序列編碼的翻譯產物(SEQ ID NO24)在分子中心區含有額外的插入並由此與其它變體存在14個胺基酸左右的不同。
變體SEQ ID NO54、SEQ ID NO55、SEQ ID NO56、SEQ ID NO57的翻譯產物即蛋白質SEQ ID NO58、SEQ ID NO59、SEQ ID NO60、SEQ ID NO61同樣被改變。
對於功能區域的預測的分析顯示了對於SEQ ID NO22、SEQ ID NO23、SEQ ID NO24、SEQ ID NO58、SED ID NO60存在而對於SEQ IDNO59，SEQ ID NO61不存在酪氨酸磷酸酶結構域。對所有變體，預測了3-4個跨膜區(圖.6)。
採用特異性抗體對TPTE抗原表達的分析證實了在睪丸和多種腫瘤中的選擇性表達。共區域化實驗還揭示了根據本發明TPTE與I類免疫球蛋白一起位於腫瘤細胞表面。以前，TPTE僅被描述為高爾基體-相關蛋白質。由於TPTE在腫瘤細胞表面的表達，該腫瘤抗原根據本發明適於作為用於形成診斷性和治療性單克隆抗體的重要的靶位。由於預測的TPTE的膜拓撲學，故根據本發明胞外暴露區特別適於本目的。根據本發明，其包括肽FTDSKLYIPLEYRS(SEQ ID NO81)和FDIKLLRNIPRWT(SEQ ID NO82)。另外，TPTE顯示出促進腫瘤細胞的遷移。為實現該目的，用「Boyden chamber」遷移試驗對在真核啟動子的控制下用TPTE轉染的腫瘤細胞和對照細胞進行研究，以便確定它們是否表現出定向遷移。此處TPTE轉染的細胞根據本發明在4個獨立試驗中顯著地(3倍)增加了遷移。這些功能性數據顯示出TPTE在腫瘤轉移中發揮重要作用。因此，根據本發明抑制腫瘤細胞中內源TPTE活性的方法，例如通過採用表達載體或逆轉錄病毒而使用反義RNA、不同的RNA幹擾(RNAi)方法以及通過使用小分子，可導致轉移的降低，因此在治療上具有非常重要的意義。最近對酪氨酸磷酸酶PTEN建立了腫瘤中磷酸酶活性和轉移的增加和轉移灶形成的增加間的因果關係(Iijima和Devreotes，Cell 109599-610，2002)。
實施例3新腫瘤抗原TSBP的鑑定根據本發明使用的電子克隆方法生成TSBP(SEQ ID NO29)和來源於其的蛋白質(SEQ ID NO30)。該基因先前被描述為是睪丸特異性調節的(登錄號NM_006781)。該基因被預測為編碼鹼性蛋白質並位於染色體6上靠近編碼MHC複合物的序列(C60rf10)的位置(StammersM.et al.，Immunogenetics 51(4-5)373-82，2000)。根據本發明，前述序列是不正確的。本發明的序列明顯不同於已知序列。根據本發明，克隆3個不同的剪接變體。圖7中描述了根據本發明發現的TSBP變體的核苷酸序列(SEQ ID NO31，SEQ ID NO32，SEQ ID NO33)與已知序列(NM_006781，SEQ ID NO29)的差異(差異用粗體字顯示)。其導致移碼因此由根據本發明發現的TSBP變體所編碼的蛋白質(SEQ IDNO34，SEQ ID NO35，SEQ ID NO36)基本上不同於前述蛋白質(SEQID NO30)(圖.8)。
根據本發明，證實了該抗原在正常組織中是嚴格轉錄抑制的(PCR引物5』-TCTAGCACTGTCTCGATCAAG-3』和5』-TGTCCTCTTGGTACATCTGAC-3』)。然而，在所研究的25個正常組織中，除了睪丸外，TSBP還在正常淋巴結組織中表達。根據本發明，在腫瘤中還檢測到TSBP的異位激活，因此其能夠作為腫瘤標記物或腫瘤相關抗原(表3)。
雖然在原發腫瘤組織中發現TSBP表達，但在相應腫瘤體的永久細胞系中未發現表達。而且，所述基因直接與Notch 4相鄰，所述Notch4在動脈中特異性表達並與血管形成相關。這些明顯地提示所述基因可作為特異性內皮細胞地標記物。因此，TSBP可作為腫瘤內皮和新生血管靶向的潛在性標記物。
因此，所述TSBP啟動子可克隆至另一需要在淋巴結中的選擇性表達的基因產物。
採用特異性抗體的TSBP抗原表達的分析證實了所述蛋白質在睪丸和淋巴結中以及在黑素瘤和支氣管癌中的選擇性定位。另外，使用GFP標記的TSBP的免疫組織學研究揭示了顯著的核周的積累。
表3.TSBP在腫瘤中的表達
實施例4新腫瘤抗原MS4A12的鑑定MS4A12(SEQ ID NO37，登錄號NM_017716)和其翻譯產物(SEQID NO38)先前被描述為與B細胞特異性抗原CD20、造血細胞特異性蛋白質HTm4和高親和性IgE受體的β鏈有關的多基因家族成員。所有家族成員的特徵在於其至少四個潛在跨膜區以及C末端和N末端均是細胞質的(Liang Y.et al.，Immunogenetics 53(5)357-68，2001；Liang Y. Tedder，Genomics 72(2)119-27，2001)。根據本發明，對MS4A12實施RT-PCR實驗。根據公開的MS4A12序列(NM_017716)選擇引物(有義CTGTGTCAGCATCCAAGGAGC，反義TTCACCTTTGCCAGCATGTAG)。在所檢測的組織中，僅在睪丸、結腸(6/8)和結腸直腸癌(colon-Ca’s)(16/20)中以及在結腸轉移灶(12/15)中檢測到表達(圖.9)。
