哺乳類動物的臟器保存方法

2023-04-28 07:50:11

專利名稱：哺乳類動物的臟器保存方法
技術領域：
本發明涉及在生物體外長期保存哺乳類動物的臟器的技術。
背景技術：
人類的肺、心臟、肝臟、腎臟、胰腺等臟器的臨床移植治療早已被實用化、日常化，但相對於每年增加的等待移植的患者的捐贈者不足的問題非常嚴重，等待手術的時間延長了。另外，即使臟器移植的捐贈者出現了，目前的狀況是像血液這樣長期保存或者供給體制的配備不充分。
特別是在移植臟器方面，低溫保存是主流，對臟器移植的有效的保存時間的界限是保存約4～24小時(Cooper JD，Patterson GA，Trulock EPet all；J.Thorac.Cardiovasc.Surg.107，460-471，1994)。
在實際使用University of Winsconsin Solution液(UWS液)進行的大鼠、兔子、狒狒的摘出心臟的低溫保存和再生中，限度為6～18小時(Makowka I，Zerbe TR，Champman F，et all；Transplant Proc.21，1350，1989 and Yen T，Hanan SA，Johson DE，et all；Ann.Thorac.Surg.49，932，1990)。
另外，組合使用該UWS液和全氟化碳介質保存大鼠的心臟並移植成功，為24小時(5隻全部)到48小時(5隻中的4隻)(Kuroda Y，KawamuraT，Tanioka T，et all；Transplantation，59，699-701，1995)。該理由的根據在於摘出的心臟一旦暴露在4℃的低溫或者受到缺血傷害，則細胞膜受到損傷，因此組織細胞不能再生(Pegg DE；Organ presevation.Surg，Clin.Notth Am.66，617，1986OzMC，Pinsky DJ，Koga S，et all；Circulation 88，291-297，1993and Heffner JE，Pepine JERev.Pespir.Dis.140，531-554，1989)。
哺乳動物的活體組織的長期保存·再生的技術一直只在血液、精子、卵子等單細胞方面進行開發。有關作為細胞的集合的組織或者由若干個組織構成的臟器的低溫保存，也正在朝實用化進行，總之，目前的狀況是必須在最大24小時以內進行移植(Kalayoglu M，Sollinger HW，Strarra RJ，et all；Lancet，2，617，1988)。
附帶說一下，海藻糖是在自然界廣泛分布的非還原性的二糖類，據報導在各種應激下，對細胞膜構造具有穩定化或保護的作用(Crowe JH，CroweLM，Chapman D；Science 233，701-703，1984 and Wiemken A；Ant inei VanLeeunwenhoek.58，209-217，1990)。據報導，心臟一旦暴露在4℃的低溫或者受到缺血傷害，海藻糖就會對細胞膜顯示出保護作用(Stringham JC，Southhard JH，Hegge J，et all；Transplantation，58，287-294，1992and Hirata T，Fukuse T，Liu CJ，et all；Surgery，115，102-107，1994)。另外，據報導，在緩步類動物的高靜水壓實驗中，一旦成為無水狀態，則海藻糖增大10倍(Crowe JH，Crowe LM，Chapman D；Science 233，701-703，1984 and Crowe JH，Crowe LM，Chapman D，Aurell Wistorm C；Biochemical Journal，242，1-10，1987)。該緩步類動物由約40000個細胞構成，是也具有神經細胞的多細胞生物。
本發明人發現了乾燥狀態的緩步類動物等在全氟化碳液中，可以耐受所謂極限為600Mpa這樣的高水壓環境的負荷，保持著生命力(KunihiroSeki et al；Nature Vol.395，No.6705，pp.853-854，29 Oct.1998，和特開平11-289917號；該內容引入本說明書中，作為參考)。緩步類動物的乾燥狀態通過大桶狀態或酒桶狀態形成。其生理機理雖然不十分明了，但可知緩步類動物的體內的水分量極端減少，成為脫水狀態。
上述以往的臟器的冷藏保存是通過降低臟器的溫度，使其代謝功能降低，從而維持其生存狀態。通過溫度降低，雖然代謝功能降低了，但在作為極性介質的水分中存在豐富的離子，它們成了隨著時間流逝引起細胞的自崩潰、細胞死亡、壞死(Necrosis)的原因。
因而，冷藏保存的保存時間越長，就不可避免地具有嚴重的血栓或功能障礙急增的可能性，其保存時間存在質的界限。
另一方面，一般動物的組織細胞如果沒有水分則不能生存。如果是由不同種組織構成的高等臟器的話，容易預計由乾燥狀態的再生是不可能的。以往已經開發出乾燥保存植物或各種細菌的技術，但還沒有看到乾燥保存高等動物的器官本身之後使其再生的實驗例。
令人驚奇的是，本發明人發現在一定的條件下，從哺乳類動物摘出的臟器除去大量的水，將該臟器浸在惰性介質中並在低溫下保存時，達到和緩步類動物以酒桶狀態長時間維持生命時一樣的假死狀態(apparentdeath)狀態(特開2000-72601將該申請引入本說明書中，作為參考)。
特別令人驚奇的是，確認了哺乳類動物的多細胞且多組織的臟器從極度脫水狀態再生，以及再生的心臟的跳動。這些臟器的各細胞被認為處於氧消耗量極端地降低至正常時的1/1000或以下或者氧消耗實質上停止了的假死狀態。