結腸轉移灶中的高生成率使得TSBP可作為有意義的診斷靶位和治療靶位。根據本發明，包含蛋白質序列GVAGQDYWAVLSGKG(SEQ ID NO83)的預測的細胞外區特別適於產生單克隆抗體和小化學抑制劑。根據本發明，在細胞膜上的MS4A1 2蛋白質的細胞內定位還通過使用質膜標記物而在共聚焦免疫螢光法中的螢光疊加得以證實。
表4.MS4A12在正常組織中和結腸直腸癌和轉移中的表達
因此，MS4A12是正常結腸上皮的位於細胞膜的分化抗原，其還在結腸直腸腫瘤和轉移中表達。
實施例5新腫瘤抗原BRCO1的鑑定先前沒有關於BRCO1和其翻譯產物的描述。本發明的數據挖掘方法生成EST(已表達序列標誌)AI668620。實施採用特異性引物(有義CTTGCTCTGAGTCATCAGATG，反義CACAGAATATGAGCCATACAG)的RT-PCR研究用於表達分析。根據本發明，在睪丸組織中且還在正常乳腺中發現特異性表達(表5)。在所有其它組織中，該抗原在轉錄上受抑制。該現象同樣在乳腺腫瘤發現(20/20)。與在正常乳腺組織中的表達相比，BRCO1在乳腺腫瘤中明顯過表達(圖.10)。
採用EST重疊群(摻入下述ESTAW137203、BF327792、BF327797、BE069044、BF330665)，通過電子全長克隆根據本發明克隆超過1500bp的該轉錄本(SEQ ID NO39)。該序列繪圖於染色體10p11-12。在該相同區中，在直接靠近的位置，乳腺分化抗厚NY-BR-1的基因在這之前已經被公開(NM_052997；Jager，D.et al.，Cancer Res.61(5)2055-61，2001)。
表5.BRCO1在正常組織和乳腺腫瘤中的表達
配對研究(乳癌和鄰近正常組織)顯示出與正常組織相比BRCO1在70％的乳癌中過表達。
因此，BRCO1是一種新的正常乳腺上皮的分化抗原，其在乳腺腫瘤中過表達。
實施例6新腫瘤抗原TPX1的鑑定TPX1的序列(登錄號NM 003296；SEQ ID NO40)和其翻譯產物的序列(SEQ ID NO41)是已知的。該抗原先前被描述為僅具有睪丸特異性，其是精子的外周纖維和頂體的元件。以前，將粘附分子在精子與支持細胞的附著中的作用歸功於所述抗原(o』Bryan，M.K.et al.，Mol.Reprod.Dev.58(1)116-25，2001；Maeda，T.et al.，Dev.Growth Differ.41(6)715-22，1999)。本發明首次揭示了，TPX1在實體腫瘤中的異常表達(表6)。由於TPX1和嗜中性粒細胞特異性基質糖蛋白SGP 28間顯著的胺基酸同源性(Kjeldsen et al.，FEBS Lett380246-259，1996)，含有肽SREVTTNAQR(SEQ ID NO84)的TPX1特異性蛋白質序列根據本發明適於製備診斷性和治療性分子。
表6.TPX1在腫瘤中的表達
實施例7新腫瘤基因產物BRCO2的鑑定先前沒有關於BROC2和其翻譯產物的描述。本發明的方法生成EST(已表達序列標誌)BE069341、BF330573和AA601511。實施採用特異性引物(有義AGACATGGCTCAGATGTGCAG，反義GGAAATTAGCAAGGCTCTCGC)的RT-PCR研究而用於表達分析。根據本發明，在睪丸組織中且還在正常乳腺中發現了特異性表達(表7)。在全部其它組織中，該基因產物在轉錄上受抑制。其同樣在乳腺腫瘤中檢測到。使用EST重疊群(摻入下述ESTBF330573、AL044891和AA601511)，通過電子全長克隆根據本發明克隆1300bp的該轉錄本(SEQ ID 62)。該序列繪圖於染色體10p11-12。在該相同區中，在直接靠近的位置，乳腺分化基因產物NY-BR-1的基因在這之前已經被公開(NM 052997；Jager，D.et al.，Cancer Res.61(5)2055-61，2001)，而實施例6中的上述BRCO1位於此處。更進一步的基因分析揭示出根據本發明SEQ ID NO62所列的序列代表NY-BR-1基因的3』端非翻譯區，這之前沒有公開過該序列。
表7.BRCO2在正常組織和乳腺腫瘤中的表達
BRCO2是一種正常乳腺上皮的新的分化基因產物，其還在乳腺腫瘤中表達。
實施例8新腫瘤基因產物PCSC的鑑定先前沒有關於PCSC(SEQ ID NO63)和其翻譯產物的描述。本發明的數據挖掘方法生成EST(已表達序列標誌)BF064073。實施使用特異性引物(有義TCAGGTATTCCCTGCTCTTAC，反義TGGGCAATTCTCTCAGGCTTG)的RT-PCR研究用於表達分析。根據本發明，在正常結腸和結腸癌中檢測到特異性表達(表5)。在全部其它組織中，該基因產物在轉錄上受到抑制。PCSC編碼兩個推定的ORF(SEQ ID 64和SEQ ID 65)。SEQ ID 64的序列分析揭示了與CXC細胞因子的結構同源性。此外，克隆了4個選擇性PCSC cDNA片段(SEQ ID NO85-88)。在此，根據本發明，每個cDNA均包含3個編碼SEQ ID NO89-100中所示多肽的推定的ORF。
表8PCSC在正常組織和結腸直腸癌中的表達
故此，PCSC是正常結腸上皮的分化抗原，其也在結腸直腸腫瘤和全部所研究的結腸轉移中表達。根據本發明，在全部結腸直腸轉移灶中檢測到PCSC的表達使得該腫瘤抗原成為用於轉移性結腸腫瘤的預防和治療的非常令人感興趣的靶。
實施例9新腫瘤抗原SGY-1的鑑定
SGY-1轉錄本的序列(SEQ ID NO70)和其翻譯產物的序列(SEQID NO71)已公開於GenBank中，其登錄號是AF177398(Krupnik etal.，Gene 238，301-313，1999)。Soggy-1先前被描述為能作為Wnt蛋白家族的抑制劑和拮抗劑的Dickkopf蛋白家族成員。而該Wnt蛋白質依次在胚胎發育中發揮重要功能。根據SGY-1的序列(SEQ ID NO70)，根據本發明製備PCR引物(5』-CTCCTATCCATGATGCTGACG-3』和5』-CCTGAGGATGTACAGTAAGTG-3』)，並用於多種人類組織中的RT-PCR分析(95℃15分鐘；94℃1分鐘；63℃1分鐘；72℃1分鐘；35個循環)。顯示為正常組織中的表達僅限於睪丸。如對其它eCT所述，根據本發明SGY-1顯示出在多種腫瘤組織中被異位激活；參照表9。
表9.腫瘤中SGY-1的表達
實施例10新腫瘤抗原MORC的鑑定MORC轉錄本的序列(SEQ ID NO74)和其翻譯產物的序列(SEQ IDNO75)已公開於GenBank中，其登錄號為XM_037008(Inoue et al.，Hum Mol Gene t.Jul；8(7)1201-7，1999)。
MORC最先被描述為參與精子生成。小鼠系統中該蛋白質的突變導致生殖腺發育不全。
根據MORC的序列(SEQ ID NO74)，根據本發明製備PCR引物(5』-CTGAGTATCAGCTACCATCAG-3』和5』-TCTGTAGTCCTTCACATATCG-3』)並用於多種人類組織中的RT-PCR分析(95℃15分鐘；94℃1分鐘；63℃1分鐘；72℃1分鐘；35個循環)。顯示為正常組織中的表達僅限於睪丸。如對其它eCT所述，根據本發明MORC顯示出在多種腫瘤組織中被異位激活參照表10。
表10.腫瘤中MORC的表達
序列表110Sahin Dr.，UgurTüreci Dr.，OelemKoslowski Dr.，Michael120在腫瘤中差異表達的基因產物及其用途130342-3PCT160100170PatentIn version 3.121012111171212DNA213智人4001ctgtcgttgg tgtatttttc tggtgtcact tctgtgcctt ccttcaaagg ttctccaaat60gtcaactgtc aaggagcagc taattgagaa gctaattgag gatgatgaaa actcccagtg120taaaattact attgttggaa ctggtgccgt aggcatggct tgtgctatta gtatcttact180gaaggatttg gctgatgaac ttgcccttgt tgatgttgca ttggacaaac tgaagggaga240aatgatggat cttcagcatg gcagtctttt ctttagtact tcaaagatta cttctggaaa300agattacagt gtatctgcaa actccagaat agttattgtc acagcaggtg caaggcagca360ggagggagaa actcgccttg ccctggtcca acgtaatgtg gctataatga aatcaatcat420tcctgccata gtccattata gtcctgattg taaaattctt gttgtttcaa atccagtgga480tattttgaca tatatagtct ggaagataag tggcttacct gtaactcgtg taattggaag540tggttgtaat ctagactctg cccgtttccg ttacctaatt ggagaaaagt tgggtgtcca600ccccacaagc tgccatggtt ggattattgg agaacatggt gattctagtg tgcccttatg660gagtggggtg aatgttgctg gtgttgctct gaagactctg gaccctaaat taggaacgga720