用特開2000-72601所公開的方法保存的臟器，再生後可以採集活的神經或幹細胞，可以將臟器自體或採集的組織用在移植治療中。另外，在病理組織學的研究中，重大的意義在於可以長期保存可再生的生物體材料而不是壞死的標本。
上述保存方法可以防止在活體外保存的臟器的細胞或組織的隨時間流逝的自崩潰，可以大幅度增加保存的天數，但該脫水方法依賴於與臟器接觸的脫水劑。為了進一步改良該保存方法，需要探索更優異的脫水方法。
發明的公開本發明涉及哺乳類動物的心臟這樣的臟器的保存方法，包括從臟器除去水分且殘留可以再生的水分量的脫水步驟，和將臟器浸漬在惰性介質中，保持在冷藏溫度下的步驟。
本發明的哺乳類動物的臟器的保存方法包括，脫水步驟，該步驟從含有生理學上正常水分量的臟器，通過其血管系統導出該臟器內的水分，來除去相對於脫水前的臟器總重量，重量比為約10％或以上或25％或以上的水分，且相對於脫水前的總水分量，殘留重量比為約10～約20％或以上的水分；和將該臟器浸漬在惰性介質中，並保持在冷藏溫度下的步驟。上述臟器可選自心臟、肝臟、腎臟、胰腺和肺。
本發明的哺乳類動物的心臟的保存方法包括，脫血步驟，該步驟將生理鹽水溶液灌注到心臟中，將心臟內的血液置換為生理鹽水溶液；脫水步驟，該步驟從脫血的心臟，通過其血管系統導出該臟器內的水分，來除去相對於脫水前的心臟總重量，重量比為約10～約50％的水分；以及將該心臟浸漬在惰性介質中，並保持在約1～約8℃的冷藏溫度的步驟。另外本發明理論上也可以包括除去相對於脫水前的心臟總重量，重量比為約25％～約60％的水分的脫水步驟。
利用上述血管系統的脫水，包括向臟器或者心臟的血管系統送入氣體。例如，將氣體灌注到心臟的大動脈時，通過該氣體的流動，從該心臟的血管系統導出水分。即通過該氣體的流壓，水分被擠出到臟器外。優選流壓是恆壓。而且，上述脫水步驟也可以進一步包括使脫水劑與浸漬在惰性介質中的臟器接觸。特別是在使用氣體的脫水中，為了避免血液和灌注的氣體接觸而凝固的問題，優選在脫水步驟之前，用生理鹽水溶液對臟器進行脫血處理。最優選的是流壓是恆壓的脫血灌注。
送入到血管系統中的氣體優選使用空氣、O2-CO2混合氣體，但也可以使用N2、He、Ar、Ne、Kr或者Xe等惰性氣體。例如，使用用於灌注生理鹽水溶液的灌注裝置，可以送入氣體來取代該生理鹽水溶液。通過向血管系統灌注氣體，臟器內的體液被擠出，而且，從一個個細胞經毛細管導出水分。
作為送入到血管系統中的液體，包括濃度比臟器的體液高的高滲溶液那樣的利用滲透壓差從細胞轉移水分的溶劑。另外也可以是後面所述的惰性介質或者醇類。
通過上述介質進入到上述血管系統的毛細管中而產生流壓，使氣體大致相等地到達全體臟器組織，因此，氣體在毛細管中循環(例如從動脈血管到靜脈血管)，能夠達到血管系統的另一端。該脫水由於利用在臟器中固有的水分供給路徑，所以可以以各個組織或細胞為目標，慢慢地製造出均勻的脫水狀態。即使是哺乳類動物的多細胞且多組織的臟器，也可以不對生物體組織施加無用的應激，向高度的脫水狀態轉移。因而，通常即使是對生物體組織成為應激的10wt％或以上或者25wt％或以上的脫水，臟器也可以不伴有缺血障礙或生物體組織的損傷，達到極其穩定的假死狀態。於是，在恢復水分時，功能復原，不僅其細胞或組織，而且臟器自體的功能也可以再生。
一般假死狀態意指生物學上的假死，但在本發明中意圖的假死意指通過高度的脫水狀態，不能確認外觀上的生命現象，但在恢復水分時，可以再次確認生命現象的狀態。本發明中所謂的「再生」意指從該脫水狀態恢復水分時，可以確認組織的電生理學反應或者作為器官的生物學的生命活動的現象。
在其它方面，本發明涉及哺乳類動物的心臟的保存方法，包括，在含有生理學上正常水分量的臟器表面上形成油膜的步驟、通過將該心臟暴露在氣體中，使該心臟內的水分蒸發到該氣體中，由此除去相對於脫水前的心臟總重量，重量比為約10％或以上的水分的步驟和將該臟器保持在約1～約8℃，優選約2～約4℃的冷藏溫度下的步驟。
本發明還涉及哺乳類動物的心臟的保存方法，包括向心臟灌注生理鹽水溶液，將心臟內的血液置換為生理鹽水溶液的脫血步驟、在脫血的心臟的表面形成油膜的步驟、通過將該心臟暴露在氣體中，使該心臟內的水分蒸發到該氣體中，由此除去相對於脫水前的心臟總重量，重量比為約10～約50％的水分的步驟和將該臟器保持在約1～約8℃的冷藏溫度下的步驟。
採用本發明的方法，一旦除去來自臟器的組織和細胞的游離水，則難於受到可使生物體膜等的生物結構在水相中活化的物質，特別是金屬離子的攻擊。另外，可認為該生物結構被其周圍被稱為結合水的結晶狀態的水包圍而受到保護。使生物組織惡化的極性介質被除去的結果是，組織或細胞可以逃避不可逆的經時崩潰，從而謀求臟器的保存狀態的質的改善。此時，保存液中的海藻糖賦予生物結構的穩定化。
通過將被加熱到體溫程度的體液或者代用體液，例如上述生理鹽水溶液、人工血液和/或血液灌注到其血管系統中，用本發明的方法保存的心臟、肝臟、腎臟、胰腺或者肺可以再生。對於再生的臟器，可以將該臟器或從該臟器採集的組織移植到人體中。另外，從再生的臟器採集神經組織、其它活的組織或細胞，可用在藥理試驗等中。
另外，本發明可適用於以向人體異種移植為目的的除人之外的哺乳類動物的臟器，由此，可以提供因捐贈者不足估計在臨床上的需要增大的動物臟器的保存技術。特別是本發明在養殖的豬的心臟、肝臟、胰腺等的可大量生產的臟器的保存中也是有用的，提供可耐受長時間的輸送，尤其是超過數十小時的航空輸送的保存技術。
再者，如本發明可長期保存的技術對臟器庫的建立是有用的。例如，通過培養具有像胚胎幹細胞這樣具有全能性的幹細胞，可以再生所需的組織或器官，本發明可適用在它們的保存中。在發現疾病前，通過保存預備的臟器，發病後可馬上接受移植。而且本發明對腦或其它神經組織等的保存也是有用的。