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Gly Pro Ala Gly His Pro Pro Thr Met Val Gln Gly Pro Ala Gly Leu20 25 30Pro Leu Ala Met Ala Gln Val Thr His Pro Leu Val His Ile Thr Glu35 40 45Glu Val Glu Glu Asn Arg Thr Gln Asp Gly Lys Pro Glu Arg Ile Ala50 55 60Gln Leu Thr Trp Asn Glu Ala65 70
權利要求
1.一種藥物組合物，包含抑制腫瘤相關抗原的表達或活性的試劑，所述腫瘤相關抗原含有由選自下列的核酸所編碼的序列(a)包括選自SEQ ID NO1-5、19-21、29、31-33、37、39、40、54-57、62、63、70、74、85-88、其部分或其衍生物的核酸序列的核酸，(b)在嚴謹條件下與(a)的核酸雜交的核酸，(c)關於(a)或(b)的核酸的簡併核酸，和(d)與(a)、(b)或(c)的核酸互補的核酸。
2.一種藥物組合物，包含具有抑制腫瘤活性的試劑，該試劑具有對表達或異常表達腫瘤相關抗原的細胞的選擇性，所述腫瘤相關抗原含有由選自下列的核酸所編碼的序列(a)包括選自SEQ ID NO1-5、19-21、29、31-33、37、39、40、54-57、62、63、70、74、85-88、其部分或其衍生物的核酸序列的核酸，(b)在嚴謹條件下與(a)的核酸雜交的核酸，(c)關於(a)或(b)的核酸的簡併核酸，和(d)與(a)、(b)或(c)的核酸互補的核酸。
3.根據權利要求2的藥物組合物，其中所述試劑導致誘導細胞死亡、細胞生長降低、細胞膜的破壞或細胞因子的分泌。
4.根據權利要求1或2的藥物組合物，其中所述試劑是與編碼腫瘤相關抗原的核酸選擇性雜交的反義核酸。
5.根據權利要求1或2的藥物組合物，其中所述試劑是與腫瘤相關抗原選擇性結合的抗體。
6.根據權利要求2的藥物組合物，其中所述試劑是與腫瘤相關抗原選擇性結合的激活補體的抗體。
7.一種藥物組合物，包含在使用時選擇性增加HLA分子和腫瘤相關抗原或其部分間複合物的量的試劑，所述腫瘤相關抗原含有由一種核酸編碼的序列，所述核酸選自(a)包括選自SEQ ID NO1-5、19-21、29、31-33、37、39、40、54-57、62、63、70、74、85-88、其部分或其衍生物的核酸序列的核酸，(b)在嚴謹條件下與(a)的核酸雜交的核酸，(c)關於(a)或(b)的核酸的簡併核酸，和(d)與(a)、(b)或(c)的核酸互補的核酸。
8.根據權利要求7的藥物組合物，其中所述試劑包括一個或多個選自下列的組分(i)腫瘤相關抗原或其部分，(ii)編碼腫瘤相關抗原或其部分的核酸，(iii)編碼腫瘤相關抗原或其部分的宿主細胞，和(iv)分離的腫瘤相關抗原或其部分和HLA分子間的複合物。
9.根據權利要求1、2或7的藥物組合物，其中所述試劑包括多個試劑，這些試劑各選擇性抑制不同腫瘤相關抗原的表達或活性，並且各具有對表達不同腫瘤相關抗原的細胞的選擇性，或能提高HLA分子和不同腫瘤相關抗原或其部分間複合物的量，其中至少一個所述腫瘤相關抗原含有由選自下列的核酸所編碼的序列(a)包括選自SEQ ID NO1-5、19-21、29、31-33、37、39、40、54-57、62、63、70、74、85-88、其部分或其衍生物的核酸序列的核酸，(b)在嚴謹條件下與(a)的核酸雜交的核酸，(c)關於(a)或(b)的核酸的簡併核酸，和(d)與(a)、(b)或(c)的核酸互補的核酸。
10.一種藥物組合物，包括一個或多個選自下列的組分(i)腫瘤相關抗原或其部分，(ii)編碼腫瘤相關抗原或其部分的核酸，(iii)與腫瘤相關抗原或其部分結合的抗體，(iv)與編碼腫瘤相關抗原的核酸特異性雜交的反義核酸，(v)表達腫瘤相關抗原或其部分的宿主細胞，和(vi)分離的腫瘤相關抗原或其部分和HLA分子間的複合物，所述腫瘤相關抗原包含由選自下列的核酸所編碼的序列(a)包括選自SEQ ID NO1-5、19-21、29、31-33、37、39、40、54-57、62、63、70、74、85-88、其部分或其衍生物的核酸序列的核酸，(b)在嚴謹條件下與(a)的核酸雜交的核酸，(c)關於(a)或(b)的核酸的簡併核酸，和(d)與(a)、(b)或(c)的核酸互補的核酸。
11.根據權利要求8或10的藥物組合物，其中(ii)的核酸存在於表達載體中。
12.根據權利要求8或10的藥物組合物，其中(ii)的核酸功能性地連接於啟動子。
13.根據權利要求8或10的藥物組合物，其中所述宿主細胞分泌所述腫瘤相關抗原或其部分。
14.根據權利要求8或10的藥物組合物，其中所述宿主細胞還表達與腫瘤相關抗原或其部分結合的HLA分子。
15.根據權利要求14的藥物組合物，其中所述宿主細胞以重組方式表達所述HLA分子和/或所述腫瘤相關抗原或其部分。
16.根據權利要求14的藥物組合物，其中所述宿主細胞內源性表達HLA分子。
17.根據權利要求8、10、14或16的藥物組合物，其中宿主細胞是抗原遞呈細胞。
18.根據權利要求17的藥物組合物，其中抗原遞呈細胞是樹突細胞或巨噬細胞。
19.根據權利要求8、10和13-18中任一項的藥物組合物，其中宿主細胞具有非增殖性。
20.根據權利要求5或10的藥物組合物，其中抗體是單克隆抗體。
21.根據權利要求5或10的藥物組合物，其中抗體是嵌合抗體或人源化抗體。
22.根據權利要求5或10的藥物組合物，其中所述抗體是天然抗體的片段。
23.根據權利要求5或10的藥物組合物，其中所述抗體與治療劑或診斷劑偶聯。
24.根據權利要求4或10的藥物組合物，其中所述反義核酸包括來自編碼腫瘤相關抗原的核酸的6-50個連續核苷酸的序列。
25.根據權利要求8和10-13中任一項的藥物組合物，其中由所述藥物組合物提供的所述腫瘤相關抗原或其部分與表達異常量所述腫瘤相關抗原或其部分的細胞表面上的MHC分子結合。
26.根據權利要求25的藥物組合物，其中所述結合導致細胞溶解反應和/或誘導細胞因子釋放。
27.根據權利要求1-26中任一項的藥物組合物，還包括藥物學上可接受的載體和/或佐劑。
28.根據權利要求27的藥物組合物，其中所述佐劑是皂苷、GM-CSF、CpG、細胞因子或趨化因子。
29.根據權利要求1-28中任一項的藥物組合物，可用於治療特徵是表達或異常表達腫瘤相關抗原的疾病。
30.根據權利要求29的藥物組合物，其中所述疾病是癌症。
31.根據權利要求29的藥物組合物，其中所述疾病是肺腫瘤、乳腺腫瘤、前列腺腫瘤、黑素瘤、結腸腫瘤、結腸腫瘤轉移、腎細胞癌或宮頸癌、結腸癌或乳癌。
32.根據權利要求1-31中任一項的藥物組合物，其中所述腫瘤相關抗原包括選自SEQ ID NO6-13、14-18、22-24、30、34-36、38、41、58-61、64、65、71、75、80-84、89-100、其部分或其衍生物的胺基酸序列。
33.一種診斷疾病的方法，所述疾病的特徵是表達或異常表達腫瘤相關抗原，所述方法包括(i)檢測編碼腫瘤相關抗原或其部分的核酸，和/或(ii)檢測腫瘤相關抗原或其部分，和/或(iii)檢測針對腫瘤相關抗原的抗體或其部分和/或(iv)在分離自患者的生物樣品中檢測具有對腫瘤相關抗原或其部分特異性的細胞毒性T淋巴細胞或輔助T淋巴細胞，其中所述腫瘤相關抗原含有由選自下列的核酸所編碼的序列(a)包括選自SEQ ID NO1-5、19-21、29、31-33、37、39、40、54-57、62、63、70、74、85-88、其部分或其衍生物的核酸序列的核酸，(b)在嚴謹條件下與(a)的核酸雜交的核酸，(c)關於(a)或(b)的核酸的簡併核酸，和(d)與(a)、(b)或(c)的核酸互補的核酸。
34.根據權利要求33的方法，其中所述檢測包括(i)將生物樣品與試劑接觸，所述試劑特異性地與所述編碼腫瘤相關抗原的核酸或其部分、與所述腫瘤相關抗原或其部分、與所述抗體或者與細胞毒性T淋巴細胞或輔助T淋巴細胞結合，和(ii)檢測所述試劑和所述核酸或其部分、所述腫瘤相關抗原或其部分、所述抗體或者細胞毒性T淋巴細胞或輔助T淋巴細胞間複合物的形成。
35.根據權利要求33或34的方法，其中將所述檢測與在可比較的正常生物樣品中的檢測進行比較。
36.根據權利要求33-35中任一項的方法，其中疾病的特徵是表達或異常表達多個不同腫瘤相關抗原，和其中檢測包括檢測編碼所述多個不同腫瘤相關抗原的多個核酸或其部分，檢測多個不同腫瘤相關抗原或其部分，檢測與所述多個不同腫瘤相關抗原或其部分結合的多個抗體，或檢測具有對所述多個不同腫瘤相關抗原特異性的多個細胞毒性T淋巴細胞或輔助T淋巴細胞。
37.根據權利要求33-36中任一項的方法，其中採用與所述核酸或其部分特異性雜交的多核苷酸探針檢測所述核酸或其部分。
38.根據權利要求37的方法，其中所述多核苷酸探針包括來自編碼所述腫瘤相關抗原的核酸的6-50個連續核苷酸的序列。
39.根據權利要求33-36中任一項的方法，其中所述核酸或其部分通過選擇性擴增所述核酸或其所述部分進行檢測。
40.根據權利要求33-36中任一項的方法，其中待檢測的所述腫瘤相關抗原或其部分處於與MHC分子的複合物中。
41.根據權利要求40的方法，其中所述MHC分子是HLA分子。
42.根據權利要求33-36和40-41中任一項的方法，其中採用與所述腫瘤相關抗原或其部分特異性結合的抗體檢測所述腫瘤相關抗原或其部分。
43.根據權利要求33-36中任一項的方法，其中採用與所述抗體特異性結合的蛋白質或肽檢測所述抗體。
44.一種測定特徵是表達或異常表達腫瘤相關抗原的疾病的消退、進程或發病的方法，所述方法包括在來自患有所述疾病的患者或疑為患有所述疾病的患者的樣品中監測一個或多個選自下列的參數(i)編碼腫瘤相關抗原的核酸或其部分的量，(ii)腫瘤相關抗原或其部分的量，(iii)與腫瘤相關抗原或其部分特異性結合的抗體的量，和(iv)具有對腫瘤相關抗原或其部分和MHC分子間複合物的特異性的細胞溶解性或細胞因子釋放性T細胞的量，所述腫瘤相關抗原含有由選自下列的核酸所編碼的序列(a)包括選自SEQ ID NO1-5、19-21、29、31-33、37、39、40、54-57、62、63、70、74、85-88、其部分或其衍生物的核酸序列的核酸，(b)在嚴謹條件下與(a)的核酸雜交的核酸，(c)關於(a)或(b)的核酸的簡併核酸，和(d)與(a)、(b)或(c)的核酸互補的核酸。