術語的定義本發明中所謂的「除去約10％或以上的水分」或「除去約25％或以上的水分」是指除去血管系統內的體液以及各個細胞和細胞間的游離水。另外，本發明中所謂的「保留約10～約20％或以上的水分」是指包括在生物組織內的結合水，對於再生具有充足量的水分。在本發明中，一般認為控制保存的臟器的新鮮度的主要是游離水的量，理論上，為了實現保存時間的長期化，優選儘可能除去游離水。另外，為了保持再生能力，優選殘留可以保持結合水的範圍的水分量。所謂結合水是可觀測到水合狀態或者結晶狀態的水，游離水可定義為結合水以外的水。
血管系統在解剖學上被分為血管系統和淋巴系統。本發明中所謂的「血管系統」優選包括用於向臟器的各個細胞補充水分和養分的營養血管系統。另外，如果是心臟，可將灌注裝置和與心房和心室連接的固有的血管連接，向與心臟的營養血管系統連接的冠狀動脈和冠狀靜脈間接地施加流壓。進而，所謂像肝臟這樣的營養血管系統是具有另外與門脈循環有關的功能血管系統的臟器，也可以利用這樣的功能血管系統。
在本發明中所謂的「含有生理學上正常水分量的臟器」是指，典型地從活體摘出後的狀態的臟器，另外，例如在包括脫血步驟的發明中，可理解為是通過用於脫血的灌注，其血液被置換為生理鹽水溶液的狀態的臟器。將具有這樣的生理學上正常的水分量的臟器的重量作為基準，可以特別指定上述脫水量。
在本發明中所謂的「生理鹽水溶液」是和血液一樣的具備生物學活性的代用體液，已知代表性的是林格液(Ringer’s solution)，例如是KH(Kreps-Henseleit)液。可以在這種生理鹽水溶液中溶解使用有助於脫水狀態的生物結構穩定的多糖類。這種多糖類優選海藻糖。另外，作為其它的生物結構物質，也可以將蘋果酸、甘露糖醇、甘油、甜菜鹼、脯氨酸、1，4，5，6-四氫-2-甲基-4-吡啶甲酸等胺基酸溶解在生理鹽水溶液中使用。
本發明中所謂的「惰性介質」是在水和油中不溶解的介質，是在保存溫度下為液狀的氟化烴液體，特別優選全氟化碳液體。另外，只要滿足類似於其的條件，不限於液體，也可以使用氣體、溶膠或者凝膠。再者，作為其它惰性介質，可以使用水銀或者矽酮油。
附圖的簡單說明


圖1是在實施例3的實驗8中紀錄的心電圖。
圖2是在實施例3的實驗9中紀錄的心電圖。
圖3是在實施例4的實驗1中紀錄的心電圖。
圖4是在實施例4的實驗2中紀錄的心電圖。
圖5是在實施例5的實驗中紀錄的心電圖。
實施發明的最佳方式包括利用血管系統的脫水的發明的方式一般來說，一旦血液和氣體接觸，或者暴露在低溫下，就會凝固而引起血栓，這會妨礙後面所述的脫水或者再生。因此，保存對象的臟器，例如通過手術摘出的臟器，要被洗淨，脫血。作為用於脫血的灌注裝置，可以使用公知的Langendorff的裝置，對於該脫血灌注的技術，作為Langendorff法(Doring H.J，Dehnert H；Biomesstechnik-Vertag MatchGmb，Germany，1988)，本領域技術人員是公知的。按照Langendorff法，對於臟器，將灌注用的導管(或者套管)安裝到其血管系統的大動脈上，向血管系統送入海藻糖-KH(Kreps-Henseleit)混合液，將臟器的血液置換為生理鹽水溶液。對該生理鹽水溶液預先充入氧氣，臟器內經常被送入新鮮的代用液體。利用該灌注進行脫血時，臟器的溫度降低至1～8℃，使臟器的活動停止。脫血完了，接著進入脫水步驟。
脫水步驟利用在上述脫血中使用的Langendorff的裝置來完成。例如，在規定的流壓下，從灌注裝置向脫血完了的臟器的大靜脈送入氣體來代替生理鹽水溶液。人工灌注手段不限於單方面從大動脈送入氣體的手段，本領域技術人員容易理解也包括在大動脈和大靜脈之間連接的封閉循環系統。即，上述氣體灌注不限於送入氣體的方法，也可以是將血管內抽真空的方法。
利用上述灌注裝置向血管系統施加流壓時，生理鹽水溶液從臟器內的大靜脈側流出，進行脫水。優選進入到血管內的氣體通過各個毛細血管流向大靜脈側，而且各個細胞和細胞間的水分因其蒸汽壓而進入到流過血管內的氣體中。最終，各組織和細胞內的游離水的大部分通過血管系統向臟器外排出。
利用上述血管系統的脫水與接觸脫水劑的處理不同，而是利用在臟器內均勻分布的毛細血管的極其廣大的表面積的脫水，雖然是慢慢地，但可以在比較短的時間裡將組織和各個細胞目標性脫水。與上述脫水劑相比較，脫水較均勻且脫水的臟器的變色情況也不嚴重，從這一點就可以看出其優點。如後面所述的實施例所示，在利用氣體灌注的脫水中，實際上再生率非常高，且可以看到再生狀態的改善。另外，用氣體的脫水是從外部有效控制的主動的處理，對於要求迅速且慎重處理的臟器來說是應激少且有效的手段。
送入到血管系統中的氣體可以是在市售的鋼瓶中裝滿的便宜的壓縮氣體。如果是O2-CO2混合氣體的話，優選含有低於5％CO2的混合氣體。另外，在後面所述的實施例中，使用的是乾燥的氣體，但也可以使用含有溼氣的氣體。而且作為脫水用的氣體，更優選可使用N2、Ne、Ar、Ne、Kr或者Xe等惰性氣體。在惰性氣體中，Xe價格高，但由於有報導其對生物組織有麻醉作用，所以預期在本發明的脫水中使用Xe的優點較大。另外，使用惰性氣體也意味著可以避免由活性氧造成的生物組織的損傷。
除了用上述氣體灌注的脫水之外，也可以輔助性合併使用保存時使脫水劑直接或間接地與臟器接觸的脫水方法。
在脫水步驟中使用脫水劑的場合，將調整到所需容量的脫水劑和臟器一起浸漬在後面所述的惰性介質中的方法是簡單的。具體地說，將例如用矽膠、分子篩、沸石等包圍的臟器收納在相對於保存用的惰性介質是惰性材質的金屬絲網、合成纖維網等中，使它們浸漬在惰性介質中。