45.根據權利要求44的方法，其包括在第一個樣品中於第一時間點和在另一樣品中於第二時間點測定所述參數，並且通過比較所述兩個樣品確定疾病的進程。
46.根據權利要求44或45的方法，其中所述疾病的特徵在於表達或異常表達多個不同腫瘤相關抗原，而且其中的監測包括監測(i)編碼所述多個不同腫瘤相關抗原的多個核酸或其部分的量，(ii)所述多個不同腫瘤相關抗原或其部分的量，(iii)與所述多個不同腫瘤相關抗原或其部分結合的多個抗體的量，和/或(iv)具有對所述多個不同腫瘤相關抗原或其部分和MHC分子間複合物特異性的多個細胞溶解性或細胞因子釋放性T細胞的量。
47.根據權利要求44-46中任一項的方法，其中使用與所述核酸或其所述部分特異性雜交的多核苷酸探針監測所述核酸或其部分的量。
48.根據權利要求47的方法，其中所述多核苷酸探針包括來自編碼所述腫瘤相關抗原的核酸的6-50個連續核苷酸的序列。
49.根據權利要求44-46中任一項的方法，其中通過選擇性擴增所述核酸或其所述部分監測所述核酸或其部分的量。
50.根據權利要求44-46中任一項的方法，其中採用與所述腫瘤相關抗原或其所述部分特異性結合的抗體監測腫瘤相關抗原或其部分的量。
51.根據權利要求44-46中任一項的方法，其中採用與所述抗體特異性結合的蛋白質或肽監測抗體的量。
52.根據權利要求44-46中任一項的方法，其中採用呈遞所述腫瘤相關抗原或其部分和MHC分子間複合物的細胞監測細胞溶解性或細胞因子釋放性T細胞的量。
53.根據權利要求37-38，42-43，47-48和50-52中任一項的方法，其中所述多核苷酸探針、所述抗體、所述蛋白質或肽或所述細胞用可檢測的方法進行標記。
54.根據權利要求53的方法，其中所述可檢測的標記物是放射性標記物或酶標記物。
55.根據權利要求33-54中任一項的方法，其中所述樣品包括體液和/或身體組織。
56.一種治療特徵是表達或異常表達腫瘤相關抗原的疾病的方法，該方法包括施用如權利要求1-32任一項的藥物組合物，其中所述腫瘤相關抗原含有由選自下列的核酸所編碼的序列(a)包括選自SEQ ID NO1-5、19-21、29、31-33、37、39、40、54-57、62、63、70、74、85-88、其部分或其衍生物的核酸序列的核酸，(b)在嚴謹條件下與(a)的核酸雜交的核酸，(c)關於(a)或(b)的核酸的簡併核酸，和(d)與(a)、(b)或(c)的核酸互補的核酸。
57.一種治療、診斷或監測特徵是表達或異常表達腫瘤相關抗原的疾病的方法，所述方法包括施用與所述腫瘤相關抗原或其部分結合的並與治療劑或診斷劑偶聯的抗體，所述腫瘤相關抗原含有由選自下列的核酸所編碼的序列(a)包括選自SEQ ID NO1-5、19-21、29、31-33、37、39、40、54-57、62、63、70、74、85-88、其部分或其衍生物的核酸序列的核酸，(b)在嚴謹條件下與(a)的核酸雜交的核酸，(c)關於(a)或(b)的核酸的簡併核酸，和(d)與(a)、(b)或(c)的核酸互補的核酸。
58.根據權利要求42、50或57的方法，其中抗體是單克隆抗體。
59.根據權利要求42、50或57的方法，其中抗體是嵌合抗體或人源化抗體。
60.根據權利要求42、50或57的方法，其中所述抗體是天然抗體的片段。
61.一種治療患有特徵是表達或異常表達腫瘤相關抗原的疾病的患者的方法，所述方法包括(i)從所述患者分離含有免疫反應細胞的樣品，(ii)在適於生成抗所述腫瘤相關抗原或其部分的細胞溶解性或細胞因子釋放性T細胞條件下，將所述樣品與表達所述腫瘤相關抗原或其部分的宿主細胞接觸，和(iii)將細胞溶解性或細胞因子釋放性T細胞以適於溶解表達腫瘤相關抗原或其部分的細胞的量導入所述患者，所述腫瘤相關抗原含有由選自下列的核酸所編碼的序列(a)包括選自SEQ ID NO1-5、19-21、29、31-33、37、39、40、54-57、62、63、70、74、85-88、其部分或其衍生物的核酸序列的核酸，(b)在嚴謹條件下與(a)的核酸雜交的核酸，(c)關於(a)或(b)的核酸的簡併核酸，和(d)與(a)、(b)或(c)的核酸互補的核酸。
62.根據權利要求61的方法，其中所述宿主細胞重組性表達與腫瘤相關抗原或其部分結合的HLA分子。
63.根據權利要求62的方法，其中所述宿主細胞內源性表達與腫瘤相關抗原或其部分結合的HLA分子。
64.一種治療患者的方法，所述患者患有特徵為表達或異常表達腫瘤相關抗原的疾病，所述方法包括(i)鑑定由與所述疾病相關的細胞表達的核酸，所述核酸選自(a)包括選自SEQ ID NO1-5、19-21、29、31-33、37、39、40、54-57、62、63、70、74、85-88、其部分或其衍生物的核酸序列的核酸，(b)在嚴謹條件下與(a)的核酸雜交的核酸，(c)關於(a)或(b)的核酸的簡併核酸，和(d)與(a)、(b)或(c)的核酸互補的核酸，(ii)用所述核酸或其部分轉染宿主細胞，(iii)培養轉染的宿主細胞以表達所述核酸，和(iv)將所述宿主細胞或其提取物以適於提高對與所述疾病相關的患者細胞的免疫反應的量導入所述患者。
65.根據權利要求64的方法，其還包括鑑定呈遞所述腫瘤相關抗原或其部分的MHC分子，其中所述宿主細胞表達經鑑定的MHC分子並呈遞所述腫瘤相關抗原或其部分。
66.根據權利要求的方法64或65，其中所述免疫應答包括B細胞反應或T細胞反應。
67.根據權利要求的方法66，其中所述免疫反應是T細胞反應，其包括生成具有與呈遞腫瘤相關抗原或其部分的所述宿主細胞或表達所述腫瘤相關抗原或其部分的患者細胞的特異性的細胞溶解性或細胞因子釋放性T細胞。
68.根據權利要求61～67中任一項的方法，其中所述宿主細胞具有非增殖性。
69.一種治療疾病的方法，所述疾病特徵為表達或異常表達腫瘤相關抗原，所述方法包括(i)鑑定來自患者的表達異常量的腫瘤相關抗原的細胞，(ii)分離所述細胞樣品(iii)培養所述細胞，和(iv)將所述細胞以適於引發對所述細胞的免疫反應的量導入所述患者，所述腫瘤相關抗原含有由選自下列的核酸所編碼的序列(a)包括選自SEQ ID NO1-5、19-21、29、31-33、37、39、40、54-57、62、63、70、74、85-88、其部分或其衍生物的核酸序列的核酸，(b)在嚴謹條件下與(a)的核酸雜交的核酸，(c)關於(a)或(b)的核酸的簡併核酸，和(d)與(a)、(b)或(c)的核酸互補的核酸。
70.根據權利要求33～69中任一項的方法，其中所述疾病是癌症。
71.一種抑制患者癌症發展的方法，所述方法包括施用有效量的根據權利要求1-32中任一項的藥物組合物。
72.根據權利要求33～71中任一項的方法，其中所述腫瘤相關抗原包括選自SEQ ID NO6-13、14-18、22-24、30、34-36、38、41、58-61、64、65、71、75、80-84、89-100、其部分或其衍生物的胺基酸序列。
73.一種核酸，選自(a)包括選自SEQ ID NO2-5，20-21，31-33，37，39，54-57，62，63，85-88，其部分或其衍生物的核酸序列的核酸，(b)在嚴謹條件下與(a)的核酸雜交的核酸，(c)關於(a)或(b)的核酸的簡併核酸，和(d)與(a)、(b)或(c)的核酸互補的核酸。
74.一種編碼包括選自SEQ ID NO7-13、14-18、23-24、34-36、58-61、64、65、89-100、其部分或其衍生物的胺基酸序列的蛋白質或多肽的核酸。
75.一種包括根據權利要求73或74的核酸的重組DNA或RNA分子。
76.根據權利要求75的重組DNA分子，其為載體。
77.根據權利要求76的重組DNA分子，其中所述載體為病毒載體或噬菌體。
78.根據權利要求75～77中任一項的重組DNA分子，還包括控制所述核酸表達的表達控制序列。
79.根據權利要求78的重組DNA分子，其中所述表達控制序列與所述核酸同源或異源。
80.一種宿主細胞，其包含根據權利要求73或74的核酸或根據權利要求75～79中任一項的重組DNA分子。
81.根據權利要求80的宿主細胞，還包含編碼HLA分子的核酸。
82.一種由根據權利要求73的核酸編碼的蛋白質或多肽。
83.一種蛋白質或多肽，其包含選自SEQ ID NO7-13、14-18、23-24、34-36、58-61、64、65、89-100、其部分或其衍生物的胺基酸序列。
84.根據權利要求82或83的蛋白質或多肽的免疫原性片段。
85.與人HLA受體或人抗體結合的根據權利要求82或83的蛋白質或多肽的片段。
86.一種與蛋白質或多肽或其部分特異性結合的試劑，所述蛋白質或多肽由選自下列的核酸編碼(a)包括選自SEQ ID NO1-5、19-21、29、31-33、37、39、40、54-57、62、63、70、74、85-88、其部分或其衍生物的核酸序列的核酸，(b)在嚴謹條件下與(a)的核酸雜交的核酸，(c)關於(a)或(b)的核酸的簡併核酸，和(d)與(a)、(b)或(c)的核酸互補的核酸。
87.根據權利要求86的試劑，其中所述蛋白質或多肽包括選自SEQID NO6-13、14-18、22-24、30、34-36、38、41、58-61、64、65、71、75、80-84、89-100、其部分或其衍生物的胺基酸序列。
88.根據權利要求86或87的試劑，其為抗體。
89.根據權利要求88的試劑，其中抗體是單克隆抗體、嵌合抗體或人源化抗體或者抗體的片段。