使用的脫水劑的量可以從該臟器所需的後面所述的除水率來計算，另外，浸漬後，也可在適當的時間除去、追加或交換脫水劑。
另外，在本發明人的緩步類動物的實驗中，在高溼度，優選80％溼度的環境下進行脫水處理時，再生率可達到100％。如果考慮此情形，可認為臟器在高溼度下進行脫水處理是優選的。
上述氣體灌注的條件的一個例子是在0.05～0.2kgf/cm2，優選0.1kgf/cm2的流壓下，1小時～1小時30分鐘或以上，將空氣灌注到大鼠的心臟的大動脈中。最優選在恆壓下的灌注。通過這樣的空氣灌注，對於即將該脫水之前的臟器，可以達到25wt％或以上的除水率。
即將脫水前的臟器是具有代用體液，含有生理學上正常水分量的臟器，為了長期保存，從該水分量儘可能除去大量的游離水。在本發明中，用以下式表示的臟器總重量作為基準的水分除去率(重量比)規定應該除去的水分量。
水分除去率(重量比)＝100-(脫水後的臟器總重量÷脫水前的臟器總重量×100)在特定上述脫水狀態時，除了作為重量比的水分除去率之外，還可以使用NMR，規定臟器內的水分子的絕對量或其狀態。NMR是在生物組織中的水的狀態的研究中一直最為廣泛使用的手段。
對於使用NMR的生物組織中的水的最初的研究是由Belton，P.S.，Jackson，R.R.，Packer，K.J.Pulsed NMR studies of water in strainedmuscle，I.Transverse nuclear spin relaxat ion times and freezingeffects；Biochem.Biophys.Aata.28616-25(1972)報導的。而且，用NMR的水的結構解析是由例如Hazlewood，C.F.，Chang，D.C.，Woessner，D.E.，Nichols，B.C.Nuclear magnetic resonance transverserelaxation times of water protons in skeletal muscle. Biophys.J.14583-605(1974)報導的。
Belton等下結論為水由3個狀態構成，約8％的水分子是與細胞膜的內膜、蛋白質、核酸這樣的生物體內分子結合的結合水，約82％的水分子是結合水以外的游離水，殘存的10％的水分子是與細胞膜的外側相接的游離水。該結合水和其它的水分子不同，確保一定優勢的配行，基於和生物高分子直接結合的水分子，在數個分子層中處於定向的狀態。
一般可理解為在生物組織內的總水分量中，結合水佔約10～約20％，游離水佔約80～約90％。在大鼠的心臟內，以臟器總重量為基準，一般總水分量為約80質量％，結合水為8～16質量％，游離水為64～72質量％。
在本發明涉及的脫水步驟中，理論上可認為可以除去臟器總重量的約25～60wt％的水分。如果是該程度，一般認為除去的水全部是游離水。
因而，脫水的結果，大鼠心臟內殘存的自由水的質量％降至數％～40％左右，但結合水的絕對量沒有變。即使實際的水分量因動物種類或臟器的種類多少有些不同，通過除去相對於脫水前的臟器總重量，重量比為約25％或以上的游離水，也可以殘留相對於脫水前的總水分量，重量比為約10～20％或以上的水分(含結合水)。
臟器所允許的自由水的除去率因脫水方法、臟器的種類、所希望的保存期、其它的保存條件而異。目前，認為對於大鼠心臟來說，約25～35％是安全的。對豬的心臟來說，一般認為約10～50％，特別是15～25％比較合適。
在現階段，上述的脫水狀態與在臟器的保存時間的增加如何相互關聯的機理不十分明了。根據本發明人的研究，至少可以判斷為，保存時間的增加不取決於保存液的成分，在很大程度上取決於臟器的組織或細胞內的水分子的絕對量。從通過各組織和細胞的脫水沒有發現實質性的生命活動的臟器在其後再生的事實，可認為臟器達到假死狀態(apparent death)。該假死狀態可以稱為「不死的狀態」或者學術上稱為「crypotbiotic狀態」(Vreeland H.R.et al；Nature Vol.407 pp.897-900，19 Oct.2000Cano J.R at al；Science Vol.268 pp.1060-1064，19 May.1995)。
被脫水的臟器在作為在水和油中不溶的惰性介質的全氟化碳中保存。臟器浸漬到惰性介質中一般在常壓下的密閉狀態下進行，還可以根據需要在加壓狀態下進行。此時，如上所述，也可以與脫水劑一起保存。另外，惰性介質優選被純氧充氣。
本發明中所謂的「冷藏溫度或以下的溫度」是在約+1～約+8℃，優選約+2～約+4℃附近，在該保存狀態下可以保持規定的天數。另外，如果充分除去臟器的自由水，理論上也可以在冷藏溫度，例如在液氮內保存。
臟器從保存狀態的再生可以利用上述Langendorff法。首先從全氟化碳中取出保存的臟器，如果有脫水劑，將其除去。將該臟器放入+4℃的培養皿內的KH液體中，優選用純氧充氣的KH液中。將灌注用的導管固定到該臟器的大動脈上，優選將連續用O2-CO2混合氣體充氣且在加熱至37℃的KH液體通過灌注泵產生的一定流量下送入大動脈側的導管中。通過該灌注謀求臟器的再生。
在哺乳類動物的臟器的保存中成為問題的是在必須驗證保存後臟器的哪個組織真的生存下來了等方面。作為其手段，有組織解剖學的手段、實際移植而驗證的移植法、電生理學的手段等。無論採用這些手段的哪一種，首先都必須驗證組織細胞是否生存。
在本發明中，作為驗證組織細胞的再生的方法，使用電生理學手段，例如對心臟使用心電圖測定。心電圖可以實時紀錄神經細胞組織的活動，可以在神經細胞的活動消失的時點，判斷細胞死亡發生的情況。另外，輔助性的，可以用目視觀察臟器組織的變色情況，除此之外，如果是心臟，通過確認有無心臟跳動，可以觀察作為臟器的再生狀態。
包括油膜的形成以及通過暴露在氣體中達到脫水的發明該發明使用將臟器暴露在氣體中而達到水分蒸發來代替上述從血管系統的脫水。其脫血步驟和再生步驟基本上與從上述的血管系統脫水的發明相同。對於通過暴露在氣體中的發明，其保存步驟既可以應用，也可以不應用將臟器浸漬在惰性介質中的上述保存方法。在不將臟器浸漬到惰性介質中的場合，乾燥的臟器可以在所需的保存期間，在冷藏溫度下保持在適當的溼度的氣體中。
將脫血的臟器和套管一起從灌注裝置中取下，輕輕地浸漬在油中。在臟器的整個表面形成油膜。油膜的形成可以防止因在乾燥氣體下的水分除去而擔心摘出的心臟的乾燥速度的不平衡以及由此造成的心臟表面的收縮或角質化。
使用的油對臟器是無害的，優選具有可在臟器的表面形成適當厚度的油膜的粘度，典型的是矽油。矽油由有機氧化矽的聚合物構成，在生理學上幾乎無害，且是化學惰性的物質。在後面所述的實施例中使用的矽油的動粘度為100mm2/s(攝氏25℃)，且是不揮發性的，一般認為適合於保護以免經過長時間心臟表面過量乾燥。一旦在心臟的表面形成油膜，就可以用目視確認在沒有油膜時，由乾燥產生的心臟表面的裂紋等物理性傷害減輕了。
對於使用的氣體，一般可以使用空氣，或者O2-CO2混合氣體，但對它們沒有限定。作為乾燥用的氣體，優選O2-CO2混合氣體。
如後面所述的實施例所示，作為保存用的氣體，可以使用含有Xe的氣體。由於氙氣是不具有極性的惰性氣體，所以與周圍的水疏水性水合，從而可以抑制水分子的熱運動。如果水的構造化提高，分子運動緩慢的話，水的粘度就會上升，而且由於生物體反應通過水進行，所以一般認為如果水的粘度上述的話，細胞的代謝就會受到抑制。除了除去自由水以及在低溫下保持之外，如果在保存氣體中使用氙氣的話，臟器的代謝可進一步受到抑制。
另外，氙氣的離解壓(攝氏0℃)是1.15個大氣壓(0.1115MPa)，已知在比較低的加壓下，容易製造氣體水合物。因而，在使用氙氣的場合，在加壓下保存臟器比較好。一般認為，在加壓環境下，氙氣在臟器(包括細胞內和細胞外)內的水相中的溶解度會提高。如果對包圍臟器的氙氣加壓，可推測可以促進臟器內的水的構造化，臟器的代謝將顯著受到抑制。
對於使用暴露在氣體中的脫水方法，例如放入乾燥劑矽膠，並將脫血後的臟器放入保持在冷藏溫度下的密閉容器中，經規定時間將臟器暴露在乾燥的氣體中。應達成的脫水率因臟器的重量而異，是脫水前的臟器總重量的10-50wt％。但是，在同一乾燥條件下，由於要達到的脫水率取決於臟器的大小(重量等)，所以優選適用考慮了該情況的乾燥條件。
用於脫水的時間因臟器的重量和乾燥劑的量而異。例如，如果是大鼠的心臟，則在24～48小時左右，如果是豬的心臟，則在1周左右，對它們沒有限定。在各乾燥期間後，將臟器保存在惰性介質中比較好。用該脫水方法可以不傷害臟器，從而達成在長期保存中所希望的高的脫水率。由於臟器的損傷少，所以在比較短的時間保存下，再生狀態非常好，另外，即使在長時間保存下，再生率也上升了。
在後面所述的實施例4中，使豬臟器在37天後再生成功了。在以往的冷藏保存中這是豬臟器腐敗的期間，但在此卻確認了臟器的心肌組織再生了。
實施例實施例1(通過血管系統使之脫水的大鼠心臟的保存)按照美國的NIH的實驗動物基準，使用人工繁殖的7周齡的Wistar系雄性大鼠(體重300g)作為實驗動物。
在大鼠的腹腔內注射給藥戊巴比妥鈉0.25ml和肝素鈉(肝素鈉鹽)5mg，測定體重後，開始摘出心臟。將摘出的心臟放置在恆溫槽中，向大動脈插入導管後，使用溶解有海藻糖117mmol並充入了95％O2-5％CO2混合氣體的KH液體，進行Langendorff式的脫血灌注。降低恆溫槽的溫度並使心臟停止，結束脫血灌注。
測定心臟重量後，通過其灌注裝置，向心臟送入上述95％O2-5％CO2混合氣體並開始脫水。一面測定心臟的重量並記錄水分除去率，一面在從脫水開始進行氣體灌注，到約1小時30分鐘後停止氣體灌注。在僅擦拭去外表面的水分的狀態下測定心臟的總重量。
將脫水的心臟浸漬在預先充入了1分鐘純氧的4℃的全氟化碳液體(住友スリ-エム社制，フロリナ-トFC77；C8F17)500ml中，將其裝入密閉容器中，保存在冷藏庫內。
規定的時間後，從全氟化碳液體取出保存的心臟，向大動脈插入導管，並使用充入了上述混合氣體的熱的KH液體，試著進行了通過Langendorff式灌注的再生。
·實驗1(4小時的保存)R349(Wistar大鼠，5周齡，雄性)2000年9月11日室溫24℃15:39體重測定130g15:51開始心臟摘出15:53心臟摘出以及插入導管結束15:53脫血灌注開始恆溫槽溫度5.0℃，速度1.0～3.8ml/min16:14心臟停止，脫血灌注結束恆溫槽溫度5.0℃，心臟溫度18.2℃16:14心臟重量測定0.663g16:18用混合氣體灌注的脫水開始氣壓0.05kgf/cm2，恆溫槽溫度2.8℃16:48心臟重量測定0.516g，水分除去率22.2％16:50脫水繼續氣壓0.05kgf/cm2，恆溫槽溫度1.1℃17:20心臟重量測定0.458g，水分除去率30.9％17:21脫水繼續氣壓0.05kgf/cm2，恆溫槽溫度1.6℃17:51心臟重量測定0.394g，水分除去率40.6％17:55浸漬在PFC液中，保存4小時0.6℃21:54保存結束，撈出心臟(室溫26℃)21:55心臟重量測定0.436g21:55再生灌注開始恆溫槽溫度34.4℃，速度1.0～3.8ml/min23:40再生灌注結束恆溫槽溫度33.7℃評價KH灌注開始後4分鐘，雖然可以看到心肌的微弱收縮，但心房沒有動。心肌繼續動直至停止灌注，心臟略微膨脹。