90.一種與由下列組分構成的複合物選擇性結合的抗體(i)蛋白質或多肽或其部分和(ii)與所述蛋白質或多肽或其所述部分結合的MHC分子，其中所述抗體不與(i)或(ii)單獨結合，和所述蛋白質或多肽由選自下列的核酸所編碼(a)包括選自SEQ ID NO1-5、19-21、29、31-33、37、39、40、54-57、62、63、70、74、85-88、其部分或其衍生物的核酸序列的核酸，(b)在嚴謹條件下與(a)的核酸雜交的核酸，(c)關於(a)或(b)的核酸的簡併核酸，和(d)與(a)、(b)或(c)的核酸互補的核酸。
91.根據權利要求90的抗體，其中所述蛋白質或多肽包含選自SEQID NO6-13、14-18、22-24、30、34-36、38、41、58-61、64、65、71、75、80-84、89-100、其部分或其衍生物的胺基酸序列。
92.根據權利要求90或91的抗體，所述抗體是單克隆抗體、嵌合抗體或人源化抗體或抗體的片段。
93.一種根據權利要求86-89中任一項的試劑或根據權利要求90-92中任一項的抗體和治療劑或診斷劑間的偶聯物。
94.根據權利要求93的偶聯物，其中所述治療劑或診斷劑是毒素。
95.一種檢測腫瘤相關抗原表達或異常表達的試劑盒，所述試劑盒包括用於下列檢測的試劑(i)檢測編碼所述腫瘤相關抗原的核酸或其部分，(ii)檢測所述腫瘤相關抗原或其部分，(iii)檢測與所述腫瘤相關抗原或其部分結合的抗體，和/或(iv)檢測具有對所述腫瘤相關抗原或其部分和MHC分子間複合物特異性的T細胞，所述腫瘤相關抗原含有由選自下列的核酸所編碼的序列(a)包括選自SEQ ID NO1-5、19-21、29、31-33、37、39、40、54-57、62、63、70、74、85-88、其部分或其衍生物的核酸序列的核酸，(b)在嚴謹條件下與(a)的核酸雜交的核酸，(c)關於(a)或(b)的核酸的簡併核酸，和(d)與(a)、(b)或(c)的核酸互補的核酸。
96.根據權利要求95的試劑盒，其中用於監測編碼所述腫瘤相關抗原的核酸，或其部分的所述試劑是用於選擇性擴增所述核酸的核酸分子。
97.根據權利要求96的試劑盒，其中用於選擇性擴增所述核酸的所述核酸分子包括來自編碼所述腫瘤相關抗原的核酸的6-50個連續核苷酸的序列。
98.一種重組DNA分子，其包含源自選自SEQ ID NO1-5、19-21、29、31-33、37、39、40、54-57、62、63、70、74、85-88的核酸序列的啟動子區。
99.一種藥物組合物，包含抑制腫瘤抗原TPTE SEQ ID NO19、22的表達或活性的試劑。
100.一種藥物組合物，包含抑制TPTE的遷移活性和轉移活性的試劑。
101.根據權利要求99或100的試劑，其是抗體。
102.根據權利要求101的試劑，其中抗體是單克隆抗體、嵌合抗體或人源化抗體或者抗體的片段。
103.一種與包含序列SEQ ID NO81-82的細胞外蛋白質區結合的抗體。
104.根據權利要求99或100的試劑，其是與編碼TPTE的核酸選擇性雜交的反義核酸。
105.根據權利要求104的試劑，其中所述反義核酸包括來自編碼TPTE的核酸的6-50個連續核苷酸的序列。
106.根據權利要求99或100的試劑，其是RNA幹擾(RNAi)。
107.根據權利要求106的試劑，其中RNAi含有所謂的「短髮夾」結構(shRNA)。
108.根據權利要求107的試劑，其中shRNA由用表達載體轉染後的轉錄形成。
109.根據權利要求107的試劑，其中shRNA由逆轉錄病毒的轉錄形成。
110.根據權利要求107的試劑，其中shRNA由慢病毒系統介導。
111.根據權利要求99或100的試劑，其是小化學分子。
112.根據權利要求111的試劑，其中所述小化學分子與TPTE結合。
113.根據權利要求112的試劑，其中所述小化學分子與包含SEQ IDNO81-82的細胞外區結合。
114.一種治療、診斷或監測特徵是表達或異常表達TPTE的轉移性腫瘤的方法，所述方法包括施用結合TPTE或其部分的並與治療劑或診斷劑偶聯的抗體，所述TPTE含有由選自下列的核酸所編碼的序列(a)選自含有SEQ ID NO19，其部分或其衍生物的核酸序列的核酸，(b)在嚴謹條件下與(a)的核酸雜交的核酸，(c)關於(a)或(b)的核酸的簡併核酸，和(d)與(a)、(b)或(c)的核酸互補的核酸。
115.根據權利要求114的方法，其中抗體是單克隆抗體。
116.根據權利要求114的方法，其中抗體是嵌合抗體或人源化抗體。
117.根據權利要求114的方法，其中抗體是天然抗體的片段。
全文摘要
本發明涉及鑑定具有與腫瘤相關性表達的基因產物和編碼其的核酸。本發明涉及治療和診斷疾病的方法，所述具有與腫瘤相關性表達的基因產物在所述疾病中異常表達。本發明還涉及具有與腫瘤相關性表達的蛋白質、多肽和肽以及編碼其的核酸。
文檔編號A61K48/00GK1646692SQ03807493
公開日2005年7月27日 申請日期2003年3月12日 優先權日2002年3月13日
發明者U·薩因, O·圖裡斯, M·科斯洛斯基 申請人:加尼梅德醫藥品有限公司