·實驗2(8小時的保存)R350(Wistar大鼠，5周齡，雄性)2000年9月12日室溫25℃19:10體重測定150g19:20開始心臟摘出19:22心臟摘出以及插入導管結束
19:22脫血灌注開始恆溫槽溫度5.0℃，速度1.0～3.8ml/min19:37心臟停止，脫血灌注結束恆溫槽溫度4.6℃，心臟溫度15.7℃19:39心臟重量測定0.718g19:43用混合氣體灌注的脫水開始氣壓0.1kgf/cm2，恆溫槽溫度4.4℃20:13心臟重量測定0.647g，水分除去率9.9％20:15脫水繼續氣壓0.1kgf/cm2，恆溫槽溫度2.4℃20:35心臟重量測定0.550g，水分除去率23.4％20:48脫水繼續氣壓0.05kgf/cm2，恆溫槽溫度4.8℃20:18心臟重量測定0.483g，水分除去率32.7％17:55浸漬在PFC液中，保存8小時0.6℃2000年9月13日05:21保存結束，撈出心臟(室溫27℃)05:23心臟重量測定0.523g05:24再生灌注開始恆溫槽溫度33.6℃，速度1.0～3.8ml/min07:25再生灌注結束恆溫槽溫度36.6℃評價從05:29開始，心肌劇烈收縮，但約10秒鐘就停止了。0600的時候，確認了肺動脈周圍(右心)附近微弱運動。心臟相當膨脹，在外觀上幾乎不能確認跳動，但在停止灌注並去掉心臟的KH液時，可以清楚地看出在跳動。
·實驗3(16小時的保存)R351(Wistar大鼠，5周齡，雄性)2000年9月13日室溫24℃16:22體重測定120g16:28開始心臟摘出16:31心臟摘出以及插入導管結束16:31脫血灌注開始恆溫槽溫度26.9℃，速度1.0～3.8ml/min16:44心臟停止，脫血灌注結束恆溫槽溫度4.6℃，心臟溫度16.2℃16:45心臟重量測定0.605g16:50用混合氣體灌注的脫水開始氣壓0.1kgf/cm2，恆溫槽溫度3.3℃
17:20心臟重量測定0.534g，水分除去率11.7％17:23脫水繼續氣壓0.1kgf/cm2，恆溫槽溫度1.3℃17:53心臟重量測定0.517g，水分除去率14.5％17:55脫水繼續氣壓0.2kgf/cm2，恆溫槽溫度0.5℃18:25心臟重量測定0.522g，水分除去率13.7％18:30浸漬在PFC液中，保存16小時2.8℃2000年9月14日10:28保存結束，撈出心臟(室溫25℃)10:30再生灌注開始恆溫槽溫度32.9℃，速度1.0～3.8ml/min17:25再生灌注結束恆溫槽溫度34.5℃評價由於心臟的膨脹劇烈，跳動的狀態不明了，因此採取通過心電圖的記錄。
·實驗4大鼠R443(24小時的保存)2001年2月6日16:10心臟摘出16:20脫血灌注開始恆溫槽溫度26.8℃→7.9℃16:45脫血灌注結束，心臟重量測定0.582g16:45一邊從大動脈灌注空氣(0.1kgf/cm2)，一邊浸漬在PFC液中2001年2月7日16:48從PFC液撈出心臟16:50心臟重量測定0.430g，水分除去率26.1％16:50KH液的灌注開始(恆溫槽27.0℃→35.5℃)18:30再生確認，有穩定的跳動再生·實驗5大鼠R444(24小時的保存)2001年2月7日18:55給藥戊巴比妥鈉0.2ml18:57給藥肝素鈉5mg
18:57體重測定19:00心臟摘出19:03溶解海藻糖的KH液灌注(恆溫槽27.6℃→5.5℃)19:23灌注結束，心臟重量測定0.767g19:27在瓶內空氣灌注(0.1kgf/cm2，0.8℃)19:57灌注結束，心臟重量測定0.483g，水分除去率34.8％20:00PFC浸漬2001年2月8日20:25從PFC(0.5℃)撈出心臟20:27心臟重量測定20:27KH液灌注開始(恆溫槽溫度26.9℃→35.4℃)21:27再生確認，跳動數次，停止實施例2(通過血管系統使之脫水的大鼠心臟的保存)實驗動物按照美國的NIH實驗動物基準，使用繁殖的Wistar大鼠(5周齡，雄性)。在下述的各實驗例中，分別各使用5隻大鼠。作為惰性介質，使用全氟化碳(PFC)。
·實驗1(4小時的保存)給大鼠腹腔內給藥戊巴比妥鈉0.2ml後，腹腔內給藥將肝素鈉5mg溶解在0.3ml的生理鹽水中的溶液。將大鼠開胸並摘出心臟後，將導管插入到摘出的心臟的大動脈上並用棉線結紮。將插入導管的摘出心臟裝配在定流量灌注裝置上，以3.2ml/min灌注溶解了117mmol海藻糖的27℃的KH液體。KH液體時常用95％O2-5％CO2的混合氣體充氣。慢慢降低灌注液的溫度並使心臟停止，測定完全停止的心臟的重量後，用導管在0.1kgf/cm2的流壓下灌注空氣來乾燥心臟。測定乾燥的心臟的重量後，在時常用混合氣體充氣下，將其浸漬保存在保冷到4℃的PFC中。4小時後，從保存液取出心臟，將其安裝在定流量灌注裝置上，以3.2ml/min灌注經常用混合氣體充氣的27℃的KH液體。摘出的心臟保存後再次開始灌注時，組織細胞如果維持生命的話，就會自動再生，神經活動顯現，這一點是已知的。在再生的心臟上安裝電極，用描筆式記錄器記錄表面心電圖。
·實驗2(16小時的保存)除了將保存時間定為16小時之外，和上述實驗例12一樣進行。
上述各大鼠的氣體灌注時間和水分除去率如下所示。實驗1的脫水率1-1 1小時34分，44.1％1-2 2小時37分，32.8％1-3 2小時37分，44.4％1-4 2小時37分，47.5％1-5 3小時7分， 41.1％實驗2的脫水率2-1 1小時35分，44.4％2-2 2小時37分，41.2％2-3 1小時3分， 45.8％2-4 3小時12分，41.3％2-5 2小時9分， 41.4％實驗例2的結果在實驗1和實驗2的雙方中，所有的試樣再生了。在上述實驗1和2中可以看到，水分除去所需的時間和水分除去率顯著的參差不齊。可認為原因是摘出時的心臟的狀態不一定。從插入到大動脈的導管送入的空氣從左右冠狀動脈口遍布在心肌的毛細血管中，使各心肌細胞乾燥，但在毛細血管中，即使很少，但一旦產生有血栓，則空氣就不會達到其前面的細胞，時間和除去率就不成比例。總之，令人驚奇的是，在此次實驗中，水分除去率40％或以上的大鼠心臟保存4小時和16小時，可以確認100％的再生。
實施例3(暴露在氣體中使之脫水的大鼠心臟的保存)在本實施例中，將矽油塗布到從大鼠摘出的心臟上，在乾燥氣體的加壓下，在4℃保存該心臟3天。
在本實驗中使用的大鼠是按照美國的NIH的實驗動物基準，使用人工繁殖的7周齡的Wistar系雄性大鼠(300g)。從大鼠摘出心臟，進行脫血後，用導管注入心肌保護液(Miotecter持田製藥制)2ml，使心臟停止。將矽油(WF·30和光純製藥)塗布到灌注結束的心臟的表面上，將心臟包裹在滅菌紗布(120×120mm)中，放入標準瓶(60ml)中。將放入了心臟的瓶子放置到鋪滿矽膠的耐壓室內並密封。用混合氣體(氧氣95％，二氧化碳5％)置換室內後，充入混合氣體以達到0.2Mpa。處理後，將室保存在攝氏4度的冷藏庫中。
根據需要，每24小時打開室，將矽油塗布到摘出的心臟上，進行修整。經過規定時間後，從室內的矽油取出心臟，放在恆壓灌注裝置中。從充滿了用氧95％，二氧化碳5％的混合氣體連續充氣的KH液的灌注液貯留槽導出的灌注液在恆壓(約60mmHg)下送入到大動脈導管中。摘出的心臟在攝氏37度下開始灌注。在灌注中，將心電圖記錄用電極安裝到左心室和大動脈開口部，使用生物放大器(Bioview-ENEC三榮制)連續記錄雙曲誘導下的心電圖·基本的實驗順序如下。
1.將摘出的心臟浸在充滿了KH液的培養皿中。
2.在培養皿中將套管插入到大動脈，用棉線固定。
3.將套管安裝在Langendorff式恆壓灌注裝置上，向心臟脫血灌注KH液。在此時的KH液中添加青黴素鉀20萬u/L。灌注溫度約37℃，灌注壓力60mmHg。
4.20分鐘的灌注後，將約2ml心停止液(心肌保護液)ミオテクタ一灌注到心臟中，促進心臟停止。
5.從灌注裝置與套管一起取下心臟，用紗布擦去表面的水分，測定心臟的重量。
6.將心臟輕輕地浸在矽油中，在表面形成矽油層。
7.用紗布慢慢包裹心臟，放入容器中。
8.將放入了心臟的容器收容在耐壓室中。在室內的底部鋪滿矽膠。
9.將室密閉，送入混合氣體(95％氧，5％二氧化碳)加壓直至達到0.3MPa。根據需要，使用氙氣(例如氙氣約0.1MPa和混合氣0.2MPa)。
10.加壓完了後，與室一起放入冷藏庫，在2～4℃保存。
11.3天後，從冷藏庫取出室後，排出氣體。
12.打開室，取出心臟，測定重量。
13.將心臟安裝在Langendorff式恆壓灌注裝置上，開始灌注。例如，灌注溫度為37.0℃，灌注壓力為60mmHg。
14.如果確認了再生，則測定心臟表面的心電圖。
另外，根據試樣改變充入到室內的氣體，或者改變乾燥期間。將乾燥期結束的試樣浸漬到保存液(矽油·PFC)中，和乾燥時一樣，在室內加壓保存。
應用上述方法被確認再生的實驗如下所示。
·實驗1保存前的心臟重量1.46g保存開始的日期和時間2001年12月30日21:07使用的氣體混合氣體0.3Mpa再生開始的日期和時間2002年1月2日16:09再生開始前的心臟重量0.97g(3天除去35％的水分)·實驗2保存前的心臟重量1.29g保存開始的日期和時間2001年12月30日21:07使用的氣體混合氣體0.3Mpa再生開始的日期和時間2002年1月2日17:42再生開始前的心臟重量0.89g(除去35％的水分)·實驗3保存前的心臟重量1.37g保存開始的日期和時間2002年1月8日19:20使用的氣體混合氣體0.2Mpa，還有Xe0.1MPa再生開始的日期和時間2002年1月11日14:34再生開始前的心臟重量0.98g(除去32％的水分)·實驗4保存前的心臟重量1.41g保存開始的日期和時間2002年1月8日19:20
使用的氣體混合氣體0.2Mpa，還有Xe 0.1MPa再生開始的日期和時間2002年1月11日15:42再生開始前的心臟重量1.10g(除去27％的水分)·實驗5保存前的心臟重量1.60g保存開始的日期和時間2002年1月9日10:16使用的氣體混合氣體0.2Mpa，還有Xe0.1MPa再生開始的日期和時間2002年1月12日17:42再生開始前的心臟重量0.94g(除去46％的水分)·實驗6保存前的心臟重量1.63g保存開始的日期和時間2002年1月15日19:13使用的氣體混合氣體0.3Mpa再生開始的日期和時間2002年1月18日13:49再生開始前的心臟重量1.12g(除去31％的水分)·實驗7保存前的心臟重量1.41g保存開始的日期和時間2002年1月15日19:13使用的氣體混合氣體0.3Mpa再生開始的日期和時間2002年1月18日16:02再生開始前的心臟重量1.04g(除去35％的水分)·實驗8保存前的心臟重量1.43g保存開始的日期和時間2002年1月8日19:20使用的氣體混合氣體0.2Mpa，還有Xe0.1MPa再生開始的日期和時間2002年1月11日18:54再生開始前的心臟重量1.07g(除去28％的水分)
圖1是在本實驗中的心臟表面心電圖(21:04測定)·實驗9
保存前的心臟重量1.61g保存開始的日期和時間2002年1月9日20:16使用的氣體混合氣體0.2Mpa，還有Xe0.1MPa再生開始的日期和時間2002年1月12日19:18再生開始前的心臟重量1.00g(除去42％的水分)圖2是在本實驗中的心臟表面心電圖(20:25測定)實施例4(暴露在氣體中使之脫水的豬心臟的保存)在該實施例中，將豬心臟暴露在混合氣中使之脫水，在該混合氣下保存7～8天·實驗1(7天)保存前的心臟重量31.9g保存開始的日期2002年2月16日使用的油矽油使用的氣體混合氣(沒有加壓)程序用聚氨酯泡沫包裹塗布了油的心臟，並收容在容器(瓶子)中，和容器一起放入室內，進行向混合氣的置換。將其放入冷藏庫中，保持在2～4℃的冷藏溫度下。每天取出臟器，塗布矽油，進行修整。
再生開始的日期2002年2月23日再生開始前的心臟重量25.6g(除去19.7％的水分)圖3是保存7天後使之再生的該心臟表面的心電圖。
·實驗2(8天)保存前的心臟重量31.2g保存開始的日期2002年2月17日使用的油矽油使用的氣體混合氣(沒有加壓)程序用聚氨酯泡沫包裹塗布了油的心臟，並收容在容器(瓶子)中，和容器一起放入室內，進行向混合氣的置換。將其放入冷藏庫中，保持在2～4℃的冷藏溫度下。每天取出臟器，塗布矽油，進行修整。
再生開始的日期2002年2月25日再生開始前的心臟重量23.5g(除去24.6％的水分)圖4是保存8天後再生的該心臟表面的心電圖。
實施例5(暴露在氣體中使之脫水的豬心臟的長期保存)在該實驗中，應用將豬心臟暴露在氣體中的脫水，試驗長期保存(37天)。
豬體重5kg，保存前的心臟重量32.6g保存開始的日期和時間2001年12月16日使用的氣體混合氣(沒有加壓)程序用聚氨酯泡沫包裹塗布了油的心臟，並收容在容器(瓶子)中，和容器一起放入室內，進行向混合氣的置換。將其放入冷藏庫中，保持在2～4℃的冷藏溫度下。每天取出臟器，再次塗布矽油。從脫水開始至1周後，浸漬到惰性介質(PFC)中，保持在2～4℃的冷藏溫度下。
再生開始的日期和時間2002年1月22日從脫水開始37天後，取出臟器，進行用於再生的灌注。
再生開始前的心臟重量25.1g(除去23％的水分)如圖5所示，再生開始後(19:04)，心臟表面(溫度29.0℃)的心電圖顯現。從1mV至最大5mV，記錄了每分鐘8次～40次的脈衝。
權利要求
1.一種哺乳類動物的臟器的保存方法，包括脫水步驟，該步驟從含有生理學上正常水分量的臟器，通過其血管系統，導出該臟器內的水分，除去相對於脫水前的臟器總重量，重量比為約10％或以上的水分，且相對於脫水前的總水分量，殘留重量比為約10～約20％或以上的水分，和將該臟器浸漬在惰性介質中，並保持在冷藏溫度下的步驟。
2.一種保存方法，包括脫血步驟，該步驟將生理鹽水溶液灌注到心臟中，將心臟內的血液置換為生理鹽水溶液；脫水步驟，該步驟從脫血的心臟，通過其血管系統導出該臟器內的水分，除去相對於脫水前的心臟總重量，重量比為約10～約50％的水分；以及將該心臟浸漬在惰性介質中，並保持在約1～約8℃的冷藏溫度下的步驟。
3.一種保存方法，包括脫血步驟，該步驟將生理鹽水溶液灌注到心臟中，將心臟內的血液置換為生理鹽水溶液；脫水步驟，該步驟從脫血的心臟，通過其血管系統導出該臟器內的水分，除去相對於脫水前的心臟總重量，重量比為約25～約60％的水分；以及將該心臟浸漬在惰性介質中，並保持在約1～約8℃的冷藏溫度下的步驟。
4.權利要求1～3任一項所述的保存方法，上述脫水步驟包括送入氣體作為導出水分的介質。
5.權利要求4所述的保存方法，上述脫水步驟包括向心臟的大動脈灌注氣體，通過該氣體的流動，從該心臟的血管系統導出水分。
6.權利要求1～3任一項所述的保存方法，上述脫水步驟包括向臟器或者心臟的血管系統送入空氣。
7.權利要求1～3任一項所述的保存方法，上述脫水步驟包括向臟器或者心臟的血管系統送入以O2為主要成分的O2-CO2混合氣體。
8.權利要求1～3任一項所述的保存方法，上述脫水步驟進一步包括使浸在惰性介質中的該臟器與脫水劑接觸。
9.權利要求1或2所述的保存方法，在上述生理鹽水溶液中溶解使用海藻糖。
10.權利要求1～3任一項所述的保存方法，在上述惰性介質中使用全氟化碳液體。
11.權利要求1所述的保存方法，上述臟器選自心臟、肝臟、腎臟、胰腺和肺。
13.權利要求1所述的保存方法，上述臟器是豬的心臟。
14.一種哺乳類動物的心臟的保存方法，包括在含有生理學上正常水分量的臟器表面形成油膜的步驟、通過將該心臟暴露在氣體中，使該心臟內的水分蒸發到該氣體中，來除去相對於脫水前的心臟總重量，重量比為約10％或以上的水分的步驟和將該臟器保持在約2～約8℃的冷藏溫度下的步驟。
15.一種哺乳類動物的心臟的保存方法，包括向心臟灌注生理鹽水溶液，將心臟內的血液置換為生理鹽水溶液的脫血步驟、在脫血的心臟的表面形成油膜的步驟、通過將該心臟暴露在氣體中，使該心臟內的水分蒸發到該氣體中，以除去相對於脫水前的心臟總重量，重量比為約10～約50％的水分的步驟和將該臟器保持在約1～約8℃的冷藏溫度下的步驟。
16.權利要求14或15所述的保存方法，進一步包括將除去水分的上述臟器浸漬在惰性介質中，並保持在約1～約8℃的冷藏溫度下的步驟。
17.權利要求14或15所述的保存方法，上述臟器選自心臟、肝臟、腎臟、胰腺和肺。
18.權利要求17所述的保存方法，上述臟器是豬的心臟。
全文摘要
本發明涉及哺乳類動物的臟器的保存方法，包括從含有生理學上正常水分量的臟器，通過血管系統導出該臟器內的水分，除去相對於脫水前的臟器總重量，重量比為約10％或以上，優選25％或以上的水分的脫水步驟，和將該臟器浸漬在惰性介質中並保持在冷藏溫度下的步驟。
文檔編號A01N1/02GK1505474SQ0280888
公開日2004年6月16日 申請日期2002年3月6日 優先權日2001年3月6日
發明者關邦博 申請人:生物庫株式會社